raport de faza

Proiect 7.3.5. Plan Sectorial

ETAPA a IV-a - RAPORT DE FAZA

Influenta agentilor microbieni imunosupresori (PRRS, Circovirus, Mycoplasma etc.)

asupra eficientei programelor de imunoprofilaxie aplicate in unitatile de crestere a

porcilor

1 | P a g e

RAPORT DE FAZA

Etapa a IV-a – Ianuarie-Iunie 2013

Existenta unor agenti patogeni, recunoscuti a avea activitate

imunosupresoare, in populatiile porcine, pot determina slabirea capacitatii de

aparare a organismului, dar mai ales pot contribui la cresterea riscurilor de

aparitie si evolutie grava a unor boli.

Inducerea unei imunitati protectoare contra diferitelor infectii la porcine

depinde de cativa factori. Unii patogeni (PRRS, circovirusul porcin,

Mycoplasma etc.), micotoxinele si chimicalele sunt cunoscute a modula

negativ sistemul imun si astfel, pot interfera semnificativ cu eficacitatea oricarui

protocol de vaccinare. Cele mai multe informatii cu privire la mecanismele

imunologice implicate in protectia contra infectiei cu diferite virusuri au aratat

ca, in unele cazuri, protectia indusa prin vaccinare a fost atinsa in absenta

anticorpilor neutralizanti la momentul infectiei cu o tulpina virulenta. Aceste

observatii implica rolul vital al imunitatii mediate celular in protectia virala in

timpul fazei timpurii a imunitatii.

Imunitatea mediata celular este cunoscuta a avea un rol efector si de

reglare asupra sistemului imun si se crede ca este esentiala pentru imunitatea

contra agentilor patogeni, inclusiv virusurile. Informatiile anterioare cu privire

la rolul imunitatii mediate celular in protectia virala indusa de vaccinuri la porci

sunt foarte limitate, datorita faptului ca tehnicile conventionale sunt

impracticabile pentru detectia imunitatii mediate celular la porcine. Mai mult,

s-a demonstrat activitatea limfoproliferativa specifica fata de un antigen in





porcilor

2 | P a g e

limfocitele din sangele periferic de la porci vaccinati care au fost protejati

contra infectiei cu virus PPC. A fost demonstrata existenta limfocitelor T

citotoxice pentru PPC (CTL) in celulele mononucleare din sangele periferic

(PMBC) de la porci imunizati.

In vivo, virusul PRRS se replică în macrofagele alveolare pulmonare,

celulele dendridice din amigdale, limfonoduli, timus, splină, plăci Peyer, ficat,

rinichi, cord. Diagnosticul de certitudine se realizează prin izolare virală sau,

recent, prin utilizarea testului PCR (detecţia genomului viral in probele

biologice).

Testele serologice, bazate pe detecţia anticorpilor faţă de virus, realizate

prin metode imunoenzimatice şi testele de imunofluorescenţă, directă sau

indirectă, sunt utilizate în programele de supraveghere a efectivelor porcine de

reproducţie. Indiferent de testul utilizat, pot fi inregistrate erori de diagnostic

datorate variabilităţii antigenice şi genetice (virusul PRRS fiind se pare virusul

cu cea mai înaltă rată de mutageneză, de 10-2/situs/an, faţă de alte virusuri ARN,

la care evoluţia inregistrează indici de 10-3/situs/an; Laboratorul de referinţă

OIE, Canada, nu a stabilit inca un protocol de diagnostic genetic standardizat).

În ceea ce priveşte combaterea şi controlul bolii, în zonele cu prevalenţă ridicată

şansele de eliminare a infecţiei sunt minime.

Niciuna dintre metodele de eradicare utilizate (depopularea secvenţială a

adăposturilor, înţărcare precoce, cu transfer în alte adăposturi, vaccinare) nu a

dat rezultate pozitive în totalitate. Vaccinurile inactivate existente nu conferă

protecţie decât asupra manifestărilor de reproducţie, iar cele vii doar asupra

manifestărilor respiratorii. Virusul PRRS/infecţiile asociate acestuia fac obiectul

unor cercetări intense. Tulpinile tip EU nu induc manifestări respiratorii in

infecţii unice. Nivelul răspunsului mediat celular (evidenţiat prin detecţia gIF)





porcilor

3 | P a g e

protejează faţă de manifestările respiratorii in cazul tulpinilor NA. In răspunsul

imun la nivelul ţesutului pulmonar un rol major il au limfocitele T citotoxice.

In model celular s-a constatat că induce apoptoză, iar in model animal s-a

inregistrat creşterea citokinelor pro-inflamatorii (IFNa şi TNFa), asociată unui

aspect sever al leziunilor pulmonare. Numeroase studii sunt dedicate tehnicilor

de detecţie, epidemiologiei moleculare (prezenţa concomitentă in anumite regiuni

a ambelor tipuri virale, absenţa clusterilor pe criterii geografice sau temporale,

ca şi corelaţia negativă intre evoluţia genetică a virusului si presiunea selectivă

datorată vaccinărilor).

Au fost construite variante ELISA cu peptide sintetice iar in prevenţia /

controlul bolii sunt incercate vaccinurile ADN cu secvenţe izolate din tulpini

sălbatice sau cu secvenţe sintetice in care s-au introdus substitutii, si chiar

serumizări. Un alt virus implicat în infecţiile respiratorii la porc, adeseori asociat

cu PRRS este circovirusul porcin 2 (PCV- 2), considerat în prezent ca agent

etiologic al sindromului caşectizant multisistemic al purceilor înţărcaţi

(Postweaning multisystemic wasting syndrom - PMWS), al sindromului

tremurului congenital al purceilor nou-născuţi şi implicat în infecţiile

respiratorii la porc. CVP2 are ca celule ţintă monocitele şi macrofagele, având de

asemenea efect supresor, iar la nivel celular, efect apoptotic. Date experimentale arată

că vaccinările pot exacerba agresivitatea PCV 2.

Circovirusul porcin (PCV) a fost descris pentru prima data in urma cu

peste 20 de ani ca fiind un contaminant picornavirus-like permanent al liniei

celulare renale de porc PK15 (ATCC-CCL 33). Dupa cativa ani, s-a raportat ca

PCV este un virus mic, fara anvelopa, icozaedric, continand un genom ADN

monocatenar circular. Dupa aceasta PCV a fost atribuit familiei Circoviridae.





porcilor

4 | P a g e

Recent, aparitia unui virus PCV distinct antigenic si genomic in populatiile

de porcine ce a fost asociat cu un numar de stari clinice a crescut interesul

pentru studierea PCV. Virusul descoperit nou a fost denumit PCV2, iar

contaminantul original PCV al celulelor PK15 a fost denumit PCV1. Diferenta

antigenica a acestor izolate noi fata de PCV1 a fost confirmata cu anticorpi

monoclonali si policlonali.

Virusurile PCV2 au fost izolate de la porci bolnavi in America de Nord,

Europa, Taiwan si Coreea de Sud. PCV1 si PCV2 sunt virusuri mici (17 nm),

icozaedrice, fara anvelopa, continand un genom ADN monocatenar circular.

Densitatea PCV1 in CsCl a fost raportata a fi de 1.37 g/cm3 de catre Tischer si

de 1.33-1.34 g/ml de catre Allan et al., iar coeficientul de sedimentare de 57S

comparativ cu coeficientul de sedimentare cunoscut al enterovirusului bovin.

PCV1 nu hemaglutineaza eritrocitele de la o gama de animale si este rezistent la

inactivare dupa expunere la pH 3, cloroform, 56oC si 70

oC. Secventa

nucleotidica completa (1759 nt) a genomului circular al contaminantului PCV1

al celulelor PK15 este cunoscuta si PCV1 poate replica printr-o forma replicata

dublucatenara (RF).

S-a demonstrat o forma RF PCV1 si ambele catene ale RF PCV1 sunt

transcrise si proteinele de codificare sunt cunoscute. Sunt recunoscute cateva

cadre de citire deschise (ORF) pentru PCV1 cu un potential de a codifica

proteine mai mari de 5 kDa, codificate pe una dintre catenele RF PCV. Analiza

secventei de proteine codificate de catre ORF1 a indicat un grad de omologie cu

nanovirusul plantelor ORF cunoscut a codifica proteinele asociate replicarii.

Intr-adevar, infectia cu PCV la porci poate fi initiata de catre un nanovirus al

plantelor care isi schimba gazda pentru a infecta o vertebrata si apoi se

recombina cu un virus infectant al vertebratelor. Aceasta omologie cu





porcilor

5 | P a g e

nanovirusurile plantelor si similaritatea inalta a secventei de aminoacizi intre un

produs proteic potential al ORF1 al virusului bolii ciocului si penelor si

produsul ORF1 al PCV1 a fost raportata.

Micoplasmele sunt cele mai mici si cele mai simple organisme ce pot sa se

multiplice singure si se disting fenotipic de alte bacterii prin marimea lor si lipsa

unui perete celular. Ele sunt caracterizate prin marimea mica si un continut mic

in G+C ale genomului. In timpul evolutiei, Mycoplasma spp a pierdut toate

genele implicate in biosinteza de acizi grasi si aminoacizi. M. hyopneumoniae,

cea mai importanta specie de Mycoplasma la porcine, este agentul primar al

pneumoniei enzootice porcine si, in asociere cu unele virusuri respiratorii, joaca

un rol important in complexul de boli respiratorii porcine (PRDC).

Ambele afectiuni cauzeaza pierderi economice majore pentru industria de

crestere a porcului in intreaga lume datorita scaderii performantei si cresterii

susceptibilitatii la alte infectii. Alte micoplasme patogene importante la porcine

includ M. hyorhinis, ce produce poliserozita si artrita, M. hyosynoviae, o cauza

a artritei la porcii in crestere si M. suis care este asociata in principal cu anemia.

Aceste date conduc la necesitatea stabilirii implicatiilor agentilor

microbieni imunosupresori asupra eficientei programelor de

imunoprofilaxie aplicate in unitatile de crestere a porcilor pentru a se

obtine date care sa fundamenteze masuri adecvate de control care sa

limiteze pierderile economice si care sa aiba un impact pozitiv asupra

sanatatii si bunastarii efectivelor de porcine si asupra cresterii calitatii si

sigurantei alimentare prin obtinerea si aplicarea unor metode de profilaxie

eficiente.





porcilor

6 | P a g e

Obiectivul etapei a IV-a a fost:

Evaluarea răspunsului imun indus prin vaccinare la porci

convenţionali (vaccin antirujetic), în absenţa şi în prezenţa tulpinilor de

microorganisme cu efect imunosupresor şi cuantificarea parametrilor

imunologici post vaccinali la animalele vaccinate din sistemul intensiv de

creştere a porcinelor, în prezenţa microorganismelor imunosupresoare.

Atingerea acestui obiectiv s-a realizat prin indeplinirea urmatoarelor

activitati:

Activitatea IV.1.: Experimente de vaccinare efectuate pe porci

convenţionali infectaţi/neinfectaţi cu germeni patogeni imunosupresori.

Activitatea IV.2.: Evaluarea parametrilor imunologici post vaccinali la

animale vaccinate din sistemul intensiv de creştere a porcinelor, în

prezenţa şi în absenţa microorganismelor imunosupresoare.

Activitatea IV.3.: Analiza statistică a datelor obţinute în experimentele

efectuate.

Activitatea IV.1.: Experimente de vaccinare efectuate pe porci

convenţionali infectaţi/neinfectaţi cu germeni patogeni imunosupresori.

Pentru desfăşurarea lucrărilor s-au achiziţionat din import:

Kituri ELISA , pentru detecţia anticorpilor specifici pentru PRRS,

Circovirus şi Mycoplasma hyopneumoniae.

Medii de cultură pentru izolarea bacteriei Mycoplasma hyopneumoniae.

Kituri pentru testul PCR.





porcilor

7 | P a g e

Alte materiale aferente lucrărilor: tuburi pentru recoltarea probelor de

sânge, din organe, secreţii, tampoane pentru recoltarea secreţiilor nazale

şi bucale, seringi, vacutainere, instrumente chirurgicale.

S-a efectuat documentarea ştiinţifică, programarea şi desfăşurarea

lucrărilor în teren şi în laborator

Recomandari privind efectuarea acţiunilor de imunoprofilaxie

specifică într-o unitate de creştere şi îngrăşare a porcinelor

I. ANIMALE ÎN PERIOADA DE CARANTINĂ

Scrofiţele şi vieruşii cumpăraţi vor fi supuşi următoarelor acţiuni .

- vaccinare antileptospirică, antiparvo +antirujetica la 20 zile de la cumpărare

- vaccinare antileptospirică, antiparvo+antirujetica la 50 zile de la cumpărare

Acţiunea de prelevare a probelor de sânge pentru examene serologice se va

realiza în primele 14-20 zile de la preluare.

Se recomandă ca, cel puţin animalele nou achiziţionate să fie vaccinate cu un

vaccin antileptospiric tetravalent.

II. SCROFIŢE ÎN AŞTEPTARE (producţie proprie)

- vaccinare antileptospirică, antiparvo* şi contra PRRS*

- vaccinarea I - la 210 zile vârstă;

- vaccinarea a II-a - la 240 zile vârstă (ultima vaccinare cu 14-21 zile

înainte de montă)

III. VIERI

- vaccinare antileptospirică - trimestrial;





porcilor

8 | P a g e

- vaccinare anti-PRRS de două ori pe an (primăvara şi toamna) cu rapel la

21 zile*.

IV. SCROAFE GESTANTE

- vaccinare antileptospirică I - Ia 50 zile de la montă;

- vaccinare antileptospirică II - la 65 zile de la montă;

- vaccinare anti-coli I - la 70 zile de la montă;

- vaccinare anti-coli II - la 90 zile de la montă;

În funcţie de situaţia epidemiologică a unităţii se pot aplica vaccinări de

necesitate contra pleuropneumoniei infectioase, poliserozitei infectioase

(boala lui Glasser) şi anaerobiozelor o dată cu vaccinarea I şi a II-a anti E.

coli.

V. SCROAFE LACTANTE, AŞTEPTARE

- vaccinare antiparvo si/sau antirujetica (o singură inoculare) cu 5 zile

înainte de înţărcare*;

VI. PURCEI SUGARI

- vaccinare contra Mycoplasma hyopneumoniae (PEP) I – la 7 zile vârstă*

- vaccinare contra Mycoplasma hyopneumoniae (PEP) II – la 21 zile

vârstă*

- vaccinare contra Mycoplasma hyopneumoniae +circovirus (PCV2)– la

21 zile de varsta (conform recomandarilor firmelor care produc

vaccinurile respective)*

VII. TINERET CRESCĂTORIE

Nu este cazul





porcilor

9 | P a g e

VIII. PORCI GRAŞI

Nu este cazul

* vaccinări opţionale în funcţie de situaţia epidemiologică si recomandarile

firmelor producatoare de vaccinuri.

S-a făcut documentarea pentru metodele de izolare a virusului PRRS şi

Circovirus, întocmindu-se şi procedura de izolare a germenilor Mycoplasma

hyopneumoniae la suine.

De asemenea, s-au continuat investigaţiile privind existenţa şi ponderea

germenilor circulanţi patogeni cu efect imunosupresor în ferme de porcine.

S-a continuat recoltarea de probe biologice (sânge şi organe) din diferite locatii,

atât din ferme de crestere intensivă, cât şi de la animale sălbatice (mistreţi):

- probe recoltate dintr-o fermă de porcine cu crestere intensivă Pigcom

Satu Nou

- avand in vedere ca vanatoarea la mistreti este sezoniera, s-au prelevat in

avans probe in vederea analizelor de laborator cuprinse in activitatile

fazei V a proiectului. Probele au fost recoltate de la mistreţi din 8 judeţe:

Prahova, Bacău, Suceava, Vâlcea, Brasov, Mureş, Covasna şi Giurgiu,

dupa cum urmeaza:

66 probe organe mistreţi de la Directia Silvica Prahova (AVPS Câmpina,

FV 22 Orjogoaia, AVPS Pisica salbatică, FV 30 Slon, FV 10 Sicriţa, FV

9 Drăgăneşti, FV 28 Telejenel, FV 35 Paltineţ, FV 35 Şoimari, FV 24

Comarnic, FV 19 Mislea, FV 36 Cosmina, FV 29 Basca, FV 11

Gherghita, FV 42 Malu Rosu, FV 31 Caldaruşi)

4 probe organe si 4 probe sânge mistreţi de la Directia Silvică Bacău

(fondul de vanatoare Coţofeneşti),





porcilor

10 | P a g e

47 probe sânge mistreţi de la Directia Silvică Vâlcea (FV 47 Răcoasa -

Oc. Silvic Dragaşani, FV 36 Padina - AVPS Băniceana, FV 32 N.

Bălcescu - Ocolul silvic Stoiceni, FV 37 Mitrofani - CVPS Dragasani, FV

41 Dozesti - AJVPS Valcea, Balcesti, FV 44 Draganu - AJVPS Valcea

Balcesti, FV 39 Usurei, AJVPS Valcea - Ladesti, FV 13 Cozia

Calimanesti, FV 19 Olanesti - AVPS Brai, FV 38 Dobrusa - Oc. silvic

Dragasani, FV 2 Dobrunu Oc. silvic Voineasa, FV 45 Fauresti, FV 37

Mitrofani, FV 27 Cernisoara - Horezu, FV 25 Stroesti- Horezu, FV18

Cazanesti - AJVPS Valcea, FV 9 Caineni - AJVPS Valcea – Brezoi, FV 8

Malaia - FVPS Cinegetica Lovistea – Brezoi, FV 4 Babuiesti - AVPS

Sitarul Bucuresti, FV 21 Romani - AVPS Pajura – Horezu, FV 13 Cozia -

Oc. silvic Calimanesti, FV 20 Bistrita, Oc. silvic Romani, Costesti)

12 probe organe mistreţi de la DSVSA Suceava (FV 24 Frasin, FV 54

Pătrăuţi, FV 23 Negrileasa – Stulpicani, FV 47 Voroneţ, FV 16 Valea

Cârlibabei)

23 probe organe mistreţi de la DSVSA Brasov

146 probe organe mistreţi de la DSVSA Mureş

92 probe organe mistreţi de la DSVSA Covasna

2 seturi organe si 4 probe sânge de la mistreţi, FV 4 Căscioarele, ocolul

silvic Bolintin Vale, Jud. Giurgiu

PROBE RECOLTATE DIN SISTEMUL DE CRESTERE INTENSIV

Pentru studiul nostru am luat ca referinţă ferma PIGCOM SA Satu Nou,

judetul Tulcea, în care PRRS a fost confirmată în urmă cu 4 ani.





porcilor

11 | P a g e

Probele biologice (sânge şi organe) au fost prelevate la anumite intervale

de timp, ţinând cont de vârstă, fluxul tehnologic şi dinamica vaccinărilor din

fermă.

Activităţile de reproducere, creştere şi îngrăşare a porcinelor din această

exploataţie se derulează în 13 spaţii de cazare (hale), astfel:

- 3 hale pentru reproducţie, unde se aplică în exclusivitate însămânţările

artificiale, materialul seminal fiind asigurat de la cei 28 vieri terminali. In

perioada anterioară materialul seminal a fost achizitionat şi din import,

constituind probabil sursa de infecţie cu PRRS, circovirus;

- 2 hale de maternitate destinate fătării si creşterii descendenţilor până la vârsta

de inţărcare (30 - 32 zile);

- 2 hale pentru creşterea tineretului de unde se selectau din punct de vedere

fenotipic, cele mai reprezentative exemplare de scrofite pentru inlocuirea

matcii;

- 6 hale pentru porcinele la ingrasat

Materialul de reproducţie femel este reprezentat de tineretul femel

obţinut în unitate care constituie materialul de înlocuire al reformelor de

scroafe, exploatate de 2,1 ori pe an şi vierii terminali donatori de material

seminal, achiziţionati de la SC PIG Romania, SC Dan Bred SRL din judetul

Argeş, în perspectiva de la unităţi de profil din Ungaria, cu care se negociază

condiţiile de achiziţie.

Între o depopulare şi urmatoarea populare se asigură repaosul tehnologic

pentru executarea decontaminării spaţiilor de cazare,"odihna tehnologică" a

spaţiilor de cazare pentru asigurarea unor conditii optime pentru o noua serie de

purcei care intră pe fluxul de productie. Pentru verificarea eficacităţii acesteia

se efectueaza testele specifice de laborator.





porcilor

12 | P a g e

În maternitate actul fătării se produce în boxe individuale, unde scrofele

gestante deparazitate sunt introduse cu cel putin 2 zile înainte de fătare,

încălzirea în pardoseală find asigurată de către o reţea de calorifere care

realizează temperatura tehnologică pentru nou-născuţi, până la încheierea

ciclului (înţărcarea).

Trecerea la categoria tineret creştere se face la vârsta de 30-32 de zile de

şedere în maternitate, practicându-se procedeul tehnologic "totul plin totul gol"

când un procent redus dintre aceştia îl reprezintă exemplarele rămase în creştere

pe care se grefează o anumita flora care determina un procent totuşi ridicat de

pierderi prin mortalitate de 8-10%, fenomen cantonat în proporţie ridicată la

această categorie de purcei. Se practică creşterea la baterii, şi la sol, un mijloc

sigur de contaminare a purceilor aproape la fiecare serie, o cauză care poate

influenţa condiţiile de microclimat.

Porcii grasi sunt crescuti la sol până la atingerea varstei şi a greutăţii de

livrare, când sunt valorificaţi la tăiere.

Condiţiile de furajare sunt bune, nutreţurile combinate producându-se pe

plan local în staţia proprie de măcinare unde se înglobează premixurile necesare

fiecărei categorii de porcine din exploatare, în funcţie de statusul de sănătate

existent la un moment dat sau eventualele perioade cu sporuri de creştere

nefavorabile.

Situaţia vaccinărilor în fermă:

La matcă: la vârsta de 180 de zile,

- Vaccinare contra PRRS, cu rapel cu 2 săptămâni înainte de montă.

- Vaccinare contra parvovirozei

- Vaccinare contra circovirozei

- Vaccinare contra leptospirozei





porcilor

13 | P a g e

La scroafe şi scrofiţe pentru însămânţare:

- Vaccin antileptospiric la vârsta de 55 de zile

- Vaccin contra PRRS şi rapel cu vaccin antileptospiric, la vârsta de 70 de

zile.

- Vaccin contra anaerobiozelor şi contra colibacilozelor la vârsta de 75 de

zile cu rapel la 95 de zile.

În maternitate, la purcei cu 2 săptămâni înainte de înţărcare: vaccin

PARVORUVAX- contra parvovirozei şi rujetului.

- La purcei , vârsta de 21 zile- vaccin Flexcombo contra circovirozelor şi

micoplasmei.

- la tineret- vaccin contra pleuropneumoniei la vârsta de 42 de zile cu rapel la

72 de zile.

- la porcul gras nu se face vaccinare.

Deparazitarea internă şi externă se face o singură dată, cu premixuri cu

ivermectină, după vârsta de inţărcare. Nu se face deparazitarea adăpostului.

Din ancheta epizootologică efectuată în fermă s-au constatat tulburări

respiratorii la scroafe iar la purcei, la scurt timp după naştere, pe lângă aceste

tulburări, prezintă anorexie, febră pasageră şi o dezvoltare redusă. De asemenea,

apar tulburări de reproducţie la scroafe (avorturi, fătări de purcei mumifiaţi,

număr mic de progeni din cauza mortalităţii embriofetale parţiale sau purcei

neviabili).

Semnele clinice sunt frecvent agravate de infecţii secundare.

S-au prelevat probe biologice (sânge şi organe) de la suine din fermă, in

vederea punerii in evidenta a virusurilor PRRS , Circovirus, M. hyopneumoniae.





porcilor

14 | P a g e

05.12.2012

PIG COM SATU NOU

4 seturi organe tineret porcin varsta 2 luni

proba 1: pulmoni + ganglioni

=> PCR (PRRS, Circovirus, Mycoplasma hyopneumoniae)

=> Virusologic (PRRS, Circovirus)

=> Bacteriologic -Mycoplasma hyopneumoniae

proba 2: pulmoni




proba 3: pulmoni


=> Virusologic (PRRS, Circovirus),


proba 4: pulmoni




14.12.2012

PIG COM SATU NOU

Probe prelevate

Seturi de organe de la purcei cu leziuni de PRRS dupa cum urmeaza:

- 3 probe din hala 6 compartimentul 4 de la purcei in varsta de 42-45 de zile;

-2 probe de la purcei cu leziuni de PRRS din hala 7, in varsta de 65 de zile.





porcilor

15 | P a g e

In ambele cazuri, probele prelevate au fost: ggl. mandibulari, mediastinali,

mezenterici, portiuni de trahee, pulmon, ficat, rinichi.

Seturi organe suine (ganglioni mandibulari, mediastinali, mezenterici, trahee,

pulmoni, ficat, rinichi

H6C4, varsta 42-45 zile – 3 probe

H7, varsta 65 zile – 2 probe

Analize:

Proba 1 – purcel de 40 zile, intarcat, H6 – leziuni congestive si

pneumonie(hepatizatie pe zone reduse) => PCR (pulmoni si trahee)

Proba 2 – purcel de 44 zile, intarcat, H6 – leziuni congestive si

pneumonie(hepatizatie rosie si cenusie la varful lobilor apical si cardiac))

=> PCR, virusologic (pulmoni, gg traheobronhici si trahee)

Proba 3 – purcel de 65 zile, intarcat, H7 – leziuni de pneumonie, aspect

mozaicat cu zone de hepatizatie si edem pulmonar) => PCR, virusologic

(pulmoni, gg traheobronhici si trahee)

Proba 4 – purcel de 75 zile, intarcat, H7 – leziuni de pneumonie cu zone

de hepatizatie in diverse stadii) => PCR (pulmoni, gg traheobronhici si

trahee)

27.02.2013

Pig Com SATU NOU, Tulcea

9 avortoni suine

37 probe sange suine, tineret inţărcat, înainte şi după vaccinare

antirujetică

Avortoni: hepatoză, ficat friabil, congestie intestinală





porcilor

16 | P a g e

virusologic (pulmoni, trahee, splina, rinichi) – probele 5/1 si 5/2

PCR (pulmoni, trahee, splina, rinichi) – probele 5/1 si 5/2

Mycoplasma hyopneumoniae (pulmoni) – probele 5/4 si 5/5

37 probe sânge H7 C10 (1-16 inainte de vaccinare antirujetica, varsta 92 zile;

1-21 dupa vaccinarea antirujetica, varsta 109 zile)

serologic PRRS, Circovirus, M. hyo, Rujet (37 probe)

PCR (probele 7, 14 – 92 zile si 1, 5 -109 zile)

15.05.2013 BA 1407

PICOM SATU NOU, TULCEA

S-au recoltat probe de sânge , din confluentul jugular de la:

- purcei cu vârsta de 180 de zile, probele 1-21.

- tineret cu vârsta de 85 de zile( hala 12, compartimentul 17), probele

22-42

- scroafe în aşteptare( înainte de montă) 5 probe: S1,S2,S3,S4,S5.

S-au prelevat, de asemenea, probe din organe cu leziuni de la doi purcei

cu vârste de aproximativ 45 de zile, din ficat, pulmoni, ganglioni

mezenterici, intestin subţire.

46 probe ser sanguin: 20 probe tineret x 180 zile, 21 probe tineret x 85 zile,

5 probe scroafe in asteptare

Rezultate teste ELISA: M. hyopneumoniae, Circovirus, PRRS





porcilor

17 | P a g e

Activitatea IV.2.: Evaluarea parametrilor imunologici post vaccinali la

animale vaccinate din sistemul intensiv de creştere a porcinelor, în

prezenţa şi în absenţa microorganismelor imunosupresoare.

REZULTATE EXAMENULUI SEROLOGIC

Pentru decelarea anticorpilor specifici din serul animalelor s-a folosit

testul imunoenzimatic ELISA.

Au fost analizate 83 probe sânge provenite de la porcine crescute in

sistem intensiv, dintre care, pentru PRRS, 41 au fost pozitive (37 de la tineret

si 4 de la scroafe in asteptare).

În cazul infecţiei cu Circovirus la tineret au fost 21 suspecte, iar la scroafe

în aşteptare 2 pozitive şi 2 suspecte.

La infecţia cu M. hyopneumoniae s-au identificat la tineret 21 probe

pozitive şi 2 suspecte, iar la scroafe în aşteptare 2 pozitive.

Anticorpi antirujetici s-au detectat la 9 probe din categoria tineret.





porcilor

18 | P a g e

Nr.

crt. Proprietar Varsta Status imun

ELISA

PRRS M. hyo Circovirus Rujet

1 Pig Com Satu Nou 92 zile Nevaccinate

anti Rujet

Negativ Negativ Negativ Negativ

2 Negativ Negativ Negativ Negativ






8 Negativ Negativ Suspect Negativ









TOTAL POZITIVE 0/16 0/16 0/16 0/16

TOTAL SUSPECTE 0/16 0/16 1/16 (6.25%) 0/16





porcilor

19 | P a g e

Nr.

crt. Proprietar Varsta

Status

imun

ELISA

PRRS M. hyo Circovirus Rujet

1 Pig Com Satu Nou 109 zile Vaccinate

anti Rujet

Negativ Negativ Suspect Negativ











12 Negativ Negativ Negativ Pozitiv

13 Negativ Negativ Suspect Pozitiv









TOTAL POZITIVE 0/21 0/21 0/21 0/21

TOTAL SUSPECTE 0/21 0/21 4/21 (19%) 9/21 (42%)





porcilor

20 | P a g e

Tineret x 180 zile REZULTATE ELISA

Pig Com Satu Nou PRRS CIRCOVIRUS M.

HYOPNEUMONIAE

RUJET

1 Pozitiv Suspect Pozitiv Negativ

2 Pozitiv Negativ Pozitiv Negativ


4 Pozitiv Suspect Suspect Negativ

















TOTAL 20 pozitive 9 suspecte 19 pozitive, 1

suspect 0/20





porcilor

21 | P a g e

Tineret x 85 zile REZULTATE ELISA


HYOPNEUMONIAE

RUJET

1 Negativ Suspect Negativ Negativ

2 Pozitiv Negativ Negativ Negativ







9 Pozitiv Negativ Suspect Negativ



12 Pozitiv Suspect Negativ Negativ




16 Negativ Suspect Negativ Negativ






TOTAL 17 pozitive 7 suspecte 2 pozitive, 1

suspect 0/21





porcilor

22 | P a g e

scroafe in asteptare REZULTATE ELISA


HYOPNEUMONIAE

RUJET

S1 Pozitiv Suspect Negativ Negativ

S2 Pozitiv Suspect Pozitiv Negativ

S3 Pozitiv Negativ Pozitiv Negativ

S4 Negativ Pozitiv Negativ Negativ

S5 Pozitiv Pozitiv Negativ Negativ

TOTAL 4 pozitive 2 pozitive, 2

suspecte 2 pozitive 0/5

REZULTATELE EXAMENELOR ANATOMOPATOLOGIC SI

BACTERIOLOGIC

Organele examinate de la tineretul porcin in varsta de 45 de zile (ficat,

pulmon, ganglioni mezenterici, intestin subţire), au prezentat si infectii

bacteriene cu germeni asociati.

La examenul anatomopatologic din organe au predominat leziuni de

poliserozita serofibrinoasa, pleura, pericardul si peritoneul fiind acoperite de

depozite de fibrin cenusii-galbui, usor detasabile. Aceste leziuni au orientat

diagnosticul spre o bola infectioasa, specifica porcinelor, produsa de

Haemophilus parasuis, confirmata de altfel de catre medical epizootolog al

fermei.





porcilor

23 | P a g e

La examenul necropsic efectuat pe unele cadavre de purcei, examinate in

ferma, s-au observat si leziuni de pneumonie interstitiala si ganglioni (traheo-

bronhici, mediastinali) mariti, cu aspect marmorat pe sectiune.

Pentru izolare s-au utilizat medii de imbogatire: Agar cu sange de oaie

5%, Agar şocolat, Bulion nutritiv cu sange de oaie 5%, iar pentru diferenţierea

primară a germenilor s-au utilizat mediile selective: Mac Conkey sau Istrati-

Meitert.

Insămânţările primare au fost incubate aerob, la 37 C, caracterele

culturale fiind examinate la 24 si 48 de ore. Examenul caracterelor morfologice

s-a efectuat prin microscopie optică, folosindu-se metoda de colorare Gram.

Identificarea tulpinilor izolate s-a realizat utilizand sistemului clasic TSI,

MIU si Simmons, precum si sisteme miniaturizate, standardizate, API 20 E

pentru identificarea enterobacteriaceelor si API 20NE pentru germeni Gram-

negativi non-fermentativi.

Rezistenta la antibiotice s-a determinat prin metoda Kirby-Bauer

difuzimetrica), pe mediu Mueller-Hinton pentru enterobacteriacee şi Agar

triptonat, imbogaţit cu 5% sânge de oaie pentru germenii cu cerinţe speciale de

creştere.

Rezultate:

Din pulmoni si cord (1/2) s-a izolat Mannheimia haemolytica,

sensibila la Fosfomicina+Tylosin, Amoxicilina, Ampicilina,

moderat sensibila la Enrofloxacin, Flumequine, Florfenicol si

rezistenta la Colistin, Doxiciclina, Gentamicina, Oxitetraciclina.

Din ficat (1/2)s-a izolat o tulpina de Salmonella spp. (serogrup C),

sensibila la Enrofloxacin, Florfenicol, Sulfametoxazol +

Trimetoprim, Fosbac + T, Gentamicina, Ampicilina, Amoxicilina

si rezistenta la Oxitetraciclina, Colistin, Doxiciclina si Flumequine.





porcilor

24 | P a g e

Fig.1 Identificare Mannheimia

haemolytica prin kit API20NE

Fig.2 Antibiograma M. haemolytica pe

Mueller-Hinton cu 5% sange defibrinat

de oaie

Fig.3 Salmonella spp. grup C pe medii

TSI si MIU





porcilor

25 | P a g e

Examenul bacteriologic pentru izolarea M. hyopneumoniae

Procedura de lucru:

1. Scop

Stabileşte etapele care trebuiesc parcurse pentru a obţine tulpina de

Mycoplasma hyopneumoniae, pornind de la probe recoltate de la animale

cu leziuni specifice ale infecţiei cu această bacterie.

2. Aplicabilitate

2.1. Procedura se aplică lotului de porci testaţi în cadrul proiectului ADER

7.3.5.

2.2. Procedura se aplică în Laboratorul de diagnostic pe probele recoltate în

teren sau de la abator, de la porcii supuşi testului.

3. Responsabilitate

3.1. Recoltarea, prelucrarea probelor şi pregătirea materialelor: Dr. Cătălin

Tudoran, Dr. Petru Sevciuc, Biol. Alina Radu, Dr. Nicolae Levandovschi,

Dr. Cristian Uluitu.

3.2. Verificarea respectării/ execuţiei corecte a procedurii: Dr. Viorica

Chiurciu

4. Definiţii, prescurtări

4.1. Definiţii: -

4.2. Prescurtări/abrevieri utilizate în textul procedurii:

4.2.1. PPLO : Pleuropneumonia – like – organism

4.2.2. MPS : Pneumonia micoplasmică a suinelor

4.2.3. PRRS : Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome

4.2.4. M. hyo. : Mycoplasma hyopneumoniae

4.2.5. POS: Procedura de Operare Standard





porcilor

26 | P a g e

5. Materiale si echipamente

Eprubete

Recipiente pentru recoltare probe, prevăzute cu filet şi capac

Plăci Petri pentru microscopie

Truse de necropsie

Truse de microbiologie

Genţi pentru transportul probelor (frigorifice)

Medii de cultură

Termostat 37°C, cu posibilitatea de asigurare a umidităţii şi a atmosferei CO2

Microscop sau Stereoscop

Echipament de protecţie specific locului intervenţiei (fermă, abator, laborator)

6. Procedura

6.1. Considerente de securitate: Precauţii pentru lucrul cu animale,

elemente fizice, chimice, biologice periculoase (salopete pentru zonele

cu risc înalt, măşti, ochelari, mânuşi, ustensile pentru imobilizarea

animalelor, curăţarea scurgerilor accidentale etc.).

6.2. Introducere: Mycoplasma hyopneumoniae – agent al pneumoniei

enzootice porcine şi co-factor al sindromului PRRS

6.2.1. Pneumonia micoplasmică a porcinelor (MPS) sau pneumonia

enzootică, este cauzată de Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyo.)

şi reprezintă unul dintre cei mai importanţi factori ai bolilor

cauzatoare de pierderi în producţia de porcine. Pierderile

economice asociate cu MPS sunt adesea rezultatul unei interacţiuni

complexe între Mycoplasma şi co-infecţii cu alte bacterii,

managementului sănătăţii şi condiţiilor precare de mediu. Studiile





porcilor

27 | P a g e

arată că peste 90% din efectivele de porcine din întreaga lume

suferă de pneumonie enzootică, catalogând-o drept una dintre cele

mai prevalente şi costisitoare boli. Chiar la niveluri scăzute ale

infecţiei, această boală respiratorie cronică prezintă costuri

semnificative suplimentare, datorate eficienţei scăzute a asimilării

hranei, scăderii globale a sporurilor zilnice de greutate, variabilităţii

mărimii porcilor, scăderii preţului carcasei şi repetării tratamentului

cu antibiotice.

6.2.2. MPS este menţinut în mai multe efective prin transmiterea de la

scroafă la purcel a M. hyo. Odată ce infecţia este stabilită la câţiva

porci, ea va fi transmisă la porcii din întregul efectiv, mai ales după

ce animalele sunt comasate în timpul înţărcării. În sistemele de

producţie continuă, M. hyo. şi o serie de alţi agenţi patogeni

respiratori importanţi pot fi transmişi în număr mare la porcii tineri.

Semne de MPS, de obicei, nu sunt întâlnite la purcei sub vârsta de

şase săptămâni. Deşi este de aşteptat ca infecţiile cu M. hyo. să fie

întâlnite începând cu etapa de creşă a porcilor, dovada

microbiologică a prezenţei microorganismului în leziunile

pulmonare nu a fost găsită. Factorii care ar putea contribui la

prevalenţa uriaşă în etapele de creştere şi de îngrăşare a porcilor

sunt: perioada lungă de incubaţie a M. hyo., răspândirea lentă a

microorganismului la purcei, creşterea densităţii animalelor după

etapa de creşă, răspândirea altor agenţi infecţioşi şi factorii de

mediu după înţărcare.

6.2.3. Deşi infectate cu Mycoplasma hyopneumoniae, animalele pot

deveni co-infectate cu virusul PRRS, virusul gripei porcine şi cu

alţi agenţi ai bolilor respiratorii porcine, care conduc la grave





porcilor

28 | P a g e

probleme reproductive. De asemenea, pierderile economice pot fi

considerabile în cazul în care apar infecţii bacteriene secundare.

Aceste pierderi pot include probleme de reproducţie, cum ar fi

avortul şi fetuşii fătaţi morţi în loturile de reproducţie.

6.2.4. La porcii bolnavi germenii se găsesc în pulmon, atât în partea

lezată, cât şi în cea normală. În secreţiile aparatului respirator se

găsesc în cantitate mai mică şi în mod constant (jetaj, secreţii

bronşice din timpul strănutului, tusei, grohăitului). Factorii de

microclimat (umiditatea mare şi temperatura scăzută) contribuie la

răspândirea bolii.

6.2.5. Mycoplasma hyopneumoniae (identică cu Mycoplasma

suipneumoniae) este un germen polimorf, care se colorează prin

metoda Giemsa şi creşte pe medii complexe ce conţin ser de porc,

colesterol, în condiţii de anaerobioză cu 5-10% CO2. Bacteria

rezistă foarte puţin în mediul extern, este inactivată în 48 de ore la

uscăciune, dar poate rezista până la 17 zile în apa de ploaie la

2-7°C. Este sensibilă in vitro la penicilina G, tiamulin, tylosin,

lincomicin, spiramicin, enrofloxacin şi la tetracicline.

6.2.6. Confirmarea în laborator a prezenţei bacteriei se poate realiza

prin:

izolarea Mycoplasmei hyopneumoniae pe medii de cultură

specifice din probe recoltate din secreţiile aparatului

respirator sau din zonele pulmonare afectate

evidenţierea micoplasmelor în amprente sau secţiuni de ţesut

pulmonar prin imunofluorescenţă directă sau în secreţii

bronşice (spălături bronhiale de la ambii pulmoni) prin PCR





porcilor

29 | P a g e

şi ELISA folosind anticorpi monoclonali, hibridarea

ADN/ADN

teste serologice - permit detectarea anticorpilor specifici din

serul sanguin prin Reacţia de fixare a complementului (este

mai puţin specifică decât ELISA), testele ELISA : ELISAs -

utilizează ca antigen 36 kDa lactat dehidrogenaza,

monoclonal ELISAs blocking şi Tween 20 ELISAs.

Anticorpii pot fi evidenţiaţi la 10 zile după infecţie şi se

menţin cel puţin 80 de zile.

6.3. Principiile procedurii – Tehnica de izolare

6.3.1. Izolarea micoplasmelor depinde de bogăţia de germeni din probă.

Un inoculum bogat, însămânţat cât mai repede după recoltarea

probelor, într-un mediu îmbogăţit cu glucoză şi ser de cal asigură

izolarea germenilor. Pentru a inhiba dezvoltarea contaminaţilor

obişnuiţi în astfel de probe, în mediul de izolare se adaugă acetat de

taliu (500 µg/ml), penicilină G (1.000 UI/ml) şi amfotericină B

(5 µg/ml). Incubarea se face la 37°C în atmosferă cu 95 % azot şi

5 % CO2.

6.3.2. Izolarea M. hyopneumoniae din materialele patologice se

realizează mai greu comparativ cu alte micoplasme, iar pe medii

solide formează colonii foarte mici, mai rar apărând aspectul clasic

de „ouă ochiuri”. Necesită pentru creştere steroli, aminoacizi,

extract de drojdie, hidrolizat de lactalbumină şi ser de porc. Se

poate cultiva şi pe culturi celulare primare sau pe linii celulare

standardizate pe care produce efect citopatic şi/sau citotoxic.

6.3.3. Mycoplasma hyopneumoniae este identică antigenic cu

Mycoplasma flocculare care este nepatogenă. Proprietăţile





porcilor

30 | P a g e

biochimice : fermentează constant glucoza, nu hidrolizează arginina

şi ureea.

6.3.4. Mediul de cultură utilizat pentru transportul probelor: 2,5 g heart

infusion broth în 70 ml apă deionizată încălzită la 80°C, 10 ml de

25 % extract proaspăt de drojdie, 20 ml ser de cal, 0,2 ml de soluţie

10 % de acetat de thaliu şi 0,5 ml de penicilină (200.000 UI/ml). Se

ajustează pH-ul la 7,6 şi se sterilizează prin filtrare.

6.3.5. Medii de cultură: - este recomandată utilizarea în paralel a mai

multor variante de mediu, pentru a spori şansele de recuperare a

bacteriei

Mediul Eaton’s: 21 g de Broth base PPLO (fără cristal-violet)

dizolvaţi în 700 ml apă deionizată, peste care se adaugă 100

ml extract proaspăt de drojdie, 200 ml ser neinactivat de cal,

10 g glucoză, 0,5 ml de penicilină (200.000 UI/ml), 12,5 ml

de soluţie roşu fenol 0,2 % şi 0,02 g de ADN. Se ajustează

pH-ul la 7,6-7,8 şi se sterilizează prin filtrare.

Mediul Chanock, Hayflick şi Barile, constituit din: 7 părţi

Difco PPLO broth, 2 părţi ser de cal neinactivat, 1 parte

extract 25 % de drojdie, suplimentat cu acetat de thaliu ad. 1:

2.000, dextroză ad. 1 %, roşu fenol ad. 0,002 %.

Mediul Friis modificat – 500 ml tampon salin Hank’s, 8,2 g

brain heart infusion broth (Difco), 8,7 g PPLO fără cristal-

violet (Difco) şi 750 ml apă deionizată. Se autoclavează, apoi

se adaugă 60 ml extract proaspăt de drojdie, 4,5 ml de soluţie

0,5 % roşu fenol, 250 mg bacitracină şi 250 mg meticiclină.

La final, se adaugă ser suin inactivat şi de cal până la o





porcilor

31 | P a g e

concentraţie finală de 10 % din fiecare. Se ajustează pH-ul la

valoarea 7,4 şi se sterilizează prin filtrare.

Mediul Goodwin: 40 % tampon salin Hank’s, 30 % bulion

Hartley’s, 10 % soluţie 5 % de hidrolizat de lactalbumină,

20 % ser suin, 0,1 % acetat de thaliu, 0,5 % extract de drojdie,

200 unităţi/ml de penicilină.

6.3.6. Mediul solid pentru cultivare (PPLO agar): PPLO broth base,

noble agar, extract proaspăt de drojdie, glucoză, L-arginină, sare

disodică de ADN şi sare disodică de NAD, cu adăugarea de ser suin

inactivat până la o concentraţie finală de 15-20 %.

6.4. Recoltarea de probe de la animalele din experiment:

6.4.1. tampoane sterile din bumbac pentru secreţiile nazale: - se

inserează cât mai adânc în fosa/fosele nazale, apoi se imersează în

eprubete ce conţin mediu steril de transport

6.4.2. de la animalele aflate în fază acută de boală se poate încerca

recoltarea de lichid pleural prin puncţia cavităţii toracice în

porţiunea declivă din spaţiul intercostal VII-VIII.

6.4.3. la abator, sunt recoltate probe din leziunile localizate la nivelul

pulmonilor: suprafaţa exterioară a organului este sterilizată prin

flambare sau opărire. Acolo unde este posibil, se foloseşte un set

diferit de instrumente sterile pentru fiecare recoltare. În mod aseptic

se recoltează fragmente mici (1-3 cm3) de la nivelul porţiunii de

trecere dintre ţesutul normal şi cel afectat. Fiecare fragment este

introdus într-un flacon cu filet, conţinând mediu de transport steril.

Leziunile încapsulate sunt extrase, după răzuirea suprafeţei cu

ajutorul uneui scalpel şi introduse în recipiente cu mediu de

transport.





porcilor

32 | P a g e

6.5. Transportul probelor

6.5.1. Probele sunt trimise la laborator cât mai curând după recoltare,

preferabil în aceeaşi zi

6.5.2. Păstrarea probelor se face la rece (≈ 4°C)

6.5.3. Dacă examinarea microbiologică nu se poate realiza imediat,

păstrarea probelor la congelatorul de temperaturi joase este absolut

necesară.

6.6. Tehnica pentru izolare în medii lichide şi solide:

6.6.1. Se efectuează diluţii zecimale (10-1

—10-6

) din probele recoltate,

folosind mediu lichid

6.6.2. Din fiecare probă se inoculează câteva picături pe suprafaţa

mediilor solide sau se realizează însămânţarea prin amprenta

porţiunii de organ pe suprafaţa agarului nutritiv. De asemenea, este

recomandată inocularea cu ajutorul tampoanelor îmbibate cu probe,

prin metoda striurilor paralele.

6.6.3. Controalele se menţin la termostat, în condiţii de umiditate, 5 %

CO2, 37°C.

6.6.4. Controalele cu mediu lichid sunt urmărite zilnic pentru a constata

semne de dezvoltare a culturii sau virarea culorii mediului dată de

indicatorul roşu-fenol. În fascicul de lumină, culturile de

Mycoplasma apar între a 3-a şi a 5-a zi de cultivare, conferind o

turbiditate slabă mediului, fiind mai uşor de pus în evidenţă prin

compararea cu un recipient cu mediu neinoculat.

6.6.5. Controalele cu mediu solid sunt examinate după 2-3 zile cu

obiectivul 35x pentru a constata aspectul cultural de „ouă ochiuri”

al coloniilor.





porcilor

33 | P a g e

6.6.6. În funcţie de rezultatele observate, se poate lua una din

următoarele decizii:

pasajul culturii din mediu lichid în mediu lichid: se transferă

un volum egal cu 10 % de inocul

pasajul culturii din mediu lichid în mediu solid: o picătură de

inocul este folosită pentru a umecta suprafaţa plăcii cu agar

pasajul culturii din mediu solid în mediu lichid: colonii

izolate, corespunzătoare sunt recoltate cu ajutorul unei spatule

sterile sau cu o pipetă Pasteur şi imersate în mediu lichid

pasajul culturii din mediu solid în mediu solid: se decolează o

porţiune de agar ce conţine colonii corespunzătoare şi se

suprapune, cu faţa în jos, pe suprafaţa unei alte plăci cu agar.

6.6.7. culturile cu valoarea pH sub 7 sunt improprii

dezvoltării/menţinerii micoplasmelor, astfel încât se evită atingerea

acestei valori, realizându-se pasaje repetate.

6.6.8. pasajele care necesită mai mult de trei încercări pentru izolare

sunt considerate negative şi sunt eliminate.

6.6.9. pasajul anterior este păstrat în condiţii corespunzătoare, astfel

încât, la sfârşitul experimentului, cea mai veche cultură poate avea

patru săptămâni.

7. Raportare/Înregistrări

7.1. Rezultatele sunt înregistrate în fişele de experiment

7.2. Eventualele probleme sunt aduse la cunoştinţa responsabililor de proiect.

7.3. Orice deviaţie de la procedură trebuie aprobată şi înregistrată.





porcilor

34 | P a g e

8. Referinţe

Lucrări, documente la care s-a făcut apel pentru întocmirea prezentei

proceduri. Ex.:

8.1. Bacteriologie – Lucrări aplicative – Dănuţ Turcu, 2004

8.2. Bacteriologie veterinară specială – Simona Ivana, 2007

8.3. Studiul unor tulpini de Mycoplasma izolate de la porc – Ioan Jula , 1976

8.4. Isolation of Mycoplasma hyosynoviae from pneumononic lung of swine,

Dahlia, H., Tan, L.J., Zarrahimah, Z. and Maria, J. – Veterinary

Research Institute, 31400 Ipoh Perak, Malaysia, 2009

8.5. Diagnosis of Mycoplasma hyopneumoniae, Thacker EL. – Swine Health

Prod., 2004

8.6. Replication of Mycoplasma pneumoniae în Broth Culture, Iolanda E. Low,

Monroe D. Eaton, Journal of Bacteriology, 1965

8.7. PORCINE RESPIRATORY DISEASE COMPLEX (PRDC): A REVIEW.

II. DIAGNOSTICS, TREATMENT AND PREVENTION -

Bulgarian Journal of Veterinary Medicine ,2008

8.8. Evaluation of Mycoplasma hyopneumoniae growth by flow cytometry - P.

Assuncao, R. Diaz, J. Comas, C.M. Ruiz de Galarreta, O.R.

Gonzalez-Llamazares and J.B. Poveda, 2005

8.9. Swine mycoplasmoses, M. KOBISCH, N.F. FRIIS, 1996

8.10. Detection of Mycoplasmas in Cell Cultures by Cultural Methods,

Methods in Molecular Biology, Vol. 104 – Mycoplasma

protocols, Gerald. K. Masover, Frances A. Becker,

8.11. Detection of Mycoplasmas in Cell Cultures by Cultural Methods,

Methods in Molecular Biology, Vol. 104 – Mycoplasma

protocols, Robin Nicholas, Samantha Baker,





porcilor

35 | P a g e

8.12. Isolation of Mycoplasma hyopneumoniae and its association with

pneumonia of pigs in Australia, Sue L. Furlong, B. Sc., A.J.

Turner, Altwood Veterinary Research Laboratory, Westmeadows,

Victoria

8.13. Farmacopeea Europeană 7.0 (European Pharmacopoeia 7.0)

8.14. Manualul Calităţii Romvac

Modul de lucru:

a. Prelucrare:

Probele au fost însămânţate pe controale perechi : tuburi cu

mediu selectiv lichid şi plăci cu mediu selectiv agarizat şi

menţinute la anaerostat la 37°C.

b. Citire la 24 ore:

în toate tuburile s-a constatat dezvoltarea unei culturi

abundente, cu miros fetid, depozit masiv, turbiditate intensă,

făcând imposibilă prelucrarea ulterioară a acestor probe. În

frotiuri s-a evidenţiat existenţa unei bacterii cocoide, Gram-

negativă, în majoritatea cazurilor.

În plăcile cu agar s-a obţinut uniformitate a dezvoltării culturale pe

întreaga suprafaţă a mediului. În frotiuri s-a evidenţiat o populaţie bacteriană

cocobacilară, Gram-negativă. Într-o singură placă, după 5 zile de termostatare,

s-a observat dezvoltarea unor colonii asemanătoare micoplasmelor. S-a încercat

pasajul pe mediu lichid şi solid, dar nu a dat rezultate.





porcilor

36 | P a g e

EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU IZOLAREA M.

HYOPNEUMONIAE

Pentru izolarea M. hyopneumoniae din probele de organe recoltate de la

porcine, s-au recoltat 12 probe pulmoni şi ganglioni traheobronhici.

În urma punerii pe medii speciale a izolatelor din organe (pulmoni şi

ganglioni traheobronhici) nu s-au dezvoltat colonii specifice pentru

micoplasme. De asemenea, examenul bacterioscopic efectuat din culturi a fost

negativ.

EXAMENUL VIRUSOLOGIC

Au fost prelucrate probe organe recoltate de la porcine provenienta SC

PIG COM – SA Babadag Jud. Tulcea.

Probele de ţesut (pulmon, splină, rinichi) au fost triturate individual şi

resuspendate în PBS în diluţie 1/10. Soluţiile triturate se centrifughează la 2000

rpm timp de 20 de minute şi se filtrează prin filtru de clarificare 0,40 µm şi apoi

prin filtru steril de 0,22 µm. Pentru clarificare s-au utilizat filtre Durapore HPF

Millex – HV, iar pentru sterilizare s-au utilizat filtre Millex – GS Millipore.

Suspensiile filtrate au fost repartizate pe monostrate din liniile celulare

VERO (rinichi de maimuţă verde africană, adultă), MARK (rinichi de maimuţă)

şi PK15 (rinichi de porc adult), pe plăcuţe pentru culturi celulare cu 12 godeuri

pentru fiecare probă (suspensie filtrată). Un godeu a fost inoculat în mediu şi

două godeuri au fost inoculate pe monostrat, cu cîte 0,2 ml iar un godeu a rămas

martor de cultură, pentru fiecare probă testată. Fişele liniilor celulare utilizate

sînt prezentate în anexe.





porcilor

37 | P a g e

Fig.4 Probe de organe recoltate de

la suine, provenienta PIGCOM

Fig.5 Esantioane inocul prelucrate

pentru insamantarea pe culturi

celulare

Fig.6 Linia celulară Vero





porcilor

38 | P a g e

Plăcile au fost examinate zilnic în vederea urmăririi apariţiei unor

modificări ale monostratului datorate inoculului, (prezenţa virusului), cu

ajutorul unui microscop ranversat tip ZEISS, cu obiectiv 16X şi ocular 10X..

Pe liniile celulare VERO şi MARK nu au fost observate modificări

(prezenţa efectului citopatic) datorate inoculului.

Pe plăcile cu linia celulară PK15 în godeurile inoculate s-a observat o

modificare a monostratului sub forma unor focare de diferite mărimi cu celule

refringente şi cu monostratul desprins de pe suport. Aceste focare au fost

prezente la 3 dintre probele analizate.

Fig.7 Efect citopatic aparut pe

linia celulara PK15 inoculată cu

triturat de pulmoni

În lucrările viitoare se vor efectua 2 – 3 pasaje, urmărindu-se

transmisibilitatea, prezenţa ECP (efectului citopatic) precum şi caracterizarea

izolatelor virale prin IFD (imunofluorescenţă directă) utilizînd kitul: FITC

conjugat BIO 268 cu anticorpi monoclonali anti- virus PRRS.





porcilor

39 | P a g e

ROMVAC COMPANY S.A.

COMPARTIMENTUL TULPINI VIRALE ŞI REAGENŢI

FIŞA Nr. 1 / 04.10.1991

1. PROVENIENŢA

ECACC, PHLS, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton,

Salisbury Wilts SP40JG – UK.

2. CARACTERISTICILE DE BAZĂ

2.1. Ţesutul de bază: rinichi de maimuţă verde africană adultă Japonia

(1962).

2.2. Rata de multiplicare: 1:30 în 7 zile cu schimbare de mediu de 3 ori în

7 zile şi pH păstrat la 7.4 (CO2 + aer).

2.3. Cariotip: frecventa distribuţiei cromozomilor la 50 celule: 2n = 60.

2.4. Mediu de creştere: EMEM + 5% BFS.

2.5. Mediu de congelare: EMEM + 30% BFS + 10% DMSO.

2.6. Pasaje din stocul în azot lichid: - periodic conform necesităţilor şi

pentru conservarea aproape de 100% a viabilităţii.

2.7. Susceptibilitate la virusuri: SV – 40, SV- 5, rujeolă, arbovirusuri,

reovirus, rubeolei, adenovirusuri simiene şi poliovirus.

3. OBSERVAŢII

Linia de celule VERO a fost depozitată la ECACC, de către WHO, la pasajul

134 (produs al Institutului Merieux – Franţa – celule cultivate în fermentor pe

micropurtători Cytodex 1).

S-a constituit un stoc de celule cultivate conform indicaţiilor ECACC:

Şef Compartiment

Dr. Gh. MOŢIU





porcilor

40 | P a g e

ROMVAC COMPANY S.A. Nr. Înregistrare............

COMPARTIMENT TULPINI,

LINII CELULARE ŞI REAGENŢI

F I Ş A

PENTRU LINIA CELULARĂ

PK 15 (Kidney, Porcine Sus scrofa)

1. PROVENIENŢA: American Type Culture Collection 12301 Parklonn

Drine, Rockville, Maryland 20852 USA. PK 15 – ATCC Nr. CCL 33 –

pasaj 133


2.1. Ţesutul de bază: Rinichi de porc adult. Linia parentală a PK 15, PK –

2a, a fost iniţiată în noiembrie 1955 de către E. Stice de la Cutter Lab.

Berkeley California.

2.2. Rata de multiplicare: 1 / 2 – 1 / 4 cu reîmprospătarea mediului de

2 – 3 ori pe săptămînă. Subcultivarea se face cu soluţie proaspătă 0.25%

tripsină + 0.03% EDTA în film.

2.3. Cariotip: Frecvenţa distribuţiei cromozomilor la 50 celule: 2n = 38

2.4. Mediu de creştere: MEM (Eagle) cu aminoacizi neesenţiali, piruvat de

sodiu 1mM, cu Earle BSS 95% + 5% BFS.

2.5. Mediu de congelare: Mediu de creştere 95%+5% glicerină, fără

antibiotice.

2.6. Pasaje din stocul în azot lichid: periodic, conform necesităţilor şi

pentru

conservarea viabilităţii celulelor în azot lichid aproape de 100 %.

2.7. Susceptibilitate la virusuri: Virusul stomatitei veziculare (Indiana

Strain), vaccinia, reovirusurile tip 2, 3, adenovirusurile tipurile 4, 5,

Coxackie B2, B4, B5, B6 şi virusul pestei porcine, tulpina Thyverval.

Nesusceptibilă la poliovirus tip 2.

3. OBSERVAŢII: Linia de cultură celulară PK 15 a fost primită în stare

congelată (fiole în gheaţă carbonică). S-a constituit un stoc.

4. RESPONSABIL CU ÎNTREŢINEREA LINIEI: Dr. Gh. MOŢIU





porcilor

41 | P a g e

ROMVAC COMPANY S.A. Nr. Înregistrare............

COMPARTIMENT TULPINI,

LINII CELULARE ŞI REAGENŢI

F I Ş A

PENTRU LINIA CELULARĂ

MARK 145

1. PROVENIENŢA: AMES – NVSL – USA MARK – 145 provine din MA –

104.


2.1. Ţesutul de bază: Rinichi de maimuţă.

2.2. Rata de multiplicare: 1 / 2 – 1 / 4 cu schimbarea mediului de 2 – 3 ori

pe săptămînă. Subcultivarea se realizează la confluenţă cu soluţie

proaspătă T+V în film.

2.3. Cariotip: 2.4. Mediu de creştere: EMEM 90% + BFS 10%.

2.5. Mediu de congelare: Mediu de creştere 95% + DMSO 5%.

2.6. Pasaje din stocul în azot lichid: periodic, conform necesităţilor şi

pentru conservarea viabilităţii celulelor în azot lichid aproape de 100 %.

2.7. Susceptibilitate la virusuri:P.A.R.R.S. Şi alte virusuri animale (BIA,

Aujeszky etc. Conf Dr. Olaru LCSVD).

3. OBSERVAŢII

Linia de cultură celulară MARK - 145 a fost primită sub formă de

monostrat pe placă de plastic de la LCSVD. A fost constituit un stoc.

4. RESPONSABIL CU ÎNTREŢINEREA LINIEI: Dr. Gh. MOŢIU





porcilor

42 | P a g e

Raport activitate biologie moleculara

Pentru izolarea materialului genetic viral şi bacterian s-a folosit tehnica

PCR urmărindu-se protocolul de extracţie, amplificare şi identificare, astfel:

1. Material biologic – materialul biologic a fost reprezentat de omogenate

pulmon colectate în cadrul proiectului.

2. Extractia ADN viral s-a efectuat prin utilizarea kit-ului PureLink

Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, Life Technologies), conform

recomandarilor producatorului (Tabelul 1).





porcilor

43 | P a g e

Tabelul 1

Protocol extractie ADN viral utilizand kit-ul PureLink Genomic DNA

Nr. Crt Acţiune μl/probă

1 Pobă biologică 200 μl

2 Proteinaza K 20 μl

3 Rnaza A 20 μl

4 Omogenizare prin vortexare. Centrifugare tip spin pentru colectare

Incubare 2 minute la temperatura camerei -

5 Tampon de liza PureLink Genomic Lysis/Binding Buffer 200 μl


Incubare 10 minute la 55ºC -

7 Etanol absolut 200 μl


9 Transfazare in coloniţele de purificare. Volumul maxim de incărcare al

coloniţelor este de 650 ul. -

10 Centrifugare 1 minut la aproximativ 13000 rpm; îndepărtare eluat -

11 Se pipetează tampon spalare I 500 μl

12 Centrifugare 1 minut la aproximativ 13000 rpm; îndepărtare eluat -

13 Se pipetează tampon spalare II 500 μl

14 Centrifugare 30 secunde la aproximativ 13000 rpm; îndepărtare eluat. Se

înlocuiesc tuburile de colecţie -

15 Se centrifughează 3 minute la viteza maximă. Se aruncă tubul de colecţie si

se inseră coloniţa într-un tub Eppendorf de 1,5ml. -

16 Tampon elutie 100 μl

17 Incubare 1 minut la temperatura camerei -

18 Se centrifughează 1 minut la 11.000 – 13000rpm -





porcilor

44 | P a g e

3. Depozitarea ADN viral s-a efectuat la temperaturi adecvate (-20ºC) pana

la efectuarea amplificarii.

Amplificarea – protocol de screening

1. Primerii utilizati pentru amplificare au fost descrisi anterior, (Mattsson si

col., 1995; Holko si col., 2004), cu amplificarea unui fragment de 649

nucleotide de la nivelul 16S ARNr (ARN ribozomal).

2. Kit-ul utilizat pentru aceasta etapa – GoTaq Flexi DNA Polymerase

(Promega), cu un volum final de 50µl (Tabelul 2)

Tabelul 2

Reagentii utilizati pentru amplificare

Reagent

Volum/proba Numar de

probe

Volum final

Tampon Green Buffer 5x 10µl

MgCl2, 25mM 3µl

dNTP 10 mM 1µl

Primer Sens (20 μM) 1,5µl

Primer Antisens (20 μM) 1,5µl

Apa ultrapura 27,75µl

GoTaq DNA Polymerase 0,25µl

45µl mix cu 5µl ADN

3. Profil termic – in general, profilul termic a fost cel recomandat de

literatură (Tabelul 3).





porcilor

45 | P a g e

Tabelul 3

Profil termic amplificare

95ºC pentru 2 minute – denaturare initiala

94ºC pentru 35 secunde

60ºC pentru 45 secunde 40 cicluri PCR

72ºC pentru 1 minut

72ºC pentru 5 minute – extensie finala

4ºC pana la efectuarea electroforezei





porcilor

46 | P a g e

Bibliografie

1) MATTSSON JENS G., KATRIN BERGSTRO¨ M, PER WALLGREN,

AND KARL-ERIK JOHANSSON. Detection of Mycoplasma

hyopneumoniae in Nose Swabs from Pigs by In Vitro Amplification of

the 16S rRNA Gene. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,

Apr. 1995, p. 893–897

2) Holko I., Urbanova J., Holkova T., Kmet V. Diagnostics of main

bacterial agents of porcine respiratory diseases complex (PRDC) using

PCR detection of Mycoplasma hyopneumoniae. Vet. Med. – Czech, 49,

2004 (2): 35–41





porcilor

47 | P a g e

Analiza probelor recoltate

Extracţia şi amplificarea au fost efectuate conform protocoalelor

optimizate anterior. Pentru virusul PRRS au fost identificate un număr total de

şapte probe pozitive, după cum urmează:

Proba 2 = purcel înţărcat x 44 zile, NOTA din 10.01.2013.

Proba 3 = purcel înţărcat x 65 zile, NOTA din 10.01.2013.

Proba 10 = avorton, 5/1-PIG-COM Tulcea - NOTA din 04.03.2013.

Proba 12 = avorton, 5/3-PIG-COM Tulcea - NOTA din 04.03.2013.

Rezultatele sunt prezentate în figura 1.

Fig.8 – rezultatele testului RT-PCR identificare genom specific PRRS

În ceea ce priveşte circovirusul porcin tip 2 (PCV2), acesta a fost

identificat la un număr total de 5 probe, după cum urmeaza:

Proba 2 - PIG-COM Tulcea - purcel înţărcat x 44 zile, NOTA din

10.01.2013.

Proba 3 - PIG-COM Tulcea - purcel înţărcat x 65 zile, NOTA din

10.01.2013.





porcilor

48 | P a g e

Proba 10 - PIG-COM Tulcea – avorton-individualizare 5/1, NOTA din

04.03.2013.


04.03.2013.


04.03.2013.

Nicio proba nu a fost pozitiva pentru prezenta genomului specific M.

hyopneumoniae.

Rezultatele testelor de biologie moleculară pentru PCV2 şi M.

hyopneumoniae sunt prezentate în figura 2.

Fig. 9 – rezultatele testului RT-PCR identificare genom specific PCV2 si M. hyopneumoniae





porcilor

49 | P a g e

Activitatea IV.3.: Analiza statistică a datelor obţinute în experimentele

efectuate.

Investigaţiile efectuate au fost realizate pe porcine din sistemul de

creştere intensivă. Animalele au beneficiat de parametri optimi de producţie şi

reproducţie, condiţii de hrănire şi întreţinere corespunzătoare, situaţie sanitar-

veterinară bună.

În tabelele prezentate au fost centralizate rezultatele obţinute în urma

determinărilor serologice efectuate prin metoda ELISA.

Astfel, la suinele crescute în sistem intensiv, din 83 de probe s-au obţinut

următoarele rezultate : 41 probe au fost pozitive la PRRS (49%), 6 pozitive şi

18 suspecte (29%) în cazul infecţiei cu Circovirus iar la infecţia cu M.

hyopneumoniae s-au identificat 23 probe pozitive şi 2 suspecte (30%).

Fig.10 Rezultate comparative intre titrul anticorpilor anti-PRRS şi anti-Rujet

81

0 0 0 0

42

100

0

80

00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

85 zile 92 zile 109 zile 180 zile scroafe in

asteptare

varsta

ELISA PRRS - Rujet

PRRS

Rujet





porcilor

50 | P a g e

Fig.11 Rezultate comparative intre titrul anticorpilor anti-Circovirus şi anti-Rujet

33

0

6

0

19

4245

0

80

00

10

20

30

40

50

60

70

80


asteptare

varsta

ELISA Circovirus - Rujet

Circovirus

Rujet

Fig.12 Rezultate comparative intre titrul anticorpilor anti-M. hyopneumoniae şi anti-

Rujet

14

0 0 0 0

4245

0

40

00

5

10

15

20

25

30

35

40

45


asteptare

varsta

ELISA M. hyopneumoniae - Rujet

M. hyo

Rujet





porcilor

51 | P a g e

Fig.13 Rezultate comparative intre titrul anticorpilor impotriva germenilor

imunosupresori şi al anticorpilor antirujetici

81

33

14

0 06

0 0 0

19

0

42

100

4545

0

8080

40

0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


asteptare

varsta

Rezultate ELISA

PRRS

Circovirus

M. hyo

Rujet

În urma însămânţării pe medii speciale a probelor de pulmoni şi ganglioni

traheobronhici, nu s-au dezvoltat colonii specifice micoplasmelor.

În urma examinarii prin metoda PCR a probelor de organe suine, s-au

obtinut urmatoarele rezultate: pentru virusul PRRS s-au identificat 4 probe

pozitive, iar Circovirusul porcin tip 2 (PCV2) a fost identificat la un număr total

de 5 probe. Nu au fost probe pozitive pentru prezenta genomului specific M.

hyopneumoniae.

La examenul virusologic, pe plăcile cu linia celulară PK15 în godeurile

inoculate s-a observat o modificare a monostratului sub forma unor focare de

diferite mărimi cu celule refringente şi cu monostratul desprins de pe suport, la

3 probe. Urmează ca în următoarele lucrări să se investigheze transmisibilitatea,

prezenţa ECP (efectului citopatic) precum şi caracterizarea izolatelor virale prin

IFD (imunofluorescenţă directă).





porcilor

52 | P a g e

S-au efectuat examene bacteriologice din organe utilizându-se tehnici

bacteriologice clasice pe medii de îmbogăţire şi selective, solide şi lichide.

Culturile obţinute au fost caracterizate morfo-cultural şi biochimic prin teste

clasice si prin sisteme multitest API 20NE. Tulpinile bacteriene studiate au fost

identificate ca aparţinând speciilor Salmonella spp. şi Mannheimia haemolytica.





porcilor

53 | P a g e

CONCLUZII

1. Corelatiile clinico-epidemiologice din ferma PIGCOM Satu Nou, au

condus la diagnosticul de sindrom respirator si de reproductie porcin.

2. Testele de laborator au urmarit pe de o parte izolarea si identificarea

agentilor virali si bacterieni, iar pe de alta parte decelarea anticorpilor

specifici:

pentru izolarea virusului PRRS au fost realizate suspensii filtrate

din probe de ţesut (pulmoni, splină, rinichi), care au fost inoculate

pe monostrate din liniile celulare VERO, MARK si PK15, conform

tehnicilor amintite. Pe liniile celulare VERO si MARK nu au fost

observate modificări (prezenta efectului citopatic) datorate

inoculului. Pe plăcile cu linia celulara PK15 inoculate cu triturat de

pulmoni s-a observat efect citopatic.

prin testul RT-PCR s-au identificat proteine din genomul viral,

găsindu-se 4 probe pozitive pentru PRRS şi 5 pentru Circovirusul

porcin tip 2 (PCV2). Nicio proba nu a fost pozitivă pentru prezenţa

genomului specific M. hyopneumoniae.

decelarea anticorpilor specifici din serul animalelor a fost facută

prin investigatii serologice care au evidenţiat o incidenţă crescută a

infecţiei cu virusurile PRRS, Circovirus si M. hyopneumoniae la

porcii în vârstă de 85 zile, 180 zile şi la scroafe în aşteptare.





porcilor

54 | P a g e





porcilor

55 | P a g e





porcilor

56 | P a g e





porcilor

57 | P a g e





porcilor

58 | P a g e





porcilor

59 | P a g e





porcilor

60 | P a g e





porcilor

61 | P a g e





porcilor

62 | P a g e





porcilor

63 | P a g e





porcilor

64 | P a g e





porcilor

65 | P a g e





porcilor

66 | P a g e





porcilor

67 | P a g e





porcilor

68 | P a g e





porcilor

69 | P a g e





porcilor

70 | P a g e





porcilor

71 | P a g e





porcilor

72 | P a g e





porcilor

73 | P a g e





porcilor

74 | P a g e





porcilor

75 | P a g e





porcilor

76 | P a g e

raport de faza

Documents