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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA BIO12007- Biologia Molecular Básica

Roteiro de aulas práticas 1

Extração de DNA de cebola: isolando DNA na cozinha.

Objetivo: extrair DNA de cebola utilizando produtos de uso doméstico (detergente para lavar louça, sal de cozinha e álcool).

A extração de ácidos nucléicos (DNA e/ou RNA) geralmente é a primeira de várias etapas

para o estudo da biologia molecular de qualquer organismo. Nesta aula, serão utilizados produtos de uso doméstico para a extração de DNA da cebola (Allium cepa), para demonstrar que procedimentos para extração de ácidos nucléicos são simples e podem ser executados mesmo em laboratórios sem infra-estrutura específica para este fim. Referência: Loreto, E. L. S. & Sepel, L. M. N. Atividades experimentais e didáticas de Biologia Molecular e Celular. São Paulo, Editora da Sociedade Brasileira de Genética, 2002.

Material

• Uma cebola grande • Ralador • Sal de cozinha (NaCl) • Detergente para lavar louça (líquido ou gel) • Água quente (65°C a 80°C) • Papel-filtro ou filtro de café • Funil ou suporte para filtro de café • Gelo • Álcool 96°GL gelado • Dois frascos de vidro (~200ml) • Bastão ou pipeta de vidro • Recipiente (plástico ou isopor) para o banho de gelo

Procedimento

1. Rale a cebola e coloque o material ralado em um dos frascos. 2. Adicione 100 ml de uma solução feita com 80 ml de água quente, 20 ml de detergente

e uma colher de sopa de sal (NaCl). Misture bem a solução com a cebola ralada. Aguardar aproximadamente 10 min.

3. Coloque o frasco com a cebola ralada em um banho de gelo (recipiente com um pouco de água e gelo). À medida que a suapensão onde está a cebola ralada esfriar, deverá ser possível observar que o líquido parece estar “talhando” (formando grumos).

4. Quando a suspensão com a cebola ralada estiver fria, filtre-a e colete o líquido filtrado em um frasco limpo.

5. Incline o frasco de vidro com o líquido filtrado (ângulo de 30° a 40°) e derrame vagarosamente, pela parede lateral, o álcool gelado. Você verá que o álcool não se mistura prontamente com a solução filtrada, havendo a formação de duas fases (na superior fica o álcool). Entre as duas fases é possível observar a formação de um precipitado com aspecto de “fiapos” esbranquiçados, que são os ácidos nucléicos.

6. Com a ajuda do bastão ou da pipeta de vidro, é possível enrolar os ácidos nucléicos que estão precipitando, ou seja, você pode “pescar” o DNA da cebola.

7. Uma vez enrolados no bastão, os ácidos nucléicos devem secar por alguns minutos ao ar para a evaporação do etanol; depois o material deve ser transferido da extremidade do bastão para um tubo com 0,5 ml de água destilada. Assim, a amostra será

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reidratada rapidamente e o DNA em solução poderá posteriormente ser analisado por eletroforese em gel de agarose.

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Extração de DNA plasmidial de Escherichia coli

Objetivo: Isolar DNA plasmidial de Escherichia coli a partir de um pequeno volume de cultura (minipreparação de plasmídeo) pela técnica de lise alcalina. Referência: Birnboim H. C. & Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res., 7(6): 1513-1523, 1979. A técnica fundamenta-se na remoção seqüencial de barreiras e na precipitação seletiva de moléculas de ácidos nucléicos. A célula é lisada por tratamento com detergente para remoção da parede celular e membrana plasmática e liberação do conteúdo celular (incluindo ácidos nucléicos). O DNA genômico (cromossômico) é precipitado em uma primeira etapa na presença de SDS (detergente) em pH alcalino, ficando o DNA plasmidial em solução. O DNA plasmidial é então precipitado com a adição de etanol e recuperado por centrifugação. Material: • Células de E. coli portadoras de plasmídeo pUC18 • Meio de cultivo Luria Bertani (LB) (Composição por litro de água destilada) Triptona 10 g Extrato de Levedura 5 g NaCl 10 g pH ajustado para 7 com NaOH 1N • Ampicilina (50 mg/ml) • Solução 1 50mM glicose 25mM Tris/Cl pH 8,0 10mM EDTA pH 8,0 • Solução 2 (preparar no momento do uso) 0,2 N NaOH 1% SDS • Solução 3 60 ml de Acetato de Potássio 5M 11,5 ml Ácido acético glacial 28,5 ml H2O • TE Tris.HCl 10 mM, pH 8,0 EDTA 1 mM • Isopropanol

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• Etanol absoluto • Etanol 70% Procedimentos: 1. Inocular 1 colônia de E. coli contendo o plasmídeo pUC18 em 3 ml de meio LB contendo

ampicilina (50 μg/ml). Incubar por 14-16 h a 37 oC sob agitação.

2. Centrifugar 3 ml da cultura de bactérias a 13.000 rpm por 1 min, em duas etapas. Em um tubo

de 1,5 ml, centrifugar aproximadamente a metade da cultura bacteriana. Após a primeira

centrifugação, desprezar o sobrenadante e adicionar ao sedimento o restante da cultura. Após a

segunda centrifugação, descartar novamente o sobrenadante, escorrendo bem para que não

fiquem restos de meio sobre material precipitado (células de E. coli).

3. Ressuspender as células em 250 μl da solução 1, agitando vigorosamente em vórtex.

4. Adicionar 250 μl da solução 2 e misturar delicadamente por 2 a 5 min, até a obtenção de uma

solução clara.

5. Adicionar 350 μl da solução 3 e misturar rápidamente, invertendo o tubo de 3 a 5 vezes (haverá

a formação de um precipitado branco, que inclui proteínas, material de parede celular e DNA

cromossômico).

6. Centrifugar a 13.000 rpm por 10 min.

7. Transferir 800 μl do sobrenadante (que contém o DNA plasmidial em solução) para outro tubo,

tendo o máximo de cuidado para não carregar junto o material precipitado.

8. Adicionar 650 μl de isopropanol e misturar por inversão (a adição do álcool levará à precipitação

do DNA plasmidial, mas isso não será visível).

9. Centrifugar a 13 000 rpm por 10 min.

10. Remover todo o sobrenadante (escorrendo bem) e lavar o material precipitado (nem sempre

visível) com 250 μl de etanol absoluto, tomando cuidado para não ressuspendê-lo. Repetir a

lavagem com etanol 70%. O material precipitado inclui o DNA plasmidial e também RNA. Quando

há uma maior quantidade de RNA na preparação, pode-se observar, no fundo do tubo, um

pequeno sedimento branco.

11. Secar o material precipitado ao ar e ressuspendê-lo em 50 μl de TE. Alíquotas de 5 a 10 μl

podem ser utilizadas para análise do DNA plasmidial purificado por eletroforese em gel de

agarose.

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Clivagem de DNA plasmidial com endonucleases de restrição Objetivo: clivar DNA do plasmídeo pUC18 com a endonuclease de restrição EcoRI. Material • Endonucleases de restrição: EcoRI (1U/μl). Uma unidade de atividade de uma endonuclease de restrição (1U) corresponde à quantidade de enzima necessária para digerir completamente 1 μg de DNA do bacteriófago λ em uma reação de 1 h na temperatura ótima de atividade da enzima (37°C, para a maioria da endonucleases de restrição utilizadas em biologia molecular). Qualquer endonuclease de restrição deve ser sempre estocada em tampão adequado, contendo 50% de glicerol (para evitar congelamento) a -20°C. Durante o uso, o tubo com a enzima deve ser sempre mantido em banho de gelo (0°C). • Tampão de reação 10X para EcoRI

Cada endonuclease de restrição tem sua atividade ótima em um determinado tipo de tampão, com composição definida e tamponado para o pH ótimo para a atividade da enzima. Para e concentração salina. Para EcoRI e Sau3AI, o tampão 10X utilizado é : Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 NaCl 100 mM MgCl

2 10 mM DTT 1 mM Procedimento: 1. Em um tubo tipo Eppendorf de 0,5 ml montar a seguinte reação de clivagem (pipetando os

componentes na ordem indicada):

6 μl de água 2 μl de tampão de reação 10X para EcoRI 10 μl de DNA de pUC18 (da amostra preparada conforme o roteiro 2)

2 μl de EcoRI (1 U/μl)

Volume total 20 μl 2. Incubar durante 1 h a 37°C. 3. Aquecer a amostras a 65°C por 5 min para a inativação da enzima. 4. Após a inativação da enzima, a reação de clivagem pode ser estocada a -20 °C até a sua utilização. 5. A análise do DNA plasmidial clivado poderá ser feita por eletroforese em gel de agarose.

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Análise de DNA por eletroforese em gel de agarose Objetivo: preparar um gel de agarose para análise de ácidos nucléicos e resolver eletroforeticamente amostras de DNA plasmidial (pUC18) clivado ou não com EcoRI. Material: • TBE 5X (Composição para 1 litro) Tris-HCl 54 g Ácido bórico 27,5 g EDTA 0,5 M pH 8,0 20 ml • Gel de agarose 0,8% TBE 5X 20 ml agarose 0,8 g água bidestilada q.s.p. 100 ml • Tampão de amostra 5X (em TBE) Ficoll 15% Azul de bromofenol 0,15% (migração na altura de ~1 kb) Xilenocianol 0,15% (migração na altura de ~4 kb) • Brometo de etídeo 1 mg/ml (Cuidado! O brometo de etídeo é mutagênico e cancerígeno. Não

tocar nos géis corados com brometo de etídeo sem a devida proteção. O professor dará as orientações de segurança para manipulação e descarte dos géis).

• Transiluminador ultravioleta e máscaras de proteção Procedimentos • Preparação do gel: Preparar a solução de agarose em frasco de Erlenmeyer e aquecê-la (até a fervura) em banho-maria ou forno de microondas até a sua completa solubilização. O frasco deve ser coberto, mas nunca selado, durante o aquecimento. Ele também deve ser agitado freqüentemente para homogeneização e para evitar transboradamento. Após a solubilização, a solução de agarose deve ser resfriada por alguns minutos e a ela devem ser adicionados 20 μl de uma solução de brometo de etídio 1 mg/ml (concentração final de 0,2 μg/ml). Depois disso, agitar a solução e vertê-la sobre uma placa-molde de gel com o pente já montado. Aguardar a gelificação a temperatura ambiente por 30 min a 1 h. O gel assim preparado pode ser envolvido em filme plástico e armazenado por até 10 dias a 4°C. • Preparação das amostras: Em tubos de microcentrífuda de 0,5 ml misturar 5 μl de cada amostra de DNA de interesse (DNA plasmidial íntegro, preparado conforme o roteiro 2, e DNA plasmidial clivado com EcoRI, preparado conforme o roteiro 3), 3 μl de água e 2 μl de tampão de amostra 5X. • Eletroforese:

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1. Colocar o gel de agarose 0,8% na cuba de eletroforese e submergi-lo em TBE 1X.

2. Aplicar as amostras no gel com uma micropipeta

4. Submeter as amostras a eletroforese a uma voltagem de 100V (correpondente a 50-70 mA), por aproximadamente 60 min.

5. Visualizar as amostras de DNA resolvidads eletroforeticamente colocando o gel sobre transluminador com iluminação ultravioleta (Cuidado! O ultravioleta pode causar queimaduras e é mutagênico. Não visualizar os géis sem as devidas precauções de segurança, que serão informadas pelo professor).

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Purificação de fragmentos de DNA de gel de agarose Objetivos:

Isolar fragmentos de DNA de gel de agarose pelo método de “freeze-squeeze”. Referência: Tautz, D. & Renz, M. An optimized freeze-squeeze method for the recovery of DNA fragments from agarose gels. Anal. Biochem. 132(1):14-19, 1983.

Material: • Gel de agarose 0,8% contendo amostras de DNA clivadas já resolvidas por eletroforese. • Transiluminador ultravioleta e máscaras de proteção • Bisturi, tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, nitrogênio líquido • Tubo de 0,5 ml perfurado no fundo e na tampa contendo lã de vidro siliconizada • Solução equilibrante (SE) Acetato de Sódio 0,3 M, pH 7,0 EDTA 1 mM • Etanol absoluto e etanol 70%

Procedimentos: Os fragmentos de DNA foram previamente resolvidos por eletroforese em gel de agarose e corados com brometo de etídeo (gel agarose 0,8%; TBE 1X; brometo de etídeo 0,2 μg/ml).

1. Visualizar os fragmentos de DNA no gel em transiluminador UV. Atenção: o UV induz quebras no DNA que prejudicam a clonagem; por isso, expor o DNA ao UV o mínimo de tempo necessário).

2. Selecionar e cortar a(s) banda(s) de interesse do gel com auxílio do bisturi. Transferir o(s) fragmento(s) de gel cortado(s) para tubo(s) de microcentrífuga de 1,5 ml.

2. Estimar o volume do fragmento de gel. Adicionar um volume de SE correspondente a 10 vezes o volume estimado do fragmento de gel (por exemplo 1 ml para um fragmento com volume estimado de 100 μl). Equilibrar o fragmento de gel de agarose no tampão SE a temperatura ambiente sob leve agitação durante 20 min.

3. Transferir o fragmento de gel para o tubo de microcentrífuga de 0,5 ml perfurado em ambas as extremidades e contendo lã de vidro siliconizada no fundo.

4. Imergir o tubo em nitrogênio líquido (-196ºC) até o total congelamento da amostra. Transferir imediatamente o tubo de 0,5 ml para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml sem tampa já posicionado na microcentrífuga. Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 min.

5. Medir o volume da solução eluída no tubo de 1,5 ml e adicionar cerca de 2,5 volumes de etanol absoluto. Incubar a -70°C por 10 min ou, alternativamente, manter o tubo por 1 h a -20°C.

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6. Centrifugar o tubo a 12.000 rpm durante 5 min. Descartar o sobrenadante e escorrer o excesso de álcool em papel absorvente. Lavar o precipitado com etanol 70%. Secar o precipitado deixando o tubo em estufa a 60°C por 10 min.

7. Dissolver o precipitado de DNA (fragmento de DNA) em 10 μl de água bidestilada.

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Ligação de fragmento(s) de DNA purificado(s) de gel de agarose em vetor plasmidial clivado Objetivo:

Ligar fragmentos de DNA separados eletroforeticamente e purificados de gel de agarose ao plasmídeo pUC18 clivado com EcoRI.

Material: • Fragmentos de DNA clivados com EcoRI, separados por eletroforese em gel de agarose e

purificados de gel. • DNA de pUC18 clivado com EcoRI. • Tampão de ligação 10X Tris-HCl 300 mM, pH 7,8 DTT 100 mM ATP 10 mM MgCl2 100 mM • DNA-ligase de bacteriófago T4 (1 U/μl)

A enzima DNA-ligase do bacteriófago T4 catalisa a formação de ligações fosfodiéster entre as extremidades 5’-fosfato e 3’-hidroxila de fitas duplas de DNA justapostas. A ligação é facilitada por pareamento, por pontes de hidrogênio, entre extremidades coesivas, mas também acontece, com menor eficiência, entre moléculas de DNA de extremidades cegas. Uma unidade de atividade de DNA-ligase é definida como a quantidade de enzima necessária para catalisar a ligação de mais de 95% dos fragmentos gerados pela clivagem de 1 μg de DNA do fago λ com HindIII, em 20 min a 16°C.

Procedimento: • Em tubos de microcentrífuga de 0,5 ml preparar a seguinte reação de ligação: 5 μl de DNA de pUC18 clivado com EcoRI (preparado conforme o roteiro 3) 5 μl de preparação de fragmento de DNA clivado e purificado (preparado conforme o roteiro 5) 2 μl de tampão de ligação 10X 1 μl de DNA-ligase de T4 (1U/μl) 8 μl de água bidestilada _________________ Volume total: 20 μl • Incubar a reação de ligação a 16°C por 14 a 16 h. Depois, estocá-la a -20°C até a utilização da

mesma para transformação de células de E. coli (roteiro 7).

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Transformação genética de bactérias I Objetivos: 1. Preparar células de E. coli competentes para transformação; 2. Tranformar células competentes de E. coli com DNA plasmidial por choque térmico.

Material: • Meio de cultivo Luria Bertani (LB). (Composição por litro de água destilada) Triptona 10 g Extrato de Levedura 5 g NaCl 10 g Ajustar o pH para 7 com NaOH 1N • Ampicilina 50 mg/ml • Frasco de Erlenmeyer (250 ml) • Pipetas, placas de Petri e ponteiras • Alça de Drigalski, copo de Becker com álcool • Bico de Bunsen • Gelo • CaCl

2 0,1 M

Atenção: Todo o material e soluções devem ser esterilizados por autoclavação ou ultrafiltração e manipulados em ambiente estéril. Para tanto, trabalhe próximo ao bico de Bunsen (a uma distância de até 20 cm da chama) ou em capela de fluxo laminar.

Procedimentos:

Preparação de células de E. coli competentes (etapas 1 e 2 feitas previamente)

1. Inocular 1,5 ml de LB com uma colônia isolada de E. coli DH5α e incubar durante 16 h a 37°C sob agitação.

2. Inocular 1 ml da pré-cultura em 100 ml (1/100) de LB em frasco Erlenmeyer de 250 ml. Incubar a 37°C sob agitação até DO600 = 0,3 (aproximadamente 2h30min).

3. Transferir 20 ml da cultura para um tubo de centrífuga e centrifugar a 5.000 rpm por 5 min a 4°C.

Atenção: A partir deste passo, manter as células no gelo.

4. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as bactérias em 5 ml de solução de CaCl2 0,1 M

gelada (4°C). Incubar no gelo por 20 min.

5. Centrifugar a 5.000 rpm por 5 min a 4°C.

6. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de CaCl2 0,1 M gelado. Manter as

células no gelo. As células são agora consideradas competentes para transformação (permeáveis a DNA exógeno).

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Tranformação bacteriana com DNA plasmidial

1. Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, misturar 100 μl de células de E. coli competentes com a reação de ligação (preparada conforme o roteiro 6). Incubar no gelo por 20 min. 2. Durante o tempo de incubação da etapa 1, preparar uma placa de Petri com meio LB sólido contendo ampicilina 100 μg/ml: 25 ml de meio de cultura LB sólido fundido por aquecimento em forno de microondas 50 μl de ampicilina (50 mg/ml) 20 μl IPTG 0,1 M 40 μl X-gal 20 mg/ml

3. Transferir o tubo de microcentrífuga para um banho-maria a 42°C por 2 min (choque térmico). Imediatamente recolocar o tubo no gelo.

4. Adicionar 0,9 ml de meio de cultura LB líquido e incubar a 37°C por 30 minutos, sob agitação.

Atenção: Durante a incubação, secar as placas de Petri (preparadas na etapa 2) em estufa a 60°C.

5. Espalhar 20 ou 100 μl a suspensão de bactérias sobre a placa de Petri contendo meio LB/ampicilina com a alça de Drigalski

6. Incubar as placas a 37°C, invertidas, durante 16 h.

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Transformação genética de bactérias II

Objetivos: identificar colônias bacterianas transformantes portadoras de plasmídeos parentais daquelas portadoras de plasmídeos recombinantes.

Procedimentos:

Avaliação do resultado da transformação e da clonagem

1. Contar o número de colônias transformantes (número total de colônias: azuis + brancas). Estimar a eficiência de transformação (número de colônias por micrograma de DNA utilizado na transformação).

2. Contar o número de colônias recombinantes (brancas). Calcular a eficiência da clonagem (número de colônias brancas/número total de colônias x 100%).

3. Para confirmação da clonagem, pode ser extraído DNA plasmidial das prováveis colônias recombinantes (roteiro 2) e ele pode ser clivado com EcoRI para liberação do inserto (roteiro 3) ou amplificado por PCR (roteiro 9) e analisado por eletroforese em gel de agarose (roteiro 4). Questões para discussão: 1. Como podemos diferenciar as colônias transformantes das não transformantes?

2. Qual a diferença entre as colônias brancas e as colônias azuis?

3. Qual a diferença entre um plasmídeo parental e um plasmídeo recombinante?

4. No plasmídeo pUC18, qual é a importância do sítio de policlonagem estar localizado dentro do

gene lacZ, que codifica a enzima β-galactosidase.

5. Por que é necessário utilizar ampicilina no meio de cultura no qual são espalhadas as bactérias

submetidas à transformação por choque térmico?

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Reação em cadeia da polimerase (PCR) Objetivo: amplificar um fragmento de DNA clonado no vetor pUC18. Introdução

Em 1985, foi descrita a metodologia da reação em cadeia da polimerase (PCR, de polymerase chain reaction). Seu idealizador, Kary Mullis, recebeu, por isso, o Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia em 1993. A PCR permite a produção de grandes quantidades de um determinado segmento de DNA in vitro a partir de uma pequena quantidade de DNA-molde, evitando assim a necessidade de introdução (clonagem) do DNA de interesse em bactérias. Referências: Kubista, M.; Andrade, J.M.; Bengtsson, M.; Forootan, A.; Jonak, J.; Lind, K.; Sindelka, R.; Sjoback, R.; Sjogreen, B.; Strombom, L.; Stahlberg, A. & Zoric, N. The real-time polymerase chain reaction. Mol. Aspects. Med., 27(2-3): 95-125, 2006. Mullis, K.; Faloona, F.; Scharf, S.; Saiki, R.; Horn, G. & Erlich, H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol., 51 Pt 1: 263-273, 1986. Saiki, R.K.; Scharf, S.; Faloona, F.; Mullis, K.B.; Horn, G.T.; Erlich, H.A. & Arnheim, N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230(4732): 1350-1354, 1985. Material:

• Iniciadores de cadeia direto (anela na extremidade 5’ do molde) (20 pmol/μl) • Iniciadores de cadeia inverso (anela na extremidade 3' do molde) (20 pmol/μl) • DNA-molde (pUC18 recombinante, obtido conforme roteiro 8) • dNTPs (desoxirribonucleotídeos): dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (10mM) • Tampão da Taq DNA-polimerase (10X) • Taq DNA-polimerase (1 U/μl)

Os iniciadores (primers) direto e inverso são oligonucleotídeos complementares a seqüências do vetor (conhecidas) que flanqueiam o sítio no qual está inserido o fragmento clonado. A seqüência e a Tm de cada iniciador serão fornecidas pelo professor. A temperatura de anelamento dos iniciadores ao DNA-molde na PCR é definida com base na Tm. Geralmente, ela deve ser de cerca de 20 a 25ºC abaixo da Tm dos iniciadores. Estimativa da Tm de iniciadores A seguinte fórmula pode ser utilizada para estimar a temperatura média de fusão (Tm) de um iniciador:

Tm (°C) = 4 x (G + C) + 2 x (A + T) Procedimentos: 1. Pipetar as seguintes soluções em um tubo de centrífuga de 0,5 ml:

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água bidestilada 38 μl DNA molde (50 ng/μl) 1,0 μl Iniciador 5' (20 pmol/μl) 1,0 μl Iniciador 3' (20 pmol/μl) 1,0 μl Tampão da Taq DNA-polimerase (10X)* 5,0 μl dNTP's (10 mM) 2,0 μl Taq DNA-polimerase (0,5 U/μl)** 2,0 μl __________

Volume total 50,0 μl Óleo Mineral 50,0 μl * 100mM Tris-HCl (pH 9,0), 15mM MgCl2, 500mM KCl ** em 50mM Tris-HCl (pH7,5); 0,1mM EDTA; 5mM DTT, e 50% glicerol Nota: Uma unidade enzimática da DNA-polimerase é definida como a quantidade de enzima necessária para catalizar a incorporação de 10 nmol de dNTP durante 30 min à 74°C. 2. Colocar a reação em um termociclador com a seguinte programação de ciclos de temperatura: 95°C - 2 min DESNATURAÇÃO 95°C - 45 s DESNATURAÇÃO ⏐ 65°C - 45 s ANELAMENTO ⎬ 30 ciclos 72°C - 45 s EXTENSÃO ⏐ 4° C - indefinidamente ARMAZENAMENTO 3. Transferir cerca de 40μl da fase inferior do tubo de reação (lembre que a camada superior é o óleo mineral) para um outro tubo. 4. Preparar uma amostra de 10 μl do produto da reação para eletroforese em gel de agarose (conforme roteiro 4), adicionando 2 ml de tampão de amostra 5X. 5. Submeter a amostra a eletroforese em gel de agarose 0,8% (conforme roteiro 4).

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Roteiro de aula prática 10

Seqüenciamento de DNA pelo método de terminação de cadeia por

didesoxirribonucleotídeos (método de Sanger) Objetivo: compreender o seqüenciamento de DNA pelo método de terminação de cadeia por didesoxirribonucleotídeos. O método de terminação da cadeia por didesoxirribonucleotídeos (ddNTPs), descrito Frederick Sanger, em 1975, é o método de seqüenciamento de DNA mais utilizado, devido à sua praticidade. Pelo trabalho de desenvolvimento deste método, Sanger recebeu, em 1980, o seu segundo Prêmio Nobel de Química (ele já havia ganho um em 1958, pela elucidação da estrutura da insulina). O método desenvolvido por Sanger pode ser utilizado tanto no seqüenciamento de DNA manual como no automatizado, sendo que, neste último caso, algumas adaptações ao método original são necessárias. Ele é um método enzimático, baseado na atividade natural de polimerização de nucleotídeos da DNA-polimerase, que é capaz de estender uma cadeia polinucleotídica adicionando nucleotídeos complementares a uma fita-molde. Referências: Sanger, F. & Coulson A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol., 94(3): 441-448, 1975. Sanger, F. The early days of DNA sequences. Nat Med., 7(3): 267-268, 2001. Atualmente, o seqüenciamento pelo método de terminação de cadeia com ddNTPs é associado à técnica de PCR, o que confere uma série de vantagens em relação a estratégias convencionais. Dentre estas vantagens, podemos citar: • amplificação exponencial do DNA-molde, reduzindo a quantidade de DNA necessária. • a alta temperatura utilizada durante cada ciclo de desnaturação elimina a necessidade da desnaturação alcalina e precipitação do DNA de fita-dupla. • os ciclos de desnaturação também ajudam a evitar o rápido reanelamento dos moldes de DNA fita dupla. • as elevadas temperaturas de anelamento aumentam a especificidade da hibridização dos iniciadores ao DNA molde. • a alta temperatura de polimerização diminui a formação de estruturas secundárias do DNA molde e, deste modo, permite a polimerização através de regiões de DNA altamente estruturado. Reagentes e material necessário: • Termociclador • Tampão de reação 10X • DNA-molde de fita dupla (500fmol = 500 x 10-15mol) • Desoxirribonucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) • didesoxirrinucleosídeos trifosfatos (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) marcados radioativamente ([α-33P]-ddNTPs) ou com algum cromóforo (em geral, corantes fluorescentes). • Iniciador de cadeia (oligonucleotídeo complementar a uma das fitas do DNA-molde) • DNA-polimerase Procedimentos básicos:

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• Devem ser montadas quatro reações diferentes, cada uma delas incluindo os componentes descritos acima e com a seguinte composição de nucleotídeos:

Reação A: com ddATP, dATP, dCTP, dGTP e dTTP Reação C: com ddCTP, dATP, dCTP, dGTP e dTTP Reação G: com ddGTP, dATP, dCTP, dGTP e dTTP Reação T: com ddTTP, dATP, dCTP, dGTP e dTTP

A proporção entre o ddNTP e os dNTPs deve ser cuidadosamente equilibrada em cada reação, de forma a permitir o máximo de alongamento possível às cadeias sintetizadas, mas com uma probabilidade relativamente elevada de incorporação do ddNTP e término da cadeia na qual isso ocorre. Os componentes de cada reação permitirão que a DNA-polimerase estenda a cadeia de DNA, a partir do iniciador anelado ao DNA-molde, até que haja a incorporação de um ddNTP marcado. A base seguinte não será incorporada devido à ausência da hidroxila na posição 3' necessária para a extensão da fita pela DNA-polimerase. • Amostras de 5 μl de cada uma das 4 reações (A, C, G e T) são submetidas, em paralelo, a eletroforese em gel de poliacrilamida com agente desnaturante (uréia) e a temperatura elevada (40-50ºC). Estas condições desnaturantes não permitem que haja o reanelamento do DNA de fita dupla ou a formação de pareamentos intracadeia em cada amostra. Assim, as cadeias de DNA sintetizadas em cada reação permanecem na forma de fita simples linear, sendo separadas apenas de acordo com as diferenças de tamanho. • Após a eletroforese, o gel de poliacrilamida é colocado sobre uma folha de papel filtro e secado sob vácuo a alta temperatura. • O papel filtro seco com o gel de poliacrilamida aderido é transferido para um cassete e um filme radiográfico é exposto a ele. • O filme é revelado após 1 a 3 dias de exposição, dependendo do sinal radioativo. Questões para discussão: 1. Qual o resultado experado para a análise das amostras na auto-radiografia (número de bandas e tamanho de cada uma delas em cada amostra? 2. Como o resultado da auto-radiografia é interpretado de modo a permitir a determinação da seqüência de DNA do molde? 3. Qual é a orientação da seqüência lida a partir do gel? 4. Qual é a seqüência e a orientação da fita utilizada como molde no seqüenciamento?

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DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA BIO 12007 - Biologia Molecular Básica

INFORMAÇÕES ADICIONAIS SOBRE REAGENTES E METODOLOGIAS COMUMENTE UTILIZADOS EM MÉTODOS EXPERIMENTAIS PARA A MANIPULAÇÃO DE ÁCIDOS

NUCLÉICOS Solução de lise (NaOH e SDS): saponificação de lipídeos e rompimento da parede bacteriana pela solubilização da bicamada lipídica. O pH elevado do Tris-HCl inibe a ação das DNAses. EDTA: (ácido etilenodiaminotetracético) inibe a atividade de desoxirribonucleases (DNases) pois atua como agente quelante de íons essenciais para a atividade destas enzimas (Mg2+) SDS: é um detergente aniônico que solubiliza lipídeos. É um desnaturante de proteínas e também rompe ligações não-covalentes inter-subunidades de proteínas oligoméricas. Também é utilizado para se certificar que nenhuma nuclease que não depende de Mg2+ cause qualquer degradação no DNA. NaCl: íons no meio aquoso podem romper ligações iônicas de cadeias polipeptídicas. Também auxiliam na dissociação das proteínas ligadas aos ácidos nucléicos. Solventes orgânicos: aqueles que têm uma porção hidrofóbica (lipofílica) e uma porção polar são agentes de precipitação de macromoléculas. Os grupos polares interagem com grupos polares protéicos em competição com moléculas de água. Os grupos hidrofóbicos podem romper interações intramoleculares estabilizantes da estrutura da proteína. Um volume elevado de solvente orgânico reduz a concentração efetiva da água, deixando menos moléculas de água para hidratação da proteína. Isto é, modificam a camada de solvatação das proteínas. Fenol-clorofórmio: contaminantes protéicos são desnaturados e há partição das mesmas na fase orgânica ou interface entre as fases orgânica e aquosa, enquanto que ácidos nucléicos permanecem na fase aquosa. A utilização de fenol-clorofórmio é mais eficiente do que a utilização de somente um deles. Lipídeos, grandes polissacarídeos e proteínas complexadas ao SDS permanecem na fase fenólica. Álcool isoamílico: reduz a formação de espuma e ajuda a separação e a manutenção da estabilidade das camadas orgânica e aquosa após a separação por centrifugação. Etanol: É utilizado para precipitar ácidos nucléicos com mais do que 15 nucleotídeos. Sais e outros solutos tais como fenol e clorofórmio ficam em solução enquanto que ácidos nucléicos formam um precipitado branco que pode ser coletado por centrifugação. Tampões contendo > 1mM fosfato ou > 10mM EDTA não devem ser utilizados para precipitação com etanol, pois estas substâncias co-precipitam com os ácidos nucléicos. Acetato de sódio: utilizado para a precipitação de DNA e RNA. É mais solúvel em etanol do que NaCl. Plasmídeos: são elementos genéticos extracomossômicos com capacidade de replicação autônoma. Alguns plasmídeos podem conferir vantagens às células hospedeiras, como por exemplo, proporcionar resistência a substâncias anti-microbianas. Características desejáveis para plasmídeos utilizados como vetores para clonagem molecular: Tamanho relativamente pequeno (3 a 5 kb)

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Multicópia Possuem gene marcador que permite a seleção de bactérias transformantes (gene que confere resistência a um antibiótico, por exemplo) Possuem gene marcador que permite a seleção de recombinantes (gene que confere resistência a um segundo antibiótico ou que codifica uma proeína/enzima que confere fenótipo visualmente identificável a uma colônia de bactéria portadora do plasmídeo, por exemplo) Sítio(s) único(s) para endonuclease(s) de restrição (preferencialmente um ou mais sobre a seqüência de um gene marcador). Endonucleases de restrição e sistemas de restrição/modificação em bactérias

Endonucleases de restrição são enzimas que reconhecem e clivam ligações fosfodiéster de seqüências específicas de DNA. As endonucleases de restrição não clivam a seqüência de seu sítio de reconhecimento no DNA quando ela tiver um ou mais nucleotídeos modificados enzimaticamente. Estas modificações enzimáticas são feitas, por exemplo, por metilases que adicionam grupos metila a nucleotídeos em seqüências específicas, as mesmas reconhecidas e clivadas pela endonuclease de restrição correspondente.

Diferentes espécies e cepas de bactérias possuem pares únicos de enzimas de restrição-modificação, de modo que o DNA de uma bactéria é imune (por ser modificado) à clivagem pela enzima de restrição que ela produz. Quando um DNA exógeno, como, por exemplo o de um bacteriófago (vírus que infecta bactérias), é introduzido numa célula bacteriana com sistema de restrição-modificação, ele é imediatamente clivado pela endonuclease de restrição e rapidamente degradado.

Uma unidade enzimática de restrição (1U) é a quantidade de enzima necessária para clivar completamente 1μg de DNA do bacteriófago λ, em 1 hora, na temperatura ótima de atividade da enzima (em geral, 37°C). Análise eletroforética em gel de agarose A agarose é um polímero linear extraído de algas marinhas, composto de D-Galactose e L-Galactose. Quando a agarose é fundida e posteriormente resfriada, ocorre a formação de uma matriz ou gel, que serve como uma peneira para a separação de fragmentos de DNA de diferentes tamanhos. A eletroforese em gel de agarose é uma técnica simples, fácil e sensível, capaz de separar fragmentos com maior resolução do que outros métodos, como a centrifugação em gradientes de CsCl (cloreto de Césio), por exemplo. Outra vantagem é que os ácidos nucléicos podem ser visualizados no gel, pelo uso do corante fluorescente Brometo de Etídeo (λexc≈300nm; λ≈590nm, vermelho-laranja). Este corante se intercala entre os pares de bases empilhados da molécula de DNA/RNA. A fluorescência do Brometo de Etídeo associado a ácidos nucléicos é maior do que livre em solução, permitindo, deste modo, que pequenas quantidades de DNA/RNA sejam detectadas (cerca de 10ng DNA ou RNA por banda). Fatores que influenciam a migração em gel de agarose: Concentração da amostra. Tamanho dos fragmentos de DNA: fitas lineares duplas passam através da matriz do gel a uma velocidade inversamente proporcional ao log pb (fragmento menor é mais rápido). Conformação do DNA: o formato do fragmento de DNA de um determinado tamanho influencia a velocidade de migração (circular fechado: + rápido; circular aberto: mais lento; linear: intermediário). Corrente aplicada: maior voltagem resulta em migração mais rápida. (voltagens muito altas ou muito baixas não são recomendadas). Voltagem normal: 5-10 V/cm Direção do campo elétrico: DNA migra em direção ao ânodo (carga positiva) devido aos grupamentos fosfato de carga negativa. Composição do tampão de eletroforese: na ausência de íons a condutância elétrica é mínima e o DNA migra bem devagar. Em tampões de alta força iônica a condutância elétrica é alta e uma grande quantidade de calor é gerada - no pior caso o gel derrete e o DNA desnatura. Também a carga é função do pH do tampão.

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Transformação: A transformação é a introdução de moléculas de DNA em uma célula hospedeira (bactérias e células eucarióticas, incluindo células vegetais e animais). Várias técnicas têm sido descritas para a introdução de DNA em células bacterianas, como choque térmico e eletroporação. a) Choque térmico: as células hospedeiras (preparadas com cloreto de cálcio) são misturadas com moléculas de DNA e submetidas a um choque térmico que resulta num aumento da eficiência da transformação. Os mecanismos envolvidos na transformação de DNA não são completamente conhecidos. Mas os requerimentos essenciais para uma transformação eficiente são a presença de cátions multi-valentes, incubação a 0°C e controle rigoroso do choque térmico a 42°C. A proporção de células que se tornam “competentes” para transformação é de aproximadamente 10% da população total. Eficiência: 105-106 colônias transformadas/μg de DNA plasmidial. b) Eletroporação: é um processo físico que transitoriamente permeabiliza membranas de células procarióticas e eucarióticas a partir de um pulso elétrico. Eficiência: 109 - 1010 colônias transformadas/μg de DNA plasmidial. A eletroporação é feita a baixa temperatura (0-4°C), pois a eficiência é reduzida em cerca de 100 vezes à temperatura ambiente. c) Balística de Micropartículas: Projéteis de ouro (ou tungstênio) são cobertos com moléculas de DNA e utilizados para bombardear células hospedeiras. Análise de colônias: As colônias são analisadas utilizando algum marcador que permita a diferenciação entre as células não-transformadas, células portadoras do plasmídeo (transformadas) e células contendo o plasmídeo recombinante. Reação em cadeia da polimerase (PCR) Dois desenvolvimentos tecnológicos simplificaram e tornaram mais eficiente a PCR: 1) a utilização de DNA-polimerase termoestáveis, principalmente a enzima isolada de Thermus

aquaticus (Taq DNA-polimerase), que permanece ativa mesmo em temperatura altas o suficiente para desnaturarem a fita dupla do DNA. A Taq DNA-polimerase tem uma meia-vida de 40 min a 94 - 95°C. Esta enzima consiste de uma única cadeia polipeptídica, com uma massa molecular de 95 kDa. A Taq DNA-polimerase tem atividade máxima em uma temperatura em torno de 75°C e no pH 9. Uma unidade de atividade de uma DNA-polimerase é definida como a quantidade de enzima necessária para catalizar a incorporação de 10 nmol de dNTP em uma reação de polimerização de 30 min nas condições ótimas para a enzima.

2) o desenvolvimento do termociclador programável permitiu que a alternância das etapas de

aquecimento e resfriamento de cada ciclo da PCR pudesse ser automatizada, o trabalho manual tedioso de transferência das amostras entre blocos de aquecimento em diferentes temperaturas.

Os componentes básicos necessários para a execução de uma PCR são: • DNA-molde contendo a seqüência de DNA a ser amplificada • DNA-polimerase (preferencialmente uma termo-estável) • dois oligonucleotídeos iniciadores (primers) complementares a seqüências (conhecidas) que flanqueiam o segmento de DNA a ser amplificado. Os iniciadores devem ter orientações opostas, isto é, cada um deve anelar em uma fita diferente do DNA-molde de fita dupla. • desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP) • tampão de reação da DNA-polimerase (´contendo MgCl2, DTT) As etapas de uma PCR A PCR consiste de várias etapas que são repetidas durante o processo de amplificação do DNA molde: 1) Desnaturação: a fita dupla do DNA-molde é desnaturada termicamente em suas fitas simples

(94-95°C, por 15 s a 2 min)

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2) Anelamento: os iniciadores (oligonucleotídeos) anelam por complementaridade às fitas do DNA-molde a uma temperatura mais baixa (20 a 25°C abaixo da Tm dos iniciadores) do que a utilizada na etapa anterior (40-60°C, por 30 s a 1 min)

3) Extensão (síntese): os iniciadores anelados ao DNA-molde servem como pontos de partida

para que a DNA-polimerase os alongue, sintetizando uma fita de DNA complementar e de orientação inversa àquela do DNA-molde. Isso é feito a partir da incorporação seqüencial de dNTPs na extremidade 3’ da cadeia nascente. Ao término desta etapa, foi dobrado o número de fitas correspondente a região amplificável do molde (entre os sítios de anelamento dos iniciadores). A temperatura para extensão é geralmente de 72°C e a sua duração é de 1 min por kb do produto de amplificação esperado.

As 3 etapas descritas acima constituem um ciclo, que é repetido várias vezes (de 20 a 40

vezes). Ao final de cada ciclo, ocorre a duplicação do número de moléculas de DNA de fita dupla que havia no ciclo anterior. Isto é, há uma amplificação exponencial da seqüência do DNA-alvo: 2n, onde n = número de ciclos. Por exemplo, ao término de 20 ciclos haverá 220 (mais de 1 milhão) cópias da porção amplificada do DNA-molde. A concentração dos iniciadores é alta (em excesso), o que faz com que a hibridização (anelamento) dos mesmos ao DNA-molde ocorra rapidamente (em segundos), após a desnaturação e o resfriamento. O DNA amplificado pode então ser analisado (quanto ao tamanho, quantidade e seqüência) por eletroforese em gel de agarose, clonagem e/ou seqüenciamento. RT-PCR para a amplificação de seqüências derivadas de produtos de transcrição (RNA) As DNA-polimerases utilizadas na PCR utilizam fitas de DNA como molde (são DNA-polimerases DNA-dependentes) e, portanto, a metodologia tem sua aplicação limitada à amplificação de moléculas de DNA. A amplificação de seqüências derivadas de RNA (especialmente mRNA), para análise qualitativa e quantitativa de produtos de transcrição, depende, então, de uma etapa inicial, na qual a seqüência de RNA é convertida em uma seqüência de DNA. Para isso, são utilizadas DNA-polimerases RNA-dependentes de vírus eucarióticos, chamadas de transcriptases reversas. Estas enzimas utilizam uma fita-molde de RNA para a síntese de uma fita de DNA correspondente (complementar e de orientação oposta à do molde). A fita de DNA complementar (cDNA) sintetizada pode então ser utilizada como molde em uma reação de PCR tradicional. A metodologia de PCR precedida pela síntese de cDNA por transcrição reversa para a amplificação de seqüências correspondentes a um RNA é chamada de RT-PCR (RT = reverse transcription). Cuidados para evitar produtos de amplificação decorrentes de contaminação da amostra (falsos positivos) A contaminação com cópias idênticas ou seqüências muito similares à do DNA-molde e passíveis de hibridização com os iniciadores. Este é o problema mais sério e também o de ocorrência mais provável, devido à grande sensibilidade da técnica. Mesmo a presença de poucas moléculas contaminantes poderá levar à geração de produtos de amplificação em quantidades detectáveis. As seguintes precauções devem ser tomadas a fim de evitar contaminações: • utilizar material descartável. • utilizar reagentes previamente aliquotados em lotes submetidos a um controle de qualidade exigente. • utilizar pipetadores automáticos (nunca pipetar reagentes com a boca). • analisar os produtos da amplificação em uma área fisicamente separada da área onde reagentes e amostras são preparados. • sempre utilizar um controle negativo de amplificação (reação sem DNA-molde). Exemplos de aplicações da PCR

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• Caracterização estrutural e funcional de genes. A PCR permite analisar a estrutura e a organização de genes e seus produtos de RNA. • Amplificação de DNA para posterior clonagem, seqüenciamento e caracterização estrutural e funcional. • Estudos genéticos e taxonômicos, para identificação e análise de marcadores moleculares associados a características fenotípicas. Identificação de variabilidade entre indivíduos e análises filogenéticas. • Controle de qualidade, para avaliação da origem e composição de amostras derivadas de material biológico e/ou detecção de material oriundo de organismos contaminantes. • Diagnóstico molecular de doenças infecciosas e genéticas. Alguns exemplos práticos da utilização da PCR: • Diagnóstico de infecções por Mycobacterium tuberculosis: a microscopia de escarro seguida pela cultura é o método tradicional para o diagnóstico da tuberculose. No entanto, estes métodos bacteriológicos são lentos e caros. Além disso, estes métodos apresentam baixa sensibilidade quando as amostras clínicas têm um pequeno número de células do patógeno. A seqüência de inserção IS6110 é específica do complexo M. tuberculosis e está presente em diversas cópias no genoma da bactéria, tornando a IS6110 um alvo excelente para amplificação visando à detecção do patógeno em amostras de escarro de pacientes com suspeita de tuberculose. A visualização do produto de PCR em gel de agarose ou em dot-blot colorimétrico indica a presença deste patógeno na amostra. Nota: os elementos de inserção (IS) são elementos genéticos transponíveis que carregam apenas a informação genética essencial para a própria transposição. Esta informação genética é constituída por seqüências de DNA repetidas e invertidas que flanqueiam um gene codificador de uma transposase, que reconhece as seqüências repetidas e catalisa o processo de transposição da IS. Referência: Sperhacke RD, Mello FC, Zaha A, Kritski A, Rossetti ML. Detection of Mycobacterium tuberculosis by a polymerase chain reaction colorimetric dot-blot assay. Int J Tuberc Lung Dis., 8(3): 312-317, 2004. • Diagnóstico da AIDS (infecção pelo human immunodeficiency virus type 1, HIV-1). O HIV-1 é um dos agentes etiológicos da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) em seres humanos. A presença do vírus em leucócitos pode ser detectada por ensaios de PCR de amostras de sangue do paciente com suspeita da infecção, utilizando iniciadores derivados de seqüências do genoma viral. Referência: Sahni AK, Gupta RM, Jena J, Nair MN. Early detection of HIV-1 in infants by PCR. Indian J Pathol Microbiol., 48(1): 49-52, 2005. • Identificação de cepas de Staphylococcus aureus (Gram+) resistentes à meticilina. Cepas de S. Aureus resistentes ao antibiótico meticilina são responsáveis por um grande número de infecções hospitalares. A amplificação por PCR do gene mecA da bactéria, que codifica a proteína responsável pela resistência ao antibiótico (penicillin-binding protein-2a, PBP-2a), permite distinguir cepas resistentes (que possuem o gene) de cepas sensíveis (que não o possuem) ao tratamento com antibióticos β-lactâmicos. Referência: Carroll, R.B. Leonard, P.L. Newcomb-Gayman and D.R. Hillyard, Rapid detection of staphylococcal mecA gene from Bactec blood culture bottles by the polymerase chain reaction. Am. J. Clin. Pathol. 106: 600–605, 1996.

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• A PCR pode ser usada para diagnósticos de doenças de etiologia genética, como a fibrose

cística A fibrose cística do pâncreas, ou mucoviscidose, é uma das doenças genéticas mais comuns, tendo um padrão de herança autossômico recessivo. Se um casal tiver uma criança afetada, o risco de que uma segunda criança venha a apresentar a mesma síndrome é de 25%. Mutações no gene CFTR são responsáveis pelo quadro clínico. Essas mutações podem causar as formas clássicas de fibrose cística (caracterizadas por pneumonias de repetição com ou sem envolvimento pancreático) bem como sinais mais leves da doença, como pancreatite ou esterilidade masculina em decorrência de agenesia dos vasos deferentes. Já foram descritas mais de 1000 mutações diferentes no gene CFTR e, portanto, a triagem de todas as mutações é inviável economicamente. Na população brasileira, as mutações mais freqüentes são DF508 (no éxon 10 do gene) e G542X (no éxon 11 do gene) e sua análise permite confirmar o diagnóstico clínico em 39% dos casos com a forma clássica de fibrose cística. A presença destas mutações é detectada pela amplificação, por PCR, e o posterior seqüenciamento das regiões do gene CFTR correspondentes aos éxons 10 e 11. Referência: Raskin S, Phillips JA, Kaplan G, McClure M, Vnencak-Jones C, Rozov T, Cardieri JM, Marostica P, Abreu F, Giugliani R, Reis F, Rosario NA, Ludwig N, Pereira L, Faucz F, Gabardo J, Culpi L. Geographic heterogeneity of 4 common worldwide cystic fibrosis non-DF508 mutations in Brazil. Hum Biol., 71(1): 111-121, 1999. Otimização da PCR • [MgCl2] DNA molde, agentes quelantes na amostra (ex. EDTA), dNTPs e

proteínas alteram a [Mg2+] livre. Ausência de [Mg2+] adequada: Taq DNA Polimerase é inativa. Excesso de Mg2+ livre: redução da fidelidade enzimática e aumento de

produtos não específicos. Importante: determinar empiricamente [Mg2+] ótima para cada reação.

• Tampão Ausência de Triton X-100: pouca ou nenhuma atividade da Taq DNA-polimerase. • [Enzima] Recomendado: 1,25U da Taq DNA-polimerase em reação de 50 μl.

A adição de mais enzima não altera a quantidade de produto formado ao final da reação.

• Rastro de DNA em gel de agarose: tempos de extensão muito longos e/ou excesso de enzima levam ao aumento da atividade de exonuclease 5'→3' da Taq DNA-polimerase, levando à geração de produtos de degradação exonucleolítica.

• Projeto dos iniciadores de cadeia Tamanho ideal: entre 15 e 30 nt Conteúdo de G+C: entre 40 e 60% Evitar seqüências que permitam a formação de estruturas secundárias exemplo: 5' CCCCATTGGGG 3' → T A T C G C G C G C G

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As extremidades 3' dos dois iniciadores da reação não devem ser complementares, de modo a evitar a formação de dímeros de iniciadores na reação de PCR 5' ATCGTAATGCGC 3' → 5' ATCGTAATGCGC 3' 5' CTAATTGCGCA 3' → 3' ACGCGTTAATC 5' As Tm dos dois iniciadores devem ser similares. Em caso de diferença, a temperatura de anelamento deve ser calculada com base no iniciador com menor Tm. •Qualidade da solução com o DNA-molde Contaminação com reagentes utilizados na preparação de amostras de DNA, como sais, guanidina, proteases, solventes orgânicos e SDS, pode inibir a atividade da Taq DNA-polimerase. • Quantidade de DNA Erros muito comuns: DNA-molde em excesso

Aconselha-se iniciar com pelo menos 104 cópias da molécula do DNA-molde, mas a concentração do DNA-molde na reação deve ser ≤ 10ng/μl.

(1 μg de um fragmento de DNA de fita dupla de 1 kb = 9,12 x 1011 moléculas)

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rot prati cas

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