Dror E. WARSCHAWSKIdror@ibpc.fr

RMN solide, lipides et gA...

Deuxième réunion ANR-MEMINT, LPS, Orsay, 8 avril 2014

Biologie Physico-Chimique des Protéines Membranaires

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Introduction:13C et 15N

Spectromètre RMN solide700 MHz

ICSN, Gif-surYvetteMscL

Lipides et RMN:

31P13C / 12C et 1H / 2H

Spectromètre RMN solide400 MHz

ENS, Paris

2 0 -2

2H (kHz)

∆νQ

2 0 -2

2H (kHz)

Statique

Saut entre2 sites

Diffusionaxiale

Dynamique dans la membrane

Attention: si θ ≈ 54° (angle magique), alors 3cos2θ - 1 = 0quelque soit la dynamique...

∆νQ = C <3cos2θ - 1><3cos2β - 1>

RMN du 2H :B0

β

Ν+

ΧΗ2

ΧΟ Ο−

Ο

Η3Χ

Η3Χ

ΧΗ3

ΧΗ2ΧΧΗ2Ο

Χ

Η

ΟΧ

ΠΟ

Ο

Ο

ΗΗ Θ

B0

α

β

θ

H

H

so

T°

ld

Davis (1983)

RMN du 2H: « profil de paramètres d’ordre »

∆ν

Q ou

paramètre d’ord re

Mais: nécessité de marquage isotopique au 2H

Les avantages:

-Le 13C est présent tout le long du lipide-Haute résolution de toutes les positions 13C -Pas besoin de marquage isotopique d’où:

1) possibilité d’étudier des lipides insaturés2) possibilité d’étudier des biomembranes

RMN du 13C :

160 120 80 40 013C (ppm)

C12

C13

C14

-Expérience à deux dimensions-Chaque carbone, dans une dimension, est associé au couplage

dipolaire 13C-1H avec le proton voisin, donc avec le paramètre d'ordre local

-Tous les paramètres sont obtenus en une seule expérience et sans marquage isotopique

RMN du 13C « DROSS »:

ωD/2π (kHz)

13C (ppm)

J. D. Gross, D. E. Warschawski and R. G. Griffin, "Dipolar recoupling in MAS NMR: A probe for segmental order in lipid bilayers"

J. Am. Chem. Soc. 119:796-802 (1997)

0

0.05

0.1

0.15

8 10 12 14 16 18

DOPC/Chol:2/1 (37?C) DOPC 37?C

Order parameter

Carbon number

DOPCDOPC / Cholestérol

Lipide + inclusion:Projet ANR avec Doru Constantin (LPS, Orsay) pour mesurer l'effet sur les lipides de l'ajout d'inclusions (peptides, mais aussi particules inorganiques).

Dans le cas du peptide Gramicidine A: combien de lipides sont affectés? De quelle façon? Sont-ils affectés globalement ou localement? La longueur du lipide joue-t-elle un rôle?

D. E. Warschawski and P. F. Devaux "1H-13C polarization transfer in membranes: A tool for probing lipid dynamics and the effect of cholesterol" J. Magn. Reson. 177:166-171 (2005)

D. E. Warschawski and P. F. Devaux "Order parameters of unsaturated phospholipids in membranes and the effect of cholesterol: a 1H-13C solid-state NMR study at natural abundance" Eur. Biophys. J. 34:987-996 (2005)

DLPC / Gramicidine A:

Résultats préliminaires (2009)Spectres 1D rapides (1 minute) :

C10

C10

gA ?

DLPC / Gramicidine A:

Spectres 2D rapides (4 heures)Et tranches « C10 » :

Bonnes nouvelles:

Quelques problèmes:-Signal/bruit un peu faible-Effet surtout sur C10-Tranches asymétriques-Signal de gA anormal

-Bonne sensibilité (quelques heures), bonne résolution-Mesure facile des paramètres d’ordre-Applicable aux phases physiologiques-Applicable aux lipides sans marquage isotopique

Quelques conclusions:-On observe bien un effet croissant de la rigidification des lipides

avec une quantité croissante de gA-Certains lipides sont tellement rigidifiés qu'ils disparaissent du

spectre (>30% gA)

DMPC / Gramicidine A:

Avec Elise, 2013Spectres 1D longs (1 heure) :

C12

C12

DMPC / Gramicidine A:

Spectres 2D longs (14 heures)Et tranches « C12 » :

Bonnes nouvelles:

Quelques problèmes:-Effet toujours surtout sur C12 (à confirmer…)-Les tranches sont toujours asymétriques: problème identifié-Le spectromètre de l'ENS est bloqué par les travaux jusqu'à la fin

de l'année

-Effectivement c'est mieux avec des expériences plus longues!-Effet toujours mesurable, mais pas encore quantifié-On ne voit plus le signal de gA

Perspectives:-Régler le problème de l'asymétrie (acquisition et processing)-Quantifier la rigidification

Conclusion et perspectives:

RMN du 2H et lipides insaturés:

-Synthèse difficile-UNE synthèse et UNE expérience par position-Impossible de distinguer C9 et C10

C2 C9,10

C3 C11

C8 C17

Rance et al. (1980)

C9C10

Attention:effet de l’angle

magique

Biochemistry 20:3922-3932 (1981)RMN du 2HDROSS vs. 2H:

chaîne 1 chaîne 2

13C-1H DROSS

DOPC:

C9 chaînes 1 et 2

C10 chaînes 1 et 2

DOPC:

[9,10-2H2] chaînes 1 et 2

[9,10-2H2] chaîne 2

Seelig et al. (1981)

9

10

10

On corrige une erreur d’attribution qui persistait depuis 25 ans…

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