removal of cumulus from mammalian zygotes using microfluidic techniques

6
Biomedical Microdevices 3:3, 219±224, 2001 # 2001 Kluwer Academic Publishers. Manufactured in The Netherlands. Removal of Cumulus from Mammalian Zygotes using Micro¯uidic Techniques H.C. Zeringue, 1 D.J. Beebe, 1 * and M.B. Wheeler 2 1 Department of Biomedical Engineering, University of WisconsinÐ Madison, Madison, WI 2 Department of Animal Sciences, University of Illinois at UrbanaÐ Champaign, Urbana, IL Abstract. We designed, fabricated, and tested a micro¯uidic device for mechanical removal of cumulus cells from individual in-vitro fertilized mammalian (bovine) cumulus-oocyte complexes. Building devices in poly-dimethylsiloxane with channel dimensions on the same order as that of the cumulus-oocyte complex (f%400 lm) allows for tracking and ¯uidic manipulation of individual cumulus- oocyte complexes. Two regions slightly more narrow than the ovum reorient the cumulus into a doughnut shape around the ovum. Two ports (channels signi®cantly narrower than the ovum) are used to remove the cumulus via suction. The system uses pressure-driven ¯ow to achieve positioning and movement of the cumulus-oocyte complex leading to the complete separation and removal of the cumulus cells from the oocyte. Key Words. embryo, removal, granulosa, cumulus, micro¯uidic Introduction Use of in-vitro embryo manipulation is expanding as new applications emerge. These applications include: produ- cing genetically improved livestock (Seidel, 1983); producing transgenic animals that generate pharmaceu- tical products in their milk (Velander et al., 1997); producing chimeric animals for cancer (Lee et al., 1991) and genetic disease (Stone, 1995) research; and enabling infertile couples to become pregnant (Hagmann, 1999; Trounson et al., 1994). Common in-vitro production (IVP) processes include in-vitro maturation (IVM), in- vitro fertilization (IVF), in-vitro embryo culture (IVC), embryo biopsy, and nuclear transfer. IVF is the combining of the male and female gametes to form an embryo. During IVC, the embryo develops from a zygote (single cell embryo) to a blastocyst (embryo consisting of approximately 100 cells) ready for transfer to the recipient. Removal of cumulus cells from the ovum is a step in each of these procedures. Embryos of many mammalian species (i.e., bovine, porcine, ovine, human) are physically similar for the ®rst 5±7 days of development. During this time, the ova (Figure 1) have a mean diameter of 100±140 mm (dependent on species) that does not signi®cantly change, although the number of cells may greatly increase. Upon removal from the donor, the oocyte (unfertilized female gamete) is surrounded by a mass of granulosa cells, called the cumulus oophorus. The cumulus cells surround the ovum in an irregular spherical shape with a typical diameter of 300±500 mm (Figure 1). The oocyte and surrounding cumulus cells make up the cumulus-oocyte complex (COC); for convenience, we will use the term COC even when referring to cumulus cells surrounding a zygote (e.g., a recently fertilized single cell embryo). The cumulus is integral to the pre-fertilization and fertilization processes. In most systems, the newly harvested ova is incapable of being fertilized. The ova needs to go through the process of maturation, usually involving culture in a hormone-enriched medium. The cumulus is reported to aid in oocyte maturation of some species (Fukui and Sakuma, 1980). Cumulus cells, in some species, also seem to aid in fertilization at low sperm concentrations (Chian et al., 1995). During fertilization, sperm release hyaluronidase (an enzyme) that attacks the cumulus mass (Yanagimachi, 1981), allowing penetration through the cumulus for contact with the outer oocyte membrane (zona pellucida). Some studies suggest an intact cumulus layer surrounding the oocyte can inhibit polyspermy (fertilization by multiple sperm) (Martino et al., 1995). Polyspermy yields a non- viable embryo (Wolf, 1981). In vivo, the cumulus is naturally removed from around the oocyte following fertilization (Druiz, 1965; Lorton and First, 1979). If cumulus cells are left on the ovum, byproducts from the hyaluronidase/cumulus interaction will break down the zona pellucida, decreasing embryo viability (Bavister, 1981; Yanagimachi, 1981). For these reasons, the cumulus cells are typically removed from the ovum either before IVF or within the ®rst 24 hours following IVF, depending on the species. * Corresponding author. Partially based on a communication presented at the BioMEMS and Biomedical Technology World 2000 conference in Columbus, Ohio, September 23±26, 2000. 219

Upload: hc-zeringue

Post on 03-Aug-2016

212 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Removal of Cumulus from Mammalian Zygotes using Microfluidic Techniques

��������� ���������� ���� �������� ����� ���� ����� �������� ���� ��� � ��� ��!���� �� "�� #�!������ �

������� �� ��� ���� �������� ������� ���� ��������� ���������

��� ��������� ���� ��!���" ��� � � #������$

���%������� �� ��������� &����������� '��������� �� #��������(

������� ������� #)$��%������� �� *����� +�������� '��������� �� )������� �� '�!���(

���%����� '�!���� ),

*!������� $� �� �%���� ������!��� ��� !� !�� � �����&����� ������ �� ��������� ������ � ����� �� ��� ��������� ��-����� ��!��'�� �������� (������) ����� *���+!� ���,�-� � ������%������ �� ,�+*����!�+ ��-��� ��!� ������ ����� ��� �� !�� ��� ����� � !��! � !�� ����� *���+!� ���,�- (�������)��� �� !���.��% ��� &����� ����,��!��� � ��������� ����� *���+!� ���,�-� � "�� ��%��� �%�!+ ���� ������ !��� !�� �����������! !�� ����� ��!� � ���%���! ��,� ������ !�� ����� "��,��! (������ �%��/���!+ �������� !��� !�� ����) ��� � �� !������� !�� ����� ��� ��!���� "�� + !�� � � ,�� ���*������&�� !� ������� ,� �!�����% ��� �������! � !�� ����� *���+!����,�- �����% !� !�� ���,�!� �,���!��� ��� ������ � !������� �� ��� !�� ���+!��

.�� #����� ����+�� ������� %����� �� ����� � �����&�����

)����������

��� �� �������� ����� ��� ������ �� �� ����� � ���

�������� ������� ����� �������� �������� �����

���� ��������� �� ����� ��������� �������� !"#$%

�������� ��������� ����� ��� ������� �������

���� ������� �� ����� ���� �&������ �� ��� !!'$%

�������� �������� ����� ��� ����� �(�� �� ��� !! $

�� ������� ������ ������� !!)$ �������% �� �������

��������� ��� ��� �� ������ ������ �*����� !!!%

�������� �� ��� !!+$� ,����� �������� ���������

�-&.$ �������� ������� �������� �������� �-&/$� �������� �������0���� �-&1$� �������� ����� ������� �-&,$�

����� ��� �� �� ������ �������� -&1 �� ���

��������� �� ��� ��� �� ����� ������ �� ���� �

������ 2����� -&,� ��� ����� ������ � ���� 0����

������� ���� �����$ �� �������� ������ ���������� ��

�������� 33 �����$ ��� ��� ������� �� ���

���� ����� 4����� �� ������� ����� ���� ��� ���� ��

��� �� ��� �� ����� ����������

5����� �� �� ������ � ����� ������ �������

������� ������ ����$ �� ������ ������ ��� ��� 6���

)7' �� �� ������ ����� 2����� ���� ����� ��� ��

�1����� $ ��� ��� ������� �� 337 +3 ����� ������ �� � �����$ ��� ���� ��� �����6����

������ ������� ��� ������ �� ����� � �����

�������� � �� ������ ���� ��� ������ ��� ��������������0�� ����� �����$ �� ���������� � ��� ��

������� ������ ����� ��� ������� �� ������ ���

������� ����� �������� ��� ���� �� � �������� � ������

�� � ���� � ��� ������� �� #337)33 �� �1����� $�

��� ����� �� ����������� ������� ����� ��� � ���

������������� ��� ��� �,8,$% ��� ������������ ��

���� ��� ��� ���� ,8, ���� ���� ��������� �� �������

����� ����������� 0���� ������ ������� �������0��

������ ���� �����$�

��� ������� �� ������� �� ��� ����������0���� ��

�������0���� ��������� -� ���� ������� ��� ����

�������� �� �� ��� ��� �� ����� �������0��� ��� ��

����� �� �� ������� ��� ������ �� ��������� �����

��������� ������� �� ���������������� ������� ���

������� �� �� ����� �� �� �� ����� �������� �� ����

� ����� �1���� �� ����� !"3$� ,������ ������ ��

���� � ������ ��� ���� �� �� �� �������0���� � ���

� ��� ������������� �,��� �� ��� !!)$� 2�����

�������0����� � ��� ������ ���������� �� ��0��$

��� ����� ��� ������� ��� �9�������� !" $�

������� ��������� ������� ��� ������� ��� ������

���� ��� ����� ����� ������� �0�� �������$� ����

������� ������� � ����� ������� ��� ����������� ���

����� �� ������� ��� ��� ��������0���� � ����� ��

� ���$ �/����� �� ��� !!)$� .��� ��� ����� ����

����� ����� �:���� !" $� �� ����� ��� ������� ��

������ ������� ���� ����� ��� ����� ���������

�������0���� �2���0� !;)% (����� �� 1����� !'!$� -�

������� ����� �� ���� �� ��� ����� � ������� ���� ���

����������<������� ���������� ���� ���� ���� ���

0�� �������� ��������� ����� ������� �=�������

!" % 9�������� !" $� 1�� ����� ������� ���

������� ����� �� � ���� ������� ���� ��� ����

������ ������ -&1 �� ������ ��� 6��� >+ ����� ���������

-&1� �� ������ �� ��� � ������

? ,����� ������ ������

.����� ���� �� ������������ �������� � ��� =��/5/� ��

=�������� ��������� :���� >333 ���������� �� ,�������� 8����

�� ������ >#7>;� >333�

$�/

Page 2: Removal of Cumulus from Mammalian Zygotes using Microfluidic Techniques

,�������� ������ �� ��������� ������� ��� �������

������ �� � ���� ���� �� �� ��������� ����� 8��

������ �������� ��� ��� �� � �� ����� ��0�� ����

� ����� ��� ��������� @����� ��� ,8, ���� �� ��� ��

��� � ���� �� �� ��������� ������ ��� ��������

1������ ��� ����� ���� �� ��� �� ����� � ����

����� ���� �������� �� ��� ����� �4�������� >333$�

A������ �������� ��� ������� ������ �� ������ ���

���������� -� ���� ������� ����� �� ,8,� �� ���� 37

33$ �� ���� �� ���������� ���� �� ��� ���� �� � ��

���������� �� ����� ������ �� @��� ������ ��� �����

B��������0���� ������ ��������� ��� ������� ������

�4�������� >333$� &�������� ����� ���� ����� ��������

�� ��� 0���� �� �� �������� �� ���� �������

������������� C��� ��������� �������� ������� ��

��������� 0������ ������ ������� �� ������

������D�� �� ���� �:��� !!'$� A ����� ������ �� ���

���������� �� ����� ��� ����� ������� �������

����� �,��� �� ��� !!)$� *��������� ���� ���� ���

������ ��� �������� �� �� � ���� ���� �� �� ��� ��

��� �������� ������D��� ��������� ���� �(����� ��

1����� !'!$� A������� ���� ������D�� ������� ���

�������� ������ ������� �� ������ ��� �������� ��

��� ������ ������ �� ��� � �� ��� ��������� �� ��� ,8,�

-� ����� �� ��������� �� ������ �������

������ �� ����� ��� ������0�� ����� ��������

�� ��� ����� ������0�� ,8, �������� �� �������

������� �������� ���� ������ ������� ������� @���

������������ ������� ���� ���� � ������� �� �����

�� ������� �� ��������� ���

������ ������ ��� 0�!��������

-��������� �� ��� ��������� ���� ������ ������D��� ��

�� ����� ��� ��� ���� � ��� ������ ��������� ���

�����@����� ������ �� ���� �������� �� ����� ����

������ ��� ������ �� ���������� ������D���� ���

������ �� ��� ��������� �� �������� � $ �����������%

�>$ ������ ���� ����% �#$ ���� ������ ������% �+$

�� ��� ��0�� �� �������� �������% �)$ ������� ���

������������ �� ��� ������� �����% �;$ ���� ���

�������� ���� ��� �� ��� �������% �� �'$ �����������

��� ���� ������ ������� �� ��� @����

��� ������ �� �������� ���� �����������������

�.2/�$� -� �� ���� ����� ��� �� � ��� ������

��������� �������� ��������� .2/�� �� ��� ����� ��

������ �,�� �� ��� !!!% ,��� �� ��� !!"$� ���

������ ����� ,8, ������� �� �� ���� ��� ������ �����

������� ������ � ������ �������� 1����� > ������$ ��

� ��������� ���� �� ��� ������ ����������� ��� �����

����� ��� ������������ ������� �� ��� ��� ������ �����

��� ����� �� ��� ������ ������� ��������� �� ����

������ ���� ��� .2/�� ���� ������ ��������� � ���

��� �� ��� ��� ������ �1����� > ������$$� ��� ���

������ �� ��0�� �� ���� ������ ,8, �� ����� �����

�)33 �� ���� � +33 �� ���$� ��� ��� ������

������� ��� ������� ������������ ������� �1����� >�$$

�������� ��� ��� ����� � ��� ���� �>)3 �� ��

)3 �� ���� � +33 �� ���� ��� �������$� 1����� ����

��� ��� ������ !3� ���� ����� ��� ��� �� �������� ������� �� ��� ���� ������ ���� �+3 �� ���� �

+33 �� ���$ �1����� >�$� ��� ��������� �� � ������

������� ��� ��� ������ ��� ������� �� ��� ���

������ ������� �� ���� ������ �������� ������ ��

������� ����<������� ������� �C����� �� ��� !!"$�

��� .2/� ������� ���� ��� ����� ����������

���������� ������ ������� �� ��������� �� ���

����� � ������� �������� ������ ���������� -�

�������� ��� .2/� ������ ������� ��� ���� � ����

0��� $� � � ������ �� �� � �� �� ��� �� � ��� � ���� ���� � ���� ���� ��� �� �������� ������� ���� �� �� �� ��� ����� ��������� ����� �� �� ���� ����

0��� �� �� �� � �� � �� �� � ���� ���� �������� �� ������������ �� �� � ����� ��� �� ��� � ��� ��������� � �� ��� ������� � �� ���� �� ��������� � ������� ���� ������������ ��������� ���� �����! �"#"��

$$1 $����� %� �� &���

Page 3: Removal of Cumulus from Mammalian Zygotes using Microfluidic Techniques

����� ��� ����� ��� ����� �����$� � �� �����

� ���� �� �� ���������� ���� ������ ����� ��������

,������ �� �������� �� .2/� ����� ������������

������� �2��� �� ��� !!"% E� �� ��� !!!$� 1�����

������ ����� �� ����� ���� ������� ���� ����� ������

6�� ������6���� ����� ����"� 33� /�������� ,�� �

F������ /A$� 4���� �� �� ������ ���� ��� ���� ��

� �� � )33 �� �� ��� ) ������� ���� �� �� �

>)3 �� ���<������� �� >33 � � ��� ' ������� ���

���� �� ���� � !)�, ��� ) ������ �� ���� ���� �&

� ���� �� >33�E<��>� �� ���� ��� � !)�, ��� >

������ ��� ����� �� ������ �� �� 5 �� ������ ��

�/�������� ,�� $ ����� ��� ����� �� ���� � ) ��������

� ���� #37+3 �������� ��� ���� �� ���� ������� �

>)�, ��� >3 �������� .2/� ������ "+� 2��

,������� /������ /-$ �� ����� �� 3 � ���� ��

����� ���� ��� ������ A ��@�� �.�15$ ��������� ��

���� �� ���� ���� ��� .2/� �� ���� ��� ����� ����� ���

.2/� �� ����� � +3�, ��� + ������ ��� ������ ��

������� ���� ��� .2/� �� ��� .2/� �� ������� ����

��� ������ ��� .2/� �� ��������� ���� ������� ��

����$ �� ����� �� ����� ������� ��� .2/� �����

������ ������� ��� .2/� �� ������ �� ����

�������� � ����� ����� � ����� ��� �E� �� ��

!!!$� A �� �� ���� ���� �� ����� �4�& 3"� 2���

,������$ �� ��� ����� ������ ��� �� ������ @���

��������� � ��� ����� �1����� #$� A� ����� ����������

������ �1����� #$ �� ���� �� �������� ��� �� ��� �����

������ ����������� ���� ��� ��� ������������������ @���

������� ��� ������ �� ����� �� ��� ������ ������

����� ��� �� ��� ������ ����������� �1����� # ������$$�

5�� ���� �� ���������� �� ������� ����� �� ����

6������ ������� �� �� ��������� �������� �� �������

������$ �� ��� ������ �� ���������� ������ �� ����

������ �� ����� ������ @�� ����������$�

&2%��������� ������

��� ������� ��������� ���� ���� ���� �� ������

������� ����� ���� ������ ,8,�� ��� ,8,� ��

�� ��� �� � -&1 �����> ���� �� ��������� �� ���

������� ��� @��� ���������� ������ �1����� #$ ��

��������� �� ��� ������ �� ������� ��������� ���

������$ �� ��� ������� ��� ������ �� ���� @����� �����

������ ��� ���� ��� ����� ���� �� 6���� ���� ����� �������

������ �� ��� ������ �� �� ���� ������� ��� ������

� ������ �� ��� �������� ��� ������ �� ���� 6����

��� ���� ������� ������ �� ���� �����

�������������� �� A ,8, �� � ����� ���� ��� ������

�� ������ �� ���� �� ��� ������ �� ��� ����� ��� ,8, ��

���� ���� ���� ��� ��� ������ �� ������� ��� ���

������������ ������� ����� ���� ������ ������� �� ���

������ �� ��� ��� ������� :���� ����� ���� �������

��� ������ ������������ ������� @�� �� �������� ��

������ ��� �1����� >$� ������� ��� ,8, ����� ���

� A� ��� � �������� ��� �� ��� ������� �� ������

������� ��� ������ ��� ����� ��� ���� �� �������� �

��� ������� �� ��� ���� 4����� �� �������� �

��������� @��� @�� ���� ��� ������ ��������� ��

��� � 1��� �� ���� ������ �� ��� >� ��� ,8, ��

���� �� ��� >� ������� �� ��� ������� ����� ���

�������� �� ������� �� �������� 8��� ������� ��

�������� ��� ����� �� @����� ��� ���� ��� ���� ���

�������� � � �������

������

,������ ������ �� �������� �� >) ,8,� ���� ���

������ �� ����� ����� ����� ����� ��������� �������

��������� �� >) ���������� ������� �������� /���

������ � ������ �� ���� �� ������� @��� @�� �� ���

�������� ��� ,8, �� ����� ���� ��� ����� ���� ��

���� ���� ��� ��� ������� ��� ����� ���� �� ���

������� �� � ������ ��������� ����� ��� �����

-� ��� ��� ������� ��� ,8, ���������� ���

������������ ������� �1����� +$ ��� ��� ���� ���

������� ����� ���� ���6������� ��� ���������

��� ���� ������� ������� A� ��� ,8, ����� �������

��� ��� ������������ �������� ��� ������� �� ����������

����� ��� ����� ������� @������ ���� �� � ����

��� ������� ����� ��� ��� ��� �� ��� ���� � ���

������ �� ��� ����� � �� ������� ��� ������ ������������

������ ��� ���� �� ������ ������������ ���� ��� ������

0��� 3� � � ������ �� ���� ���� �� ���� ��� ������� �� �������������� ����� ������ ��� "����������� � ���� ��� ��� �� �� ����� ��������� ����� �� �� ��'( ����� �� ����� � �� ���� ��'( �� ���� ������ )����� ��������� ���� �� �� ����� �� ������

*��� � �� "������ ���� ' �� �� � $���� $$�

Page 4: Removal of Cumulus from Mammalian Zygotes using Microfluidic Techniques

�� ��� ������� ��� ,8, ������� ��� �����������

���������� ����� ������� �� ������ ��� �1�����

+�$� ��� ����������� ���������� ����� ��� ������� ��

������ ��� ������ ��� ������ ��� ��� ������ ���

������� �� ���� ���� ���� ��� ��� ����� ��� 0���� ��

������� � ��� � ����� �� ��� ���� ������� @���

������� ���� ��� ��� �� ������� ��� ������� ���� ���

0����� ��� 0���� ���� ����� ������ �������

������� �� �� ������� ���� ����� ������ �� ���

0�����# 1��� �� ���� �������� �� ��� >� 2�� �� ���

�� �������� ���������� �� ��� ��� ������ ����� ���

,8, ���� ����� � �� ����� ���� ��� �� ��� >�

������� ��� �������� ������� �� ����� ��� ������ ���

��� �� ��� 0���� �1����� +�$� ��� �������� �������

�� ���� ������� � ������� ������ ������� 0���� ��

��� ������ �1����� +�$� 4������ �� @�� �� ��� ���

������ ������ ��� ������ 0���� ������� ��� ���

������ ��� ���� ��� ������ ����� ��� ������� 0���� ��

���� ��������� ���� ��� ������ �����

���������

(����� ,8,� ���� ��� ������ �� ��������� ������� ���

��� �� ��� ��������� �� ����� ���� .������� �������

�C����� �� ��� !!"$ �� @���������� ���� ���� ���

������ ������� � ��� ������ �� ��� ����� -� ����

������� ��� ����� ���� �� ���� ������� � ���

������ ������� �� ��������� ����� ���� ���

������� ��������� ��� ����� �� ���� �� ��� �����

C������ ��� �� �� ��� � ���� �� ��� ������� �� ���

������ ������ ����� ������ �� ����� �������� ��� ��

��� � ���� ���������� �� ��� @���<�� �������� ����� �

��������� ��� � ���� ���� ��� ����� :��� ��� ������ �����

��� �� �� ��� ������ �� ������ ���� ��� ��� �� ��� ���

������� ���� ���6������� ����� ,8, �� �� ����

������� ������ ������ ��� ���� ������ � ������ �����

��� ��� �� ���� �� ��� ������ ����� ��� ,8, � �� �����

���� ��� ������ ���� ��� ������� 5���� ������ ����

��� ������ ���� ��� ��6�� ��� ������� ���������

������ �� ���� ��� ��D���� ������ ����� ����������

�� ��� � �����

1��� ��� ������ ����� ��� ,8, �� ������ ���� ���

������ ����� �� ���������� ��� ����������� �������� -�

��� ����������� �������� ��� ,8, �� �������� ���� ��� ����

�� � ����� ��� ���� �1����� )$� �� ������ ����

���6�������� ��� ����������� ������� �������� ���

��������� �� ��� ,8,G� ������� �� ��� ����� �� ���

����� ����� ��� ���� ����� �� �� ���� ��� ���� ��� ���

�������� ��� ������� ��� ������� � ���� ��� ���

���������� ������ ���� ������ @������ HH>�������

�����GG ��I��� ��� ��������� ������� ������� A� �

��� �� �� ��� ������ �� ���� ���6�������� 1����� )

������ ��� ���� � � ���� ����� ������� �� ����� �

������� �$ �� ���� ����� ��� ���� �� ��$ �������� ���

0��� 4� ������� � �� ���� � �� �� �� �� �� ������� ���� �������� ����� ���� ���� ��� �� �� ������� � � ������ �� ��������� ���� ������� � �� � ��� ������� �� ����� ���������������� ���� ����� ����� ������ �� �� ������� ������ ���� ����� �� "#" ���� ������ "#"� ������ ������ "#"� �� ������� "#"� � ����� ������� �� ��������� ������ ��� �� "#" �� ����� � ���� +� ���� ����� ��� ����� �� ��� ������� ���� �� ��������� ���� ���,� ���� �� ���� � ����� ��� �� ������� ��� �� � �� ���� ���� ���� + �� ���� -� ��� *� ����� ������� �� ����� � ���� - � ���� �� � �����

0��� 5� ������� ���� �� �� ������� ������ ���� ����� �� ����� � ��� ���� ����� ���� ������� � � � ����� � �� � ����� ����� ���������� �� �� ����� ��� &��� � ����� � ������������ ���� ������ ���� � �� ����� ��� ������� ���� ���� �� ����� � � ����������� ������ ���� ��� ���� ������������ !��

$$$ $����� %� �� &���

Page 5: Removal of Cumulus from Mammalian Zygotes using Microfluidic Techniques

������ ������ �� ��� ����� ��� ������ �� ��� HH����GG

���6������� �� ��� ,8, ���� ��� ����� ����� ������

��� ��� ��� ���� ���������� ��� ��� ���� �������

������� ����� ������� ��� ������� ����� ���

�������������� -� ��� ������� �� �� � ������

���������� ����� ��� ���� �1����� )�$� ��� ,8, ����

�� ������ ����� ����� �� ��� �� ������ ��� ����

������� ����������� ��� ������� ���� �����

���������� ����� ��� ����� � $ ��� ��6�� ������

������� �>$ ��� ��6�� ������ � ������� �#$ �����

�� ����� �� ������ ��������� �� ��� ,8, �� �+$

��������� ���������

A���� ������������ �� ��� �������� ������ �� ���

������� �� �������� � ������ ����� ,������ ������

�� ������� � @��� �� ���� ������� ��� ������ ��� ��

����� ��� ,8, �� ������� ��� ���� ����� �� 3 �������� � ��� ������� ���� ����� ��� ������ ���

��)3 ���� ������ ��� ���� �� 33 ��� �� �� �� �

��� ������� �� ��� ���� 1���� ���� ������� ��� ���

�� ��� ������� ����� ������� ��� ���� �������� ��� �����

���� ��� ����� 1�� ������� �� �� ������� �� ����������

��� ������� ���� ����� ��� ������ ��� ��� �� ���

����� -� ��� ���������� ��� ������� �� ��� ������ ����

�� ����� �� ���6���� �� ������ ��� �������� ��������� �� ��

�������� ��� ��� ������� �� ���� ��� ������ ���

��� �� ��� ����� ��� ������� ������������ ��� ����

��� ,8, �� ���� � ����������� (���� @�� �� �����0�� ��

������ ���� ���������� � ��� ,8, @��� ���� ���

����������� ������� �� ��� 6��� ������ ���� ��� ������

���� ���� � !3 ������ ���� ���� ��� ������

�������� ������ ���� ��� � ����� ����� �� ��� �����

8�� �� ������ �������� ��� ������ � ��� �

��������� ���� ��� ��� �� ������ ������ �� ����� ��

������ ��� ���� �������

��������

-� ���� ��� �� �������� �����@����� ������ ���

������� ������ ���� ������ ������� .��������

������ @�� �� ������������ ����� ��� ��� ������ ��

������� ���� ������ 0������ .������ ������� �� �����

������� �� @�� ���� ���� ��� ���������� ��������

������� ��������� ������� ������� ���� ����

���������� ��� ������� �� �� ��������� ������������

���� ��� �� ��� ������� �� ��������� �������� ���

����� �� ������� ������� ����� ������� ��

��������� ��� ���� ��� ���� ����������� ������

���� ������ ����� ��������� �������� 1����� ���� ����

������� �����D���� �������0����� �� ������� ����� ��

������ ��� ����� ����� �� ��� ������� ������� �

����� ����������

,������ -&. �������� �� ������ �� ��������� ��� �

�������� �� � ����� �� ���� �� ������� A

�����@����� ������ �� ���� ����������� ��� ���

������� ������ ��� �� � -&. ������� 2����� ����

�� ������� �� ������� ����� �������� �� ������� ���

-&, �4� �� ��� >33 $ �� 0�� ������� ������

�B������� �� ��� >333$� 5�� �� ��� ������� ���� ������

��������� ������ �� �������� ������ ���������� �� ���

��� � ���� ������ ������ �������

*�6��7���������

��� ������ ����� ���� �� ���� E�� 4������� �� 4���

/����� �2� ������ �� A���� ��������� ��������� ��

:���������/������ /������ :- )#'3;$ ��� �� ����

��� ������ ,8,�� ��� ������ ����� �� ����� ���� ��

���� 4��� /����� ��� �� ���� ��� ,8,� ���� �� ����

�� �������� 1������ ��� ���� ��I��� �� ������� �

��� -������� ,������ �� 1��� �� A���������� 4������

�� ��� ��������� �� :��������J/������ C�����

/������ �� -� C����� ���� ��� ��� �� ��� �� �����

�� ���� ���������

8����

� 1�� ��� ���� ��� ���� �� ���� �� ��� ��� ����� ;3�, �� ���

���� �� � �� 6�� ��� ������ ���� ��� ��� ���� 1�������� ���

���� ��� ��� ��� �� ������ �� ���� �� ���� ��� ������ ������

�������� ��� �����

>� =����� ,8,� �� �������� ���� ������ ������ �� ������ ��

�������� ���� ��/,� !!�1=��F ������1�*�.���������$ ��� ����� �� >+ ����� � #!�,� ��� ������ ,8,�

�� ����� ����� ����� �� ������� ���� ��( *5.5�� =�A�F

������ ��������$ ���� ���� �� �������0���� ���� �����6��

�( �������=�A�F ������ ��������$� ��� �����������

�� �������0���� �������� � 333 � ������� �� ���������� ���� ���

���� �� ������ �� ���������� ���� ��� ,8,� ��� >37>+ ����� �

#!�,� ��� ,8,� �� ����� ����� ����� �� ������� ���� �� ����

�� ������� ���� ��� ����� �� ���������

#� -� ��� �������� ��� ���� ������ ������ �� ���� ��� ���� �������

������ ����� ������ ����

����������

=�2� =������� .������ ���� �� /������� �������� �� 0����� E�(�&���� /�������� �� E�2� =������� ���� �.����� .����� F�� 9����

+ 7;3� !" $�

F�C� ,��� E��� (��� ���E� ,���� *�,� B�������� -�K� C������ 2�E�

=����� �� /�=� :������� ������������� 0�� $� >#+ � !!!$�

4�,� ,���� K� 8���� �� K� F��� A���� 4� ��������� ������� �1�#'7+" � !!)$�

���E� ,���� -� C������ *� B�������� 2� =����� ��/�:������� =�����

�� 4� ��������� 01��� �� $� !; � !!"$�

.�E� 2���0� A������� 4����� �0�� > 7> + � !;)$�

2� 2���� E�,� /������� 8�E�A� ���������� �� C� :����������

A�������� ,������ -���������� ������� �� 5������� �2� ))37)')� !!"$�

*��� � �� "������ ���� ' �� �� � $���� $$3

Page 6: Removal of Cumulus from Mammalian Zygotes using Microfluidic Techniques

9� 1���� �� 9� ����� =����� �� 4� ��������� ��� ;;!7;'# � !"3$�-�K� C������ *�,� B�������� 2�E� =����� ���E� ,���� E� (��� F�C�

,��� �� /� :������� *������ -�������� /����� 5�����

����� /����@������� �/// �� ��� %����� /��� �1�)$� )'37)'"

�>33 $�

/� *����� ������� �1�� 3!'7 3!" � !!!$�

=� E�� (�/�&� (��������� K�/� /��������� �� 2�E� =����� E����� ��

/������������������� ������ �� $� ';7" �>333$�

C�*� (��� K� F����� *� K��� /� K������ A� 9������� ��

������ �� �� K����� ,���� 4������ 0�� >$� #>)'7#>;3� !! $�

��.� (����� �� F�(� 1����� =����� �� 4� ��������� ��� #3 7#3"

� !'!$�

A� /������ �� /���� /�E� .����� �� /��� .����� �������������

��� +'>7+") � !!)$�

�� 4�� E�A� 2���� 2�E� =����� ��(� 4�������0�0�� �� /�=� :�������

������������� 00� $� >+ �>333$�

E�E� 4�������� .������ ,����������� �>333$�

C�5� ������� =����� �� 4� ��������� �1� #;7+! � !"#$�

A� ������ ������� �23�/� >+$� ''# � !!)$�

A� ��������� 2� .������� (�E� /������� -� (����� �� 2�K� C������

,������ ����� �� -&/<-&1 �� 5���� ,������ �� *���� �� 1��

A������ ������������� ��� )'7;; � !!+$�

:�*� &������� *� (����� �� :�F� 2����� �������6� A������

�23� $� '37'+ � !!'$�

(� :��� 2�E� =����� A�4� :������� �� K�2� 5���� -555

���������� �� =�������� 5���������� ��� $� >"7 #" � !!'$�

2�.� :���� .������ ���� �� /������� �������� �� 0����� (�

/������� �� E�2� =������� ���� �.����� .����� F�� 9���� "#�

!" $�

4� 9�������� .������ ���� �� /������� �������� �� 0����� (�/������� �� E�2� =������� ���� �.����� .����� F�� 9���� >7

# � !" $�

*�,� B�������� K�4� K���� -�K� C������ �� 4�� /�=� :������� ��

2�E� =����� '���� ��� � �� ���� (���� �K����� A������

.���������� 5�������� ��� F���������� > +7> '� >333$�

$$4 $����� %� �� &���