UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I MEDICIN VETERINAR FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

LUCRARE DE DIPLOM

Bucureti 20081

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I MEDICIN VETERINAR FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

LUCRARE DE DIPLOMAspecte privind diagnosticul i imunoprofilaxia n rabie

Bucureti 20082

Cuprins Introducere Partea I - Consideraii generale asupra virusului rabic Capitolul 1 - Istoricul rabiei1.1. Rspndirea i importana bolii

6 7 810

Capitolul 2 - Virusul Rabic Caracteristici generale2.1. Taxonomia virusului rabic 2.2. Structura virusului rabic 2.3. Caracteristici chimice ale virusului rabic 2.4. Replicarea virusului rabic 2.5. Cicul infeciei i replicrii 2.6. Caractere epizootologice 2.7. Patogeneza 2.8. Epidemiologie 2.9 Simptomatologie 2.10 Diagnostic 11 12 14 14 17 18 20 21 21 23

11

Capitolul 3- Investigaii, tratament, vaccinuri, prevenire i combatere 273.1. Ivestigaii 3.2. Tratament Generaliti 3.3. Vaccinarea 3.4. Prevenire 3.5. Combatere 27 28 29 31 37

Capitolul 4 - Turbarea la diverse specii de animale4.1. Turbarea la cine 4.1.1. Forma furioas sau turbarea 4.1.2. Forma paralitic, mut sau linitit 4.2. Turbarea la alte specii de animale 37 38 41 43

37

Partea a II a Cercetri proprii3

45

Capitolul 5 - Testul de imunofluorescen direct pentru diagnosticul Rabiei la speciile mamifere5.1. Principiul metodei 5.1.1. Reactivii necasari reaciei 5.2. Echipamente de ncercare i mijloace de msurare 5.2.1. Aparatura necesar 5.2.2. Instrumentarul necesar 5.2.3. Alte materiale 5.2.4. Sticlria necesar 5.3. Mod de lucru 5.3.1. Prelevare i conservare/ pregtire probe 5.4. Efectuarea reaciei de imunofluorescen direct 5.4.1. Efectuarea de amprente 5.5. Realizarea de frotiuri prin metoda amprentei 5.5.1 Uscarea amprentei 5.5.2. Fixarea i uscarea 5.5.3. Marcarea 5.5.4. Preparare i depunere conjugat 5.5.5. Incubare 5.5.6. Splare 5.5.7. Montare lamele 5.5.8. Validare 5.5.9. Interpretarea rezultatelor

4646 46 46 46 46 46 47 47 47 49 49 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51

Capitolul 6 - Testul de bioprob pe oareci cu confirmare prin imunofluorescen direct pentru diagnosticul Rabiei la speciile mamifere 536.1. Principiul metodei 6.2. Reactivii necasari reactiei 6.3. Echipamente de ncercare i mijloace de msurare4

53 53 53

6.3.1. Aparatura necesar 6.3.2. Instrumentarul necesar 6.3.3. Alte materiale 6.3.4. Sticlria necesar 6.3.5. Animalele de laborator 6.4. Mod de lucru 6.4.1. Prelevare i conservare/ pregtire probe 6.4.2. Inocularea oarecilor 6.4.3. Prepararea inocului n hot 6.4.4. Sterilizarea suspensiei de creier 6.4.5. Inocularea prorpiu zis 6.4.6. Recoltarea creierului de oarece 6.4.7. Validarea rezultatelor 6.4.8. Interpretare rezultate 6.4.9. Exprimarea rezultatelor

53 53 53 54 54 54 54 55 55 56 56 57 57 57 58

Capitolul 7 - Cazuri suspecte de rabie n Bucureti i n Ilfov7.1. Probe din Ilfov n 2007 7.2. Probe din Bucureti n 2007 7.3. Probe Bucureti n 2008 7.3.1. Materiale necesare 7.3.2. Prelevarea probelor 7.3.3. Rezultate 7.3.4.Testul de bioprob pe oricei albi de laborator 7.3.4.1. Materialele necesare efectuarii testului de bioprob 7.4. Probe din Ilfov n 2008 7.4.1 Materialele necesare pentru testul de IDF 7.4.2 Prelevarea probelor 7.4.3. Rezultat 7.5. Rezultate i Conluzii 7.6. Bibliografie5

5959 59 60 60 60

70 71 71 78 78 78 79 84 87

IntroducereRabia Este o encefalomielit viral acut, de obicei fatal odat ce apar semnele clinice. Rezervoare de rabie se gsesc pretutindeni n lume, dar rabia canin predomin n Africa, Asia, America Latin. n Europa, prin metodele profilactice reprezentate de vaccinri, practic rabia canin a fost eradicat. Din pcate, cinele poate reprezenta o cale facil de transmitere a virusului, din rezervorul meninut nc de animalele slbatice. La om, boala se poate transmite prin muctur sau contact direct cu saliva animalului infectat. Principalele semne ale bolii sunt cele cu predominan pe sistemul nervos, schimbri n comportament, agresivitate. Manifestrile clinice pot fi imprite n trei faze, perioada prodromal, faza sau forma furioas i faza paralitic. Practic, n faza a doua se regsete agresivitatea paradoxal i cel mai important aspect este dispariia oricrei precauii fa de un duman de specie. Cinele va ncerca s mute chiar cu riscul automutilrii. A treia faz, cea paralitic, este reprezentat n principal de paralizia musculaturii maseterului i a gtului, lucru ce duce la incapacitatea animalului de a nghiii saliva, mandibula fiind practic cobort permanent. Datorit incidenei crescute i la pisici, se recomand vaccinarea anual att la cine ct i la pisic, dar i nregistrarea acestor vaccinri.

Virusul rabic [20]

6

Partea I Consideraii generale asupra virusului rabic

7

Capitolul 1 Istoricul rabieiTurbarea este o maladie infecioas cunoscut nc din antichitate (Babilon Codex sec 23 .C.). Cuvntul grecesc lyssa, utilizat pentru desemnarea rabiei, nseamn nebunie. Cuvntul rabie provine de la latinescul "rabiere" (a fi violent) derivat din sanscrita veche "rabhas" (care nseamn tot a fi violent). Alte denumiri ale bolii sunt turbare sau hidrofobie (n limba greac fric de ap) [24]. O descriere ampl a bolii dateaz din primul secol al erei noastre i este fcut de Celsus. Transmisibilitatea prin muctur este admis, la fel, de mult timp, ns acest lucru nu a fost demonstrat, experimental, dect la nceputul secolului al XIX lea, cnd Zinke (1804), apoi Magendie (1821) i Hertwig (1829) reuesc s transmit, cu regularitate, turbarea prin saliva animalelor bolnave. n 1879, Galtier a fcut primele ncercri de vaccinare antirabic a animalelor, reuind s imunizeze taurinele prin inocularea intravenoas de saliv provenit de la animale bolnave [24]. n 1881 Pasteur i Roux au stabilit c agentul turbrii se gsete n sistemul nervos central la animalele bolnave sau moarte de turbare i c, prin inocularea creierului sau mduvei spinrii, boala se reproduce totdeauna la animalele de laborator. Agentul patogen nu s-a putut observa la microscop i nici nu s-a putut cultiva pe medii sintetice i de aceea Pasteur l-a denumit virus rabic (de la cuvntul latin virus otrav). Ulterior, n perioada 1881 1884, Pasteur a elaborat prima metod tiinific de imunizare antirabic, folosind o tulpin de virus rabic (de la o vac infectat) a crei patogenitate a fost modificat prin inoculri subdurale la iepure. Dup aproximativ 60 de pasaje, a constatat c aceast tulpin a devenit apatogen pentru cine, pe cale subcutanat, dar i-a pstrat proprietile imunizante, iar pe cale intracerebral, provoac constant turbarea paralitic, dup o incubaie constant de 7 zile. Aceast variant de virus rabic obinut n laborator a fost denumit de Pasteur virus fix, pentru a-l deosebi de virusul nativ, care circul n natur, denumit virus rabic de strad [10]. Pentru imunizarea antirabic, Pasteur a folosit mduva spinrii de la iepuri inoculai subdural cu virus rabic fix, aceasta fiind uscat n prealabil la temperatura de 22C, n condiii de ntuneric i n prezena hidratului de potasiu timp de 1 pn la 15 zile. Tratamentul antirabic a fost aplicat pentru prima dat de Pasteur, n 1883, la cini i apoi n 1885 la om. n scurt timp, metoda pasteurian s-a extins n toat lumea. Primul institut antirabic este nfiinat la Odesa, de Gamaleia (1886), iar al doilea, la Bucureti, de ctre Victor Babe (1888). n 1889, V. Babe i Lepp au artat c n sngele animalelor imunizate contra turbrii apar anticorpi specifici, care neutralizeaz virusul rabic, att tulpina fix ct i cea de strad in vitro, fiind, astfel, primii care au folosit serul antirabic n tratamentul oamenilor mucai de animale turbate.8

Roux i Nocard (1890), au stabilit c saliva animalelor infectate cu virus rabic de strad devine virulent cu 3 8 zile nainte de apariia primelor simptome de turbare [10]. n 1892, V. Babe a descris modificrile histopatologice n sistemul nervos central i a semnalat prezena unor incluzii oxifile n citoplasma celulelor nervoase, fr s arate, ns, importana lor pentru diagnosticul turbrii. n 1903, Negri demonstreaz specificitatea incluziilor descrise de Babe, care au fost denumite corpusculii lui Negri. n 1950, la Congresul Internaional de Microbiologie din Praga, aceast denumire s-a rectificat i astzi incluziile patognomonice din turbare poart denumirea de corpusculii Babe Negri. Ulterior, s-au elaborat metode de preparare a serului antirabic i a gamaglobulinelor specifice, care se folosesc tot mai larg n tratamentul antirabic al oamenilor grav mucai. De asemenea, s-au elaborat metode noi de preparare a vaccinurilor antirabice vii din tulpini avianizate, a vaccinurilor uscate, etc. n ara noastr, n 1957, Popovici i colab., au elaborat o metod de preparare a vaccinului antirabic din virus fix viu, nemodificat, adsorbit pe hidroxid de aluminiu, care s-a folosit mult timp n tratamentul profilactic al turbrii la om n ara noastr. Descoperiri importante s-au fcut i n domeniul etiologiei, patogeniei i epizootologiei turbrii. S-a reuit cultivarea virusului rabic n culturi de esuturi, n ou embrionate, n tumori maligne in vivo i in vitro, constatndu-se c virusul formeaz incluzii oxifile nu numai n celulele nervoase, dar i n celulele epiteliale din cornee, amigdale, membrana corialantoidian a embrionului de gin, n celulele tumorale, etc, virusul rabic nefiind strict neurotrop. S-a stabilit de asemenea, c n organismul infectat virusul se propag centripet i centrifug nu numai pe traiectul nervilor, dar i pe cale sanguin i limfatic; virusul nu este stabil ci se poate modifica relativ uor sub influena condiiilor de mediu, observndu-se c, n diferite zone, se ntlnesc tulpini de virus ce se deosebesc ca virulen i patogenitate. n prezent, aceast maladie este practic disprut la om n majoritatea rilor dezvoltate, dar continu s reprezinte o problem major de sntate public n multe ri din Asia i n Africa [26].

9

Fig.1. Neuron infectat cu virus rabic ce prezint incluzii intracitoplasmice; Culoarea roie - crmizie indic ariile antigenului viral (complexul avidin- biotin sau IHC) [22]

1.1. Rspndirea i importana boliiTurbarea a fost nregistrat, cu o frecven variabil, n toate continentele. Unele ri, favorizate de poziia geografic, dar i de urma unor msuri dractice, au reuit s devin i s se menin indemne de boal. n general, incidena cazurilor de turbare au variat i variaz n limite foarte largi de la o ara la alta, fiind condiionat de o serie de factori, printre care un rol important revine msurilor-sanitar-veterinare. n cazul aplicrii cu severitate a acestor msuri sanitar veterinare i a celor de imunoprofilaxie, turbarea a putut fi lichidat n numeroase ri [31, 32,34]. n ara noastr, ca urmare a msurilor de distrugere a focarului epizoogen i de vaccinare a cinilor, numrul cazurilor de turbare este n continuu scdere. Turbarea este o boal cu o mare importan economic, dar i cu importan sanitar. Astfel, n rile contaminate de turbare, importana economic a bolii rezult, pe de o parte, din pierderile directe, prin mortalitate, iar pe de alt parte, prin aceea c aciunile de prevenire i combatere a bolii impovareaz greu bugetele statelor respective. Anual, pe glob, zeci de mii de persoane sunt supuse tratamentului antirabic de necesitate i sute de mii de animale supuse imunizrilor antirabice preventive sau de necesitate. Acest lucru reflect sute de mii de zile de munc pierdute pe lng suferine, cheltuieli de deplasare i ntreinere, posibiliti de accidente postvaccinale, uneori mortale [40,42].

10

Capitolul 2 Virusul Rabic Caracteristici generale

Fig.2 Morfologia virusului rabic [25]

2.1. Taxonomia virusului rabicVirusul rabic face parte din Ordinul Mononegavirales, fam Rhabdoviridae, n cadrul genului Lyssavirus, se disting mai multe serotipuri, difereniate prin teste de protecie ncruciat. Folosirea anticorpilor monoclonali direct mpotriva antigenilor nucleocapsidei virale sau glicoproteinei i secvenierea zonei definite genomic a fcut posibil separarea a numeroase subtipuri n cadrul fiecrui serotip. Rabia este o boal viral provocat de acest virus neurotrop care se gsete n saliva animalelor. Se caracterizeaz prin tulburri ale sistemului nervos central, urmate de paralizie i moarte. Mucturile care afecteaz faa, capul, gtul sau minile sunt considerate cu risc crescut. Perioada de incubare este lung, ntre 10 zile i mai bine de un an. Media se situeaz ntre 30-40 de zile [22].Group V: (-)sense RNA VirusesOrder Mononegavirales

Family Rhabdoviridae

Genus Vesiculovirus Lyssavirus (Greek, 'frenzy') Ephemerovirus Novirhabdovirus Cytorhabdovirus Nucleorhabdovirus

Type Species Vesicular stomatitis Indiana virus Rabies virus Bovine ephemeral fever virus Infectious haematopoetic necrosis virus Lettuce necrotic yellows virus Potato yellow dwarf virus

Hosts Vertebrates Vertebrates Vertebrates Vertebrates Plants Plants

2.2. Structura virusului rabic11

Genetic, acest virus prezint un acid ribonucleic (ARN) nesegmentat, de sens negativ cu un genom de aproximativ 12 kb. Aceasta nseamn c ARN-ul nu poate codifica direct sinteza proteinelor i trebuie s copieze informaia pe un ARN mesager, de sens pozitiv. Particulele virale cu dimensiuni de 180 / 70 nm, au forma unui glon, rotunjite la un capt. Se observ variaii de lungime n funcie de tulpin, astfel CVS (Challenge virus standard) este mai lung dect PV (Pasteur virus). Uneori cnd infecia este prea mare, iar numrul gazdelor este redus pot s apar particule defective interferente care prezint un genom trunchiat i, deci, mai multe funcii virale defectuoase i dependente de virionii infeciosi pentru a compensa deficiena. Cum genomul acestor particule interferente este scurtat, acestea se vor replica mai rapid i vor intra n competiie pentru ncapsidare cu genomurile virale normale. Virionul este divizat n dou uniti structurale: un cilindru central i dens format din ribonucleocapsid i anvelopa subire din care sunt proiectai spiculi de 10 nm lungime, situai la 5 nm deprtare unul de cellalt [18]. Studiile biochimice au artat c fiecare virion este constituit dintr-o singur molecul de ARN genomic i din 5 proteine: Proteina L: conine 2142, respectiv 2127 de aminoacizi la tulpinile PV, respectiv SAD-B19 i reprezint o polimeraz ARN dependent cu o mas molecular relativ mare. Glicoproteina G: figureaz printre proteinele rabice cel mai bine studiate pe plan structural i imunologic. Ea este constituit din 524 aminoacizi i conine 2 segmente hidrofobe tipice naturii sale transmembranare. S-au localizat 8 situsuri antigenice pe domeniul extern al proteinei G ale diferitelor tulpini rabice (I-VI, a i G1). Cu excepia situsurilor VI i G1 care au fost identificate n urma denaturrii, restul situsurilor sunt dependente de conformaia spaial a proteinei. Situsul II stimuleaz rspunsul imun prin limfocitele B. Termenul de situs antigenic a fost rezervat regiunilor descrise cu ajutorul anticorpilor monoclonali diferii (II,III,a), n timp ce termenul de epitop a fost folosit pentru situsurile care nu au fost recunoscute de unul sau mai muli anticorpi monoclonali (I,IV,V,VI,G1). De asemenea s-au localizat epitopii limfocitelor T pe proteina G cu ajutorul peptidelor clivate chimic sau al peptidelor de sinteza. Proteina G este implicat n patogeneza virusului i se crede c este responsabil, n parte, de neurotropismul virusului [8, 9]. Nucleoproteina N: este o polipeptid cu o lungime de 450 de aminoacizi care este fosforilat i acoper genomul, protejndu-l de nucleaze i meninndu-l ntr-o anumit conformaie. S-au utilizat anticorpi monoclonali contra proteinei N pentru a diferenia i clasa izolatele slbatice de virus rabic n diferitele tipuri de Lyssavirus. S-au caracterizat 3 situsuri antigenice de-a lungul acestei proteine, dar doar dou sunt cartografiate (poziiile 374 - 383 i 313 - 337 ale segmentelor de aminoacizi). S-au caracterizat de asemenea mai muli epitopi imunodominani ai limfocitelor T12

auxiliare dintre care unul este protector pentru oareci dac este cuplat cu epitopul liniar al proteinei G. (9, 13) Fosfoproteina NS : Este o protein foarte hidrofil care este alctuit din 297 de aminoacizi i prezint diferite stadii de fosforilare i conine mult serin i treonin care permite legarea reziduurilor fosfat. De-a lungul proteinei NS s-au caracterizat 2 situsuri antigenice, ambele situate n poziia 75 - 90. Recent s-au identificat n poziia 191 - 206 epitopi imunodominani ai limfocitelor T citotoxice i T auxiliare. (9, 13) Proteina matriceal sau membranar M: const ntr-o polipeptid lung de 202 aminoacizi care are rolul de a intermedia legtura dintre nucleocapsid i membrana viral. 40 de reziduuri aminoterminale pot participa la inhibarea transcripiei i replicrii nainte de rularea sub form helicoidal a ribonucleocapsidei. Aceast proteina este responsabil, de asemenea, pentru asamblarea i constituirea formei de glon a particulei virale, ct i pentru interaciunea cu proteinele G transmembranare n timpul nmuguririi. Aceast regiune pare s fie implicat n rspunsul imun al gazdei contra rabiei deoarece s-a depistat un determinant antigenic major ntre reziduurile 1 i 72. Un segment central de 19 reziduuri (poziia 89 - 107) pare a fi suficient de hidrofob pentru a permite ancorarea proteinei de membrana virionului. (13, 26)

A

13

B Fig.3. A i B - Structura virusului rabic [6]

2.3. Caracteristici chimice ale virusului rabicVirusul rabic este stabil la pH cuprins ntre 3 i 11 i poate supravieui pentru mai muli ani la temperatura de 70C sau n stare liofilizat la 0 - 4C. Este rapid inactivat prin desicare, expunere la raze UV i X, raze solare, tripsin, betapropiolacton, eter i detergeni [14, 15].

2.4. Replicarea virusului rabic.Transmiterea la om i ntre animale se face prin contact direct prin muctur. In vivo prezint o perioad lung de incubaie, dar acest lucru nu se reflect n cinetica replicrii pe culturi celulare. Replicarea se realizeaz n 8 pai: Adsorbia: Spiculii proteinei G se leag de receptorii celulei gazd. Exist 2 tipuri de receptori celulari pentru virusul rabic: AchR Nicotinic Acethylcholine Receptor i NCAM Neural Cell Adhesion Molecule, acesta din urm fiind recent identificat. Penetrarea: Virionii ptrund n celul prin pinocitoz i fuzioneaz cu membrana veziculei mediate de spiculii glicoproteinei G formnd endozomi. Fuzionarea virusului rabic cu membranele celulare apare la un pH acid. Denudarea: Membrana viral fuzioneaz cu cea endozomal (din membrana celular), iar ribonucleoproteina viral este eliberat n citoplasm. Transcripia: Procesul de transcripie se desfoar n citoplasm. n cazul virusului rabic metoda de transcriere este denumit start - stop sau transcripie secvenial. Aceasta ncepe de la captul 3 al genomului. n primul rnd este transcris secvena primelor 50 de nucleotide leader,14

urmat de cele 5 molecule de ARNm monocistronic care codific proteinele N, NS, M, L i G. Dei aceast metod de transcriere nu este neleas pe deplin se crede c secvenele intergenice (2 - 24 de nucleotide) sunt responsabile de terminarea i reiniializarea transcripiei de ctre polimeraza fiecrei gene [4]. Translaia: Translaia, sinteza proteinelor N, NS, M, L i G n funcie de ARNm corespunztor, se desfoar n ribozomii liberi din citoplasm. Translaia proteinei G ncepe tot n ribozomii liberi, dar se finalizeaz n reticulul endoplasmic granular. Aceasta este transportat de aparatul Golgi spre membrana citoplasmic celular, poriunea glicozilat fiind ndreptat spre exterior. Proteinele L i NS sunt elemente catalizatoare ale polimerizrii moleculelor proteice virale. Proteina N joac un rol structural n ncapsidarea genomului i a antigenomului ARN cu rol n trecerea de la transcripie la replicare [4]. Replicarea: Proteina N mpreun cu ARNv (ARN viral) este responsabil de comutarea de la translaie la replicare. Se presupune c proteina N nou sintetizat se leag de secvena leader a ARNv i previne recunoaterea de ctre polimeraz a semnalelor terminale. Replicarea este un proces non stop care produce un lan pozitiv de ARN. n continuare, polimeraza transcrie ARNv de sens negativ ntr-o caten de sens pozitiv. Acesta servete ca matri pentru transcriptaz pentru a transcrie noi molecule de ARNv sens negativ. Faza replicativ necesit sintez proteic cu implicarea aceleiai polimeraze [4]. Asamblarea: Proteina M este capabil s inhibe sinteza de ARN, s ajute la nrularea n spiral a ribonucleoproteinei i s concentreze proteina G, etape premergtoare nmuguririi. Proteinele N, NS i L mpreun ncapsuleaz lanul negativ de ARN n miezul nucleoproteic. Proteina M formeaz o capsul n jurul acestuia i este responsabil pentru asamblarea n forma de glon i nmugurirea particulelor virale dup ce are loc interaciunea acesteia cu glicoproteinele G transmembranare. Este caracteristic rhabdovirusurilor ca, cele de mai sus, s aib loc ntr-o regiune a citoplasmei care se comport ca o fabric de virusuri i care apare sub form de corpi incluzionali denumii corpi Babe Negri [4]. Eliminarea: virionii prsesc celula gazd prin nmugurire, anvelopa lipidic fiind preluat din membrana celulei gazd [18, 30, 32, 33].

15

Fig.4. Ciclul de multiplicare intracitoplasmatic a rabdovirusurilor [49]

Fig.5. Organizarea genomului rabdovirusurilor. N codific nucleoproteina, P codific fosfoproteina, M codific proteina matricial, G codific glicoproteina, L codific ARN polimeraza [49] Fuziunea virusului rabic mbrac membrana celulei gazd (o adsoarbe) i se ncepe procesul de infecie. Interaciunea preteinei G i suprafaa celulei cu receptorii pot fi implicate n proces. Dup adsorbie, virusul penetreaz celula gazd i intr n citoplasm prin pinocitoz. Virionul se ngrmdete n veziculele celulei. Membrana viral fuzioneaz la membranele endozomale,16

provocnd eliberarea RNP n citoplasm. Din cauza faptului c Lyssavirusurile au o singur structur mpletit de genom cu acid ribonucleic, acidul ribonucleic mesager trebuie s fie transcris pentru a permite virusului s se replice [27, 44, 46, 1].

2.5. Cicul infeciei i replicrii

Fig. 6 Ciclul infeciei i replicrii virusului rabic [22] Gena L transcrie acidul ribonucleic al rabiei n acid ribonucleic leader i cinci capete i acidul ribonucleic mesager sunt traduse n proteine. Traducerea implic sinteza proteinelor N, P, M, G i L, ea avnd loc n ribozomii din citoplasm. Dei proteina G sintetizeaz n ribozomi, competiia de sintez i de glicolizare are loc n reticulul endoplasmatic i n aparatul Golgi. Proporia intracelular a acidului ribonucleic leader la proteina N regleaz schimbarea de la transripie la replicare. Cnd este activat schimbarea, ncepe replicarea genomului viral. Primul pas n replicarea viral este sinteza unei copii fidele a genomului viral (partea pozitiv). Cnd se produce comutarea de la transcripie la replicare, transcrierea acidului ribonucleic devine non-stop i codonii stop sunt ignorai. Polimeraza viral intr pe un singur loc 3 la captul genomului i urmeaz sinteza ntregii lungimi a gnomului. Partea pozitiv a genomului rabic servete la sinteza prii negative a genomului viral [10].

17

Fig. 7 Ciclul evolutiv al infeciei cu virusul rabic i replicarea acestuia n organism [25]

2.6. Caractere epizootologicen condiii naturale sunt receptive la infecia rabic, n msur aproape egal, toate speciile de mamifere domestice i slbatice, inclusiv omul. Frecvena bolii variaz ns de la o specie la alta, dup modul de via i de posibilitile de contaminare existente. Astfel, dintre animalele domestice, turbarea se ntlnete frecvent la pisici i la cine (80-90 % din cazuri), datorit modului de via al indivizilor din aceast specie, n libertate sau n semilibertate, care ofer cele mai multe posibiliti de contaminare [4]. n general receptivitatea la infecia rabic este influenat de sex, specie, stare de ntreinere, factorii climatici, anotimp. Animalele tinere sunt mai sensibile dect cele adulte. La mamiferele hibernante, n perioada de hibernare, evoluia bolii este ns mult ncetinit. Sursele naturale ale infeciei rabice sunt reprezentate prin animale bolnave, animale infectate, aflate n ultima faz a perioadei de incubaie. La acest tip de animale virusul de gsete n sistemul nervos central i periferic, dar repartiia lui nu este uniform. Creierul este cel mai bogat n virus, concentraia lui fiind mare n substan cenuie, cornul lui Ammon, cerebel, scoara lobilor frontali, etc. n mduva spinrii i n ganglionii nervoi cantitatea de virus este mic, iar n nervii periferici se gsete n cantiti18

foarte reduse. Virusul se gsete i n saliv, la sfritul perioadei de incubaie i persist n tot cursul bolii. Laptele animalelor turbate, practic nu conine virusul i nu se cunosc cazuri de boal transmis prin lapte. n urin, virusul se gsete inconstant i n cantitate mic. n general sunt considerate avirulente sau foarte slab virulente i inconstant virulente: sngele; secreiile genitale; materiile fecale; limfa; limfoganglionii; esutul muscular; lichidul cefalorahidian [27, 48]. Virusul rabic se conserv numai n organismul animalelor infectate, dintre care vulpile ocup locul cel mai important. Alturi de vulpi se pot enumera i lupii, acalii i pisicile. Ca i surse de infecie pot servi, n anumite condiii, cadavrele animalelor turbate. Contaminarea prin cadavre se poate produce n timpul necropsiei sau n timpul recoltrii creierului de la cadavru. Obiectele murdrite cu saliva animalelor turbate pot servi ca surse de infecie cu condiia ca, dup contaminare, ele s vin repede n contact cu o plag recent, virusul distrugndu-se repede n mediul extern. n condiii naturale, transmiterea virusului de la animal la animal sau la om se face, n imensa majoritate a cazurilor, pe cale direct, prin muctura animaleleor trubate [28]. Prin muctur, animalele turbate inoculeaz n rnile respective virusul rabic din saliv. Mucturile animalelor turbate sunt cu att mai periculoase cu ct sunt mai profunde i n numr mai mare, deoarece se inoculeaz o cantitate mare de saliv. De asemenea, sunt mai periculoase cu ct sunt situate mai aproape de sistemul nervos central i ntr-o regiune mai bogat n filete nervoase. De aceea, mucturile de lup sunt dintre cele mai periculoase, fiind profunde, multiple i situate de obicei la extremitatea cefalic. Pe lng mucturi, mai sunt i zgrieturile pisicilor care sunt multiple i profunde cnd lezioneaz un numar mai mare de filete nervoase [15]. Infecia cu virusul rabiei pe cale transplacentar, de la mama la ft, a fost rar semnalat, att la om ct i la animale. Mucoasele placentare intacte par nepenetrabile pentru virusul rabic; aa se comport i mucoasa digestiv. Mucoasa pituitar i cea a cilor respiratorii ns permite instalarea infeciei rabice. Turbarea reprezint o boal a animalelor, n special a celor care se muc ntre ele, ce este rspndit pe tot globul i fr s fie nfluenat de clim sau anotimpuri, poate avea caracter sporadic, enzootic sau chiar epizootic. Apariia i difuziunea infeciei rabice nu este influenat de factorii de mediu, ci numai de posibilitile de contaminare, ce pot varia de la o ara la alta, de la o regiune la alta i de la un sezon la altul. Rabia este o boal care are ca i cauz infecia cu un virus, care apare de cele mai multe ori ca urmare a contactului cu saliva animalelor infectate. Ocazional, virusul se poate transmite i prin intermediul animalelor de companie, cum sunt pisicile sau cinii, ns aceasta se ntmpl foarte rar datorit programelor de vaccinare eficiente. Animalele de companie care nu prsesc niciodat apartamentul au un risc foarte mic de a fi expuse virusului care determin rabia. n situaii i mai rare, unele persoane se pot infecta fr a fi mucate de un animal infestat, fie prin manipularea unui animal care e infestat, fie prin inhalarea virusului, mai19

ales n locuri n care acesta se gsete n cantitate foarte mare (peterile n care traiesc lilieci de exemplu) [1].

2.7. PatogenezaTurbarea se transmite, n general, prin muctur, virusul fiind inoculat prin saliva afectat a carnasierului bolnav. Totui, nu toate mucturile animalelor turbate sunt urmate de o infecie. Babe a fcut o statistic privitoare la mortalitatea persoanelor mucate de animalele trubate, nainte de aplicarea tratamentului antirabic pasteurian, arat c, dintre persoanele mucate la cap, erau n medie 88 %, dintre persoanele mucate la mini, procentul este de 67.25 %, cele mucate la trunchi, 31.81 %, iar dintre cele mucate la membrele inferioare, 21.21 %. Aceast variabilitate se datoreaz faptului c exist o serie de cauze care pot mpiedica realizarea infeciei rabice: saliva animalelor care muc poate s nu fie virulent n momentul mucturii, cantitatea de virus inoculat prin muctur ar putea s fie prea mic, n doz subrabigen, mai ales cnd muctura nu se face direct prin mbrcminte, prin posibilitile defensive locale ale organismului, aciunea virulicid exercitat de umori i esuturi, concurena viral a germenilor de asociaie aflai n plgi. Dup ptrunderea n organism, pentru realizarea infeciei rabice este necesar ca la nivelul porii de intrare s se gseasc filete nervoase recent lezionate, pe care s se poat fixa i prin care s se poat propaga virusul. Virusul rabic nu se replic la poarta de intrare n organism, dar se poate conserva aici un timp variabil. Pentru realizarea infeciei rabice este necesar ca, la nivelul porii de intrare s se gseasc filete nervoase recent lezionate pe care s se poat fixa virusul [4]. Cu ct o plag va conine mai mult esut nervos lezionat, cu att ea va fi mai favorabil infeciei rabice. De la locul inoculrii virusul se propag centripet spre sistemul nervos central, de-a lungul nervilor pe care i invadeaz progresiv, determinnd encefalita rabic. Propagarea centripet a virusului a fost denumit de Levaditi neuroprobazie. Pe msur ce se replic n sistemul nervos central, virusul se disperseaz din nou n organism, n sens centrifug, tot pe traiectul nervilor, realiznd fenomenul de septinevrit descris de Nicolau i colaboratorii lui. Calea nervoas nu este ns exclus pentru propagarea virusului rabic [25]. Difuzarea se mai poate face pe cale sanguin sau limfatic, dar aceastea au o importan mai redus. n sistemul nervos central, virusul produce modificri n celulele nervoase i n pereii vasculari. Iniial virusul acioneaz asupra celulelor nervoase senzitive, provocnd iritaia lor i apariia semnelor clinice prodomale. Astfel activitatea funcional a neuronilor este exaltat i tradus prin stri de excitaie psihic, motorie, senzitiv, exagerarea reflexelor, ceea ce nseamn c determin acese de furie i agresivitate. n ultima faz, consecutiv distrugerilor neuronilor motori, apar paraliziile progresive, iar dup prinderea centrilor respiratori se produce moartea prin asfixie. n cazuri exceptional de rare, virusul rabic, ajuns n centri nervoi, poate rmane n stare de laten timp20

ndelungat i sub influena unor factori favorizani, se poate reactiva. De asemenea, se poate ntampla ca virusul rabic, dup ce s-a multiplicat n centrii nervoi, s fie distrus de forele de aprare ale organismului, n timp ce leziunile provocate s duc totui la moartea animalului; este o infecie mortal autosterilizant [45].

2.8. EpidemiologieRabia este o zoonoz de nivel mondial, cu multe specii gazd ce reprezint rezervoare pentru infecie. Epidemiologia rabiei s-a schimbat n ultimii ani, deoarece este inut sub control sau chiar eradicat la multe specii de animale terestre n Europa i Nordul Americii. Un mare numr de lyssavirusuri sunt acum caracterizate, iar distribuia i animalele gazd ale acestora au devenit cunoscute. Cu toate acestea, rabia persist, ca i problem de sntate public, mai ales n arealurile unde rabia canin este nc endemic, ndeosebi n rile din Africa i Asia [2]. Omul reprezint ultima verig a infeciei cu virus rabic, gazdele naturale fiind vulpile, cinii, pisicile, liliecii, etc, rabia fiind transmis uzual prin muctura animalelor. Unele ri favorizate de poziia lor geografic, dar i n urma unor msuri drastice au reuit s devin i s rmn indemne de boal (Australia, Islanda, Anglia, Irlanda, etc). Romnia a fost una dintre rile cu cel mai mare numr de cazuri de rabie la animale din Europa. Din 1999 s-a aplicat un program de monitorizare a rabiei la animalele domestice i slbatice. n zonele cu o inciden crescut a rabiei s-a iniiat vaccinarea oral a vulpilor. De asemenea s-au vaccinat toate speciile de animale domestice din aceast arie [3].

2.9. SimptomatologieAparita simptomatologiei marcheaz un stadiu evolutiv al bolii care de cele mai multe ori este fatal. Virusul atac i lezeaz sistemul nervos central care include att encefalul (creierul) ct i mduva spinrii. Pentru a preveni rabia, persoanele infectate trebuiesc tratate nainte de apariia vreunui simptom. Primele simptome pot aprea ntr-un interval cuprins ntre cteva zile i aproape un an, ns n majoritatea cazurilor simptomele se dezvolt n 4-6 sptamni de la momentul infeciei. Tratamentul afeciunii este indicat i n cazul n care simptomatologia nu debuteaz la scurt timp de la expunerea la virusul ce produce boala [16]. Simptome la animale. Animalele infestate pot manifesta simptome vizibile sau tulburri de comportament. Animalul care a mucat o persoan i care s-a comportat sau se comport ciudat poate fi infectat cu virusul rabic. Este important urmrirea, pe ct este posibil, a animalului respectiv pentru a putea oferi un tratament corespunzator i la momentul oportun oricrei persoane care a intrat n contact cu animalul respectiv. Este foarte posibil ca un animal s aib rabie dac prezint urmatoarele semne:21

- lipsa fricii de oameni, mai ales la animalele slbatice; - atitudine timid la un animal de cas care era de obicei prietenos; - nelinite, excitabilitate, agresiune sau schimbri brute de comportament; - salivare n exces; - animale active noaptea (lilieci, ratoni i sconcii) care devin active n timpul zilei; - consumul de substane care n mod normal nu sunt comestibile; - paralizie, care uneori poate fi unicul semn [48, 39]. Simptome la oameni. Perioada tipic de incubaie a virusului rabic este de 4-6 sptmni. n aceast perioad, de obicei nu este prezent nici un simptom al bolii. Primele simptome care apar includ durerea i amoreala la locul mucturii, urmate apoi de simptomatologie vag, care poate aparea n multe alte afeciuni i care includ: febr; tuse sau senzaia de gt uscat; durere, arsur, mncrime; furnicturi sau amoreal la locul mucturii sau al expunerii iniiale; durere abdominal; anxietate [7, 16]. Simptomatologia ulterioar. Este mai specific i poate include: perioade alternante de comportament normal i comportament bizar sau neobinuit (anxietate, halucinaii, delir); frica de ap (hidrofobie) sau frica de aer (aerofobie); spasme musculare la nivelul muchilor feei, gtului sau diafragmului, urmate de convulsii; paralizia, care este adesea singurul simptom, se dezvolt n cazul unei forme de rabie mai puin obinuit, rabia paralitic, care apare dup muctura liliecilor vampir; fluctuaii mari ale temperaturii corporale, ale pulsului i a presiunii sangvine; com, insuficien cardiac i respiratorie [7, 16, 39, 48].

2.10. Diagnostic

Fig.8 Diagnostic prin testul de imunofluorescen direct (IFD) [50]

22

Diagnosticul precoce al turbrii are o importan deosebit, avnd n vedere gravitatea infeciei rabice i pericolul pe care-l prezint animalele turbate att penru celelalte animale ct i pentru om. n toate cazurile de turbare se impune un diagnostic imediat i luarea de msuri urgente, att fa de animalele turbate sau suspectate de turbare, ct i fa de animalele i persoanele contaminate sau suspectate de contaminare [33, 36]. ntruct nici aspectele clinice i nici leziunile macroscopice nu sunt caracteristice, diagnosticul turbrii se bazeaz pe examenele de laborator (virusologice, biologice, histo-patologice, serologice). Metodele de indentificare sau de evideniere a virusului rabic se aplic pe esutul cerebral bogat n virus (hipocamp i bulbul cerebral) i const n tehnica anticorpilor fluorescenti i tehnica imunoenzimatic. Ambele metode asigur un diagnostic de certitudine pn la 98-100 % din cazuri [33, 36]. Pentru a pune n eviden celulele nervoase infectate se fac amprente din hipocamp (cornul lui Ammon) proaspt pe lame de sticl i se coloreaz prin metoda Sellers sau se fac seciuni histologice preparate prin metoda Mann. Ambele procedee vor pune n eviden corpusculii virali colorai n rou, denumii corpusculii Babe Negri. Prezena incluziilor intracitoplasmatice sub forma corpusculilor Babe Negri confirm existena infeciei, dar lipsa lor nu infirm diagnosticul de turbare, deoarece se pot obine rezultate fals negative de pn la 15 %. Simultan cu examenul histopatologic se execut i o prob biologic. n acest scop, oarecii nou nscui sau tineri sunt inoculai intracerebral cu o suspensie din conul lui Ammon i tinui sub observatie timp de 21 de zile. Orice oarece mort ntre a 10a i a 21a zi de la inoculare se examineaz prin imunofluorescent. n acelai scop, se inoculeaz pentru izolarea virusului i o celul monocelular de neuroblasme. Prezena virusului poate fi fcut dup 18-24 de ore prin imunofluorescen [33, 36]. Serologic (neutralizarea anticorpilor din ser sau din lichidul cerebrospinal la persoanele nevaccinate, dar se detecteaz de obicei destul de trziu n evoluia bolii aproximativ 8 zile dup apariia semnelor clinice). Acest test se folosete n principal pentru evaluarea rspunsului imun la indivizii vaccinai. Sunt folosite rar datorit procentului redus de animale ce supravietuiesc bolii [35]. Prin imunofluorescen direct (IFD). Determinarea antigenelor se face prin imunofluorescen folosind probe biopsice din piele, creier, cornee. Cea mai rspndit metod i totodat recomandat de OMS i WHO este FAT (fluorescent antibody test, dFA). Probele sunt tratate cu ser antirabic conjugat cu fluorescein (FITC), iar agregatele specifice antigenului virusului rabic sunt detectate prin fluorescena relevat la un microscop cu ultraviolete (figura 9). Metoda este sensibil i rapid rezultatele fiind obinute la 1 2 ore de la recepia probelor [22].

23

Fig.9 Imunofluorescen direct pe amprent de creier (reacie pozitiv) [22] Histologic, caracteristic este prezena corpilor Babe Negri. Acetia sunt incluzii intracitoplasmatice eozinofilice formate prin agregarea nucleocapsidelor n neuroni. Acetia sunt caracteristici rabiei, dar rezultatul trebuie citit de cineva experimentat (pot aprea rezultate fals pozitive rezultatul trebuie confirmat i prin alte metode) [22]

A

24

B Fig.10 A neuron fr corpusculi Babe Negri B corpusculi Babe Negri ntr-un neuron infectat [22] PCR (polymerase chain reaction) poate fi de asemenea utilizat pentru detecia de virus (amplific unele fragmente ale genomului viral). Acest test nu este recomandat de WHO a fi folosit n mod curent n diagnosticul post mortem, dar poate fi utilizat pentru diagnosticul in vitam la om. Deoarece determin rezultate fals pozitive sau fals negative aceast tehnic trebuie folosit n combinaie cu alte tehnici convenionale [4]. Un studiu comparativ efectuat n scopul evalurii testelor uzuale de laborator testul de inoculare la oarece, coloraia histologic Sellers i testul cu anticorpi fluoresceni) a fost fcut de ctre Mala Chhabra i col. n anul 2005. Corpii Negri au fost detectai prin coloraia Seller n 52,5% din specimenele pozitive la inocularea pe oarece, concordana ntre aceste dou teste fiind de 77,8%. Testul de imunofluorescen a fost pozitiv la 91,5% din probele pozitive la testul de inoculare la oarece cu o concordan de 95,5%; 12,2% din probe au fost pozitive prin imunofluorescen din care la o treime s-a detectat prezena corpilor Negri; n timp ce testul de inoculare la oarece a fost negativ, din care s-a dedus c virusul, la aceste probe, a fost prezent ntr-o form inactivat [22].

25

Fig.11 Rezultatele testului PCR pentru prezena virusului rabic. Sgeile indic poziia benzilor pozitive [22]

2.10. Diagnosticul diferenialFormele menigne de turbare, cu evoluie supra-acut, foarte rar ntlnite, pot fi confundate cu meningoencefalita din boala lui Carre. Datele anamnestice, catrul mucoaselor, prezena eventual i a altor localizri ale infeciei cu virusul bolii lui Carre permit diferenierea: paralizia maxilar nespecific, se deosebete de cea rabic, prin faptul c, n afar de paralizia maxilarului inferior, animalele nu prezint alte semne de boal; luxaia temporo-mandibular se deosebete de turbarea paralitic prin aceea c tulburrile se instaleaz brusc, regiunea articulaiei respective este deformat i foarte sensibil, maxilarul inferior este imobilizat i nu poate fi apropiat de cel superior, animalele nu au nici un fel de tulburri psihice; oprirea de corpi strini n cavitatea bucal i faringian, poate simula turbarea, ns examenul atent al animalelor respective, instalarea brusc a simptomelor, lipsa tulburrilor psihice, permit diferenierea [25]. Nu trebuie uitat faptul c, n marea majoritate a cazurilor de turbare paralitic la cine, nsoitorii acestora afirm aproape ntotdeauna ca au adus animalul la consultaie, pentru c a nghiit un os. Prognosticul este nefavorabil, deoarece boala se termin aproape fr excepie prin moartea animalelor [25].

26

Capitolul 3 Investigaii, tratament, vaccinuri, prevenire i combatere 3.1. InvestigaiiInvestigaiile fac mai uor diagnosticul rabiei la oameni i pot include: testul direct cu anticorpi fluoresceni (IFD). Este un test uzual, rapid, care detecteaz proteinele ce alctuiesc virusul rabic. Testul se face prin prelevarea unei mostre de esut din zona potenial infectat; testul de polimerizare n lan (PCR). Acest test detecteaz materialul genetic (ADN) al proteinelor din virusul rabic, este foarte exact i poate fi fcut din saliv, lichid cefalorahidian sau oricare alt esut [38]. Diagnosticul la animale este de asemenea dificil. Animalele care au un comportament ciudat pot fi infectate cu virusul rabic. Presupunerea c un animal este infectat se bazeaz pe: tipul animalului, unele animale au risc mai mare s fie infectate, cum ar fi: liliecii, sconcii, ratonii, vulpile i coioii; comportamentul animalului, cum ar fi salivaia excesiv sau comportament agresiv; riscul apariiei bolii ntr-un areal geografic anumit; data ultimei vaccinri a animalului. Dac o persoan a fost mucat sau expus n alt fel virusului rabic, se pot administra o serie de vaccinuri, ca i profilaxie postexpunere, pn la sosirea rezultatelor testelor care s confirme boala i care au ca scop prevenirea instalrii bolii nainte ca diagnosticul s fie confirmat prin teste specifice [35, 42]. Muctura provocat de un animal cu risc mic de a fi infectat cu rabie. Dac un animal cu risc mic de a fi infectat cu virusul rabic, cum ar fi animalele de companie ca pisicile sau cinii, muc pe cineva, se impune capturarea acestuia de ctre autoritaile special pregtite pentru a prinde animalele infestate cu rabie, meninerea acestora n carantin i urmrirea lor pentru aproximativ 10 zile i dac: animalul nu prezint semne de boal n acest interval, se presupune ca nu a fost infestat n momentul mucturii i c persoana mucat nu necesit tratament; animalul dezvolt semne de boal, atunci se va ncepe tratament preventiv. Animalul infestat va fi omort (eutanasiat), iar esutul su cerebral va fi supus unor teste care s confirme existena bolii. Dureaz doar cteva ore pentru a se efectua aceste teste. Dac rezultatul este negativ, se poate opri tratamentul prevenitv [36, 37]. Muctura provocat de un animal cu risc crescut de a fi infectat cu rabie. Dac o persoan este mucat de un animal cu risc mare de a fi infectat cu virusul rabic, trebuie contactat imediat autoritaea competent. Animalul infestat va fi capturat de personalul special antrenat pentru aceasta. n funcie de protocoalele urmate de departamentul respectiv, animalul poate fi observat sau eutanasiat. n cazul eutanasierii, esutul cerebral al animalului va fi supus testrii pentru confirmarea27

diagnosticului. n tot acest timp, persoana mucat va fi supus tratamentului. Dac testele sunt negative, tratamentul se oprete. Dac testele sunt pozitive, tratamentul se continu. Uneori, animalul suspectat de rabie nu poate fi capturat. n acest caz, este indicat contactarea autoritii competente, pentru a afla care specii de animale din zon respectiv au un risc crescut de a fi infectate i de a determina astfel dac trebuie sau nu iniiat un tratament [48]. Infecia cu virusul rabic poate fi suspicionat i cnd nu este decelabil o muctur de animal. Liliecii n special, dat fiind faptul c au dimensiuni reduse, pot provoca mucturi sau zgrieturi ce nu se observ uor. Atunci cnd exist persoane sau copii care au venit n contact direct cu un liliac sau acest animal este gsit n ncperi n care se afl persoane care dorm sau care nu sunt contiente trebuie contactat un medic, iar copiii trebuie nvai s evite contactul cu liliecii sau alte animale slbatice [42, 12].

3.2. Tratament - GeneralitiDup o expunere posibil la virusul rabic, se impune curirea rnii i vaccinarea pentru c acestea sunt cele mai eficiente metode de a stopa rspndirea infeciei. Ingrijirea rnii. Cnd o persoan este mucat de un animal, rana trebuie curat imediat cu multa ap i spun pentru a reduce riscul unei infecii. Este indicat efectuarea unui consult medical de specialitate pentru a se stabili un tratament mai complex al rnii. (20) Tratament ambulatoriu. Se rezum la evitarea contactului cu virusul, tratamentul imediat i adecvat al rnii urmat de consultul medical de specialitate pentru a determina dac exist riscul unei infecii. Pentru a evita contactul cu virusul rabic se recomand: vaccinarea mpotriva virusului rabic a animalelor de companie cum sunt pisicile i cinii; dac animalul de companie a avut un alt proprietar, noul proprietar trebuie s i cear acestuia fis de vaccinri a animalului [23]. Veterinarii elibereaz un certificat dup vaccinarea animalelor. Cnd nu exist astfel de documente este necesar ca medicul veterinar s confirme vaccinarea; evitarea oricrui contact cu liliecii. n anumite zone geografice prezena rabiei la oameni este asociat cu contactul persoanelor infectate cu liliecii; evitarea contactului sau a tentativelor de a mblnzii animale slbatice ca vulpi, sconci, ratoni sau coioi. Copii trebuie instruiti s evite aceste animale; depozitarea gunoiului trebuie s se fac n containerele special amenajate, n pungi de plastic astfel nct s nu atrag animalele slbatice; blocarea tuturor posibilelor ci de acces ale animalelor slbatice n domiciliu; evitarea contactului cu cadavrele animalelor i mai ales cu esutul cerebral al acestora [42]. Autongrijirea n cazul mucturii animalelor. n cazul mucturii de animale sau a altor contacte cu risc de infecie, se pot lua urmatoarele msuri: curirea rnii i a altor zone expuse cu apa i spun. Este necesar apoi un consult medical pentru a se decide dac sunt necesare i alte msuri; dac animalul care provoac muctura este unul domestic (cine, pisic) se ncearc prinderea28

acestuia sau contactarea propietarului; dac muctura este provocat de un animal slbatic nu se recomand prinderea acestuia [4]. Trebuie stabilit specia din care face parte animalul i dac prezint tulburri ale comportamentului. Dac animalul a fost ucis, trebuie pstrat capul acestuia, fr a se atinge creierul. Medicii vor testa acestesut

pentru a determina dac virusul este prezent, orice musctur sau

zgrietur puternic trebuie raportat; apoi se evalueaz riscul de infecie i se captureaz pentru testare animalul, care dac este infectat va fi eutanasiat, medicii specialiti vor hotr dac este necesar vaccinarea antitetanic ce ofer protecie mpotriva tetanosului (infecie ce apare cnd bacteria tetanic ajunge n contact cu o ran deschis). Vaccinarea antitetanic ce se efectueaz n copilarie n cadrul programului naional de vaccinri trebuie apoi repetat din 10 n 10 ani. Revaccinarea se recomand i atunci cnd exist o ran contaminat i au trecut peste 5 ani de la ultima vaccinare sau dac nu se cunoate data ultimei vaccinri. Se recomand ca vaccinarea antitetanic s se fac n primele 48 de ore dup muctur sau dup contaminarea rnii [17].

3.3. Vaccinarean cazul expunerii la virusul rabic este necesar administrarea unor vaccinuri. Acestea constituie terapia postexpunere. Vaccinarea ajut sistemulimun

s combat boala n stadiile timpurii.

Cnd se administreaz vaccinurile naintea apariiei simptomelor severe, ele previn de obicei dezvoltarea infeciei i cresc ansele de recuperare. Dac apar simptomele bolii vaccinurile nu mai sunt eficiente i persoana infectat decedeaz. Vaccinul este administrat n funcie de riscul de expunere la virusul rabic. Medicii din cadrul direciei de snatate pot evalua acest risc i pot stabili dac este necesar vaccinarea. Printre factorii luai n calcul n determinarea riscului se numr i urmatoarele: - tipul expunerii expunerea la virusul rabic se poate realiza prin intermediul unei mucturi sau a altor rni. Rnile (infecia apare cnd o leziune deschis a pielii sau a mucoaselor este expus virusului) duc rar la apariia bolii, tratamentul fiind necesar - tipul animalului implicat unele animale au un risc mai mare de a fi infestate cu virusul rabic.(4, 15) Profilaxia postexpunere. Tipurile de vaccin antirabic includ: -injectarea de anticorpi injectarea de anticorpi (imunoglobuline) antirabici inactiveaz virusul rabic care se gsete n apropierea rnii (porile de intrare ale virusului norganism),

dar i cel

care s-a rspndit n organism pn cnd organismul i poate sintetiza singur anticorpii; -vaccinarea n serie injectarea unor vaccinuri n serie determin sistemul imun s i creasc rspunsul mpotriva virusului rabic [15].29

Vaccinurile antirabice folosite includ vaccinul cu celule diploide umane, vaccin cu

virus

rabic

atenuat, vaccinul din celule de embrioni de pui purificai. Organizaii de sntate au aprobat i alte vaccinuri, unele dintre ele putnd fi administrate subcutanat, iar altele sunt obinute din sesut nervos [15]. Vaccinarea profilactic. Anumite profesii, hobby-uri sau cltorii frecvente efectuate n ri n curs de dezvoltare au un risc crescut de expunere la virusul rabic. Vaccinarea profilactic sau profilaxia preexpunere este recomandat n aceste cazuri. Vaccinurile antirabice sunt recomandate i n cazul cltoriilor n zonele rurale ale rilor cu risc deinfecie.

n multe din rile n curs de

dezvoltare din Asia, Africa i America de Sud rabia este o afeciune frecvent, majoritatea persoanelor nfectandu-se prin mucturi de cine. Deoarece copiii au un risc mai mare dect adulii de a fi mucati, iar mucturile la acetia tind s fie mai severe, se recomand vaccinarea profilactic naintea cltoriilor [26]. Faza tardiv a bolii. Odat ce apar simptomele, funciile inimii, plmnilor i a altor organe vitale pot fi meninute pentru un timp prin msuri medicale intensive, dar n cele din urm pacientul va deceda. n cazuri extrem de rare, cu ajutorul vaccinurilor, pacientul se poate vindeca. Dup orice contact cu un animal ce poate fi infectat este necesar instituirea tratamentului [35]. Vaccinuri disponibile. Astzi, vaccinurile mpotriva rabiei sunt preparate pe culturi celulare. Mai multe tipuri de vaccinuri sunt disponibile, n funcie de ar. Se folosesc substraturi diferite, inclusiv celule diploide umane, celule Vero, culturi celulare primare de pui embrionat sau celule de foetus de maimu rhesus [25]. Strategii de imunizare. Pn de curnd recomandat doar persoanelor care prezentau risc profesional (veterinari, personal de laborator, tbcari, taxidermiti, lucrtori n zootehnie sau lucrtori forestieri), imunizarea mpotriva rabiei este recomandat cltorilor, inclusiv copiilor de peste 12 luni, care plnuiesc s stea n zone endemice. n plus, vaccinul antirabic este administrat persoanelor care au intrat n contact cu un animal care ar putea avea rabie. n acest caz vaccinul, care necesit cinci injecii, este echivalent cu un tratament "post-expunere". Dup ct de grav este muctura, uneori este combinat cu o doz de imunoglobulin antirabic. Pn acum este singurul tratament mpotriva turbrii. Vaccinul neutralizeaz virusul nainte ca acesta s ating encefalul; odat atins encefalul, finalul este ntotdeauna fatal. Turbarea este o encefalit infecioas acut, caracterizat prin simptome nervoase extrem de grave, tulburri senzoriale, furie, tendina de a muca, paralizii, urmate ntotdeauna de moarte. Boala este transmisibil i la om. Ea este produs de un virus filtrabil care se gsete n cantitate mare n creierul i n saliva animalelor turbate. Infecia se transmite aproape exclusiv prin muctura animalelor turbate sau purtatoare de virus. Saliva conine virusul turbrii chiar cu 10 zile nainte de apariia primului semn clinic de boal [8].30

inerea sub observaie a cinilor suspeci de turbare, care au mucat oameni, va trebui s depeasc acest termen de 10 zile pentru certitudine. n afara de forma "furioas descris mai sus, exista i o alta, aa-zis "form mut" care, nefiind nsoit de manifestri agresive, poate induce lesne n eroare, dnd posibilitatea contaminrii. Ea se manifest prin tulburri gastrice, paralizie a membrelor posterioare i, ulterior, a maxilarelor [8, 9, 13, 14, 26].

3.4 PrevenireCel mai eficient (i obligatoriu prin lege) mod de prevenire a turbrii este vaccinarea anual antirabic. Dac animalul de companie a fost mucat de un animal suspect, se urmeaz de urgent procedura de mai jos: - se duce imediat animalul la cea mai apropiat clinic veterinar i se informeaz medicul asupra datei ultimei vaccinari (dac animalul nu a fost vaccinat, respectiv revaccinat, proprietarul va fi pasibil de amend!); - s se ncerce contenia animalului care a mucat, fr a va pune ns n pericol; este indicat ca animalul suspect s fie inut sub observaie timp de 10 zile; - dac n acest interval nu prezint semnele clinice ale turbrii, muctura nu prezint un pericol sub acest aspect. Dac animalul suspect este eutanasiat, se vor trimite la laborator mostre de esut, pentru analiz [33, 34]. Profilaxia. Lupta mpotriva turbrii include aplicarea unui complex de msuri sanitar veterinare de imunoprofilaxie. Un rol important l joac profilaxia nespecific, aceasta se bazeaz pe msuri generale de prevenire a apariiei i rspndirii bolii. Msurile generale se adreseaz distrugerii rezervorului de virus i a vectorilor principali. Acesta se poate obine prin reducerea la maximum a numrului de carnivore domestice, reglementarea circulaiei acestora, distrugerea carnivorelor slbatice, evidena strict a cinilor de paz, de apartament i de vntoare, purtarea obligatorie a botniei. Totodat, este necesar s se duc o larg munc de informare a populaiei asupra pericolului turbrii i asupra metodelor de prevenire a bolii [1, 4]. Imunoprofilaxia. Se bazeaz pe vaccinarea antirabic obligatorie a cinilor. De la prima vaccinare aplicat de Pasteur i pn n prezent, n imunoprofilaxia turbrii au fost utilizate o serie de metode care se deosebesc ntre ele prin modalitatile de obinere a materialului biologic imunizat. Printre acestea se remarc: - folosirea virusului rabicfix, inoculat pe cale subcutanat; - folosirea de virusuri vii sau atenuate, obinute din culturi celulare cu diverse tulpini adaptate la diferite celule; - folosirea virusului rabic modificat calitativ prin adaptarea pe embrionul de gin;31

- folosirea vaccinului inactivat cu ajutorul fenolului, formolului, alcoolului metilic, mertiolatului de sodiu, ap ionizat [4]. Astzi sunt folosite vaccinurile care conin att virus viu modificat prin pasaje pe animale, ou embrionate sau pe culturi celulare, ct i vaccinuri preparate cu virus inactivat cu ajutorul agenilor chimici. Ambele tipuri de vaccinuri pot imuniza animalele pentru o perioad de 1-3 ani. De menionat este faptul c, dei subtipurile de virus rabic difer mult n patogenitate, totui, cu excepia serotipului 3, ele produc o imunitate ncruciat aproape perfect. Astfel vaccinurile preparate cu tulpina original a lui Pasteur i derivatele ei, dar i tulpinile izolate ulterior, protejeaz mpotriva tuturor tulpinilor izolate pn la cele ale serotipului 1 [45]. n Romnia, pentru imunizarea cinilor i a altor specii de animale, se folosesc vaccinurile urmatoare: - vaccinul antirabic preparat pe culturi de celule de rinichi de porc; - vaccinul preparat pe fibroblaste de embrion de gin; - vaccinul mixt-trivalent, inactivat pe suport de aluminiu fosfat. Efortul de a elimina rabia, ca i zoonoz, trebuie s includ vaccinarea animalelor gazd, mai ales a cinilor comunitari, dar i a celorlalte categorii de animale domestice i slbatice care pot transmite virusul prin folosirea momelilor, la fel ca i a vaccinurilor tradiionale la animalele de companie i de interes economic. S-a demonstrat faptul c vaccinarea a cel puin 80% dintre cini este suficient pentru a rupe lanul de transmitere a virusului prin intermediul acestora (109). ncepnd cu anul 1958 cnd s-a cultivat virusul rabiei n culturi celulare de rinichi de hamster pentru prima oar, progrese importante s-au obinut att n domeniul culturilor de celule ct i n cel al adaptrii i replicrii virusului rabic n culturi celulare, progrese ce au condus la apariia unei noi generaii de vaccinuri (generaia a doua) (96). Dintre vaccinurile de generaia a doua de uz veterinar, se pot distinge mai multe tipuri, n funcie de tulpina de virus utilizat i substratul celular ales, existnd vaccinuri antirabice vii sau inactivate, cele vii folosindu-se mai ales pentru imunizarea animalelor din sfera slbatic, iar cele inactivate pentru animalele domestice. Normele de fabricaie pentru vaccinurile vii de uz veterinar sunt n general mai puine dect cele referitoare la vaccinurile inactivate. Tehnologiile de producere sunt mai simple, iar volumul de celule i de suspensie viral mai sczute. ns acestea prezint mai multe inconveniente care trebuie luate n considerare: tulpinile virale atenuate posed o patogenitate rezidual care variaz n funcie de specia animal, calea de administrare i doza inoculat. Aceast patogenitate rezidual este asociat vaccinurilor preparate din tulpinile de virus rabic LEP Flury, ERA i SAD. Aceste vaccinuri sunt32

strict contraindicate la pisic i la toate animalele care se gsesc ntr-o stare de sntate necorespunztoare [4]. Tabel 1 Principalele vaccinuri antirabice de uz veterinar, preparate cu virus modificat, inactivat [4]Doza ml Vrsta la prima vaccinare

Vaccinul Originea: encefal de animale adulte Originea: B.H.K. (N.C.P.) tulpina Kissling, tulpina Pitman-Moore

Utilizare la

Rapel recomandat

PE ESUT NERVOS cine pisic 2 ml 2 ml 3 luni 3 luni n fiecare an n fiecare an

PE CULTURI CELULARE cine pisic cine, talie mare bovine cabaline ovine caprine Originea: linia BHK tulpina Pitman Moore asociat cu vaccin panleucopenic, antihepatitic, anti leptospiric Originea: ou embrionat, tulpina Flury L.E.P. Originea:celule renale de porc tulpina Flury, L.E.P. pisic cine bovine ovine pisic bovine cine pisic bovine cabaline ovine caprine Originea: celule renale de porc, tulpina Flury, L.E.P. cine pisic bovine cabaline ovine caprine 1ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 3 ml 2 ml 1 ml 1 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 3 luni 3 luni 3 i 15 luni 4 luni 4 luni 4 luni 4 luni 3 luni 3 luni 4 luni 4 luni 3 luni 3 luni 3 i 4 luni 3 i 4 luni la alegere la alegere la alegere la alegere 3 i 4 luni 3 i 4 luni la alegere la alegere la alegere la alegere n fiecare an n fiecare an la fiecare 3 ani n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an

33

Tabel 2 Principalele vaccinuri antirabice de uz veterinar, preparate cu virus modificat, neinactivat [4]

Vaccinul Originea: ou embrionat LEP tulpina Flury Originea: celule canine din linia H.E.P tulpina Flury Originea:celule de porc H.P.C. (high cell passage) tulpina S.A.D

Utilizare la cine

Doza ml 1 ml

Vrsta la pima vaccinare 3 i 15 luni

Rapel recomandat la fiecare 3 ani

cine pisic cine caprine ovine bovine cabaline

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

3 i 15 luni 3 luni 3 i 5 luni 4 luni 4 luni 4 luni 4 luni 3 i 5 luni peste 3 luni

la fiecare 3 ani la fiecare 3 ani la fiecare 3 ani in fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an la fiecare 3 ani n fiecare an

Originea:celule canine (high cell passage) tulpina S.A.D. Originea: celule renale bovine H.P.C. tulpina S.A.D.

cine pisic

cine

1 ml

3 luni

n fiecare an

Originea: linia B.H.K (celule renale de hamster - H.P.C., tulpina Kissling cine Originea: celule de hamster, tulpina Vnukovo, 32 cine pisic bovine cabaline ovine caprine 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 3 luni 3 i 5 luni la alegere la alegere la alegere la alegere la alegere n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an n fiecare an

Tabel 3 Tulpini de virus rabic utilizate pentru producia de vaccinuri antirabice inactivate [4]34

Tulpina Pasteur Paris PV

Originea Izolat n Frana de la o vac bolnav de rabie Virus rabic Pasteur fix obinut pe iepure

Istoricul pasajelor Are mai mult de 300 pasaje pe creier de iepure; este adaptat pe celule Vero. Adaptat pe creier de iepure, rinichi de fetus bovin, rinichi de hamster auriu, liniile celulare BHK21 i Vero; Adaptat pe creier de iepure, celule diploide de om, celule primare de rinichi de cine, celule Vero i Nil 2; Adaptat pe creier de soarece, rinichi de hamster, linia BHK21 i celule de embrion de pui de gina

PM (PitmanMoore) CVS 11 (Challenge Virus Standard ) Nishigara Fuenzalinda S- 51 Fuenzalinda S- 91

Virus rabic fix PV

Virus rabic fix PV

Virus rabic fix PV (Japonia, 1915) Izolat n Chili n anul 1943 de la un cine bolnav de rabie Izolat n Chili n anul 1943 de la un om bolnav de rabie

Adaptat pe creier de iepure i celule nervose de cobai nou nscut Adaptat pe celule nervoase de oarece Adaptat pe celule nervoase de oarece nou nscut 100 de pasaje n celule de embrion de pui de gin i creier de oarece Adaptat pe celule de creier de oarece, rinichi de cine i de hamster, ct i pe linia stabilizat BHK21 Adaptat pe celule renale de porc i de hamster ct i pe linia stabilizat BHK21

Kelev SAD (Street AlabamaDufferin) ERA (Evelyn Rokitniki Abelseth) Flury LEP HEP

Izolat n Israel n anul 1950 de la un cine bolnav de rabie Izolat de la un cine mort n Alabama, S.U.A., n anul 1935 Virus SAD

Izolat n anul 1939 n Georgia (S.U.A.) de la un om Tulpina Flury Tulpina Flury

Adaptat pe fibroblaste embrionare de pui 40 50 pasaje n culturi celulare de embrion de pui de gin; este adaptat pe BHK21 Mai mult de 180 de pasaje n culturi de celule de embrion de pui de gin

3.5. Combaterea

35

ntr-un focar de turbare se aplic urmatoarele msuri: se declar oficial boala i se instituie carantin de gardul III; se delimiteaz zona epizootic pe o raz de cel putin 30 kilometrii n jurul focarului; se distrug cadavrele animalelor moarte. Animalele cu simptome de turbare se ucid, iar dup recoltarea probelor pentru examenul de laborator, se distrug. Carnasienele suspecte de turbare, care nu au mucat, care nu au zgriat alte animale sau oamenii, se ucid i se distrug, iar cele suspecte care au mucat, zgriat sau au venit n alt mod n contact cu alte animale sau cu oamenii, se in sub observaie sanitar veterinar timp de 10 zile, dup care se ucid. Carnasienele bnuite de contaminare prin mucare sau alte metode sau carnasienele care vin n contact cu animale bonlave sau suspecte de boal, se ucid, chiar dac au fost vaccinate antirabic. Nu se ucid carnasienele cu valoare (cinii de paz sau cei de vntoare) i care fac dovada c au fost vaccinate n ultimele 6 luni, dar se supun carantinei timp de 90 de zile. Boala se consider stins i msurile de carantin se ridic dac au trecut cele 3 luni de la ultimul caz de moarte sau ucidere i dac n unitate nu mai sunt animale sub observaie sanitar veterinar [35, 36, 37].

Capitolul 4 Turbarea la diverse specii de animale 4.1. Turbarea la cine

Fig.17 Animal infectat cu virusul rabic (vulpea), n timp ce muc alt cine sntos [52]

36

Fig.18 Transmiterea virusului rabic prin muctur [51] Cinele dintre toate animalele domestice sau slbatice este animalul care prezint cel mai frecvent infecia rabic. El a fost i este animalul care a dus i duce cu el turbarea n toate zonele lumii. Toate rasele de cini sunt n egal msur receptive. Se constat ns unele diferene de receptivitate n ceeea ce privete vrsta. Astfel, dup cercetarile lui Babe, procentul cinilor turbai n raport cu vrsta este urmtorul: 1-2 ani = 13-14 %; 2-3 ani =17 %; 3-6 = 10 %; 6-10 ani = 2 %. Simptomele clinice sunt poliforme i difer de la un individ la altul. n general turbarea evolueaz ACUT, sub dou aspecte clinice principale: furioas i paralitic. Simptomele apar dup o perioad de incubaie de 2-3 sptmni, rareori mai mult de 3 luni (n medie 20-50 de zile) existnd i limite extreme de aproape 1 an [11, 42].

4.1.1. Forma furioas sau turbarea

Fig.19 Forma furioas a turbrii n cazul mai multor animale [50]

37

Se caracterizeaz printr-o stare de excitaie i excitabilitate extrem, cu manifestri de furie, agresivitate etc. Aceast form furioas este cea mai caracteristic a bolii, deoarece cuvantul turbare n toate limbile exprim mnie, furie, cruzime. n evoluia bolii se pot distinge trei perioade i anume: prodromic, de excitaie sau de stare i faza terminal sau paralitic [42]. Faza prodromic ncepe cu simptome vagi ca: schimbarea caracterului animalului, acesta devenind mai afectuos, mai apropiat fa de stpn sau din contr mai trist, mai retras, caut singurtatea, uneori caut ntunericul, st ascuns n cuc sau sub diferite obiecte, nu rspunde imediat la chemare, ia atitudinea animalului care dormiteaz. Apoi ncepe s devin nelinitit, uor agitat, se aeaz ntr-un loc i deodat fr nici un motiv, se ridic pentru a se aeza ntr-un alt loc. Starea de nelinite, de agitaie, se accentueaz, animalul i rscolete aternutul, pmntul, roade cuca, lanul i orice alt obiect care-i vine n cale. Temperatura corpului atinge n cursul acestei faze, 39-39.8 grade Celsius. Acest febr trecatoare este urmat de o stare febril continu care se instaleaz cu 1-5 zile naintea apariiei oricrui simptom i pe care Babe o numete febr iniial i o consider ca foarte important din punct de vedere al diagnosticului (febra premonitorie) [4]. Apetitul este uneori conservat, alteori diminuat, exagerat sau prevertit. Animalul inger tot felul de corpi strini: pietre pmnt, paie, sticl, pri din aternut. Setea este conservat sau chiar exagerat. Animalul mai poate prezenta o senzaie de prurit sau de durere la locul mucturii sau a cicatricei rmase dup vindecarea plgii. n acest caz, acesta i linge, i freac sau i rupe cu dinii esturile din regiunea respectiv. La masculi se mai poate observa uneori i o hiperexcitaie genezic [4]. Tabloul sangiun n perioada prodomic i chiar cu 2-3 zile nainte de apariia oricrui simptom, prezint modificri marcante. n general, se observ o leucocitoz cu scderea brusc a euzinofilelor, pn la aneozinofilie, o cretere a polinucleotidelor neutrofile i o uoar scdere a numrului de limfocite i monocite, ceeea ce constituie sindromul hematologic de alarm. Durata medie a fazei prodomice este de 1-2 zile. Adeseori poate trece neobservat, mai ales la animalele ce nu sunt supuse unei observaii mai atente [4]. Faza de stare sau de excitaie. Acest faz se instaleaz treptat i se traduce printr-o excitabilitate extrem. La orice zgomot, uoar atingere, animalul reacioneaz puternic, tresare, sare brusc n sus, ncepe s latre, apoi se linitete. Timbrul i tonalitatea vocii se schimb n urma paraliziei muchilor laringieni i a corzilor vocale; vocea devine groas i rguit, iar ltratul, scurt i sacadat, sfrete printr-un urlat prelung. Cinele turbat, n timpul ltratului, totdeauna se oprete i ridic botul sus. Treptat, starea de excitabilitate i agresivitate se intensific. La nceput, agresivitatea se manifest de obicei numai fa de animale, apoi i fa38

de om. Dintre toate speciile de animale, cinele este acela care provoac cea mai puternic temere asupra animalelor turbate; la vederea unui cine acestea devin furioase i se reped la el [43]. Cinii turbai, nchisi n cuti de fier, se reped cu violen la gratii, le muc provocndu-i rni, chiar fracturi ale molarilor - fr s manifeste vreun semn de durere; dac li se prezint un baston, se reped la el fr s latre, l apuc cu dinii i l in strns, ca i cum s-ar produce un trismus al masterilor. Faciesul cinilor turbai exprim groaz, suferin; animalele cu privirea absent sau tulbure, unele prezint conjunctivit sau cheratit, strabism, inegalitate pupilar, vomismente, uneori diaree hemoragic. n faza de excitaie, cinele turbat caut s scape din lan, din cuc, din camera unde este nchis, sprgnd fereastra, roznd ua, smulgndu-se din lan i dup ce a scapat, rtcete un timp n preajma gospodriei, apoi pleac putnd s parcurg zeci de kilometrii n netire, fenomen numit dromomanie. Pe drum, atac omanenii i animalele, intr n cirezi, n sate, se repede far nici o fric fa de ali cini [47]. Cinele, ca i lupul turbat, atac ntotdeauna prin surprindere, fr s latre, ceea ce l face i mai periculos. Spre sfritul fazei de excitaie, care dureaz 2-4-6 zile, apare paralizia faringelui, nsoit de salivaie abundent. Faza de paralizie sau faza depresiv dureaz 1-3 zile rareori 5 zile i se manifest prin paralizia muchilor limbii, muchilor masteri, muchilor oculomotori i a muchilor laringieni; cinele nu mai poate nghii i nici nu mai poate muca, devine afon, ochii i rmn imobili, adeseori se observ proeminena pleoapei a treia. Treptat, tulburrile paralitice cuprind i celelalte regiuni ale corpului. Accesele de excitaie devin tot mai rare, apare pereplegia i animalul nu se mai poate ridica. n faza final a bolii, paralizia faringelui i a laringelui este total, deglutiia nu se mai poate face i, din aceast cauz, saliva curge n continuu din gur. Moartea survine dup 3-7 zile de la apariia primelor simptome i numai foarte rar survine moartea dupa 10-11 zile [11, 42, 43, 47].

4.1.2. Forma paralitic, mut sau linitit39

Fig.20 Cine infectat cu virusul rabic faza mut sau linitit [53] Se deosebete de forma furioas prin faptul c animalele nu prezint nici o manifestare de excitaie sau de agresivitate, sau dac exist aceste manifestri, dureaz att de puin nct pot trece neobservate. Boala ncepe prin depresiune, urmat foarte repede de paralizia muchilor faringelui i cei masteri; animalul nu poate nghii, st cu gura deschis, din care se scurge saliva filant. Ltratul este rguit, apoi cinele devine repede afon. Faa cinelui cu turbare paralitic exprim mult suferin i tristee; privirea este vag, rtcit, din timp n timp i pierd conotina. Spre sfritul bolii apar paralizii care progreseaz repede i duc la moarte n 24 zile de la apariia primelor semne clinice. n cazuri mai rare, turbarea paralitic poate ncepe prin paralizia unui grup muscular, dar evolueaz tot spre paralize general [40]. n afar de aceste dou forme principale (forma furioas i cea paralitic) sub care evolueaz turbarea la cine, n marea majoritate a cazurilor au fost descrise i forme cu40

caractere intermediare, cu manifestri monosimptomatice. Astfel, a fost descris i o form gastrointestinal, manifestat prin vomizri, colici, enterit hemoragic, fr agresivitate sau paralizie, o alt form este cea meningeal cu evoluie supra-acuta, o form atrofic sau consomptiv caracterizat printr-o slbire progresiv, fr alte semne caracteristice turbrii [40]. Tabloul anatomopatologic. Leziunile macroscopice ntlnite variaz dup forma clinic a bolii i dup faza n care a intervenit moartea. n general, aceste leziuni sunt nespecifice. Privite n ansamblu, ele pot fuziona date care s ntreasc suspiciunea de turbare sau s trezeasc aceast suspiciune. Cadavrele animalelor turbate, mai ales ale acelora care au fcut forma furioasa a bolii, sau cu prul murdar, cu numeroase plgi externe, botul uscat, acoperit uneori cu saliv cleioas, murdar, plgi recente la nivelul buzelor, la nivelul limbii, la nivelul feei, incisivii i molarii sunt rupi, chiar apare fractura maxilarului inferior. La deschiderea cadavrului se constat o staz venoas general, sngele slab coagulat, de culoare negricioas, asfixic [34]. Stomacul, lipsit de alimente, conine adeseori, n proporie de 45-99 % din cazuri, diferii corpi strini. Se mai poate constata congestie i edeme ale meningelor creierului i mduvei spinrii. Mult mai importante pentru diagnostic sunt modificrile histoptologice de la nivelul sistemului nervos central. Ele au caracterul unei encefaliomielite limfocitare nepurulente. Unele dintre aceste leziuni sunt specifice bolii altele sunt nespecifice [34]. Ca i leziuni nespecifice, mai importante sunt infiltraiile limfocitare i monocitare din sistemul nervos central i ganglionar, care pot fi difuze, pericelulare sau perivasculare sub form de manoane. Astfel, leziunile aparatului vasculo-conjunctiv se manifest prin dilatarea, mai ales a vaselor de calibru mic, hemoragii prin diapedez i perivascularit infiltrativ. n esutul glial se observ hiperplazia celulelor gliale i a celor satelite, mai ales n jurul celulelor i fibrelor nervoase degenerate, nsoit de neurofagie total sau parial, urmat de nlocuirea celulei degenerate i fagocitate cu elemente neoformate. n acest fel apar focare de celule rotunde, cu aspect nodular, descrise prima data de Babe n turbare i denumite nodulii rabici Babe, care se gsesc ns i n alte boli virotice [34]. n celulele nervoase se observ modificri distroficonecrobiotice, manifestate prin tumefierea celulelor, degenerarea gras i hidropic, tigroliza, picnoza, cariorexa, urmate de neurofagie i formarea noduilor rabici - Babe. Asemenea leziuni, distroficonecrobiotice se gsesc i n sistemul nervos periferic, n ganglioni nervoi se constat infiltraia intens a stromei ganglionare cu celule hiperplaziate, edem pericelular pronunat, degenerarea celulelor nervoase i neurofagie cu formarea unor acumulri de celule rotunde (satelite), cunoscute sub demunirea de nodulii lui Van Gehuchten Nelis. n nervii periferici se produc leziuni de41

endonevrit i perinevrit, cu degenerarea tecilor de mielin i infiltraii cu celule limfoide [34, 36]. Leziunile cele mai grave se observ n nervii de la locul mucturii i explic pruritul i senzaia ce se observ uneori la animalele turbate. Leziunile specifice sunt reprezentate prin incluziunile oxifile din celulele nervoase, socotite caracteristice n turbare i cunoscute sub denumirea de corpusculii Babe Negri [40]. Incluziunile se gsesc n citoplasma celulelor nervoase piramidal din cornul lui Ammon, dar pot fi ntlnite i n alte pri ale sistemului nervos central i periferic i chiar n unele organe sau glande. Ele au forma rotund sau oval i sunt formate din substan bazal oxifil, n care se gsesc granulaii bazofile [42]. Numrul i dimensiunile corpusculilor BabeNegri variaz dup durata bolii, fiind mai mari i mai numeroi cnd boala a evoluat mai lent. n creierul animalelor moarte de turbare, n afara corpusculilor Babe Negri, se pot gsi incluzii oxifile cu aspect de coci, intracelulare i extracelulare, care se pare c sunt formate numai din substan bazal i ar reprezenta faza iniial de dezvoltare a corpusculilor Babe Negri [40, 42, 46].

4.2. Turbarea la alte specii de animaleToate animalele cu snge cald, inclusiv psrile, sunt mai mult sau mai puin susceptibile turbare, dar nu toate au posibilitatea s transmit boala i deci nu toate cazurile de turbare reprezint surs de infecie. La pasri n faza prodomic pasrea bonlav devine foarte nelinitit, speriat, alearg mereu, din cnd n cnd sare brusc n aer btnd din aripi; prezint strabism, penele se zbrlesc, privirea devine fix. n faza de excitaie, ginile devin agresive, atac oamenii, animalele, pasrile, lovesc cu ciocul, cu aripile i cu picioarele. Moartea survine n 2-3 zile cu pareze i paralizii progresive [36]. La mistre boala evolueaz sub forma furioas. Animalul este nelinitit, are tendina de a muca, gronhie i destul de repede se instaleaz paraliziile. La ovine i caprine perioada de incubaie dureaz ntre 10-65 de zile, rareori mai multe luni. De obicei, boala evoluaz sub forma furioas i mai rar sub form paralitic. n forma furioas, semnele prodomice sunt repede urmate de furie i agresivitate. Animalul turbat alearg tot timpul, din cnd n cnd se oprete brusc, lovete pmntul cu picioarele, scutur capul, sforie zgomotos, behie cu voce gros, rgusit, scond sunete prelungi. Pupilele sunt puternic dilatate, ochii congestionai. Oile sunt animale timide, blnde, fricoase, dar dup infecie, devin agresive, se reped la oameni, la alte oi, la cini, ncercnd s mute, s loveasc cu capul i cu picioarele. De cele mai multe ori n timpul acceselor de furie se produce moartea subit, din cauza edemului pulmonar subacut, din gura i nrile animalului scurgndu-se o mare42

cantitate de lichid spumos sanguinolent. Evoluia dureaz ntre 2 i 8 zile, fiind mai lung la capre. n forma paralitic dup semnele prodomice manifestate prin midriaz, moiz, privire speriat i modificarea vocii, apar pareze i paralizii care duc la moarte n 24 de ore pana la 3 zile de la apariia primelor simptome [36]. Pisicile sunt sensibile la infecie i prezint un rol important n transmiterea bolii. Ele constituie un deosebit pericol pentru om i animale datorit agresivitii, a rnilor multiple i profunde pe care le pot produce i n consecin a mortalitii ridicate fa de mucturile de cine. La pisic perioada de incubare este mai scurt, 10-15 zile, dar poate avea limita minim de 9 zile i limita maxim de peste 260 de zile. Clinic, predomin forma furioas la peste 90 % din cazuri. Animalul devine agresiv, nu recunoate stpnii, miaun fr ntrerupere, cu un mieunat ngroat dar strident nc din faza prodomic; prezint inegalitate pupilar, facies tipic, crispat i puternic ncordat. n faza de excitatie, pisicile turbate prezint crize dramatice, cad, se rostogolesc i miaun strident. n faza terminal, apar paralizii progresive, sufocare i moartea. ntreaga evoluie a bolii la pisic este de 3-10 zile [37]. Forma paralitic se manifest prin apariia paraliziei muchilor masteri; pisica ine gura deschis, saliveaz, dar este i agresiv i poate produce plgi profunde i multiple. Durata evoluiei este de 2-4 zile i se termin prin moarte ca urmare a asfixiei i paraliziei centrilor respiratori. Turbarea la pisic se poate preveni prin vaccinari preventive, folosind diverse produse biologice (vaccinul Rabiffa, Rabguard Tc, Rabirom). Vacinul antirabic inactivat Rabguard Tc, este constituit dintr-o suspensie de virus rabic replicat pe o linie celular porcin stabil, inactivat cu betapropiolacton i absorbit pe hidroxid de aluminiu. Se inoculeaz n doz de 1 ml la pisici i cini i rezultatul este o protecie de aproximativ 3 ani. Vaccinul se folosete de la vrsta de 12 sptmni [35, 36].

43

Partea a - II - a Cercetri proprii

Capitolul 544

Testul de imunofluorescen direct pentru diagnosticul Rabiei la speciile mamifere 5.1. Principiul metodeiDetecia antigenic a virusului rabic n esuturile infectate se produce n urma legrii specifice a acestuia de ctre un antiser conjugat cu fluorocrom (obinuit izotiocianat de fluorescein) i vizualizrii n lumin UV a fluorocromului legat. n baza acestui principiu se poate efectua detecia direct a antigenului rabic pe amprenta de creier sau culturi celulare infectate.

5.1.1. Reactivii necasari reaciei sunt:- conjugatul pentru diagnosticul prin imunofluorescen direct (o prob activ i un martor); aceton; tampon fosfat salin; glicerin anhidr 50% tamponat; mediu de triturat este recomandat o soluie salin fiziologic sau alte soluii similare (ser fiziologic); ap distilat sau ap ultrapur. n cazul n care materialul de inoculat nu este steril sau proaspt, la soluie se adaug i antibiotice. Reactivii utilizai trebuie s fie de calitate pentru analiz sau de calitate echivalent. Apa trebuie s fie distilat sau de puritate echivalent.

5.2. Echipamente de ncercare i mijloace de msurare 5.2.1. Aparatura necesar este:- congelator; microscop; lamp UV; balan tehnic; centrifug; micropipet; hot; pH metru; etuv; termohigrometru.

5.2.2. Instrumentarul necesar este compus din:- menghin; foarfeci; pense anatomice i dentare; fierstru; ochelari de protecie; bi umede de incubae; bi de splare; cuit; satr de buctrie; cuve centrifug; cuve nchise etan ce vor funciona ca bi umede sau bi de splare; ceas de laborator; seringi gradate, ace de sering.

5.2.3. Alte materiale ca:- marker waterpoof; container Biorad; alcool sanitar; masc de protecie; bi de splare; tifon, lavete care nu las scame; hrtie igienic; pungi i saci de plastic; mnui chirurgicale i de uz menajer; cloroform, soluie dezinfectant de laborator; spun; baghete de sticl sterilizate la etuv; detergent; creioane grase pentru marcarea lamelor, nefluorescente n UV; cuti pentru oarecii pe care se va face inocularea; hrtie de filtru; hrtie pentru ambalaj; nisip de cuar sau nisip de mare sterilizat termic; eprubete de plastic; filtru; suporturi pentru lame.

5.2.4. Sticlria necesar:45

- cuva de fixare (n care se fixeaz frotiul cu aceton); cuve pentru centrifug; lame i lamele pentru microscop; pipete gradate; eprubete; plci Petri; pahare Berzelius; cilindrii gradai.

5.3. Mod de lucru: 5.3.1. Prelevare i conservare/ pregtire probeRecoltarea, condiionarea i transportul probelor pentru analiz s-au fcut conform normelor sanitar-veterinare recomandate pentru virozele majore. n cazul n care animalele moarte sunt de talie mic (pisicile), se va trimite ntreg cadavrul, iar la animalele care sunt de talie mare (cinii) se va aduce la analiz dect capul. Pentru ca rezultatele analizelor de laborator s fie corespunzatoare, transportul probelor se face n condiii de refrigerare, n ambalaje metalice cu dublu capac ce se nchid ermetic, sau n cazul n care nu exist ambalaje din metal se pot folosi i cele din material plastic, n mai multe straturi, astfel nct s nu se produc o scurgere de lichide. Eticheta de pe aceste ambalaje trebuie s aib pe ele inscriptia ATENIE RABIE!. Persoanele care particip la recoltarea, condiionarea i transportul probelor vor fi instruite privind regulile de protecie a muncii. Recoltarea materialului de inoculat trebuie s se fac n spaii special amenajate pentru acest scop. Spaiile trebuie s fie dotate corespunzator cu mese ce pot fi igienizate, cu surs de lumin suficient, chiuvete racordate la reeaua de ap cald, dulapuri pentru instrumentar, substane pentru efectuarea dezinfeciilor n cantiti suficiente. Operaia de deschidere a cutiei craniene ncepe cu ndepartarea pielii de pe suprafaa capului cu ajutorul cuitului. Deschiderea propriu-zis s-a executat cu ajutorul unor dli, cuite sau fierstraie, n funcie de mrimea capului animalului. Folosind materiale de demensiuni corespunzatoare ajut mult ca operaiunea s se desfaoare cu uurin. Calota se ridic, se extrage encefalul din cutia cranian, dup ce n prealabil a fost secionat meningele, bulbul cerebral i nervii craneni cu ajutorul unui bisturiu sau al unei foarfeci cu vrfurile rotunjite. Se noteaz aspectul macroscopic al creierului menionndu-se dac exist unele modificri anatomopatologice (congestie, hemoragii, prezena exudatelor). Creierul se mparte n cele dou emisfere, una din ele fiind secionat n vederea efecturii amprentelor pentru reacia de imunofluorescen ct i pentru prelevarea de probe pentru diagnosticul histologic, iar cealalt emisfer va constitui contra-proba (se vor introduce flocoane din acesta n flacoane nchise etan care vor fi atent identificate). Protocolul prelevrii probelor postmortem pentru diagnosticul Rabiei la animale.46

Fig. 21 Eviscerarea sistemului nervos central

Fig. 22 Seciune longitudinal antero-posterioar a emisferelor cerebrale

47

Fig. 23 Evidenierea cornului lui Ammon corespunztor fiecrei emisfere cerebrale

5.4. Efectuarea reaciei de imunofluorescen direct 5.4.1. Efectuarea de amprentePentru prepararea lamelor se recolteaz fragmente de creier din zonele de elecie (cornul lui Ammon, cerebel, scoara, trunchi). Se numeroteaz lamele, fiecare n parte, cu cifre marcate cu creionul ordinar pe partea de lucru a lamei. Se fac seciuni transversale n cornul lui Ammon i n celelalte zone, se preleveaz fragmente cubice de esut ce se depun apoi pe o suprafa ce ader, dup aceea se efectueaz cte dou amprente pe fiecare lam. Dup efectuarea a 8 - 10 lame, se decupeaz vrful cubului ce se pune n contact cu lamele. Resturile de creier se pstreaz pentru obinerea omogenatului n vederea inoculrii animalelor, n cazul n care imunofluorescena direct este negativ, dar i pentru constituirea contra-probei care se depoziteaz la temperatura de sub -20 de grade Celsius, timp de 45 de zile.

48

Fig. 24 Prelevarea i etalonarea unui fragment din cornul lui Ammon

Fig. 25 Realizarea de frotiuri prin metoda amprentei

5.5. Realizarea de frotiuri prin metoda amprentei49

5.5.1 Uscarea amprentei. Aceast operaie se execut n hot. Lamele se ususc latemperatura camerei n hot cu ventilaie, apoi se expun la lumin UV 30 de minute pentru inactivarea virusului.

5.5.2. Fixarea i uscarea. Se realizeaz tot n hot. Fixarea se face n aceton, rcit nprealabil, timp de 30 de minute n congelator, dup care se scot i se usuc la temperatura camerei.

5.5.3. Marcarea. Se fac marcaje cu creionul gras (cerat) imunofluorescent, n form decerc cu diametrul de 1,5-1,8 cm, pe 4 sau 5 lame din cele 8-10 lame iniial preparate.

5.5.4. Preparare i depunere conjugat. La preparare se respect recomandrileproductorului. Conjugatul liofilizat se hidrateaz ntr-un volum de ap distilat i se centrifugheaz, pentru clarificare, timp de 20 de minute la 2500 rpm. Supernatantul este folosit la colorarea amprentelor supuse diagnosticului. Serul fluorescent activ se pune pe una din amprente, iar serul fluorescent inactivat, ce a servit ca martor negativ, se pune pe cealalt amprent pe aceeai lam.

5.5.5. Incubare. Preparatele se introduc n baie umed la termostat timp de 30 de minute la37 grade Celsius.

5.5.6. Splare. Dup inoculare se ndeprteaz conjugatul ntr-un recipient cu dezinfectant ise pune la splat timp de 15 minute ntr-o baie cu tampon fosfat salin (T.F.S.) la pH=7.0 7.4 pe agitatorul magnetic.

5.5.7. Montare lamele. Lamele dup ce au fost scoase de la agitatorul magnetic, se las lazvntat, se adaug o pictur de glicerina tamponat, peste care se pun lamelele degresate, care se preseaz uor pentru ndepartatea bulelor de aer. Apoi se scutur lamele pe cant pentru ndepartarea surplusului de glicerin.

5.5.8. Validare. Se folosesc ca etaloane, amprentele martor ce conin esut tratat cu ser fade anticorpi antirabici marcai.

5.5.9. Interpretarea rezultatelor. Pentru confirmarea diagnosticului prin acest test s-aconvenit c cel puin dou din cele 4-5 lame colorate s conin corpusculi fluoresceni specifici. n situaia n care se gsesc formaiuni ce ntrunesc caracteristicile acestora pe o singur lam din cele 4-5 colorate, se face i colorarea celorlalte lame aflate n rezerv, iar interpretarea final se va face pe 10 lame lucrate i examinate; testul fiind apreciat ca fiind pozitiv dac din totalul acestora se gasesc dou lame cu corpusculi fluoresceni.

50

Fig.26 Testul de imunofluorescen direct - rezultat pozitiv

Fig.27 Testul de imunofluorescen direct - rezultat negativ

51

Capitolul 6 Testul de bioprob pe oareci cu confirmare prin imunofluorescen direct pentru diagnosticul Rabiei la speciile mamifere 6.1. Principiul metodeiDetecia de antigeni ai virusului rabic pe cale intracerebral a oarecilor tineri cu o suspensie dintr-un broiaj de materie cerebral. oarecii tineri sunt mai sensibili dect cei aduli, iar infecia provoac mortalitate pn la a 28 zi de la inoculare. Din creierul oarecilor mori pn la a 28 zi, inclusiv, se efectueaz testul de imunofluorescen direct.

6.2. Reactivii necasari reactiei sunt:- conjugatul pentru diagnosticul prin imunofluorescen direct (o prob activ i un martor) din setul de diagnostic; aceton; tampon fosfat salin; glicerin anhidr 50% tamponat; mediu de triturat este recomandat o soluie salin fiziologic sau alte soluii similare (ser fiziologic); ap distilat sau ap ultra pur. n cazul n care materialul de inoculat nu este steril sau proaspt, la soluie se adaug i antibiotice. Reactivii utilizai trebuie s fie de calitate pentru analiz sau de calitate echivalent. Apa trebuie s fie distilat sau de puritate echivalent.

6.3. Echipamente de ncercare i mijloace de msurare 6.3.1. Aparatura necesar este:- congelator; microscop; lamp UV; balan tehnic; centrifug; micropipet; hot; pH metru; etuv; termohigrometru.

6.3.2. Instrumentarul necesar este compus din:- menghin; foarfeci; pense anatomice i dentare; fierstru; ochelari de protecie; bi umede de incubae; bi de splare; cuit; satr de buctrie; cuve centrifug; cuve nchise etan ce vor funciona ca bi umede sau bi de splare; ceas de laborator; seringi gradate, ace de sering.

6.3.3. Alte materiale ca:- marker waterpoof; container Biorad; alcool sanitar; masc de protecie; bi de splare; tifon, lavete care nu las scame; hrtie igienic; pungi i saci de plastic; mnui chirurgicale i de uz menajer; cloroform, soluie dezinfectant de laborator; spun; baghete de sticl sterilizate la etuv; detergent; creioane grase pentru marcarea lamelor, nefluorescente n UV; cuti pentru

52

oarecii pe care se va face inocularea; hrtie de filtru; hrtie pentru ambalaj; nisip de cuar sau nisip de mare sterilizat termic; eprubete de plastic; filtru; suporturi pentru lame.

6.3.4. Sticlria necesar:- cuva de fixare (n care se fixeaz frotiul cu aceton); cuve pentru centrifug; lame i lamele pentru microscop; pipete gradate; eprubete; plci Petri; pahare Berzelius; cilindrii gradai.

6.3.5. Animalele de laborator folosite sunt reprezentate de 5-10 oricei albi cu vrsta de 2-3sptmni pentru fiecare prob.

Fig. 27 oarece alb de laborator cu simptome de rabie (paralizia membrelor posterioare)

6.4. Mod de lucru 6.4.1. Prelevare i conservare/ pregtire probeRecoltarea, condiionarea i transportul probelor pentru analiz