128 Fresenius Z. Anal. Chem., Band 290 (1978)

3. Die selektive Hydrolyse yon Lipiden in intakten VLDL ftihrt zu unterschiedlichen Ergebnissen. Die Abspaltung von Fetts~iuren aus Phospholipiden verursacht eine starke Hem- mung der Immunkomplexbildung. Die Abspaltung von Neu- ramins/iure und von basischen Anteilen in Phospholipiden beschleunigt die Reaktion. Die Hydrolyse yon Triglyceriden, vor allem aber die Spaltung von Cholesterinestern ftihrt zu einer betr~ichtlichen Trfibungsminderung.

4. Unter standardisierten Arbeitsbedingungen betr/igt die Korrelation zwischen der nephelometrischen Bestimmung yon Apo B und der Quantifizierung mit Hilfe der radialen Immundiffusion 8 0 - 9 6 % (n: 200 Seren mit Grenzwerten ffir Triglyceride yon 40 mg/100 ml und 4000 mg/100 mi und ffir Cholesterin von 40 mg/100 ml und 1400 mg/100 ml). Erwar- tungsgem/iB ist die Korrelation bei Seren mit Normolip/imie am h6chsten und nimmt mit zunehmenden Triglyceridkon- zentrationen ab.

5. Der Variationskoeffizient der nephelometrischen Be- stimmung liegt je nach AusmaB der Lipidfimie des Serums zwischen 4 % (bei Normolip/imie) und 8 % (bei Typ V Hyper- lipoproteingmie) (n: 20 Messungen in der Serie). Die Prfizi- sion von Tag zu Tag liegt mit einem Vk von 5% (TypIIa Serum) fiber einen Zeitraum yon 13 Tagen.

Das unterschiedliche Verhalten isolierter Lipoproteine bei der Immunreaktion mit Anti-Apo B weist auf typische Unter- schiede der Oberflgchenstruktur in den einzelnen Lipopro- teinklassen hin. Die Ergebnisse des methodischen Vergleichs

der Bestimmung von Apo-B lassen die Folgerung zu, dab die quantitative Trfibungsmessung yon Apo-B bei einem gerin- gen Arbeitsaufwand zu fihnlichen Aussagen ftihrt, wie sic mit Hilfe einer herk6mmlichen Untersuchungsmethode erreicht werden kann.

Literatur

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Quantitative Immunologic Determination of Mammalian and Human Phosphofructokinase

H. W. Hofer and M. Ffirst

Fachbereich Biologie, Universitiit Konstanz, Postfach 7733, 7750 Konstanz

Quantitative immunologische Bestimmung von tierischer- und menschlicher Phosphofructokinase

Key words: Best. von Phosphofructokinase; Immunologische Analyse

Two methods are presented for the quantitative determi- nation of phosphofructokinase (PFK) based on immunologi- cal techniques. The methods are independent of the enzyme activity and are applicable to a wide variety of mammalian PFK, including PFK from human tissues. The techniques allow for a comparison of PFK concentrations in tissues where the enzyme activity may be present in variable specific activities. The procedures seem especially useful for in- vestigations of PFK deficiencies, ageing processes, and also for studies concerning the interconversion of the enzyme.

Methods

Rabbit, rat, bovine and human muscle PFK and the anti- bodies against rabbit muscle PFK were prepared as described previously [1,2]. Protein concentrations were determined fluorometrically using rabbit muscle PFK as a standard.

Iodination of PFK. PFK (l .8mg) was added to 0.5ml of 0.05 M K-phosphate buffer (pH 7.0) containing 0A M KCI, 0.5raM fructose 1,6-bisphosphate and 5.0raM ATP. The iodination was performed in the presence of 0 . l ing of lactoperoxidase (Sigma) and Na 125I (4.106 dps) at 30 C for 15 min. The reaction was stopped by the addition of 0.02 ml of 20% mercaptoethanol. The enzyme was separated from inorganic iodine by chromatography o n a Sephadex G-25 column (2.5 x 30cm).

Radio-Immunoprecipitation Test ofPFK. 4 [tg of 12 si_labelled PFK (20.103 dps per mg of protein) were incubated with 0.005 ml of antiserum in a total volume of 0.25 ml of K- phosphate buffer (pH 8.0) in the presence of PFK standards (0 .5 - 30 g of protein) or samples. After incubation for 30 rain at 20 ~ C, the vials were centrifuged and l zsI radioactivity was determined in the supernatants.

Complement Fixation Test of PFK. The samples containing 0.02ml of antibodies and 0.004ml of complement from guinea pig (Behringwerke) were incubated in a total volume

6. Freie Themen 129

of 0.6 ml of 105 mM K-phosphate buffer (pH 8.0), containing 0.1% bovine serum albumin, 0.5 mM ATP,,0.5 mM fructose- 1,6-bisphosphate, 0.5mM MgCI~ and 0.15mM CaCI 2 for 60 min at room temperature. After the addition of 0.1 ml of sensitized sheep erythrocytes [4.106 Ery preincubated with 0.005ml amboceptor (Behringwerke) for 60min at 20 C], incubation was continued for another 60min at 37 C. Unlysed erythrocytes were removed by centrifugation and lysis was measured at 416nm in the supernatants after addition of 0.1 ~tmole KCN.

Results

Immunoprecipitation of PFK. Figure 1 shows the variation in the amount of anti-rabbit muscle PFK serum required to precipitate PFK from different mammalian muscles. The antibodies precipitate 125I-labelled PFK in the same ratio as unlabelled PFK. The precipitation of PFK from various tissues by antiserum against rabbit muscle PFK offered the possibility for a convenient determination of unknown con- centrations of PFK protein. Amounts of 2 - 6 ~g of rabbit muscle PFK were accurately estimated by a simple radio- immunoassay. The sensitivity of the technique increases inversely proportional to the affinity of the labelled PFK indicator for the antiserum. The requirement of freshly prepared [I2sI]-PFK is the major disadvantage of this method.

Complement Fixation Test. Complement fixation tests were used for the determination of 3 - 3 0 ng of PFK with good reproducibility. The test does not differentiate between active and inactive PFK. The method was successfully applied to the

100

o= 50-

u

0_

I I I I

50 100 150 200 250 300 ~JL Serum/]67nkat PFK

Fig. 1, Precipitation of PFK flom different species by anti- rabbit muscle PFK serum. [] Rabbit muscle PFK; �9 125I- rabbit muscle PFK; O pig muscle PFK; �9 beef muscle PFK; A human muscle PFK

determination of the specific activity of PFK in human muscle extracts.

The study was supported by the Deutsche Forschungsge- meinschaft and the Fonds der Chemischen Industrie.

References

1. Bartholom6-D6nnicke, M., Hofer, H. W.: Biochim. Bio- phys. Acta 397, 347-354 (1975)

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6 , 4 ,

Fresenius Z. Anal. Chem. 290, 129-130 (1978) - ~ by Springer-Verlag 1978

Beitriige zur rechnerunterstiitzten Diagnostik II. Gruppierung biochemischer Schilddriisenparameter ohne Beriicksichtigung der klinischen Diagnose

P. Sandel, W. Vogt, S. Broda, D. Jfingst und M. Knedel

Institut ffir Klinische Chemie und Medizinische Klinik II am Klinikum Groghadern der UniversitM Mfinchen, Post- fach 702 260, 8000 Mfinchen 70

Contributions to Computer Assisted Diagnostics: II. Grouping of Biochemical Thyroid Parameters without Considering Clinical Diagnosis

Key words: Untersuchung der Schilddrfise; Gruppierung der Parameter

Der Stellenwert der Laboratoriumsuntersuchungen in der Schilddrfisendiagnostik allgemein ist unbestritten. Bei der Frage jedoch, welche Bewertung den einzelnen Parametern in der Diagnostik der Schilddrfisenerkrankungen zukommt,

gehen die Ansichten bereits weit auseinander. Grund ffir solche Differenzen ist die Tatsache, dab die Beurteilung der Laborwerte bisher weitgehend empirisch erfolgte.

Dank leistungsffihiger Computer ist es nun abet m6glich, die empirische Vorgehensweise durch eine analytische zu ersetzen, und so rficken mehrdimensionale statistische Analy- sen von Laborwerten immer st/irker in den Vordergrund des Interesses der labordiagnostischen Forschung. Es sind dies vor allem Clusteranalysen und Diskriminanzanalysen.

Ziel unserer Untersuchungen war es, im Rahmen der Schilddrfisendiagnostik zur Klfirung fotgender Fragen beizu- tragen:

Welche Gruppierungen lassen sich in den Laborwerten finden?

Sind und wie sind die gefundenen Gruppen pathophysio- logisch zu interpretieren?

Mit welcher Strategie - parallel bzw. seriell - sind die Laboranalysen am zweckmS, gigsten durchzufiihren?

Mit welchem Unsicherheitsfaktor ist die Aussage der verschiedenen Laboranalysen behaftet?

Die Daten, mit denen die Untersuchungen durchgeffihrt wurden, starnmen aus der endokrinologischen Ambulanz des Klinikums GroBhadern. Von insgesamt 322Patienten mit Verdacht auf Schilddrfisenerkrankung wurden die anamne- stischen Daten, die Laborwerte, die klinischen, ohne Kennt-