san xuat protein g csf 3

SẢN XUẤT PROTEIN G-CSFGranulocyte-colony stimulating factor

Nguyễn Đặng Thanh Hảo 1218094Trần Khắc Huy 1218139Phạm Đăng Huy 1218138Nguyễn Văn Hùng 1218145Lê Đăng Lộc 1218201

GIỚI THIỆU VỀ GCSF VÀ CÁC ĐẶC ĐIỂMI

TẠO DÒNG VI SINH VẬT BIỂU HIỆN GCSF TÁI TỔ HỢP

QUY TRÌNH LÊN MEN

TINH CHẾ

II

III

IV

NỘI DUNG

I/ GIỚI THIỆU G-CSF VÀ CÁC ĐẶC ĐIỂM

1/ Giới thiệu G-CSF(Granulocyte-Colony Stimulating Factor) chức năng

kích thích nguyên bào tủy tái sinh, phát triển và biệt hóa tạo bạch cầu hạt trung tính.

Bối cảnh:

Hóa trị (điều trị ung thư)

Bạch cầu giảm (Bệnh

Neutropania)

Ngưng hóa trị

Cần sử dụng GCSF

Nhu cầu sản xuất quy mô CN


G-CSF giúp tế bào gốc máu biệt hóa thành tế bào bạch cầu hạt trung tính

1. Đặc điểm gen

Mã hóa cho hai mRNA khác nhau

Thuộc locut q21-22

Gồm 5 exon và 4 intronKích thước: 2.5 Kb

G-CSF 174 acid amin G-CSF 177 acid amin

Gen

mRNA

Protein

Chiếm ưu thế và có hoạt tính mạnh hơn

NST 17


2. Đặc điểm protein

G-CSF 174 acid amin- Tồn tại ở dạng glycoprotein- Trọng lượng 18,7 kDa

a. Cấu trúc chuỗi polipeptide

G-CSF 177 acid amin có thêmGlu, Ser, Val


2. Đặc điểm protein

Vị trí O-glycosyl hóa tại Thr 133

a. Cấu trúc chuổi polipeptide1 cysteine tự do ở vị trí Cys17

Hai cầu nối disulfide

Cys36 - Cys42

Cys64 - Cys74

17

36

42 64

74

133


b. Cấu trúc không gian ba chiều

Cấu trúc protein G-CSF. A. Mô hình cấu trúc phẳng B. Cấu trúc không gian

- 4 xoắn α đối song và xoắn trái

- Một xoắn phụ nhỏ nằm trong vùng vòng nối giữa xoắn A và xoắn B.


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 17

172 173 174

35 46


II/ NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VI SINH VẬT BIỂU HIỆN G-CSF TÁI TỔ HỢP

Chọn hệ thống TB chủ

Chọn chiến lược biểu

hiện

Tối ưu hóa gen

Dung hợp gen với các phần phụ

1/ Hệ thống tế bào chủ

Hệ thống TB chủ nào phù hợp?

Tiêu chí trong sản xuất G-CSF tái tổ hợp E. coli P. pastoris

Hiệu quả kinh tế x xQuy trình sản xuất:_ Tốc độ tăng trưởng tb chủ cao_ Dễ kiểm soát quy trình uôi cấy_ Lượng G-CSF được tạo ra lớn

xxx

xxKhông đạt

Biến đổi G-CSF sau dịch mã_ O-glycosyl hóa_ Cầu nối disulfide

Không đạtx (*)

xx

Quy trình tạo dòng tb chủ đơn giản x x

Độ ổn định của gene mục tiêu trong tb x x (*)

Mức độ biểu hiện Cao Thấp - Cao

Tại sao không chọn các chủng chủ khác như động vật hữu nhũ hoặc tế bào côn trùng?


Kinh tế

• Năng suất thấp hơn

• Nuôi cấy tốn kém

Kỹ thuật

• Tế bào chuyển gen không ổn đinh.

• Glycolsyl hóa không ảnh hưởng tới hoạt tính GCSF

không cần sử dụng tế bào ĐV

• Quá trình nuôi cấy và chuyển gene phức tạp.

• Thời gian nuôi cấy lâu

Các chiến lược biểu hiện

E. coli

Dạng tiết ra ngoại bàoP. pastoris

Dạng thể vùi trong tế bào chất

Dạng tan trong tế bào chất

Dạng tiết ra chu chất


2/ Tối ưu hóa và dung hợp gen với các phần phụ

2.1/ Tối ưu hóa gen mục tiêu

Trình tự gen G-CSF người được lấy từ ngân hàng gen trên NCBI

-> cần tối ưu hóa để có thể biểu hiện trên E. coli và P. pastoris.

o Dùng phần mềm tin sinh học để phân tích, thay đổi vài codon dựa theo tần số sử dụng codon ở tế bào chủ biểu hiện:

• g-csfmE : tế bào chủ biểu hiện gene là E. coli

• g-csfmY : tế bào chủ biểu hiện gene là P. pastoris

o Đánh giá độ tương đồng của protein G-CSF được dịch mã so với protein ban đầu.

2.2/ Dung hợp gen với các phần phụ

Thể vùi trong tế bào chất

Tan trong tế bào chất

Tiết ra chu chất

Tiết ra ngoại bào

Các gen sẽ được dung hợp thêm với các thành phần đề phù hợp với 4 chiến lược biểu hiện:


Chiến lược Thành phần

Plasmid bổ sung

Thể vùi

6HIS: thẻ tinh chếTEV: trình tự nhận biết của TEV protease


FTNH: cải thiện tính tan của protein trong E. coli

plasmid pDnaK: chứa gen mã hóa cho chaperone DnaK hỗ trợ gấp cuộn


SP: chuỗi tín hiệu tiết (ra ngoài chu chất)


αMF: giúp GCSF được tiết ra ngoại bào


a. Thể vùi: Do E. coli không có chaperon gấp cuộnprotein không tantạo thể vùi.

Việc loại bỏ thẻ HIS ảnh hưởng tới hiệu suất thu nhận proteinTiến hành nghiên cứu theo hai hướng: Có thẻ HIS Không có thẻ HIS

b. Tan trong tế bào chất:

Dung hợp

chuỗi nặng FTNH

Plasmid

pDnaK mã hóa

chaperone DnaK

Hỗ trợ GCSF tan


c. Tiết ra chu chất:

• Giúp protein được nhận diện bởi hệ thống vận chuyển màng

• Giúp protein giữ được cấu trúc sơ cấp trong suốt qúa trình vận chuyển.

Chức năng của SP

Oxi hóa: hình thành cầu nối disulfide giữa các cysteineĐồng phân hóa: sửa chữa các cầu nối không chính xác

Vai trò của họ protein Dsb


Các vector và các chủng tế bào chủ

Chiến lược Vector lưu trữ Vector biểu hiệnTB tạo dòng/TB

biểu hiện

Dạng thể vùi

pUC57

pET28b

E. Coli DH5/E. coli BL21 (DE3)


pET28a, pDnaK

Tiết ra chu chất pET28b

Tiết ra ngoại bào pZEROpPICZA (Invitrogen)

E. Coli DH5/ P. pastoris GS115


1L 5L50L

Dạng thể vùi

Tan trong TB chất



Dạng thể vùi (Tối ưu)

1. Quy mô

III. QUY TRÌNH LÊN MEN

Các dạng biểu hiệnThể vùi Tan trong

TB chấtTiết ra chu chất


Thể tích lên men 1L 1L 1L 1L

Thời gian lên men 24g 24g 24g 96g

Mật độ tế bào

Sinh khối thô (g/L)

%G-CSF/protein tổng 50,1 33,1 11,0 31,8

Tổng lượng protein thu được trong các pha chưa G-CSF của 1 lít dịch lên men (g)

Lượng G-CSF (g/L) 1,831 0,289 0,158 0,109

Hiệu quả thu nhận G-CSF (%) 19,86 8,17 2,5 0,16

Tiến hành đo và so sánh các dạng biểu hiện:

Kết quả: xác định được dạng biểu hiện G-CSF ở thể vùi trong tế bào chất) là tối ưu nhất.


2. Phương pháp thu và phá vỡ tế bào, thu nhận chu chất

a. Phương pháp thu tế bào

Hai phương thức thu sinh khối đối với E.coli được dùng rộng rãi: ly tâm lọc tiếp tuyến.

lọc tiếp tuyến giảm thể tích ở giai đoạn ban đầu và ly tâm thu nhận sinh khối ở giai đoạn sau.



Phương thức thu sinh khối bằng phương pháp lọc tiếp tuyến (bên phải)

b. Phá vỡ tế bào và thu nhận chu chất

Các phương pháp phá màng: máy phá tế bào, sử dụng dung môi, sử dụng các loại enzyme …

Nhược điểm: giá thành cao, chỉ áp dụng cho mẫu nhỏ!

Phương pháp tối ưu: công nghệ bơm dịch treo tế bào dưới áp lực qua một khe nhỏ.

Thu nhận chu chất: sử dụng sốc thẩm thấu.


Rửa với dd đẳng trương

Ủ với dd ưu trương

Cho vào nước

TB bị sốc, màng ngoài bị phá vỡ

GCSF giải phóng khỏi chu

chất


Chu chất của vi khuẩn gram âm (hình dưới)

• Tế bào chỉ bị phá vỡ lớp màng ngoài (outer membrane)

• Màng trong (plasma membrane) vẫn không bị vỡ chỉ protein ở chu chất (periplasmic space) được giải phóng

Thu nhận G-CSF ở chu chất bằng sốc thẩm thấu

IV. TINH CHẾ

Từ Thể Vùi Không tan trong nội bào, gấp cuộn không chính xác

• Phương pháp: Ly tâm thu tủa rửa tủa• Cần quá trình tái gấp cuộn pha loãng và thẩm

tích trong dd tái gấp cuộn

1. Tinh chế trung gian

Nguyên lý chung của quá trính tái gấp cuộn:• Dd protein được pha loãng trong lượng lớn dd tái gấp cuộn.• Dd tái gấp cuộn có thế oxi hóa- khử thích hợp cho việc tái gấp

cuộn protein.

Vấn đề: sự kết cụm protein (do tương tác kị nước liên phân tử của các dạng tái gấp cuộn trung gian) Giải pháp: ngăn ngừa các liên kết kị nước bằng cách pha thật loãng dung dịch hòa tan protein trong dung dịch tái gấp cuộn

IV. TINH CHẾ

Phương pháp thẩm tích dùng trong quá trính tái gấp cuộn

IV. TINH CHẾ

Từ TB Chất

Từ Môi Trường

Tan, đã gấp cuộn chính xác

Tan ở ngoại bào, đã gấp cuộn chính xác

• Phương pháp: phá vỡ TB hoặc màng ngoài, lytâm thu dịch nổi

• Phương pháp: ly tâm loại bỏ sinh khối

Từ Chu Chất

IV. TINH CHẾ

• Trường hợp có thẻ His: dùng sắc kí ái lực

• Trường hợp không có thẻ His: do 4 His và 1 Cys được đưa ra bề mặt, trong đó, 2 His số 52 và 156 nằm kế nhau có thể dùng sắc kí ái lực

• Dùng sắc kí trao đổi cation

Lý do: sau quá trình tái gấp cuộn, pH của dd bằng 4.0 < pI của GCSF (5.5 - 6.1) GCSF tích điện dương

Quy Mô PTN Quy Mô Công Nghiệp

2. Tinh chế hoàn tất

Tối ưu hóa genDung hợp với các thành phần khác

Chuyển plasmid lưu trữ

Chuyển vào E.coli DH5α Lưu trữ

Tối ưu hóa gen

Tóm Tắt Quy Trình

Tách plasmid lưu trữ từ E. coli DH5α

Thu nhận DNA mục tiêu bằng PCR

Chèn vào plasmid biểu hiện

Chuyển vào tế bào E. coli DH5α

Thu nhận plasmid TTH

Chuyển vào tế bào biểu hiện

Biểu hiện gen


Thu nhận sinh khối(E. coli)

Phá tế bàoPhá màng ngoài

Thu nhận GCSF(tạp chất)

Tái gấp cuộn Tinh chế GCSF

Kiểm tra hoạt tính

Tinh chế và kiểm tra hoạt tính


Tài liệu tham khảo

• Báo cáo tổng hợp kết quả khoa công nghệ đề tài nghiên cứu công nghệ sản xuất Granulocyte-Colony Stimulating Factor (G-CSF) người tái tổ hợp để hỗ trợ điều trị bệnh giảm bạch cầu hạt- Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên, ĐH Quốc Gia Tp. HCM, TS. Võ Minh Trí, 2010

• Tạo dòng và biểu hiện protein G-CSF ở người bằng các hệ thống biểu hiện khác E.coli- Liên Thúy Linh, 2008

• Tạo dòng và biểu hiện protein G-CSF ở người trong các hệ thống biểu hiện ở Pichia patoris- Trương Lê Na, 2008

• Nghiên cứu thu nhận G-CSF tái tổ hợp có hoạt tính từ thể vùi được biểu hiện trong E.coli- Trần Thanh Hòa, 2010

• Nghiên cứu biểu hiện và thu nhận hG-CSF có hoạt tính từ thể vùi không điển hình trong E.coli- Nguyễn Thị Phương Hiếu, 2010

san xuat protein g csf 3

Documents