1. Universidad Nacional Autnoma de Mxico Facultad de Qumica Qumica Analtica Instrumental IITcnicas CromatogrficasDiciembre de 2007

2. Introduccin a los mtodos de separacinCaptulo 1.Introduccin a los mtodos de separacin1.1 Introduccin a la cromatografa En 1906, el botnico Ruso M. Tswett realiz un experimento que condujo al descubrimiento de loque hoy conocemos como cromatografa. Coloc un extracto de pigmentos vegetales en la partesuperior de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio (CaCO3). Al agregar ter, observ que lamezcla original se separaba en diversas bandas coloridas que descendan a travs de la columna adiferentes velocidades. Un rasgo caracterstico de la cromatografa es la presencia de dos fases; dispuestas de tal maneraque mientras una permanece estacionaria dentro del sistema (fase estacionaria), la otra se desplaza a lolargo de l (fase mvil). La clave de la separacin en cromatografa es que la velocidad con la que semueve cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribucin). En elexperimento de Tswett, la separacin de los pigmentos vegetales se logr gracias a que cada uno deellos tena una afinidad diferente por las fases. En general, los componentes ms afines a la faseestacionaria avanzan lentamente (ms retenidos) mientras que los ms afines a la fase mvil (menosretenidos) se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia, el medio cromatogrfico (columna, placa opapel) funciona como un controlador de la velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla,logrando as su separacin y mediante el uso de un detector, su caracterizacin qumica.Aunque los principios fundamentales son los mismos, se acostumbra clasificar los mtodoscromatogrficos segn el estado fsico de la fase mvil:Cromatografa lquida. La fase mvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria unslido que interacta con las sustancias que se desea separar (cromatografa lquido-slido), o bien unlquido inmiscible con la fase mvil, depositado en la superficie de un slido (cromatografa lquido-lquido). Esta forma de cromatografa puede realizarse con diferentes arreglos experimentales: encolumna, en capa delgada o en papel. En el primer caso, la fase estacionaria se encuentra rellenando untubo; en el segundo, se dispersa sobre una lmina de vidrio o aluminio formando un lecho de espesoruniforme; en la cromatografa en papel, la fase estacionaria es la solucin acuosa contenida en el interiorde las celdas formadas por las fibras de la celulosa, y es por tanto una forma de cromatografa lquido-lquido.Captulo 1 1 3. Introduccin a los mtodos de separacinCromatografa de gases. En este caso la fase mvil es un gas inerte (helio o nitrgeno) y la faseestacionaria es un slido (cromatografa gas-slido) o un lquido sostenido por un slido inerte(cromatografa gas-lquido). Este tipo de cromatografa siempre es en columna, ya que es la nicamanera de que la fase mvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La columnapuede estar rellena con la fase estacionaria, en forma semejante a la cromatografa lquida, o bien la faseestacionaria puede depositarse sobre las paredes de un tubo muy delgado (0.25mm de dimetro) y largo(hasta 100m). Este tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayorcapacidad de separacin. De acuerdo con el mecanismo de retencin, la cromatografa se puedeclasificar en los siguientes tipos: adsorcin (normal, de fase reversa)permeacin sobre gel particin lquido-lquidode afinidad intercambio inicoLas reas de aplicacin son muy diversas y abarcan prcticamente todas las actividades en las queinterviene la qumica, por ejemplo: se emplea en:El anlisis de drogas y frmacos en fluidos biolgicos como la saliva, la sangre, la orina;Seguir la transformacin de las sustancias responsables de la transmisin neurolgica;Determinar la presencia de contaminantes en el medio ambiente;Descifrar la composicin de los combustibles fsiles;Realizar el control de calidad de los productos qumicos y farmacuticos manufacturados; en fin, la listade ejemplos es interminable.1.2 Cromatografa en papelLa cromatografa en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar anlisiscualitativos ya que pese a no ser una tcnica potente no requiere de ningn tipo de equipamiento. Lafase estacionaria est constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita enun extremo colocando pequeas gotas de la disolucin y evaporando el disolvente. Luego el disolventeempleado como fase mvil se hace ascender por capilaridad. La separacin se realiza en funcin de laafinidad de los solutos con las dos fases, las ms solubles en agua se quedarn cerca del punto donde seaplic la muestra, y las menos solubles en agua y ms solubles en el disolvente llegarn ms lejos. Lassustancias separadas se identifican mediante diversos procedimientos fsicos o qumicosCaptulo 1 2 4. Introduccin a los mtodos de separacinLa cromatografa en papel es una tcnica utilizada para anlisis inorgnico cualitativo, permite llevara cabo la separacin e identificacin de iones, trabajando con cantidades mnimas de sustancia.Pertenece al tipo de Cromatografa de particin se fundamenta en que las sustancias problema,pueden tener diferentes coeficientes de reparto en dos disolventes de inmiscibilidad limitada, unopermanece fijo en la superficie del papel fase estacionaria generalmente en agua, la fase mvilconstituida generalmente por una mezcla de disolventes parcialmente miscibles en ella. Hay varios tiposde cromatografa, la ascendente (papel hacia arriba), descendente (papel invertido), radial y deseparacin de zonas y sectores.Al entrar en contacto con los disolventes empieza su fase de movilidad lo que produce unasmanchas caractersticas sobre el papel, generalmente, estas no son coloreadas y se revelan con unalmpara fluorescente, los contornos se marcan con lpiz. Como medida en cromatografa sobre papel seemplea el Rf (Retention factor), el cual se define como el cociente de dividir el recorrido de la sustanciapor el disolvente, esto es, la distancia media desde el origen hasta el centro de la mancha (X) dividida porla distancia que media desde el origen hasta el frente del disolvente (S). = [1]En la cromatografa en papel se utiliza como fase estacionaria una hoja de papel de celulosa deelevada pureza recubierta de una capa de agua asociada a las fibras de celulosa. La fase mvil, en la queir disuelta la muestra, se forma por disolventes cuya naturaleza se elige en funcin de los componentesque se pretenden separar.1.3 Cromatografa en capa finaLa cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa, uniforme, de unadsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, unadsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensin, otro paraCaptulo 13 5. Introduccin a los mtodos de separacinaplicar la capa de adsorbente, y una cmara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es precisotambin poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas.La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase estacionaria ser uncomponente polar y el eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma quelos componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares.Polaridad de los compuestos orgnicos en orden creciente:hidrocarburos < olefinas < flor < cloro < nitro < aldehdo aldehdo < ester < alcohol < cetonas < aminas < cidos < amidasLa cromatografa en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros mtodoscromatogrficos (en columna, en papel, en fase gaseosa) ya que el utillaje que precisa es ms simple. Eltiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separacin esgeneralmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruiran elcromatograma. El mtodo es simple y los resultados son fcilmente reproducibles, lo que hace que seaun mtodo adecuado para fines analticos.Al realizar la eleccin del adsorbente se debe tener en cuenta el tamao de las partculas deladsorbente, cuanto ms finamente dividido est mayor ser su adhesin al soporte, aunque tambin sele puede aadir un adherente.En la eleccin del eluyente influyen varios factores: Precio. No utilizar compuestos muy voltiles. Pureza. Evitar que contengan trazas de metales Noutilizar mezclas deeluyentes (catalizadores).(reproducibilidad).La eleccin del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que estudiar la polaridad del componente yprobar con eluyentes cada vez menos polares.Captulo 1 4 6. Introduccin a los mtodos de separacin Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados conlos componentes orgnicos (con tonos amarillo-marrn), pero las manchas desaparecen con el tiempocon lo que es conveniente sealar las manchas aparecidas. Otro reactivo revelador bastante utilizado es el cido sulfrico, que reacciona con loscomponentes orgnicos produciendo manchas negras. Sin embargo debe tenerse en cuenta que eltamao de las manchas no est relacionado con la cantidad de componente separado.1.4 Cromatografa de permeacin en gel La cromatografa de permeacin en gel, tambin conocida como cromatografa de exclusin esuna variante de la CLAE que consiste en una columna cromatogrfica empacada de tal manera que laspartculas de dicho empacamiento tienen diferentes tamaos de poros o de redes de poros con el fin deque las molculas de soluto sean retenidas o excluidas basndose en su forma y tamao y no en el pesomolecular. Bajo este entendido, las molculas de mayor tamao no caben dentro de los poros y sonarrastrados alrededor de la fase estacionaria, por lo que son excluidas y eluyen en el volumen de camade vaco de la fase mvil. Por el contrario, las partculas de menor tamao eluyen hasta el final porquetiene ms espacio de columna que recorrer debido a un fenmeno de difusin haca los poros que tienenaccesibles. Las molculas de tamaos intermedios tardan diferentes tiempos en eluir, debido a lacantidad de poros por los que puedan pasar.Empaquetamientos de columna. Existen distintos tipos de empacamientos columna. Entre ellos estnlos polmeros macromoleculares semirgidos, los entrecruzados, las slices rgidas las de porocontrolado. Los materiales semirgidos se hinchan ligeramente se debe tener cierto cuidado en su usoya que se limitan a una presin de 300psi. Las cuentas de poliestireno parcialmente sulfonado que tienenun tamao usual de 5m, son buenas para usarse con sistemas acuosos mientras los no sulfonados soncompatibles con sistemas no acosos.Captulo 1 5 7. Introduccin a los mtodos de separacinOtro tipo de empacamiento hidroflico poroso es preparado mediante una polimerizacin porsuspensin de metacrilato de 2-hidroxietilo con dimetacrilato de etileno. Estos empacamientos resistenpresiones de hasta 3000psi y pueden ser usados con sistemas acuosos y una amplia gama de disolventesorgnicos polares.Disolventes. La cromatografa de exclusin requiere un solo disolvente durante el anlisis en el cual sepueda disolver la muestra. El nico inconveniente que pude presentarse con los disolventes es larelacin de viscosidades. Cuando la viscosidad de la muestra inyectada difiere mucho con la viscosidadde la fase mvil se pueden dar, una distorsin en los picos cromatogrficos y cambios anmalos en lostiempos de retencin.1.5 Cromatografa de exclusin de ionesUna variante de la cromatografa de permeacin en gel o cromatografa de exclusin, es cuandose realiza para la exclusin de iones. Mediante esta modificacin, se tienen separaciones que dependende factores como tamao de partcula de la resina, forma inica e incluso distribucin de ismeros. Estopermite separar especies que de otra forma eluiran al mismo tiempo. Las separaciones se llevan a caboen resinas de intercambio con base en poliestireno de alta capacidad como eluyentes, cidos mineralesdiluidos.Mucho del trabajo en la industria de alimentos y bebidas (vino, cerveza, jugo de frutas, etc.) o demuestras fisiolgicas en donde la mayora de los cidos del ciclo de Krebs estn presentes, puede serhecho fcilmente mediante el uso de una columna de exclusin aninica. El uso de las columnas deexclusin aninica, en su modalidad con iones de calcio, se extiende a la separacin de oligosacridosusando agua como eluyente a una temperatura de 90C, aplicando tambin la separacin por exclusinestrica.1.6 Cromatografa de intercambio inicoLa cromatografa de intercambio inico se lleva a cabo con empaques de columna que tienegrupos funcionales cargados unidos a una matriz polimrica. Los grupos funcionales enlazadospermanentemente y asociados con contraiones de carga opuesta. El mecanismo de retencin mscomn es el intercambio simple de los iones de la muestra y de la fase mvil con el grupo cargado de lafase estacionaria.En el caso de empaques cargados negativamente sirven para intercambiar especies catinicas.Los ms comunes son los sulfnicos, los cuales son fuertemente cidos y tiene las propiedades de losCaptulo 16 8. Introduccin a los mtodos de separacincidos fuertes cuando est en la forma H. los empaques cargados positivamente se utilizan para elintercambio con especies aninicas. Los ms comunes son las aminas cuaternarias, las cuales sonfuertemente bsicas y en su forma OH presentan las propiedades de una base fuerte. Ambos gruposfuncionales estn totalmente disociados. As, sus propiedades de intercambio son independientes del pHde la fase mvil.La cromatografa de intercambio inico puede efectuarse con alguno de los varios tipos deempaques. El tipo pelicular consiste en un recubrimiento de resina, alrededor de 1-2m de espesor,sobre una cuenta de vidrio con dimetro de 30-40m. Las resinas superficialmente porosas se obtienenrecubriendo cuentas de vidrio con un lecho delgado de microesferas de slice en el que se impregna oenlaza un intercambiador de iones. Para ambos tipos de empaques la capacidad de intercambio es baja:0.01- 0.1 meq/g.El intercambiador puede tambin estar enlazado a macropartculas de slice por medio de reacciones desililacin o polimerizado dentro de los poros de un gel suficientemente poroso.El proceso primario en la cromatografa de intercambio inico involucra la adsorcin/desorcin demateriales inicos cargados en la fase mvil con una fase estacionara permanentemente cargadas (designo contrario). Ejemplo, una resina ionizada, inicialmente en forma H, en contacto con una solucinque contiene iones K+, existe un equilibrio:resina, H + K+resina, K+ + H+Las diferencias de retencin estn gobernadas esencialmente por las propiedades fsicas de los ionessolvatados. La fase de resina presenta preferencia por:1. El ion de carga mayor.2. El ion con menor radio solvatado.3. El ion que tenga mayor polarizabilidad.Aplicaciones de intercambio catinico:Los cationes inorgnicos se pueden determinar en alimentos, tales como los alimentos dietticos bajosen sodio, y en muestras de orina.Aplicaciones de intercambio aninico:Se pueden separar los cidos HCN, carbnico, silcico y brico de los cidos fosfrico, sulfrico yclorhdrico. Los metales que forman complejos cloruro y floruro.Captulo 17 9. Introduccin a los mtodos de separacin1.7 Cromatografa de fluidos supercrticosLa temperatura crtica de una sustancia es la temperatura por encima de la cual no puede existiren la fase lquida independientemente de la presin. La presin crtica es la presin de vapor de unasustancia a su temperatura crtica. Una sustancia a temperaturas y presiones por encima de sutemperatura y de su presin crtica (punto crtico) se denomina fluido supercrtico.Los fluidos supercrticos tienen densidades, viscosidades y otras propiedades que son intermedias entrelas caractersticas de esa sustancia en estado gaseoso y en estado lquido.Comparacin de las propiedades de los fluidos supercrticos con las de gases y lquidos. (Los datos sloindican el grado de magnitud). GASFLUIDO SUPERCRTICO LQUIDO Densidad (g/cm3)(0,6-2)*10-3 0,2- 0,50,6- 2 Coeficiente de difusin (cm2/s) (1-4) * 10-1 10-3 10-4 (0,2 2)* 10-5 Viscosidad (g cm-1 s-1) (1-3)* 10-4(1-3) * 10-4(0,2- 3)* 10-2Las propiedades seleccionadas son aquellas que son significativas para la cromatografa de gases,lquidos y fluidos supercrticos, as como la extraccin de fluidos supercrticos. Una propiedad importantede los fluidos supercrticos, que est relacionada con sus densidades elevadas (de 0,2 a 0,5 g/cm3), es sunotable capacidad para disolver molculas grandes no voltiles. Por ejemplo, el dixido de carbonosupercrtico disuelve fcilmente n- alcanos que poseen entre 5 y 30 tomos de carbono. Una segundapropiedad notable de los fluidos supercrticos es que los analitos disueltos en ellos pueden serfcilmente recuperados por el procedimiento simple de permitir que las disoluciones se equilibren con laatmsfera a temperaturas relativamente bajas. Otra ventaja de los fluidos supercrticos es que sonbaratos, inocuos y no son sustancias txicas, por lo que se pueden dejar evaporar libremente en laatmsfera sin efectos ambientales dainos.La cromatografa de fluidos supercrticos (SFC) es una modalidad hbrida entre la cromatografade gases y de lquidos que combina algunas caractersticas de cada una de ellas. Esta tcnica es una delos tres tipos importantes de cromatografa en columna, sta permite la separacin y determinacin decompuestos que no son manipulados ni por la cromatografa de gases ni por la de lquidos: compuestosno voltiles o trmicamente lbiles para los que la cromatografa de gases es inaplicable y (2) losCaptulo 1 8 10. Introduccin a los mtodos de separacincompuestos que tienen grupos funcionales que no son detectables por las tcnicas espectroscpicas oelectroqumicas empleadas en cromatografa de lquidos.Los equipos instrumentales para la cromatografa de fluidos supercrticos son bastante parecidosen lo referente a los componentes instrumentales a los equipos de HPLC. Existen, sin embargo, dosdiferencias importantes: (1) Es necesario un horno, similar para mantener la columna termostatizada yadems proporcionar un control preciso de la temperatura de la fase mvil; (2) un restrictor o undispositivo de contrapresin, que se utiliza para mantener la presin en la columna en el nivel deseado ypara convertir el eluyente, de fluido supercrtico en un gas, y arrastrarlo al detector.Las variaciones de presin en cromatografa de fluidos supercrticos tienen un efecto muymarcado sobre el factor retencin o de capacidad, k. Este efecto es una consecuencia del incremento dela densidad de la fase mvil a medida que aumenta la presin. Tal incremento de la densidad origina unaumento de la capacidad disolvente de la fase mvil, lo cual acorta los tiempos de elucin. La mayora delos perfiles de presin utilizados en cromatografa de fluidos supercrticos son: presin constante(isobrica) para un perodo de tiempo dado seguida de un aumento lineal o asinttico de la presin hastaalcanzar el valor de la presin final.Fases estacionarias. En SFC se emplean tanto las columnas abiertas como las columnas rellenas, aunquelas primeras son las ms empleadas. Las columnas abiertas son similares a las columnas de slice fundidacon recubrimientos internos de varios tipos de siloxanos enlazados y de enlaces cruzados. Las columnastienen una longitud de 10 a 20 m y un dimetro interno de 0,05 a 0.10 mm. El espesor de la pelcula varaentre 0.05 1 micrmetro.Fases mviles. La fase mvil ms utilizada en SFC es el CO2. Es un disolvente excelente par un conjunto demolculas orgnicas no polares. Adems, es una sustancia transparente en el ultravioleta, es colora, notxica, fcilmente disponible y muy barata cuando se compara con otras fases mviles cromatogrficas.La temperatura crtica del CO2 ES 31 C y su presin crtica 72,9 atmsferas, lo cual permite jugar con unabanda amplia de temperaturas y presiones sin superar las condiciones de operacin de un equipo deHPLC moderno. Sustancias como etano, butano, xido nitroso, diclorodifluorometano, ter dietlico,amonaco y tetrahidrofurano han sido utilizadas como fases mviles de cromatografa de fluidossupercrticos.Detectores. La principal ventaja de la SFC frente al HPLC es que se pueden utilizar como en lacromatografa de gases, detectores de ionizacin de llama. Este detector es de respuesta universal acompuestos orgnicos, de elevada sensibilidad. Los espectrmetros de masas tambin se puedenCaptulo 1 9 11. Introduccin a los mtodos de separacinadaptar como detectores ms fcilmente para SFC que para HPLC. Otros detectores utilizados son deabsorcin en el ultravioleta y en el infrarrojo, de emisin de fluorescencia, termoinico y fotomtrico dellama. La cromatografa de fluidos supercrticos se ha aplicado a la separacin de un amplio conjunto desustancias, entre los que se cuentan productos naturales, frmacos, alimentos, pesticidas y herbicidas,tensoactivos, polmeros, aditivos de polmeros, combustibles fsiles y explosivos y propelentes.1.8 Cromatografa de afinidad La cromatografa de afinidad separa las protenas (analitos) en funcin de su especificidad defijacin de ligandos. Los ligandos de afinidad son molculas polimricas que sirven de soporte porqueestn unidas covalentemente sobre la columna cromatogrfica o matriz inerte que debe de tener unaestructura de poro abierta y estabilidad en condiciones de cambio de pH, detergentes y agentesdisociantes, para as, retener y adsorber especficamente a las protenas, la fase estacionaria es slida.Estos ligandos se clasifican segn su naturaleza qumica o su selectividad para la retencin de analitos,esta ltima se clasifica en ligandos especficos (anticuerpos) y generales (como las lecitinas). Cuando lasprotenas no especficas se han lavado a travs de la columna, se eluye la protena ligada con solucinque contiene ligando libre. Despus se introduce una nueva fase mvil que se desactiva, generalmentepor el acoplamiento o alteracin de los sitios activos inhibidor-ligando, para que esto pueda ser posible,se necesita un cambio en el pH, la fuerza inica o la polaridad, debido a que estas condiciones modificanlas caractersticas de los sitios activos, la finalidad de este proceso es hacer fluir a la protena paracontinuar con la regeneracin de la columna cromatogrfica. La cromatografa de afinidad tiene la ventaja de ser altamente selectiva para la retencin deprotenas afines a la columna, para ello, emplea sistemas de baja presin, columnas cortas y un camporestringido para la separacin. Esquema de cromatografa de afinidad: En el primer vaso, se encuentra una mezcla de protenasque se aaden a la columna, la cual contiene un ligando especfico ligado al polmero, para la protena deinters. En el segundo matraz se encuentra una solucin de ligando, el cual se aade a una probeta paraque eluya a la protena de inters. La bureta de en medio indica que las protenas deseadas se lavan atravs de la columna. Los puntos rojos representan la protena de inters, los negros, el ligando y las bolas beigeunidas a los puntos negros, representan el ligando acoplado con el polmero.Captulo 110 12. Introduccin a los mtodos de separacin1.9 Cromatografa de lquidos de alta resolucinLa cromatografa de lquidos de alta eficacia es la tcnica analtica de separacin ms ampliamenteutilizada. Las razones son la sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas,es ideal para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y por su gran aplicabilidad a sustanciasque son de inters en la industria. Algunos ejemplos son: aminocidos, protenas, cidos nucleicos,hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenoides, plaguicidas, antibiticos, esteroides, especiesorganometlicas y gran variedad de sustancias inorgnicas. La fase mvil es un lquido y la faseestacionaria es una columna que puede ser de acero inoxidable.1.10 ElectroforesisLos orgenes de sta tcnica se remontan a los trabajos de Tiselius en 1973, quien logr separarmezclas de protenas (micelas cargadas elctricamente) por su distinta movilidad en un soporte porosoal que se aplicaba un campo elctrico. Posteriormente se ha aplicado a la separacin de cualquierespecie cargada o alrededor de una doble capa elctrica.El fundamento de la tcnica consiste en depositar sobre un medio poroso una mezcla deespecies cargadas. Por aplicacin de un campo elctrico entre los extremos del soporte poroso lasespecies se separan en funcin de sus cargas y su movilidad inica en ese medio. Cuanto ms elevadosean el voltaje y la intensidad en menos tiempo se produce la separacin; sin embargo valores altos deestas variables provocan un aumento de temperatura, con la consiguiente evaporacin del disolvente yacumulacin de sales del tampn, lo cual es indeseable.Para favorecer el paso de corriente se utilizan disoluciones fondo conductoras (electrolitos) queson disoluciones reguladoras en las que se empapa previamente el soporte poroso, debidamenteescogidas para que no formen precipitados con las especies del problema. Como soportes se hanutilizado almina, lana de vidrio, almidn, agar-agar, gel de slice, etc.Captulo 1 11 13. Introduccin a los mtodos de separacinElectroforesis capilarLa seccin transversal del aparato de electroforesis se puede reducir se forma drstica al realizarla electroforesis en el interior de un tubo capilar de dimetro interno menor a 0.1mm y una longitud de50cm a 1m. Es efectivo llevar de sta forma la tcnica porque la resistencia elctrica de la disolucin estan alta que la corriente se mantiene baja, en consecuencia se pueden mantener voltajes ms altos sincalentamiento excesivo. La tcnica tiene gran poder de resolucin y se han desarrollado mtodos parallevar a cabo la electroforesis incluso en molculas neutras no inicas.Adems, las zonas de analitos separados por electroforesis capilar se pueden detectar de igualmodo que en una cromatografa en columna. El inconveniente de utilizar un capilar es que el volumen demuestra debe ser de alrededor de un nanolitro o menos, y despus de la separacin, cada uno de losanalitos est en volmenes inferiores al nanolitro. Con volmenes de lquido tan pequeos, muy pocosmtodos de deteccin se pueden usar eficazmente. Fig. 1. Diagrama de las partes bsicas de un instrumento de electroforesis capilar con deteccin espectroscpica. La muestra penetra por la parte de la izquierda introduciendo el final del capilar en la disolucin de la muestra y cargndolo, bien hidrodinmicamente, bien electrocinticamente. Toda la unidad de la ilustracin funciona a temperatura constante. El capilar est enrollado alrededor de un soporte. Durante el anlisis los niveles de las dos disoluciones tampn deben ser iguales como se indica con la lnea punteada) para evitar el flujo de masa debido a una diferencia de presin.1.11 Bibliografa Braithwaite, A. Mtodos cromatogrficos, 4 ed., ED. Chapman & Hall, Londres, 1985. Pginas 216-217, 271-272. Burriel Marti, Felipe Lucena Conde, Siro Arribas Jimeno, Jess Hernndez Mndez, Qumica AnalticaCualitativa, Ed. Thompson, Espaa, 2003 pp 321-322. Garrido, A., Fundamentos de qumica biolgica. Interamericana Mc Graw-Hill. Espaa. 1991. Kenneth A. Rubinson, Judith F. Rubinson, Anlisis Instrumental, Ed. Prentice Hall, Espaa 2004, pp730-739. Lehninger, Albert. L. Principios de Bioqumica. Segunda Edicin. Ediciones Omega. Barcelona, 1995,pp 137Captulo 1 12 14. Introduccin a los mtodos de separacin McCABE / SMITH /HARRIOTT. Operaciones Unitarias en Ingeniera Qumica 1991. Cuarta Edicin enEspaol. Editorial McGraw Hill S.A. Espaa PERRY, ROBERT H. Manual del Ingeniero Qumico 1992. Sexta Edicin. Tercera Edicin en Espaol.Editorial McGraw Hill. Mxico Skoog A. Douglas. Principios de anlisis instrumental, 5 ed., Saunders Collage Publishing, Espana,2001, pgs.: 785- 791 y 831- 836. Willard Hobart, Mtodos instrumentales de anlisis. 7. Ed., Compaa de publicaciones Wadsworth,California, 1988, Pginas 644-650. http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/cromatografia.htm http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_de_afinidad.pdf http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/capa-fina http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_en_papelhttp://www.monografias.com/trabajos13/sepal/sepal.shtmlCaptulo 113 15. Parmetros cromatogrficosCaptulo 2Parmetros cromatogrficos2.1 GlosarioAnchura de base: suele ser el intervalo de longitud de frecuencia de un pico; el intervalo pasa por unseparador de banda.Banda: Es una situacin ideal, es una distribucin gausiana. La cantidad de compuesto que sale decromatografico o de una columna electrofortica.Coeficiente de difusin: Medida de la movilidad de una especie en unidades de cm2/s.Coeficiente de reparto: constante de equilibrio que describe la distribucin de un soluto entre dos fases,para definir el coeficiente de particin solo se utiliza una forma de un soluto (kD).Coeficiente de selectividad: medida de la sensibilidad de un mtodo para un interferente dado encomparacin con su sensibilidad para el analito (KA,I).Cola: prolongacin final de un pico cromatogrfico, generalmente debida a la presencia de lugares muyactivos en la fase estacionaria.Constante de disociacin: constante de equilibrio de una reaccin en la que un complejo metal- ligandose disocia para formar un in metlico libre y un ligando (kD).Constante de equilibrio: K Constante que se basa en las concentraciones molares al equilibrio, su valornumrico de K depende de la fuerza inica del medio.Cromatografa: separacin en la que los solutos se distribuyen entre fase mvil y estacionaria.Cromatografa gaseosa: tcnica cromatogrfico en la que la fase mvil es un gas.Cromatograma: registro de la seal de deteccin en funcin del tiempo de elusin o del volumen.Eficiencia de la columna: medida del grado de ensanchamiento de una banda cromatogrfico, se sueleexpresar en trminos de la altura H, de los platos o del nmero N de platos tericos. En la medida en quela distribucin del analito dentro de la banda es gausiana, la altura de los platos est dada por la varianzadividida entre la longitud de la columna del empacado.Captulo 214 16. Parmetros cromatogrficosEnsanchamiento de banda: aumento de la anchura de base de un soluto a medida que se desplazadesde el punto de inyeccin al detector.Factor de capacidad: medida de la fortaleza con la que la fase estacionaria retiene en soluto dado (k).Factor de selectividad: cociente de los factores de capacidad de dos solutos que muestra la selectividadde la columna para uno de ellos ().Factor de separacin: medida de la eficacia de una separacin en lo que se refiere a la separacin entreel analito y el interferente.Fase estacionaria: fase extractante que permanece en posicin fija.Fase mvil: fase extractarte que se desplaza a travs del sistema.Nmero de platos tericos: caracterstica de una columna cromatogrfica que se emplea para medir sueficiencia.Plato terico: medio cuantitativo para evaluar la eficacia de una columna y que consiste en tratar unacolumna, como si estuviera compuesta de pequeas zonas o platos, en las que tiene lugar el repartoentre las fases mvil y estacionariaRelacin de distribucin: cociente que expresa la concentracin total de soluto en una fase en relacincon una segunda fase; en su definicin participan todas las zonas del soluto (D).Resolucin: separacin entre dos bandas cromatogrficas (R).Selectividad: Medida de la ausencia de interferencia de un mtodo que se mide ante el cociente deselectividad del mismo.Tiempo de retencin: es el tiempo entre la inyeccin en una columna cromatogrfica y la llegada a unpico de analito al detector.Tiempo muerto: tiempo necesario para que una especie no retenida pase a travs de la columna.Captulo 2 15 17. Parmetros cromatogrficos Un parmetro es una cantidad que puede tener distintos valores y que caracteriza un proceso,una operacin o un resultado. La parametrizacin de datos en cromatografa, como en otros mtodosfacilita la tabulacin y la comunicacin de dichos datos. Se puede parametrizar la forma, la posicin y laresolucin de las bandas de una cromatografa. Estos pueden correlacionarse satisfactoriamente condescripciones de los procesos moleculares que tienen lugar durante la separacin.2.2 Constantes de Distribucin Al encontrarse un soluto disperso en una fase que entra en contacto con otra, ocurre unfenmeno de distribucin, en el cual dicho soluto puede tener mayor afinidad a alguna de las dos fases.De esta manera, se genera un equilibrio entre la cantidad de soluto que existe en una fase y en otra. Laconstante asociada es la llamada constante de distribucin, que se define para un soluto A como: 1 = 2donde [A]1 y [A]2 son la concentracin de A en la fase 1 y 2 respectivamente. Concretamente, encromatografa la fase 1 es la fase estacionaria y la fase 2 es la fase mvil y el soluto A es el analito deinters. Esta constante es especfica para cada compuesto con cada determinada fase estacionaria y fasemvil.2.3 Factores de influencia en la retencin La retencin que ocurre del soluto en la fase estacionaria, se debe generalmente a la diferenciade polaridades entre las fases estacionaria y la mvil, promoviendo que el soluto se reparta entre ellassegn su coeficiente de distribucin. De esta manera, al separarse una mezcla que contenga solutos conpolaridad distinta, y por lo mismo coeficientes de distribucin distintos, la retencin ser diferente paracada uno. En la cromatografa de gases, el to, es evaluado convenientemente a partir del tiempo deretencin del pico de aire. En la cromatografa de lquidos, cualquier compuesto no retenido puedeusarse como muestra para medir el to. El tiempo muerto de la columna puede usarse para determinar el llamado tiempo de retencinajustado o corregido, tR.tR = tR toCaptulo 216 18. Parmetros cromatogrficosUna medida conveniente y til de la retencin del soluto est dada por el factor de capacidad (ofactor de retencin), k = 0FIG. 1. Cromatograma que muestra diferentes picos con tiempos de retencin diferentes, as como el tiempo muerto.Los valores de k no tienen un significado simple en un gradiente de elucin o en temperaturaprogramada, y usualmente no son reportados cuando esos procedimientos son usados. Los valores de kpueden ser determinados a partir del tiempo de retencin, tR.En los modos de retencin de cromatografa se tiene: k > 0, que significa que no hay bandaseluidas antes del tiempo muerto, to. A menudo es til expresar el tiempo de retencin o el volumen entrminos del factor de capacidad, k. tR = to (1+ k)VR = Vm (1 + k)La retencin del soluto en la fase estacionaria depende de la afinidad, y de los factores que puedanafectar a la misma. El fenmeno de adsorcin depende fuertemente de la temperatura, a mayor sea stase fomentar la desorcin, y debe por tanto controlarse dependiendo de la naturaleza del anlisis.2.4 Retencin y Equilibrio en CromatografaEl soluto se encuentra en un equilibrio de distribucin entre la fase mvil y la estacionaria, ydependiendo del desplazamiento de dicho equilibrio es la retencin del mismo. Una separacincromatogrfica tpica se muestra en la figura 2. La separacin est fuertemente afectada por laproximidad de bandas adyacentes en el cromatograma.Captulo 217 19. Parmetros cromatogrficosUna importante medida de la proximidad de bandas es el llamado factor de separacin, , dondedos bandas adyacentes, teniendo los valores k1 y k2: = k2 / k1El factor de separacin, , es usualmente identificado con la selectividad del sistemacromatogrfico, es decir, la habilidad del sistema a prever diferentes tiempos de retencin para doscompuestos especficos. Dicho factor debe tener un valor mayor a uno, pues esto significara que no hayseparacin, pero es recomendable que sea menor a dos puesto que tiempos de retencin muy largos setraducen en tiempo desperdiciado durante la operacin experimental. Los valores de depende de losdos solutos y de1) La composicin qumica de la fase estacionaria.2) La composicin qumica de la fase mvil (excepto en cromatografa de gases).3) La temperatura.En cromatografa de fluidos supercrticos, la presin tambin puede afectar a al cambiar la densidad dela fase mvil.FIG. 2. Separacin de una muestra de un compuesto nitrado con 10 componentes por cromatografa de lquidos .2.5 Eficiencia de separacin de una columnaLas columnas cromatogrficas consisten en un nmero de zonas adyacentes en cada una de lascuales hay suficiente espacio para que un analito est en equilibrio entre dos fases. Cada una de estaszonas se conoce con el nombre de plato terico (de los que hay N en cada columna). La longitud de unacolumna contiene una altura del plato, H, que tiene unidades de longitud, normalmente en micras. ElCaptulo 218 20. Parmetros cromatogrficosvalor numrico de N y H para cada columna en particular es expresado en referencia a cada analito. Laaltura del plato est relacionada con la anchura del pico del analito y la distancia que recorre dentro dela columna, X: 2= Xdonde es un estndar de desviacin de la banda gaussiana. Para los picos gaussianos simtricos laanchura de la base es igual a 4 y la anchura del pico al punto de inflexin, i es igual a 2. Por lo tantoel valor de H puede ser calculado desde el cromatograma midiendo la anchura del pico.El nmero de platos tericos en la columna entera viene dado por: == 2 donde L es la longitud de la columna.Si consideramos la posicin del pico a X = L con el hecho de que la anchura del pico en su base es ,obtenida de las tangentes dibujadas desde los dos puntos con ms pendiente del pico, es igual a 4, laecuacin anterior se convierte en 16 2=W2Si en lugar de medir L y en unidades de longitud se hace en tiempo, la ecuacin quedar: 2 = 16La medicin del ancho del pico es ms confiable cuando se realiza a la mitad de la altura del pico,con lo cual se puede utilizar 2 = 5.5451/2Tambin puede hacerse en funcin de la altura y rea del pico 2 = 2Es importante que tanto , W W1/2 se expresen en las mismas unidades yaque N es adimensional.Captulo 2 19 21. Parmetros cromatogrficosPara que un sistema sea eficiente, se necesitan fases poco viscosas, espesores de pelcula delgados ycolumnas de poco dimetro, para que se favorezca la transferencia de masa. La velocidad promedio de lafase mvil tambin afecta la altura del pico, por lo que hay una velocidad ptima para obtener elmximo de eficiencia. Generalmente se trabaja a flujos mayores de ste para no perder demasiadotiempo en anlisis.2.6 Procesos de ensanchamiento de bandaEl nmero de platos de una columna (eficiencia, N) es una medida del ensanchamiento de labanda cromatogrfica. Cuando inyectamos un pequeo volumen de analito en una columna forma unabanda estrecha en su inicio, pero a medida que el analito migra la banda se va ensanchando. La anchurade pico aumenta con la raz cuadrada de la longitud que la banda ha recorrido. Segn la ecuacin de VanDeemter+ = + A representa el trmino de caminos mltiples. Esto es porque las molculas no siguennicamente un camino, hay multicanales, que se deben a la densidad de empacado de la faseestacionaria y afecta segn el tamao y forma de la partcula.B representa la difusin axial, la cual depende de la movilidad de las molculas en las fases. Elsoluto se difunde desde la zona central que es la ms concentrada hacia las regiones ms diluidas. Enesto influye la velocidad v , pues a velocidades muy altas no se alcanza a difundir y predomina el trminoA. Para encontrar la velocidad ptima puede trazarse una curva de Van Deemter al graficar H en funcinde v.Por ltimo, C representa la resistencia a la transferencia de masa. Es necesario ste trmino porque enrealidad los fenmenos que ocurren estn fuera del equilibrio. Esto es porque las corrientes de la fasemvil como la capa de fase estacionaria tienen una anchura determinada. Por lo que las molculas deanalito necesitan primero migrar desde el centro de ellas hasta la interfase donde ocurre latransferencia, y este retraso temporal se traduce en ensanchamiento de bandas.2.7 ResolucinLa separacin relativa de dos bandas a menudo se refiere a su resolucin, Rs. La resolucin se definecomoCaptulo 2 20 22. Parmetros cromatogrficos 2 1 =1( + 2 )2 1Aqu, t1 y t2 se refieren a los tiempos de retencin (tR) de la primera y la segunda banda, y W1 y W2son el ancho de dichas bandas. La figura 3 ilustra la separacin de dos bandas adyacentes como unafuncin de sus valores de Rs y su tamao relativo. Se observa que la separacin mejora sistemticamentea mayores valores de Rs, y la separacin es generalmente mejor para dos bandas de igual tamao (y elmismo valor de Rs.). Esto es, mayores valores de Rs se requerirn normalmente para la separacin de lasbandas desiguales.Fig 3. Separacin de dos bandas como una funcin de la resolucin (Rs) y el tamao relativo de banda.La resolucin depende de la retencin y selectividad de manera proporcional. A mayorselectividad y retencin k, mayor resolucin. Para tener una buena separacin se recomienda utilizar k> 2, y generalmente se trabaja con 1.Para el anlisis cuantitativo es deseable (pero no siempre prctico) alcanzar la resolucin de almenos Rs = 1.5, desde que esto corresponde a la separacin a la lnea base de bandas de tamao similar.La separacin de la lnea base hace que los sistemas de datos midan el tamao de cada bandaapropiadamente y esto significa una cuantificacin fiable.Una resolucin pobre puede deberse a que el mtodo utilizado no es apropiado, pues nodiscrimina entre los solutos, o que hay mucha muestra en proporcin a la columna cromatogrfica.Captulo 221 23. Parmetros cromatogrficos2.8 Cuantificacin en cromatografaPara llevar a cabo un anlisis cuantitativo, es necesario que los datos obtenidos sean confiables,tanto para la construccin de la curva de calibracin como para el tratamiento del analito mismo.Primero es necesario llevar a cabo un anlisis cualitativo, en el cual se encuentren las condicionesptimas. Para evaluar esto, se calculan los parmetros cromatogrficos de cada ensayo que sirven comoreferencia. De sta manera se eliminan fuentes de error, pues se trabaja en las mejores condicionesposibles, acercndose a resultados reproducibles y por tanto precisos, y lo ms exactos que sta tcnicanos permite.Si no se obtiene una buena resolucin, primero debe repetirse el ensayo con menor cantidad demuestre, sino puede probarse utilizando una fase mvil distinta, y si esto no ayuda, puede utilizarse otrafase estacionaria. En caso de que la selectividad no sea buena, debe revisarse la temperatura de trabajo,y analizar la naturaleza qumica de las distintas fases as como solutos, para probar con otra fase seaestacionaria o mvil. No debe perderse de vista, que a menor tiempo de operacin mejor, y que una vezencontradas las mejores condiciones, no deben alterarse.Para realizar la curva de calibracin puede usarse el mtodo de estndar externo o interno,siendo el segundo apropiado para eliminar posibles errores de operacin.2.9 ResumenLa cromatografa es una tcnica de separacin que se basa en la diferencia de distribucin queexiste entre dos componentes de una mezcla en las fases estacionaria y mvil. As, cada soluto tendr untiempo de retencin distinto y podrn analizarse por separado.Los parmetros cromatogrficos son claves para el diseo de un anlisis, pues son herramientasque ayudan a evaluar las condiciones en las que se est llevando a cabo.Cada soluto tendr asociado un tiempo de retencin distinto que se puede expresar como elfactor de capacidad, y la relacin de los tiempos de retencin o factores de capacidad de los solutos nosindicar si la selectividad del sistema es buena. Al calcular la resolucin se podr evaluar si la separacinentre los tiempos de retencin se los solutos es suficiente o excesiva. El clculo de los platos tericos nosindicar la eficiencia del sistema.Una vez evaluados los parmetros cromatogrficos, se podr determinar si el cromatogramaobtenido es aceptable, o si es necesario modificar alguna condicin para optimizarlo.Captulo 222 24. Parmetros cromatogrficos2.10 BibliografaHeftmann, E. Chromatography: Fundamentals and Applications of chromatography and relateddifferential migration methods, Elsevier Science Publishers B.V,5a. edicin, EUA, 1992, pp. 2-14Rojo Callejas F., Manual de Qumica Analtica Instrumental II, Anexo III, Facultad de Qumica UNAM,Mxico 2002http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografiahttp://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/manchi/alim/Trabajo5.pdfhttp://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr-14/skoog/26d.htmlCaptulo 223 25. Cromatografa en fase lquida a columna abiertaCaptulo 3Cromatografa en fase lquida a columna abierta3.1 Procedimientos de empaquetamientoEn cromatografa de fase lquida, la fase mvil es un lquido y ste desciende a travs de lacolumna. La fase estacionaria es frecuentemente un lquido que recubre el interior de un tubo capilar ola superficie de partculas slidas empaquetadas dentro de la columna. Alternativamente, las mismaspartculas slidas pueden ser la fase estacionaria (como se muestra en la figura 1, en cualquier caso, elreparto de solutos entre las fases mvil y estacionaria dan lugar a la separacin.Fig 1. Representacin esquemtica de una separacin cromatogrfica. El soluto A, que tiene una mayor afinidadque el soluto B para la fase estacionaria, permanece en la columna ms tiempo.Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llenacon partculas que contienen la fase estacionaria y los materiales ms usados para los tubos de lascolumnas son de acero inoxidable y de vidrio, siendo el primero preferido por la manipulacin ms fcil.Para el caso de la columna de tubo abierto, se trata de un capilar hueco estrecho con la faseestacionaria cubriendo las paredes interiores.En las columnas empaquetadas, el soporte debe ser un slido poroso con gran rea superficial,inerte y con una buena resistencia mecnica. Los compuestos empleados para empaquetamiento varan,entre los cuales podemos encontrar: tierra de diatomeas (ms empleado en CG), alminas, resinas deintercambio inico o compuestos de slice como SiO2 amorfo, sin embargo, ste debe de someterse a untratamiento para hacerlo an ms inerte y que pueda ser empleado sin problemas. Es caracterstico queCaptulo 3Pgina 24 26. Cromatografa en fase lquida a columna abiertael tamao de las partculas y de los poros deben ser lo ms uniforme posible. El procedimiento delempaquetado es muy sencillo y se resume en los dos siguientes pasos:1. Colocacin de la fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento de manera uniforme y compacta en la columna (longitud y dimetro apropiados).2. Verificacin de ausencia de espacios vacos en la columna (para evitar que los picos del cromatograma sean ms anchos y de menor eficiencia.2.2 Aplicacin de la muestra Una vez que la columna se encuentra correctamente empaquetada, se procede a la aplicacin dela disolucin de la muestra. Cuando se introduce en la columna cierta cantidad de muestra, sta sequeda en una zona de cierta altura en la columna. Si entonces se introduce el disolvente, comienza eldesplazamiento de la zona a lo largo de la columna. La parte superior de la zona se disuelve poco a pocoy, empujado por la disolucin que se forma, el frente de la zona avanza hacia la base de la columna. Si eldisolvente utilizado para la elusin es el mismo que la disolucin problema, los platos tericoscomprendidos en la parte central de la zona, reciben una fase mvil en equilibrio con ellos y lasconcentraciones permanecen estacionarias. El movimiento de la zona slo es aparente en sus extremospor lo que su estudio se puede hacer sobre una zona que se supone no tiene ms espesor de un platoterico.2.3 Procedimientos de elucin La diferente capacidad de los distintos disolventes para eluir un determinado soluto esprcticamente independiente de la naturaleza del soluto. Se puede describir la elucin como eldesplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente.Para el caso especfico de cromatografa de adsorcin, existe una ordenacin de los disolventes deacuerdo a su capacidad relativa para desplazar solutos de un determinado adsorbente, llamada serieeluotrpica. La fuerza eluyente es una medida de energa de adsorcin del disolvente, supuesto valorcero para el sistema pentano/slice pura. Cuanto ms polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyenterespecto a la slice en cromatografa de adsorcin.Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente, tanto ms rpidamente se eluirn los solutos de lacolumna.Captulo 3 Pgina 25 27. Cromatografa en fase lquida a columna abiertaLa cromatografa de adsorcin sobre slice pura es un ejemplo de cromatografa de fase normal,que se caracteriza por usar una fase estacionaria polar y un eluyente menos polar. Un disolvente mspolar tiene fuerza eluyente mayor. La cromatografa de fase inversa, que es la ms utilizada, secaracteriza porque la fase estacionaria es no polar o dbilmente polar y el disolvente es ms polar. Undisolvente menos polar tiene mayor fuerza eluyente. La cromatografa de fase inversa elimina las colasde los picos porque la fase estacionaria tiene pocos puntos que adsorban con fuerza a ningn solutooriginando colas. La cromatografa de fase inversa tambin es menos sensible a impurezas polares (comoel agua), que pueda haber en el eluyente.2.4 Elucin isocrtica y gradienteLa elucin isocrtica se lleva a cabo con un nico disolvente (o una mezcla de disolventes fija). Si undisolvente no permite una elucin suficientemente rpida de todos los componentes, se puede usar unaelucin gradiente. En este caso, se van aadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A,produciendo un gradiente contino.Fig 1. Las molculas del disolvente y las molculas del soluto compiten entre s en su reaccin con los puntos activosde la fase estacionaria. Cuanto mayor es la fuerza del eluyente, ms fcilmente se desplaza el soluto.2.5 Cromatografa de absorcin y de particin de columnaEstas son dos tcnicas de anlisis cromatogrfico, la diferencia entre ellas es que la retencin del analitoen la columna depende de la naturaleza de su interaccin con la fase estacionaria.En el dibujo de abajo, observamos las diferentes formas en que interacciona el soluto, nuestro analito,con la fase estacionaria, en la de absorcin, vemos que de pega a la superficie, mientras que en la departicin de columna, el analito se disuelve dentro de la fase estacionaria.Captulo 3Pgina 26 28. Cromatografa en fase lquida a columna abierta2.6 Cromatografa de adsorcinLa absorcin es un fenmeno de superficie, por lo tanto fsico, en el cual diversas sustancias sonatrapadas en la superficie de un material, es decir, se acumulan en una determinada superficieinterfacial, formndose una pelcula del material retenido en la superficie del cuerpo adsorbente, seaslido o lquido, aunque este proceso implica una interaccin de diferentes fuerzas, sean estas fsicas oqumicas, por ello se habla de fisisorcin, cuando la naturaleza de las fuerzas que retienen al material essolo fsica, y quimisorcin, cuando la retencin implica enlaces con el adsorbente. As pues, en lacromatografa de adsorcin, se aprovecha esta propiedad del analito que queremos separar, dado que sies en una mezcla, cada componente de la mezcla se adsorbe con distinta fuerza, lo cual origina que elanalito se retenga en la fase estacionaria, es decir, se adsorba, y los dems componentes se eliminen.Durante la separacin, se filtra una solucin a travs de una columna de adsorbente, que es lafase mvil, esta es adsorbida en la superficie de la fase estacionaria slida, formando una cama departculas que se dividen de modo que el rea de absorcin sea mxima, o sea, se distribuyen a lo largodel slido para atrapar la mayor cantidad posible del analito, estos se llaman sitios de absorcin.El equilibrio entre la fase estacionaria y mvil permite la separacin del analito. Si vemos lailustracin de abajo, los puntos negros representan el analito, y la mancha gris con protuberancias es lafase slida, los huecos en ella son los sitios de absorcin, donde el analito interacciona con la faseestacionaria y se retiene. Como fase estacionaria se han usado muchos materiales, aunquegeneralmente encontramos la Hidroxiapatita (Ca3(PO4)2.Ca(OH)2), alumina (Al2O3) y carbonato demagnesio.Captulo 3 Pgina 27 29. Cromatografa en fase lquida a columna abiertaAplicaciones. Esta es una de las tcnicas cromatogrficas mas antiguas, su uso depende deltipo de compuesto que estemos separando, o sea de su naturaleza qumica, en particular se usa para laseparacin de compuestos isomricos, especies no polares, hidrocarburos alifticos, y para compuestoscon grupos funcionales capaces de formar puentes de hidrgeno fuertes, por ello es utilizada paraseparar azcares, especialmente azucares aminados y glicoproteinas as como oligosacridos, y tambinse ha usado para obtener protenas biliares.2.7 Cromatografa de particin de columnaEsta tcnica se basa en la retencin del analito en una columna slida como granos de fibra ocualquier otro material inerte qumicamente, sobre la cual hay distribuida una capa fina de un disolventeafn al analito; y una fase mvil liquida o gaseosa; cuando la fase mvil pasa a travs de la columna, elequilibrio entre esta y la estacionaria esta mediado por el analito, que se reparte entre ambas y queda alfinal disuelto en la fase estacionaria. En el dibujo de abajo, vemos las flechas, que son el flujo de la fasemvil y que llevan el analito, pasan por la fase estacionaria, los crculos, alrededor de los cuales hay unacapa donde se quedan retenidos los analitos, esta capa es de un material que interacciona con el analito,donde este se disuelve.Las molculas del analito se equilibran entre la fase estacionaria y la mvil, a esto se le llamaparticin puesto que se distribuyen, o sea se reparten dependiendo de la fisicoqumica del sistema, entrelas dos fases. La retencin depende de la solubilidad del analito con la capa de sorbente adherida a lamatriz slida, y de que tanto la fase mvil pueda arrastrarlo al fluir, en el dibujo de abajo, vemos como elanalito, los puntos negros, se quedan disueltos en la superficie de la fase estacionaria, dentro de la capaCaptulo 3Pgina 28 30. Cromatografa en fase lquida a columna abiertade solvente adherida a la matriz slida, y como vemos tambin, el analito se distribuye entre la capa desolvente de la fase estacionaria y otra entre la fase estacionaria, a esto se le llama reparto, y como estasobre una columna, por ello se le llaman particin de columna.La solubilidad en ambas fases esta dada por el coeficiente de particin, KD: = Eso se debe a que el analito tiene diferentes afinidades para las dos diferentes fases, o sea tienediferentes preferencias por estar en una u otra fase, de esta forma, la separacin del analito de la mezclase logra por migracin diferencial de este, y dada la afinidad que tiene el analito pro el disolvente de lacolumna, el reparto en esta ser mayor que en la fase mvil.Aplicaciones.Esta tcnica se usa para separa sustancias en la misma fase, o lquidosinmiscibles.2.8 Cromatografa en gel.La separacin basada en el tamizado molecular se puede llevar a cabo en sustancias sin cargadurante una migracin osmtica a travs de geles. La filtracin en gel es el mtodo de separacin queconsiste en la separacin de molculas basado en el tamao relativo de las mismas.En la cromatografa en gel, la fase estacionaria es una matriz porosa polimrica cuyos poros sellenan con el solvente que se usar en la fase mvil.El flujo de la fase mvil provocar que molculas mayores pasen a travs de la columnalibremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partculas ms pequeas tardarn ms tiempo ensalir dependiendo de la penetracin que tengan sobre el gel. Los componentes de una mezcla emergende la columna de acuerdo a masa molecular relativa.Captulo 3Pgina 29 31. Cromatografa en fase lquida a columna abiertaEl volumen total de la columna, Vt es la suma del volumen del lquido afuera de la matriz de gel(V0, volumen de la fase mvil que eludir a una molcula completamente excluida ), el volumen dellquido dentro de la matriz (Vi) y el volumen de la matriz de gel (Vm).El volumen de elusin (Ve) se puede relacionar con V0 y Vi: Ve V0 K d ViKd es el coeficiente de distribucin volumtrica: K d (Ve V 0) / ViKd caracteriza el comportamiento de retencin del soluto. Representa la fraccin del volumen del gelque es accesible a la molcula en cuestin. Si Kd se grafica contra el logaritmo del peso molecular se unaserie de solutos similares en forma y densidad molecular, se obtiene:En un rango pequeo de Kd, el rango de fraccionamiento, la curva se aproxima a una lnea recta: K d A B log MLa separacin por cromatografa en gel est influenciada por las propiedades de los poros de lared tridimensional, y la naturaleza del material que forma el poro. Se distinguen dos tipos de materialpara el gel: xerogeles y aerogeles. Los xerogeles son geles simples; consisten en polmerosentrecruzados que se engrosan en contacto con el solvente para formar un medio porosos relativamentesuave. Los aerogeles son slidos porosos que son penetrados por el disolvente; algunos ejemplos es elvidrio y silica porosos. El nombre de los geles ms comnmente utilizados: Sephadex, Strygel, BiogelCaptulo 3 Pgina 30 32. Cromatografa en fase lquida a columna abiertaAplicaciones. Desalinizacin: Largas molculas de origen biolgico son separadas de especiesionizables o inorgnicas. Un ejemplo en la separacin de la hemoglobina y NaCl en un gel Sephadex.La cromatografa en gel se utiliza para separar protenas, pptidos, cidos nuclicos,polisacridos, enzimas, hormonas y los qumicos en polmeros, para determinar distribuciones de pesosmoleculares en mezclas de polmeros.2.9 Cromatografa de intercambio inico.El intercambio inico es un proceso donde una solucin de un electrolito se pone en contactocon una resina de intercambio inico y los iones activos de la resina son remplazados por las especiesinicas de carga similar del analito. Ocurre un intercambio de iones de signo igual entre una solucin yun slido esencialmente insoluble en contacto con la solucin.Las resinas cambiadoras de iones estn constituidas por una red tridimensional de cadenaspolmeras entrelazadas con cadenas cortas que tienen grupos funcionales ionizables. Se tiene una faseinsoluble con sitios inicos fijos de una sola carga, muestra que las especies de carga contraria semueven libremente a su alrededor se pueden sustituir por otros iones de la misma carga, a condicin deque se mantenga la electroneutralidad. Una resina tpica se prepara por polimerizacin de estireno ydivinilbenceno.Cambiadores catinicos. Los grupos funcionales cidos se pueden introducir fcilmente, tienen elprotn disociado, pero no libres para abandonar la resina, excepto cuando se sustituyen por otros ionespositivos.Cambiadores aninicos. Si se introducen grupos funcionales bsicos, la resina intercambia aniones. Loscambiadores aninicos se preparan con aminas, obtenindose in grupo amonio, y por tanto, un mediobsico.Las propiedades ms importantes que determinan el funcionamiento de una resina:o Tamao de las partculas velocidad de intercambio y permeabilidad de la columna.o Naturaleza de los grupos funcionales tipo de los iones intercambiables.o Fuerza de los grupos funcionales coeficiente de distribucin.o Nmero de grupos funcionales capacidad de la resina.Captulo 3Pgina 31 33. Cromatografa en fase lquida a columna abiertaA partir de la sustitucin de cantidades equimolares de iones de cargas iguales, se obtienenequilibrios de intercambio. Se aplica la ley de accin de masa, donde K(coeficiente de selectividad), es laconstante de equilibrio del sistema. Y donde el coeficiente de distribucin KD: K [ HR]KD [H ]Efecto del pH del eluyente. La carga elctrica de una especie se puede aumentar, disminuir o invertirpor cambio del pH. Disponemos de un medio para influir sobre la relacin de distribucin o evitar unintercambio total. El efecto del pH sobre la elusin:Efecto de agentes complejantes. Los aniones complejan muchos iones metlicos dando iones complejosde carga negativa. En esta forma, los cationes metlicos que se separen mal en cambiadores catinicos,se pueden complejar y separar en cambiadores aninicos.Aplicaciones. Eliminacin de iones. Un agua completamente desionizada se obtiene pasndola atravs de un cambiador de cationes, y despus a travs de un cambiador de aniones.Separacin de aminocidos. La naturaleza anftera de este grupo permite cambiar el signo de su carga oeliminar la carga neta, de modo que un cido determinado se puede intercambiar en una resinaaninica, en una resina catinica o en ninguna de las dos, mediante control de pH de la solucin.2.10 Cromatografa covalenteEs un sistema especial de cromatografa, el cual es altamente selectiva la fase estacionaria, en el que seforma un enlace covalente reversible entre la fase estacionaria y la biomolcula a separar, lasseparaciones se basan en el acoplamiento llave-cerradura tpico de la biologa molecular; por lo cual esmuy utilizado en esta rea, adems de tener un pequeo inconveniente de que al ser tan selectiva, solose puede separar un solo analito.Captulo 3Pgina 32 34. Cromatografa en fase lquida a columna abierta2.11 Conformacin de la cromatografa covalentea) Ligandos: Se trata de biomolculas que se encuentran en una base slida, siendo estas lasresponsables de la adsorcin especfica de los solutos-analitos. Los ligandos se pueden clasificar de 2maneras: Ligandos especficos, como los anticuerpos, que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, ylos ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioqumicos, como laslectinas y nucletidos.b) Soportes: Es la superficie en donde se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad Debeposeer propiedades como tener una gran superficie, porosidad controlable, carcter suficientementehidroflico para evitar adsorciones no especficas de protenas u otras molculas, estabilidad mecnica,en especial para trabajar a alta presin, estos soportes generalmente geles orgnicos derivados de lospolisacridos como la agarosa (sepharosa), polmeros de acrilamida, fractogel TSK y slices CPG.2.12 Fundamento de la cromatografa de afinidadUn volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biolgica se introduce en lacolumna que contienen un soporte polimrico inerte que retienen a la sustancia activa enlazadocovalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Slo existe interaccin especfica entre esteligando y un soluto-analito (protena) de la muestra insertada que queda retenido. Se procede a laelusin de los dems componentes de la muestra mediante una primera fase mvil que no influye en elacoplamiento. A continuacin se introduce una nueva fase mvil que desactiva el acoplamiento poralteracin reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando, del soluto (protena) o de ambos;generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las caractersticas de los sitios activos de estamanera se eluye el soluto de inters. Una vez finalizada la separacin, se procede a la regeneracin de lacolumna, lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase mvil siendo una etaparpida.Captulo 3 Pgina 33 35. Cromatografa en fase lquida a columna abierta2.13 Cromatografa FlashEs un mtodo cromatogrfico, el cual nos permite separar de una manera rpida, fiable y econmica;principalmente utilizada para la separacin y purificacin de protenas.La Cromatografa Flash consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presin para laseparacin puede llevarse a cabo con relativa rapidez.El sistema incluye dos bombas de flujo continuo en la depuracin de las columnas (variables por elusuario), una bomba peristltica puede utilizarse para deposito en la columna, seguido de la radiacinultravioleta para detectar las biomolculas en la columna, un mezclador para producir un gradiente deelusin, las vlvulas de motor puede ser utilizados para ayudar en la inyeccin de la muestra, la seleccinde la columna o corriente de inversin, y un controlador con una funcin de integracincomputadorizada, en el cual se muestran los resultados de el anlisis.Aplicaciones. En farmacia la cromatografa lquida rpida de protenas (FPLC) se utiliza para ladepuracin de grandes cantidades de diferentes biomolculas (es decir, las protenas y el ADN).2.14 ResumenLas columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena conpartculas que contienen la fase estacionaria y la columna de tubo abierto, es un capilar hueco estrechocon la fase estacionaria cubriendo las paredes interiores. El procedimiento del empaquetado consta dedos sencillos pasos: a) colocacin de fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento, y b)Verificacin de compactacin (no espacios vacos).El desplazamiento de la muestra a travs de la columna, depende de la afinidad por sta y del disolventeempleado para el proceso.Captulo 3Pgina 34 36. Cromatografa en fase lquida a columna abiertaLa elucin es el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente. Existen dos tiposde elusiones: Elusin por gradiente (cambio continuo de la composicin del eluyente en sentido deaumento de fuerza eluyente) y elusin isocrtica (un solo disolvente).Cromatografa de adsorcin: esta tcnica aprovecha el fenmeno de la absorcin de sustancias en unasuperficie para separar analitos de mezclas al hacerlos pasar por una columna con un materialadsorbente, que retiene el analito cuando este pasa a travs de su superficie.Cromatografa de particin de columna: sta tcnica permite separar analitos al hacerlos pasar por unacolumna sobre la cual hay una capa fina de un disolvente qumicamente similar al analito, en el que estequeda disuelto y retenido cuando pasa la fase mvil, se separa cuando se da un reparto entre las fases,en el que se espera que la mayor parte se quede en el disolvente de la columna.Cromatografa en gel: consiste en la filtracin en gel que consiste en la separacin de molculas basadoen el tamao relativo de las mismas. El flujo de la fase mvil del sistema provocar que molculasmayores pasen a travs de la columna libremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partculasms pequeas tardarn ms tiempo en salir dependiendo de la penetracin que tengan sobre el mismo.Los componentes de una mezcla emergen de la columna de acuerdo a masa molecular relativa.Cromatografa de intercambio inico: el intercambio inico es un proceso donde una solucin de unelectrolito se pone en contacto con una resina de intercambio inico y los iones activos de la resina sonremplazados por las especies inicas de carga similar del analito. Se tiene una fase insoluble con sitiosinicos fijos de una sola carga, muestra que las especies de carga contraria se mueven libremente a sualrededor se pueden sustituir por otros iones de la misma carga.Cromatografa covalente: las separaciones se basan en el acoplamiento llave-cerradura tpico de labiologa molecular; por lo cual es muy utilizado en esta rea, adems de tener un pequeoinconveniente de que al ser tan selectiva, solo se puede separar un solo analito. Permite la separacin deanticuerpos y enzimas.Cromatografa Flash: consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presin para laseparacin puede llevarse a cabo con relativa rapidez. Es una tcnica muy utilizada en el rea debioqumica ya que nos permite separar biomolculas y protenas.Captulo 3 Pgina 35 37. Cromatografa en fase lquida a columna abierta2.15 BibliografaBERMEJO, F. - Qumica Analtica General, Cuantitativa e Instrumental - Vol 1. - Ed. Paraninfo 7maedicin, Madrid 1991.HARRIS, D. - Anlisis Qumico Cuantitativo - Ed. Revert - 2 edicin - Espaa, 2001.SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH - Qumica Analtica - 7 ed - McGraw Hill Mxico, 2001.ROUESSAC - Mtodos y tcnicas instrumentales modernas. Anlisis Qumico - McGraw Hill USA, 2003.SHARON, N. - Complex Carbohydrates: their chemistry, Biosntesis and Functions - Addison-Wesley - NewYork, 1975.PECSOK, Robert Mtodos Modernos de Anlisis Qumico Editorial Limusa Mxico, 1981.BRAITHWAITE, SMITH Chromatografic Methods 4 edicin - Chapman & Hall UK, 1994.http://www.srigc.com/2003catalog/cat-86.htmhttp://holivo.pharmacy.uiowa.edu/separation/chromatography.pdfhttp://www.che.utexas.edu/cache/newsletters/spring2001_chemmicro.pdfhttp://www.resonancepub.com/chromtutorial.htmwww.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/www.um.es/bbmbi/AyudasDocenteswww.um.es/bbmbi/AyudasDocenteswww.gmi-inc.com/Products/PharmaciaFPLC.htmCaptulo 3 Pgina 36 38. Cromatografa de gasesCaptulo 4Cromatografa de gasesEsta tcnica permite el anlisis rpido y exacto de gases, vapores lquidos; permite identificar loscomponentes individuales de las mezclas gaseosas. Iniciada a finales de 1952, se ha desarrolladonotablemente en separacin, identificacin y determinacin de compuestos voltiles (gases y lquidos)de puntos de ebullicin de hasta 350-400C. El mtodo tiene las ventajas de ser sensible, rpido ysencillo, y si se maneja con suficiente cuidado, suministra informacin cuantitativa exacta con cantidadesmuy pequeas de muestra.En cromatografa de gases (GC) la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columnacromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de un fase mvil de un gas inerte a diferencia de losotros tipo de cromatografa, la fase mvil no interaccionan con la molculas del analito; su nica funcines la de transportar el analito a travs de la columna.Existen dos tipos de cromatografa de gases:lacromatografa Gas-Slido (GCS) y la cromatografa gas liquido (GLC).La cromatografa gas liquido tienegran aplicacin en todos los campos de la ciencia y su denominacin se abrevia normalmente comocromatografa de gases (GC).En la cromatografa gas slido se produce la retencin de los analitos de una fase estacionariacomo consecuencia de la absorcin fsica. La cromatografa gas slido ha tenido una aplicacin limitadadebido a la retencin semipermanente de las molculas activas o polares y a la obtencin de picos deelusin con colas muy significativas (como consecuencia del carcter no lineal del proceso de absorcin),de modo que esta tcnica no ha encontrado una gran aplicacin excepto para la separacin de ciertasespecies gaseosas de bajo peso molecular. La cromatografa gas lquido se basa en la distribucin delanalito entre una fase mvil gaseosa y una fase lquido inmovilizada sobre la superficie de un slidoinerte.4.1 InstrumentacinLos componentes bsicos de un instrumento para la cromatografa de gases se muestran acontinuacin, el caudal de gas se divide antes de entrar en la columna, este tipo de disposicin se utilizacuando el detector empleado mide un cambio en las propiedades de la corriente de gas por lapresencia de las molculas de analito.Captulo 4 37 39. Cromatografa de gases Gas portador. Entre los gases portadoresdeben ser qumicamente inertes, se encuentran elhelio, nitrgeno y el hidrogeno, con el suministro de gas se encuentran asociados los reguladores depresin, manmetros y medidores de caudal. Adems el sistema de gas portador contiene a menudo untamiz molecular para eliminar el agua u otras impurezas. Los caudales se controlan normalmentemediante un regulador de presin de dos niveles colocando en el cilindro de gas, y algn tipo deregulador de presin o regulador de flujo instalado en el cromatgrafo. Sistema de inyeccin de muestra.La eficacia de la columna requiere que la muestrasea de un tamao adecuado y que sea introducida como un de vapor, la inyeccin lenta de lamuestras demasiado grandes provoca un ensanchamiento de la bandas y una pobre resolucin .Elmtodo mas comn de inyeccin de muestra implica el uso de una micro jeringa para inyectar unamuestra liquida o gaseosa a travs de un diafragma o de goma de silicona en una cmara devaporizacin instantnea situada en la cabeza de la columna (la cmara demuestra normalmente estaunos 50C por encima del punto de ebullicin del componente menos voltil de la muestra. Configuracin de la columna y del horno para la columna. En cromatografa degases se usan dos tipos generales de columnas, las rellenas, y las abiertas o capilares. Hasta la fecha lamayor parte de las cromatografa de gases se ha realizado con columnas rellenas. Sin embargo, en laactualidad esta situacin est cambiando rpidamente y parece probable que en un futuro prximo,Captulo 4 38 40. Cromatografa de gasesexcepto para ciertas aplicaciones especiales, las columnas de relleno sean sustituidas por columnasabiertas ms eficaces y rpidas. Las columnas cromatogrficas varan desde menos de 2 hasta 50m delongitud o ms. Estn construidas con acero inoxidable, vidrio, slice fundida o tefln.La temperatura de la columna es una variable importante para que un trabajo preciso ha deregularse a las dcimas de grado, por ello la columna normalmente se introduce dentro de un horno detemperatura controlada , la temperatura optima de la columna depende del punto de ebullicin de lamuestra y del grado de separacin requerida.Sistemas de deteccin. El detector ideal para cromatografa de gases tiene las siguientescaractersticas.1.- adecuada sensibilidad2.- buena estabilidad y reproducibilidad3.-respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios rdenes de magnitud4.-intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos400C5.-tiempos de respuesta cortos que sean independientes del caudal6.-alta fiabilidad y manejo sencillo7.-respuesta semejante para todos los soluto s o por el contrario una respuesta selectiva y altamentepredecible para uno o ms tipos de soluto8.-no destructivo de la muestra.Resolucin (Rs). Existe una magnitud que expresa el poder de resolucin de la columna yque se denomina resolucin de la columna y se define:2 2 1 = 1 + 2Si se toma W como el ancho medio de los picos, la ecuacin queda:2 2 1 = Para los picos que estn prximos entre s Wb1 y Wb2 sern lo suficientemente parecidos comopara que baste medir slo uno.Captulo 439 41. Cromatografa de gasesComo lo muestra la figura, la resolucin 1.5 nos da una separacin prcticamente completa delos solutos, mientras que una resolucin de 0.75 no lo hace. A una resolucin de 1, la zona X contienecasi 4% de Y y viceversa, a una resolucin de 1.5 la superposicin es de aproximadamente 0.3%. Para elmismo tipo de empaque, la resolucin puede mejorarse alargando la columna y por lo tantoaumentando el nmero de platos tericos.Tipos de Columnas. Existen dos tipos de columnas, principalmente, de relleno y capilares osemicapilares. Contiene la fase estacionaria y en ella tiene lugar la separacin cromatogrficaLas columnas de relleno suelen ser de cobre, acero inoxidable, aluminio, vidrio y tefln; con undimetro interior entre 2 y 4 mm y una longitud entre 2 y 3 m. La eficacia est en torno a 1.000-2.000(platos tericos/m). Suelen emplearse para muestras poco complejas, mximo 10 componentes. Lacolumna est rellena de un material slido (soporte), finamente dividido y homogneo; recubierto, poruna capa de 0,05-1 m de espesor, de fase estacionaria lquida. Est configurada en forma helicoidal, conun dimetro de unos 15 cm, para poder ser instalada en el horno termostatizadoFase estacionaria. Eleccin de la fase estacionaria de una columna cromatogrfica ha de reuniruna serie de requisitos como: o Baja volatilidad, su punto de ebullicin debe de ser por lo menos 100 C superior a latemperatura mxima de operacin de la columna. Estabilidad trmica.Captulo 440 42. Cromatografa de gases Inercia qumica. Los valores del factor de capacidad (k) y del factor de selectividad () de los analitos deben estardentro de los intervalos aconsejados.La separacin en cromatografa gas-lquido se debe a los diferentes coeficientes de reparto delanalito entre la fase mvil y la fase estacionaria y tiene que haber un cierto grado de solubilidad de loscompuestos con la fase estacionaria. Por ello, una caracterstica muy importante de la fase estacionariaes la polaridad. Siguiendo el principio de "semejantes disuelven a semejantes" los solutos se retienenms en las fases lquidas de polaridad parecida, lo que permiten obtener mejores separaciones.Las fases estacionarias compuestas de hidrocarburos y de dialquilsiloxanos son poco polares, lascompuestas por polister son muy polares. En cuanto a posibles compuestos objeto de separacin, losalcoholes, cidos y aminas son polares; los steres cetonas y aldehidos tienen polaridas intermedia; yson de baja polaridad los hidrocarburos saturados.Otro factor a tener en cuenta son los lmites de temperatura que puede soportar la faseestacionaria, el lmite inferior ser el punto de fusin o temperatura a la que la viscosidad de la faselquida es muy elevada, lo que hara disminuir la eficacia. El lmite superior es la temperatura a la que la opresin de vapor de esta fase sea 0,1 mm Hg (250 C inferior al punto de ebullicin) por encima de estatemperatura se produce arrastre de la fase lquida, lo que lleva consigo efectos en el detector (ruido,suciedad), interferencias con los solutos y en suma, deterioro de la columna.En una fase lquida cualquiera, una serie homloga se eluye segn orden creciente de nmero detomos de carbono. Si la fase es no polar, los solutos no polares eluyen segn orden creciente de puntode ebullicin. En una fase polar se retendrn ms los solutos polares que los no polares a igualdad depuntos de ebullicin.Otro aspecto a desarrollar, relacionado con la fase estacionaria, es el soporte slido empleado en lascolumnas de relleno; el objetivo es el de proporcionar una superficie elevada donde depositar la faselquida en forma de pelcula muy fina para proporcionar una mayor superficie de contacto entre fasemvil y fase estacionaria.2Las caractersticas de los soportes slidos son, una elevada superficie especfica (1m /g); unasuperficie homognea; estabilidad trmica; geometra adecuada; baja dispersin de tamao de laspartculas, entre 150-250 m; dureza mecnica; inercia qumica y naturaleza porosa.Captulo 4 41 43. Cromatografa de gasesLos soporte, ms generalizados, son los de silceo como las tierras de diatomeas o sintticos; devidrio y de polifluorocarbonados (tefln). Los soportes de diatomeas estn constituidos por residuos dealgas unicelulares diatomceas que se unen formando filamentos.Hay unas 10.000 especies de diatomeas con esqueletos diferentes, pero parecida estructura. Tienen 2una superficie especfica de 1 m /g. El constituyente mayoritario es de anhdrido silcico SiO (90%), 2 otratado con un fundente alcalino a 1.600 C se obtiene el producto comercial conocido como ChromosorbW de superficie poco adsorbente por lo que es muy til para separar compuestos polares.Otro soporte es el de polvo de ladrillo refractario conocido como Chromosorb P, C-22 y Sterchomel,tiene mayor resistencia mecnica y superficie especfica que el anterior, pero es muy activo y no sepuede utilizar con compuestos polares.Los soportes de silicatos en columnas de relleno y en las paredes interiores de slice fundida, en lascolumnas capilares, provocan adsorciones no deseadas de analitos polares, lo que da como resultadopicos cromatogrficos distorsionados.Se ha demostrado que este fenmeno se debe a los grupos silanol (-SiOH) que se forman en lasuperficie de los silicatos debido a la humedad. El silanol tiene gran afinidas por las molculas orgnicaspolares. Este proceso puede desactivarse por sililacin con dimetilclorosilano , Cl Si(CH ) , que elimina el 2 3 2H del silanol formando ClH. Columnas capilares. Las columnas capilares son de dos tipos bsicos: WCOT, de pared recubierta y SCOT, de soporte recubierto. Las WCOT son simplemente tubos capilares donde la pared interna se ha recubierto con una finsima capa de fase estacionaria. Las columnas SCOT tienen en su parte interna una fina capa de material adsorbente como el empleado en las columnas de relleno donde se ha adherido la fase estacionaria. Las ventajas de las SCOT frente alas WCOT es la mayor capacidad de carga de esta ltima, ya que en su fabricacin se emplean mayorescantidades de fase estacionaria, al ser la superficie de intercambio mayor. Por orden de eficacia, enprimer lugar estn las WCOT, luego las SCOT y por ltimo las columnas de relleno.Las columnas WCOT se fabrican a partir de slice fundida, conocidas como columnas tubularesabiertas de slice fundida o FSOT. Estas columnas se fabrican a partir de slice especialmente pura, sinCaptulo 4 42 44. Cromatografa de gasesapenas contenido de xidos metlicos. Debido a la fragilidad inherente a este material, en el mismoproceso de obtencin del tubo se recubre con una capa de poliamida, de esta forma la columna puedeenrollarse con un dimetro de unos pocos centmetros, ya que la longitud de estas columnas es varia de2 a 50 metros, por lo que se tiene la necesidad de enrollarlas en una forma helicoidal con dimetros de10 a 30 cm, dependiendo del tamao del horno.. Estas columnas, con propiedades como bajareactividad, resistencia fsica y flexibilidad, han sustituido a las WCOT clsicas.Las columnas FSOT tienen dimetros internos variables, entre 250 y 320 m y 150-200 m paracolumnas de alta resolucin. Estas ltimas requieren menor cantidad de analito y un detector mssensible, al eluir menor cantidad de gas. Existen asimismo columnas macrocapilares con dimetros dehasta 530 m, que admiten cantidades de analito comparables a las de relleno pero con mejoresprestaciones.En estas columnas existe un problema debido a la adsorcin del analito sobre la superficie de laslice fundida, adsorcin debida a la presencia de grupos silanol, los cuales interaccionan fuertementecon molculas polares orgnicas. Este inconveniente se suele solventar inactivando la superficie porsililacin con DMCS. La adsorcin debida a los xidos metlicos se ve paliada en gran parte por la elevadapureza de la slice empleada.4.2 Cromatografa gas-slidoEn la cromatografa gas-slido se produce la retencin de los analitos en una fase estacionariaslida como consecuencia de la absorcin fsica.La cromatografa gas-slido ha tenido una aplicacin limitada debido a la retencinsemipermanente de las molculas activas o polares y a la obtencin de picos de elusin con colas muysignificativas (como consecuencia del carcter no lineal del proceso de adsorcion), de modo que estatcnica no ha encontrado una gran aplicacin excepto para la separacin de ciertas especies gaseosas debajo peso molecular.La cromatografa gas-slido se basa en la adsorcion de sustancias gaseosas sobre superficiesslidas. Los coeficientes de distribucin son generalmente mucho mayores que en el caso de lacromatografa gas-liquido. En consecuencia la cromatografa gas-slido es til para la separacin deespecies que no se retienen en columnas de gas-liquido, tales como los componentes del aire, sulfuro dehidrogeno, disulfuro de carbono, xidos de nitrgeno, monxido de carbono, dixido de carbono y gasesnobles.Captulo 4 43 45. Cromatografa de gases La cromatografa gas-slido se lleva a cabo tanto en columnas de relleno como en columnasabiertas. En estas ltimas, se fija en las paredes del capilar una delgada capa del adsorbente; estascolumnas a veces se denominan columnas abiertas de pared porosa, o columnas PLOT. Se encuentrasdos tipos de adsorbente: los tamices moleculares y los polmeros porosos.4.3 Tamices moleculares. Los tamices moleculares son intercambiadores de iones de silicato de aluminio, cuyo tamao deporo depende del tipo de catin presente. Los preparados comerciales de esos materiales estndisponibles en tamaos de partcula de 40/60 mesh a 100/120 mesh. Los tamices se clasifican segn eldimetro mximo de las molculas que pueden penetrar en los poros. Los tamices molecularescomerciales ser encuentran con tamaos de poro de 4, 5, 10 y 13 amstrongs. Las molculas mspequeas que las dimensiones anteriores penetran en el interior de las partculas donde tiene lugar laadsorcion, para estas molculas el rea de la superficie disponible es enorme cuando se compara con elrea disponible para las molculas ms grandes. Por ello, los tamices moleculares se pueden utilizar paraseparar las molculas pequeas de las grandes. Por ejemplo, un relleno de 5 amstrongs y 183 cm de largo, a temperatura ambiente, separarfcilmente una mezcla de helio, oxigeno, nitrgeno, metano y monxido de carbono en ese orden. En laprimer figura de la siguiente hoja se muestra un tpico cromatograma obtenido con tamices moleculares.En esta aplicacin se utilizan dos columnas de relleno: una es una columna de gas-liquido ordinaria y laotra es una columna de tamices moleculares. La primera retiene solamente el dixido de carbono y dejapasar los restantes gases a una velocidad que corresponde a la velocidad del portador. Cuando el dixidode carbono eluye de la primera columna, un conmutador desva el flujo de la segunda columna paraevitar la adsorcion permanente del dixido de carbono en los tamices moleculares. Una vez que la sealde dixido de carbono ha vuelto a cero el flujo se reconduce a traves de la segunda columna, y de estemodo se produce la separacin y elusin del resto de los componentes de la muestra.4.4 Polmeros porosos: Las bolitas de los polmeros porosos de tamao uniforme se fabrican a partir de estirenopolimerizado con divinilbenceno. El tamao de poro en estas bolitas es uniforme y se controla por elgrado de polimerizacin. Los polmeros porosos han encontrado una gran aplicacin en la separacin deespecies polares gaseosas tales como sulfuro de hidrogeno, xidos de nitrgeno, agua, dixido decarbono, metanol y cloruro de vinilo.Captulo 444 46. Cromatografa de gasesEn la segunda figura de la siguiente hoja se muestra una aplicacin caracterstica de una columnaabierta revestida con un polmero poroso (columna PLOT).4.4 Aplicaciones.Se sabe que los cidos grasos trans incrementan el colesterol LDL y disminuyen el colesterol HDLen sangre. Consecuentemente una ingesta excesiva de cidos grasos trans aumenta el riesgo deenfermedad cardiovascular. La aumentada preocupacin por los cidos grasos trans requiere demtodos precisos y convenientes para el anlisis de productos comerciales.Los mtodos analticos disponibles actualmente incluyen: cromatografa degases,espectroscopia de infrarrojo, y cromatografa de gases de capa fina (AgNO3- TLC- GC, por sus siglas eningls). Dentro de estos mtodos la cromatografa de gases se ha usado preferencialmente dado suconveniencia y su sensibilidad. Bis cianopropil polisiloxano o bis cianopropilsiloxano polisilfenileno sonlas fases estacionarias comnmente usadas en el anlisis de cidos grasos trans en correspondencia a lanecesidad por una alta resolucin entre los picos de los metil- esteres de los cidos grasos (FAME).Existen varios mtodos analticos oficiales utilizando estas fases estacionarias tales como losmtodos del AOAC (Asociacin Oficial de Qumicos Agricultores) y AOCS (Asociacin Americana deQumicos y Aceites) (por sus siglas en ingls).A pesar de que el mtodo de AOCS es muy preciso tiene varias desventajas, tales como: untiempo de anlisis mayor debido a la longitud de la columna (100 m), la dificultad en la identificacin delos picos debido a su fase estacionaria de bis cianopropil polisiloxano y los grandes costos econmicosdebidos a el uso de un estndar caro.Por lo tanto debe buscarse un mtodo ms conveniente de GC, particularmente para elpropsito de control de calidad.Captulo 445 47. Cromatografa de gases 1Mtodo 1Mtodo 2Mtodo 3TMTM ColumnaTC- 70 (GL- Science)SP-2560(Supelco Inc.) Fase estacionariabis cianopropilsiloxano polisilfenileno bis cianopropil polisiloxano Longitud 30m 60m 100m Dimetro interno 0.25mm0.25mm Grosor de pelcula 0.25m0.20m2 Temperatura190C 180C Inj/Det250C/260C 250C/250C Gas acarreador 1 ml/min Helio1 ml/min Helio Split100:1 100:13 Volumen inyectado1l 1l Tiempo de corrida18min 40 min74minTabla 1. Ejemplo del trabajo hecho porShirasawa y colaboradores para encontrar un mejor mtodo dedeterminacin de cidos grasos trans1) Prueba control: AOCS celh-052) 180C (60 min)- (10C/min)- 220C (10 min)3) 1% del aceite en hexano. Por otro lado, derivados de las anfetaminas tales como: 3,4-metilendioxi(MDA), 3,4 -metilendioxietilanfetamina (MDEA) y 3,4- metilendioximetilanfetamina (MDMA) constituyen un grupode estimulantes del sistema nervioso que producen efectos cardiovasculares y del comportamiento bienidentificados. El abuso de estas drogas es especialmente problemtico entre la poblacin joven y a pesarde que las intoxicaciones agudas han sido ampliamente documentadas el potencial de toxicidad porlapsos mayores de tiempo para el sistema nervioso es el tema de muchas controversias. MDMA seexcreta en la orina generalmente sin cambio alguno junto con otros derivados de las anfetaminas comoHHMA, HHA, HMMA y HMA. La cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas es la tcnica instrumental mscomnmente empleada en el anlisis de anfetaminas y sus derivados. La derivatizacin es requerida paramejorar la cromatografa, en cuanto a la sensibilidad y reproducibilidad de aminas primarias ysecundarias.Captulo 446 48. Cromatografa de gasesTabla 2. Ejemplo del trabajo de Pirnay y colaboradores en la cuantificacin de derivados de anfetaminas en orinapor GC-MS4.5 ResumenLa cromatografa de gases constituye un poderoso instrumento en la determinacin de loscomponentes de una muestra, al permitir tanto la separacin de stos como su deteccin individual. Unagran ventaja de este mtodo es la rapidez y su lmite de deteccin, un requisito indispensable para elanlisis es que la muestra debe ser voltil.Dependiendo de la fase estacionaria utilizada la cromatografa de gas se subdivide en: gas-lquido y gas slido.En el caso de la cromatografa de lquidos, los parmetros dependen del poder del eluyente (lapolaridad de este); para la cromatografa de gases, los parmetros dependen de la temperatura a la cualse est trabajando y del flujo del gas de arrastre.Las partes esenciales de un equipo de cromatografa son: fuente de gas portador, sistema deregulacin de caudales, bloque termostatado de inyeccin de las muestras, columna termostatada,detector termostatado, con amplificador de seal y registro grfico y caudalmetro de precisin.4.6 Bibliografa http://www.upct.es/~sait/_sit/html/recursos_masas_y_gases.htm http://instrumental.uprh.edu BERMEJO, Francisco. BERMEJO, Pilar. BERMEJO, Adela. Qumica Analtica generla, cuantitativa einstrumental. Vol. 2. 6ta. Edicin. Ed. Paraninfo. Madrid 1991. SKOOG, Douglas A. y Leary, James J. (1994),