RESISTANCE DU CYTOMEGALOVIRUS AUX ANTIVIRAUX APRES TRANSPLANTATION D’ORGANE ET GREFFE DE

MOELLE, A L’ERE DE LA PROPHYLAXIE : MISE EN PLACE D’UN OBSERVATOIRE NATIONAL

EN PARTENARIAT AVEC LE CENTRE NATIONAL DE REFERENCE DU CYTOMEGALOVIRUS

PHRC INTER-REGIONAL 2006

Investigateur principal : Pr ALAIN Sophie : Virologie, Centre National de Référence du Cytomégalovirus

Hôpital Dupuytren 2 av. Martin Luther King 87042 Limoges Cedex Téléphone : 05 55 05 67 24 E-mail : sophie.alain@unilim.fr

Co-Investigateurs : Dr MENGELLE Catherine : Virologie

Institut Fédératif de Biologie 330 avenue de Grande Bretagne – TS4 40031 - 31059 TOULOUSE Cedex 09 Téléphone : 05 67 69 04 19 E-mail : mengelle.c@chu-toulouse.fr

Dr GARRIGUE Isabelle: Virologie Hôpital Pellegrin Place Amélie Raba-Léon, 33076 BORDEAUX Cedex Téléphone : 05 56 79 55 10 E-mail : isabelle.garrigue@chu-bordeaux.fr

Dr MAZERON Marie-Christine : Virologie- Centre National de Référence du Cytomégalovirus

Hôpital Lariboisière 2 rue A Paré 75475 Paris Cedex 10 Téléphone : 01 49 95 65 47 E-mail : marie-christine.mazeron@lrb.ap-hop-paris.fr

Collaborations : • Statistiques : Pr PM PREUX, Unité fonctionnelle Recherche Clinique et

Biostatistiques, CHU Dupuytren • Conseil Logistique : Dr B FRANÇOIS, Centre de Recherche Clinique, CHU

Dupuytren

Promoteur de l'étude : • CHU de Limoges – Hôpital Dupuytren 2 av. Martin Luther King 87042 Limoges Cedex

Version 6 du PHRC datant du 01/06/2006 - Avis favorable du CCPPRB du 18/05/2006

Amendement n°1 validé par le CCPPRB le 27 juillet 2006 Amendement n°2 validé par le CPP le 21 décembre 2006

Amendement n°3 validé par le CPP le 26 juillet 2007

1

Investigateurs associés membres du Comité Scientifique : Pr B.M. IMBERT-MARCILLE : Virologie

Institut de Biologie du CHU de NANTES 9 quai Moncousu 44093 NANTES Cedex

Dr M. LERUEZ-VILLE : Virologie Hôpital Necker – Enfants Malades 149 rue de Sèvres 75743 PARIS Cedex 15

Autres Investigateurs associés :

Région Etablissement Service Investigateur Bactériologie – Virologie – Hygiène

Pr Sophie ALAIN Pr François DENIS Pr Dominique BORDESSOULE Hématologie Clinique Dr Pascal TURLURE Dr Jean Philippe REROLLE Néphrologie - Hémodialyse Dr Béatrice CHAMPTIAUX-DECHAMP

Chirurgie Thoracique et Cardio-Vasculaire

Dr Florence ROLLE

Hépato-gastro-entérologie Dr Marilyne DEBETTE-GRATIEN

CHU de LIMOGES Hôpital Dupuytren 2 Avenue Martin Luther King 87042 LIMOGES CEDEX

Réanimation polyvalente Pharmacologie

Dr Bruno FRANCOIS Dr Pierre MARQUET

Hôpital Mère-Enfant – rue D. Larrey -87042 LIMOGES

Onco-Hématologie Pédiatrique Dr Christophe PIGUET

Virologie Dr Isabelle GARRIGUE Chirurgie Vasculaire et Greffes Hépatiques

Dr Martine NEAU-CRANSAC

Chirurgie Cardio-Vasculaire Dr Marc Alain BILLES Transplantation Rénale Pr Pierre MERVILLE Chirurgie Thoracique Dr Claire DROMER

CHU de BORDEAUX Hôpital Pellegrin Place Amélie Raba-Léon 33076 BORDEAUX Cedex CHU Haut-Lévêque – 1 avenue de Magellan – 33604 PESSAC Cedex Hématologie Pr Noël MILPIED

Dr Reza TABRIZI Dr Stéphane VIGOUROUX

CHU de TOULOUSE Hôpital Purpan

Virologie

Dr Catherine MENGELLE Dr Jean Michel MANSUY Pr M. ATTAL Hématologie Dr Anne HUYNH Pr Lionel ROSTAING

Place du Docteur BAYLAC 31059 TOULOUSE Cedex 9 Hôpital Rangueil - 1 avenue Jean-Poulhes - TSA 50032 - 31059 TOULOUSE Cedex 9 CHU Larrey - 24, chemin de Pouvourville - 31059 TOULOUSE

Néphrologie Pneumologie

Dr Nassim KAMAR Dr Laure CROGNIER

CHU de CLERMONT FERRAND Hôpital Gabriel Monpied - 58 rue Montalembert - 63000 CLERMONT FERRAND Hotel Dieu - Boulevard Léon Malfreyt - 63000 CLERMONT FERRAND

Virologie Néphrologie Hématologie pédiatrique Hématologie adulte

Pr Hélène PEIGUE-LAFEUILLE Dr Christine ARCHIMBAUD Dr Cécile HENQUELL Pr Patrice DETEIX Dr François DEMEOCQ Pr Jacques Olivier BAY

Grand Sud Ouest

CHU de POITIERS Cité Hospitalière de la Milétrie - BP 577- 2, rue de la Miléterie 86021 POITIERS Cedex

Virologie Hématologie clinique

Dr Agnès BEBY-DEFAUX Dr Marc RENAUD

2

CHU de MONTPELLIER Hôpital Saint Eloi - 80 av. A. Fliche - 34295 MONTPELLIER Cedex 5

Virologie

Dr Michel SEGONDY Dr Vincent FOULONGNE

Ouest CHU de BREST

Hôpital Morvan 29609 BREST Cedex

Virologie Pr Christopher PAYAN

CHU de NANTES Hôtel Dieu - Place Alexis Ricordeau 44093 NANTES Cedex 1 Hôpital Laennec - boulevard Jacques Monod - 44093 NANTES Cedex 1

Virologie Hématologie Clinique Transplantation Rénale

Pr B.M. IMBERT-MARCILLE Dr Cécile BRESSOLLETTE Dr Patrice CHEVALLIER Dr Magali GIRAL

CHU d’ANGERS Hôtel Dieu - 4 rue Larrey 49933 ANGERS Cedex 9

Bactériologie - Virologie Dr Françoise LUNEL Dr Alexandra DUCANCELLE

CHU de RENNES Hôpital Pontchaillou - 2 rue Henri le Guilloux - 35033 RENNES Cedex 9

Bactériologie – Virologie Maladie Infectieuse et Réanimation Médicale

Dr Sophie MINJOLLE-CHA Dr Christophe CAMUS

CHU de ROUEN Hôpital Charles Nicolle - 1, rue de Germont - 76031 ROUEN Cedex Bois Guillaume - 76031 ROUEN

Virologie Néphrologie

Dr Marie GUEUDIN Dr Isabelle ETIENNE

CHU de TOURS Hôpital Bretonneau 2, bvd Tonnellé 37044 TOURS Cedex

Virologie Néphrologie

Dr Catherine GAUDY Pr Yvon LEBRANCHU Dr Matthias BUCHLER Dr Christelle BARBET

CHU de CAEN Hôpital Clemenceau - Av. Georges Clemenceau - 14033 CAEN Cedex

Virologie Néphrologie

Dr Stéphanie GOUARIN Pr Bruno HURAULT de LIGNY

Grand Sud CHU de GRENOBLE

Hôpital Albert Michallon Avenue du maquis du Grésivaudan BP 217 38043 GRENOBLE Cedex 09

Virologie Néphrologie Cardiologie Pneumologie Infectiologie Hématologie

Pr Patrice MORAND Dr Raphaële GERMI Dr François BAYLE Dr Linda NERON Pr Christophe PISON Dr Jean Paul BRION Pr Jean Yves CAHN

CHU de MARSEILLE Hôpital de la Timone 264, rue Saint Pierre 13385 MARSEILLE Cedex 5

Virologie Dr Christine ZANDOTTI

CHU de SAINT ETIENNE Hôpital Nord 42055 SAINT ETIENNE Cedex 2

Virologie Pr Bruno POZZETTO Dr Sylvie PILLET

CHU de LYON Faculté de Médecine Rockefeller 8, avenue Rockefeller 69373 LYON Cedex 08 Hôpital de la Croix Rousse 103, grande rue de la Croix Rousse 69314 LYON Cedex 04 Centre Hospitalier Lyon-Sud Pierre-Bénite 69495 Cedex

Virologie Virologie Néphrologie

Dr Florence MORFIN Dr Fatiha NAJIOULLAH Pr Patrice ANDRE Dr Marie Paule MILON Dr Claire POUTEIL-NOBLE

CHU de NICE Hôpital Pasteur BP 69 - Avenue de la voie Romaine 06002 NICE Cedex 3

Virologie Pr Claude LEFEBVRE

3

CHU de NIMES 5, rue Hoche 30029 NIMES Cedex 4

Virologie Dr Sylvie CHARACHON

CHU de NANCY Hôpital d’Adultes Rue du Morvan 54511 VANDOEUVRE LES NANCY

Bactériologie - Virologie Dr Véronique VENARD Dr Anne Charlotte SENTILHES

Hôpital d’Enfants 5 allée du Morvan 54500 VANDOEUVRE LES NANCY

Médecine Infantile II Hémato-oncologie pédiatrique et transplantation médullaire

Pr Pierre BORDIGONI Dr Laurence CLEMENT

CHU de DIJON 1 Boulevard Jeanne d’ARC BP 77908 21079 DIJON

Virologie Néphrologie Hépato-gastro-entérologie Réanimation clinique

Dr Jean Baptiste BOUR Pr Pierre POTHIER Pr Christiane MOUSSON Dr Yves TANTER Pr Patrick HILLON Dr Anne MINELLO Dr Philippe CHARVE

Est

CHU de BESANCON Hôpital Saint Jacques – 2 place Saint Jacques - 25030 BESANCON CedexHôpital Jean Minjoz - 1 boulevard Fleming- 25030 BESANCON Cedex

Virologie Néphrologie Hépatologie Hématologie

Dr Alain COAQUETTE Pr Georges HERBEIN Dr Didier DUCLOUX Dr Claire VANLEMMENS Dr Fabrice LAROSA

CHU de STRASBOURG UF3441 - 3, rue Koeberlé - 67000 1 place de l’Hôpital 67051 STRASBOURG Hôpital de Hautepierre 1, avenue Molière 67098 STRASBOURG Cedex

Virologie Néphrologie Hématologie

Pr Françoise STOLL-KELLER Dr Samira FAFI-KREMER Pr Bruno MOULIN Dr Sophie CAILLARD Dr Bruno LIOURE Dr Natacha ENTZ-WERLE Dr Patrick LUTZ Dr Nadine COJEAN Dr Annegret LAPLACE

CHU de REIMS Hôpital Robert Debré Avenue du Général Koenig 51092 REIMS Cedex

Virologie

Pr Laurent ANDREOLETTI Dr Nicolas LEVEQUE

Virologie

Dr Anny DEWILDE Nord CHU de LILLE Hôpital Calmette 59037 LILLE Cedex Néphrologie Dr Marc HAZZAN

CHU d’AMIENS Hôpital Sud Avenue René Laënnec 80054 AMIENS Cedex

Virologie

Dr Sandrine GAUDIO CASTELAIN

DOM-TOM CHU SAINT DENIS DE LA

REUNION Hôpital Felix Guyon – 97405-

Néphrologie Dr Bruno BOURGEON

CHU DE POINTE A PITRE 97159 – Pointe à Pitre Cedex

Virologie Néphrologie

Dr Cécile HERRMANN Dr Christian HIESSE

CHU FORT DE FRANCE Hôpital Pierre Zobda-Quitman Route de Châteauboeuf - BP 632 – 97261 – FDF Cedex

Virologie Dr Raymond CESAIRE

4

Virologie Dr P. HONDERLICK Hôpital FOCH 40 rue Worth 92150 SURESNE

Pneumologie Néphrologie

Dr D. GRENET Dr M. STERN Dr Alexandre KARRAS Dr Michel DELAHOUSSE

Virologie Dr Catherine SCIEUX Dr Jérôme LE GOFF

AP-HP Hôpital SAINT-LOUIS 1 avenue Claude Vellefaux 75475 PARIS Cedex 10

Greffe de Moelle Osseuse Néphrologie

Dr Patricia RIBAUD Dr Denis GLOTZ

Virologie Dr Françoise BRUN VEZINET Dr Nadira HOUHOU

AP-HP Hôpital Bichat – Claude Bernard 46 rue Henri Huchard 75018 PARIS

Chirurgie Thoracique et Cardio - Vasculaire

Dr D. FOURCHY

Virologie Dr Claire DEBACK Dr David BOUTOLLEAU Pr Henri AGUT

Hématologie Dr Nathalie DHEDIN

AP-HP Groupe Hospitalier Pitié – Salpétrière 47-83 Boulevard de l’Hôpital 75651 PARIS Cedex 13 Transplantation rénale Pr B. BARROU

Ile de France

AP-HP Hôpital Necker – Enfants Malades 149 rue de Sèvres 75743 PARIS Cedex 15

Virologie

Dr Marianne LERUEZ-VILLE

AP-HP Hôpital AVICENNE 125, route de Stalingrad 93009 BOBIGNY Cedex

Virologie Pr Paul DENY

AP-HP Hôpital LARIBOISIERE 2, rue Ambroise Paré 75010 PARIS

Virologie Dr Marie Christine MAZERON

AP-HP Hôpital PAUL BROUSSE 12, avenue Paul Vaillant Couturier 94800 VILLEJUIF Cedex

Virologie Hépato-Biliaire Anesthésie-Réanimation

Pr Elisabeth DE CERNER-DUSSAIX Dr Parissa VAGHEFI Pr Faouzi SALIBA Dr Philippe ICHAI

Demande à ce que le CHU de Limoges se porte promoteur de l’étude et prenne en charge :

Les frais d’assurance,

Les frais de saisine du CPP, Les surcoûts de l’étude en présentant le projet au PHRC Interrégional 2006.

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SOMMAIRE I- SYNOPSIS DE L’ETUDE................................................................................................................................ 7

II- JUSTIFICATION DE L'ETUDE................................................................................................................... 9

II-1- RATIONNEL ................................................................................................................................................ 9 II-2- REVUE DE LA LITTERATURE ..................................................................................................................... 13 II-3- BENEFICES ATTENDUS ET PERSPECTIVES.................................................................................................. 23

III- OBJECTIFS DE L'ETUDE ........................................................................................................................ 26

III-1- OBJECTIF PRINCIPAL ............................................................................................................................... 26 III-2- OBJECTIFS SECONDAIRES ........................................................................................................................ 26 III-3-PERSPECTIVES D’AVENIR ......................................................................................................................... 26

IV- TYPE D’ETUDE .......................................................................................................................................... 26

V- JUSTIFICATION DU RAPPORT BENEFICE / RISQUE........................................................................ 27

VI- SELECTION DES SUJETS ........................................................................................................................ 27

VI-1- CRITERES D'INCLUSION DANS LA COHORTE............................................................................................. 27 VI-2- CRITERES DE NON INCLUSION ................................................................................................................. 28 VI-3- CONDITIONS DE RECRUTEMENT DES SUJETS ET INFORMATION DES PATIENTS ......................................... 28

VII- CRITERES DE JUGEMENT.................................................................................................................... 29

VII-1- CRITERE DE JUGEMENT PRINCIPAL ........................................................................................................ 29 VII-2- CRITERES DE JUGEMENT SECONDAIRES ................................................................................................. 29

VIII- ORGANISATION DE L’ESSAI .............................................................................................................. 30

VIII-1- PROCEDURES CLINIQUES ET BIOLOGIQUES ........................................................................................... 30 VIII-2 CALCUL DU NOMBRE DE PATIENTS ........................................................................................................ 33 VIII-3- GESTION DES EVENEMENTS INDESIRABLES .......................................................................................... 34

VIII-3-1- Définition d’un événement indésirable ....................................................................................... 34 VIII-3-2- Définition d’un événement indésirable grave ............................................................................. 34 VIII-3-3- Gestion d’un événement indésirable grave................................................................................. 34

VIII-4- SCHÉMA RÉCAPITULATIF DE L’ÉTUDE .................................................................................................. 35

IX- ETUDE MEDICO-ECONOMIQUE .......................................................................................................... 36

IX-1 DUREE DE L’ETUDE.................................................................................................................................. 36 IX-2 ANALYSES STATISTIQUES......................................................................................................................... 36

IX-2-1- Calcul de l’incidence de l’infection active à CMV résistant aux antiviraux. ................................ 36 IX-2-2- Analyse des facteurs influençant la survenue de résistance avérée .............................................. 37

X- COMITE DE SURVEILLANCE.................................................................................................................. 37

XI- ASPECTS MATERIELS ET LEGAUX..................................................................................................... 38

XII- REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.................................................................................................. 40

XIII- ANNEXES : ............................................................................................................................................... 45

ANNEXE 1 : NOTICE D’INFORMATION............................................................................................................... 45 ANNEXE 2 : FORMULAIRE DE CONSENTEMENT POUR ADULTE .......................................................................... 47 ANNEXE 3 : FORMULAIRE DE DECLARATION D’EIG POUR ETUDE HORS MEDICAMENT ..................................... 50 ANNEXE 4: SYNOPSIS EN ANGLAIS ................................................................................................................... 52 ANNEXE 5 : CURRICULUM VITAE DES INVESTIGATEURS ................................................................................... 54 ANNEXE 6 : EVALUATION BUDGETAIRE ........................................................................................................... 60 ANNEXE 7 : PROCEDURE DE CONSTITUTION DES BIOTHEQUES.......................................................................... 62 ANNEXE 8 : FEUILLES DE RENSEIGNEMENT POUR DECLARATION ET RECHERCHE DE RESISTANCE ................... 64 ANNEXE 9 : REPARTITION DES CENTRES ENTRE LES DEUX LABORATOIRES DE REFERENCE .............................. 68 ANNEXE 10 : LISTE DES DONNEES RECUEILLIES ............................................................................................... 69

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I- SYNOPSIS DE L’ETUDE

RESISTANCE DU CYTOMEGALOVIRUS AUX ANTIVIRAUX APRES

TRANSPLANTATION D’ORGANE ET GREFFE DE MOELLE, A L’ERE DE LA PROPHYLAXIE: MISE EN PLACE D’UN OBSERVATOIRE NATIONAL

EN PARTENARIAT AVEC LE CENTRE NATIONAL DE REFERENCE DU CYTOMEGALOVIRUS

Objectif principal : Etude de l’incidence de la résistance du cytomégalovirus aux antiviraux après transplantation d’organe et greffe de cellules souches hématopoïétiques chez les patients présentant une infection active à CMV. Projet en partenariat avec le Centre National de Référence du Cytomégalovirus (Coordination : Dr S. Alain, Virologie, CHU Dupuytren, Limoges) et l’Institut de Veille Sanitaire.

Objectifs secondaires :

Etude de la diversité des souches lors de l’épisode initial et au moment de la résistance clinique ou avérée

Fréquence des différentes mutations de résistance et étude de leur retentissement clinique.

Etude du rôle dans la résistance au traitement des nouvelles mutations éventuellement détectées.

Mise en place, au niveau national, d’un réseau de recueil prospectif de données de souches et d’échantillons. (Utilisable ultérieurement pour l’étude de la résistance à de nouvelles molécules antivirales en développement)

Critères d’inclusion :

Patient receveur d’allogreffe de moelle ou de cellules souches hématopoïétiques ou patient receveur d’organe solide

Greffé après le 1er janvier 2006 Majeur ou mineur Bénéficiant ou non d’une prophylaxie

spécifique anti-CMV Présentant ou ayant présenté une infection

active à CMV (les patients rentrent dans la cohorte à partir du premier épisode d’infection active)

Critères d’exclusion :

Patients non assurés sociaux. Patient refusant de participer

Bilan initial de sélection (bilan d’inclusion) : Diagnostic d’Infection active et conservation des prélèvements et de la souche initiale

Isolement de la souche virale : • sang (tube hépariné 7 ml) • autre prélèvement (urine, salive, liquides

biopsie) Prélèvement pour génotype de résistance

de la souche initiale sang (tube EDTA 7 ml) autre prélèvement (urine, salive, liquides biopsie)

Bilan de suivi : Durée de suivi : 18 mois

ADNémie ou ARNémie ou antigénémie en routine

En cas de résistance clinique : • Isolement de souche virale pour phénotype de

résistance (au laboratoire du centre ou envoi au laboratoire de référence)

• Prélèvements pour génotype de résistance • Sang (tube EDTA 7 ml) • Autre prélèvement (urine, salive, liquides biopsie) • Envoi au laboratoire de référence avec les

prélèvements antérieurs • Prélèvements pour dosage des antiviraux (1

tube EDTA 7 ml)

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Examens complémentaires : Phénotype de résistance (antivirogramme) Génotype de résistance (recherche de mutations) Etude épidémiologique des souches

Circuits des Prélèvements : Laboratoire de virologie du centre

investigateur Envoi souches et échantillons cliniques et

fiches déclaratives au laboratoire de référence via le transporteur de l’étude

Critères de jugement : Le critère de jugement principal est l’incidence de la résistance virologique avérée dans les 18 mois suivant la greffe chez les patients ayant au moins un épisode d’infection active à CMV. Nombre de sujets : Nombre de greffes prévues (registre 2004) : 4816 Fréquence des infections actives à CMV : 10 à 30% selon les protocoles Nombre d’inclusions prévues : au minimum 481 soit 10% de l’ensemble des greffes, au maximum 1443 soit 30% de l’ensemble des greffes. Nombre de cas de résistance clinique : inconnu. Calcul de l’incidence de la résistance au décours des greffes, et dans le groupe des patients présentant une infection active à CMV Mots-clés : cytomégalovirus, résistance, transplantation, organes solides, cellules souches hématopoïétiques

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II- JUSTIFICATION DE L'ETUDE

II-1- Rationnel Le cytomégalovirus (CMV) est un herpès virus ubiquitaire, infectant près de 60% de la population, et responsable d’infections bénignes chez le sujet immunocompétent, mais potentiellement graves chez les sujets présentant un déficit immunitaire. L’infection à cytomégalovirus (CMV), qui jusqu’aux années 90 représentait une pathologie opportuniste majeure chez les patients infectés par le VIH, a vu sa fréquence diminuer considérablement chez ces patients avec l’avènement des trithérapies antirétrovirales. Elle n’en demeure pas moins une complication redoutée après transplantation d’organe et greffe de cellules souches hématopoïétiques, chez l’adulte comme chez l’enfant (Haastrup, Muller et al. 2005) et peut également compliquer l’évolution de toute pathologie nécessitant ou entraînant une immunodépression cellulaire importante (lymphome, corticothérapie prolongée). Ce virus est en effet capable de moduler les défenses immunitaires de l’hôte, d’échapper complètement au système immunitaire, et de persister en latence dans de nombreuses cellules de l’organisme, notamment les cellules endothéliales et épithéliales et les cellules du système hématopoïétique, pour se réactiver à la faveur d’une baisse des défenses immunitaires. Les conséquences de l’infection à cytomégalovirus, tant chez les patients receveurs de greffe que chez le fœtus ont justifié la mise en place par l’Institut de Veille Sanitaire d’un Centre de Référence National (CNR). Coordonné par le Dr Sophie ALAIN (CHU DUPUYTREN) en association avec les laboratoires de virologie de Lariboisière (Dr Marie-Christine MAZERON) et Necker (Dr Marianne LERUEZ-VILLE) ce CNR a pour missions d’organiser au niveau national la surveillance épidémiologique des infections à CMV, la surveillance des résistances aux antiviraux, et l’aide au diagnostic des infections à CMV.

L’évolution peut être dramatique lorsque sa persistance malgré des traitements itératifs est liée à la sélection d’une souche multirésistante, contre laquelle aucun antiviral n’est plus actif. La morbidité liée au CMV après greffe de moelle ou transplantation d’organe justifie des traitements préventifs de la maladie à CMV, prophylactiques, à doses réduites et au long cours, ou anticipés, dès les premiers signes biologiques de réplication virale. Les molécules actuellement utilisées en prévention valaciclovir (Zelitrex®) et valganciclovir (Rovalcyte®) sont identiques ou possèdent des résistances croisées avec le ganciclovir (Cymévan®) qui est le traitement de première intention de la maladie à CMV. Ce qui peut compromettre un traitement ultérieur par cette molécule. Les facteurs favorisant l’émergence de résistance sont classiquement : un traitement de longue durée, une charge virale élevée dans le sang et une immunodépression intense. Ces facteurs sont idéalement réunis dans les mois qui suivent la greffe. (Emery and Griffiths 2000). Les souches résistantes, initialement minoritaires, peuvent être sélectionnées et devenir majoritaires à la faveur d’un nouvel épisode justifiant un traitement antiviral (Alain, Honderlick et al. 1997; Emery and Griffiths 2000; Ducancelle, Belloc et al. 2004). Les conséquences de telles infections varient selon l’atteinte (maladie à CMV ou syndrome CMV, l’organe greffé et le degré d’immunodépression). Le risque pour le greffon et pour la survie du patient est celui d’une infection persistante à CMV mal contrôlée par le traitement, parfois fatale (Kruger, Shannon et al. 1999).

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Face à ce risque, les molécules disponibles en pratique clinique sont peu nombreuses. Toutes sont des inhibiteurs de l’ADN polymérase virale. Le ganciclovir est un analogue nucléosidique, dépendant de la phosphotransférase virale UL97 pour son activation intracellulaire. Le cidofovir, analogue nucléotidique, ne dépend pas de la primo-phosphorylation par UL97, et le foscarnet, analogue de pyrophosphate, est directement actif dans la cellule infectée. A la différence de l’acyclovir (40 fois moins actif sur le CMV que le ganciclovir), ces molécules présentent une toxicité importante pour la cellule (neutropénie induite par le ganciclovir ou toxicité rénale du cidofovir et du foscarnet), qui limite leur utilisation, et peut nécessiter des traitements à doses réduites tant que l’immunosuppression persiste, favorisant l’émergence de souches résistantes. Les traitements prophylactiques utilisant des prodrogues par voie orale (Lowance, Neumayer et al. 1999) ont progressivement remplacé les prophylaxies par voie intraveineuse et ont montré leur efficacité. La prévention ciblée aux patients à risque sur la base d’une surveillance virologique avec traitement anticipé des infections actives (les anglo-saxons utilisent le terme « traitement préemptif »). Cependant, les critères d’initiation du traitement, les méthodes de surveillance de l’infection, la dose, la durée de traitement varient en fonction du type de greffe et des équipes. Le choix entre chimioprophylaxie et traitement anticipé après transplantation d'organe est discuté à la fois en terme de rapport coût-efficacité, en faveur de la prophylaxie, et en terme d'émergence de résistances, en faveur de traitements anticipés, courts et à forte dose .

Une des conséquences de l’utilisation large de traitements préventifs en transplantation d’organe, comme après allogreffe de cellules souches hématopoiétiques est l’apparition de maladies à CMV retardées, à l’arrêt de la prophylaxie. Celles-ci sont actuellement reconnues comme une véritable complication de la transplantation. Plus la prophylaxie est efficace et prolongée et plus la maladie retardée est fréquente, probablement du fait d’un retard à la mise en place d’une réponse immunitaire cellulaire T efficace vis-à-vis du CMV. Les receveurs d’organe solide séronégatifs avant greffe, qui font une primo-infection à CMV sont particulièrement touchés. Ces maladies tardives surviennent après le sixième mois, le plus souvent dans la première année suivant la greffe, et peuvent compromettre la survie du patient (Wolf, Lurain et al. 2003; Razonable 2005; Singh 2006). Elles justifient une surveillance prolongée des patients. Bien que l’efficacité des traitements préventifs sur l’incidence de la maladie à CMV dépasse 60%, il faut noter que la fréquence des résistances au cours de ces traitements est encore mal connue. La seule étude de cohorte concerne les greffes d’organes. Rétrospective et prospective (Lurain, Bhorade et al. 2002) elle montre que la fréquence des résistances se situe entre 2,2% et 15% selon l’organe parmi les patients présentant une infection active à CMV après greffe, soit 0,45 à 2,2% des patients greffés. Au décours des traitements prophylactiques peu d’études sont disponibles. Etudiée au cours des études randomisées accompagnant le développement du valganciclovir dans des populations de patients ciblés et étroitement surveillées, la fréquence globale des résistances varie de 0% à 2,5% selon l’organe greffé (Boivin, Goyette et al. 2004; Boivin, Goyette et al. 2005; Humar, Kumar et al. 2005). Les autres travaux font état de taux de résistance variable, souvent dans de faibles populations, étudiées de manière rétrospective ou comparées à une population historique (Humar, Kumar et al. 2005). Pris ensemble, ces travaux montrent que le taux de résistance dépend de l’organe greffé, avec un

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risque maximal après transplantation pulmonaire, du statut sérologique du receveur et du protocole d’immunosuppression utilisé (Gilbert and Boivin 2005). Enfin, les données chez les receveurs de greffe de cellules souches hématopoïétiques sont parcellaires. Les travaux que nous avons effectué au laboratoire et les descriptions de la littérature, montrent que la résistance du CMV aux antiviraux représente un réel problème thérapeutique après transplantation . Ces souches résistantes sont en effet pathogènes, non pas parce qu‘elles possèdent une virulence accrue, mais parce qu’elles continuent pour la plupart à se répliquer activement dans l’organisme, pérennisant les effets délétères sur le greffon et sur l’hôte de l’infection à CMV (Chou, Marousek et al. 1997) . Dans certains cas, la diminution de l’immunosuppression permet de juguler la réplication virale(Anglicheau, Lautrette et al. 2003). Lorsque cela est impossible, il arrive de se trouver en impasse thérapeutique. Compte tenu de la variabilité de prise en charge entre les différentes équipes il est souhaitable d’en apprécier l’importance en pratique clinique quotidienne. Un point sans doute important pour comprendre la réponse au traitement tient à la diversité (multiplicité) des souches présentes chez les patients greffés et l’évolution de cette diversité au cours des traitements successifs. Plusieurs descriptions de coinfection par des souches multiples, résistantes et sensibles ont été décrites (Ducancelle et al., 2004). Si le génotype des souches ne paraît pas influencer le décours de la greffe (Humar, Kumar et al. 2003) les coinfections par plusieurs génotypes ne sont pas rares chez les transplantés (Chou 1989), et pourraient influencer l’évolution vers la maladie à CMV (Coaquette e al., 2003). Une étonnante diversité est constatée chez certains transplantés pulmonaires, qui pourrait favoriser l’émergence de résistances chez ces patients (Puchhammer-Stockl, Gorzer et al. 2006). Enfin, si de très nombreuses mutations de résistance aux antiviraux ont été décrites, de nouvelles mutations ont été récemment mises en évidence et d’autres certainement à découvrir. Il est utile de les identifier, de déterminer leur rôle dans la résistance, d’étudier leur retentissement sur l’échappement thérapeutique afin de disposer, à l’instar de ce qui est fait pour le VIH d’un algorithme décisionnel remis à jour régulièrement. Ainsi après valaciclovir ou valganciclovir, on observe en parallèle des mutations de résistance connues, des mutations nouvelles, qui peuvent être soit des polymorphismes soit des mutations de résistance nouvelles et qu’il est important de classifier (Boivin et al ., 2004). Devant la limitation que représente la toxicité actuelle des molécules capables de stopper la réplication du CMV, l’industrie pharmaceutique développe de nouvelles molécules. Il s’agit de molécules cycliques ciblant les étapes finales du cycle viral, terminaison de la réplication et encapsidation de l’ADN viral. L’un d’eux, le maribavir (Lu and Thomas 2004), agit par l’intermédiaire de la phosphotransférase UL97, et de la protéine UL27 en bloquant la sortie des virions néoformés hors du noyau de la cellule infectée. Il pourrait être largement utilisé dans les années à venir car peu toxique et également efficace sur le virus Epstein Barr (Gershburg, Hong et al. 2004). Fait intéressant, les mutations de résistance au ganciclovir situées sur UL97 sont sans effet sur le maribavir . La faible fréquence attendue de résistances, la mise sur le marché possible de nouveaux antiviraux justifie la mise en œuvre d’un réseau susceptible de regrouper des

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informations au niveau national. Un tel réseau, une fois fonctionnel, sera à même d’assurer une surveillance prospective efficace de l’incidence des résistances, en pratique clinique quotidienne, y compris lors de l’introduction de nouvelles molécules. Ce type de réseau a antérieurement permis d’étudier l’émergence de souches d’Herpès simplex résistantes à l’acyclovir dans différentes populations : immunocompétents, transplantés, patients atteints d’hémopathies et personnes infectées par le VIH (Danve-Szatanek, Aymard et al. 2004). L’importance de l’infection à CMV chez les personnes immunodéprimées et de la surveillance des résistances a justifié son insertion dans le cahier des charges du Centre National de Référence (CNR) du Cytomégalovirus mis en place depuis janvier 2006 au CHU de LIMOGES, coordonné par le Dr Sophie ALAIN, avec les laboratoires associés de Lariboisière (Dr Marie-Christine MAZERON) et de Necker (Dr Marianne LERUEZ-VILLE). Ce partenariat avec le CNR et l’Institut National de Veille Sanitaire devrait faciliter la mise en place rapide d’un observatoire fonctionnel en dégageant des moyens complémentaires à ce effet.

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II-2- Revue de la littérature

L’infection à CMV en transplantation

Virus ubiquitaire, le CMV est le plus souvent acquis dans la petite enfance et plus de 40% des personnes sont porteuses de ce virus. Après une primo-infection le plus souvent inapparente, le CMVpersiste dans de nombreuses cellules de l’organisme, notamment les cellules endothéliales et les monocytes, pendant toute la vie de l’individu, en alternant périodes de latence et réactivations silencieuses avec excrétion virale au niveau du pharynx, des urines et des sécrétions génitales. Dans le contexte de l’immunosuppression liée à la greffe, la diminution des défenses immunitaires et notamment de l’immunité cellulaire fragilise les défenses anti-CMV. La réplication virale est mal jugulée et peut exercer ses effets délétères. Après transplantation d’organe, l’infection active correspond à la présence d’une réplication virale détectable. Elle augmente le risque de dysfonctionnement du greffon, et de rejet, elle favorise les infections opportunistes bactériennes et fungiques, et augmente le risque d’athérosclérose du greffon après transplantation cardiaque (Razonable and Paya 2003). Lorsque l’infection est symptomatique le syndrome CMV correspond à une fièvre prolongée, associée à un malaise, des arthralgies, une neutropénie. Il est dù le plus souvent à une primo-infection par transmission du CMV à partir d’un greffon de donneur CMV séropositif à un receveur CMV séronégatif. La maladie à CMV correspond à l’atteinte d’un ou plusieurs organes, poumon, tractus digestif ou foie, liée au CMV. Les manifestations cliniques varient selon l’organe transplanté. En l’absence de traitement antiviral, la fréquence des infections symptomatiques est 39 à 40% des patients après transplantation pulmonaire, 9 à 35% après transplantation cardiaque, 22 à 29% après greffe de foie ou de pancréas, 8 à 32% après transplantation rénale, 50% après greffe rein-pancréas et 22% après transplantation digestive (Sia and Patel 2000) . Les receveurs séronégatifs avant greffe, qui sont les sujets les plus à risque d’infection symptomatique, ont augmenté ces dernières années de 14% à 46% en 2000-2003(Razonable 2005). Après allogreffe de cellules souches hématopoiétiques, les manifestations les plus fréquentes de la maladie à CMV sont la pneumopathie à CMV, qui reste associée à une mortalité importante (30 à 50%) malgré le traitement par ganciclovir et immunoglobulines, et l’atteinte de la muqueuse digestive. En l’absence de traitement la fréquence de l’infection symptomatique à CMV et de la pneumopathie à CMV étaient respectivement de 38% et 17% et la mortalité de la pneumopathie atteignait 85%. Contrairement aux transplantations d’organe, le risque d’infection à CMV ou de maladie à CMV est plus élevé chez les receveurs séropositifs avant greffe (70 à 80% d’infection active en l’absence de traitement, 15% chez les receveurs séronégatifs). Il est majoré par l’existence d’une réaction du greffon contre l’hôte(Meijer, Boland et al. 2003; Razonable 2005).

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Face à ce risque, deux stratégies sont proposées en prévention de l’infection à CMV : Un traitement prophylactique, avec deux molécules : le valaciclovir, prodrogue de l’acyclovir (Lowance, Neumayer et al. 1999), ou le ganciclovir sous forme intraveineuse ou orale ou sa prodrogue orale, le valganciclovir (Cvetkovic and Wellington 2005), administrées pendant les trois mois suivant la greffe. Un traitement anticipé (également appelé préemptif) : utilisant le ganciclovir intraveineux ou le valaciclovir, administré au stade d’infection active, afin de prévenir le développement des manifestations cliniques Ces moyens de prévention font appel aux mêmes molécules que celles utilisées en traitement curatif du syndrome ou de la maladie à CMV,ou à des molécules de mécanisme d’action identique. On peut donc craindre l’émergence tardive de souches résistantes, sélectionnées pendant le traitement préventif.

Résistance aux antiviraux La résistance du cytomégalovirus humain (CMV) aux antiviraux est une cause majeure d’échec du traitement et de mise en jeu du pronostic fonctionnel ou vital du patient. Une charge virale élevée, des traitements prolongés ou à posologie réduite (traitement d’entretien) favorisent l’émergence de la résistance (Drew 2000; Emery and Griffiths 2000). Les patients immunodéprimés, receveurs d’allogreffe de moelle ou d’organe, patients infectés par le VIH à un stade d’immunodepréssion sévère sont particulièrement exposés aux complications de l’infection à CMV qui reste difficile à prendre en charge. Cependant, l’émergence de la résistance est à craindre également chez les patients souffrant d’hémopathies malignes ou de déficit immunitaire complexe. Trois molécules sont actuellement disponibles en thérapeutique pour traiter les infections sévères à cytomégalovirus (CMV) chez les patients immunodéprimés (figure 1). Ce sont trois inhibiteurs de l’ADN polymérase virale, UL54. Le ganciclovir (GCV), analogue nucléosidique de la guanosine, chimiquement très proche de l’aciclovir, est converti in vivo en un dérivé triphosphate, forme active de la molécule. La première phosphorylation est assurée par une enzyme virale, la protéine kinase UL97(Sullivan, Talarico et al. 1992), qui phosphoryle également l’acyclovir (ou le valaciclovir). Il dépent de UL97 pour son activation, tout comme l’acyclovir et agit sous forme triphosphate en inhibant la polymérase du CMV, UL54. Le cidofovir (CDV) est un phosphonate analogue nucléotidique acyclique de la cytidine. Il ne dépend pas de UL97 pour son activation, et sa cible est UL54. Le foscarnet (PFA) est un analogue des pyrophosphates qui n’a besoin d’aucune métabolisation préalable pour être actif. Il inhibe de façon réversible et non compétitive l’ADN polymérase des herpès virus humains en bloquant leur site de fixation des pyrophosphates

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Figure 1 : Métabolisme intracellulaire des antiviraux

GCV-P : ganciclovir phosphate, CDV-P : cidofovir phosphate, PFA : foscarnet

GCV CDV PFA

ADN polymérase

UL97

GCV-P

GCV-PPP

Kinases cellulaires

CDV-PP PFA

Kinases cellulaires

Les mécanismes moléculaires de résistance sont connus, et les résistances peuvent être détectées en temps réel par un laboratoire expérimenté. Deux protéines sont donc impliquées dans la résistance du CMV au GCV, mais aussi à l’aciclovir, la phosphotransférase UL97 et l’ADN polymérase UL54. Les modifications de la phosphotransférase UL97 ne touchent que la sensibilité au ganciclovir ou à l’aciclovir. Elles sont responsables d’un défaut de phosphorylation du ganciclovir qui apparaît comme le mécanisme majeur de résistance, aussi bien chez les mutants de laboratoire, que dans les isolats cliniques (Stanat, Reardon et al. 1991). Les mutations de résistance au GCV portent sur les acides aminés 460, 520 et 590 à 607. En pratique clinique, 60 à 80% des souches résistantes présentent des mutations au niveau du site de phosphorylation du GCV portant sur les acides aminés (aa) 460 (M460V/I), 594 (A594V), et 595 (L595S) ((Erice, Gil-Roda et al. 1997; Erice 1999; Chou, Waldemer et al. 2002; Lurain, Bhorade et al. 2002; Gilbert and Boivin 2005). Ces mutations de UL97 conduisent à une résistance de bas niveau au ganciclovir (figure 2). L’activité catalytique de l’ADN polymérase du CMV est portée par une protéine codée par le gène UL54. De nombreuses mutations de UL54 ont été identifiées dans des souches résistantes. Le plus souvent, les mutations de UL54 qui induisent la résistance au ganciclovir viennent s’ajouter après des traitements prolongés (9 mois en moyenne) aux mutations dans UL97, les premières à apparaître. Elles conduisent à une résistance de haut niveau au ganciclovir, associée à une résistance au cidofovir (Smith, Cherrington et al. 1997; Erice 1999; Chou, Waldemer et al. 2002). Les mutations entraînant une résistance croisée au ganciclovir et au foscarnet, sont rares, et situées dans des domaines fonctionnels différents. Elles ne touchent pas la sensibilité au cidofovir (figure 3).

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Localisation des principales substitutions d'acidesaminés responsables de la résistance au

ganciclovir dans la phosphotransférase UL97 :

• Plus de 70 % des mutations de résistance connuessont situées entre les acides aminés 460 et 607

I II III IV V VI VII VIII IX X XINH2 COOH

520 594595

460 601 659603 665606-607590-592

594-599

397205

figure 2 figure 3

IV δ-region C II VI III I VII VNH2 COOH

408 495410412413419415

501 545503513516522

588 700 722715 756 781 787

802805

Localisation des principales substitutions d ’acideaminé responsables de résistance dans UL54

809812821

D981-982987

Résistance au cidofovir :Résistance au ganciclovir et au cidofovir :Résistance au foscarnetRésistance au ganciclovir et au foscarnet :

Exo I Exo II Exo III

301

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Des associations de mutations multiples de UL97 et/ou UL54 peuvent survenir au cours de traitements prolongés (Chou, Marousek et al. 1997; Smith, Cherrington et al. 1997). Elles conduisent, selon les cas, à une résistance isolée au ganciclovir (mutations de UL97), à une résistance de haut niveau au ganciclovir associée à une résistance au cidofovir, à une résistance au ganciclovir et au foscarnet, ou une résistance aux trois molécules. Ces associations de mutations résultent soit de l’accumulation de mutations sur une même souche, soit de la coexistence de plusieurs souches mutées dérivant ou non d’une seule souche initiale(Jabs, Martin et al. 2001).. La possibilité d’effet compensateur entre deux mutations de UL97 en position 594 et 605 a récemment été démontrée(Ijichi, Michel et al. 2002). Conséquences de la résistance

La capacité des souches résistantes à se répliquer et à se disséminer chez le patient semble conservée, comme en témoigne l’identification de mutants résistants avant l’apparition des manifestations cliniques (Alain, Honderlick et al. 1997). L’isolement d'une souche résistante après greffe de moelle ou transplantation d’organe solide est fréquemment associé à une augmentation de la morbidité en cas de persistance de l’immunosuppression Cependant, le pouvoir pathogène de ces souches ne paraît pas augmenté. (Baldanti, Underwood et al. 1996; Alain, Honderlick et al. 1997; Chou, Marousek et al. 1997; Erice, Gil-Roda et al. 1997; Gilbert, Bestman-Smith et al. 2002; Baldanti, Lurain et al. 2004; Gilbert and Boivin 2005). Il est donc possible, avant que n’apparaisse une maladie à CMV, d’en stopper la réplication, en modulant le traitement antiviral, mais aussi, le traitement immunosuppresseur(Anglicheau, Lautrette et al. 2002).

Dans certains cas la souche résistante est sélectionnée très tôt, et reste minoritaire jusqu’à l’instauration d’un traitement. Ceci a été observé au cours du sida, mais aussi au décours des greffes d’organe(Alain, Honderlick et al. 1997; Gilbert, LeBlanc et al. 2001; Hantz, Michel et al. 2005). Il est donc particulièrement important de disposer de méthodes sensibles pour détecter ces résistances le plus tôt possible, afin d’adapter le traitement.

Détection des résistances

La résistance clinique au GCV correspond à la persistance d’une réplication virale le plus souvent disséminée (virémie, antigénémie, ADNémie) associée ou non à des signes cliniques d’infection à CMV sous traitement bien conduit. Elle doit faire rechercher une souche résistante, sans négliger les causes d’origine pharmacologique (sous dosage, mauvaise distribution du produit au site de l’infection), ou immunologiques. La résistance d’origine virologique est démontrée par la présence chez le patient, dans le sang périphérique ou mieux au site de l’infection, d’une souche de CMV résistante au GCV, soit par l’étude du phénotype de la souche isolée en culture, soit par la détection des mutations de résistance dans les gènes d’intérêt

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.

Phénotype de résistance Le phénotype de résistance repose sur la mesure des concentrations de GCV inhibant 50% (CI50 ) et 90% (CI90) de la multiplication virale en culture cellulaire. Il ne peut être effectué que si l’isolement viral a été obtenu en culture. Les sites d’isolement les plus fréquents sont les urines et le sang périphérique. Les méthodes de mesure des CI50 et CI90 sont nombreuses et mal standardisées. Il n’est donc pas possible de définir une valeur seuil universelle de CI50 ou de CI90. Ainsi, les valeurs de CI50 du ganciclovir vis-à-vis de la souche sensible de référence AD169 varient de 0,5 à 8 µM selon les laboratoires(DREW WL 1993), (Snoeck R 1996). Le groupe CMV de l’Action coordonnée n° 11 de l’Agence nationale de recherche sur le sida (ANRS) a défini une technique consensus (MAZERON M.C. 1994) (Ducancelle, Belloc et al. 2004)utilisant la détermination de l’indice de sensibilité 50% ou IS50 (CI50 de la souche étudiée divisée par la CI50 de la souche AD169 testée au cours de la même manipulation). Cet indice réduit les variations et permet une comparaison des résultats. Une souche peut être considérée comme résistante lorsque son IS50 est supérieur ou égal à 3.

Cependant, des difficultés d’interprétation subsistent. En particulier, les souches sensibles ou résistantes minoritaires au sein d’un mélange de souches peuvent être méconnues. Enfin, une souche isolée des urines ou du sang périphérique peut différer de la souche responsable de l’atteinte clinique qui justifie la mise sous traitement. Il apparaît donc important, lorsqu’une résistance est détectée, de comparer la souche émergente avec les souches antérieures du patient afin d’en vérifier la filiation. Des méthodes de biologie moléculaire sont disponibles (Watanabe 1994; Ducancelle, Belloc et al. 2004). Les souches sont différenciées finement entre elles par l’étude de deux régions : les gènes de glycoprotéines d’enveloppe UL 10, 11, 12 et 13 et la région « a » qui comporte des séquences répétées en nombre variable.

Génotype de résistance Les mutations qui induisent la résistance au GCV peuvent être directement détectées soit à partir des isolats soit à partir de l’ADN extrait des produits pathologiques. Les méthodes proposées sont variées. La méthode de référence, et la seule permettant la détection de toutes les mutations responsables de résistance, repose sur la détermination de la séquence directe des gènes UL97 et UL54. Cette méthode a également l’avantage de répertorier les mutations nouvelles et les polymorphismes (Alain, Mazeron et al. 1995; Lurain, Weinberg et al. 2001; Fillet, Auray et al. 2004; Hantz, Michel et al. 2005). La corrélation entre génotype et phénotype est excellente pour les mutations connues. Dans le cas d’une mutation nouvelle, les mutations trouvées dans des souches phénotypiquement résistantes sont considérées comme associées à la résistance. La présence de mutations de résistance connues dans le sang ou les urines est toujours associée à la résistance phénotypique des isolats correspondants (Jabs, Martin et al. 2001; Lurain, Bhorade et al. 2002). Cette bonne corrélation entre la recherche directe des mutations et l’étude phénotypique des isolats justifie la détection des mutants résistants.

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Nous avons optimisé, au laboratoire, un système de séquençage permettant de réaliser en trois à cinq jours une recherche des mutations de résistance par séquençage des gènes d’intérêt (Alain et al., ICAAC 2002, Abstract V 927 ; Champier et al. J. Virol., Methods soumis). Nous utilisons déjà largement ce test génotypique pour la surveillance des résistances chez les transplantés des régions Sud-Ouest (Toulouse, Bordeaux, Limoges) et Est (Nançy) de la France, ainsi que pour de nombreux hôpitaux parisiens, et les travaux issus de ces réseaux ont démontré la possibilité d’émergence de nouvelles mutations de résistance après transplantation rénale (Hantz, Michel et al. 2005) ou hépatique (Mengelle et al., Workshop CMV 2005). Sa sensibilité est de l’ordre de 1000 copies de génome par millilitre de sang total. Nous disposons par ailleurs d’une banque de données, issue de la littérature et de notre expérience, qui recense non seulement l’ensemble des mutations de résistance connues à ce jour, mais aussi les mutations de polymorphisme naturel sur les gènes UL97 et UL54. Ceci nous permet de différencier, devant une mutation inédite, un polymorphisme d’une mutation potentiellement responsable de résistance. Plusieurs études ont cherché à définir des facteurs de risque de résistance, et des marqueurs indirects d’émergence de la résistance tels qu’une augmentation rapide de la charge virale sous traitement ou une dissociation entre les résultats de l’antigénémie et de l’ADNémie sous traitement. Il nous paraît plus simple, puisque nous disposons dans nos deux laboratoires d’un outil de génotypage performant, et des méthodes d'étude du phénotype de résistance de rechercher systématiquement les résistances dans les souches circulantes ou au site de l’infection, puis de corréler secondairement ce résultat avec la recherche des facteurs de risques. Chez certains patients la souche résistante peut se répliquer, mais avec une charge virale circulante faible. Il est donc nécessaire de disposer de méthodes sensibles pour la détecter. L’isolement viral est dans ce cas le plus souvent impossible. Le génotype est donc la méthode de référence (Alain, Hantz et al. 2004). Lorsque l’amplification d’un gène entier n’est pas possible, il est possible d’amplifier le gène en plusieurs fragments chevauchants de petite taille pour augmenter la sensibilité. Cependant, certaines souches très minoritaires, ou de capacité réplicative très diminuée, ne seront que très difficilement analysables. Dans ce cas il est intéressant de répéter l’examen sur des prélèvements séquentiels. Les résistances du CMV aux antiviraux en pratique clinique Avant tout traitement, seuls quelques isolements ponctuels de souches résistantes au ganciclovir et/ou au foscarnet ont été rapportés (Erice A. 1989) et la description de mutations de résistance avant traitement reste exceptionnelle. En dehors du sida, les études disponibles dans la littérature concernent essentiellement l’émergence de résistance au ganciclovir, après traitement par ganciclovir IV ou oral, en transplantation d’organe. Les autres publications concernent des observations ponctuelles (Alain, Honderlick et al. 1997; Bienvenu, Thervet et al. 2000; Gilbert, LeBlanc et al. 2001). Chez les patients atteints de SIDA, l’incidence de la résistance atteignait 27 à 37 % après un an de traitement, avant l’ère des traitements antirétroviraux hautement actifs. Dans ces études, la probabilité d’émergence sous traitement de la résistance au foscarnet ou au CDV n’apparaît

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pas différente de celle de la résistance au ganciclovir (Drew 1991; Jacobson, Drew et al. 1991; Drew 1992; Alain, Honderlick et al. 1997; Bienvenu, Thervet et al. 2000; Gilbert, LeBlanc et al. 2001; Jabs, Martin et al. 2001; Jabs, Martin et al. 2003; Jabs, Martin et al. 2005). La résistance du CMV aux antiviraux apparaît comme un problème émergent chez les patients transplantés. L’équipe de Limaye a montré en 2000 une prévalence de la résistance au GCV à 7% chez l’ensemble des receveurs de greffe après 10 mois de traitement (Limaye, Corey et al. 2000). Les receveurs les plus à risque sont les receveurs séronégatifs pour le CMV avant greffe qui reçoivent un organe d’un donneur séropositif, les receveurs qui nécessitent des traitements immunosuppresseurs longs et intenses et les patients ayant subi une transplantation pulmonaire. L’incidence de la résistance chez les patients atteints d’hémopathie maligne ou de déficit immunitaire n’a été que peu étudiée à ce jour. L'utilisation à titre préventif de GCV oral, de GCV ou foscarnet par voie intra-veineuse a suscité la crainte de favoriser l'émergence de mutants résistants. Les premières études n'ont pas montré de modification de la réponse au traitement par le GCV intra-veineux institué secondairement à une prophylaxie par voie orale au cours du SIDA(Boivin, Gilbert et al. 2001).

Résistance aux antiviraux après greffe :

Valaciclovir et acyclovir:

La chimioprophylaxie orale par valaciclovir diminue l’incidence de la maladie à CMV de 78% chez les receveurs séronégatifs et de 82% chez les receveurs séropositifs ainsi que les épisodes de rejet aigu (Lowance, Neumayer et al. 1999). La faible toxicité, l’excellente biodisponibilité du valaciclovir et son excellent rapport coût-efficacité ont largement contribué à son utilisation en transplantation (Legendre, Norman et al. 2000; Fiddian, Sabin et al. 2002; Squifflet and Legendre 2002). Cette molécule a donc une AMM en prophylaxie primaire, en transplantation d’organe. Elle est également utilisée en transplantation de cellules souches hématopiétiques(Ljungman, de La Camara et al. 2002). Cependant, si l’incidence de la virémie dans les six premiers mois est globalement diminuée de 25 à 30% par la prophylaxie, un pourcentage résiduel de patients (20% des sujets séronégatifs et 14% des sujets séropositifs) développe, à l’arrêt de la prophylaxie, une infection à CMV retardée, à l’arrêt de la prophylaxie, et quelques patients présentent une réplication virale détectable sous prophylaxie (Alain, Hantz et al. 2004) (Lowance, Neumayer et al. 1999). La tendance actuelle est donc d’allonger la période de prophylaxie jusqu’au 6ème mois après la greffe et de réduire l'immunosuppression en cas d'infection à CMV (Anglicheau, Lautrette et al. 2003).

Les données manquent concernant le valaciclovir, puisque les travaux démontrant son efficacité en transplantation rénale et après allogreffe de moelle n’ont pas recherché les souches résistantes (Lowance, Neumayer et al. 1999).(Ljungman, de La Camara et al. 2002); et qu’il n’existe que des données éparses, voire contradictoires (Boivin, Erice et al. 1993; Erice, Borrell et al. 1998; Gilbert, Roy et al. 2001; Ljungman, de La Camara et al. 2002)concernant la résistance au ganciclovir liée à l’administration d’aciclovir après greffe de moelle.

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Plusieurs point peuvent être soulignés :

1) La résistance au ganciclovir après sélection in vitro par l’aciclovir a été démontrée (Michel, Hohn et al. 2001).

2) Nous avons démontré, au cours d'une étude pilote rétrospective, multicentrique, regroupant 25 cas d’infection active sous, ou à l’arrêt, d’une prophylaxie par valaciclovir, l'émergence d’une résistance de bas niveau au ganciclovir chez un receveur de rein (Alain, Hantz et al. 2004). Elle avait présenté une réplication virale continue, à très bas bruit, pendant toute la période de prophylaxie. Cette réplication virale sous prophylaxie, ou à l’arrêt du traitement, est retrouvée chez un petit nombre de patients sous valaciclovir, sans lien immédiat avec une résistance au traitement. C’est le plus souvent la levée de l’immunosuppression qui permet l’arrêt de la réplication virale(Anglicheau, Lautrette et al. 2003).

3) Nous avons également observé chez un receveur de greffe de rein séronégatif, l’émergence rapide de résistance au ganciclovir après prophylaxie par valaciclovir, avec sélection d’une mutation de résistance inconnue à ce jour (Hantz, Michel et al. 2005). L’émergence rapide, en quelques semaines, d’une mutation connue de résistance au ganciclovir a également été démontrée par l’équipe de Nantes chez un receveur de greffe cardiaque ayant reçu du valaciclovir (Imbert et al., Congrès de la Société Française de Microbiologie, Mai 2004, abstract).

Valganciclovir et ganciclovir :

La mise sur le marché, en 2004, du valganciclovir (Rovalcyte®) en traitement prophylactique ou anticipé de la maladie à CMV après transplantation d’organe a modifié les attitudes thérapeutiques. Administrable par voie orale, en une à deux prises par jour, cette prodrogue permet d’obtenir une concentration plasmatique équivalente à celle du ganciclovir intraveineux (Currant and Noble, 2001). Le valganciclovir est de plus en plus largement utilisé, en prophylaxie du fait de son efficacité (10% d’infections actives résiduelles sous traitement prophylactique)(Boivin, Goyette et al. 2005) supérieure à celle du ganciclovir oral et équivalente à celle du ganciclovir intraveineux, et de sa bonne biodisponibilité Pescovitz, 2003 #633}. Cependant, le taux d’infection active à l’arrêt de la prophylaxie serait plus élevé qu’avec le ganciclovir oral (14% versus 7%). Sa toxicité, similaire à celle du gancivlovir intraveineux, et la difficulté d’adapter les doses chez certaint patients est parfois à l’origine d’interruptions thérapeutiques.

Après greffe, les résistances après prophylaxie par ganciclovir surviennent essentiellement chez les transplantés pulmonaires et dans cette population, la différence d’incidence entre ganciclovir IV et valganciclovir n’est pas significative (Humar, Kumar et al. 2005). A l’inverse, comparé au ganciclovir oral, le valganciclovir apparaît moins pourvoyeur de résistances probablement du fait d’une meilleure biodisponibilité (Tableau I).

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Très peu de données sont disponibles sur les résistances après traitement anticipé. Elles concernent exclusivement le ganciclovir et le valganciclovir. Les études les plus récentes portant sur 70 receveurs d’organes Diaz Pedroche, (Diaz-Pedroche, Lumbreras et al. 2005) et

Tableau I : fréquence des résistances au ganciclovir en transplantation d’organe

Humar2005

1/40 (2,5)6m1 an

UL97SystématiquePoumonGCV oral#

Boivin2004

2/103 (1,9)1/33 (6,1)

4m1 an

UL97SystématiqueTousGCV oral

Gruber,2005

0>1 an/Maladie à CMVReinVal GCV*

Humar2005

1/40 (2,5)1/40 (2,5)

6 m1 an

UL97/UL54

SystématiquePoumonVal GCV#

Boivin2004

00

4m1 an

/SystématiqueTousVal GCV

Limaye,2000

5/240 (2,1)1 anUL97Maladie à CMVTousGCV oral

N (%)suiviMutantsCirconstancesOrganeTraitement

107 receveurs de cellules souches hématopoiétiques (van der Heiden, Kalpoe et al. 2006), confirment l’efficacité équivalente du ganciclovir IV et du valganciclovir en traitement préemptif, et ne montrent pas de résistance clinique sur 12 mois. Cependant l’étude de Limaye, en 2002 portant sur 18 patients traités par ganciclovir IV montrait une fréquence élevée de résistance (10%).

Les données manquent après allogreffe de moelle. La fréquence des souches résistantes lorsqu’une réplication virale persiste sous traitement par ganciclovir serait de 9% (Reusser, Cordonnier et al. 1996; Reusser, Hostettler et al. 1996; Meijer, Boland et al. 2003), mais dans l’étude de Reusser, seules quelques souches ont été étudiées. Des cas isolés de résistance ont été décrits, y compris récemment (Springer, Chou et al. 2005)mais aucune étude de cohorte spécifique n’a été publiée à ce jour. Cependant, l’émergence rapide de résistance sous GCV, chez les patients ayant reçu de l’aciclovir en prévention des infections à Herpès simplex a été observée(Erice, Borrell et al. 1998).

Facteurs de risque de résistance :

L’émergence sous traitement d’une souche de CMV résistante résulte de l’association de plusieurs facteurs : 1) Le caractère intense et prolongé de l’immunodépression, qui favorise la persistance d’une réplication virale, rend nécessaire des traitements prolongés tant que l’immunodépression persiste. 2) L’existence d’une forte réplication virale, reflétée par la charge virale dans le sang périphérique ou l’antigénémie, favorise l’émergence des mutants, initialement minoritaires. 3) Enfin, l’exposition prolongée du virus à l’antiviral favorise la

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sélection des souches résistantes. Le facteur à prendre en compte est la durée cumulée de traitement, car les mutants résistants peuvent persister dans l’organisme sous forme latente après l’infection. Des tentatives séduisantes de modélisation mathématique en fonction de ces paramètres sont en cours, mais ne sont pas, à l’heure actuelle, applicables en pratique courante (Emery and Griffiths 2000). Parmi les receveurs d’organe, les transplantés pulmonaires constituent un groupe à risque élevé de résistance. Un point important est la possibilité d’émergence rapide de multiples souches chez un même patient, témoignant du potentiel évolutif des souches de CMV chez les patients. Ce phénomène connu chez les patients infectés par le VIH et observé, sous pression de sélection antivirale chez des patients immunosupprimés (Alain, Honderlick et al. 1997; Chou, Marousek et al. 1997; Ducancelle, Gravisse et al. 2005) avec compartimentation possible des souches, est également retrouvé en l’absence de pression antivirale, après transplantation pulmonaire. Cette variabilité des souches pourrait faciliter la sélection (Puchhammer-Stockl, Gorzer et al. 2006) de mutants résistants.

Un point important pour la réponse thérapeutique est la reconstitution immunitaire spécifique anti-CMV :

Par des techniques immunologiques (Tétraméres, ou techniques ELISPOT) (Ohnishi, Sakurai et al. 2005; Westall, Kotsimbos et al. 2006) il est possible de mesurer la réponse cytotoxique spécifique du CMV. Après greffe de cellules souches hématopoiétiques comme après greffe d’organe, la reconstitution immunitaire est corrélée à la réponse au traitement. Elle représente donc un élément intérressant pour prédire les rechutes et il serait utile de la corréler à l’emergence de résistance ou à la multiplicité des souches présentes chez les patients. Le choix d’un observatoire large, avec des prélèvements ciblés, rend difficile l’étude de la réponse immunitaire, qui pourrait faire l’objet de protocoles ancillaires sur des populations ciblées.

II-3- Bénéfices attendus et perspectives

Sur la base de l’expérience acquise en matière de résistance du CMV aux antiviraux, et à partir des travaux communs effectués en collaboration avec de nombreux collègues virologues (Alain, Hantz et al. 2004; Ducancelle, Belloc et al. 2004; Fillet, Auray et al. 2004; Alain, Ducancelle et al. 2005; Ducancelle, Alain et al. 2005; Hantz, Michel et al. 2005) il nous est apparu utile de mettre en place un réseau national de surveillance systématique de l’émergence de souches résistantes après transplantation.

En effet, la résistance aux antiviraux en pratique clinique quotidienne est incomplètement recensée :

Nous avons tenté sur quelques centres l’étude rétrospective des résistances pour les patients transplantés en 2004. Les résultats très parcellaires ci-dessous montrent la difficulté de recueillir de façon rétrospective des informations exhaustives (Tableau II). Une récente méta-analyse sur 17 essais et 1980 receveurs d’organes solides destinée à mettre en évidence le bénéfice des traitements préventifs (prophylaxie versus traitement anticipé (Kalil, Levitsky et al. 2005) sur l’incidence de la maladie à CMV montre clairement les limites des différentes

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études publiées : faible taille des populations étudiées, caractère parcellaire des recueils de données, absence de distinction entre maladie à CMV et syndrome CMV, manque d’information sur la date de survenue de la maladie à CMV. Ceci souligne la nécessité d’un recueil prospectif, exhaustif de données et d’échantillons cliniques dans une large population, pour obtenir des résultats interprétables.

L’utilité d’un tel réseau pour les patients transplantés est :

1) de mesurer l’incidence des échappements au traitement préventif ou curatif liés à une résistance aux antiviraux, non pas dans des études de mise sur le marché, mais dans la pratique courante, en association aux multiples traitements administrés après transplantation et

2) de disposer rapidement des données de résistance des souches pour chaque patient, afin d’adapter au mieux l’attitude thérapeutique.

Dans un premier temps nous devrons valider le fonctionnement de ce réseau par un bilan à la fin de la première année de recueil de données. Une fois en place, celui-ci sera utilisable pour mesurer l’impact sur la résistance de toute nouvelle molécule utilisée en prévention de la maladie à CMV.

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Tableau II : Etude rétrospective des résistances chez les patients transplantés en 2004 et suivis en 2004 et 2005. Cette étude est non exhaustive, faute de recueil prospectif des données.

HOPITAUX RESISTANCE

Cellules soucheshématopoiètiques Rein

Rein-pancreasou pancreas Foie

Poumon ou cœur-poumon Cœur TOTAL

NeckerRésistance clinique 10/72 (14%)

(3 adultes et 7 enfants) 10Résistance avérée(mutation)

2 enfants/72 (2,7%) (Décédés)(- 1er enfant mutation UL54 : K513N et E756D

mutation UL97: C607S- 2nd enfant mutation UL54: N408D mutation UL97: A594P) 2

St Louis Résistance clinique 5/243 (2%) 3/130 (2,3%) 8Résistance avérée(mutation)

2 (0,8%) 1 (0,7%)3

Pitié-Salpêtrière Résistance clinique 1/55 (1,8%) 1Résistance avérée(mutation)

1/55 (1,8%) (mutation UL97 : 1

Foch Résistance clinique 2/58 (3,4%) 2Résistance avérée(mutation) 0 0

Rennes Résistance clinique 1/22 (4,5%) 2/104 (1,9%) 3Résistance avérée(mutation)

ND 00

Limoges Résistance clinique 0 0Résistance avérée(mutation)

00

Bordeaux Résistance clinique 2/80 (2,5%) 2Résistance avérée(mutation) 0 0

Toulouse Résistance clinique 4/87 (4,6%) 1/51 (1,96%) 5Résistance avérée(mutation)

1/87 (1,1%)(mutation UL97: M460 I)

1/51 (1,96%)(mutation UL97: A594V) 2

Nancy Résistance clinique 1/43 (2,3%) 1/18 (5%) 2Résistance avérée(mutation)

1/43 (2,3%)(mutation UL97 : M460I et A594T) 0 1

Besançon - Dijon Résistance clinique 1/32 (3,1%) 2/40 (5%) 3Résistance avérée(mutation)

1/32 (3,1%) (Décédé)(mutation UL97: Met 460 Val)

1/40 (2,5%) + ND (mutation : L595S) 2

ND : phénotype et génotype impossibles à réaliser Total résistances cliniques : 36Résistance clinique : cas déclarés, recueil non exhaustif Total résistances avérées : 11Résistance avérée : cas pour lesquels un génotype ou un phénotype a été effectué avec succès

GREFFES

Bilan des recherches de résistances pour les centres participants en 2004 et 2005

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III- OBJECTIFS DE L'ETUDE

III-1- Objectif principal

Etude de l’incidence de la résistance du cytomégalovirus aux antiviraux après transplantation d’organe et greffe de cellules souches hématopoïétiques chez les patients présentant une infection active à CMV.

III-2- Objectifs secondaires

1. Etude des mutations de résistance et des nouvelles mutations associées à une

résistance clinique et virologique. 2. Epidémiologie des souches initiales, des souches présentes à l’arrêt de la prophylaxie

et des souches associées à une résistance clinique. 3. Dosage plasmatique des antiviraux au cours des épisodes de résistance clinique, à la

recherche d’une cause pharmacologique à l’échappement virologique. 4. Si le nombre de cas de résistance le permet, étude des facteurs favorisant la persistance

de la réplication virale dans les cas ou la résistance virologique n’est pas démontrée (immunosuppression, réponse spécifique anti-CMV, charge virale).

5. Mise en place, au niveau national, d’un réseau de recueil prospectif de données, de souches et d’échantillons.

III-3-Perspectives d’avenir

Au delà de la durée du PHRC, cet observatoire permet de mettre en place un circuit de recherche clinique sur le CMV. Ainsi certains patients, notamment ceux présentant des épisodes itératifs de réplication virale, ou une réplication prolongée à bas bruit, sans résistance pendant la période d’observation, seront suivis plus longtemps, et continueront d’enrichir la banque de données créée pour l’observatoire. Le réseau et la banque de données de l’observatoire pourront ainsi être utilisés au fur et à mesure que de nouveaux antiviraux seront mis sur le marché, pour suivre les patients présentant une résistance.

IV- TYPE D’ETUDE Etude multicentrique, de cohorte, ouverte. Loi Huriet avec bénéfice individuel direct.

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V- JUSTIFICATION DU RAPPORT BENEFICE / RISQUE

Bénéfice pour le patient : La détection des résistances, effectuée en temps réel, permet d’adapter la stratégie thérapeutique, d’améliorer la prise en charge des complications de l’infection à CMV et de ne pas poursuivre un traitement antiviral inadapté lorsqu’une résistance est détectée. Risque : Uniquement lié aux prélèvements sanguins pour recherche de résistance.

VI- SELECTION DES SUJETS

VI-1- Critères d'inclusion dans la cohorte

Présentant ou ayant présenté une infection active à CMV (les patients rentrent dans la cohorte à partir du premier épisode d’infection active)

Bénéficiant ou non d’une prophylaxie spécifique anti-CMV Patients affiliés à un régime de sécurité sociale

Patients informés Patient receveur d’allogreffe de moelle ou de cellules souches hématopoïétiques ou

patient receveur d’organe solide Greffé après le 1er janvier 2006 et présentant un premier épisode d’infection à CMV Majeur ou mineur

NB : L’inclusion des mineurs est justifiée compte tenu de l’importance du bénéfice escompté Définition (Boivin, Goyette et al. 2005)

L’infection active à CMV (ou infection à CMV) est définie par la présence d’un ou plusieurs marqueurs de dissémination sanguine du virus :

• Virémie (isolement du virus à partir du sang) ou , • Antigénémie ou, • Présence répétée d’ADN du CMV dans le sang ou les leucocytes détecté par

des méthodes quantitatives ou dans le plasma avec ou sans quantification virale.

• Présence d’ARN messagers précoces du virus dans les leucocytes

Et/ou un échantillon tissulaire positif (culture, histologie, immunochimie, hybridation in situ)

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VI-2- Critères de non inclusion

Patients non assurés sociaux,

Patient refusant de participer.

VI-3- Conditions de recrutement des sujets et information des patients Patients concernés : Patients hospitalisés ou suivis en hôpital de jour, après une transplantation d’organe ou de cellules souches hématopoïétiques. Conditions de recrutement :

Signalement de l’infection active à CMV par le virologue investigateur. Eligibilité : discutée entre le virologue et le clinicien investigateur. Inclusion : selon les critères, après information du patient par le clinicien investigateur (le

consentement n’est pas nécessaire puisque l’étude ne relève pas de la loi HURIET). L’investigateur, ou un médecin qui le représente, doit faire connaître aux personnes

recrutées, l’objectif de l’étude, la durée de l’étude, les bénéfices attendus ainsi que les contraintes et risques prévisibles, les alternatives médicales, les examens supplémentaires.

Les mineurs, les majeurs protégés ou les majeurs hors d’état d’exprimer leur consentement doivent recevoir l’information adaptée à leur capacité de compréhension ainsi que les personnes, organes ou autorités chargés de les assister, de les représenter ou d’autoriser la recherche. Pour les mineurs non émancipés, l’information est donnée aux titulaires de l’exercice de l’autorité parentale. Consentement des 2 titulaires de l’autorité parentale est recherché mais s’il est impossible de consulter l’un des 2 titulaires, le consentement de l’autre suffit.

La participation à un autre protocole n’est pas un critère d’exclusion.

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VII- CRITERES DE JUGEMENT

VII-1- Critère de jugement principal

Le critère de jugement principal est l’incidence de la résistance virologique avérée dans les 18 mois suivant la greffe chez les patients ayant au moins un épisode d’infection active à CMV.

VII-2- Critères de jugement secondaires

Définitions des évènements liés à l’infection à CMV : (Meijer, Boland et al. 2003; Boivin, Goyette et al. 2005)

La maladie à CMV avec syndrome viral à CMV est définie par : • Une dissémination sanguine du virus associée à une fièvre persistante (≥ à

38°C) ou une leucopénie (<3000leucocytes/μL) ou une thrombopénie (plaquettes< 75000/μL) ou une élévation des enzymes hépatiques (2 x la limite supérieure de la normale)

La maladie à CMV avec invasion tissulaire est définie par : • La preuve d’une infection localisée à CMV par une biopsie ou par un autre

échantillon approprié (liquide de lavage broncho-alvéolaire, liquide céphalo-rachidien…) et

• Des symptômes appropriés ou des signes de dysfonctionnement d’organe (le rejet étant exclu).

• Associés ou non à un syndrome CMV. Une suspicion de résistance virologique est définie par :

• la persistance d’une infection active à CMV, définie par une antigénémie pp65 positive ou une ADNémie leucocytaire persistant pendant plus de 15 jours sous traitement antiviral bien conduit,

• et/ou l’augmentation de la charge virale de plus de 0.5 log par semaine sous traitement antiviral,

• et/ou l’absence de réponse clinique à l’administration d’un traitement antiviral adéquat (posologie et voie d’administration correcte) appréciée par le clinicien.

Une résistance virologique avérée est définie : • Après isolement de la souche de CMV du patient par une augmentation de la

concentration inhibitrice 50% de l’antiviral vis-à-vis de la souche du patient d’un facteur supérieur ou égal à 3 par rapport à la souche AD169 de phénotype sensible.

• Et/ou la détection de mutations de résistance connues au sein des gènes viraux UL97 et/ou UL54 à partir de prélèvements de sang ou de prélèvements au site de l’infection.

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VIII- ORGANISATION DE L’ESSAI

VIII-1- Procédures cliniques et biologiques 1) Les patients sont inclus dans chaque centre, par le virologue investigateur en accord

avec le clinicien, devant la présence d’une infection active à CMV. Le virologue adresse la fiche de renseignements au laboratoire de référence. (cf fiche de première infection à CMV en annexe7). Il conserve un aliquote de 500 μl de sang total ou de leucocytes (selon la technique de surveillance utilisée en routine dans son laboratoire : antigénémie ou ADN/ARNémie) à l’inclusion et, si possible, obtient isole et conserve une souche virale selon les modalités en vigueur dans son laboratoire.

2) Les recherches de résistance sont demandées par le virologue devant toute suspicion

de résistance clinique (voir critères de jugement). Les prélèvements destinés à la recherche de résistance sont effectués dans les services cliniques et transmis au laboratoire de virologie du centre qui les traite. Chaque fois que cela est possible, il est souhaitable d’isoler à partir de sang, d’urines, de salive ou d’autres prélèvements la souche de CMV afin de pouvoir pratiquer un antivirogramme en plus du génotype de résistance. Le virologue organise le stockage des souches et des échantillons cliniques destinés à l’Observatoire et leur envoi vers le laboratoire central. Il demande les prélèvements complémentaires destinés au dosage de l’antiviral. Il remplit la feuille de renseignements pour demande de résistance (Annexe 7) et l’envoie au laboratoire de référence avec le prélèvement. Dans l’impossibilité de réaliser l’isolement, le virologue peut transmettre les prélèvements destinés à l’isolement au laboratoire de référence.

3) Le virologue adresse avec la demande de résistance les prélèvements initiaux et, si

disponibles, des échantillons cliniques des épisodes intermédiaires, destinés à la recherche rétrospective de résistance et, si possible, un bilan des charges virales ou antigénémies antérieures du patient.

4) L’ARC de l’étude réceptionne les fiches d’inclusion, les demandes de résistance, et

les prélèvements. Il anonymise les dossiers patients et entre les données dans une banque de données excel . Les prélèvements et le recueil des données des patients inclus dans la cohorte sont anonymisés et référencés par les trois premières lettres du nom, les deux premières lettres du prénom, un numéro de centre et un numéro de patient. Il s’enquiert pour chaque demande de résistance de l’adaptation thérapeutique effectuée (levée de l’immunosuppression, changement d’antiviral) et de son résultat.

5) Les dossiers destinés au recueil de données cliniques et virologiques incomplets sont

remplis par l’ARC de l’étude avec le concours des cliniciens investigateurs et les virologues, à l’aide d’une fiche de liaison EXCEL colligeant l’ensemble des données listées en annexe 9. Les données manquantes sont collectées par l’ARC de l’étude au cours des visites de centre (deux visites pendant la période d’étude). Il récupérera en outre le nombre total de greffes par centre par organe ainsi que les sérologies des donneurs et des receveurs.

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6) Les schémas de surveillance virologique après greffe peuvent varier selon les équipes. Il est néanmoins nécessaire, afin de permettre l’analyse des résultats que la surveillance systématique des patients suive le schéma minimal le plus communément admis et appliqué dans les publications internationales : Au moins une recherche de CMV dans le sang toutes les deux semaines pendant les trois premiers mois puis une fois par mois pendant les trois mois suivants, et une fois tous les deux mois jusqu’à la fin de la première année. (Razonable, Paya et al. 2002; Kamar, Mengelle et al. 2005). Puis une recherche à chaque visite. Si un traitement prophylactique de plus de trois mois est utilisé, des prélèvements au moins mensuels sont recommandés pendant les trois mois suivant l’arrêt de celui-ci. C’est en effet pendant cette période que les récurrences sont les plus fréquentes.

7) La durée de la période d’observation est de dix-huit mois, sachant que la majorité des

infections actives, même retardées surviennent dans la première année suivant la greffe (Meijer, Boland et al. 2003; Boivin, Goyette et al. 2005; Razonable 2005). Cette période pourra être prolongée hors étude si nécessaire, dans le cadre des activités du CNR pour les patients ayant déjà présenté plusieurs épisodes d’infection à CMV traités pendant la période d’étude .

Outre la modification éventuelle du rythme des prélèvements les pratiques habituelles du laboratoire et des services en matière de diagnostic et de traitement de l’infection à CMV ne sont pas modifiées. Chaque centre reste libre d’exploiter ses données.

Prélèvements virologiques

Prélèvements complémentaires suivants destinés à l’isolement de la souche virale et à la recherche de résistance :

Trois tubes de 7ml de sang (Deux tube sur EDTA destinés au génotype et au dosage éventuel de la molécule administrée en cas de suspicion de résistance, et un tube sur héparine destiné à l’isolement viral).

Un prélèvement d’urine en milieu de transport virus. Un prélèvement de salive en milieu de transport virus. Si disponibles, des prélèvements permettant d’identifier la souche présente au site de

l’infection (lavage bronchoalvéolaire, biopsie, liquide céphalorachidien…).

Examens virologiques

Sur ces prélèvements seront effectués un isolement viral pour antivirogramme, et une amplification et séquençage des gènes UL97 et UL54 à la recherche de résistance. Lorsque cela est possible, il est préférable que l’isolement viral soit effectué en routine par le laboratoire du centre investigateur, qui transmettra ensuite la souche isolée au laboratoire centralisateur. Dans le cas contraire, un tube hépariné envoyé à température ambiante ou un prélèvement (urines, salive, LBA), envoyé à -30°C en milieu de transport, permettra au laboratoire de référence de tenter l’isolement.

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Etude du phénotype de résistance

Elle sera effectuée en différé chez tous les patients inclus, à partir des souches isolées en culture cellulaire.

La méthode consensus développée par le groupe CMV de l’Action coordonnée n°11 de l’Agence nationale de recherche sur le SIDA (ANRS) sera utilisée.

Cette méthode associe l’utilisation d’un inoculum constitué des cellules infectées après un à trois passages du virus en culture cellulaire et la mesure de la réduction du nombre de foyers marqués en 5 à 6 jours par immunopéroxydase indirecte à l’aide d’un anticorps monoclonal spécifique des antigènes très précoces du CMV (Ducancelle, Belloc et al. 2004; Hantz, Michel et al. 2005). La détermination de l’indice de sensibilité 50 % ou IS50 (CI50 de la souche étudiée divisée par la CI50 de la souche AD169 testée au cours de la même manipulation) réduit les variations et permet une comparaison des résultats. Une souche peut être considérée comme résistante lorsque son IS50 est supérieur ou égal à 3 (Alain, Mazeron et al. 1993; Alain, Mazeron et al. 1995).

La comparaison des souches isolées avant et en cours de traitement sera effectuée.

En cas de résistance au ganciclovir ou de mutations de l’ADN polymérase virale, des résistances croisées à l’acyclovir, au cidofovir et au foscarnet seront systématiquement recherchées par antivirogramme.

Etude du génotype de résistance

La méthode de référence de l’étude sera la séquence directe des gènes UL97 et UL54, développée au laboratoire, associant une PCR sur isolats ou prélèvements cliniques et une séquence par la méthode Bayer Diagnostic (Dye-primer) ou ABI (Dye Terminator) avec alignement et interprétation des séquence dans le logiciel GeneObject (Bayer Diagnostics). Cette méthode permet la détection des souches mutées avec un seuil de 20% de la population virale (Champier et al., J. Virol. Methods, soumis). Nous avons construit une banque de données comportant les mutations connues de résistance du CMV aux antiviraux, et nous utilisons un logiciel d’alignement performant qui permet de repérer rapidement les mutations de résistance, et de rendre les résultats sous forme d’un rapport clinique. Si le laboratoire du centre investigateur effectue en routine la recherche de résistance par une méthode différente de celle préconisée dans le protocole, les résultats rendus par ce laboratoire seront utilisés. La séquence sera complétée par les laboratoires centraux à partir des prélèvements qui lui seront envoyés afin d’obtenir, in fine, des résultats homogènes de séquence et de détecter toute mutation inédite.

Dosage des molécules administrées En cas de résistance clinique un tube de plasma sera prélevé et conservé à -80°C sous volume de 1ml aliquoté pour dosage plasmatique éventuel des antiviraux. Ce sdosages pourront être effectués par le service de pharmacologie du CHU DUPUYTREN, à Limoges.

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Epidémiologie des souches

Les techniques d’épidémiologie des souches résistantes sont en place dans les laboratoires participant au Centre de Référence Cytomégalovirus. Les souches correspondant à l’épisode initial, au rebond virologique après arrêt de la prophylaxie et aux épisodes de résistance cliniques seront étudiées. Le typage des souches sera effectué par séquençage de régions des gènes codant pour les protéines G N et O (Puchhammer-Stockl, Gorzer et al. 2006). Les souches multiples seront détectées par étude du profil de restriction d’un fragment de la région recouvrant les gènes UL10-11-12-13 (Watanabe 1994). Ces résultats seront contrôlés par l’étude des microsatellites (Picone, Ville et al. 2005).

Etudes ancillaires En fonction des résultats, des études ancillaires pourront être effectuées sur les prélèvements centralisés et un complément d’information clinique pourra être demandé.

VIII-2 Calcul du nombre de patients

Nombre de greffes 4816 en 2004 d’après le registre des greffes :

Cellules du sang

Rein(suivi) Cœur Foie Poumons Pancréas TOTAL

Sud 360 911 96 309 39 7 1722Nord 623 1512 221 622 106 10 3094

983 2423 317 931 145 17 4816

TOTAL DES GREFFES PAR ORGANE

Nombre d’infections actives à CMV : de 10% à 30% selon les types de greffe (organe ou moelle et le traitement : prophylaxie ou anticipé) Soit : de 481 à 1443 infections actives à CMV attendues par an, donc 962 à 2886 infections actives sur 2 ans (durée des inclusions) Si nous enlevons 10% de patients non inclus : 952 à 2857 Donc au maximum 2857 patients inclus Résistance clinique : Inclut les résistances avérées, mais aussi les rechutes et les résistances cliniques liées à des causes pharmacologiques ou à l’immunosuppression. Elle est estimée arbitrairement à 10% soit 95 à 285 patients présentant une résistance clinique, au maximum Ce pourcentage varie selon, le schéma thérapeutique, le schéma d’immunosuppression, le type de greffe.

33

Pour chaque patient : 2 recherches de résistance sont effectuées : sur les prélèvements pratiqués au moment de la résistance clinique et sur les prélèvements initiaux du patient.

VIII-3- Gestion des événements indésirables VIII-3-1- Définition d’un événement indésirable

Un événement indésirable est défini comme tout événement médical survenant à tout

moment de l'essai, chez un patient ou un sujet quelle que soit sa relation de causalité avec le traitement de l'essai.

Aucun traitement n’étant administré les seuls effets indésirables possibles sont ceux liés aux prélèvements de sang ou d’urine.

VIII-3-2- Définition d’un événement indésirable grave

Un événement indésirable grave répond à une définition réglementaire « recommandations du 12 Septembre 1994 de l’Agence du Médicament », cela n'implique pas nécessairement qu'il s'agit d'un événement cliniquement grave ou délétère. Un événement indésirable grave est défini comme tout événement survenu au cours de l'essai et qui a conduit à l'une des évolutions suivantes :

- dont l’issue est fatale, - mettant en jeu le pronostic vital, - entraînant une hospitalisation ou une prolongation d’hospitalisation, - entraînant une incapacité fonctionnelle durable, - survenant après un surdosage, - faisant apparaître une anomalie congénitale ou une affection néoplasique.

Aucun effet indésirable grave n’est attendu dans l’étude VIII-3-3- Gestion d’un événement indésirable grave

Dès la survenue d'un événement indésirable, l'investigateur apportera les soins

nécessaires au patient. L'investigateur remplira un formulaire de déclaration d'événement indésirable grave

(annexe 3) et le transmettra par fax au promoteur, le CHU de LIMOGES. CHU de Limoges – Hôpital Dupuytren Direction des Affaires Médicales et de la Recherche Clinique 2 Avenue Martin Luther King 87042 Limoges Cedex TEL : 05 55 05 63 49 FAX : 05 55 05 66 96

Cette procédure a pour objet de permettre au CHU de Limoges de faire face à ces

obligations légales de déclaration au Comité de Protection des Personnes et à l’Autorité Compétente.

Le Comité de Protection des Personnes s’assure, par la suite, que les patients sont informés des effets indésirables et qu’ils confirment leur consentement.

34

VIII-4- Schéma récapitulatif de l’étude

35

IX- ETUDE MEDICO-ECONOMIQUE

Cette étude de cohorte n’est pas conçue pour permettre un recueil de données économiques

IX-1 Durée de l’étude Trois ans et demi Durée des inclusions : deux ans. Durée de participation des patients : 18 mois de surveillance.

IX-2 Analyses statistiques Effectuée par l’Unité Fonctionnelle de Recherche Clinique et de Biostatistique (UFRCB). IX-2-1- Calcul de l’incidence de l’infection active à CMV résistant aux antiviraux.

L’incidence de la résistance se calcule sous 2 modes de calcul différents : Incidence cumulée = nombre de patients résistants / nombre total de greffes Densité d’incidence = durée de suivi pour chaque patient en fonction de la date de greffe La densité d’incidence est plus précise car elle tient compte du temps de suivi de chaque patient car différentes figures peuvent apparaître pour les patients greffés : Greffe suivi pendant une durée minimum de 18 mois sans résistance Greffe patient perdu de vue Greffe patient décédé Greffe Résistance(s) Même si le patient présente plusieurs résistances successives dans le temps, on ne tiendra compte que de la date de la première résistance pour le calcul de l’incidence. A partir de cette étude, l’obtention du nombre de patients greffés total sera obtenu facilement. Ce nombre permettra d’estimer de façon plus précise le pourcentage de résistances avérées attendues. Ce n’est pas un échantillon mais une population ; il n’y aura donc pas de calcul d’intervalle de confiance.

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HOPITAUX RESISTANCE

Cellules soucheshématopoiètiques Rein

Rein-pancreasou pancreas Foie

Poumon ou cœur-poumon Cœur TOTAL

NeckerRésistance clinique 10/72 (14%)

(3 adultes et 7 enfants) 10Résistance avérée(mutation)

2 enfants/72 (2,7%) (Décédés)(- 1er enfant mutation UL54 : K513N et E756D

mutation UL97: C607S- 2nd enfant mutation UL54: N408D mutation UL97: A594P) 2

St Louis Résistance clinique 5/243 (2%) 3/130 (2,3%) 8Résistance avérée(mutation)

2 (0,8%) 1 (0,7%)3

Pitié-Salpêtrière Résistance clinique 1/55 (1,8%) 1Résistance avérée(mutation)

1/55 (1,8%) (mutation UL97 : 1

Foch Résistance clinique 2/58 (3,4%) 2Résistance avérée(mutation) 0 0

Rennes Résistance clinique 1/22 (4,5%) 2/104 (1,9%) 3Résistance avérée(mutation)

ND 00

Limoges Résistance clinique 0 0Résistance avérée(mutation)

00

Bordeaux Résistance clinique 2/80 (2,5%) 2Résistance avérée(mutation) 0 0

Toulouse Résistance clinique 4/87 (4,6%) 1/51 (1,96%) 5Résistance avérée(mutation)

1/87 (1,1%)(mutation UL97: M460 I)

1/51 (1,96%)(mutation UL97: A594V) 2

Nancy Résistance clinique 1/43 (2,3%) 1/18 (5%) 2Résistance avérée(mutation)

1/43 (2,3%)(mutation UL97 : M460I et A594T) 0 1

Besançon - Dijon Résistance clinique 1/32 (3,1%) 2/40 (5%) 3Résistance avérée(mutation)

1/32 (3,1%) (Décédé)(mutation UL97: Met 460 Val)

1/40 (2,5%) + ND (mutation : L595S) 2

ND : phénotype et génotype impossibles à réaliser Total résistances cliniques : 36Résistance clinique : cas déclarés, recueil non exhaustif Total résistances avérées : 11Résistance avérée : cas pour lesquels un génotype ou un phénotype a été effectué avec succès

GREFFES

Bilan des recherches de résistances pour les centres participants en 2004 et 2005

IX-2-2- Analyse des facteurs influençant la survenue de résistance avérée

L’analyse des facteurs influençant la survenue de résistance avérée sera calculée

uniquement si le nombre de cas de résistance avérée permet ce calcul.

Chaque paramètre (statut sérologique donneur/receveur, charge virale, administration d’anticorps antilymphocytaires, …) sera d’abord comparé entre le groupe patients avec survenue de résistance et le groupe sans survenue de résistance en analyse univariée. Les tests statistiques classiques chi 2 ou test exact de Fisher, test T de Student ou Mann Whitney seront utilisés.

L’ensemble des paramètres significatifs ou ceux ayant un degré de significativité inférieur à 0,20 seront entrés dans un modèle multivarié (régression logistique). Le modèle final sera ensuite obtenu en pas à pas descendant (méthode de Hosner et Lemeshow). Les interactions 2 à 2 seront testées. Le degré de significativité sera fixé à 0,05 pour l’ensemble des analyses.

X- COMITE DE SURVEILLANCE

Il s’agit d’une étude de cohorte ne nécessitant pas de Comité de Surveillance

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XI- ASPECTS MATERIELS ET LEGAUX

Assurance

Conformément à la loi, le CHU de LIMOGES a souscrit une assurance garantissant sa

responsabilité civile de manière spécifique à cette étude.

Comité de Protection des Personnes (CPP)

Conformément au code de la Santé Publique, ce protocole sera soumis pour avis au Comité de Protection des Personnes du Limousin qui est le comité compétent pour le CHU de Limoges où l’investigateur principal exerce son activité.

Autorité Compétente

Conformément au code de la Santé Publique, ce protocole sera soumis pour autorisation à l’Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé (AFSSaPS) « pour les études thérapeutiques, ou faisant intervenir un médicament qui n’est pas à l’étude, ou les études sur les dispositifs médicaux »,

à la Direction Générale de la Santé « pour les autres ».

Procédure d’amendement au protocole

Toute modification substantielle recueillera l’avis du CPP et l’autorisation de l’Autorité Compétente avant d’être mise en application.

Concernant les faits nouveaux portant atteintes à la sécurité des personnes, l’investigateur prend les mesures de sécurité urgentes appropriées et en informe le promoteur le plus rapidement possible. Ce dernier informe, sans délai, l’Autorité Compétente et le CPP de ces faits nouveaux et des mesures prises.

Anonymat des sujets participant à cette étude

L’identité des personnes participantes n’apparaîtra dans aucune publication et/ou communication issues de cette étude.

Toutes les données collectées au cours de cette étude feront l’objet d’un traitement informatisé. Les patients seront désignés par les 3 premières lettres du nom et les 2 premières lettres du prénom. Le promoteur effectuera une déclaration des fichiers informatiques auprès de la CNIL, conformément à la loi relative à l’Information et aux Libertés du 6 Janvier 1978.

Tous les participants de l’étude s’engagent à maintenir la plus stricte Confidentialité sur tous les documents et informations qui leur seront soumis.

Assurance qualité

Les personnes chargées du contrôle de qualité de l’étude et dûment mandatées à cet effet

par le promoteur ont accès, sous réserve de l’accord des personnes concernées, aux données individuelles strictement nécessaires à ce contrôle ; elles sont soumises au secret professionnel.

38

Archivage des documents de l’essai

Conformément à la loi et aux Bonnes Pratiques Cliniques, tous les documents se

rapportant à l’essai seront conservés sur support papier durant une période minimale de 15 ans à la fois chez l’investigateur principal et le promoteur.

Règles de publication

Les données de l’observatoire pourraient être exploitées sous deux formes :

Publication virologique ou publication clinique Dans les deux cas l’investigateur principal signe les publications en premier ou en

dernier auteur Le co-investigateur en deuxième Les autres investigateurs virologues et/ou cliniciens apparaissent par ordre décroissant en fonction de leur contribution à l’étude. Si le nombre d’auteurs est limité, apparaitront en plus de l’investigateur principal et du co-investigateur les investigateurs principaux. Les autres investigateurs formant un groupe dit « Groupe observatoire CMV » détaillé dans la publication et seront considérés comme co-auteurs.

Surcoûts de l’étude

Les surcoûts de l’étude sont précisés dans l’évaluation budgétaire qui se trouve en

annexe de ce protocole et sont pris en charge par :

L’InVS via le Budget du Centre National de Référence Cytomégalovirus prend en charge les réactifs et le personnel nécessaires à la réalisation des examens virologiques centralisés (génotype de résistance et antivirogramme) ainsi que la moitié du surcoût lié au transport des échantillons.

La contribution demandée au titre du PHRC Interrégional correspondrait au surcoût lié à l’emploi de 0,5 équivalent plein temps d’ARC pendant la durée de l’étude (en vue d’assurer la logistique de l’étude, le recueil et l’analyse des données) et aux déplacements de celui-ci dans les centres et à la prise en charge de 50% du surcoût lié au transport des échantillons

Ne sont pas prévus dans la prise en charge : les surcoûts liés à la gestion des prélèvements et à l’isolement viral pour les centres investigateurs.

Le CHU de LIMOGES, promoteur de l’étude, signe, avec chaque centre associé, une

convention hospitalière récapitulant les surcoûts engendrés par ces centres, avant toute mise en place et démarrage de l’étude.

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44

XIII- ANNEXES :

Annexe 1 : Notice d’information

RESISTANCE DU CYTOMEGALOVIRUS AUX ANTIVIRAUX APRES TRANSPLANTATION D’ORGANE ET GREFFE DE MOELLE, A L’ERE DE LA

PROPHYLAXIE : Mise en place d’un Observatoire National en partenariat avec le Centre

National de Référence du cytomégalovirus Investigateur principal : Dr S ALAIN

Madame, Monsieur, Suite à une greffe, les patients peuvent développer une infection virale appelée cytomégalovirus (CMV). Ce virus peut engendrer des complications graves voire mortelles chez l’enfant et l’adulte transplantés. Le CMV profite d’une diminution immunitaire du patient pour agir même 6 mois après la greffe. Après transplantation, l’infection augmente le risque de dysfonctionnement du greffon, et de rejet ; elle favorise les infections opportunistes bactérienne et fungiques qui peuvent atteindre un ou plusieurs organes, entraînant une réplication persistante du virus, à l’origine de complications propres à cette infection (fièvre prolongée, neutropénie, pneumopathie…). Des traitements antiviraux appropriés peuvent être administrés pour en prévenir les conséquences cliniques défavorables. Ils sont peu nombreux : le Ganciclovir, le Valaciclovir, le Foscarnet et le Cidofovir. Leur utilisation n’est pas sans conséquence pour la santé du patient car elles présentent des effets secondaires importants en particulier au niveau rénal et hématologique. Ce processus limite leur utilisation et peut nécessiter des traitements à dose réduite tant que l’immunosuppression persiste (donc souvent sur une longue durée) favorisant l’émergence de souches résistantes qui échappe progressivement à tout traitement. On observe alors une absence d’amélioration des symptômes malgré un traitement bien suivi. Il convient dans ce cas de rechercher une résistance au traitement. L’intérêt de l’étude que nous vous proposons réside dans la détection de ces résistances pour permettre une meilleure adaptation du traitement de l’infection à cytomégalovirus. La gravité à CMV chez les personnes immunodéprimées a justifié la mise en place d’un Centre National de Référence (CNR) dédié à ce virus. Ce CNR à travers un Observatoire National est chargé d’assurer une surveillance efficace de l’incidence des résistances, de transmettre ces données régulièrement à vos médecins pour qu’ils adaptent au mieux les traitements. Les résistances sont détectées par l’étude de la séquence de gènes viraux à la recherche de mutations. Cette étude est effectuée sur le virus retrouvé dans le sang circulant ou dans les urines.

Nous vous proposons d’entrer dans la cohorte de surveillance des souches de CMV aux antiviraux. Votre traitement sera déterminé selon les habitudes de votre équipe soignante : il sera adapté si nécessaire en fonction des résultats des prélèvements.

La participation à cette étude ne modifie pas votre prise en charge habituelle. Elle vous permet de bénéficier d’une surveillance régulière de la résistance aux antiviraux en cas de

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résistance au CMV. Il vous sera simplement demandé, lors de vos consultations de surveillance, en cas d’infection à CMV :

un prélèvement de sang supplémentaire : 3 tubes de 7ml. un prélèvement d’urine supplémentaire. un prélèvement de salive supplémentaire : 1 à 2 ml.

La résistance sera recherchée sur le virus dans le sang et dans les urines. Les résultats rendus pourront être utilisés pour adapter votre traitement antiviral, si cela paraît justifié. La durée de surveillance minimum sera de 18 mois après la greffe. Les données anonymisées seront conservées dans un fichier à visée nationale. Participer à cette étude de cohorte ne vous empêche pas de participer à une autre étude. Cette étude est réalisée sous la conduite du Dr ….., le CHU de Limoges en étant le promoteur. Vous pouvez refuser de participer et retirer votre participation sans encourir aucune responsabilité et sans que la qualité des soins qui vous sont prodigués n’en soient affectés. Toutes les données collectées au cours de cette étude feront l’objet d’un traitement informatisé.

Ces données demeureront strictement confidentielles, conformément à la loi « Informatique et Liberté ». Si des résultats de cette étude devaient être présentés dans des communications et / ou des publications scientifiques ou médicales, l’identité des participants n’apparaîtrait d’aucune façon. Vous bénéficiez, en outre, d’un droit d’accès et de rectification aux données vous concernant (article 40) ; celui-ci s’exerçant à tout moment auprès du médecin de votre choix. Vous pouvez demander à être informé des résultats globaux de l’étude.

Conformément à la loi, une assurance a été souscrite, garantissant la responsabilité civile du CHU de LIMOGES.

Ce projet a été soumis au Comité de Protection des Personnes du Limousin qui a émis un avis favorable en date du ………………...

Afin de mettre en œuvre cette étude, la Direction Générale de la Santé a donné son autorisation en date du ……………………

La société Roche participe également à cette étude.

46

Annexe 2 : Formulaire de consentement pour adulte

Je soussigné (e), Mme, Mlle, Mr ( Rayer la mention inutile ) :

Nom :…………………………..Prénom :……………………………………………………

Date de naissance :…………….Adresse :……………………………………………………..

……………………………………………………………………………….………………...

déclare avoir pris connaissance de la notice d’information et avoir bien compris les bénéfices, risques et déroulement de l’étude qui m’ont été précisés par le Pr, Dr ………………….. concernant l’étude ci-dessous mentionnée et à laquelle j’accepte de participer.

Résistance du cytomégalovirus aux antiviraux après transplantation d’organe et greffe de moelle, à l’ère de la prophylaxie : Mise en place d’un Observatoire National en

partenariat avec le Centre national de Référence du Cytomégalovirus. Il m’a été précisé que je suis libre d’accepter ou de refuser de participer à cette recherche, sans que cela ne modifie ma prise en charge médicale. Je pourrai, à tout moment, si je le désire, interrompre ma participation en le signalant au médecin chargé de cette étude, sans encourir la moindre responsabilité et sans aucun préjudice pour la qualité des soins qui me seront prodigués. Mon consentement ne décharge pas les responsables de la recherche de leurs responsabilités. Je conserve tous mes droits garantis par la loi. Pour tout complément d’information ou pour signaler la survenue d’un événement éventuellement indésirable, je peux contacter le médecin chargé de l’étude. Cette étude a reçu un avis favorable du Comité Consultatif de Protection des Personnes se prêtant à la Recherche Biomédicale du Limousin (CCPPRB) en date du |__|__| |__|__| |__|__| Le promoteur de l’étude, c’est-à-dire le CHU de Limoges, a souscrit une assurance spécifique pour cette recherche. J’accepte que les données collectées au cours de cette étude fassent l’objet d’un traitement informatisé par le CHU de Limoges. Les données qui me concernent resteront strictement confidentielles. Je n’autorise leur consultation que par des personnes qui collaborent à la recherche ou qui sont mandatées par le C.H.U. de Limoges et éventuellement par un représentant des autorités de santé ; toutes ces personnes étant soumises au secret professionnel.

J’ai bien noté que mon droit d’accès et de rectification prévu par la loi « Informatique et Libertés » (article 40) s’exerce à tout moment auprès du médecin de mon choix. J’ai reçu copie du présent document, ai été informé (e) qu’une copie serait conservée par l’investigateur, une autre dans le dossier médical et une autre par le CHU de Limoges et j’y consens. L’investigateur Le(La) patient(e)(Médecin chargé de l’étude) Fait à………………….. Fait à…………………….. Le |__|__| |__|__| |__|__| Le |__|__| |__|__| |__|__| Pr, Dr : Signature de l’investigateur Signature du (de la) patient (e)

47

Formulaire de consentement pour mineur

Nous, soussignés, Madame ………………………………………..…………………….et Monsieur……………………………………………….….déclarons avoir pris connaissance de la notice d’information et avoir bien compris les bénéfices, risques et déroulement de l’étude qui nous ont été précisés par le Pr, Dr ……………………………………….. concernant l’étude intitulée :

Résistance du cytomégalovirus aux antiviraux après transplantation d’organe et greffe de moelle, à l’ère de la prophylaxie : Mise en place d’un Observatoire National en partenariat avec le

Centre national de Référence du Cytomégalovirus.

et à laquelle nous acceptons la participation de notre enfant : Nom :……………………………………………Prénom :……………………………………..……… Date de naissance :………………………………Adresse……………………………….…..………… ……………………………………………………………………………………………….…………... Ce consentement devra être éventuellement confirmé à la majorité du (de la) mineur(e) le |__|__| |__|__| |__|__|. Notre enfant a été informé et ne s’oppose pas à participer à la recherche. Il nous a été précisé que nous sommes libres d’accepter ou de refuser la participation de notre enfant à cette recherche, sans que cela ne modifie sa prise en charge médicale. Nous pourrons, à tout moment, si nous le désirons, interrompre sa participation en le signalant au médecin chargé de cette étude, sans encourir la moindre responsabilité et sans aucun préjudice pour la qualité des soins qui lui seront prodigués. Notre consentement ne décharge pas les responsables de la recherche de leurs responsabilités. Nous conservons tous nos droits garantis par la loi.

Pour tout complément d’information ou pour signaler la survenue d’un événement éventuellement indésirable, nous pouvons contacter le médecin chargé de l’étude. Cette étude a reçu un avis favorable du Comité Consultatif de Protection des Personnes se prêtant à la Recherche Biomédicale du Limousin (CCPPRB) en date du |__|__| |__|__| |__|__| Le promoteur de l’étude, c’est-à-dire le CHU de Limoges, a souscrit une assurance spécifique pour cette recherche. Nous acceptons que les données collectées au cours de cette étude fassent l’objet d’un traitement informatisé par le CHU de Limoges. Les données qui concernent notre enfant resteront strictement confidentielles. Nous n’autorisons leur consultation que par des personnes qui collaborent à la recherche ou qui sont mandatées par le C.H.U. de Limoges et éventuellement par un représentant des autorités de santé ; toutes ces personnes étant soumises au secret professionnel.

Nous avons bien noté que notre droit d’accès et de rectification prévu par la loi « Informatique et Libertés » (article 40) s’exerce à tout moment auprès du médecin de notre choix. Nous avons reçu copie du présent document, avons été informés qu’une copie serait conservée par l’investigateur, une autre dans le dossier médical et une autre par le CHU de Limoges et nous y consentons. L’investigateur Le (La) patient(e) mineur(e) Les 2 titulaires de (Médecin chargé de l’étude) (le consentement du mineur doit être recherché l’autorité parentale

lorsqu’il est apte à exprimer sa volonté) Fait à……………. Fait à………………… Fait à……………… Le |__|__| |__|__| |__|__| Le |__|__| |__|__| |__|__| Le |__|__| |__|__| |__|__| Pr, Dr :……………………… Signature Signature du (de la) patient(e) Signature des 2 titulaires de l’investigateur de l’autorité parentale

48

Formulaire de consentement pour personne de confiance

Je soussigné (e), Mme, Mlle, Mr (Rayer la mention inutile) :

Nom :………………………………………..Prénom :……………………………………………...

déclare avoir pris connaissance de la notice d’information et avoir bien compris les bénéfices, risques et déroulement de l’étude qui m’a été précisé par le Pr, Dr ……………………. concernant l’étude intitulée :

Résistance du cytomégalovirus aux antiviraux après transplantation d’organe et greffe de moelle, à l’ère de la prophylaxie : Mise en place d’un Observatoire National en partenariat avec le

Centre national de Référence du Cytomégalovirus.

et à laquelle j’accepte la participation du (de la ) patient(e) :

Nom :……………………………………………Prénom :…………………..………………………

Date de naissance :………………………………Adresse……………………………………………

………………………………………………………………………………………………….……..

Je représente cette personne en qualité de ( lien de parenté ou mention « personne de confiance ») : ………………………………………………………….…………………………………………….. Il m’a été précisé que je suis libre d’accepter ou de refuser la participation, à cette étude, de la personne que je représente, sans que cela ne modifie sa prise en charge médicale. Nous pourrons à tout moment, si nous le désirons, interrompre cette participation, en le signalant au médecin chargé de cette étude, sans encourir la moindre responsabilité et sans aucun préjudice pour la qualité des soins qui seront prodigués au (à la) patient(e). Notre consentement ne décharge pas les responsables de la recherche de leurs responsabilités. Nous conservons tous nos droits garantis par la loi.

Pour tout complément d’information ou pour signaler la survenue d’un événement éventuellement indésirable, nous pouvons contacter le médecin chargé de l’étude.

Cette étude a reçu un avis favorable du Comité Consultatif de Protection des Personnes se prêtant à la Recherche Biomédicale du Limousin (CCPPRB) en date du |__|__| |__|__| |__|__| Le promoteur de l’étude, c’est-à-dire le CHU de Limoges, a souscrit une assurance spécifique pour cette recherche.

Nous acceptons que les données collectées au cours de cette étude fassent l’objet d’un traitement informatisé par le CHU de Limoges. Ces données resteront strictement confidentielles. Nous n’autorisons leur consultation que par des personnes qui collaborent à la recherche ou qui sont mandatées par le C.H.U. de Limoges et éventuellement par un représentant des autorités de santé ; toutes ces personnes étant soumises au secret professionnel.

Nous avons bien noté que notre droit d’accès et de rectification prévu par la loi « Informatique et Libertés » (article 40) s’exerce à tout moment auprès du médecin de notre choix.

Nous avons reçu copie du présent document, avons été informés qu’une copie serait conservée par l’investigateur, une autre dans le dossier médical et une autre par le CHU de Limoges et nous y consentons.

L’investigateur Le (La) patient(e) Le parent ou la personne (Médecin chargé de l’étude) (le consentement du patient doit être recherché de confiance

dès qu’il sera apte à exprimer sa volonté) Fait à…………………. Fait à………………… Fait à……………….. Le |__|__| |__|__| |__|__| Le |__|__| |__|__| |__|__| Le |__|__| |__|__| |__|__| Pr, Dr :……………………… Signature de l’investigateur Signature du (de la) patient(e) Signature du parent ou de la personne de confiance

49

Annexe 3 : Formulaire de déclaration d’EIG pour étude hors médicament

FICHE D’OBSERVATION D’UN EVENEMENT INDESIRABLE GRAVE

SUSCEPTIBLE D’ETRE DU A UNE RECHERCHE BIOMEDICALE

CENTRE HOSPITALIER UNIVERSITAIRE DE LIMOGES

2 Avenue Martin Luther King 87042 LIMOGES Cedex

Cette fiche doit être retournée dûment complétée à la D.R.R.C. par fax au 05.55.05.66.96 L’original doit être conservé dans le cahier d’observation. Titre de l’essai : Résistance du cytomégalovirus aux antiviraux après transplantation d’organe et greffe de moelle, à l’ère de la prophylaxie : Mise en place d’un Observatoire National en partenariat avec le Centre national de Référence du Cytomégalovirus Investigateur principal : Dr Sophie Alain Nom et adresse du centre investigateur principal : Service de Virologie– CHU de LIMOGES – 2 Avenue Martin Luther King – 87042 LIMOGES Cedex

Identification du patient Evénement indésirable graveNom : |__|__|__| Prénom : |__|__|__| Décès Patient N° : |__|__|__| Mise en jeu du pronostic vital Date de Naissance : |__|__|__||__|__|__| Nécessite ou prolonge l’hospitalisation Lieu de Naissance : _______________________ Séquelles durables Age ( an ) : |__|__| Evolution cancéreuse Poids ( kg ) : |__|__|__| Anomalie congénitale Sexe ( M/F ) : |__| Surdosage Antécédents ( Allergie, insuffisance rénale, …) : ___________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

• Description de l’événement indésirable : Date de survenue : |__|__| jj |__|__| mm |__|__| aa et heure de survenue : |__|__| hh |__|__| min Description : ________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________ Délai de survenue : __________________________________________________________

• Si médicaments associés ( à l’exclusion de ceux utilisés pour traiter l’événement ) :

Nom Commercial ou DCI

Voie Dose / 24 h et unités

Date de début Date de fin ( si arrêt ) ou sinon en cours

Indication

|__|__||__|__||__|__| |__|__||__|__||__|__|

|__|__||__|__||__|__| |__|__||__|__||__|__|

|__|__||__|__||__|__| |__|__||__|__||__|__|

|__|__||__|__||__|__| |__|__||__|__||__|__|

|__|__||__|__||__|__| |__|__||__|__||__|__|

50

Initiales du patient |__|__|__| |__|__|__| Numéro du patient |__|__|

• Si dispositif médical associé : Modèle / type / référence : ____________________________________________________ Nom du fabricant : __________________________ du fournisseur : ___________________ N° de série ou de lot : ________________ Date de péremption si stérile : |__|__||__|__||__|__|

• Evolution ( indiquez si des mesures symptomatiques ont été prises ) : ___________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________ Date de disparition : |__|__| jj |__|__| mm |__|__| aa et heure de disparition : |__|__| hh |__|__| min

• Autres étiologies envisagées, examens complémentaires réalisés et résultats : ___________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

• Selon l’investigateur, l’événement indésirable semble plutôt lié :

A un problème d’utilisation d’un matériel Aux procédures de l’étude A un problème technologique A la progression de la maladie A un médicament administré Autre préciser :_______________________ A une maladie intercurrente ____________________________________

Date : |__|__| jj |__|__| mm |__|__| aa Nom : _____________________________ Signature de l’investigateur :

NE RIEN INSCRIRE DANS CES CADRES ( RESERVES AU PROMOTEUR )

Numéro d’identification de l’événement : |__|__|__| Date de réception par le promoteur : |__|__| jj |__|__| mm |__|__| aa Date de ce rapport : |__|__| jj |__|__| mm |__|__| aa Initial Suivi N ° |__|__|

• Selon le promoteur, l’événement indésirable semble plutôt lié : A un problème technologique ( matériel ) Aux procédures de l’étude A un médicament administré A la progression de la maladie A une maladie intercurrente Autre préciser :______________________

• Selon le promoteur, l’événement semble plutôt lié au protocole : L’événement indésirable est attendu L’événement indésirable est inattendu

• Commentaires du promoteur : ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Nom et qualité du représentant du promoteur : _________________________________________

Signature :

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Annexe 4: Synopsis en anglais ENREGISTREMENT D’UN PROJET SUR LA BASE CLINICALTRIALS.GOV L’investigateur doit fournir les éléments suivants en anglais : Titre court de l’étude : Prospective multicentric study of cytomegalovirus resistance in

transplant patients and bone marrow recipients.

Titre entier de l’étude : Cytomegalovirus resistance in transplant patients and bone marrow

recipients in the prophylaxis era, a French multicentric cohort study.

Bref résumé …Our aim is to determine the incidence of cytomegalovirus resistance to

antivirals in a cohort study. The patients are included at their first CMV active infection and

are followed during two years thereafter. When criteria for suspected resistance are meet,

blood and urine samples are collected for virus isolation and further resistance phenotype, and

for resistance genotype determination. Resullts are compared with baseline samples. Clinical

informations such as treatment, immunosuppressive regimen and clinical evolution will be

collected. Through this study, we aim to organize a national network for the detection and

identification of CMV resistant strains that will be useful when new therapeutics will be

available.

Description des examens et analyses effectués :

Virus isolation from urine, blood, or any suitable sample in case of CMV disease

Resistance phenotype to antivirals UL97 and UL54 genes sequencing from blood, urines or

any suitable samples for resistance mutations detection and polymorphism study.

Critère de jugement principal : Resistance incidence in our patients with subgroup analysis,

by organ and by the use of prophylaxis or preemptive treatment.

Critères de jugement secondaires

Strain diversity in baseline isolates and in resistant isolates

Frequency of known resistance mutations

Identification of new resistance-related mutations

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Conditions de recrutement : Patient coming to an French transplantation center for solid

organ or bone marrow transplant, with informatient and signed consent.

5 Mots - clés : cytomegalovirus, resistance, transplantation,

Critères d’inclusion : Allogeneic bone marrow transplant recipient or solid organ transplant

recipient, included in the cohort at the time of its firs active CMV infection (ie biological

signs of CMV replication (viremia, ADN or ARN aemia, Antigenaemiapp65….) with or

without fever, or clinical end organ disease symptoms.

Critères d’exclusion : Patient without medical care policy, patient that did not signed the

médical consent.

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Annexe 5 : Curriculum vitae des investigateurs Nom : Docteur Sophie ALAIN-ALBERTINI Fonctions : Maître de Conférence des Universités – Praticien hospitalier en Virologie Titres : Docteur en Médecine

Doctorat d’Université, option Microbiologie, université Paris 11 Habilitation à diriger les recherches en Virologie DES de Biologie spécialisée

Organisme : Centre Hospitalier Universitaire - LIMOGES

Université de Limoges Affiliation : INSERM CNRS Autres : Equipe accueil EA 3175 Adresse : Service de Bactériologie – Virologie - Hygiène Laboratoire de Virologie C.H.U. de LIMOGES - Hôpital Dupuytren 2, avenue Martin Luther King 87042 LIMOGES Cedex Téléphone : 05 55 05 67 24 Télécopie : 05 55 05 67 22 Email : sophie.alain@unilim.fr

Principales publications : (cinq références + copie de la première page) ALAIN S, HANTZ S, SCIEUX C, KARRAS A, MAZERON M.C, SZELAG J.C., IMBERT B.M., FILLET A.M., GOUARIN S, MENGELLE C, DE WILDE, COGNE N, CHAMPIER G, ROGEZ S, LEGENDRE C, DENIS F. – Detection of ganciclovir-resistant cytomegalovirus strains after valaciclovir-prophylaxis in renal transplant recipients. J Med Virol,2004,73(4): 566-73 FILLET AM, AURAY L, ALAIN S, GOURLAIN K, BM IMBERT, NAJIOULLAH F, CHAMPIER G, GOUARIN S, CARQUIN J, HOUHOU N, GARRIGUE I, DUCANCELLE A, THOUVENOT D, MAZERON MC. Natural polymorphism of cytomegalovirus DNA polymerase lies in two non-conserved regions spanning between domains delta-C and II and between domains III and I. Antimicrobial Agents Chemother. 2004,48 : 1865-8. DUCANCELLE A, BELLOC S, ALAIN S, SCIEUX C, PETIT F, SANSON LE PORS MJ, MAZERON MC. Comparison of sequential cytomegalovirus isolates in a patient with lymphoma failing antiviral therapy. J Clin Virol, 2004,29 :241-247. HANTZ S, MICHEL D, FILLET AM, GUIGONIS V, CHAMPIER G, MAZERON MC, BENSMAN A, DENIS F, MERTENS T, DEHEE A, ALAIN S. Early selection of a new UL97 mutant with severe defect of ganciclovir phosphorylation after valaciclovir prophylaxis and short-term ganciclovir therapy in a renal transplant recipient. Antimicrob. Agents Chemother, 2005, 49 : 1580-1583. ALAIN S, DUCANCELLE A., DE SAUSSURE P., BOUHNIK Y., LAVERGNE A., SANSON-LE PORS M.J., MAZERON M.C. Cytomegalovirus in patients with active inflammatory bowel disease. J. Clin. Virol. 2005 ; 33 : 180-182. (*) une fiche à remplir par chaque investigateur mentionné en page 1 de l’annexe 4.

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CURRICULUM VITAE (*) abrégé des investigateurs Nom : Docteur Catherine MENGELLE Fonctions : Praticien Hospitalier Titres : Pharmacien Biologiste Organisme : CHU de TOULOUSE Affiliation : INSERM CNRS Autres Adresse : Service de Virologie CHU de TOULOUSE – Hôpital Purpan Place du Dr BAYLAC – TSA 40031 31059 Toulouse Cedex Téléphone : 05 61 77 21 13 Télécopie : 05 61 77 25 42 Email : mengelle.c@chu-toulouse.fr Principales publications : (cinq références + copie de la première page) Kamar N, Mengelle C, Yahyaoui S, Sandres-Saune K, Durand D, Izopet J, Rostaing L. Follow-up of 28 HCMV seropositive renal-transplant recipients: comparison of clinical, biological and virological parameters in the groups of treated versus untreated infected patients. J Clin Virol. 2005 May ; 33(1) :35-42. Vaessen C, Kamar N, Mehrenberger M, Mazerolles C, Mengelle C, Rischmann P, Rostaing L, Malavaud B. Severe cytomegalovirus ureteritis in a renal allograft recipient with negative CMV monitoring. Nephrol Dial Transplant. 2005 Jan;20(1):227-30. Alain S, Hantz S, Scieux C, Karras A, Mazeron MC, Szelag JC, Imbert BM, Fillet AM, Gouarin S, Mengelle C, De Wilde A, Cogne N, Champier G, Rogez S, Legendre C, Denis F. Detection of ganciclovir resistance after valacyclovir-prophylaxis in renal transplant recipients with active cytomegalovirus infection. J Med Virol. 2004 Aug;73(4):566-73. Bresson JL, Clavequin MC, Mazeron MC, Mengelle C, Scieux C, Segondy M, Houhou N; Federation Francaise des CECOS. Risk of cytomegalovirus transmission by cryopreserved semen: a study of 635 semen samples from 231 donors. Hum Reprod. 2003 Sep;18(9):1881-6. Mengelle C, Sandres-Saune K, Pasquier C, Rostaing L, Mansuy JM, Marty M, Da Silva I, Attal M, Massip P, Izopet J Automated extraction and quantification of human cytomegalovirus DNA in whole blood by real-time PCR assay. J Clin Microbiol. 2003 Aug;41(8):3840-5. (*) une fiche à remplir par chaque investigateur mentionné en page 1 de l’annexe 4.

55

CURRICULUM VITAE (*) abrégé des investigateurs Nom : Docteur Isabelle GARRIGUE Fonctions : Médecin biologiste - Virologue Titres : Praticien Attaché Thèse de Médecine à Bordeaux en Novembre 1994 Organisme : Centre Hospitalier Universitaire de Bordeaux Affiliation : INSERM CNRS Autres (préciser) Adresse : Laboratoire de Virologie – CHU Pellegrin Tripode – 1er étage Place Amélie Raba-Léon 33076 BORDEAUX Cedex Téléphone : 05 56 79 55 10 Télécopie : 05 56 79 56 73 E-mail : isabelle.garrigue@chu-bordeaux.fr Principales publications : (cinq références + copie de la première page) Garrigue I, Boucher S, Couzi L, Caumont A, Dromer C, Neau-Cransac M, Tabrizi R, Schrive MH, Fleury H, Lafon ME. Whole blood real-time quantitative PCR for cytomegalovirus infection follow-up in transplant recipients. J Clin Virol. 2006 Feb 13 (sous presse) Garrigue I, Pellegrin I, Hoen B, Dumon B, Harzic M, Schrive MH, Sereni D, Fleury H. Cell-associated HIV-1-DNA quantitation after highly active antiretroviral therapy-treated primary infection in patients with persistently undetectable plasma HIV-1 RNA. AIDS. 2000 Dec 22;14(18):2851-5. Pellegrin I, Garrigue I, Ekouevi D, Couzi L, Merville P, Merel P, Chene G, Schrive MH, Trimoulet P, Lafon ME, Fleury H. New molecular assays to predict occurrence of cytomegalovirus disease in renal transplant recipients. J Infect Dis. 2000 Jul;182(1):36-42. Pellegrin I, Garrigue I, Binquet C, Chene G, Neau D, Bonot P, Bonnet F, Fleury H, Pellegrin JL. Evaluation of new quantitative assays for diagnosis and monitoring of cytomegalovirus disease in human immunodeficiency virus-positive patients. J Clin Microbiol. 1999 Oct;37(10):3124-32. Devianne-Garrigue I, Pellegrin I, Denisi R, Dupon M, Ragnaud JM, Barbeau P, Breilh D, Leng B, Fleury HJ, Pellegrin JL. Foscarnet decreases HIV-1 plasma load. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 1998 May 1;18(1):46-50. (*) une fiche à remplir par chaque investigateur mentionné en page 1 de l’annexe 4.

56

CURRICULUM VITAE (*) abrégé des investigateurs Nom : Professeur Yann LE MEUR Fonctions : Praticien hospitalier service de Néphrologie Titres : Professeur des universités - praticien hospitalier Organisme : Centre Hospitalier Universitaire, Limoges Affiliation : INSERM CNRS Autres Adresse : CHU de Limoges Hôpital Dupuytren 2 Avenue Martin Luther King 87042 Limoges Cedex Téléphone : 05 55 05 64 51 Télécopie : 05 55 05 64 52 Email : Yann.Lemeur@chu-limoges.fr Principales publications : (cinq références + copie de la première page) Le Meur Y, Jose M, Wei M, Atkins R, Chadban S. M-CSF expression and macrophage accumulation in renal allograft rejection. Transplantation, 2002, 73:1318-1324. Le Meur Y, Tesch G, Mu W, Hill P, Nikolic-Paterson D, Atkins RC.Macrophage accumulation at a site of renal inflammation is dependent of local macrophage proliferation via the M-CSF/c-fms pathway. J Leuk Biol, 2002, 72:530-537. Jose MD, Le Meur Y, Atkins RC, Chadban SJ. Blockade of macrophage colony-stimulating factor reduces macrophage proliferation and accumulation in renal allograft rejection. Am J Transplant. 2003;3(3):294-300. Arrondel C, Deschenes G, Le Meur Y, Viau A, Cordonnier C, Fournier A, Amadeo S, Gubler MC, Antignac C, Heidet L. A large tandem duplication within the COL4A5 gene is responsible for the high prevalence of Alport syndrome in French Polynesia.Kidney Int. 2004;65(6):2030-40. Le Meur Y, Leprivey-Lorgeot V, Mons S, Jose M, Dantal J, Lemauff B, Aldigier JC, Leroux-Robert C, Praloran V. Serum levels of macrophage-colony stimulating factor (M-CSF): a marker of kidney allograft rejection.Nephrol Dial Transplant. 2004 Jul;19(7):1862-5 Prémaud A, Le Meur Y, Debord J, Szelag JC, Rousseau A, Hoizey G, Toupance O, Marquet P. Maximum A Posteriori Bayesian Estimation of Mycophenolic Acid Pharmacokinetics in Renal Transplant Recipients at Different Postgrafting Periods. Ther Drug Monit. 2005;27(3):354-361. (*) une fiche à remplir par chaque investigateur mentionné en page 1 de l’annexe 4.

57

CURRICULUM VITAE (*) abrégé des investigateurs Nom : Docteur Marie-Christine MAZERON Fonctions : MCU-PH Titres : Doctorat en médecine, Doctorat de 3ème cycle, habilitation à diriger des recherches Organisme : AP-HP, Université Paris 7 Affiliation : INSERM CNRS Autres Adresse : Service de Bactériologie-Virologie Hôpital Lariboisière 2, rue Ambroise Paré 75475 Paris cedex 10 Téléphone : 0149956547 Télécopie : 0149958537 Email : marie-christine.mazeron@lrb.ap-hop-paris.fr Principales publications : (cinq références + copie de la première page)

MAZERON MC, FILLET AM, SALMON D, BOUKLI N, HOUHOU N, SÉNÉCHAL B, MATHERON S, GOZLAN J, LEPORT C, KATLAMA C, SCIEUX C, IMBERT BM, DENY P, BOUR JB, FREYMUTH F, CHAPUT S, COSTAGLIOLA D.

Quantitative markers for cytomegalovirus disease in HIV infected–patients receiving highly active antiretroviral therapy. AIDS. 2003. 17: 784-786.

FILLET AM, AURAY L, ALAIN S, GOURLAIN K, IMBERT BM, NAJIOULLAH F, CHAMPIER G, GOUARIN S, CARQUIN J, HOUHOU N, GARRIGUE I, DUCANCELLE A, THOUVENOT D, MAZERON MC.

Natural polymorphism of cytomegalovirus DNA polymerase lies in two non-conserved regions spanning between domains delta-C and II and between domains III and I. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2004, 48 :1865-1868.

DUCANCELLE A, BELLOC S, ALAIN S, SCIEUX C, PETIT F, SANSON LE PORS MJ, MAZERON MC. Comparison of sequential cytomegalovirus isolates in a patient with lymphoma failing antiviral therapy. J Clin Virol, 2004,29 :241-247.

GOURLAIN K, SALMON D, GAULT E, LEPORT C, KATLAMA C, MATHERON S, COSTAGLIOLA D, MAZERON MC, FILLET AM and the Predivir study group. Quantifitation of cytomegalovirus (CMV) DNA by real-time PCR for occurrence of CMV disease in HIV-infected patients receiving highlyactive antiretroviral therapy (Predivir study). J Med Virol. 2003.69:401-7. DUCANCELLE A, GRAVISSE J, ALAIN S, FILLET AM, PETIT F, SANSON LE PORS MJ, MAZERON MC. Phenotypic characterization of cytomegalovirus DNA polymerase: a tool to study cytomegalovirus isolates resistant to foscarnet. J Virol Meth 2005. 125 : 145-51 (*) une fiche à remplir par chaque investigateur mentionné en page 1 de l’annexe 4.

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CURRICULUM VITAE (*) abrégé des investigateurs Nom : Professeur François DENIS Fonctions : Professeur des Universités - Praticien hospitalier,

Chef de service du Laboratoire de Bactériologie – Virologie - Hygiène Titres : Docteur en Médecine et Docteur d’Etat Es Sciences Membre de la Commission Médicale d’Etablissement, du Conseil d’administration Président de la Commission de Biologie Membre du Conseil Scientifique de l’université Organisme : Centre Hospitalier Universitaire, Limoges Affiliation : INSERM CNRS Autres : Equipe accueil EA 3175 Adresse : Service de Bactériologie – Virologie – Hygiène CHU de Limoges Hôpital Dupuytren 2 Avenue Martin Luther King 87042 Limoges Cedex Téléphone : 05 55 05 61 66 Télécopie : 05 55 05 67 22 Email : fdenis@unilim.fr Principales publications : (cinq références + copie de la première page) ALAIN S, HANTZ S, SCIEUX C, KARRAS A, MAZERON M.C, SZELAG J.C., IMBERT B.M., FILLET A.M., GOUARIN S, MENGELLE C, DE WILDE, COGNE N, CHAMPIER G, ROGEZ S, LEGENDRE C, DENIS F. Detection of ganciclovir-resistant cytomegalovirus strains after valaciclovir-prophylaxis in renal transplant recipients. J. Med Virol., 2004. ROBERT PY, ADENIS JP, DENIS F, ALAIN S, RANGER-ROGEZ S. Herpes simplex virus DNA in corneal transplants : prospective study of 38 recipients. J Med Virol. 2003 ; 71 (1) : 69-74. COLLOT S, PETIT B, BORDESSOULE D, ALAIN S, TOUATI M, DENIS F, RANGER-ROGEZ S. Real-time PCR for quantification of HHV-6 DNA from lymph nodes and saliva. J. Clin. Microbiol., 2002 ; 40 : 2445-2451. GOUARIN S, PALMER P, COINTE D, ROGEZ S, VABRET A, ROZNBERG F, DENIS F, FREYMUTH F, LEBON P, GRANGEOT-KEROS L Congenital cytomegalovirus infection : a collaborative and comparative study of virus detection in amniotic fluid by culture and by PCR. J. Clin. Virol., 2001, 21 :47-55 HANTZ, S, MICHEL D, FILLET AM, GUIGONIS V, CHAMPIER G, MAZERON MC, BENSMAN A, DENIS F, MERTENS T, DEHEE A, ALAIN S. Early selection of a new UL97 mutant with severe defect of ganciclovir phosphorylation after valaciclovir prophylaxis and short-term ganciclovir therapy in a renal transplant recipient. Antimicrob. Agents Chemother. 49 : 1580-1583. (*) une fiche à remplir par chaque investigateur mentionné en page 1 de l’annexe 4.

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Annexe 6 : Evaluation budgétaire Le budget nécessaire pour le protocole inclut : I Les frais de techniciens et de réactifs pour les recherches de résistance : à la charge du Centre national de référence 0,25 Equivalent temps plein par centre de référence soit : Budget nécessaire pour les recherches de résistance sur les prélèvements initiaux et sur les prélèvements correspondant à une résistance clinique : Nombre de greffes 4816 en 2004 d’après le registre des greffes : Nombre d’infections actives à CMV attendues : de 10% à 30% selon les types de greffe (organe ou moelle et le traitement : prophylaxie ou anticipé) Soit : de 481 à 1443 infections actives à CMV attendues par an, donc 962 à 2886 infections actives sur 2 ans Résistance clinique : Inclut les résistances avérées, mais aussi les rechutes et les résistances cliniques liées à des causes pharmacologiques ou à l’immunosuppression. Elle est estimée arbitrairement à 10% soit 96 à 288 recherches de résistance au maximum sur deux ans. Nous avons donc estimé le budget pour 95 recherches de résistance par an Budget des recherches de résistance : Génotypages (UL54 et UL97)

95/an 60 euros 5 700 euros 22 800 euros

Phénotypes 95/an 50 euros 4 750 euros 19 000 euros II Les frais de logistique, recueil de données et d’échantillons, gestion des souchothèques et biothèques, gestion des données, visites de mise en place et de recueil des données manquantes, à la charge du PHRC, soit : 0,5% Equivalent temps plein d’ARC basé à Limoges pendant trois ans : 15 653 euros par an Mise en place et suivi des centres par vidéo conférence : 473 euros par an Transports : un déplacement de l’ARC par centre (voir Tableau) pour recueil final des données : 3694 euros par an Transport des échantillons : Transport des échantillons à –30°C (Devis TSE) Plus DOM-TOMs Total

95/an

50,04 euros TTC 3954 euros

4 753.8 euros

14 111euros 3954 euros 18065 euros

Les frais de transport des échantillons à température ambiante seront financés par le CNR.

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Frais de Biostatistique : L’Unité de Recherche Clinique et de Biostatistique du CHU de Limoges sera responsable de l’analyse statistique : 5234 Euros Total du financement demandé au titre du PHRC : 89 381 Euros III Les frais inhérents aux dosages d’antiviraux et aux études épidémiologiques Financés dans le cadre de la contribution des laboratoires Glaxo-Smith Kline à l’Observatoire de la Résistance pour un montant de 5 000 euros et pour le reste par le budget de notre équipe d’accueil EA 3175 Université de Limoges.

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Annexe 7 : Procédure de constitution des biothèques I - Prélèvements :

3 tubes de 7 ml de sang, correctement remplis, et acheminés immédiatement (dans les deux heures) au laboratoire de virologie, à température ambiante :

Un tube hépariné pour mise en culture à partir des leucocytes Un tube sur EDTA pour collecte du sang total (génotypage viral) Un tube sur EDTA pour collecte du plasma (dosage antiviraux)

1 à 2 ml de salive dans 2 ml de milieu de transport pour virus (prélevée en faisant saliver et cracher le patient) et acheminées rapidement dans la glace au laboratoire pour la mise en culture du virus.

20 ml d’urines diluées au demi (10 ml + 10 ml) en milieu de transport pour virus et acheminées rapidement dans la glace au laboratoire pour la mise en culture du virus à partir des urines. II - Mode opératoire A - BIOTHEQUE Au laboratoire de virologie du centre investigateur : Matériel nécessaire : tubes en polypropylène stérile type Sarstedt à bouchon à vis de 1,5 ml, congélateur à - 80 °C. Le sang total sur EDTA destiné au génotype de résistance est réparti stérilement dans des tubes en polypropylène stériles à bouchon fileté : au moins 2 aliquotes de 1,1 ml et > 2 aliquotes de 500 µl de sang total. Les tubes sont identifiés avec le code du patient et la date du prélèvement. Le sang total sur EDTA destiné au dosage des antiviraux est centrifugé 20 minutes à 1000 g à température ambiante ou mieux à + 4 °C et le plasma est réparti en aliquotes de 1 ml. Les tubes sont identifiés avec le code du patient et la date du prélèvement. Les urines sont aliquotées sous un volume de 2 ml. Pour les laboratoires qui le peuvent, les urines sont aussi immédiatement mises en culture au laboratoire (voir B, Souchothèque). Tous les aliquotes (sang, plasma, urines) sont immédiatement congelés à - 80°C. B – SOUCHOTHEQUE Une souchothèque est réalisée par les laboratoires investigateurs qui le peuvent, après isolement viral :

- soit à partir des 7 ml de sang total prélevé sur héparine (tubes à bouchon vert), par inoculation du « buffy coat »,

- soit à partir des urines ou d’un autre prélèvement.

Les cellules infectées seront conservées en azote liquide et la souche isolée sera adressée au laboratoire de référence (le labo n’envoie qu’un flacon de culture et conserve des aliquotes de cellules infectées).

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Les laboratoires qui ne pratiquent pas la culture du CMV enverront directement le tube hépariné au laboratoire de référence. NB : LE SOIR OU LE WEEK-END : les tubes héparinés peuvent être conservés à + 4 °C. Ce délai doit rester exceptionnel car il peut compromettre la survie des leucocytes. C- CAHIER DE BIOTHEQUE : Un cahier de biothèque sera fourni, avec les fiches de recueil de données. Dans ce cahier seront relevés l'identification du prélèvement avec la date de prélèvement et le nombre d'aliquotes. Les souches virales isolées seront également portées sur ce cahier, avec le site d’isolement, le nombre de passages et la date d’envoi. D- ENVOIS VERS LE LABORATOIRE CENTRAL DE VIROLOGIE QUAND ? Les aliquotes sont envoyés à chaque fois qu’une recherche de résistance est jugée nécessaire. Si ils sont disponibles, les aliquotes du premier épisode d’infection à CMV et les aliquotes intermédiaires sont adressés en même temps. QUOI ?

Sang total EDTA

2x 1,1 ml + 2x 500 µl

Urines ≥ 1 aliquote de 2 ml en milieu de transport

Autres prélèvements (salive, LBA, biopsie,…)

Souche virale

Flacon de culture rempli

Sang hépariné

Double de Feuille de biothèque

Ordon-nance

Prélèvements systématiques × × × × × Laboratoires qui

pratiquent la culture cellulaire

× × × × × ×

Laboratoires qui ne pratiquent pas

la culture cellulaire

× × × × × ×

TRANSPORT à – 30°C à – 30°C à – 30°C température ambiante

température ambiante

COMMENT ? Appeler TSE la veille du départ (fax pré rempli). Préciser – 30 °C ou température ambiante. Le transporteur fournit les pool box.

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Annexe 8 : Feuilles de renseignement pour déclaration et recherche de résistance

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Annexe 9 : Répartition des centres entre les deux laboratoires de référence

Nombre de greffes en 2004 par organe (rein, coeur, foie, poumon, sang, pancréas)

entre le Nord et le Sud (avec la Bourgogne, la Franche Comté en plus) de la France (agence de la biomédecine)

Nord61%

Sud (+B+FC)39%

REGIONS VILLESCellules du sang

Rein(suivi) Cœur Foie Poumons Pancréas TOTAL

SUD� Aquitaine BORDEAUX 61 80 8 25 13 187

AuvergneCLERMONT FERRAND 24 40 4 15 83

Bourgogne DIJON 43 8 51LA REUNION 28 28

POINT-A-PITRE 16 16Franche-Comté BESANCON 32 40 28 100Languedoc-Roussillon MONTPELLIER 16 105 9 44 174Limousin LIMOGES 52 3 3 58Midi-Pyrénées TOULOUSE 29 87 4 51 171Poitou-Charentes POITIERS 34 53 87

MARSEILLE 77 86 24 36 8 231NICE 21 73 29 123LYON 60 157 36 91 8 7 359

GRENOBLE 24 76 8 15 10 133SAINT ETIENNE 14 58 72

TOTAL 392 994 104 337 39 7 1873

REGIONS VILLESCellulesdu sang

Rein(suivi) Cœur Foie Poumons Pancréas TOTAL

NORD� Alsace STRASBOURG 37 86 9 80 5 1 218Basse-Normandie CAEN 8 41 5 43 97Pays de la Loire ANGERS 10 38 48

NANTES 43 167 24 12 4 250Bretagne BREST 21 46 67

RENNES 22 54 12 104 192Centre TOURS 81 9 90Champagne-Ardenne REIMS 39 39Haute-Normandie ROUEN 22 48 17 87Ile-De-France PARIS 337 563 110 324 88 5 1427Lorraine NANCY 43 106 18 1 168Nord-Pas-De-Calais LILLE 48 104 9 43 204Picardie AMIENS 56 56TOTAL 591 1429 213 594 106 10 2943

Dom-Tom

Provence-AlpesCôte d'Azur

Nombre de greffes par organe en 2004 (Agence de la biomédecine)

Rhone-Alpes

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Annexe 10 : Liste des données recueillies

ETAT CIVIL ET RENSEIGNEMENTS GENERAUX DONNEES GREFFES – Immunosuppression initialeNom (3 premières lettres) : Prénom (2 premières lettres) : Sexe : Date de naissance : Type de transplantation : Indication : Date de transplantation : Incompatibilité(s) A : Incompatibilité(s) B : Incompatibilité(s) DR :

SAL : OKT3 Ac anti CD25 : Stéroïdes : Tacrolimus Ciclosporine A : Sirolimus : MMF : Azathioprine : Autres :

DONNEES CMV – Prophylaxie DONNEES CMV Sérologie donneur : Sérologie receveur : Prophylaxie (oui/non) : Date début : Date arrêt : Valaciclovir : Ganciclovir per os : Ganciclovir IV : Valganciclovir : Autres :

Infection active = Infection à CMV avec marqueurs sanguins de réplication virale (Antigénémie, Virémie, ADNémie) Présentation clinique (préciser : asymptomatique / Syndrome CMV/ Maladie à CMV et détailler les manifestations cliniques) Date : Traitement : Durée traitement : Rechute : Traitement à dose suboptimale : Complications infectieuses associées :

DONNEES GREFFES DONNEES GREFFES Rejets aigus avant infection CMV active ou GvHD Date : Grade histologique rejet aigu : Grade GvHD : Stéroïdes : SAL : Autres :

Rejets aigus avant infection CMV Date : Grade histologique rejet aigu : Grade GvHD : Stéroïdes : SAL : Autres :

SURVEILLANCE VIROLOGIQUE PRELEVEMENTS POUR RECHERCHE DE RESISTANCE ET ETUDE EPIDEMIOLOGIQUE

Patients sans prophylaxie : premier épisode d’infection active puis traitements s’il y a lieu Patients traités par antiviraux : préciser le traitement (dates, molécules utilisées) Préciser les résultats quantitatifs si disponibles, ainsi que la méthode et les unités utilisées Prélèvement : Date : Antigénémie : ADNémie par PCR quantitative : Virémie : Sang total sur EDTA ou culots de leucocytes : Leucocytes (numérer) 90% Sérum veau – 10% glycérol : Souche virale : Urines : Autres :

Recherche de résistance : Phénotype : Génotype UL97 : Génotype UL54 : Profil de restriction : Etude épidémiologique : Glycoprotéine B : Watanabe : Région « a » :

La liste recueillie ci-dessus sera stockée par l’ARC sous le format Excel présenté ci-dessous

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