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STAPHYLOCOCCUS AUREUS ENTEROTOXIGÊNICO EM DOCES CREMOSOS VENDIDOS EM PADARIAS E CONFEITARIAS DO MUNICÍPIO DE SÃO PAULO, BRASIL* Sebastião Timo Iaria ** IARIA, S.T. Staphylococcus aureus enterotoxigênico em doces cremosos vendidos em padarias e confeitarias do município de São Paulo, Brasil. Rev. Saúde públ., S. Paulo, 15:321-37, 1981. RESUMO: A partir de 100 amostras de doces cremosos coletados em 40 padarias e confeitarias da cidade de São Paulo (Brasil), foi realizada a contagem de S. aureus por grama de alimento. As cepas isoladas, após terem sido identificadas morfológica e bioquimicamente, foram submetidas a provas de fagotipagem e à verificação da capacidade produtora de enterotoxina. Das 100 amostras de doces examinadas, 38,0% foram positivas para S. aureus e originárias de 21 (52,5%) dos 40 estabelecimentos visitados. Do total de doces analisados, 7% foram positivos para cepas enterotoxigênicas sendo 5% do tipo C, 1% do B e 1% do D. das 76 cepas isoladas de S. aureus, 39(51,5%) revelaram-se não fagotipáveis. Das fatotipáveis houve predomi- nância das que foram usadas por fagos do grupo I isoladamente (21,2%) ou em associação com fagos de outros grupos (35,5%). Cepas não tipáveis de S. aureus estavam presentes em 76,2% dos estabelecimentos em que houve amostras positivas para esta bactéria. UNITERMOS: Slaphylococcus aureus. Enterotoxina. Intoxicação alimentar estafilocócica. * Parte da Tese de Livre Docência apresentada ao Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP, 1978, subordinada ao título: "Staphylococcus aureus em doces vendidos em padarias e confeitarias do município de São Paulo; produção de enterotoxina estafilocócica e fagotipagem a partir das cepas isoladas (1975/76). ** Do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP "Setor Saúde Pública", Laboratório de Microbiologia de Alimentos Av. Dr. Arnaldo, 715 01255 — São Paulo, SP — Brasil. INTRODUÇÃO O Staphylococcus aureus constitui uma espécie bacteriana cuja importância na patologia humana e animal é muito conhe- cida. No homem, além de ocasionar infec- ções, que podem variar de pequenos furún- culos na pele até a septicemia grave com focos metastáticos 63 , produz freqüentemente infecções assintomáticas 1,72 . Muitos estudos foram realizados com o objetivo de verificar taxas de portadores de S. aureus. Assim, em pessoas assinto- máticas tem-se constatado taxas de porta- dores nasais variando de 30 a 60%. Na garganta, em vários estudos realizados, foram constatadas proporções de portadores de 4 a 64%, e nas mãos de aproximada- mente, 40 a 47%. A este respeito, segundo Zelante 74 (1974) as pesquisas têm mostrado que os portadores de S. aureus na boca

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STAPHYLOCOCCUS AUREUS ENTEROTOXIGÊNICO EM DOCESCREMOSOS VENDIDOS EM PADARIAS E CONFEITARIAS DO

MUNICÍPIO DE SÃO PAULO, BRASIL*

Sebastião Timo Iaria **

IARIA, S.T. Staphylococcus aureus enterotoxigênico em doces cremosos vendidos empadarias e confeitarias do município de São Paulo, Brasil. Rev. Saúde públ., S.Paulo, 15:321-37, 1981.

RESUMO: A partir de 100 amostras de doces cremosos coletados em40 padarias e confeitarias da cidade de São Paulo (Brasil), foi realizada acontagem de S. aureus por grama de alimento. As cepas isoladas, após teremsido identificadas morfológica e bioquimicamente, foram submetidas a provasde fagotipagem e à verificação da capacidade produtora de enterotoxina. Das100 amostras de doces examinadas, 38,0% foram positivas para S. aureuse originárias de 21 (52,5%) dos 40 estabelecimentos visitados. Do total dedoces analisados, 7% foram positivos para cepas enterotoxigênicas sendo5% do tipo C, 1% do B e 1% do D. das 76 cepas isoladas de S. aureus,39(51,5%) revelaram-se não fagotipáveis. Das fatotipáveis houve predomi-nância das que foram usadas por fagos do grupo I isoladamente (21,2%)ou em associação com fagos de outros grupos (35,5%). Cepas não tipáveisde S. aureus estavam presentes em 76,2% dos estabelecimentos em que houveamostras positivas para esta bactéria.

UNITERMOS: Slaphylococcus aureus. Enterotoxina. Intoxicação alimentarestafilocócica.

* Parte da Tese de Livre Docência apresentada ao Departamento de Microbiologia e Imunologiado Instituto de Ciências Biomédicas da USP, 1978, subordinada ao título: "Staphylococcusaureus em doces vendidos em padarias e confeitarias do município de São Paulo; produçãode enterotoxina estafilocócica e fagotipagem a partir das cepas isoladas (1975/76).

** Do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP"Setor Saúde Pública", Laboratório de Microbiologia de Alimentos — Av. Dr. Arnaldo, 715— 01255 — São Paulo, SP — Brasil.

INTRODUÇÃO

O Staphylococcus aureus constitui umaespécie bacteriana cuja importância napatologia humana e animal é muito conhe-cida. No homem, além de ocasionar infec-ções, que podem variar de pequenos fu rún -culos na pele até a septicemia grave comfocos metastáticos 63, produz freqüentementeinfecções assintomáticas 1,72.

Muitos estudos foram realizados com oobjetivo de verificar taxas de portadores

de S. aureus. Assim, em pessoas assinto-máticas tem-se constatado taxas de porta-dores nasais variando de 30 a 60%. Nagarganta, em vários estudos realizados,foram constatadas proporções de portadoresde 4 a 64%, e nas mãos de aproximada-mente, 40 a 47%. A este respeito, segundoZelante 74 (1974) as pesquisas têm mostradoque os portadores de S. aureus na boca

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são fontes de infecção tão importantesquanto os portadores nasais.

A partir de portadores de S. aureus pode,por vários mecanismos, atingir o ambiente,as vestimentas, o mobi l iár io , os utensíliose os equipamentos, assim como os alimentos,direta ou indiretamente. Deve-se aindaconsiderar que os animais domésticostambém podem albergar o S. aureus 5 2 ,constituindo-se em possíveis fontes de conta-minação de alimentos.

Em alimentos, segundo I n g r a m 4 3 (1960),é relevante a contagem alta de cocos Gram-positivos, dispostos em cachos, mesófilos,

catalase-positivos, anaerobios facultativos,quaisquer que sejam, pois indica que podemestar presentes também cepas de S. aureusem grande número. Por outro lado, a pre-sença de S. aureus em um alimento podeser interpretada como indicadora de conta-minação a par t i r de fossas nasais, boca epele de manipuladores 6 7 .

De f o r m a geral, al imentos como carnee derivados, aves, leite e derivados, pes-cado, verduras e outros, mostram-se fre-qüentemente contaminados com S. aureus 25,36,36,37,45,50,51,61,65,71.

Estando presente em alimento e havendocondições favoráveis à sua mult ipl icação, oS. aureus pode, em algumas horas, at ingirnúmeros elevados. Por outro lado, depen-dendo da cepa pode haver, durande o pe-ríodo de mult ipl icação, produção de ente-rotoxina, que é uma exotoxina termoestávele responsável pela intoxicação al imentarestafilocócica.

Atualmente tem-se conhecimento de gran-de variedade de alimentos já envolvidosem surtos desta intoxicação, tais comocarne bovina, carne seca, f rango congeladoe cozido, lagosta, camarão, caranguejo, peixe,língua, presunto, tortas de presunto e decarne de coelho, leite, queijo, creme de leite,sorvete, produtos cárneos embutidos, molhode frango e holandês. Produtos de confeitariarecheados com creme natural ou art if icial ,como bolos, bombas, roscas, tortas e fo-

lhados, têm sido também relacionados asurtos de intoxicação al imentar estafilocó-cica11,17,22,23,32,41,44,48,62,69.

Alguns pesquisadores 29,30,31 constataramque todas as cepas de estafilococos produ-tores de enterotoxina, por eles estudadas,eram coagulase-positivas e que nem todasas cepas coagulase-positivas eram entero-toxigênicas. Tem-se, contudo, isolado cepasde estafilococos coagulase-negativas produ-toras de enterotoxina 8 ,22. Entretanto, parecenão haver relação entre a produção de en-terotoxina a de outras toxinas ou fatoresde vi ru lência elaborados pelo S. aureus(Angelotti 1, 1969).

De há muito vêm sendo realizados estudoscom o objetivo de relacionar a produçãode enterotoxina estafilocócica ao tipo deS. aureus, determinado através da fagoti-pagem. A este respeito, tem sido mostradoque a maioria das cepas de S. aureus,associadas a surtos de intoxicação alimentar,são usadas por fagos do grupo I I I e maisraramente de outros grupos 51 ,54 ,70 . Maisrecentemente, na Inglaterra , Sinkovicova eGilber t 6 2 (1971), Gilbert e Wieneke36

(1973) e Wieneke 6 9 (1974), verificaram queas cepas de S. aureus implicadas em surtosde intoxicação al imentar são, na maioriadas vezes, usadas por fagos do grupo IIIou I / I I I e, em menor número, dos gruposI I e IV. Entretanto, a part i r da fagotipagem,não se pode predizer se uma determinadacepa de S. aureus é ou não capaz de pro-duzir enterotoxina estafilocócica 1,35. Assim,no diagnóstico de um surto de intoxicaçãoalimentar estafilocócica, o ideal é a veri-ficação da presença de enterotoxina nosalimentos suspeitos (Dack 2 2 , 1964).

Até há alguns anos, a pesquisa de ente-rotoxina era feita ministrando-se a volun-tários humanos 22, macacos 2 4 , 4 7 , 7 3 ou gatosjovens 27,58 os próprios alimentos implica-dos em surtos ou sobrenadante de culturasde S. aureus isoladas a partir deles.

Posteriormente, os estudos sobre pu r i f i -cação e antigenicidade da enterotoxina esta-f i locócica permi t i ram o uso de técnicas

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sorológicas na detecção dessa toxina emsobrenadantes de culturas de S. aureus,obtidas por diferentes métodos (Casman eBennett13, 1963; Hallander 39, 1965 e Don-nelly e col.28, 1967) ou em extratos obtidosa partir de alimentos (Hall e col.38, 1963;Casman e Bennett1 4 , 1965 e Read e col.56,57,1965).

São conhecidos, atualmente, cinco tiposde enterotoxina estafilocócica denominadasA (Casman e col.15, 1963), B (Bergdoll ecol.9, 1959), C (Bergdoll e col.7, 1965), D(Casman e col.16, 1957) e E (Bergdoll ecol.6, 1971).

Dentre os métodos sorológicos de pes-quisa de enterotoxina estafilocócica desen-volvidos, até o presente, devem-se ressaltaros de imunofluorescência 33,34,40, inibição dahemaglutinação 12,16,53,59, difusão simples emágar3 8 , radioimunoensaio em fase sól ida 4 -18,19 e o da dupla imunodifusão de Oakleyem tubo ou de Ouchterlony em placas(Gilber t 3 5 , 1974). Segundo este autor 3 5 ,as técnicas mais utilizadas são as de duplaimunodifusão em ágar em lâmina de Wads-worth68 (1957) e de Crowle21 (1958).

No Brasil, há um número muito reduzidode investigações relativas a S. aureus ente-rotoxigênico. Assim, Cotillo20 (1967) es-tudou o efeito da penicilina e da estrepto-micina sobre a síntese de enterotoxina.Delazari e Leitão25 (1976) procederam acontagem de S. aureus em macarrão, veri-ficando que 69,5% das amostras exami-nadas eram positivas para essa bactéria;as contagens variaram de 10 a 104/g dealimento. Das 106 cepas de S. aureus iso-ladas, 67(63,0%) revelaram-se enteroto-xigênicas. Iaria e col.42 (1980), estudarama ocorrência de S. aureus nas fossas nasaisde manipuladores de alimentos em cozinhasde hospitais. De 34 indivíduos examinados,12(35,3%) revelaram-se portadores de S.aureus dos quais 2(16,7%) foram positivospara cepas produtoras de enterotoxina esta-filocócica.

Do exposto e, tendo em vista a falta,em nosso país, de investigações sobre fre-

qüência de S. aureus enterotoxigênico apartir de alimentos, planejou-se a presentepesquisa que tem por f inal idade determinara presença e número de S. aureus em docescremosos vendidos em padarias e confei-tarias do município de São Paulo; verificara capacidade produtora dos diferentes tiposde enterotoxina estafilocócica das cepas iso-ladas; e determinar os fagótipos de taiscepas, produtoras ou não de enterotoxina.

MATERIAL E MÉTODOS

Obtenção das amostras de doces cre-mosos — De 40 padarias e confeitariaslocalizadas no município de São Paulo foramadquiridas 100 unidades de doces expostosà venda para consumo, na quase totalidadesem refrigeração. O conjunto de amostrasestudadas, coletadas no período de novem-bro de 1975 a novembro de 1976, era cons-tituído de diferentes tipos de doces de con-sistência cremosa ou contendo creme natural(creme de chantili) ou artificial, de cober-tura e/ou de recheio assim distribuídos:bombas (36 unidades), bolos fatiados (17),folhados (13), sonhos (13), pudins (5),tortas (5), bombocados (4), pães doces comcreme (4) e quindim (3).

Logo após a sua obtenção, as amostraseram transportadas, o mais rapidamentepossível, ao laboratório e mantidas em gela-deira a 4°C até o início do exame. O tempodecorrido entre a coleta das amostras e oinício da análise foi no máximo, de umahora.

Preparo das amostras e de suas diluições— De cada amostra foram pesados, assépti-camente, 11 g de creme de recheio e/oude cobertura em frasco esterilizado de 250ml, redondo, de boca larga, com tampa devidro esmerilhado e contendo pérolas devidro. A seguir, foram adicionados 90 ml deágua fosfatada estéril, pH 7,2, a fim dese obter uma diluição inicial do creme a10-1 (Thatcher e Clark6 7 , 1973). Quandoo creme era artificial procedia-se, a seguir,a sua homogeneização por agitação manualvigorosa do frasco. Tratando-se de creme

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natural , antes da agitação a mistura eraaquecida a 40°C a fim de se obter a fusãodo creme. No caso dos doces de consistênciacremosa, o preparo da amostra e a di luiçãoinicial eram realizados da mesma forma,porém a partir de 11 g do produto.

Da diluição inic ia l , preparava-se umasérie de diluições decimais do creme, de10-2 a 10-5 empregando-se frascos de vidrocom rolhas de borracha, contendo 9 ml deágua fosfatada, pH 7,2 esterilizada.

Contagem, isolamento e identificação deStaphylococcus aureus — Na semeadurainicial, 0,2 ml de cada diluição do material(10-1 a 10-5) era depositado na superfíciede ágar Baird-Parker (Merck) em placas.O inóculo era espalhado em todo a super-fície do meio por intermédio de um bastãode vidro em "L" esterilizado e, em seguida,as placas eram incubadas em estufa a 37°Cpor 24-48 horas (Thatcher e Clark 6 7 , 1973).

Após a incubação procedia-se, nas placascom 30 a 300 colônias, a contagem das decor negra, brilhantes, com zona de precipi-tação em toda a sua borda e circundadapor um halo claro2. O cálculo presuntivodo número de S. aureus por grama domaterial examinado era feito, mul t ip l ican-do-se por 5 o número de colônias contadase, a seguir, multiplicando-se o resultadopela recíproca da diluição correspondenteà placa de contagem. A confirmação desseresultado ou a sua correção era feita apósa identificação das cepas referentes às co-lônias isoladas. A seguir, da placa de con-tagem procedia-se o isolamento de colônias,cujo número variou de um a cinco e, cadauma delas era semeada em um tubo deágar simples inclinado e este incubado a37°C por 24 h.

A partir das culturas em ágar simples in-clinado, preparavam-se esfregaços em lâ-minas, corados pelo método de Gram, paraa verificação microscópica da morfologiadas bactérias isoladas. Em seguida, par-

tindo-se dessas mesmas culturas, as cepasisoladas eram submetidas às provas dacatalase3 , da oxidação e fermentação daglicose (F/0)66, da coagulase74 e da deso-xirribonuclease (DNase)26.

Fagotipagem — A caracterização dostagótipos das cepas isoladas de S. aureusfoi realizada na Seção de Fagotipagem doLaboratório de Estreptococos e Estafilococosdo Departamento de Parasitologia, Micro-biologia e Imunologia da Faculdade de Me-dicina de Ribeirão Preto, da Universidadede São Paulo, sendo a metodologia adotadaa proposta por Blair e Williams10 (1961).Nas provas foram utilizados 23 fagos doconjunto básico internacional (Solé-Vernin 64,1976), 7 experimentais (fagos 86,88,89,90,92,D11 e HK2) e dois extras (187 e 42 D).Todas as cepas isoladas de S. aureus foramsubmetidas à ação de 1xRTD ("RoutineTest Dose") de cada cepa de bacteriófagoe quando não reagiam a esta dose, pro-cedia-se à prova com 100xRTD (Solé-Ver-n i n 6 4 , 1 9 7 6 ) .

Pesquisa da produção de enterotoxinapelas cepas isoladas — Na produção deenterotoxina pelas cepas isoladas, foi em-pregada a técnica da cul tura de S. aureusem saco de celofane, preconizada por Don-nelly e col.28 (1967), com base no estudorealizado por Simkovicova e Gilbert6 2

(1971). Na verificação da presença deenterotoxina nos extratos obtidos, a partirdas culturas das cepas estudadas, foi em-pregada a técnica da dupla imunodifusãoem ágar em lâminas (Siles-Villarroel60,1972), sendo utilizados como padrões asenterotoxinas A,B,C,D e E e as respectivasanti-enterotoxinas.*

RESULTADOS

Na Tabela 1 encontra-se a distribuiçãodas amostras de doces examinadas, segundoa positividade para S. aureus e o tipo de

* Preparadas e gentilmente fornecidas pelo Professor Merllin S. Bergdoll do "Food ResearchInstitute" da Universidade de Wisconsin, EUA.

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enterotoxina estafilocócica produzida apartir das cepas isoladas. Das 100 amostraspesquisadas, 38,0% revelaram-se positivaspara S. aureus, dos quais 7 (18,4%) apre-sentaram-se com cepas produtoras de ente-rotoxina estafilocócica.

Na Tabela 2 constam as 40 padarias econfeitarias das quais foram obtidos os

alimentos estudados, conforme a positividadepara S. aureus em doces nelas expostosà venda para consumo e o tipo de entero-toxina estafilocócica elaborada por cepasdeles isoladas. A presença de S. aureus foiverificada em 21 (52,5%) desses estabele-cimentos comerciais. Dos 21, em 7(33,3%)encontraram-se amostras com cepas produ-toras de enterotoxina estafilocócica.

Na Tabela 3 estão distribuídas as 38amostras positivas dos diferentes tipos dedoces examinados, segundo o número debactérias por grama do material analisado.Os valores obtidos na contagem de S. aureusvariaram de 5x10 a 30,5x106/g.

A Tabela 4 mostra a distribuição dasamostras examinadas segundo a contagem de

S. aureus por grama de creme ou de docede consistência cremosa e a presença decepas produtoras de enterotoxina estafilo-cócica. Os valores foram distribuídos emoito classes, sendo a primeira (0 a 5x10S. aureus/g) a que encerra os resultadosconsiderados negativos. Isto é devido aoprocesso de contagem usado, pois com ele,

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teoricamente, só se poderia obter cresci-mento de colônias de S. aureus, nas placascorrespondentes à primeira diluição usada,quando o seu número fosse igual ou superiora 50/g do material analisado. Por essarazão, 62(62,0%) amostras foram conside-radas negativas. Com relação às amostrasposititivas, as contagens de S. aureus, consi-derando-se as classes estabelecidas variaramentre 5x10 a 102 e 107 ou mais por gramaao material examinado.

Na Tabela 5 encontra-se a distribuiçãodos valores relativos à contagem de S.aureus que é semelhante a da tabela an-terior; entretanto, os percentuais das amos-tras de cada classe foram calculados emrelação ao total de doces positivos paraS. aureus. Outrossim os percentuais dasamostras positivas para cepas enterotoxi-gênicas foram calculados considerando-se ototal de amostras da classe correspondente.

Na Tabela 6 estão distribuídas as amos-tras estudadas, segundo o tipo de doce,a positividade para S. aureus e o tipo deenterotoxina elaborado pelas cepas isoladas.Do total de doces estudados, 36,0% eramconstituídos por amostras de bombas dasquais 11 (30,6%) foram positivas para S.aureus; 35,0% foram tortas, bolos e folha-dos fatiados, com 18(51,4%) amostraspositivas; 13(13,0%) foram sonhos, dasquais 4(30,8%) mostraram-se positivas;12(12,0%) vieram de pudins, bombocadose quindins, sendo 4(33,3%) positivas e,4(4,0%) de pães doces com creme, dosquais um (25,0%) foi positivo para S. aureus.

Das 18 amostras positivas para S. aureus,do conjunto composto por tortas, bolos efolhados, das 4 de sonhos e das 4 do grupoformado por pudins, bombocado e quindins,obteve-se o isolamento de cepas produtorasde enterotoxina de 4(11,4%), 1(7,7%) e2(16,6%) respectivamente.

A Tabela 7 mostra a distribuição dascepas de S. aureus isoladas a partir dasamostras examinadas, segundo o resultadoda fagotipagem e a produção de entero-toxina. Do total das cepas, 39(51,5%) não

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fo ram usadas por nenhum dos fagos dosconjuntos básico internacional , experimentale extra empregados. As demais cepas foramusadas pelos fagos u t i l i zados , isoladamenteou em associação.

Na Tabela 8 encontram-se as 76 cepas deS. aureus ¡soladas, distribuídas segundo afagotipagem e a sua relação com as 38amostras positivas e as 21 padarias e con-feitarias, das quais foram obtidos tais pro-dutos.

DISCUSSÃO

Como evidencia a Tabela 1, revelaram-sepositivas para S. aureus 38,0% das 100amostras de doces examinadas. Este por-centual poderia ser maior se tivesse sidofei ta a simples verif icação da presença deS. aureus nesses produtos, por meio detécnicas de enr iquec imento 6 7 . Por estastécnicas a pesquisa de S. aureus pode serrealizada a par t i r de quant idade maior de

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mate r i a l to rnando, portanto, também maio ra possibilidade de isolamento dessa bac tér ia ,o que não ocorre quando se empregam pro-cessos de contagem. Ainda assim, apesarde ter sido usado um processo de contageme não de enr iquecimento, o percentual deposit ividade para S. aureus observado podeser considerado alto. Ainda na Tabela 1,pode-se ve r i f i c a r que 18,4% das amostraspositivas, ou seja, 7,0% do total exami-nado cont inham cepas enteroxigênicas.

Analisando-se a Tabela 2 observa-se queos 38 doces positivos para S. aureus f o ramobtidos de 21(52,5%) das padarias e con-fei tar ias visitadas e que em um terçodestas (33,3%) vendiam-se doces com cepasprodutoras de enterotoxina estafilocócica.Estas observações revelaram çue a presençade S. aureus foi muito f reqüente nessesestabelecimentos. Entretanto, é necessárioque estas bactérias se m u l t i p l i q u e m noal imento até a t ingirem números suficiente-mente elevados, para que a produção de

en te ro t ix ina seja e f i c a z em ocasionar mani-festações clínicas de intoxicação em seusconsumidores2 Segundo Peterson e col.5

(1962), para um a l imento causar in toxi-cação a l imen ta r estafilocócica, o número deS. aureus deve a t ingi r 106 a 109 /g doproduto. Em 1966, Donnelly e col.28 (citadospor Jay 44, 1973) ve r i f i ca ram que em leite sãonecessários 108 ou mais S. aureus por mlpara haver enterotoxina em quantidadedetectável. Hobbs em 1968 (citada por Jay4 4 ,1973) considera que em alimentos, em geralo número de S. aureus deve atingir, nomínimo, 5x105/g para haver produção deenterotoxina suf ic ien te para ocasionar mani-festações de in toxicação alimentar.

Gi lber t e col.37 (1972), examinando ali-mentos associados a 39 surtos de intoxi-cação a l imen ta r estafilocócica, obtiveramcontagem de S. aureus que variaram de 7,5x105 até mais de 109/g. Um desses surtosfoi devido a doce com creme, os quais con-t i n h a m 15x107 de S. aureus por grama

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Gilbert3 5 (1974) referindo 53 surtos deintoxicação alimentar relatou que os númerosde S. aureus encontrados nos alimentos en-volvidos variaram de 1,2 x105 a 109 oumais por grama. Entretanto, em 4 destessurtos oscilou de 105 a 10 6/g.

Segundo Angelotti 1 (1969) as quantidadesde enterotoxina tidas como capazes deocasionar sintomas de intoxicação alimentarem pessoas sensíveis são meramente espe-culativas, porquanto tais valores são esti-mados com base na sensibilidade dos pro-cessos de determinação da enterotoxinaestafilocócica por métodos de imunodifusãoem ágar. Este autor, assim como Casmanne Bennett14 (1965), admitem que sejamnecessários 1 a 5 mg deste produto tóxicopara causar manifestações patológicas nohomem. Porém Bergdoll5 (1973) afirma quea quantidade de enterotoxina requerida paraocasionar sintomas em pessoas acredita-seser menor que 1 mg.

De acordo com a Tabela 4, pode-se veri-ficar que das 100 amostras examinadas, 7continham 105 ou mais S. aureus/g; destas,2 apresentaram-se com cepas produtoras,respectivamente, de enterotoxinas C e D.Em todas as classes que compreendem ali-mentos com números de S. aureus entre5x10 e 10 5 /g do alimento exclusive, foramconstatadas cepas produtoras de enteroto-xinas B ou C.

Da Tabela 5 depreende-se uma tendênciados resultados em mostrar relação entre aquantidade de S. aureus/g do materialanalisado e a presença de cepas enterotoxi-gênicas; entretanto, o número reduzido deobservações não permite conclusão defini-tiva a esse respeito. Assim, excluindo-se aclasse correspondente às contagens de S.aureus de 104 a 105 exclusive, as positi-vidades para cepas enterotoxigênicas, comrelação às demais classes de 5x10 a 10-até 10 7 ou mais, foram de, respectivamente,14,2%, 15,4%, 20,0% e 100,0%.

Analisando-se a Tabela 6 observa-se queembora as bombas com creme tenhamapresentado alta percentagem (30,6%) de

amostras contaminadas com S. aureus, denenhuma delas conseguimos isolar cepasenterotoxigênicas dessa bactéria. Por outrolado, bolos e folhados com creme de recheioe/ou de cobertura revelaram-se com o maiorporcentual de positividade (51,4%). Das 35amostras deste grupo, 4(11,4%) forampositivas para cepas produtoras de ente-rotoxina do tipo C, sendo duas a partirde dois bolos, uma de torta e uma defolhado. Pudins, bombocados e quindinsrevelaram-se com positividade também alta(33,3%), ocupando o segundo lugar, dentreos doces estudados, quanto à presença deS. aureus. De duas amostras de pudimforam isoladas cepas produtoras de entero-toxina, respectivamente, dos tipos C e D.A cepa produtora de enterotoxina D foi iso-lada de uma amostra de pudim coberta com"fios de ovos", revelando contagem de S.aureus de 3x107/g do produto. Destaamostra foram isoladas quatro cepas de S.aureus, verificando-se que três não eramenterotoxígenas e uma era produtora deenterotoxina do tipo D. Admitindo-se queas quatro colônias foram representativas dototal de colônias da placa de contagemcorrespondente, dos 3x107 S. aureus/g doproduto, 7,6x106/g seriam produtores deenterotoxina. Cumpre salientar que alimentosrevelando contagem de S. aureus de 105

a 106/g têm sido responsabilizados porsurtos de intoxicação alimentar35.

Relativamente às amostras de sonho comcreme, observou-se também positividade alta(30,8%). De uma das quatro amostras posi-tivas para S. aureus isolou-se uma cepaprodutora de enterotoxina do tipo B.

Os pães doces cobertos com creme foramos que se revelaram com menor positividadepara S. aureus. Das quatro amostras exami-nadas, obtidas de estabelecimentos dife-rentes, em apenas uma foram constatados50 S. aureus/g (Tabela 3). As três amostrasrestantes foram negativas para esta bac-téria.

Na Inglaterra, estudos realizados 36,37,62

mostram que há uma predominância decepas produtoras de enterotoxina do tipo

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A, nos alimentos envolvidos em surtosde intoxicação alimentar estafilocócica,incluindo produtos de confeitaria. Entre-tanto, Wieneke 69 (1974) constatou que eramenos freqüente a produção de enteroto-xina dos tipos A,B,C e E por cepas isoladasde alimentos crus como frangos, carne, leitee queijo do tipo "Cheddar", do que entreas obtidas a partir de produtos cozidos.Nestes alimentos era mais freqüente o isola-mento de cepas produtoras de enterotoxinado tipo D.

No Brasil, Dellazari e Leitão25 (1976),em 106 cepas de S. aureus enterotoxígenas,isoladas de macarrão de produção comer-cial, ver if icaram que 31,1% eram produtorasde enterotoxina do tipo A, 12,2% do D,7,5% do B e 3,7% do E; 4,5% das cepasproduziram, simultaneamente, enterotoxinasdos tipos A e B. Houve, portanto, predomi-nância de cepas produtoras de enterotoxinado tipo A. No presente estudo, das 76 cepaspesquisadas, 7(9,2%) mostraram-se entero-toxígenas, das quais 5(71,4%) produziramenterotoxina do tipo C, uma (14,3%) doB e uma (14,3%) do D, predominando,portanto, as produtoras de enterotoxina dotipo C.

Produtos de confei tar ia , segundo a lite-ratura a esse respeito, são freqüentementeresponsabilizados por surtos de intoxicaçãoa l imen ta r estafilocócica 17,32,44,48.

Em nosso país, tanto a estrutura quantoos caracteres epidemiológicos de intoxicaçãoalimentar estafilocócica são desconhecidos,dada a fa l ta de dados sobre a ocorrênciade surtos dessa doença, adequadamentediagnosticados. Isto deve-se, em parte, à faltade notificação e, nos casos comunicados, anão existência de condições laboratoriaisnecessárias à realização do diagnóstico decerteza.

Neste estudo procuramos verif icar , tam-bém, se havia relação entre os resultadosda fagotipagem e a produção de enteroto-xina. Analisando-se, porém, a Tabela 7,observa-se alto porcentual (51,5%) de cepasde S. aureus não sensíveis a nenhum dos

fagos pertencentes ao conjunto básico inter-nacional nem aos fagos experimentais eextras utilizados. Verifica-se, também, queentre as 39 cepas não tipáveis estão in-cluídas as 9 (23,1%) produtoras de entero-toxina. Ainda na Tabela 7, pode-se observarque 37 (48,5%) cepas foram usadas porum ou mais fagos. Destas, 35 (94,6%)foram sensíveis a fagos do conjunto básicointernacional sendo-o, algumas vezes, tam-bém, aos fagos extras. Apenas duas cepasforam usadas somente pelos fagos 88 e88/HK2, respectivamente. O emprego dosfagos experimentais 86,88,89,90,D11 e HK2permitiu que somente duas cepas não fossemincluídas entre as não tipáveis. Entretanto,ainda assim, o número de cepas não tipáveisfoi muito alto.

Deve-se salientar, por outro lado, que 1 1(14,6%) cepas foram sensíveis ao fago 29e 5 (6,6%) ao 52, em ambos os casosisoladamente, sendo estas freqüências asmais altas observadas, excetuando-se a dascepas não tipáveis. Porém, do total de cepas,16 (21,0%) foram usadas pelo fago 52,isoladamente ou em associação, ocorrendo omesmo em 15 (19,7%) com relação ao 29.Das 37 cepas fagotipáveis, nenhuma delasrevelou capacidade produtora de enteroto-xina .

No Brasil, Lopes49 (1972), de 50 cepasde S. aureus isoladas de pescado, 66,0%foram sensíveis aos fagos 52/52A/80, sendoas mais freqüentes, e 26,0% ao fago 29.Em seu estudo, apenas uma cepa não eratipável (2,0%) pelos fagos do conjuntobásico. Em outra pesquisa, Lopes e col.50

(1973) verif icaram que de 60 cepas de S.aureus isoladas de produtos cárneos embu-tidos 30,0% mostraram-se não sensíveis aosfagos do conjunto básico. Das 42 cepastipáveis, 18,8% foram usadas pelo fago 86isoladamente e 12,0% pelos fagos 29/52/52A/80/81.

Analisando-se a Tabela 8, pode-se de-preender que entre as cepas tipáveis de S.aureus, houve predominância das que foramusadas por fagos do grupo I, isoladamente(21,2%). Entretanto, considerado-se, tam-

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bém, a sua associação com os fagos dogrupo II, NC e extra, esse porcentual seelevou a 35,5%, fração que compreende27 cepas; foram, também, apreciavelmentefreqüentes as cepas sensíveis aos fagosdo grupo NC, pertencentes ao con-junto básico internacional. Isoladamente,uma cepa (1,3%) mostrou relação com fagosdeste grupo mas, levando-se em conta asassociações com fagos dos grupos I, III eextra, o número elevou-se a 14 (18,4%).

De alimentos associados a surtos de into-xicação alimentar isolam-se comumentecepas de S. aureus sensíveis a fagos dogrupo I I I 5 1 ou dos grupos I/III 62,69.

Ainda na Tabela 8 verifica-se que cepasde S. aureus, não relacionadas aos fagosempregados foram isoladas de 22 amos-tras de doces produzidas e vendidas em16 (76,2%) das 40 padarias e confeitarias.Isso mostra que cepas não tipáveis forammuito freqüentes nos estabelecimentos visi-tados. Por outro lado, quanto às cepas quese mostraram sensíveis a um ou mais dosfagos empregados, verifica-se que as rela-cionadas com o grupo I foram mais freqüen-temente encontradas em doces de grandenúmero das padarias e confeitarias visitadas.

Do ponto de vista epidemiológico os re-sultados obtidos nesta investigação mostramque, se os alimentos examinados estivessemassociados a casos de intoxicação alimentar,seria impossível estabelecer relação com afonte de sua contaminação, visto que as 9cepas enterotoxígenas isoladas (Tabela 9)não foram sensíveis a nenhum dos fagosempregados e, das tipáveis, todas se com-portaram como cepas não produtoras deenterotoxina. Assim, mesmo que fossemisoladas cepas de S. aureus não tipáveis,dos manipuladores desses produtos positivospara cepas enterotoxígenas, não se poderialocalizar com certeza a fonte de contami-nação, ainda que tais cepas fossem, tam-bém, produtoras de enterotoxina estafilocó-cica. Um resultado dessa natureza poderia,no máximo, sugerir uma relação entre oproduto contaminado e a fonte de sua conta-minação. É importante salientar que a pre-

sente investigação mostra que os docescremosos ou contendo creme podem veicularS. aureus enterotoxígeno, devendo ser umelemento importante na cadeia epidemioló-gica da intoxicação alimentar estafilocócicaem nosso meio. Deve-se considerar, ainda,que estes produtos, após a sua elaboração,são consumidos, obviamente, sem tratamentoalgum e por pessoas de todas as idades,incluindo crianças, nas quais os processosgastrintestinais são muito sérios, por mo-tivos já bastante conhecidos.

A freqüência de 7,0% de amostras con-tendo cepas de S. aureus enterotoxigênicaspoderia ser interpretada como baixa. Deve--se levar em conta, porém, que apenas 40padarias e confeitarias foram visitadas eque cerca de 50,0% delas vendiam docescremosos positivos para S. aureus e destas33,3% com cepas enterotoxígenas, ou seja,17,5% do total visitado. Por outro lado,o número desses estabelecimentos na cidadede São Paulo é muito alto, sendo tambémalto o número de unidades desses produtosvendidos diariamente.

Do exposto pode-se salientar que me-didas de profilaxia da intoxicação alimentarestafilocócica se fazem necessárias, envol-vendo a educação sanitária dos que mani-pulam e comercializam este tipo de alimento,o que se constitui em tarefa dif íci l de serdesenvolvida.

Dack2 2 (1964) recomenda como medidade profilaxia, além da educação sanitáriados manipuladores, a conservação sobrefrigeração dos produtos recheados comcreme ou reaquecimento desses produtosapós o seu preparo, em temperaturas entre190,6°C e 218,3ºC por 30 min. Segundo esseautor, os produtos reaquecidos mostramapós esse tratamento, apenas discretasalterações de aspecto e sabor.

CONCLUSÕES

1 , Das 100 amostras de doces examinadas38,0% foram positivas para S. aureuse 7,0% continham cepas produtoras deenterotoxina B, C ou D.

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2 Em alta proporção das 40 padarias econfeitarias visitadas (52,5%) comer-cializavam-se doces contaminados comS. aureus e em 17,5%, doces com cepasprodutoras de enterotoxina estafilocó-cica.

3 Do total de doces examinados, 7,0%continham 105 ou mais de S. aureuspor grama, número tido como limite apartir do qual o alimento pode pro-vocar intoxicação alimentar.

4 Das 38 amostras positivas para S.aureus, 5(13,2%) continham cepas pro-dutoras de enterotoxina estafilocócica dotipo C, sendo este o predominante. Uma(2,6%) apresentou cepas produtoras deenterotoxina do tipo B e outra (2,6%)do tipo D.

í. Das 76 cepas de S. aureus isoladas, umalto porcentual (51,5%) não se mostrou

sensível a nenhum dos fagos do conjuntobásico internacional nem aos exeperi-mentais e extras utilizados. Neste grupode cepas estão incluídas as 9(11,8%)produtoras de enterotoxina estafilocó-cica.

6. Entre as cepas fagotipáveis houve pre-dominância das que foram usadas porfagos do grupo I isoladamente (21,2%)ou em associação com fagos de outrosgrupos (35,5%). Em segundo lugaraparecem as cepas sensíveis a fagos dogrupo não classificado do conjuntobásico internacional ou em associação(18,4%).

7. Cepas não tipáveis de S. aureus estavampresentes em doces de 76,2% das pa-darias e confeitarias em que houveamostras positivas para essa bactéria.

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ABSTRACT: One hundred samples of creamy sweets were collectedfrom 40 bakeries in the city of S. Paulo (Brazil), for the determination ofStaphylococcus aureus counts per gram of food. After morphological andbiochemical identification, phagetyping was performed and production ofenterotoxin verified. Of the samples collected 38.0% were positive forStaphylococcus aureus. These samples came from 21 (52.5%) of the 40bakeries. Of those positive, 7.0% were positive for enterotoxin, 5.0% fortype C, 1.0% type B, and 1.0% type D. Of the 76 strains of Staphylococcusaureus isolated, 39 (51.5%) could not be classified according to knownphagetypes. Of the remainder, those lysed by group I phages alone orassociated to other groups predominated (21.2% and 35.5% respectively).Strains not classified under known phagetypes were isolated from 76.2%of positive establishments.

UNITERMS: Staphylococcus aureus. Enterotoxins. Staphylococcal foodpoisoning.

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Recebido para publicação em 11/12/1980

Aprovado para publicação em 11/03/1981