Reparación y Recombinación de DNA

Metabolismo celular

Exposición Luz UV

Radiación ionizante

Exposición Química

Errores en replicación

Activación Control Ciclo

celular

Activación Programa

transcripcional

Reparación de ADN: ü  Reversión directa ü  Escisión de base ü  Escisión de nucleótido ü  Reparación de error ü  Reparación por Recombinación homóloga

Apoptosis

MUTACIONES EN EL ADN

Mutaciones espontáneas (105 – 108) Mutaciones inducidas (por mutágenos)

Mutaciones puntuales v  Mutaciones “indel”: Adiciones o deleciones de base v  Substitución de base: transición (A→G; G→A) transversión (C→G; C→A; T→G; T→A)

Repercusión a nivel de proteína v  Mutación sinónima v  Mutación de error v  Mutación sin sentido v  Mutación de marco

Conservativa No conservativa

S U S T I T U C I O N

I N D E L

AAA AGA Lys Arg básico básico

AGA AGG Arg Arg

UUU UCU Phe Ser hidrofóbico polar CAG UAG

Gln Stop

Adición de 1 pb (rojo) AAG ACT CCT AAG AGC TCC T… Deleción de 1 pb (rojo) AAG ACT CCT AAA CTC CT…

Alteraciones en el ADN

Depurinaciones por ácido, calor, glicosilasas Alquilación, radiación ionizante, radicales libres Agentes intercalantes, radiación UV

Depurinación y desaminación de citosina

100 al día

5000 al día

Otras Desaminaciones

Citosinas metiladas al desaminarse producen timina

C - G T - A

Los mutágenos externos incrementan la proporción de mutaciones

Agentes mutagénicos físicos: Rayos X Rayos UV Radiaciones α, β y γ

Agentes mutagénicos químicos: gas mostaza algunos pesticidas humo de tabaco sustancias naturales de plantas y microorganismos

Mutágeno Aflatoxina = Depurinación

Introduction to Genetic AnalysisAnthony Griffiths, VIII Ed.

Aspergillus flavus

Agente alquilante Transición de base G-C A-T T-A C-G

Etil Metano Sulfonato (EMS)

Rayos UV = Dímeros de pirimidinas

Exposición a radiaciones ultravioleta

Mecanismos de Reparación de

DNA

Reversión Directa Daño en una sola cadena

Ruptura de la doble cadena

ü  Fotoreactivación ü  Eliminación de CH3

ü  Reparación por escisión de bases (BER)

ü  Reparación por escisión de nucleótidos (NER)

ü  Reparación por desapareamiento (MMR)

ü  Recombinación homóloga

Reversión directa: fotoreactivación

FOTOLIASA Solo se activa por luz visible No está en humano

Reparación por escisión de base (BER)

DNA glicosilasas crean un sitio AP (sin base) AP endonucleasa elimina un fragmento de DNA DNA pol I rellena, ligasa sella

Reparación por escisión de nucleótido (NER)

UvrABC (escinucleasa) Helicasa separa el fragmento DNA pol I rellena, ligasa sella

Reparación por desapareamiento (mismatch repair, MMR)

MutS reconoce desapareamiento MutL y MutH se unen y recorren el DNA hasta un grupo metilo MutH corta la cadena NO metilada (nueva síntesis) Helicasa desenrolla, Exonucleasa degrada el DNA hasta el desapareamiento DNA pol III rellena, ligasa sella

Mecanismos de Recombinación

Conjugación Ciclo lisogénico bacteriófago

1. Recombinación sitio-específica

Recombinación en meiosis Reparación de DNA

3. Recombinación homóloga

Crossing-overChiasmata at meiosis.

Each line represents a chromatid of a pair of synapsed chromosomes

Transposición 2. Recombinación ilegítima

Illegitimate recombinationdoes not require segments of homologous DNA.

(Examples: transposable elements, T-DNA)

T

T

T

1

2

3

T = transposable element

Recombinación Sitio-específica: Integración del plásmido F al cromosoma

o  Se requieren sitios homólogos de recombinación. o  Hay corte ENDOnucleolítico en ambas moléculas de DNA o  Como las dos moléculas de DNA son circulares el resultado

es una sóla molécula con ambos DNA integrados

Elementos transponibles (Transposones)

•  Elementos móviles en el DNA

•  Presentes en plásmidos, virus, bacterias, eucariontes…

•  Contienen secuencias repetidas en los extremos

•  Su movimiento puede producir mutaciones o rearreglos cromosómicos y afectar la expresión de genes.

Secuencias de inserción (IS)

• Cuando los IS aparecen en el medio de los genes, pueden interrumpir la secuencia codificante e inactivar la expresión del gen.

• Fueron descubiertos por primera vez en E.Coli en el operon gal y son los transposones más simples.

• Tienen entre 700 y 1500 pb y se han encontrado en eubacterias y arqueobacterias.

•  También son frecuentes en bacteriófagos y plásmidos

secuencias repetidas e invertidas

transposasa IR IR

Sitio de inserción Se crean repetidas directas externas a la IS

432 Chapter 13 • The Dynamic Genome: Transposable Elements

Tn1

0

IS10

IS10

tetR

IS2

Tn5

Tn4IS1 cmRkanR

IS50 IS50 sm R su R amp R

Tn3

hg RIS1

Resistance-determinant segment

Figure 13-10 A schematic map of a plasmid carrying simple andcomposite transposon-resistance genes. Genes encoding resistance to theantibiotics tetracycline (tetR), kanamycin (kanR), streptomycin (smR),sulfonamide (suR), and ampicillin (ampR) and to mercury (Hg R) areshown. The resistant-determinant segment can move as a cluster ofresistance genes. Tn3 is within Tn4. Each transposon can be transferredindependently. [Simplified from S. N. Cohen and J. A. Shapiro, “TransposableGenetic Elements.” Copyright 1980 by Scientific American, Inc. All rightsreserved.]

complementary strand. In this example, integrationgenerates a five-base-pair duplication, called a target-site duplication. Virtually all transposable elements (inboth prokaryotes and eukaryotes) are flanked by a target-site duplication, indicating that all use a mechanism ofintegration similar to that shown in Figure 13-11. Whatdiffers is the length of the duplication; a particular typeof transposable element in prokaryotes (and in eukary-otes as well) has a characteristic length for its target-site duplication—as small as two base pairs for someelements.

Most transposable elements in prokaryotes (and ineukaryotes) employ one of two mechanisms of transpo-sition, called replicative and conservative (nonreplica-tive), as illustrated in Figure 13-12. In the replicativepathway (as shown for Tn3), a new copy of the trans-posable element is generated in the transposition event.The results of the transposition are that one copy ap-pears at the new site and one copy remains at the oldsite. In the conservative pathway (as shown for Tn10),there is no replication. Instead, the element is excisedfrom the chromosome or plasmid and is integrated intothe new site. The conservative pathway is also called“cut and paste.”

REPLICATIVE TRANSPOSITION Because this mecha-nism is a bit complicated, it will be described here inmore detail. As Figure 13-12 illustrates, one copy of Tn3is produced from an initial single copy, yielding twocopies of Tn3 altogether.

A G G T A A G G T A G

T C C A

AGG TAAGGTAG

Transposable element inserts.

TCCATTCC

AGG

TCCATTCC

ATC

TAAGGTAG

Five-base-pair directrepeat flanks element.

ATC

Host repairs gaps.

T T C C A T

Transposase cutstarget-site DNA.

C

AGGTAAGG

TCCATTCC

TAAGGTAG

ATTCCATC

Figure 13-11 Duplication of a short sequence of DNA at theinsertion site. The recipient DNA is cleaved at staggered sites(a 5-bp staggered cut is shown), leading to the production oftwo copies of the five-base-pair sequence flanking the insertedelement.

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Transposición de una IS

Transposones procariontes

Introduction to Genetic Analysis, 8th Ed.

Transposones eucariontes

Mecanismos de transposición

Lostransposonessonresponsablesdeincrementoseneltamañodelosgenomas

Exposición:05denoviembre20181)  ¿Cómosecontrolanlostransposonesenlosgenomas?2)  ¿Cuálessurelevanciaparalosorganismos?Slotkin & Martienssen, 2007: Nature Review Genetics Vol. 8: 272-285

Recombinación homóloga en Meiosis

Profase I: recombinación

Resultado de la recombinación

Genotipo Parental

Genotipo Recombinante

Genotipo Recombinante

Genotipo Parental

1.  Corte inicial en una de las cadenas del dúplex de ADN.

2.  Desplazamiento de la cadena rota por helicasa y síntesis nueva de ADN

3.  Invasión de la cadena sencilla a un dúplex con secuencia homóloga

4.  Desplazamiento de la cadena correspondiente en el segundo dúplex

5.  Sellado de los cortes iniciales y formación de Unión Holliday

6.  Resolución de la Unión Holliday

Mecanismo I de Recombinación homóloga The Meselson-Raddingheteroduplex model.

a) single stranded nickb) DNA polymerasec) ssDNA displaces its

counterpart in thehomologue

d) displaced ssDNA isdigested

The Meselson-Raddingheteroduplex model.

e) ligation completes theformation of a Hollidayjunction

f) resolution according toHolliday model in twoalternative ways creats eithera crossover chromatid (V) or anon-crossover chromatid (H).

The Meselson-Raddingheteroduplex model.

e) ligation completes theformation of a Hollidayjunction

f) resolution according toHolliday model in twoalternative ways creats eithera crossover chromatid (V) or anon-crossover chromatid (H).

Resolución del MODELO HOLLIDAY

1 2 3 4

1

2

4 3

H V

Doble hélice I

Doble hélice II

Corte

1.  Corte endonucleolítico en las dos cadenas de DNA

2.  Generación de DNA de cadena sencilla

3.  Invasión de la cadena sencilla a la región homóloga de otro dúplex

4.  Formación de estructura D y desplazamiento por síntesis nueva de DNA

5.  Migración recíproca y doble entrecruzamiento

6.  Se forman dos uniones Holliday que migran en sentido opuesto

Mecanismo II de Recombinación homóloga

RecBCD (bacteria): helicasa (BC) y nucleasa (D) que forman una cadena sencilla de ADN “INVASORA”

sitio chi 5´GCTGGTGG3´ 3´CGACCACC5´

1.  RecBCD realiza el corte endonucleotídico (nucleasa).

2.  RecBCD “se mueve” (helicasa) hasta encontrar el punto recombinativo “CHI”.

3.  RecBCD corta la cadena donde se identificó CHI, y la subunidad D (nucleasa) se desprende

4.  Las subunidades BC continuan desenrollando el ADN para formar la cadena sencilla “INVASORA”

Reparación de DNA por recombinación en bacteria

Rec A

Monómeros de RecA envuelven al ADN de cadena sencilla y promueven su encuentro con una región homóloga de otra doble hélice. Mediante hidrólisis de ATP, RecA facilita que la cadena del donador desplace a la cadena homóloga del receptor, y por lo tanto se empareje con la complementaria de ese receptor. En este proceso se forma una triple hélice transitoria y la “estructura en D”.

Reparación de DNA por recombinación en bacteria

Ruv A se une a las cuatro hebras del intermediario de Holliday

Ruv B es hexámero con actividad de ATPasa que sirve de motor para su movimiento. El consumo de ATP permite girar a la molécula

Ruv C es una endonucleasa que resuelve los intermediarios de Holliday

RuvABC resuelve las uniones Holliday

Reparación de DNA por recombinación en bacteria

Nombre del gen Proteína o función en la reparación de DNA

Genes exclusivos de reparación

polB (dinA) uvrA uvrB umuC umuD sulA recA dinB

Subunidad polimerasa de la DNApol II requerida para comenzar la replicación durante la reparación del DNA en recombinación Subunidades UvrA y UvrB en ABC de la escinucleasa DNA pol V Proteína que inhibe la división celular para dar tiempo a reparación del DNA Proteína RecA requerida para la reparación en recombinación DNA pol IV

Genes involucrados en replicación de DNA que participan en reparación ssb uvrD himA recN

Proteína SSB DNA helicasa II Recombinación sitio específica, replicación, transposición, regulación de la expresión Reparacón en recombinación

La reparación de ADN por recombinación homóloga es parte de la respuesta SOS en bacterias

Enfermedades humanas asociadas a problemas en los mecanismos de reparación

Enfermedad Proceso/Gen afectado Síntomas

Xeroderma Pigmentosa (XP)

Reparación por escisión de nucleótidos (NER)

Fotosensibilidad en ojos y piel, Queratosis, Carcinomas de piel

Ataxia Telangiectasia (A-T) Reconocimiento de daño al ADN

Desarrollo temprano de tumores

Anemia de Fanconi Reparación de ruptura en el ADN

Infertilidad, deformidad del esqueleto, anemia, leucemia

Síndrome de Cockayne Reparación acoplada a transcripción

Susceptibilidad a la luz solar, envejecimiento prematuro, enanismo

Síndrome de Werner Mutación en un gen de ADN helicasa

Envejecimiento prematuro

Síndrome de Bloom Mutación en un gen de ADN helicasa

Hipersensibilidad a Rayos X y a luz solar, carcinomas