PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DE CHILE

FACULTAD DE AGRONOMA E INGENIERA FORESTAL

DIRECCIN DE INVESTIGACIN Y POSTGRADO

PROGRAMA DE POSTGRADO EN CIENCIAS DE LA AGRICULTURA

MAGISTER EN CIENCIAS ANIMALES

EFECTO DEL NIVEL Y TIPO DE PROTENA DIETARIA EN INDICADORES ENZIMTICOS DEL ESTRS OXIDATIVO EN JUVENILES DE RBALO

(Eleginops maclovinus).

Tesis presentada como requisito para optar al grado de

Magister en Ciencias Animales

por:

Luis Alberto Molina Abarza

Comit de Tesis

Profesor Gua: Rui Miguel S.

Profesores Informantes:

Fernando Bas

Ivn Pea

Octubre 2012

Santiago-Chile

Agradecimientos

Se agradece al Proyecto de Iniciacin FONDECYT 11080168 por el financiamiento

entregado para la realizacin de la presente tesis.

Al mismo tiempo se agradece enormemente a Mara Jos Rioseco y Rui S por la gran

ayuda prestada durante los anlisis y posterior revisin de los datos obtenidos. Tambin,

agradezco a mis profesores informantes Ivn Pea y Fernando Bas por el apoyo

brindado.

Se agradece a Luis Vargas y su laboratorio en la Universidad Austral de Chile por el

trabajo de histologa en hgados e intestinos de rbalo.

Dedicado a:

Mi madre Vernica, por sus incansables esfuerzos y apoyo incondicional.

NDICE

ABSTRACT. 1

INTRODUCCIN... 2

MATERIALES Y MTODOS 8

-Condiciones experimentales de los peces analizados.. 8

-Muestreo................. 9

-Preparacin de las muestras . 9

-Anlisis bioqumico........ 10

-Anlisis histolgico..... 12

-Anlisis estadstico.. 13

RESULTADOS.. 13

DISCUSIN 27

-Efecto del nivel de protena dietaria en los indicadores de estrs oxidativo....... 29

-Efecto de la utilizacin de lupino en los indicadores de estrs oxidativo. 36

CONCLUSIN.. 38

RESUMEN..... 40

LITERATURA CITADA..... 41

ANEXOS..... 49

17

Al evaluar la enzima GST se observ un efecto significativo del nivel creciente de protena

en la dieta. El modelo de regresin que mejor se aproxima a la representacin de la

actividad enzimtica en funcin del nivel de protena fue de tipo lineal, es decir hay una

relacin inversa de la actividad enzimtica con el aumento de protena de la dieta. Al

evaluar el efecto de la inclusin de lupino, no se observ un efecto significativo de la

utilizacin proteica de lupino en la actividad enzimtica, ni tampoco del nivel de protena

en la dieta a los 2 niveles proteicos probados.

Figura 7. Actividad enzimtica de GST en hgados de rbalo (Eleginops maclovinus). A: Anlisis de regresin: Efecto del nivel creciente de protena en la dieta para 6 niveles de inclusin (9, 14, 21, 28, 35 y 42). B: Anlisis factorial: Efecto de la inclusin de harina de lupino en 2 niveles de la dieta 28 y 35; s: significativo, ns: no significativo, int: interaccin. Valores son presentados como promedios (n=3) desviacin estndar (DE). Significancias p < 0.05.

Para la enzima GR, se observaron diferencias significativas entre los distintos grupos de

peces al evaluar el efecto de la protena de la dieta. El modelo de regresin que mejor se

aproxima a la representacin de la actividad enzimtica en funcin del nivel de protena

fue de tipo lineal y directa, es decir con el aumento de protena de la dieta hubo un

0

20

40

60

80

100

9P 14P 21P 28P 35P 42P

nm

/min

/mg

pro

t

A. Anlisis regresin GST

0

20

40

60

80

100

28 35

nm

/min

/mg

pro

t

B. Anlisis factorial GST

HP

HL

Nivel de protena en la dieta

Nivel de protena en la dieta

Nivel de prot.

Origen de prot.

Int

ns ns ns

R2 p Coef. Var.

0,65 0,004 11%

Anlisis de regresin

Anlisis factorial

18

aumento en la actividad de esta enzima (Figura 8), situacin contraria a lo observado en

la enzima GST. El aumento de la actividad de la GR fue observado tambin en los grupos

de peces que se alimentaron con dietas con lupino, relativamente a las dietas con harina

de pescado como fuente proteica- aunque se haya observado un efecto significativo de la

inclusin proteica de lupino, no se observ un efecto significativo del nivel de protena de

la dieta en los niveles de protena probados y tampoco se observ una interaccin del tipo

de protena y del nivel de protena en la dieta.

Figura 8. Actividad enzimtica de GR en hgados de rbalo (Eleginops maclovinus). A: Anlisis de regresin: Efecto del nivel creciente de protena en la dieta para 6 niveles de inclusin (9, 14, 21, 28, 35 y 42). B: Anlisis factorial: Efecto de la inclusin de harina de lupino en 2 niveles de la dieta 28 y 35; s: significativo, ns: no significativo, int: interaccin. Valores son presentados como promedios (n=3) desviacin estndar (DE). Significancias p < 0.05.

De acuerdo al anlisis realizado para la enzima G6PDH, se observaron diferencias

significativas entre los grupos de peces al evaluar el efecto del nivel proteico creciente de

la dieta. El modelo de regresin que mejor se ajusta a la representacin de la actividad

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

9P 14P 21P 28P 35P 42P

nm

NA

DP

H o

x/m

g p

rot

A. Anlisis de regresin GR

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

28 35

nm

NA

DP

H o

x/m

g p

rot

B. Anlisis factorial GR

HP

HL

Nivel de protena en la dieta

Nivel de protena en la dieta

Nivel de prot.

Origen de prot.

Int

ns s ns

R2 p Coef. Var.

0,85 0,0002 21,6%

Anlisis de regresin

Anlisis factorial

19

enzimtica en funcin del nivel de protena es de tipo cbico y se observ un aumento de

actividad de la enzima con el aumento de la protena (Figura 9). Para esta enzima no se

determin el efecto de la inclusin de lupino.

Figura 9. Actividad enzimtica de G6PDH en hgados de rbalo (Eleginops maclovinus). Efecto del nivel creciente de protena en la dieta para 6 niveles de inclusin (9, 14, 21, 28, 35 y 42). Valores son presentados como promedios (n=3) desviacin estndar (DE). Significancias p < 0.05.

Segn el anlisis de los valores observados de la lipoperoxidacin en hgado, se

demostr un efecto significativo al evaluar el efecto del nivel de protena en la dieta. El

modelo de regresin que mejor se aproxima a la representacin de los valores de este

indicador en funcin del nivel de protena fue de tipo cuadrtico, siendo significativamente

mayor en los peces alimentados con dietas de bajo contenido en protena y disminuyendo

a medida que aumenta el contenido proteico de la dieta (Figura 10a, LPO-H). Al evaluar el

efecto de la inclusin de lupino, no se observ un efecto significativo de la inclusin

proteica de lupino, pero si se observ un efecto significativo del nivel de protena en la

dieta. Contrariamente a lo observado en tejido heptico, para la lipoperoxidacin en tejido

muscular no se observ una tendencia en funcin del nivel de protena incorporado en la

dieta (Figura 10b, LPO-M). En relacin al anlisis observado en las dietas que contenan

protena vegetal, tampoco se observ un efecto significativo de la inclusin proteica de

lupino, ni un efecto significativo del nivel de esta protena en la dieta.

R2: 0,99

p: 0,01

CV: 10,7%

0

40

80

120

160

200

9P 14P 21P 28P 35P 42P

nm

/min

/mg

pro

tG6PDH

Nivel de protena en la dieta

24

presentaron hepatocitos con forma y tamao que se considera normal, sumado a algunos

adipositos (AD) dispersos (Figura 12).

Figura 12. Comparacin de cortes histolgicos de hgado de rbalo para dietas 9P y 35P (H&E x20).

En tejido intestinal, aunque no se haya encontrado una relacin entre el nmero de

Clulas Caliciformes (c.c.) y el contenido en protena en la dieta, cuando comparamos los

tratamientos con niveles extremos de protena (9P y 35P) se observ una disminucin del

nmero de estas clulas en la mucosa de los peces alimentados con dietas de menor

contenido en protena (9P), comparativamente a los grupos de peces alimentados con la

dieta 35P (Figura 13). Tambin se ha podido observar que las micro-vellosidades

intestinales de los grupos que recibieron la dieta 9P son ms cortas que las de la 35P y

presentan invaginaciones (i.v.) consideradas anormales, sugiriendo un proceso

inflamatorio (Urn, 2008).

Figura 13.Comparacin de cortes histolgicos de intestino de rbalo para dietas 9P y 35P (H&E x4).

Dieta 9P

Dieta 9P Dieta 35P

c.c. c.c.

N.R.

P.N.

N.I.

Dieta 35P

AD

i.v.

25

Cuando se analizan comparativamente hgados obtenidos desde peces que recibieron

dietas que contenan 28% de inclusin de protena con y sin lupino, y dietas al 35% de

protena dietaria con y sin lupino, se observa en ambos grupos hepatocitos de buena

conformacin, bien distribuidos y considerados normales, sin apreciarse dao tisular por

efecto del origen de la protena (Figuras 14 y 15 respectivamente).

Figura 14. Comparacin de cortes histolgicos en hgado de rbalo para dietas 28P15L y 28PLU. (H&E x20).

Figura 15. Comparacin de cortes histolgicos en hgado de rbalo para dietas 35P15L y 35PLU. (H&E x20).

Al analizar comparativamente cortes histolgicos de intestinos de peces que se

alimentaron con dietas que contenan 28% de inclusin de protena, con y sin lupino, y

dietas al 35% de protena dietaria, con y sin lupino, se observa un igual nmero de

Clulas Caliciformes (c.c) en ambas mucosas, micro-vellosidades largas y bien

conformadas y ausencia de dao tisular (Figuras 16 y 17 respectivamente).

Dieta 28P15L Dieta 28PLU

Dieta 35P 15L Dieta 35PPLU

Dieta 35PLU

Dieta 28PLU

26

Figura 16.Comparacin de cortes histolgicos en intestino medio de rbalo para dietas 28P15L y 28PLU.

(H&E x4).

Figura 17.Comparacin de cortes histolgicos en intestino medio de rbalo para dietas 35P15L y 35PLU,

(H&E x4).

Dieta 28P Dieta 28PLU

Dieta 35P Dieta 35PLU

c.c.

c.c.

c.c.

c.c.

27

Discusin

Los juveniles de rbalo, al igual que todos los organismos que utilizan oxgeno en

situaciones normales, producen ERO durante su metabolismo. Estos radicales se

consideran molculas mensajero y controlan procesos de ventilacin, relajacin muscular

y funciones inmunolgicas en los peces (Drge 2002). A su vez, las defensas

antioxidantes del organismo aseguran que las EROS no extiendan una accin catablica

toxica sobre el propio organismo, dependiendo as la homeostasis del equilibrio entre

factores oxidantes y antioxidantes del organismo. Este equilibrio es frecuentemente

perturbado por diversas situaciones, tales como la presencia de xenobiticos (Ferreira et

al., 2006); la contaminacin con metales pesados (Pandey et al., 2001; Ferreira et al.,

2008); la presencia de un estrs nutricional (Pascual et al., 2003; Welker et al., 2003;

Sitj-Bobadilla et al., 2005), entre otros. Estas situaciones resultan en una sobre-

estimulacin y generacin de ERO, la cual, al provocar una situacin de estrs oxidativo

en el organismo, gatilla una respuesta de defensa que es evidenciada por un aumento de

la actividad de algunas enzimas y la cantidad de algunos indicadores celulares, tales

como la oxidacin lipdica o proteica.

El presente experimento prob el efecto de la utilizacin de dietas con diferente contenido

de protena (concentracin y tipo de protena) en el equilibrio redox de juveniles de rbalo

mantenidos en cautiverio, en idnticas condiciones de densidad y de variables

ambientales. De todos los indicadores de respuesta a una situacin de estrs oxidativo

probados, algunos evidenciaron una estrecha relacin con el nivel proteico entregado en

la dieta, mientras que otros indicadores no mostraron tal relacin.

Este estudio comenz del principio de que la utilizacin de un nivel de protena en la dieta

que no sea el ideal para la especie, representa un desbalance nutricional y resultar en

una consecuente variacin del equilibrio entre los EROS formados y la respuesta de

defensa del organismo. La validacin de una relacin entre la actividad de algunos

indicadores de estrs oxidativo y el nivel proteico de la dieta representa un enorme

potencial, pues permitir identificar de forma inmediata una posible situacin de carencia

o exceso de protena al comparar grupos de peces de esta especie mantenidos en

cautiverio y alimentados con diferentes niveles de protena en la dieta.

28

Del experimento de crecimiento ejecutado con juveniles de rbalo alimentados durante 14

semanas a saciedad visual aparente con dietas isoenergticas e isolipdicas y con

variable contenido en protena, se estim que 35.5% de protena en la dieta

correspondera al ptimo de protena dietaria necesaria para un mximo crecimiento. A

partir de este nivel de incorporacin de protena, aunque la proporcin en la dieta del

contenido en hidratos de carbono y protena variara, no se observaron diferencias

significativas de crecimiento o composicin proximal en los peces. En los peces

alimentados con niveles de incorporacin proteica ms altos no se observaron diferencias

significativas de crecimiento ni composicin proximal, pese a que la proporcin en la dieta

de hidratos de carbono y protena variara. Por otro lado, se observ una disminucin del

crecimiento en los grupos alimentados con niveles de protena inferiores a 35,5%. Para la

composicin proximal, solamente se observ una variacin significativa cuando el nivel de

protena en la dieta era inferior a 14%, aunque la razn protena/energa variara en todos

los grupos experimentales. Adicionalmente, los indicadores de crecimiento o composicin

proximal no han podido evidenciar un efecto significativo de la utilizacin de protena de

origen vegetal (harina de lupino a 20% de la composicin de la dieta), como reemplazante

proteico de la harina de pescado.

Los anlisis bioqumicos realizados en tejido heptico y muscular de peces de los

diferentes grupos experimentales han permitido identificar variaciones fisiolgicas donde

los resultados zootcnicos mencionados antes no las han permitido distinguir.

Concretamente, se pudo distinguir diferentes respuestas metablicas a un aumento de

produccin de EROS en dos situaciones nutricionales distintas (carencia de protena y

exceso de protena en la dieta) y se pudo adems estimar un posible efecto benfico de la

utilizacin de la harina de lupino al nivel de la respuesta antioxidante, cuando es

incorporado a 20% en la dieta.

A continuacin se plantear la interpretacin de los resultados obtenidos en funcin de los

cambios fisiolgicos anteriormente descritos:

29

1. Efecto del nivel de protena dietaria en los indicadores de estrs oxidativo

Deficiencia de protena en la dieta:

De las dietas experimentales probadas, las que contenan bajos niveles de protena

tenan simultneamente un alto contenido en carbohidratos (CHOs) (Anexo 1 Cuadro

1), el cual podra representar un agente estresor (Morel y Barouki, 1999). La falta de

protena afectara tanto la sntesis proteica como la estructura celular, y el exceso de

CHOs podra generar inflamaciones a nivel intestinal y disminucin del crecimiento,

siendo esta situacin anteriormente reportada en salmn del atlntico (Hemre et al.,

1995). Esto desencadenara un desequilibrio a nivel de la cadena transportadora de

electrones y aumentara la produccin de ERO. En el presente trabajo se cree que ocurri

tal situacin, al observar el aumento de los indicadores de respuesta antioxidante y los

indicadores de dao tisular estudiados. Por otro lado, relativo a la respuesta antioxidante,

Hilton y Atkinson (1982) al determinar el efecto nutricional en la regulacin enzimtica en

truchas arcoris, observaron una alta actividad de la G6PDH cuando fueron alimentadas

con dietas altas en CHOs. La G6PDH, siendo una enzima indicadora de lipognesis, es

simultneamente una enzima indicadora de la ocurrencia de estrs oxidativo y en el

presente experimento, los tratamientos que presentaron la mayor relacin entre CHO y

protenas en la dieta fueron los grupos 9P y 14P, no siendo visible en estos grupos un

aumento de la actividad de la enzima G6PDH. Aunque esto pudiera indicar una ausencia

de estrs oxidativo en estos grupos, su presencia no puede ser descartada.

Concretamente, se observ en estos tratamientos una disminucin del crecimiento

(Llancabure 2011) y un dao tisular a nivel intestinal, tal como haba sido observado por

Hemre et al. (1995). Adems, otros indicadores enzimticos y de dao tisular han

mostrado alta actividad en estos grupos experimentales, indicando que la presencia de

estrs oxidativo debe ser sealada mediante una anlisis multiparamtrico de indicadores.

Efectivamente, adems del aumento de los indicadores de oxidacin tisular (TBARS y

PROTOX), fue posible tambin observar alta actividad en las enzimas SOD, CAT, GPx y

GST en los peces alimentados con las dietas de menor inclusin proteica (9P y 14P),

indicando una respuesta del organismo a un aumento de la produccin de EROS.

En relacin a la utilizacin de dietas con bajos niveles de protena, el estrs resultante de

deficiencias en nitrgeno puede ser justificado por una posible limitacin de la sntesis

30

proteica y un consecuente dao a la estructura celular. Boer et al., 2010 explica esta

situacin por la ocurrencia de una sntesis de protenas deteriorada, la cual, entre otros

factores, desencadenar un desequilibrio a nivel de la cadena transportadora de

electrones produciendo un incremento de ERO a nivel celular y elevando tambin los

valores de las enzimas antioxidantes.

Relativamente a los grupos alimentados con bajos niveles de protena, se registr una

ingestin de alimento muy baja, observndose el rechazo del alimento e inclusivamente

una prdida de peso en el grupo 9P. En este tratamiento se asume que los peces

metabolizaron parte de los lpidos y protenas estructurales para la obtencin de energa,

situacin que no ocurri en los tratamientos con niveles de protena superiores. En el

grupo alimentado con la dieta con 9% de protena (9P), se observ adems una variacin

en la composicin proximal, con una disminucin significativa del contenido en grasa

relativo a los dems grupos experimentales (Llancabure, 2011). Esta situacin, adems

de explicar los bajos niveles de actividad de la enzima G6PDH, indicadora de sntesis

lipdica, fue acompaada de un incremento en la mayora de los indicadores de estrs

oxidativo y de dao tisular, apuntando este conjunto de resultados a un estado de gran

estrs oxidativo en los grupos 9P y 14P. Cabe mencionar que aunque no se haya

observado en el grupo 14P diferencias en la composicin proximal de los peces

comparativamente a grupos alimentados con mayor nivel de protenas, las diferencias en

el crecimiento son corroboradas por la alta actividad de las enzimas indicadores de estrs

oxidativo, confirmando un estrs nutricional que haba sido apenas sugerido por el menor

crecimiento observado. Para los tratamientos de bajo contenido proteico en la dieta, el

anlisis complementario de otros parmetros sanguneos (lactato, glucosa, cortisol)

ayudarn a confirmar un estado de estrs fisiolgico asociado al estrs celular

encontrado.

Otros trabajos han igualmente asociado la disminucin del crecimiento a una situacin de

estrs oxidativo. Braun et al., 2006; 2008, observaron menor crecimiento en Rhamdia

quelen y Leporinus elongatus, cuando fueron sometidos a hipoxia severa, la cual resulta

en un aumento significativo de radicales libres. Tal como ocurri en el presente trabajo,

estos autores explicaron el menor crecimiento observado por un desvo de la energa

disponible hacia la sntesis de defensas antioxidantes. En estos trabajos, se observ

igualmente una alta actividad de las enzimas SOD y CAT asociada a altos valores de

31

TBARS en los peces sometidos a la hipoxia severa como factor de estrs. La presencia

de una baja tasa de ingestin, baja tasa de crecimiento y una alta respuesta enzimtica

de la CAT, SOD, GPX y GST, adems del aumento de los indicadores de oxidacin tisular

LPO-H y PROTOX-H fueron tambin observadas en dentn (Dentex dentex) cuando fue

sometido a tratamientos de ayuno (Morales et al., 2004), indicando una respuesta

metablica similar al rbalo cultivado en una situacin de carencia nutritiva.

Correlacin entre los diferentes parmetros bioqumicos determinados:

De los indicadores de estrs oxidativo determinados, la SOD es la primera enzima en

generar una respuesta contra un aumento de las ERO (McCord y Fridovich, 1969).

Adems, Winston y Di Giulio, 1991, afirmaron que en organismos acuticos, la SOD es la

enzima que ofrece la mayor respuesta contra un EO. Sin embargo, otros autores han

definido una accin sinrgica entre las enzimas SOD y CAT (Belge et al., 2008), siendo

ambas descritas como un set de proteccin antioxidante (Kono y Fridovic, 1982). Estas

enzimas antioxidantes son las primeras en generar una respuesta de defensa. Es

importante destacar el comportamiento inverso evidenciado entre ellas en el presente

trabajo, mostrado por una correlacin negativa significativa entre ellas, la cual fue notoria

cuando el nivel de protena en la dieta era alto. Esta misma relacin inversa fue tambin

observada en hgados de trucha arcoris y esturin en el estudio realizado por Trenzado et

al., 2006.

Para otros indicadores estudiados, las enzimas dependientes del glutatin (enzimas GPX,

GR, GST), la enzima GPX present una correlacin positiva con las enzimas CAT, GST, y

con los indicadores LPO-h y PROTOX-h, observndose los mayores valores en los

tratamientos con menor contenido en protena de la dieta. Esta correlacin seala que en

esta especie este grupo de enzimas vara significativamente con el contenido proteico en

la dieta, aumentando su actividad simultneamente a la ocurrencia de dao oxidativo en

las dietas con menor contenido en protena.

Exceso de protena en la dieta:

Los parmetros de crecimiento y composicin corporal obtenidos para este mismo

experimento determinaron que aunque el nivel de protena de 35% haya sido el nivel

32

indicado para alcanzar un crecimiento mximo, 30% de protena en la dieta corresponde

al menor nivel de protena de la dieta necesario para obtener un nivel mximo de

retencin de nitrgeno (gN kg peso promedio-1 dia-1). Estos parmetros plantean que en

los grupos alimentados con las dietas 35 y 42% de protena posiblemente ocurrir un

aumento de la tasa metablica de degradacin proteica y un consecuente aumento de la

produccin de ERO a nivel mitocondrial y una alta respuesta de los mecanismos

antioxidantes. De acuerdo con Walzem et al., 1991, la actividad heptica de algunas

enzimas est ntimamente relacionada con el crecimiento del pez, sin embargo en el

presente estudio se observaron las ms altas actividades en los peces de menor tamao.

Walton et al., 1986 observaron un aumento en la actividad de las enzimas

gluconeognicas y en Treonina deshidrogenasa, Alanina aminotransferasa y Glutamato

deshidrogenasa en trucha arcoris alimentadas con dietas altas en protena, evidenciando

una mayor actividad metablica heptica. Esta mayor actividad metablica fue tambin

observada por otros autores en diferentes especies (Petzke et al., 2000) no siendo

asociada a una situacin de estrs oxidativo. En el presente estudio, los resultados

obtenidos igualmente sugieren un aumento de la formacin de EROs y una eficiente

respuesta del organismo de proteccin antioxidante.

Concretamente, la determinacin de la actividad de algunos indicadores del metabolismo

intermediario (enzimas Alanina Amino-Transferasa ALT, Glutamato deshidrogenasa

GDH, Sintetasa de cidos grasos FAS, Glucosa-6-Fostato deshidrogenasa G6PDH,

Fructosa 2,6 bifosfatasa) apuntaron a un aumento del metabolismo en los grupos

alimentados con altos niveles de protena (Rioseco, 2011). En cuanto a la respuesta

antioxidante, la relacin entre la actividad de la enzima CAT y el nivel de incorporacin

proteico probado en la dieta fue de tipo cuadrtica, siendo alta la actividad en los grupos

con menor y mayor nivel de protena. Por otro lado, en los grupos que recibieron altos

niveles de protena (35P y 42P) bajos niveles de TBARS y PROTOX fueron observados,

indicando una eficiencia de la enzima CAT como un mecanismo de proteccin

antioxidante en estos tratamientos. As, la mayor actividad metablica en los peces que

fueron alimentados con las dietas con mayor contenido en protena result en un aumento

de la formacin de EROS, los cuales fueron balanceados por el aumento de la actividad

de la enzima CAT y de otras defensas antioxidantes. De este modo, se puede distinguir el

estado fisiolgico indicado por una alta actividad de la CAT en los peces alimentados con

dietas de bajo nivel de inclusin proteica estado de estrs oxidativo del estado de alta

33

actividad metablica indicado por la actividad de esta misma enzima en los tratamientos

de alta inclusin proteica. Tal como fue mencionado, la definicin de ambos estados

depender no solamente de la actividad de la enzima CAT, sino que tambin de los

indicadores de LPO y PROTOX que definirn la presencia o no de un estado de EO.

Finalmente se destaca una alta correlacin observada entre las enzimas CAT y GPX

(p=0.02, R2=0.63), la cual sugiere una respuesta a situaciones de estrs oxidativo o

aumento metablico (bajos o altos niveles de protena, respectivamente) similar para las

dos enzimas con accin de proteccin antioxidante. A su vez, la enzima GST, aunque

tambin presente una correlacin positiva con las enzimas CAT y GPX, su alta actividad

solamente fue demostrada en los grupos alimentados con bajos niveles de protena, no

registrando un aumento de su actividad con el aumento de la actividad metablica

sugerida para los grupos alimentados con dietas de alto contenido proteico. La importante

accin de la enzima GST frente a una situacin de estrs oxidativo fue tambin detectada

en turbot (Scophthalmus maximus) frente a la presencia dietaria de ingredientes

precursores de radicales libres (Tocher et al., 2003). La actividad de las enzimas GST,

GPX y GR est ntimamente relacionada con la presencia de Glutatin en su forma

reducida u oxidada (GSH o GSSG) y en el presente experimento las enzimas GPX y GST,

aunque hayan presentado una alta actividad en los tratamientos de menor contenido en

protena, podran haber presentado una actividad ms alta si la actividad de la enzima GR

hubiese sido igualmente alta. La forma reducida del Glutatin (GSH), convertida por la

enzima GR, representa el sustrato de las enzimas GPX y GST, que convertiran el

glutatin a su forma oxidada (GSSG) (Leopold y Loscalzo, 2000), estimulando a su vez el

aumento de la actividad de la enzima GR. Diferentes situaciones podran explicar la baja

actividad de la enzima GR y alta actividad de las enzimas GPX y GST: por un lado podra

estar presente un insuficiente aporte nutricional de la forma reducida del glutatin (GSH),

acompaado de una baja disponibilidad de NADPH (sugerido por la baja actividad de la

enzima G6PDH, en estos tratamientos). De este modo estara presente el sustrato de las

enzimas GPX y GST sin intervencin significativa de la enzima GR. Por otro lado, en los

grupos alimentados con bajos niveles de protena en la dieta puede haber ocurrido un

bombeo de la forma oxidada del glutatin (GSSG) hacia el exterior de la clula. Esta

situacin fue observada por Keppler (1999) en situaciones en que la actividad de la GR es

insuficiente para la conversin del GSSG en GSH. Considerando esta posibilidad, esto

explicara una alta actividad de las enzimas GPX y GST y una simultnea baja actividad

34

de la enzima GR. Por el momento no hay informacin que permita confirmar el posible

bombeo de GSSG hacia el exterior de la clula. Por otro lado, los resultados disponibles

hasta el momento siguieren que efectivamente la disponibilidad de NADPH que permita la

accin de algunas enzimas antioxidantes fue significativamente ms alta en los

tratamientos con dietas de alta concentracin proteica en relacin a los tratamientos de

baja concentracin proteica. En este sentido, la actividad de la enzima G6PDH,

productora de NADPH, fue significativamente ms alta en las dietas de mayor inclusin

proteica y, no se observ una variacin significativa de la concentracin lipdica en los

peces de estos grupos experimentales (Llancabure, 2011 y Rioseco, 2011). Esta situacin

sugiere que el poder reductor del NADPH no fue destinado a la sntesis lipdica, siendo

utilizado por las enzimas antioxidantes, tales como la GR. Para corroborar esta hiptesis

se tiene la alta correlacin observada entre las enzimas GR y G6PDH para los altos

niveles de protena probados.

Indicadores de estrs oxidativo en diferentes tejidos:

Los presentes resultados corroboran la necesidad inherente a este tipo de estudios en

determinar la actividad de una amplia gama de indicadores de respuesta a una situacin

de estrs oxidativo. Esto se debe a que las diferentes especies de peces cuentan con

diferentes mecanismos de proteccin antioxidante que responden de forma particular, en

diferentes tejidos y en diferentes situaciones fisiolgicas, que inducen la formacin de

EROS. Concretamente y con respecto a la actividad enzimtica medida, la GPx mostr

ser una efectiva defensa heptica al estrs oxidativo en rbalo, al contrario de lo

observado por Trenzado et al., 2006, que mostr en hgado su menor actividad cuando

fue comparada con otros tejidos. Por otro lado, en este mismo estudio de Trenzado et al.

2006, se observ una mayor actividad de la enzima CAT en hgado que en msculo,

justificando estos autores las diferencias por el mayor consumo de oxgeno y actividad

metablica ms alta observada en hgado.

Con respecto al grado de peroxidacin lipdica (LPO), se observ una alta actividad de

este parmetro en hgado (LPO-H) en los tratamientos de menor nivel de incorporacin

proteica, indicando la presencia de estrs oxidativo y tambin una posible movilizacin de

lpidos (Ferreira et al., 2005; 2007). La correlacin positiva observada entre la LPO y

algunas enzimas de proteccin antioxidante corrobora la presencia de una actividad

35

enzimtica combinada para poder disminuir y/o detener la accin promotora de

lipoperoxidacin. Sin embargo, la actividad de lipoperoxidacin medida en tejido muscular

(LPO-M) mostr un patrn de variacin distinto al observado en hgado, con altas

variaciones estndar, lo que no fue esperado y no permite encontrar una explicacin para

lo ocurrido. Los resultados obtenidos son contrarios a los de otros trabajos, en los cuales

se observa una variacin similar de respuesta a tratamientos experimentales en msculo

e hgado (Braun et al., 2008).

Las protenas oxidadas (PROTOX) y LPO a nivel heptico y muscular han sido utilizadas

en diferentes trabajos como indicadores de dao celular (Morales et al., 2004; Ferreira et

al., 2008; Ferreira et al., 2010). En el presente trabajo una correlacin positiva entre estos

indicadores de dao oxidativo fue observada en tejido heptico (p=0.001, R2=0.76). En

los trabajos de Ferreira et al. (2008; 2010), una similar correlacin positiva fue observada

para estos parmetros, observndose que el incremento de la LPO en hgado puede ser

responsable por un consecuente aumento del nivel de PROTOX. En el presente trabajo,

en los diferentes grupos experimentales no fueron observadas diferencias significativas

para estos indicadores de oxidacin tisular y tampoco una asociacin fue observada en

tejido muscular, imposibilitando determinar si en el musculo existi un real dao proteico o

lipdico.

A nivel muscular, los valores promedios observados en PROTOX evidencian un bajo nivel

de oxidacin proteica en las dietas de menor y mayor nivel de inclusin proteica. Estos

resultados sugieren que a nivel muscular no ocurri un dao proteico significativo,

presumiblemente debido al efecto protector de las enzimas antioxidantes presentes y que

evidenciaron un aumento significativo de su actividad.

Histologa digestiva:

El anlisis histolgico permiti observar en el grupo de peces alimentado con dietas con

bajo aporte proteico la presencia de hepatocitos anormales, con desplazamiento de los

ncleos hacia la periferia celular, agrupndose en forma de rosetas (N.R.) o presentando

ncleos con bordes irregulares (N.I.). En el tejido intestinal analizado, fue observado para

estas mismas dietas, que los peces presentaron bajo nmero de clulas caliciformes (c.c.)

36

y la presencia de vellosidades intestinales cortas, engrosadas y daadas. Por otro lado,

peces alimentados con las dietas con mayor concentracin en protena (> 21% de

inclusin) presentan hepatocitos y adipositos considerados normales, atendiendo a su

tamao y cantidad.

Estos resultados permitieron confirmar que los peces que fueron alimentados con bajos

niveles de protena presentaron un aumento de las respuestas antioxidantes a nivel

celular, evidenciando un estrs oxidativo, confirmado por la presencia de dao tisular,

demostrado por los ndices de TBARS, PROTOX y tambin corroborado por el anlisis

histolgico observacional.

2. Efecto de la utilizacin de lupino en los indicadores de estrs oxidativo

Para el presente experimento se utiliz lupino blanco (L. albus) como reemplazante de la

harina de pescado, el que ha sido descrito por Sujack et al., 2006, como un cultivo con

uno de los mayores niveles de aminocidos, mejor perfil y ms altos niveles de

aminocidos esenciales, que otras especies por los estndares de nutricin para

humanos y animales. Segn Llancabure (2011), se observ que la inclusin dietaria de

lupino no afect significativamente el ndice Hepatosomtico (IHS) de los peces y

tampoco el crecimiento. Similarmente, en nuestros resultados, la mayora de los

indicadores de estrs oxidativo aqu cuantificados no present significancias frente a la

inclusin de lupino, por lo que se esperaba un comportamiento similar entre estos

indicadores. De las enzimas e indicadores estudiados, solamente la GR y GPX arrojaron

resultados significativos para el tipo de protena utilizado y se observ una interaccin

entre la cantidad de protena y el tipo de protena utilizado y las PROTOX-H en la

interaccin de ambos factores (nivel de protena dietario x tipo protena). Aunque no haya

mucha investigacin realizada en el Rbalo con respecto a estos parmetros, la utilizacin

de lupino dulce en otras especies gener una disminucin del IHS en los peces (Borquez

et al., 2011a), siendo en este trabajo juveniles de truchas arcoris alimentadas con dietas

con un porcentaje de inclusin significativamente ms alto que los que fueron probados

en el reemplazo parcial utilizado en esta investigacin.

37

Anlogamente a lo observado en los parmetros zootcnicos, en la mayora de los

indicadores medidos en el presente estudio, la inclusin de lupino al 20% no influy sobre

la actividad ni nivel de los indicadores de estrs oxidativo y dao tisular analizados. Por lo

tanto la presencia de ciertos alcaloides presentes en el lupino blanco (Erbas et al., 2006)

no afectaron la actividad heptica de los peces que recibieron las dietas con contenido

vegetal. En el estudio en salmones (Salmo salar L.) de Olsvik et al., 2011, se observ que

dietas con contenido vegetal presentaban mayor contenido de antioxidantes (GSH y -

tocoferol), lo que probablemente influenci una mejor respuesta antioxidante, situacin no

observada en nuestro estudio.

En el presente trabajo, la GPX (p=0.01), la GR (p=0.01) y los niveles de PROTOX

hepticos (p=0.0003) sugieren que habr un efecto positivo de la utilizacin de protena

de origen vegetal. Similarmente, en el estudio de Ashida et al., (2006) juveniles de

Paralichthys olivaceus, cuando fueron alimentados con un producto vegetal fermentado,

evidenciaron alta actividad de la GPX y menores niveles de LPO en hgado. Estos autores

sugirieron que habra ocurrido un efecto supresor de la LPO por el fermentado vegetal.

Para los dems parmetros estudiados, no se observaron diferencias significativas entre

la utilizacin de harina de lupino y harina de pescado. La mayor actividad de GPX y GR

observada en el presente trabajo se debi posiblemente a la mayor disponibilidad y aporte

de glutatin (GSH) presente en las dietas con contenido vegetal (Olsvik et al., 2011).

Sin embargo, Olsvik et al., 2011 tambin observaron que al cambiar desde una dieta de

origen marino a una dieta de origen vegetal afecta la expresin gnica y las defensas

antioxidantes del pez en el corto plazo. Ellos observaron bajos niveles transcripcionales

de la SOD-CuZn, SOD-Mn, bajos niveles hepticos de GSH y menor actividad de la SOD

y CAT, sugiriendo una menor defensa antioxidante. No obstante, en el largo plazo

(medicin al da 17), los niveles de TBARS no variaron, hubo menores niveles de cortisol

plasmtico y los niveles transcripcionales de la GPX aumentaron. Coincidentemente, en

nuestras mediciones se observ que la LPO en hgado no vari y la GPX y GR

aumentaron significativamente sus actividades en los peces que recibieron las dietas con

lupino, corroborando el resultado de que hubo un mayor aporte de GSH entregado por las

dietas vegetales.

38

A nivel histolgico, se observ que la utilizacin de 20% de lupino en dietas con 28% y

35% de protena dietaria no genera en juveniles de rbalo alteraciones a nivel de los

hepatocitos, de los enterocitos y ni de los adipocitos. En Borquez et al., 2011a al incluir

harina de lupino blanco entero en las dietas para trucha arcoris, se observ a nivel tisular

que la utilizacin de niveles muy altos de inclusin de lupino (40% de la dieta) puede

resultar en un excesivo aumento de clulas adiposas en hepatocitos. As, Vilhelmsson et

al., 2004 observaron en Oncorhynchus mykiss, que el remplazo dietario del 100% de la

harina de pescado por una mezcla de productos de origen vegetal gener un aumento en

la actividad de la G6PDH y enzima mlica (ME), enzimas indicadoras de la lipognesis.

Sin embargo, niveles menores de inclusin, similares a los utilizados en la presente

investigacin, tales efectos no fueron observados y no se observaron patologas

asociadas al contenido vegetal de la dieta, especficamente, la presencia y cantidad de

clulas adiposas en salmn fue considerada normal cuando se remplaza harina de

pescado por niveles de lupino hasta el 30% (Borquez et al., 2011a; 2011b).

Conclusin

Segn los indicadores hepticos y musculares analizados, la utilizacin de niveles de

protena dietaria de 9 y 14% repercuten en un significativo estrs oxidativo en juveniles de

rbalo, comprobado por los altos valores de las enzimas antioxidantes, los altos valores

en los indicadores de dao tisular y daos a nivel tisular observados en la histologa

heptica e intestinal. Estos resultados corroboran que los bajos ndices de crecimiento

observados en tratamientos con un nivel proteico deficitario para la especie son

acompaados por un aumento del estrs oxidativo al nivel metablico.

Se observ igualmente que cuando la protena excede al nivel proteico determinado para

un mximo crecimiento (35,5), aumenta la produccin de compuestos pro-oxidantes y

consecuentemente la actividad de las enzimas antioxidantes de primera accin SOD y

CAT. No obstante, no se produce EO en estos grupos comprobado por los niveles

reducidos de LPO y PROTOX observados a nivel heptico.

39

Para contrarrestar la mayor produccin de ERO, la actividad de las enzimas antioxidantes

hepticas de primera accin tambin aumenta, SOD y CAT, sin embargo no se produce

EO en estos grupos, corroborado por bajos niveles de LPO y PROTOX.

Finalmente, el reemplazo de la harina de pescado por lupino blanco al 20% en dietas que

contienen 28 y 35% de protena dietaria no genera una variacin en los indicadores de

estrs oxidativo, por lo que se considera que juveniles de rbalo aceptan la inclusin

vegetal de lupino al 20%.

40

Resumen

El objetivo de este trabajo fue evaluar en juveniles de rbalo (Eleginops maclovinus) el

efecto metablico de la utilizacin de dietas isoenergticas e isolipdicas con diferentes

niveles de protena de pescado y tambin el efecto de una sustitucin parcial de protena

de pescado por protena vegetal. Para ello, la actividad heptica de las enzimas

antioxidantes clave (CAT, SOD, GPx, GST, GR y G6PDH) y la presencia de algunos de

los indicadores de dao tisular (peroxidacin de lpidos, protenas oxidadas e histologa

heptica e intestinal) fueron determinadas. Los peces fueron distribuidos aleatoriamente

en 24 grupos de 40 peces cada uno. Ocho dietas experimentales fueron asignadas al azar

a los grupos en triplicado y se alimentaron durante 3 meses. Seis dietas presentaban un

aumento de los niveles de protena de pescado (9, 14, 21, 28, 35 y 42% de protena de la

dieta). Adems, dos dietas se formularon con 28 y 35% de protena y con una inclusin de

harina de lupino (Lupinus albus) al 20%. Al final del experimento, las enzimas CAT, SOD,

GPX y GST mostraron una mayor actividad en los grupos de peces alimentados con

menores niveles de protenas -Dietas 9P y 14P. De manera similar, los niveles de TBARS

y protenas oxidadas a nivel heptico mostraron un grado de oxidacin ms alto en los

peces alimentados con dietas con bajo contenido en protena, lo que indica un estrs

oxidativo en estos grupos. La actividad de GR y G6PDH aument con el contenido de

protena en la dieta. Tambin se observ una alta actividad de la enzima CAT en los

peces alimentados con un alto nivel de inclusin de protena, lo que sugiere un aumento

en la actividad metablica en los grupos alimentados con alto contenido de protena. El

anlisis histolgico de los peces alimentados con dietas bajas en protena mostr en

hgado la presencia de ncleos agrupados en rosetas y con forma irregular. En el intestino

se observ una menor presencia de clulas caliciformes y microvellosidades ms cortas y

engrosadas, indicando la ocurrencia de dao celular en ambos tejidos. En cuanto a la

utilizacin de protenas vegetales, los resultados no mostraron un aumento del estrs

oxidativo en los dos niveles de protenas ensayadas. Los parmetros estudiados en este

trabajo mostraron que los juveniles de rbalo presentan una alta tolerancia a las

diferentes dietas y evidencian un alto estrs oxidativo cuando la inclusin de protena

dietaria es muy baja.

Palabras clave: Eleginops maclovinus, Estrs oxidativo, Enzimas antioxidantes,

Lipoperoxidacin, Protenas oxidadas.

41

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49

Anexos

Cuadro 1. Formulacin y composicin de las dietas experimentales

Dietas

9P 14P 21P 28P 35P 42P 28PLU 35PLU

Ingredientes (% materia seca)

Harina de pescado LT (1)

10,0 17,5 27,5 37,5 47,5 57,5 25,5 35,5

Lupino (2) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 20,0 20,0

Almidn (3)

51,0 45,0 37,0 29,0 21,0 13,0 21,5 13,5

Grano de trigo 18,0 18,0 18,0 18,0 18,0 18,0 18,0 18,0

Aceite de pescado 14,3 13,5 12,5 11,5 10,5 9,5 11,0 10,0

Vitaminas & Minerales Premix (4)

1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

NaH2PO4 4,7 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 2,0 1,0

Oxido de cromo III 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Composicin proximal (%DW))

DW 91,37 91,34 91,36 91,38 91,40 91,42 90,40 90,42

Protena 8,94 14,19 21,19 28,19 35,19 42,19 28,19 35,19

Lpidos 15,46 15,42 15,43 15,44 15,45 15,46 15,55 15,56

Ceniza 1,81 2,71 3,91 5,11 6,31 7,51 4,57 5,77

Energa (kJ g-1) 19,49 19,66 19,92 20,18 20,43 20,69 19,95 20,21

P (Total) 1,36 1,39 1,40 1,42 1,44 1,46 1,41 1,43

Proporcin Protena/Lpidos 0,58 0,92 1,37 1,83 2,28 2,73 1,81 2,26

P/E (g / MJ) 7,22 10,80 14,95 18,52 21,63 24,37 16,25 20,26

(1) Harina de pescado ALIMAR, secada con vapor a baja temperatura (LT), (Prot: 72.8% MS; Lip: 9.9% MS).

(2) Lupino blanco AVELUP

(3) Almidn de betarraga (crudo)

(4) Premix vitamnico y mineral DSM, CLSF26A008

50

Figura 1. Modelo que relaciona la Tasa de Crecimiento Especifica (TCE, SGR en ingls) de juveniles de

Eleginops maclovinus con los diferentes niveles de protena dietaria presente en las dietas experimentales

(%). SGR mxima al 95% se obtiene con 35,5% de protena en la dieta y la TCE que cubre las necesidades

de mantencin (TCE MANT) de la especie se obtiene con 8,9% de protena en la dieta

-1,2

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

0 10 20 30 40 50 6035,58,9

Nivel de protena en la dieta (%)

SGR

TCE 95% TCE MANT

Y = (0,616134)*(1-euler^(-(0,113414)*(x-(8,90866))))