selbstreplizierende nicht-virale episomen ... selbstreplizierende nicht-virale episomen...

Selbstreplizierende nicht-virale Episomen (Minicircles): Expressionseigenschaften und

Etablierung im Zellkern

Von der Fakultät für Lebenswissenschaften

der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina

zu Braunschweig

zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

genehmigte

D i s s e r t a t i o n

von Sandra Verena Ursula Broll

aus Dortmund

1. Referent: apl. Prof. Dr. Jürgen Bode 2. Referent: Prof. Dr. Stefan Dübel eingereicht am: 30.03.2009 mündliche Prüfung (Disputation) am: 06.08.2009 Druckjahr 2009

Vorveröffentlichungen der Dissertation

Teilergebnisse aus dieser Arbeit wurden mit Genehmigung der Fakultät für Lebenswissenschaften, vertreten durch den Mentor der Arbeit, in folgenden Beiträgen vorab veröffentlicht:

Publikationen

Nehlsen K.*, Broll S.*, Bode J. (2006): Replicating minicircles: Generation of nonviral episomes for the efficient modification of dividing cells. Gene Ther. Mol. Biol. 10: 233-244.

Iqbal K., Barg-Kues B., Broll S., Bode. J., Niemann H., Kues W. A. (2009): Cytoplasmic injection of circular plasmids allows targeted expression in mammalian embryos. BioTechniques 47 (5): 959–968.

Populärwissenschaftliche Artikel

Broll S., Nehlsen K. & Bode J. (2007): Kleine Kreise mit großem Potenzial. Chem. Rundschau 2007(1-2): 40-41.

Tagungsbeiträge

Nehlsen K., Broll S. & Bode J. Episomal Replicating Minicircles. Tagungsbeitrag. EpiVector Meeting, 3.-4.2.2006, Amsterdam.

Broll S., Nehlsen K. & Bode J. Replicating minicircles: Generation of nonviral episomes for the efficient modification of dividing cells. Tagungsbeitrag. ESGT/CliniGene Satellite, 9.-10.11.2006, Athen.

Nehlsen K., Broll S., Oumard A., Qiao J. & Bode J. Chromosome-based Vectors for Predictable Antibody Production. Tagungsbeitrag. Antibody Workshop TU Braunschweig, 6.-7.12.2006, Braunschweig.

Nehlsen K., Broll S., Kandimalla R. & Bode J. Generation of stable, nonviral replicating minicircles by the use of S/MAR elements. Tagungsbeitrag 1st International Workshop on Minicircle-DNA, 22.2.-23.2.2007, Bielefeld.

Nehlsen K., Broll S., Kandimalla R. & Bode J. Chromosome-based Expression Systems: Origin, Applications an Performance. Tagungsbeitrag. CliniGene 1st Anniversary meeting, 30.3.-1.4. 2007, Annecy.

Nehlsen K., Broll S., Kandimalla R. & Bode J. Generation of stable, nonviral replicating minicircles by the use of S/MAR elements. Tagungsbeitrag. CliniGene Training Course, 12.-13.7.2007, Barcelona.

Broll S., Nehlsen K., Oumard A. & Bode J. S/MARs enable the Generation of Nonviral Replicating Minicircles. Poster. Moleda Summer School - Non-viral gene transfer into muscle and skin, 16.-22.9.2007, Evry-Maison Alfort.

Broll S., Nehlsen K., Oumard A., Bode J. S/MARs enable the generation of nonviral replicating minicircles. Tagungsbeitrag UC Davis Transgenic Animal Research Conference VI. 12.-16.8.2007, Granlibakken/Lake Tahoe. Abstract: Transgenic Research. Oct. 2007, 16: 839-863

Broll S., Nehlsen K., Bode J. Replicating Non-Viral Minicircles: Novel Tools for Predictable Transgenesis. Tagungsbeitrag ESGCT, 27.-30.10.2007, Rotterdam. Abstract: Human Gene Therapy. Oct. 2007, 18(10): 941-954

Broll S., Kandimalla R. Oumard A. & Bode J. Replicating nonviral minicircles for protein production in eukaryotic cell lines. Tagungsbeitrag. INFORMA, 3.3.2008, Prag.

Broll S., Oumard A. & Bode J. Replicating nonviral minicircles: Novel tools for predictable transgenesis. Tagungsbeitrag. CliniGene 2nd Anniversary meeting, 3.- 7.4.2008, Annecy.

Broll S., Nehlsen K., Oumard A. & Bode J. Replicating nonviral minicircles: Novel Tools for the predictable transgenesis of dividing cells. Tagungsbeitrag. 2nd International Workshop on Minicircle-DNA, 7.5. – 9.5.2008, Bielefeld.

Broll S., Oumard A. & Bode J. Prediction of gene-regulatory and replication functions by SIDD structure analysis. Tagungsbeitrag. ESGCT/CliniGene Satellite, 13.11.2008, Brügge.

Broll S., Oumard A., Benham C., Goetze S. & Bode J. Prediction of gene- regulatory and replication functions by SIDD structure analysis. Tagungsbeitrag. ESGCT, 16.11.2008, Brügge. Abstract: Human Gene Therapy. Oct. 2008, 19(10): 1060–1075.

Qiao J., Broll S., Oumard A. & Bode J. Chromatin minidomains in research and protein production. Tagungsbeitrag. INFORMA, 2.-3.3.2009, Berlin.

Broll S., Oumard A. & Bode J. Replicating Nonviral Minicircles: Novel Tools for Predictable Transgenesis. Tagungsbeitrag. CliniGene 3rd Anniversary meeting, 2.- 5.4.2009, Annecy.

Qiao J., Broll S., Oumard A. & Bode J. Novel chromosome-based vectors: Chromatin minidomains and minicircles. Tagungsbeitrag. BSGT Annual Conference, 21.-23.4.2009, London.

Inhalt i

Inhalt

Inhalt .......................................................................................................................... i 

I.  Zusammenfassung ........................................................................................... v 

1.  Einleitung........................................................................................................... 1 

1.1  Der Zellkern ................................................................................................. 1 

1.1.1  Die Organisation des Chromatins und der Histon Code .......................... 2 

1.1.2  Die Kernmatrix ......................................................................................... 3 

1.1.3  Scaffold/Matrix Attachment Regions (S/MARs) ....................................... 4 

1.2  Der Zellzyklus .............................................................................................. 7 

1.3  Gentherapie ................................................................................................. 8 

1.3.1  Virale Vektoren in der Gentherapie ......................................................... 9 

1.3.2  Nicht-virale Alternativen: Von der Plasmid-DNA zu Minicircles ............. 10 

1.3.3  pEpi – ein episomal replizierendes Plasmid zum nicht-viralen Gentransfer ............................................................................................ 13 

1.4  Sequenzspezifische Rekombination und das Flp/FRT-System ................. 14 

1.5  Aufgabenstellung ....................................................................................... 16 

2.  Ergebnisse....................................................................................................... 17 

2.1  Etablierung eines episomal replizierenden Minicircle-Vektors in verschiedenen eukaryotischen Zelllinien .............................................................. 17 

2.1.1  Etablierung und Expressionsverhalten der episomal replizierenden Vektoren ................................................................................................ 17 

2.1.2  Untersuchung des episomalen Status durch Southern Blot-Analysen .. 20 

2.1.3  Nachweis des episomalen Status mit FISH ........................................... 23 

2.2  Untersuchungen an CHO-K1-Klonen ........................................................ 25 

2.2.1  Generierung und Charakterisierung der CHO-K1-Klone ....................... 25 

2.2.2  Stabilität des episomalen Zustandes und der Transgenexpression des Minicircle-Vektors nach Kryokonservierung der CHO-K1-Klone .... 29 

2.2.3  Untersuchung von Deletionsereignissen in der Minicircle-DNA ............ 31 

2.3  Charakterisierung eines größenreduzierten S/MAR-Elements .................. 33 

2.3.1  Sequenzanalyse und biomathematische Vorhersage des S/MAR- Charakters eines größenreduzierten S/MAR-Elements ........................ 33 

2.3.2  Herstellung eines replizierenden Minicircles-Vektors auf der Grundlage des größenreduzierten S/MAR-Elements M18 .................... 36 

2.3.3  Vergleich von M18- und SAR E-basierten Minicircle-Vektoren ............. 37 

2.3.4  Vergleich von M18- und SAR E-basierten pEpi-Vektoren ..................... 40 

ii Inhalt

2.3.5  Untersuchung der transkriptionellen Termination in episomal replizierenden SAR E- und M18-Vektoren ............................................ 43 

2.4  Konzeption, Produktion und Charakterisierung eines industriell hergestellten, episomal replizierenden Minicircle-Vektors .................................... 46 

2.4.1  Vergleich der mittels unterschiedlicher Herstellungsverfahren erzeugten Minicircle-Vektoren ............................................................... 47 

2.5  Transfektionseffizienz und Etablierungsrate eines Minicircle-Vektors in Abhängigkeit von Zellzyklusphase und Chromatinstruktur ................................... 50 

2.5.1  Synchronisation von CHO-K1-Zellen und Transfektion in verschiedenen Zellzyklusphasen ........................................................... 51 

2.5.2  Einfluss der Zellzyklusphase und der Chromatinstruktur auf die transiente Expression von Minicircle-DNA ............................................ 54 

2.5.3  Einfluss der Zellzyklusphase und der Chromatinstruktur auf die Etablierung des episomal replizierenden Minicircle-Vektors ................. 55