rdna technology

22
CHAPTER RECOMBINANT DNA TECHNOLOGY 35 FOCUS 5 DNA cutting and restriction enzymes 5 Vectors 5 Clonings DNA fragments 5 Clone identification 5 Genetic engineering 5 Applications of genetic engineering Recombinant DNA technology (rDNA technology), also known as genetic engineering, is the biochemical manipulation of DNA which enables us to isolate, analyze and form recombinant DNA molecules at will. Molecular biology in the 1970s addressed the issues pertaining to biochemical and information approaches to the central problems of classical genetics. In experimental genetic studies, transfer of genetic information had to be carried out by living organisms, usually by sexual reproduction. It is however, now possible to transfer genetic material from any source to a plasmid (vector), an extrachromosomal element of bacteria, or to a virus. The DNA may be cloned and replicated in a bacterial cell. Genetic recombination, which consists essentially of breakage and re-joining of DNA molecules, is of fundamental importance to all living organisms. It is the basis of the science of genetics and has been exploited to great social benefit by plant and animal breeders. Manipulation of genetic crosses in bacteria and their viruses has been of paramount importance and recombination lies at the core of genetic engineering. It has been recognized that genetic engineering techniques can be successfully applied to animals, plants, and micro- organisms. The applications of these techniques have been used to carry new genes into human and plant chromosomes, providing therapy for genetic diseases and a means to improve crop plants. Animals can be used to generate specific genetic material as spare parts for human use. There is growing awareness about the vast potential of rDNA technology.

Upload: suresh-mg

Post on 05-May-2017

230 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

� � � � � � �

����� � ��� �

���� ���

��

� � � �

� ����������� ����������������

� �������

� ������������������

� ����� �������

� ������������

� �������������������������

��������� ��������������� �������������������������������������������������������������

������������ �������������������������������������������������� �������������������

!����������������������"#$%������������������������������������������������������������������

������������������������������������� �&��'�����������������������������������������������������

����������������������(������������������������'�������������� �&���������(�������������������������

����������������������������������������(����������'��������������������������������������(����

)��� ������������������������������������������

*��������������������������������������������������������+,�������� �������������������

�������������������������(���������� �&�������������������������������������������������'�������

������������������������������������������ �!������������������������������������������

(�������������������������������������������������������������������������������� �&����

���������������������������������������-���������������������������������������������������+

������� �)���������������������������-�����(����������������������������������������

����������������(����������������������������������������������(����������� �����������

������������������������������������������ ��� �������������� �)������������������������������

(��������������� ������������

��� ����������

���� � ������� ��� ����������� �� ����

.���(������������������������������������� �������������������������� �!�����������������

�(��(��������������+,�������� ���������������������������������������������� �/�����������+

�-������������������������������������������������������������������������������������������������

������������������������(�� �)��������-���������������������������������������������������������� �)��

�����-������������������������������������������������������������������������������������������

������� �����������������������������������������������+������� �)���������-��������+������

����-�����������������������������������������������0������������(����������

��� !"�# $�%%&'��'()("* (�#

.���������������������������������� ����������������� �����������������.������1������� ���

��������������+������������������������������������������ �&������� ����'��������+���������

�������������������������'���� �&����������������������������������������������������������

�����������������������������������������������������������������������������������������������������

���� �&���������(�(����������������������������������������������������������������������������-����

�������������2���������������������������������������������������������������������(�������(����������

������������������ �)�����������������������������������������������������������������������������

���������������������������������������������������������������������� ����������������

)������������������������������������������������������������������������������������� ����

�&� $(" (�#��#'�#+"%&*�&�

����������������������������������������������(����������������������� �)�������� ���������

����������������������������������������������������� �� �)�������� ���������������������������

����������������������������������������������������������������������-����������������� ��������+

����������������� �)�������������������������������(�������������3�������������� ������

���������������������4+�����������������������������5+�������������� �)�����'������������������

���(�(������������������������������������������������

�$�,&$ (&��*#'� �-&#"%* +$&

����������������������������(�����������"#4%� �)������������������������������������������� ��

����������������������������������������������������� ���������������������� ����������������

���������������(���������������������(���������� ������������������� �)���������������(�����

����������������������������'� �������-���������������������������-������������������������+

��������������'�������������(�������������������������������������� �� �)�������������������������

������������������������������������������-���� �������6%%��������������������(�����������(�������

���������������������������7%�������������-����� �8���(�������������������������������+��������

������������ ������������������� �)�������������������������������������(���������������

������� ��������

�� ������� ������������ ������������� �������

�� ���������������9������ ��������������������������������

9� ��������:�����;

��� �� ���!��"������������� ������ ���������;

������ �����

#� ������������� ���������$����� ������������� ���������$�����

%� <&�"��=�<���'��<���>��<���:( <&�"�=�<����(��)�� �(((��<�����((�����

���������������������� ���

������������*!"����������� � ��"�$��������� ����� ��� � ��� ���" ������ ����������$�������

����� ��"���������!���������� ������� ������������"��������"��! ����� ����������� �����������

���������������� �������������� ���� ��"����$�������"��?��������$������"�"�!��������������

������������*!"�������"�����"�������� ��������� ����������� ��� � ������!�� �����*!"�� ��"

�����������������������'����������������������������������������������������������� ������

8������+���������������������������������������������������������������������� ������������

����������������������������(���� �������������������������������������������5����,�����������5�+

�-����1����-*�)�-�+,�� �)�������������� �����������������������-���������������������

����������������� �@��������������������������������� �����-����� �)������������������������ ��

�������� �&���������������������������������������������������������������������������������������

������������ ��������'��������������� ����A�� �,5 "���������������������������������������������

������������������������������������� ��������'������������ �������� ����+���������������������

�������� �����(��������� ������ ����������,����������������������������-���������������������

�A�� �,5 6� �+���� �����������������������,�������������������������������������+������������� �)���

����������������������������������������������������������� ����������������������+,����

���������������������������������������������������-���������(������������������������������

�������������� ���� ��

Fig. 35.1 Even breaks produced in double-stranded DNA by restriction endonucleases (Hae l, Hpa l).

+������������������ ���������������������������������������������-������������������������+

������������������� �����������������������������+,���� ���� ��������������������������(��

���������������������������������������������������������+,��������������������������(��

�(�����-���� �B������������� ���������������������������������������������������������������

�����������������������������������������������������������������������������(���� �)���������

������������������������������������������������� ������������������������������������ ��������

������������������,������������������������������������������������������������������������������

�������

���. /�����

&��� ��������������������������������������������������������� ��������������������������������

&�� ������������������������������������ ������������������������������������ �����������

��. ����������

����������������������������������������������������������� � ��������(������������������������������

�'�������������������������������������������(������������������������� �� �)���������

���������������������+������������������������ �)������������� �������������������(�����������+

����������������������������������������������(������������������������������������������������������������

������������������,�����

�0�("&��)�/&" �$��%&"+%&�

+�(�������������(������������������(������������������������ �)����������������������������������.

" )���(����������������������������������������������������������������������������������

������������

6 &������������������������������������������������������������������������������������� ��

�������������������

, )���(�������������������������������

7 )���(��������������(��������������������������������������������������'����������������

������������������������������������

5 )���(��������������������������������������������������������������������

)������������������������������������������������������������(�������������(�������������+

���(�������������������(����������������� ������������

�%*�-('��*��/&" �$�

�����������������������'��������������������������'� ����������������������������������������

Fig. 35.2 Target sites of EcoRI generating staggered fragments, which are joined by DNA ligase to formrecombinant DNA.

������������������������ ���

�������� �)��������������������� �)���������� �������������������������������������������+

����������������������������� �)�������������������������������(��������"����"%%�����������������

����(�� �/��������������������������������������(��������������� �)������������������!��������

��������������������������������������������!������������������"%������������������������ �-�����

����������(������������������������(���������������������������(�����������(�������������

��������� ���������������'�� �A�������������������(�������������������(�������

-�����������������+����������������+����+����������� ���+����+����������������������������

�������� �����������������,������������������������������������ �� ������������������+1�"%"��

1�"/" �+���+�����������������������������������������������������������������������06��

�07������

-���������(��������(����(������-������������������������������������-��������������� �&����

������������������������������������������������������������������������������������������������

���������������������� ������������������������������������������������������(�����������������

)������������������ ����������������������������������������������������� ���������������

�������������� �)���������������������������������������(������������������������������������+

��������������������������� �)�������������������������� ��������,������������������� �����

���������������������������������������� ������)�������������������������� ��������������

������������������������������������������������������

.����������'���������������������������������������+1"%"��������������������������������

�������������������������������������������� ����������� �1��(�����������������������������+

���������������������&��������������������������������������������������������������������������������

�A�� �,5 ,� � ���������� ������������������������������������������������������������������������

�������������������������� �)������������������������������� ��������(����������������������

�������������� �&����������'��������� ������������������������������������������������������

"� ��!��������� �������������������������������������������������������������������&����������+

��������������+1"%� �������������������������������������� ������������������������������������+

�����������������������������������������������������(��������������������������������������������

��������

/($+�&��*��/&" �$�

C�������������������������������������������(������� �@����������������������'���� �)�������

������������������������������������"6����������+������������������������������'�����

)�������� �������������������������������� ���������� ������,������������������������ �� �)��

����������������������� ����������������������������������������������������������������������+

������������������������������������������������������������������������� �)�������������(������������

����������������������� ��������������������� ���������������������������������� �)�����������������

�(����������������������������������� ��������������������������������������������������(+

�������������������

)������������� ����������������������������������������������������������#� �����������#����

������ �)���������������� ���������(��������������������������������(����������� ����������������

��������� ��������� ������������������� ��������������������������������������������

������������(�������������������������������������������������A�� �,5 7�

�$*#�,���#��(#��%*�-('�

+��������������������������� ����������������� ����������������������������������������������

��� �������� �������� ������� � A��� �'������ )�� �� ��� ��� �������� ���� ��� ����� �� ����� �������

��1 ����������

Fig. 35.3 Cleavage sites in a plasmid molecule where the endonuclease EcoRI breaks the circular duplex.Fragments of DNA from another source, obtained with the same enzyme, are joined using DNAligase to produce a recombinant plasmid.

��� ������������������������������ ���������(��������������� �� ������������ �)�����������

���������������������������������)+ ������������������������������������������������������� ��

���-('�

��(���������������������������������������������������������������������������������������)��

����� ��������������������������"6�����������������������(���������������������������������

���� �������������� �)������� ����������� ����������� �������������������� ����������� ���������

��������������������������A�� �,5 5� �)��� ������������������������'������������������������

����������������������������������������������������������������������������� �1����������������������

���������������� ������������������������� ����

�+2*$3� ("�/&0("%&�

.���(������������������(�������������������������������������������������������������������)���(������

������������������(����������������� ������+����(�����7%��+C7%�������������(��(���������������������

�����(���������������������� �)����(����������������������������������7 ,���������������������

�������

������������������������ ���

Fig. 35.4 Lambda phage DNA is inserted in E. coli DNA at specific site between galactose and biotin (galand bio) genes.

Fig. 35.5 Cosmid is a vector system that is constructed from regions of lambda phage DNA and a plasmid.

��� ����������

���� �� � ��� ������� ��

!���� ��������������������������+�������� �&��������������(������������������������(�������������

���������(�������������������(���������'������������������������������(���������������� �)��

(��������� ����������� ���������� ������� ������� �+������������ ������������������������������ ���

�������������������������������� �)������������������������� �������D�������������������������������

�������������������������������������������������������������������� �� �+��������������������

�� $����� ���������������������������������������'����(�����������������/�,66 �&�����������+���

�������������������������������������������������������������!-�

����������������)/)�

����������

��������������������������������������������A�� �,5 4�

Fig. 35.6 Restriction sites of plasmid vector pBR 322.

�������������������������������+1"%"�������������������������� ��������������%�������� ����

����������������������������������������������������� �� �D����������������������������(�

��������������������'�����������������/�,",�������(��(������+1"%"������������������������������

������������������������������� �)������������������������������������������������������������������

�������������������������������� �)�����������������������������������������������������������

������)�������������������������������������������������������������������������������������������

�����(���-��������������� ���������������������������������������������������������������

���������������������

+�(�����������������������������������������������������'�����������������8/"%"���,%,�����& �)��

�������������������������������������������������������������������������������������� ��

������������� ������������������������������������������������� �&����������'��������������������

������������������������������������������������������������������������� �+���������������������

������������������������������������������������������������������������������������ �)������

��������������������������������������-���������������'���������������������������� �� �8���

����������������'�������������������� �����������������������������������������������������������

����������

������������������������ ���

�0*4&��*��/&" �$�

����������������(�����������'��������(���������(�������(������������������+������������� ��

�����������������������������������������������������������(������������������(���� �)�����+

�������������������������� �����������������������������������������������������������������������

�������������'����������������������� �������������������������� �����������@���������������+

�������������(���������� ���������������������������������� �8���(������������������������

����� �����������(���������������������������������������������������������������(�������������+

�����������������������-���������������������������������������(����������� ��������������

����������&���������&&&

.�����������'�������������������������������������������������(��� �)����'����������+

�������������������������������� ��������������������������������������������������������������+

���������������������������������������������� �.���������������������������������������

������������������������������������������+�������������(�������������-��� �&����������������������

����������������������������� ���������������������������������������������������������������������+

���� ������������� �)������������������������� ����������������+������������� ������-������

���������

�$&,*$* (�#��)��%�#(#4�/&" �$�

&����������������������������������������� ������������������������ ������������������������

��� � ������������������������������������������������������������������������������������������

������������� �)���������� ����������������������������(�����������������������������������������

�������������������� ������������������������ ����������������������������������������

��������������������������������� ��������������������������'���� �)����������������������

��������������������������������������������������������������������������������� �����������

&����������������������������������������������������� �������������������� �������������

����������������������������������������������������� ���������������

����������������-�����(��������������������������������(����������������������������������

�����

����������� ���

)���������-����(��(���������������������������������������������������������������������������������

��������������������� ���������������������(����� � ����������������,�����������������,�������,�

������������������������5�������������������������������������� �������������� �A������������

,������������������� �����������������������������������������������������������������������+

����� �)������������������������������������������ ����

)���� ���������������������������������������������������������������������(����������������

��������������� �)��������������������������������������������������������������������������

�����-���������������!��!����� ����� �������������������������� ����������������������������������

������������������ ������������������'����������������� �)���������������������������������������+

��(������������������������������������-������������������-�������������������������������

�����

�� ��������� ��������� � �����

)���������������-��������������������������������� ����������������������������������

������������������� ���������(���������������������������������������������������������������

��5 ����������

������ �A��������������������������������������������� �������������������������� �A�������

�����������������������(������������������ �����������������������������������������������������������

�����������������������-��

&��!����� �����������&��������������������������� �����������������������������������,������������

������������������������������(������������������ ������ ��������������������� ������ ���

)����� ��������������'������������������������������������������������� ��+����������� �)��

�� �������������������������������(�������������������������-�������������������������������

���������� �)����� ���������������������������(���������� ������������������ ���-��������

& �)��������������������������������������������'���������������������

&�������� ������ ����������������������������������������������������������������������

�����������(�����������������������'� ������������������������������ ������������������������

��������������������������������� ����������������������������(����������������������(����������

��(��������������� �)������/����������"#4%��������������������������������������������������

������� �������+��������� �������������

-���������������������������������������-������������������������������������������������

����� ��� �)����������������������5�����,�������������������������������������������������

���������������� �� �������������������������������������������������(����������������������(��

������� �� �)����� ���������������������������������� ���-���������&�����������������(���

�� �������������'� ������ ������������������������������A�� �,5 $� �)���������������������������

������+"������������(������ ��������'���������� �)���� ����������������������)��������

���(�����,���������������������'����� �)����� �������������������������(������������������������

�������������������� ������������������������-����

�%�#(#4��6,&$(-&# �

1������'����������(�����������������(������������������� �D��������'���������/�,66����������

���������������������������������������������������������������������� �����-�����������������

��������������������������������������������������������������������� �D���������������������������������

��������������������������������������������� �&��������������������������������������������

�������(������������� ��������(������������� ���������������������������������'��������

������������������� �������(��������������������� ��������������������������������� ������(��+

�����A�� �,5 E�

)�����'��������������� ������������������������������������������������������������������������� ��

������������������ �B��������������������������������������������)������������������������������

���������������������������������������(����������������� ����A�� �,5 #� �)������������ �����

�������������������������������� ���������������������������������������������������������������

�������������������������� ���������������������������������������������� �+�������������

�����������������������������

&������������������������������������������������������������������������������������������������

����������������������������� �������������������� ��������� �1�����������������������

�����-���������������������������������������-��������������������������������������������������+

�����+����������������������������������������������������������

)�������������������������������������������'����������� �����-�������������������������������

�������������������������������������������������������������(����������������� �)������������������

����������������� ������������������ �.�����������������������������������-���

������������������������ ��7

�&%&" (�#��)��%�#&��8( 0��#�&$ �� �

�������������������������������������������� ������������������������ �)�����������(��(�����������

������������������������������������(��� �)�������� ��������������������������������)���

����

������������������������������������������������(��������������������������������(� �������������������+

���������������(��������������������������������(� ��������������������������������������������������

��������������������������� �+�(�������������������������������������������������� �D����+������

����������������(�(� ������������������������+�����������������������������������������������������

������������� �1���������������� �������������(�(�������������������������������������������������

�������������������������������������������������� �)���������������������(���������������� �8���(���

������������������������������������� ����������������������������������������������������������

��-�����������������

Fig. 35.7 Reverse transcriptase technique to generate double stranded DNA molecule having poly dA andpoly dT tails. The ds DNA is subsequently spliced to the vector and cloned to produce muliplecopies of cDNA complementary to the mRNA sequence.

�5� ����������

�'&# ()("* (�#��)��%�#&��8( 0��&�($&'��#�&$ �� �

����������������������������������������������������������������������� �� �+�����������������+

������������

" &���������������������������������������������������������������������������������������

�������������������������������������������� �.��������������������������1

� ����������

������������������ �&���������������������F

���������������������������������������������������

��-�������������������������������������������������������(����������������1

����������������� ��

������������� ����������������������F

����������������������������������������������������������

���������������������������������A�� �,5 "%�

Fig. 35.8 Cloning experiment to show production of multiple hybrid DNA copies by using recombinant pBR322 plasmid.

������������������������ �5�

6 "���������������'�)���������-��������(����������/ ! �+���������������������������������

���������� ������������������������� �&�������� ���������������������������������������������

��������������� �����������������������������������������������������������������������������

������������������������������������������������������������� ��������������������8 � ����+

������������������ �����������������������������������������������������������������������

����������� �)������������������ ��������������������������� ��������������������������������

�����A�� �,5 ""� �)������������������������������������������������������������������������������'����

Fig. 35.9 Transformation of bacterial cells by introducing hybrid DNA. The cells containing hybrid DNA arecloned and finally selected as transformed cells.

�5. ����������

Fig. 35.10 Technique to identify clones with desired insert DNA by the genetic selection method.

�������������������������������������������������������������������������������������

����������� �������� �� �)������������������������������������������������������������������� ��

���������������������� �)������������������������������������������������������������������

����������� �������������������������� �)�����������������������������������'+�����������

������������

������������������������ �5�

Fig. 35.11 Southern blotting technique employed to isolate and size DNA molecules.

, ���������������'�)���� �����-����������� ��������������������+�������������������� ���������

��������������������������������������� �� �)������������������������������������������������

����������������������������������������(�� �������������������������������������������

7 ���������!����� ����'�)���������-���������(���������(���������������������������������������+

(���������������� �)��������-�������������������������������������������(�������������������

���������������� �)�������������������������(�����������������'���������������������������+

�������

5 ���������� ���� �������������'������������(�����������������������������������������������

�������'������� ����'��������� ���������������������������������������������� ��� �����

��������������������������������������������������������������� �)����������������������

�����������������(������������������������������������������������������

)��������������������������������������������������������������-�������������������������������

�������� �)����������������������������������������������������������������������������� �)��������+

��(�������������������������������������������������������� �)���������������������������������

�'������������������������A�� �,5 "6�

�51 ����������

Fig. 35.12 Identification of clones containing inserted genes by using diagnostic antibodies.

���1 ����� � ��� ������ ����9���� ����

� �� ���� �

)�������������������-�������(������������������������������������������������������'�������

������������������������������������������������'��������������� �)�������������������������������

�������(����������������������������������������������������+�������������������������������

�����������������������(����������� �/������������������������������������������������ �*�����

���������������������������������������������������������������������������������

������������(�������������������������������������� �*����������������������������������

����������������������������������������������������������������������������������������(�����

(����������������(���������������������������������������������������(�������� �&���������

��������������������������������������'��������������������������������������������������

������������������������ �5�

�3# 0&�(���)���-* �� * (#

��������������������������������������������������� �+�������������"7��������������������+

������������������������������������������������ �&�����������������������������������������������

������������������������������������������������������������������������������������&����������������

������������������������ ���������5"�����������������76�������-�������������������������

)���������-������������������������������������������.

�B*3� �3B*�B�*

76�����

����������������

)���������������������������������������������������������������������������������������� �)���

������������������������������������������� ���������� �)���(������������(���������� ��G���-��������

�����������������������������������������������A�� �,5 ",� �.����� ������������������������������

����������������������������������������������������������� �+���������������������������������

������������� ����(�������������������������������������������

�3# 0&�(���)��#�+%(#

)���������������������������������������������������������� ��������� �&��������������������

������������������������������ �&�������������.�������������������6"�������������/������(��

,%��������� �&��������������������������������������������������������������������������1�����������

���(���������(����������������������������� �)�����������������������������'�������������

����������

�/��,66������� �)��������������������� + ���������������������������������������������������

)���� + ����������������������������������-����������������������������������������������� �)��

������������� + ������+������������������������������ + ��������������������������������

������������������������������������ + �������������������������������(���������������������

������������ �!���������������(���������������������������������������������A�� �,5 "7� �)���

���������� ��� ����� ��� ���������� � �������������� ��������������� �������(������� ����������������

�����������������

���� ��������� ������ ������ �� ���� �

��������� �����������������������������������������������������������������������������

������������������(��������������������������

�,,%("* (�#��(#��4$("+% +$&

)���� �����������������������(�������������������������������� �+���������������������������

�������������+�������������������������������������������������������������� �1�����(����������

������(������������������������������������'���������������������������������������������������� �&�

���������������������������������������(�����������������������������������������(��������������������

��������� ������������������+�������������-�����������������������������������������������

��(�����������������������(��������������������

*��+������������-���������(�����������(����������������������������������������������������

������������������������������� ������������������� �&��������������������������� �������������

����������������������������������������� �+�(�����������������������������(��������������������

�5� ����������

���������'�����������������������������������(������ �+����������������������������������

����������������������������������������

�(� &"0#�%�43

�������������������������������(��������(�������������������(��������������������������������

��������������������� �&����������������������������������������������������������������������������

��������������������������������������������������������������������������������������������������

+�����������������������������������������-�������������������������������������������������

.�����������������������(���������������������������������� �)�������������������������+

���(��������'�����������������������������������������������������������������������������������

�������������������������'����������������������������

&�����������'��������(����������������������������������������������������(����������������� �)������

������������������ ������������������������������������������������������������������� �������

Fig. 35.13 Synthesis of somatostatin from synthetic somatostatin gene.

������������������������ �5�

Fig. 35.14 Synthesis of the insulin hormone from an insulin gene spliced to pBR322 plasmid.

�������������������� �)������������������������ ���������������������������������������

����������������

��%&�(#��0*$-*"&+ ("*%��#'+� $(&�

)������������(����������������� ���������������������� �������������������������������

��������� �������� ��������� ���������� �� ������ ��������� ��� �������� (���� ����� �� (������ �

����������������������

-��+���������������������������������������������������������������-�����������������

���������������������(������������������

&�������� ����������������������������������������� ���"7��������� ����������������������

��������������� �)����������������������������������������������������-������������� ���������

����������������������� �B����������������������������������'����������������������� �)���������

����������������������������������������������������������������������� �&�"#E,��������������������

����������������������������������������������������������������� �&������������(�������(�

�����������������������������(�������(����+�����������+�+��������������������� �*�����������

���������������������������������������������������������������������������(��������������

����������������������������

�55 ����������

�����

*���������������������������������������������������������� �&���������������(������������

����������������������������������������������������������������������������������������������������

��������������������������������� �!��������������������������������������������� �������������������+

������������������������������������������� �.���(���������������������������������������

��������������������������������������������������

��%&�(#��(*4#�� ("�

��������������������������������������������������������������������������(���������������

�������+�������������� �)���������������������������������������������������������������+

���������������������������� �)����������������������������������������������������������������

��������+��������������������������������������������������������� �D�������������'��������+

����+�������������������(��������������������������������������������������������������

8���������������������������������������������������������������������������������

�������������(����������������������'����������������������

���������������������������������������������������(�����������������������������(��������������

)����������(��������������������������������������������������������+���������������� �!�������

������������(����(����������+����������������������(��������������� �A����'��������������������+

�������������������������������������������������������������������������������������� �&����+

���������������������������������������������������������(����(������������������� �1������ ��

����������������������������������������������������������������������������������������������������

��������������

&����������������������������(������������������������������������������������������� �)�������

���������������� �+�(������������������� � ����� �������+������������� ������������������������

����������������������������(������������� �)�����������������������������������������������������

���������������������������������������������� �� ����(����������������������������������

����������������������������������������( �������)��������-����������� �������������������������+

�������������������������������������

� ��������� ������������������������������������������� �����������+

�������������� �������������������

� ����������������������� ��������������������������������������������(���������

���������������,������������������������������������������

� ����-������ ������������������������������������������������������������

����� �A��� �����������(���������������(���������������������-����� �)������

������������(������������������������������������ ����������������������

���������������������'�� �1�����(�������������������������������+

�������� ����������������������������������������������������������� ��

������������������

� /����������������������������� ������������� �)��������� ���������

�����������������������������'������������������������������������������

�� �)�������������������� ��������������

� A������������������� ����������������������������� �����������������

������������������������������������-����

������������������������ �57

� �����������������������������������������������������������������

�'������������ �+������������������������������������������������������� ���

�������������������� ������������

�������� ����� �

��������. �A ����/ � ���������H*������/����������!�����1����0��"���� ����.�675��"#E"

(����/ � ��H)������������ ���+�����0�� ���"�����.�57$��"#$$

*��������. ����@ �C���+0��������HB������-���������������������/�����0��"���� ���� �.�$7��"#E%

@������/ ��)�����.�����/���������� ������"#E5

!������0 ��H/����������!�����������*���0������ ���*���.�"6#��"#$4

������ ����8 D �+������H�����������/����������������������������������������� ���!��+

������0�� �������+�������� .�6$,��"#$5

D����� �. ����+ �/ �-���������,������������������ ����� ����'� �����������������)������������������

B�(����������1�������-������/���������"#E%

+����������� �@ ��H��������� ��0�� �������+�������� .�7"5��"#$$

+������8 �D ��H�����������+�-�����+�������������������������/���������0��"�����������I�������.

755��"#$#

��/��:� ������

�� .���������������������������J�.����������������������������������J

�� .������(�������������������������������������������������������J

�� ������������������������������(�����������������(�������������������J

� �������������������������������������������������������������������������������

�� �����������������������������

� �������(��������������������������������

�� 8�����������������������������������������������������J

�� /'������������������������'������������������������������������������������������ ��������

�� ���������������������������������(�������'��������������������� ������������

�� .������������������������.

�� +�������������

��� !����������������

��� 1�������� ��

��� 1������

��� ��(�������������������������������������

�����������;����� �

�� .������������������������� ��������������������������J��������������������

�� .��������������������������������������J��)����������������������������������-������

�� .���������������������������������������J��A�����������

�7� ����������

� .��������������������������������������������������J�� �����������������������������

��������� �8��������������������������� ����������������,����J��/�� ���������

�� .�������(�����J����(��������������������������� ���������������������� ���������������

�����

� .������������������������������������(�����J��&������������(������������������������������+

�������������������������������

�� .�������������J����������������������(�������������������������������

�� .�����������J����������� ����������������������������������������� ���������������

��������������������������������������������������������������������������������������

���

�� .������ �����������J�� ����������������������������������� ������������� �)���������

������������������� �����-��������������������

�� ������������������+������������������������J��+����������������(��(���������������������

���������������������������������������������������� �����������������������������

�����������������������������+����������������'���������������������������������������

���