induksi mutasi dengan ems dalam kultur antera cabai capsicum annuum l.-libre

18
INDUKSI MUTASI DENGAN ETIL METAN SULFONAT DALAM KULTUR ANTERA CABAI (Capsicum annuum L.) DAN PENGARUHNYA TERHADAP KAPASITAS EMBRIOGENESIS MUHAMMAD RIDHWAN DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2012

Upload: budi-kafan

Post on 24-Dec-2015

16 views

Category:

Documents


2 download

DESCRIPTION

kultur antera

TRANSCRIPT

Page 1: Induksi Mutasi Dengan Ems Dalam Kultur Antera Cabai Capsicum Annuum l.-libre

INDUKSI MUTASI DENGAN ETIL METAN SULFONAT DALAM

KULTUR ANTERA CABAI (Capsicum annuum L.) DAN PENGARUHNYA

TERHADAP KAPASITAS EMBRIOGENESIS

MUHAMMAD RIDHWAN

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2012

Page 2: Induksi Mutasi Dengan Ems Dalam Kultur Antera Cabai Capsicum Annuum l.-libre

ABSTRAK

MUHAMMAD RIDHWAN. Induksi Mutasi dengan Etil Metan Sulfonat dalam Kultur Antera

Cabai (Capsicum annuum L.) dan Pengaruhnya terhadap Kapasitas Embriogenesis. Dibimbing

oleh ENCE DARMO JAYA SUPENA dan HADISUNARSO.

Metode kultur antera yang efisien pada sistem media dua lapis telah dikembangkan untuk

memproduksi tanaman haploid ganda (HG) cabai kultivar lokal Indonesia (Capsicum annuum L.).

Untuk percepatan dalam menghasilkan variasi genetik dan perbaikan sifat dari cabai, metode

kultur antera ini dikombinasikan dengan teknik mutagenesis dalam penelitian ini. Induksi mutasi

dilakukan melalui perendaman antera sebagai sumber eksplan pada larutan etil metan sulfonat

(EMS) konsentrasi 0.1% dan 0.5% selama 1, 3, dan 6 jam sebelum kultur. Perlakuan EMS 0.1%

selama 6 jam tidak hanya dapat menginduksi mutasi, tetapi juga meningkatkan respon

embriogenesis, rata-rata embrio lengkap, dan rata-rata embrio berkecambah. Mutasi yang terjadi

dapat dideteksi pada tanaman yang berasal dari kultur antera pada sifat morfologi daun dan batang,

serta isozim peroksidase, aspartat aminotransferase, dan esterase. Metode kultur antera yang

dikombinasikan dengan teknik mutagenesis ini dapat digunakan untuk mempercepat proses

pemuliaan tanaman cabai kultivar lokal Indonesia.

Kata kunci: Capsicum, Kultur antera, Haploid ganda, EMS, Mutasi.

ABSTRACT

MUHAMMAD RIDHWAN. Ethyl Methane Sulphonate Treatment Mutation Induction on Anther

Cultures of Hot Pepper (Capsicum annuum L.) and Its Effect on Embryogenesis Capacity. Under

supervision of ENCE DARMO JAYA SUPENA and HADISUNARSO.

An efficient anther culture method on double layers medium system has been developed for

producing doubled haploid (DH) of Indonesian hot pepper (Capsicum annuum L.). In order to

speed up both genetic variability and improvement of hot pepper, this anther culture method was

combined with mutagenesis technique in this research. Induction of mutation was evaluated by

soaking of anthers as source of explans in 0.1% and 0.5% ethyl methane sulphonate (EMS)

solution during 1, 3, and 6 hours prior to culture. Anther treatment on 0.1% EMS during 6 hours

was not only induce mutation, but also increase embryogenesis response, complete embryo

produce, and embryo germination. The mutation could be detected on plant derived from anther

culture both in morphologycal characters of leaf and stem, and isozyme of peroxidase, aspartate

aminotransferase, and esterase. A combination of anther cultures method and mutagenesis

technique could be used for speeding up the breeding process of Indonesian local cultivar hot

pepper.

Keywords: Capsicum, Anther cultures, Doubled haploid, EMS, Mutation.

Page 3: Induksi Mutasi Dengan Ems Dalam Kultur Antera Cabai Capsicum Annuum l.-libre

INDUKSI MUTASI DENGAN ETIL METAN SULFONAT DALAM

KULTUR ANTERA CABAI (Capsicum annuum L.) DAN PENGARUHNYA

TERHADAP KAPASITAS EMBRIOGENESIS

MUHAMMAD RIDHWAN

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2012

Page 4: Induksi Mutasi Dengan Ems Dalam Kultur Antera Cabai Capsicum Annuum l.-libre

Judul : Induksi Mutasi dengan Etil Metan Sulfonat dalam Kultur Antera

Cabai (Capsicum annuum L.) dan Pengaruhnya terhadap Kapasitas

Embriogenesis

Nama : Muhammad Ridhwan

NIM : G34070086

Menyetujui,

Pembimbing I Pembimbing II

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si Ir. Hadisunarso, M.Si

NIP 19641002 198903 1 002 NIP 19550219 197903 1 002

Mengetahui,

Ketua Departemen Biologi

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si

NIP 19641002 198903 1 002

Tanggal Lulus:

Page 5: Induksi Mutasi Dengan Ems Dalam Kultur Antera Cabai Capsicum Annuum l.-libre

PRAKATA

Dengan Nama Allah Yang Maha Pengasih lagi Maha Penyayang. Segala puji dan syukur

penulis ucapkan kehadirat Allah SWT atas rahmat dan hidayah-Nya sehingga dapat menyelesaikan

karya ilmiah ini. Shalawat dan salam kepada suri tauladan terbaik Nabi Muhammad SAW dan

semoga terlimpahkan pula kepada keluarga dan para sahabatnya serta orang-orang yang mengikuti

jejak mereka sampai hari kemudian.

Pertanian Indonesia yang terus berkembang baik dalam hal aspek produksi, teknologi dan

ekonomi membutuhkan inovasi-inovasi baru. Tanaman cabai merupakan komoditas pertanian

yang penting bagi masyarakat sehingga pengembangan dan penelitian tanaman ini terus dilakukan

untuk memperoleh berbagai macam varietas-varietas baru yang baik dan unggul. Karya ilmiah ini

berjudul “Induksi Mutasi dengan Etil Metan Sulfonat dalam Kultur Antera Cabai (Capsicum

annuum L.) dan Pengaruhnya terhadap Kapasitas Embriogenesis”, dan merupakan sebuah pendekatan teknologi haploid yang dikombinasikan dengan mutagenesis dalam usaha

meningkatkan produktivitas dan kualitas tanaman cabai Indonesia.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si dan Ir.

Hadisunarso, M.Si atas segala bimbingan dan fasilitas yang diberikan untuk menunjang penelitian

penulis sampai terselesaikannya karya ilmiah ini. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr.

Ir. Sulistijorini, M.Si sebagai dosen penguji atas masukan untuk perbaikan karya ilmiah ini.

Terima kasih penulis sampaikan kepada dosen, staf dan karyawan Departemen Biologi: Dr.

Hamim, Ir. Tri Heru W, M.Si, Pak Joni, Pak Ejen, Pak Nasir, Teh Wiwiek, Ibu Eti atas bantuan

dan kerjasamanya. Terima kasih penulis sampaikan kepada staf dan rekan-rekan penelitian di

PPSHB IPB: Mbak Nia, Mbak Sarah, Pak Asep, Pak Sairi, Pak Mulya, Pak Adi, Ibu Ratna, Pak

Pras, Ita, Lia, Ikra N, Asri dan masih banyak rekan lainnya yang tidak dapat penulis sebutkan.

Saya senang bisa mengenal dan bekerjasama selama masa-masa penelitian yang tidak terlupakan.

Terima kasih penulis sampaikan kepada Syaefudin, S.Si dan Hakiim Bashaar, S.Si atas bimbingan

dan ilmu yang telah diberikan yang menunjang penelitian ini. Terima kasih penulis sampaikan

kepada saudara-saudaraku 97 orang mahasiswa Biologi angkatan 44 (BIOPAT), dan kakak-kakak

serta adik-adik Biologi angkatan 41, 42, 43, 45, 46, dan 47. Terima kasih penulis sampaikan

kepada manajemen CV. Greentech EMC, keluarga besar LDK Al Hurriyyah, dan Himabio IPB

atas dukungan dan perhatian selama studi Strata 1 IPB. Terakhir, rasa terima kasih dan hormat

yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada keluarga tercinta, Bapak, Ibu, Achmad

Muttaqiin, SE., dan adikku Anwar Fauzi atas segala doa, semangat dan kasih sayang yang

membuat penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dan studi S1 ini.

Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini masih belum sempurna, namun penulis berharap

semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan pertanian

khususnya di Indonesia.

Bogor, Mei 2012

Muhammad Ridhwan

Page 6: Induksi Mutasi Dengan Ems Dalam Kultur Antera Cabai Capsicum Annuum l.-libre

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 14 Maret 1989 merupakan anak kedua dari tiga

bersaudara, dari pasangan Eddy Sukamto dan Sunarmiyatun.

Tahun 2001 penulis lulus dari SD Islamic Village, Tangerang. Tahun 2004 penulis lulus

dari SLTP Islamic Village, Tangerang. Tahun 2007 penulis lulus dari SMA Negeri 7, Kota

Tangerang dan pada tahun yang sama penulis diterima masuk IPB melalui jalur seleksi USMI pada

mayor Biologi, di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dengan

minor Gizi Masyarakat, Fakultas Ekologi Manusia, Institut Pertanian Bogor.

Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi

Dasar selama 3 semester pada tahun 2010-2011, mata kuliah Ekologi Dasar selama 2 semester

pada tahun 2010-2011, mata kuliah Ilmu Lingkungan, Fisiologi Tumbuhan dan Genetika Dasar,

serta Pendidikan Agama Islam pada tahun 2011. Penulis lolos pendanaan dari DIKTI dalam

Program Kreativitas Mahasiswa bidang Pengabdian Masyarakat pada tahun 2009-2010 dan

program Pengabdian Masyarakat LPPM IPB tahun 2011. Penulis juga aktif berorganisasi menjadi

anggota Divisi Perekonomian LDK Al Hurriyyah tahun 2008, Ketua Departemen Minat dan Bakat

LDK Al Hurriyyah tahun 2009, Sekretaris 2 Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) IPB tahun

2009, Ketua HIMABIO IPB tahun 2010 dan Badan Pengawas HIMABIO tahun 2011, serta

Komisariat Tingkat (Komti) Biologi 44 IPB. Selain itu, penulis menjadi pengajar IPA di

Bimbingan Belajar I‟M SMART Bogor. Penulis juga berwirausaha menjadi Manajer Service and

Maintenance di CV. Greentech EMC, Bogor. Penulis memiliki pengalaman praktik lapangan

antara lain di PT. Angkasa Citra Sarana Catering Service, Bandara Soekarno-Hatta, Jakarta bagian

Human Quality Assurance (HQA) tahun 2010.

Page 7: Induksi Mutasi Dengan Ems Dalam Kultur Antera Cabai Capsicum Annuum l.-libre

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ........................................................................................................ viii

DAFTAR GAMBAR ................................................................................................... viii

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................................ viii

PENDAHULUAN ........................................................................................................... 1

BAHAN DAN METODE

Bahan Kimia dan Alat ............................................................................................. 1

Bahan Tanaman dan Sumber Antera ....................................................................... 2

Praperlakuan dan Perlakuan Etil Metan Sulfonat .................................................... 2

Prosedur Kultur Antera Cabai ................................................................................. 2

Perkecambahan dan Pertumbuhan Tanaman ........................................................... 2

Analisis Isozim ........................................................................................................ 2

HASIL

Embriogenesis Mikrospora ..................................................................................... 3

Morfologi dan Anatomi Tanaman Hasil Kultur ...................................................... 3

Keragaman Isozim .................................................................................................. 4

PEMBAHASAN .............................................................................................................. 5

SIMPULAN .................................................................................................................... 6

SARAN ........................................................................................................................... 6

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................................... 6

LAMPIRAN .................................................................................................................... 8

Page 8: Induksi Mutasi Dengan Ems Dalam Kultur Antera Cabai Capsicum Annuum l.-libre

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Hasil respon embriogenesis antera cabai (C. annuum) pada metode kultur antera

yang dikombinasikan dengan mutagenesis menggunakan senyawa kimia EMS .... 3

2 Keragaman morfologi dan anatomi tanaman cabai (C. annuum) kontrol dan hasil

kultur antera yang dikombinasikan dengan mutagenesis menggunakan senyawa

kimia EMS .............................................................................................................. 4

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Embrio hasil kultur antera cabai (C. annuum) dalam media dua lapis dan

perkembangan tanaman dari embrio yang dihasilkan ............................................. 4

2 Hasil analisis isozim: A. Peroksidase (PER); B. Aspartat Aminotransferase

(AAT); C. Esterase (EST) ........................................................................................ 5

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Komposisi larutan pewarna isozim PER, AAT, EST .............................................. 8

2 Keragaman pertumbuhan percabangan dan bentuk daun tanaman cabai (C.

annuum) pada hasil kultur antera yang dikombinasikan dengan mutagenesis

menggunakan senyawa kimia EMS ....................................................................... 9

Page 9: Induksi Mutasi Dengan Ems Dalam Kultur Antera Cabai Capsicum Annuum l.-libre

1

PENDAHULUAN

Cabai (Capsicum annuum L.) merupakan

salah satu komoditas tanaman sayuran

terpenting di Indonesia dinilai dari segi

ekonomi dan produksinya. Pada tahun 2010,

luas areal pertanaman cabai mencapai 237 105

ha dengan produktivitas rata-rata 5.60 ton/ha

(BPS 2011). Produktivitas tersebut masih jauh

lebih rendah dari potensi produktivitas cabai

yang dapat mencapai 13 ton/ha (Syukur et al.

2010). Rendahnya produktivitas disebabkan

oleh rendahnya penggunaan benih yang

unggul, budidaya tanaman belum intensif,

perubahan iklim, serangan hama/penyakit

yang tinggi (Pitojo 2003). Oleh karena itu

diperlukan usaha untuk meningkatkan

produktivitas tanaman cabai melalui

pengembangan kultivar lokal Indonesia.

Pengembangan tanaman cabai kultivar

lokal dapat dilakukan melalui pemuliaan

tanaman yang memerlukan galur murni

dengan tingkat keseragaman genetik yang

tinggi. Tanaman galur murni telah mampu

dihasilkan baik melalui penyerbukan sendiri

secara terkendali yang membutuhkan 7 – 8

generasi maupun melalui teknologi haploid.

Teknologi haploid melalui kultur in vitro

sudah dikembangkan dengan berbagai teknik

seperti kultur antera/mikrospora, kultur

ovari/ovul, dan eliminasi kromosom (Kothari

et al. 2010). Teknik ini merupakan cara efektif

dan cepat dalam menghasilkan tanaman

haploid ganda (HG) hanya dalam satu

generasi melalui kultur sel gamet (Ferrie et al.

1994). Tanaman HG tersebut merupakan hasil

penggandaan kromosom secara spontan

maupun hasil induksi menggunakan senyawa

kimia kolkisin (Supena et al. 2006b).

Kultur antera pada cabai yang pertama kali

berhasil adalah sistem kultur antera pada

media padat yang dikembangkan oleh Sibi et

al. (1979) dan selanjutnya diperbaiki oleh

Dumas de Vaulx et al. (1981). Prosedur yang

efisien untuk memproduksi tanaman HG cabai

kultivar lokal Indonesia telah dikembangkan

melalui kultur antera pada media dua lapis

(media cair di atas media padat) (Supena et al.

2006a). Metode ini selanjutnya diperbaiki

untuk meningkatkan kualitas embrio yang

dihasilkan (Supena & Custer 2011).

Pemuliaan tanaman membutuhkan

keragaman genetik yang tinggi sebagai materi

dasar. Keragaman genetik dapat diperoleh

melalui induksi mutasi dengan menggunakan

mutagen fisik maupun senyawa kimia.

Mutagen fisik yang biasa digunakan adalah

sinar-x dan sinar gamma, sedangkan mutagen

senyawa kimia diantaranya adalah kolkisin,

etil metan sulfonat (EMS), dan etilen oksida.

Proses perlakuan mutagenesis pada tanaman

dapat dilakukan pada benih, sel somatik, dan

sel gamet, secara in vivo atau in vitro (Kothari

2010). Induksi mutasi pada jaringan somatik

baru akan menghasilkan mutan yang stabil

pada 3 – 5 generasi (Szarejko & Forster

2007). Mutasi yang terjadi pada tanaman

dapat dilihat dari perubahan sifat morfologi,

anatomi, isozim atau protein, dan urutan basa

DNA.

Perlakuan mutasi dengan EMS dapat

menyebabkan terjadinya substitusi nukleotida

pada DNA. Oleh karenanya, mutasi yang

diinduksi EMS berupa mutasi titik, sehingga

dapat menghasilkan keragaman hasil mutasi

yang luas (Sega 1984).

Kombinasi teknologi haploid dengan

mutagenesis perlu dikembangkan untuk

mendapatkan keragaman genetik dan

perbaikan sifat tanaman secara cepat.

Kombinasi mutasi secara fisik menggunakan

radiasi sinar-x atau sinar gamma dengan

kultur antera telah dilakukan untuk tujuan

pemuliaan pada padi (Chen 2001). Mutasi

menggunakan senyawa EMS yang

dikombinasikan dengan kultur antera juga

telah dilaporkan untuk tanaman Nicotiana

tabacum (Medrano et al. 1986) dan padi (Lee

& Lee 2002).

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui

pengaruh EMS terhadap kapasitas

embriogenesis pada kultur antera cabai dan

kemampuannya dalam menginduksi mutasi

yang diamati dari keragaman sifat morfologis

dan isozim tanaman haploid dan haploid

ganda yang dihasilkan.

BAHAN DAN METODE

Bahan Kimia dan Alat

Bahan kimia yang digunakan diantaranya

adalah bahan untuk membuat media dua lapis

(Supena et al. 2006a), larutan EMS, media

kultur MS (Murashige & Skoog 1962), media

tanam di lapangan, AgNO3, gel pati, pewarna

isozim peroksidase, esterase, dan aspartat

aminotransferase. Alat yang digunakan adalah

Laminar Air Flow Cabinet, inkubator, cawan

petri diameter 6 cm, alat elektroforesis isozim

dan peralatan umum laboratorium yang

terdapat di PPSHB-IPB.

Bahan Tanaman dan Sumber Antera

Bahan tanaman yang digunakan pada

penelitian ini adalah tanaman cabai haploid

ganda „Tombak‟ hasil penerapan teknologi haploid (Supena et al. 2006a). Benih cabai

Page 10: Induksi Mutasi Dengan Ems Dalam Kultur Antera Cabai Capsicum Annuum l.-libre

2

disterilisasi dalam NaOCl 2% selama 10

menit, kemudian dibilas 3 kali dalam akuades.

Benih ditanam dalam polibag berisi media

tanam berupa tanah, kasting, arang sekam

(1:1:1), dengan setiap polybag berisi 2 benih

cabai dengan pengaturan jarak antar benih.

Perawatan tanaman dilakukan dengan

penyiraman setiap pagi dan sore hari,

pemberian pupuk NPK, kompos serta

penyemprotan pestisida hanya ketika terjadi

serangan hama. Setelah 3-4 bulan, kuncup

bunga sumber antera dapat dipanen dan

digunakan sebagai eksplan pada kultur antera.

Penanaman cabai dan pemeliharaannya

dilakukan pada lahan terbuka di Pusat

Penelitian Sumberdaya Hayati dan

Bioteknologi IPB Darmaga, Bogor.

Praperlakuan dan Perlakuan Etil Metan

Sulfonat

Kuncup bunga dengan ciri-ciri panjang

mahkotanya sama dengan atau sedikit lebih

panjang dari kelopaknya digunakan sebagai

sumber eksplan. Sumber eksplan tersebut

diberi praperlakuan berupa suhu 5–10oC

selama satu hari (Supena et al. 2006a). Setelah

praperlakuan, kuncup disterilisasi selama 1

menit dalam alkohol 70% dingin, kemudian

dibilas 2 kali dalam akuades steril dingin.

Selanjutnya disterilisasi selama 10 menit

dalam NaOCl 2% dengan penambahan

Tween-20 0.05% (v/v), kemudian dibilas 3

kali dalam akuades steril dingin. Kuncup

bunga dibuka dengan menggunakan pinset,

kemudian antera dipisahkan dari filamen,

putik dan kelopak bunga. Antera yang

dijadikan eksplan adalah yang terdapat warna

keunguan pada ujung anteranya sebagai

penciri mikrospora pada fase inti tunggal

akhir (Supena et al. 2006a). Perlakuan antera

adalah perendaman dalam EMS pada

konsentrasi 0.1% dan 0.5% selama 1, 3, dan 6

jam, serta kontrol tanpa perlakuan.

Prosedur Kultur Antera Cabai

Antera yang telah melalui proses

perlakuan maupun kontrol, dikulturkan pada

media dua lapis, media cair di atas media

padat dengan komposisi media Nisch (Nisch

& Nisch 1969) dengan penambahan maltosa

20 g/l. Untuk media padat ditambahkan arang

aktif 10 g/l dan agar-agar Gelrite 2 g/l.

Antibiotik timentin 50 mg/ml dan rifampisin 5

mg/ml ditambahkan pada media cair saat

kultur (Supena et al. 2006a). Kultur

diinkubasi pada suhu 5–10oC selama

seminggu kemudian dilanjutkan dengan suhu

inkubasi 25–28oC selama 7-8 minggu,

inkubasi dilakukan dalam kondisi gelap.

Embrio hasil kultur antera diamati jumlah dan

kondisinya.

Perkecambahan dan Pertumbuhan

Tanaman

Embrio dewasa lengkap dengan kotiledon,

hipokotil dan radikula dipindahkan pada

media padat MS ½ konsentrasi (Murashige &

Skoog 1962), sukrosa 20 g/l dan 6-

benzylaminopurin (BAP) 0.1 µM, dipadatkan

dengan gelrite 2 g/l. Kultur diinkubasi pada

suhu 25–280C dengan penyinaran selama 16

jam dengan intensitas 2000-3000 lux. Bibit

yang telah berdaun 4-5 helai dan memiliki

perakaran yang baik dipindahkan ke dalam

botol plastik bening tertutup berdiameter 8 cm

dan tinggi 11 cm dengan campuran tanah,

kasting dan arang sekam (1:1:1). Tanaman

pada stadium berdaun 5-6 helai diaklimatisasi

dan ditanam dalam polybag di rumah kaca.

Keragaman sifat morfologis berdasarkan

IPGRI (1995), yaitu warna batang, bentuk

batang pertumbuhan percabangan, dan bentuk

daun diamati untuk mengetahui perubahan

yang dihasilkan melalui induksi mutasi

dengan EMS.

Pengamatan jumlah kloroplas per stomata

dilakukan untuk mengetahui tingkat ploidi

tanaman yang dihasilkan (Supena et al.

2006b). Daun kelima dari tunas lateral diambil

dan dibuat irisan paradermal menggunakan

silet tajam sehingga diperoleh lapisan

epidermis yang tipis. Untuk mewarnai

kloroplas dalam stomata sehingga mudah

dihitung digunakan larutan AgNO3 1% (Qin

& Rotino 1995). Preparat kemudian diamati di

bawah mikroskop dan difoto.

Analisis Isozim

Metode analisis isozim merupakan

modifikasi teknik Wendel dan Weeden

(1989). Tahapan kegiatan analisis terdiri atas

pembuatan bufer, pembuatan gel pati,

ekstraksi enzim, elektroforesis, pewarnaan,

pencucian, dan dokumentasi. Bufer gel dibuat

dari L-Histidin monohidrat 1.048 g/l dalam

aquades pada pH 6.0 dengan Tris. Bufer

elektroda dibuat dari 10.5507 g/l asam sitrat

monohidrat dan 18.1650 g/l Tris hidroksimetil

aminometan dalam aquades pada pH 6.0.

Bufer ekstrak sebanyak 40 ml dibuat dari L-

asam askorbat 0.07045 g, L-sistein 0.1939 g,

Triton-X-100 0.12 ml, PVP-40 0.02 g, dan

0.54 g Na2HPO4.2H2O pada pH 7.0. Gel

dibuat dari pati kentang dengan konsentrasi

12%, dan selanjutnya dicetak menggunakan

cetakan gel.

Page 11: Induksi Mutasi Dengan Ems Dalam Kultur Antera Cabai Capsicum Annuum l.-libre

3

Sampel daun tanaman sebanyak 1 g, bufer

ekstrak 1.0 ml dan pasir kuarsa digerus dalam

mortar hingga halus. Ekstrak sampel diserap

menggunakan kertas saring, kemudian

dimasukkan dalam sumur yang ada pada gel.

Cetakan gel berisi ekstrak dimasukkan dalam

alat elektroforesis yang sudah ditambahkan

bufer elektroda. Elektroforesis sampel

dilakukan dalam ruang pendingin dengan

tegangan awal 50 volt selama 1 jam, dan

selanjutnya dinaikkan pada tegangan 100 volt

selama 4–5 jam. Setelah elektroforesis, gel

dikeluarkan dari cetakan dan dibelah secara

horizontal dengan ketebalan 1.5–3.0 mm, dan

selanjutnya diwarnai. Pewarna yang

digunakan adalah untuk isozim peroksidase,

esterase, dan aspartat aminotransferase.

Setelah isozim terwarnai secara optimal, gel

dicuci dengan air mengalir, dan selanjutnya

diamati pola pita isozim yang terbentuk pada

gel dan difoto.

HASIL

Embriogenesis Mikrospora

Embriogenesis mikrospora melalui kultur

antera yang dikombinasikan dengan induksi

mutasi menggunakan EMS berhasil dilakukan

pada penelitian ini. Konsentrasi EMS dan

lama perendaman antera berpengaruh

terhadap respon embriogenesis dan daya

kecambah embrio hasil kultur. Respon

embriogenesis terbesar dimiliki pada

perlakuan perendaman EMS konsentrasi 0.1%

selama 6 jam sebesar 40.1%, sedangkan pada

perendaman EMS konsentrasi 0.5% selama 1

jam tidak terjadi respon embriogenesis (0%)

(Tabel 1).

Rata-rata embrio lengkap per kuncup

bunga terbanyak yang dapat dihasilkan juga

diperoleh pada perlakuan EMS 0.1% selama 6

jam yaitu 1.9 embrio, sedangkan pada

perlakuan EMS 0.5% selama 6 jam tidak

dihasilkan embrio (Tabel 1). Embrio yang

dapat berkecambah terbanyak juga diperoleh

dari perlakuan EMS 0.1% selama 6 jam.

Embrio lengkap hasil kultur antera memiliki

ciri yaitu terdapat kotiledon, hipokotil dan

radikula (Gambar 1a) dan dapat tumbuh

dengan baik pada media perkecambahan

(Gambar 1b) yang selanjutnya berkembang

menjadi tanaman utuh (Gambar 1c). Embrio

tidak lengkap memiliki ciri mempunyai

radikula dan hipokotil tetapi tidak terdapat

kotiledon (Gambar 1d), sehingga tidak

mampu tumbuh dan berkembang dengan baik

pada media perkecambahan (Gambar 1e).

Morfologi dan Anatomi Tanaman Hasil

Kultur Keragaman sifat morfologi tanaman cabai

hasil kultur terlihat dari warna batang, bentuk

batang, pertumbuhan percabangan, dan bentuk

daun (Tabel 2). Perlakuan EMS 0.1% selama

3 jam menghasilkan keragaman pada warna

batang, bentuk batang, pertumbuhan

percabangan, dan bentuk daun (Tabel 2).

Namun keragaman tersebut ditunjukkan juga

oleh perbedaan tingkat ploidi tanaman.

Perlakuan EMS 0.1% selama 6 jam

menghasilkan keragaman morfologi berupa

bentuk daun deltoid (Tabel 2).

Jumlah kloroplas pada stomata tanaman

menunjukkan tingkat ploidi yang dimiliki oleh

tanaman tersebut. Tanaman pada perlakuan

EMS 0.1% selama 3 jam memiliki rata-rata

jumlah kloroplas sebesar 9.6 termasuk jenis

tanaman haploid. Sedangkan pada tanaman

lainnya termasuk jenis tanaman haploid ganda

atau diploid (Tabel 2).

Tabel 1 Hasil respon embriogenesis antera cabai (C. annuum) pada metode kultur antera yang

dikombinasikan dengan mutagenesis menggunakan senyawa kimia EMS

Keterangan: *= 1 kuncup bunga (5-6 antera) per Petri;

**= dari jumlah Petri tidak terkontaminasi;

***= dari kultur hidup.

Perlakuan

Total

kultur*

(Petri)

Kultur

hidup**

(%)

Kultur respon

embryogenesis***

(%)

Rata-rata embrio

lengkap per

kuncup bunga

Rata-rata embrio

berkecambah per

kuncup bunga

Kontrol 35 79.2 13.1 0.7 0.3

EMS 0.1%; 1 jam 25 66.7 33.3 1.2 0.3

EMS 0.1%; 3 jam 25 82.4 13.3 1.7 0.7

EMS 0.1%; 6 jam 25 94.4 40.1 1.9 1.7

EMS 0.5%; 1 jam 26 73.3 0.0 0.0 0.0

EMS 0.5%; 3 jam 29 66.7 5.6 0.3 0.3

EMS 0.5%; 6 jam 23 57.1 13.3 0.5 0.0

Page 12: Induksi Mutasi Dengan Ems Dalam Kultur Antera Cabai Capsicum Annuum l.-libre

4

Gambar 1 Embrio hasil kultur antera cabai (C. annuum) dalam media dua lapis dan perkembangan

tanaman dari embrio yang dihasilkan : a–b. embrio lengkap dan embrio tumbuh dan normal

berkecambah; c. tanaman HG Tombak hasil kultur antera dalam media dua lapis; d–e. embrio

tidak lengkap dan embrio yang tidak dapat tumbuh dan berkecambah. Garis skala: a dan d = 2 mm,

b dan e = 1 cm, c = 5 cm.

Keragaman Isozim

Hasil visualisasi pola pita isozim

peroksidase terlihat adanya perbedaan di

bagian negatif pada sumur ke 4 dan 8 (gambar

2A), yang masing-masing adalah perlakuan

EMS 0.1% selama 1 jam dan EMS 0.1%

selama 6 jam (tidak berkembang menjadi

tanaman lengkap). Kedua tanaman mengalami

ekspresi berlebih enzim peroksidase di bagian

negatif.

Pada Isozim aspartat aminotransferase

(AAT), tidak terdapat adanya pita yang

terbentuk di sumur 5, 7 dan 8 (Gambar 2B),

yang masing-masing adalah perlakuan EMS

0.1% selama 3 jam, EMS 0.1% selama 6 jam

pada tanaman 2 dan yang tidak berkembang

menjadi tanaman lengkap. Pada Isozim

esterase memperlihatkan adanya 3 pita pada

setiap kontrol, sedangkan pada seluruh

perlakuan hanya terdapat 2 pita yang

terbentuk (gambar 2C).

Tabel 2 Keragaman morfologi dan anatomi tanaman cabai (C. annuum) kontrol dan hasil kultur

antera yang dikombinasikan dengan mutagenesis menggunakan senyawa kimia EMS

No. Perlakuan Warna

batang

Bentuk

batang

Pertumbuhan

percabangan

Bentuk

daun

Jumlah

kloroplas*

Tingkat

ploidi

1 Kontrol Biji 1 Hijau Persegi Tegak Ovate 14.0 ± 1.2 2n

2 Kontrol Biji 2 Hijau Persegi Tegak Ovate 16.0 ± 2.5 2n

3 Kontrol Kultur Hijau Persegi Tegak Ovate 14.4 ± 1.8 2n

4 EMS 0.1%, 1 jam Hijau Persegi Tegak Ovate 14.6 ± 2.1 2n

5 EMS 0.1%, 3 jam Hijau

bergaris

ungu

Silindris Prostate Panjang

dan

ramping

9.6 ± 1.8 n

6 EMS 0.1%, 6 jam

(tanaman 1)

Hijau Persegi Tegak Deltoid 15.6 ± 1.1 2n

7 EMS 0.1%, 6 jam

(tanaman 2)

Hijau Persegi Tegak Deltoid 12.3 ± 2.5 2n

Keterangan: * Jumlah kloroplas per sel penjaga berdasarkan analisis terhadap 30 stomata dari

tiga daun.

a

d

b

e c

Page 13: Induksi Mutasi Dengan Ems Dalam Kultur Antera Cabai Capsicum Annuum l.-libre

5

Keterangan :

1. Kontrol berasal dari biji 1

2. Kontrol berasal dari biji 2

3. Kontrol berasal dari hasil kultur

4. EMS 0.1%, 1 jam

5. EMS 0.1%, 3 jam

6. EMS 0.1%, 6 jam (Tanaman 1)

7. EMS 0.1%, 6 jam (Tanaman 2)

8. EMS 0.1%, 6 jam (tidak

berkembang menjadi tanaman

lengkap)

Gambar 2 Hasil analisis isozim: A. Peroksidase (PER); B. Aspartat Aminotransferase (AAT);

C. Esterase (EST).

PEMBAHASAN

Metode kultur antera cabai haploid ganda

Tombak pada media dua lapis telah berhasil

dikombinasikan dengan teknik induksi mutasi

menggunakan etil metan sulfonat (EMS) pada

penelitian ini. Induksi mutasi menggunakan

EMS pada konsentrasi 0.1% dan 0.5% dengan

lama waktu perendaman 1, 3, dan 6 jam

berpengaruh terhadap embrio lengkap yang

dihasilkan dan embrio yang mampu

berkecambah per kuncup bunga, serta

keragaman morfologi dan isozim yang

dihasilkan.

Perlakuan EMS konsentrasi 0.1%

meningkatkan respon embriogenesis, rata-rata

embrio lengkap dan embrio berkecambah

yang dihasilkan, sebaliknya perlakuan EMS

0.5% menurunkan respon embriogenesis,

rata-rata embrio lengkap, dan embrio

berkecambah yang dihasilkan. Mikrospora

sebagai target dalam kultur antera memiliki

sensitifitas terhadap perlakuan mutagen

(Szarejko dan Forster 2007). Konsentrasi dan

lama perendaman tertentu dalam EMS dapat

berpengaruh pada peningkatan dan penurunan

respon embriogenesis mikrospora. Hal ini

sejalan dengan hasil penelitian Medrano

(1986), yaitu semakin tinggi konsentrasi EMS

yang digunakan dapat menurunkan jumlah

tanaman haploid hasil kultur antera tembakau.

Pengaruh EMS terhadap kultur antera

cabai pada penelitian ini berhasil menginduksi

terjadinya mutasi yang ditandai adanya

keragaman morfologi pada tanaman yang

dihasilkan. Masing-masing tanaman hasil

kultur dengan perlakuan EMS memberikan

keragaman morfologi yang berbeda-beda.

Keragaman sifat morfologi terlihat pada

bentuk daun hasil perlakuan EMS 0.1%

selama 3 dan 6 jam. Hal ini sejalan dengan

penelitian Jabeen & Mirza (2004) yang

menyatakan bahwa EMS dapat menginduksi

keragaman morfologi pada cabai.

Untuk variasi sifat bentuk daun yang

panjang dan ramping hasil perlakuan EMS

0.1% selama 3 jam, dapat dimungkinkan

akibat perbedaan tingkat ploidi tanaman yang

dihasilkan. Menurut Supena et al. (2006b)

bahwa pada tanaman cabai haploid kultivar

Galaxy memiliki ciri sifat morfologi berupa

ukuran tanaman lebih rendah dengan bentuk

C

+

_

+

+

_

1 2 3 4 5 6 7 8

C

A B

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8

Page 14: Induksi Mutasi Dengan Ems Dalam Kultur Antera Cabai Capsicum Annuum l.-libre

6

daun lebih ramping dan kecil dibandingkan

dengan tanaman HG maupun diploid.

Keragaman pola pita pada isozim PER,

AAT, dan EST yang terlihat dari bertambah

dan berkurangnya pita yang terbentuk,

menunjukkan telah terjadi mutasi akibat

perlakuan EMS. Pita isozim yang tidak

terbentuk karena terjadi inaktivasi terhadap

enzim akibat perubahan asam amino yang

terbentuk pada tanaman. Keragaman pola pita

isozim dapat menunjukkan perubahan pada

tingkat protein yang secara tidak langsung

menggambarkan telah terjadi perubahan DNA

akibat mutasi oleh EMS (Medrano et al. 1986)

Perbedaan pola pita isozim EST pada

tanaman kontrol dan hasil perlakuan EMS

dapat dijadikan penanda pada tanaman cabai

yang mengalami mutasi. Penggunaan isozim

untuk mengetahui terjadi mutasi pada tingkat

gen didasarkan bahwa pengujian terhadap

isozim dapat menunjukkan perbedaan hingga

tingkat varietas pada berbagai tanaman, antara

lain kedelai (Cahyarini et al. 2004), jarak

pagar (Yunus 2007), kelapa (Runtunuwu &

Lengkong 2005), dan nenas (Hadiati &

Sukmadjaja 2002).

Variasi tingkat ploidi dapat terjadi pada

embrio dan tanaman hasil kultur antera dalam

sistem media dua lapis. Tanaman dari embrio

yang dihasilkan memiliki tingkat ploidi

haploid dan haploid ganda. Untuk

menentukan tingkat ploidi tanaman dilakukan

penghitungan jumlah kloroplas per sel penjaga

pada stomata daun. Hal ini sejalan dengan

penelitian Supena et al. (2006a), bahwa rata-

rata jumlah kloroplas per stomata pada cabai

varietas Tombak untuk tanaman haploid (n)

dan haploid ganda (2n) masing-masing adalah

8.9 dan 15.8.

Metode kultur antera cabai yang berhasil

dikombinasikan dengan mutagenesis ini telah

dapat menghasilkan tanaman haploid ganda

dengan sifat tertentu yang berbeda hanya

dalam satu generasi. Oleh karena itu,

kombinasi teknik ini berpotensi untuk

digunakan dalam perbaikan genetik dan sifat

morfologi maupun sifat agronomis tertentu

tanaman cabai kultivar lokal Indonesia secara

cepat.

SIMPULAN

Perlakuan perendaman antera sebelum

kultur dengan etil metan sulfonat (EMS)

mempengaruhi respon embriogenesis dan

produksi embrio lengkap pada kultur antera

cabai menggunakan sistem media dua lapis.

Perendaman EMS 0.1% dapat meningkatkan

kapasitas embriogenesis, sedangkan EMS

0.5% menurunkan kapasitas embriogenesis.

Perlakuan EMS 0.1% selama 6 jam tidak

hanya dapat menginduksi mutasi, tetapi juga

meningkatkan respon embriogenesis, rata-rata

embrio lengkap, dan rata-rata embrio

berkecambah. Mutasi yang terjadi dapat

dideteksi pada tanaman yang berasal dari

kultur antera pada sifat morfologi daun dan

batang, serta isozim PER, AAT, dan EST.

SARAN

Pengamatan terhadap tanaman mutan

generasi ke-2 hasil kombinasi kultur antera

dan EMS perlu dilakukan untuk melihat

kestabilan hasil mutasi. Pengujian EMS

dengan taraf konsentrasi yang lebih banyak

antara 0.01 – 0.1% dengan waktu perendaman

1 – 6 jam perlu dilakukan untuk mengetahui

perlakuan optimal yang dapat menginduksi

mutasi tetapi juga berpengaruh positif

terhadap kapasitas embriogenesis kultur

antera cabai.

DAFTAR PUSTAKA

[BPS] Badan Pusat Statistik. 2011. Produksi

Cabai Indonesia. Jakarta: BPS.

Cahyarini RD, Yunus A, Purwanto E. 2004.

Identifikasi keragaman genetik beberapa

varietas lokal kedelai di Jawa berdasarkan

analisis isozim. Agrosains 6: 79-83.

Chen QF, Wang CL, Lu YM, Shen M, Afza

R, Duren MV, Brunner H. 2001. Anther

culture in connection with induced

mutations for rice improvement. Euphytica

120: 401-408.

Dumas de Vaulx R, Chambonnet D, Pochard

E. 1981. Culture in vitro d‟anthères du piment (Capsicum annuum L.):

amélioration des taux d‟obtention de plantes chez différent genotypes par des

traitements à +35oC. [Abstract in English].

Agronomie 1: 859–864.

Ferrie AM, Palmer CE, Keller WA. 1994.

Biotechnological application of haploids.

Di dalam: Shargool PD & Ngo TT,

editors. Biotechnological Applications of

Plant Cultures. Baca Raton: CRC Press.

Hadiati S, Sukmadjaja D. 2002. Keragaman

pola pita beberapa aksesi nenas

berdasarkan analisis isozim. J Bioteknol

Pertan 7: 62-70.

[IPGRI] International Plant Genetic Resources

Institute. 1995. Descriptors for Capsicum

spp. Roma: IPGRI.

Page 15: Induksi Mutasi Dengan Ems Dalam Kultur Antera Cabai Capsicum Annuum l.-libre

7

Jabeen N, Mirza B. 2004. Ethyl methane

sulfonate induces morphological mutations

in Capsicum annuum. Int J Agri Biol

6:340-345.

Kothari SL, Joshi A, Kachhwaha S, Ochoa-

alejo N. 2010. Chilli peppers – A review

on tissue culture and transgenesis.

Biotechnol Adv 28: 35-48.

Lee JH, Lee SY. 2002. Selection of stable

mutants from cultured rice anthers treated

with ethyl methane sulfonic acid. Plant

Cell Tiss Org Cult 71: 165-171.

Medrano H, Millo EP, Guerri J. 1986. Ethyl

methane sulphonate effect on anther

cultures of Nicotiana tabacum. Euphytica

35: 161-168.

Murashige T, Skoog F. 1962. A revised

medium for rapid growth and bioassays

with tobacco tissue culture. Physiol Plant

15:473-497.

Nisch JP, Nisch C. 1969. Haploid plants from

pollen grains. Science 163: 85-87.

Pitojo S. 2003. Benih Cabai. Yogyakarta:

Kanisius.

Qin X, Rotino GL. 1995. Anther culture of

several sweet and hot pepper genotypes.

Capsicum Eggplant Nwsl 12: 59-62.

Runtunuwu SD, Lengkong EF. 2005.

Identifikasi penanda isozim (PER-7, PER-

8, dan RAPD OB17375) pada kelapa genjah

salak (GSK) dan beberapa hasil

silangannya dengan kelapa dalam.

Eugenia 11: 8-17.

Sega GA. 1984. A review of the genetic

effects of ethyl methanesulfonate. Mutat

Researc 134: 113-142.

Sibi M, Dumas de Vaulx R, Chambonnet D.

1979. Obtention de plantes haplöides par

androgenèse in vitro chez le piment

(Capsicum annuum L.). [Abstract in

English]. Ann Amélior Plantes 29: 583-

606.

Supena EDJ, Suharsono S, Jacobsen E,

Custers JBM. 2006a. Succesful

development of a shed-microspore culture

protocol for doubled haploid production in

Indonesian hot pepper (Capsicum annuum

L.). Plant Cell Rep 25: 1-10.

Supena EDJ, Muswita W, Suharsono S,

Custers JBM. 2006b. Evaluation of crutial

factors for implementing shed-microspore

culture of Indonesian hot pepper

(Capsicum annuum L.) cultivars. Sci

Hortic 107: 226-232.

Supena EDJ, Custers JBM. 2011. Refinement

of shed-microspore culture protocol to

increase normal embryos production in hot

pepper (Capsicum annuum L.). Sci Hortic

130: 769-774.

Syukur M, Sujiprihati S, Yunianti R,

Kusumah DA. 2010. Evaluasi daya hasil

cabai hibrida dan daya adaptasinya di

empat lokasi dalam dua tahun. J Agron

Indo 38: 43-51.

Szarejko I, Forster BP. 2007. Doubled

haploidy and induced mutation. Euphytica

158: 359-370.

Wendel JF, Weeden NF. 1989. Visualization

and intrepretation of plant isozymes. Di

dalam: Soltis DE, Soltis PS (editor)

Isozymes in Plant Biology, Ed ke-4,

Oregon: Dioscorides Press. hlm: 5-45.

Yunus A. 2007. Identifikasi keragaman

genetik jarak pagar ( Jatropha curcas L.)

di Jawa Tengah berdasarkan penanda

isoenzim. Biodiversitas 8: 249-252.

Page 16: Induksi Mutasi Dengan Ems Dalam Kultur Antera Cabai Capsicum Annuum l.-libre

LAMPIRAN

Page 17: Induksi Mutasi Dengan Ems Dalam Kultur Antera Cabai Capsicum Annuum l.-libre

8

Lampiran 1 Komposisi larutan pewarna isozim PER, AAT, EST (Wendel &

Weeden 1989).

1. Pewarna Peroksidase (PER)

Natrium asetat pH 5.0 100 ml

CaCl2 60 mg

3-amino-9 etilkarbasol 60 mg

Aseton/N,N-Dimethylformamid 5 ml

H2O2 3% 0.5 ml

2. Pewarna Aspartat Aminotransferase (AAT)

Bufer substrat AAT pH 7.4 50 ml

H2O 800 ml

α-Asam ketoglutarat 292 mg

L-Asam aspartat 1.07 g

PVP-40 4.00 g

EDTA, Na2 salt 400 mg

Sodium fosfat 11.36 g

Fast blue BB salt 50 mg

3. Pewarna Esterase (EST)

Sodium fosfat pH 7.0 100 ml

1-Naftil asetat 50 mg

2-Naftil asetat 50 mg

Aseton 5 ml

Fast blue RR salt 50 mg

Page 18: Induksi Mutasi Dengan Ems Dalam Kultur Antera Cabai Capsicum Annuum l.-libre

9

Lampiran 2 Keragaman pertumbuhan percabangan (a dan b) dan bentuk daun (c,

d, dan e) tanaman cabai (C. annuum) pada hasil kultur antera yang

dikombinasikan dengan mutagenesis menggunakan senyawa kimia EMS

Keterangan: a = Pertumbuhan percabangan tegak

b = Pertumbuhan percabangan prostate

c = Bentuk daun panjang dan ramping

d = Bentuk daun ovate

e = Bentuk daun deltoid

a b

c d e