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Proteomanalytische Charakterisierung des

Glioblastoms im Hinblick auf das Langzeitüberleben

Dissertation

zur Erlangung des Grades Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat)

an der Fakultät für Chemie und Biochemie der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von Anja Stefanski

angefertigt am Medizinischen Proteom-Center

Bochum 2014

i

Die vorgelegte Arbeit wurde in der Zeit von August 2008 bis Dezember 2014 im Medizinischen

Proteom-Center der Ruhr-Universität Bochum unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Helmut E. Meyer

und in Kooperation am Molecular-Proteomics Laboratory der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf

unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. Kai Stühler angefertigt.

Gutachter/in: 1. Prof. Dr. Helmut E. Meyer

2. Prof. Dr. Christian Herrmann

Datum der Abgabe: Dezember 2014

ii

Meiner Familie

“Die Naturwissenschaft ist der harte Kern

der neuzeitlichen Kultur, der neuzeitlichen,

abendländischen Kultur.”

Carl Friedrich von Weizsäcker

Inhalt

iii

Inhalt

Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................................................ vi

Zusammenfassung ................................................................................................................................. viii

Summary .................................................................................................................................................. x

1. Einleitung ......................................................................................................................................... 1

Tumoren des zentralen Nervensystems .................................................................................. 1 1.1.

Das Glioblastom multiforme ................................................................................................... 2 1.2.

Genetische und epigenetische Faktoren ................................................................................. 3 1.3.

1.3.1. Amplifikation und Mutation des EGF-Rezeptors ............................................................. 4

1.3.2. Aberrante Methylierung des MGMT-Promotors............................................................. 5

1.3.3. Mutationen in den Genen von IDH1 und IDH2 ............................................................... 5

Veränderte Stoffwechselprozesse in Glioblastomen .............................................................. 8 1.4.

Entstehung, Therapie und Prognose bei Glioblastomen ....................................................... 10 1.5.

Gliomstammzellen und Resistenzen ..................................................................................... 11 1.6.

Die Rolle des Immunsystems bei Glioblastomen .................................................................. 12 1.7.

Charakterisierung der Tumorbiologie des Glioblastom mithilfe der Proteomanalyse ......... 15 1.8.

2. Zielsetzung der Arbeit ................................................................................................................... 18

3. Material und Methoden ................................................................................................................ 19

Material ................................................................................................................................. 19 3.1.

3.1.1. Puffer und Lösungen ..................................................................................................... 19

3.1.2. Laborgeräte und Verbrauchsmaterialien ...................................................................... 21

3.1.3. Software ........................................................................................................................ 22

3.1.4. Chemikalienliste ............................................................................................................ 23

3.1.5. Antikörper & Zelllinien .................................................................................................. 25

Methoden .............................................................................................................................. 26 3.2.

3.2.1. Methoden zur Probenvorbereitung .............................................................................. 26

3.2.2. Methoden zur Proteinkonzentrationsbestimmung ...................................................... 29

Inhalt

iv

3.2.3. Methoden zur Proteintrennung .................................................................................... 31

3.2.4. Methoden zum Nachweis von Proteinen ...................................................................... 33

3.2.5. Quantitative Nachweistechniken .................................................................................. 35

3.2.6. Bioinformatische Datenanalyse..................................................................................... 39

4. Ergebnisse...................................................................................................................................... 43

Differentielle Proteomstudie von Proteinüberständen extrahierter Glioblastome.............. 43 4.1.

4.1.1. 2D-DIGE Experiment ...................................................................................................... 43

4.1.2. Validierung differentieller Kandidatenproteine mittels Proteinblotting und

Transkriptomdaten ........................................................................................................ 47

4.1.3. Erweiterte Analyse der verwendeten Tumorproben hinsichtlich einer Mutation im Gen

der IDH1 ......................................................................................................................... 50

Differentielle Proteomstudie von mikrodissektierten Glioblastomen .................................. 50 4.2.

4.2.1. Etablierung der Mikrodissektion für Glioblastomproben ............................................. 50

4.2.2. Differentielle Proteomanalyse von Wildtyp-Glioblastomen ......................................... 55

4.2.3. Differentielle Proteomanalyse von Glioblastomen in Abhängigkeit von der IDH1

Mutation ........................................................................................................................ 59

Proteomanalytische Charakterisierung von murinen Gliomstammzelllinien unter 4.3.

sphärenbildenden Bedingungen .............................................................................................. 63

Identifizierung von tumorassoziierten Autoantigenen ......................................................... 65 4.4.

4.4.1. Sammlung von Patientenplasma und Demographie ..................................................... 65

4.4.2. Detektion und differentielle Analyse von tumorspezifischen Autoimmunreaktionen

mittels Proteinarrays ..................................................................................................... 67

4.4.3. Bioinformatische Analyse der tumorassoziierten Autoantigene .................................. 68

4.4.4. Vergleich der Proteom- mit Transkriptomdaten ........................................................... 69

4.4.5. Nachweis von tumorassoziierten Autoantikörpern im Plasma von progressionsfreien,

resektierten Glioblastompatienten mit mehr als 22 Monaten Gesamtüberleben ....... 72

4.4.6. Validierung von potentiellen tumorassoziierten Autoantigenen .................................. 74

5. Diskussion ...................................................................................................................................... 78

Methodische Aspekte der proteomanalytischen Charakterisierung des Glioblastoms ........ 78 5.1.

Inhalt

v

5.1.1. Klinische Proteomanalyse von Glioblastomen .............................................................. 78

5.1.2. Quantitative Proteomanalyse von Glioblastomen ........................................................ 80

5.1.3. Proteinarrays zur Detektion zum Nachweis von Tumorantigenen ............................... 81

Biologische Aspekte der proteomanalytischen Charakterisierung des Glioblastoms ........... 83 5.2.

5.2.1. Differentielle Proteomanalyse des Tumorgewebes von Glioblastomen hinsichtlich des

Langzeitüberleben ......................................................................................................... 84

5.2.2. Differentielle Proteomanalyse des Tumorgewebes von Glioblastomen in Abhängigkeit

von der IDH1 Mutation .................................................................................................. 88

5.2.3. Differentielle Proteomanalyse von Mausstammzellen ................................................. 94

5.2.4. Fazit ............................................................................................................................... 96

5.2.5. Identifizierung von tumorassoziierten Autoantigenen des Glioblastoms .................... 97

5.2.6. Fazit ............................................................................................................................. 101

5.2.7. Ausblick ........................................................................................................................ 102

6. Literatur ....................................................................................................................................... 104

Anhang ................................................................................................................................................ 116

A. Tabellen ................................................................................................................................... 116

B. Publikationen ........................................................................................................................... 142

C. Lebenslauf ............................................................................................................................... 143

D. Danksagung ............................................................................................................................. 144

E. Erklärung ................................................................................................................................. 145

Abkürzungsverzeichnis

vi


1D Eindimensional

2D Zweidimensional

2HG D-2-Hydroxyglutarat

3D Dreidimensional

5hmC 5-Hydroxymethylcytosin

5mC 5-Methylcytosin

AMIDA autoantibody-mediated identification of antigens

APS Ammoniumperoxodisulfat

ASA Aminosäureanalyse

ATP Adenosintriphosphat

BSA Rinderalbumin (bovine serum albumin)

cDNA komplementäre DNA (complementary DNA)

CHAPS 3-[N-(Cholamidopropyl)-dimethyl-ammonio]-1-propansulfat

CID Collision-induced Dissociation

CoA Coenzym A

CpG Cytosin-Guanin-Dinukleotid

CV Variationskoeffizient

Cy Cyanin-Fluoreszenzfarbstoff

Da Dalton

DIGE Differentielle Gelelektrophorese

DNA Desoxyribonukleinsäure

DTT Dithiothreitol

ECL enhanced chemiluminescence

EDTA Ethylendiamintetraacetat

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

ESI Elektrospray-Ionisation

FDR false discovery rate

GBM Glioblastom

GGN deutsches Gliomnetz

GO Gene Ontology

GSZ Genset-Anreicherungs-Wert

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography)

ICAT Isotope-coded affinity tag

IEF isoelektrische Fokussierung

Ig Immunoglobulin

iTRAQ isobaric tags for relative and absolute quantitation

kDa Kilo-Dalton

KPS Karnofsky Performance Score

LC-ESI-MS Kopplung von HPLC und ESI-MS

LTS Langzeitüberlebende (long term survivor)

LTSwt Tumore von Langzeitüberlebenden ohne Mutation im IDH1 Gen


vii

LTSmut Tumore von Langzeitüberlebenden mit Mutation im IDH1 Gen

m/z Masse-zu-Ladungs-Verhältnis

MALDI Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation

mRNA messenger RNA

MRS 1H-Magnetresonanzspektroskopie

MS Massenspektrometrie

MS/MS Tandemmassenspektrometrie

mut mutiert

MW Molekulargewicht

NADP+ Nicotinamidadenindinukleotidphosphat, oxidiert

NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat, reduziert

NS nicht-sphärische Stammzellen (nonsphere cultures)

PAGE Polyacrylamidgel Elektrophorese

PBS Phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)

PET Positronen Emissions Tomographie

pI isoelektrischer Punkt

PROTEOMEX a combination of proteomics and SEREX

PVDF Polyvinylidenfluorid

RNA Ribonukleinsäure

ROS reaktive Sauerstoff Spezies (reactive oxygen specie)s

SC Tumorsphären (sphere cultures)

SDS Natriumdodecylsulfat (sodiumdodecylsulfate)

SEREX serological identification of antigens by recombinant expression cloning

SILAC stable isotope labeling by/with amino acids in cell culture

SOM Selbstorganisierende Karte (self-organizing ma)

SOP Standard Operation Procedure

SRM selected reaction monitoring

STS Kurzzeitüberlebende (short term survivor)

STSwt Tumore von Kurzzeitüberlebenden ohne Mutation im IDH1 Gen

TAA tumorassoziiertes Autoantigen

TEMED N, N, N’ ,N’-Tetramethylethylendiamin

TFA Trifluoressigsäure

TOF Flugzeit (time of flight)

Tris Tris(hydroxymethyl-)aminomethan

WHO Weltgesundheitsorganisation (world health organisation)

wt Wildtyp

Zusammenfassung

viii

Zusammenfassung

Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Proteinen, die mit dem Langzeitüberleben von

Glioblastompatienten assoziiert sind. Hierfür sollten sowohl zelluläre als auch immunologische

Mechanismen mittels Proteomanalyse untersucht werden. Für die Analyse zellulärer Mechanismen

wurde Tumorgewebe von Patienten mit unterschiedlichen klinischen Verläufen und genetischem

Status, bzw. zur Charakterisierung eines Gliomstammzellmodells zur Untersuchung von Resistenzen,

ein Zellkulturmodell eingesetzt. Für die Analyse immunologischer Faktoren wurden Plasmaproben

von Patienten und nicht-tumorerkrankten Kontrollen zur Detektion einer humoralen Immunantwort

mittels Protein-Array Technik verwendet.

Für die Analyse von Tumorgewebe mittels 2D-DIGE Technik konnte zunächst erfolgreich ein

Protokoll zur materialsparenden Verwendung von Proteinfraktionen aus der DNA-Analytik

etabliert und für die Analyse von Glioblastomgewebe adaptiert werden (Grzendowski et al.

2009).

Durch Kombination der Lasermikrodissektion mit markierungsfreier quantitativer

Massenspektrometrie konnte das Proteom von Tumoren von Langzeit- und

Kurzzeitüberlebenden ohne IDH1 Mutation mit über 3000 Proteinen erstellt werden. Der

Vergleich der beiden Patientengruppen ergab einen signifikanten Abundanzunterschied für

178 Proteine. Bei den Proteinen, die in den Tumoren von Kurzzeitüberlebenden höher

abundant waren, konnte aufgrund der Anreicherung von Proteinen mitochondrialen

Ursprungs ein Hinweis auf eine Beteiligung an der Reduktion von NADPH und damit auf eine

möglicherweise bessere Protektion der Tumorzelle gegen oxidativen Stress gefunden

werden.

Die markierungsfreie differentielle Analyse von mikrodissektierten Glioblastomproben mit

und ohne Mutation im IDH1-Gen ergab, dass 130 Proteine einen signifikanten

Abundanzunterschied aufwiesen. Die anschließende bioinformatische Analyse zeigte zum

ersten Mal, dass in den IDH1 mutierten Tumoren RNA-bindende Proteine und hier

insbesondere Spleißfaktoren höher abundant sind und somit möglicherweise Veränderungen

im alternativen Spleißen bei der Tumorgenese IDH1 mutierter Glioblastome eine wichtige

Rolle spielen.

Die differentielle Analyse von Plasma von Tumorpatienten und Kontrollplasmen zeigte, dass

im Plasma von Tumorpatienten vermehrt Autoantikörper gegen Antigene mit bekannter

tumorbiologischer Relevanz, wie z.B. ERBB2, vorhanden sind. Diese erhöhte Abundanz der

Antikörper im Plasma von Patienten war auch mehrere Monate nach der Erkrankung noch zu

Zusammenfassung

ix

beobachten. Eine Korrelation der Immunantwort von Tumorpatienten mit der Konzentration

potentieller tumorassoziierter Antigene konnte nicht festgestellt werden, jedoch zeigte sich,

dass vermehrt Autoantikörper gegen Antigene mit zinkbindenden Motiven detektiert

wurden.

Durch die Proteomanalyse von vier murinen Gliomstammzelllinien unter normalen und

sphärenbildenden Bedingungen konnte gezeigt werden, dass die Veränderungen auf

Proteomebene durch die untersuchten Kulturbedingungen gegenüber dem biologischen

Ursprung der Zelllinien vernachlässigbar ist. Zudem konnte gezeigt werden, dass unter

sphärenbildenden Bedingungen eine erhöhte Abundanz spezifischer Stammzellproteine

vorliegt (Ahmad et al. 2014).

Summary

x

Summary

It has been shown that a subgroup of glioblastoma patients exhibits a significant longer survival time,

but until now less is known about the underlying causes for the differences in clinical outcome. The

aim of this work was to reveal the cellular and immunological mechanisms involved in long-term

survival in glioblastoma patients by a proteomic approach. For this purpose, tumor tissue of patients

with different clinical courses and genetic status as well as plasma for the detection of a humoral

immune response was used. Furthermore, we investigated the role of therapy associated resistance

by a tumor stem cell model. To reach the aim of this work the following results were obtained:

A protocol for the parallel and material saving analysis of tissue samples by transcriptomics

and proteomics using cesium chloride fractions has been established (Grzendowski et al.

2009). With this protocol a 2D-DIGE study of glioblastoma tissue was successfully performed.

Identification of more than 3000 proteins in the proteome of tumors of long term and short

term survivors by the combination of laser microdissection and mass spectrometry.

The quantitative label free analysis of long term and short term survivors revealed an

aberrant abundance of 178 proteins. Within the group of proteins with an increased

abundance in tumors of short-term survivors an enrichment of proteins with mitochondrial

origin was observed therewith suggesting a relevant role in NADPH mediated cell protection.

The label-free differential analysis of long term glioblastomas patients in dependency of the

IDH1 mutation led to the identification of 130 proteins with an aberrant expression. The

subsequent bioinformatic analysis revealed for the first time that RNA-binding proteins and

in particular splicing factors are higher abundant in IDH1 mutant tumors and thus alternative

splicing may play an important role in tumorigenesis of glioblastomas with IDH1 mutation.

The autoantibody profile of glioblastoma patients obtained by protein array analysis of

plasma revealed a high number of autoantibodies directed against antigens with known

tumor-biological relevance, such as ERBB2. Interestingly, the increased abundance of

antibodies in the plasma of patients was also observed several months after tumor resection

suggesting an immunological control mechanism.

The proteome analysis of four mouse glioma stem cell lines under normal and sphere-

forming conditions showed that the changes in the proteome of the studied culture

conditions compared to the biological origin of the cell lines is negligible. In addition, it was

shown that under sphere forming conditions an increased abundance of specific stem cell

proteins is present (Ahmad et al. 2014).

Summary

xi

This work is the first that exhaustively explored the proteome of glioblastoma from long and short

time survivors. With the help of this work first results have been obtained suggesting that short time

survivor exhibit an anti-oxidative phenotype helping the tumor cell to resist oxidative stress and

protect them for apoptosis. Whereas for long time survivors with IDH1 mutation an alternative

splicing phenotype has been revealed and is discussed in the context of clinical outcome of

glioblastoma patients. To further validate the results of this work the use of clinical samples is self-

evident as in vitro models of long-time survival are not available yet.

Kapitel 1: Einleitung

1

1. Einleitung

Tumoren des zentralen Nervensystems 1.1.

Die Diagnose von malignen Tumoren des zentralen Nervensystems geht für die Patienten meist nicht

nur mit einer schlechten Prognose einher. Wegen der durch die Tumoren hervorgerufenen starken

Beeinträchtigung von kognitiver Funktion und Lebensqualität gehören sie zu den am meisten

gefürchteten Krebsarten (Omuro und DeAngelis 2013). Die insgesamt häufigsten Hirntumoren sind

Metastasen (33-50%) ausgehend vor allem von Bronchial-, Nieren- und Mammakarzinomen,

malignem Melanomen, gastrointestinalen Tumoren, grundsätzlich aber auch von fast allen anderen

extrakraniellen malignen Tumoren. Bei den neu diagnostizierten hirneigenen Tumoren macht die

Gruppe der neuroepithelialen Tumoren einen wesentlichen Anteil aus, aber auch Tumoren der

Menignen, der Nervenscheiden, Lymphome, der Sellarregion und einige andere werden in dieser

Gruppe von Tumoren zusammengefasst.

Abbildung 1.1: Tumoren des zentralen Nervensystems. Zu den häufigsten Tumoren zählen Tumoren der

Hirnhäute und des neuroepithelialen Gewebes. Die Gruppe der neuroepithelialen Tumoren umfasst auch

Glioblastome (nach Ostrom et al. (2013)).

Tumoren des neuroepithelialen

Gewebes 31%

Tumoren der kranialen und

spinalen Nerven 8%

Tumoren der Meningen

37%

Lymphome und Hämatopoetische

Neoplasien 2%

Keimzelltumoren und Zysten

0%

Tumoren der Sellarregion

16%

nicht-klassifizierte

Tumoren 6%

Tumoren des zentralen Nervensystems


2

Jedoch handelt es sich bei diesen Tumoren um eine eher seltene Erkrankung. Der Anteil der primären

Gehirntumoren an allen neu diagnostizierten Neoplasien im Erwachsenenalter beträgt in

Deutschland nur ca. 2% (Kaatsch et al. 2013). Zwischen 2006 und 2010 lag laut Ostrom et al. (2013) in

den USA die geschätzte Zahl der neu an solchen Neoplasien Erkrankten bei 326.700. Im gleichen

Zeitraum verstarben schätzungsweise 68.000 der an einem Hirntumor erkrankten Patienten. Damit

liegt die Inzidenz aller primären Hirntumoren – benigne wie maligne – bei 21,03 auf 100.000

Personen, die malignen alleine bei 7,27.

Den größten Anteil in der Gruppe neuroepithelialer Tumoren machen Gliome aus. Diese primären

Tumore, die histologische Ähnlichkeiten mit Gliazellen aufweisen und möglicherweise von Glia-

Vorläuferzellen des Zentralnervensystems ihren Ausgang nehmen, werden nach dem glialen Zelltyp,

dem sie histologisch am meisten ähneln, eingeteilt. Somit werden Gliome in Oligodendrogliome,

Ependymome und Astrozytome eingeteilt. Letztere machen ca. 75% aller neuroepithelialen Tumoren

aus und treten vorwiegend im mittleren Lebensalter auf (Ostrom et al. 2013). Astrozytome werden

ihrerseits ebenfalls in verschiedene Grade eingeteilt. Das gebräuchlichste Graduierungssystem der

Tumoren des zentralen Nervensystems ist das der Weltgesundheitsorganisation (WHO), welches

Astrozytome entsprechend ihrer Malignität in die Stufen I-IV einteilt (Louis et al. 2007) (Tabelle 1.1).

Tabelle 1.1: WHO-Klassifikation der Astrozytome

WHO Grad Bezeichnung

WHO Grad I: Pilocytisches Astrozytom

WHO Grad II: Diffuses Astrozytom

WHO Grad III: Anaplastisches Astrozytom

WHO Grad IV: Glioblastom multiforme

Das Glioblastom multiforme 1.2.

Als WHO Grad IV wird das Glioblastom multiforme (GBM) eingestuft, ein diffus infiltrierender,

unkontrolliert proliferierender Tumortyp, welcher mit rund 50% aller Gliome den häufigsten

malignen hirneigenen Tumor bei Erwachsenen darstellt (DeAngelis 2001; Maher et al. 2001). Trotz

ihres invasiven Wachstums sind sie dennoch meist auf das Zentralnervensystem beschränkt und

metastasieren nicht. Der Begriff Glioblastoma multiforme wurde 1926 von Percival Bailey und Harvey

Cushing geprägt und basierte auf der Vorstellung, dass sich der Tumor aus primitiven Vorstufen von

Gliazellen (Glioblasten) entwickelt sowie der Beobachtung, dass das Erscheinungsbild mit Nekrosen,

Einblutungen und Zysten sowie Zellen, welche sich in Größe und Form teilweise stark unterscheiden,

sehr inhomogen (multiform) sein kann (Bailey und Cushing 1926). Histologisch werden sie


3

charakterisiert durch erhebliche mitotische Aktivität, vaskuläre Proliferation sowie nekrotische

Bereiche. Außerdem kann zwischen primären und sekundären Glioblastomen unterschieden werden.

Als primäre Glioblastome werden die Tumoren bezeichnet, welche spontan auftreten, sekundäre

Glioblastome sind deutlich seltener und entstehen aus niedriggradigeren Gliomen (Furnari et al.

2007). Der Tumor tritt am häufigsten bei älteren Erwachsenen auf, das mediane Alter bei

Diagnosestellung beträgt 64 Jahre. Männer sind deutlich öfter betroffen als Frauen (Verhältnis 1,7:1).

Daten des amerikanischen Hirntumorregisters zeigen, dass Glioblastome bei Weißen mindestens

doppelt so häufig sind wie in der schwarzen Bevölkerung. Im Vergleich zu Erwachsenen sind

Glioblastome bei Kindern sehr selten. Die Inzidenz wurde in Europa und Nordamerika mit 2,9 bis 3,5

Neuerkrankungen pro Jahr auf 100.000 Einwohner ermittelt (Polednak und Flannery 1995).

Genetische und epigenetische Faktoren 1.3.

Auch vom molekularen Standpunkt aus sind Glioblastome eher als heterogen zu bezeichnen

(Abbildung 1.2) und die Untersuchung genetischer Aberrationen bei Glioblastomen führte bereits zu

einer Reihe neuer Biomarkerkandiaten, die derzeit hinsichtlich ihrer Eignung im Bereich der

Vorhersage der Therapieantwort oder Prognose in Kliniken getestet werden. Die integrative Analyse

einer Vielzahl genomweiter Expressionsstudien (z.B.(Mischel et al. 2003; Freije et al. 2004; Liang et

al. 2005)) und Kopienzahlvariations–Analysen (Ruano et al. 2006; Beroukhim et al. 2007) zeigen, dass

im Wesentlichen vier genetische Subklassen (Klassisch, Mesenchymal, Proneural und Neural)

basierend auf den molekularen Profilen unterschieden werden können (Verhaak et al. 2010). Auch

können z.B. primäre und sekundäre Glioblastome nicht nur anamnestisch sondern auch

molekulargenetisch unterschieden werden. Sekundäre Glioblastome weisen hauptsächlich

Mutationen des TP53 Gens auf, während primäre Glioblastome vorwiegend durch eine Amplifikation

und Überexpression des EGFR Gens und eine Deletion von Chromosom 10 gekennzeichnet sind.


4

Abbildung 1.2: Häufig mutierte Onkogene und Tumorsuppressorgene in Glioblastomen. Onkogene

Genprodukte sind als grüne Pfeile, Tumorsuppressoren als rote Oktaeder dargestellt. Mut.= Mutation; Amp.=

Amplifikation; Del. = Deletion. (modifiziert nach Purow und Schiff (2009))

Im Falle der oligodendroglialen Tumoren konnte sogar gezeigt werden, dass kombinierte Deletionen

der Arme 1p und 19q als günstige prognostische Faktoren gewertet werden können (Cairncross et al.

2006). In Glioblastomen ist diese genetische Veränderung jedoch selten und die prognostische

Signifikanz ist weniger eindeutig (Ino et al. 2000), (Houillier et al. 2006). In den folgenden Abschnitten

werden die wichtigsten Aberrationen in Glioblastomen kurz erläutert.

1.3.1. Amplifikation und Mutation des EGF-Rezeptors

Die häufigste genetische Veränderung assoziiert mit GBM ist die Amplifikation des epidermalen

Wachstumsfaktorrezeptorgens (EGFR), welche in der Überexpression dieses transmembranen

Tyrosinkinaserezeptors resultiert (Ekstrand et al. 1991). Der Großteil der Glioblastome mit EGFR-

Amplifikation enthält die Mutationsvariante EGFRvIII (Wikstrand et al. 1997), welche charakterisiert

ist durch die Deletion der Exone 2-7 und zur Expression einer trunkierten extrazellulären Domäne mit

Liganden unabhängiger, konstitutiver Aktivität führt. Die Rolle der Überexpression von EGFR und

seiner Variante (vIII) in der malignen Progression bei glialen Tumoren und ihr möglicher Einfluss auf


5

die Gesamtüberlebensdauer der Patienten wurde in der Literatur oft diskutiert. Überexpression des

Wildtyp-EGFR konnte in mehreren Studien nicht als unabhängiger prognostischer Faktor bestätigt

werden (Waha et al. 1996; Galanis et al. 1998; Newcomb et al. 1998). EGFR und EGFRvIII

Amplifikation verstärken die Gliomproliferation und Invasion in vitro (Sunderkotter et al. 1994). Im

Vergleich zu Kontrollgruppen unselektierter Glioblastompatienten gibt es einen Trend zu weniger

häufigen, jedoch nicht statistisch signifikanten, EGFR Amplifikationen bei Glioblastomen von

Langzeitüberlebenden (Heimberger et al. 2005).

1.3.2. Aberrante Methylierung des MGMT-Promotors

Eine epigenetische Veränderung bei Glioblastomen mit klinischer Signifikanz ist der

Methylierungsstatus des Gens der O6-Methylguanin-Methyltransferase (MGMT). MGMT kodiert ein

DNA-Reparatur Protein, welches im Zellkern lokalisiert ist. Es ist mitverantwortlich für die Reparatur

methylierter DNA und vermittelt daher auch Resistenzen gegen DNA alkylierende Agenzien wie z.B.

Nitrosoharnstoffe und Temozolomid, welche in der Tumortherapie häufig eingesetzt werden

(Johannessen und Bjerkvig 2012). Transkriptionelles Silencing der MGMT Gene durch Promotor

Hypermethylierung wird bei ca. 50% aller Glioblastome beobachtet und ist sowohl assoziiert mit

verlängertem proggressionsfreiem Überleben als auch der Gesamtüberlebenszeit von Patienten,

welche im Rahmen ihrer Therapie mit alkylierenden Reagenzien behandelt wurden (Hegi et al. 2005).

Passend zu diesen Daten konnte MGMT Promotormethylierung bei einem signifikant erhöhten Anteil

von Langzeitüberlebenden des Glioblastoms (74%) gegenüber einer unselektierten Kontrollgruppe

(43%) beobachtet werden (Krex et al. 2007).

1.3.3. Mutationen in den Genen von IDH1 und IDH2

Eine Entdeckung jüngerer Zeit ist, dass Mutationen im Gen der Isocitrat-Dehydrogenasen 11 und 2

(IDH1/ IDH2) gehäuft bei Glioblastomen auftreten (Parsons et al. 2008). Diese befinden sich meist im

aktiven Zentrum der Isocitrat-Dehydrogenase. Die subzelluläre Lokalisation der IDH1 kodierten

Isocitrat Dehydrogenase ist das Cytoplasma und die Peroxisomen (Geisbrecht und Gould 1999). Eine

Mutation findet sich bei 12% aller Glioblastome und charakterisiert den proneuralen Typ (Verhaak et

al. 2010). Nahezu alle detektierten Mutationen resultieren in einem Austausch der Aminosäure

Arginin in Position 132 und besonders häufig ist hier ein Adenin anstelle eines Guanin als zweites

Nukleotid des Codons 132 zu finden, was in einem Histidin an Position 132 resultiert (Parsons et al.

1 Die Bezeichnung von Proteinen erfolgt in dieser Arbeit nach der Uniprot-Nomenklatur (Uniprot, 2014).


6

2008; Pusch et al. 2011). Die höchste Frequenz an IDH1 Mutationen tritt in diffusen Astrozytomen

(68%), Oligodendrogliomen (69%), Oligoastrozytomen (78%) und sekundären Glioblastomen (88%)

auf. Primäre Glioblastome und andere Entitäten sind charakterisiert durch eine geringe Frequenz

oder Abwesenheit von Mutationen der Aminosäure 132 der IDH1 (Balss et al. 2008). Die besonders

hohe Frequenz der IDH1 Mutation in WHO Grad II astrozytären und oligodendroglialen Gliomen

suggeriert eine Rolle in der frühen Tumorentstehung. Die Isocitrat-Dehydrogenasen 1 und 2

katalysieren die oxidative Decarboxylierung von Isocitrat zu α-Ketoglutarat unter Reduzierung von

NADP+ zu NADPH. Die mutierte Aminosäure Arginin in Position 132 gehört zu einer evolutionär

konservierten Region, welche in der Bindungstelle des Isocitrats lokalisiert ist.

Die physiologische Funktion der NADP-abhängigen Enzyme Isocitrat-Dehydrogenasen 1 und 2 ist

bisher nicht im Detail aufgeklärt, aber es wird davon ausgegangen, dass sie eine Rolle im Glukose-,

Fettsäure- und Glutaminmetabolismus spielen und darüber hinaus an der Aufrechterhaltung des

normalen zellulären Redox-Status beteiligt sind (Cairns und Mak 2013). NADPH ist einer der

Hauptträger von Reduktionsäquivalenten innerhalb der Zelle und wird zur Biosynthese diverser

Makromoleküle sowie für antioxidativen Schutzsysteme benötigt, welche die Zelle vor oxidativem

Stress durch reaktive Sauerstoff Spezies (reactive oxygen species, ROS) schützen. So werden z.B.

sowohl Thioredoxin als auch Glutathion NADPH-abhängig regeneriert (Holmgren 1977; Vogel et al.

1999).

Abbildung 1.3: Enzymatische Reaktionen der normalen und der mutierten Variante der Isocitrat

Dehydrogenasen. Die Isocitrat-Dehydrogenasen 1 und 2 katalysieren die Umsetzung von Isocitrat zu α-Ketoglutarat.

Dabei wird ein Molekül NADP+ zu NADPH reduziert. Die mutierten Varianten von IDH1 reduzieren gebildetes α-

Ketoglutarat weiter zu D-2-Hydroxyglutarat unter Verbrauch eines Moleküls NADPH. (modifiziert nach Cairns und

Mak (2013))

Mutierte Varianten der Isocitrat-Dehydrogenasen 1 und 2 zeigen eine signifikant verringerte

enzymatische Aktivität. Zudem weisen diese Enzyme mit der NADPH-abhängigen Reduktion von α-


7

Ketoglutarat zu D-2-Hydroxyglutarat (2HG) (siehe Abbildung 1.3) eine neue Aktivität auf (Dang et al.

2009).

Genau diese Eigenschaft der mutierten Isocitrat-Dehydrogenase 1 trägt möglicherweise

entscheidend zur Gliomgenese bei. In Zellen liegen normalerweise über 80 verschiedene

Dioxygenasen vor, welche α-Ketoglutarat als Kofaktor benötigen. 2HG ist strukturell sehr ähnlich zu

α-Ketoglutarat, inhibiert aber die enzymatische Aktivität dieser Dioxygenasen kompetitiv (Xu et al.

2011).

Abbildung 1.4: Veränderungen im Stoffwechsel durch die Produktion des Onkometaboliten 2HG durch die

mutierte IDH1. Mutationen in IDH1 können zur Akkumulation von D-2-Hydroxyglutarat führen. Dieser Metabolit

inhibiert u.a. die Funktion α-Ketoglutarat-abhängiger Enzyme, wie z.B. TET2 und KDM, welche für die Demethylierung

von DNA und Histonen verantwortlich sind. (modifiziert nach Ichimura (2012))

Diese Dioxygenasen sind an vielen verschiedenen Prozessen innerhalb der Zelle beteiligt (siehe

Abbildung 1.4). So wird z.B. davon ausgegangen, dass die Dioxygenase TET2 durch 2HG inhibiert wird,

wodurch in der Folge 5-Methylcytosin nicht mehr demethyliert wird. Dies könnte die Erklärung für

die sehr häufig im Einklang mit einer IDH1 Mutation beobachteten CpG Hypermethylierung der

Tumor DNA, dem sogenannten glioma-CpG island methylator Phänotyp (G-CIMP), liefern (Figueroa et

al. 2010; Noushmehr et al. 2010; Turcan et al. 2012). Darüber hinaus werden auch einige Histon-

Demethylasen, z.B. aus der KDM-Familie, inhibiert, wodurch auch Histone hypermethyliert werden


8

(Xu et al. 2011; Lu et al. 2012). Weiterhin wird auch der Abbau des Transkriptionsfaktors HIF-1α

durch eine 2HG abhängige Dioxygenase, HIF-PH3, reguliert. Dadurch kann HIF-1α in der Zelle

akkumulieren. HIF-1α kann seinerseits die Transkription von über 40 verschiedenen Genen

aktivieren, darunter z.B. auch VEGF, welche mit Tumor Proliferation und Angiogenese in Verbindung

gebracht werden können (Xu et al. 2011). Daher stehen die mutierten Varianten von IDH1 und IDH2

im Verdacht, als aktivierte Onkogene und ihr Produkt 2HG, als Onkometabolit zu fungieren.

Veränderte Stoffwechselprozesse in Glioblastomen 1.4.

Glioblastomzellen zeigen neben morphologischen auch auf molekularer Ebene deutliche

Aberrationen gegenüber normalen Gliazellen. Der Prozess der zellulären Transformation und

Krebsprogression beinhaltet nicht nur genetische Mutationen und epigenetische Veränderungen,

sondern auch Änderungen in der zellulären Kommunikation sowie den beschriebenen metabolischen

Wegen (Hanahan und Weinberg 2011). Mittlerweile konnte gezeigt werden, dass diese

Veränderungen im Metabolismus häufig als Konsequenz aus Mutationen und veränderter zellulärer

Kommunikation hervorgehen (Carracedo et al. 2013).

Gesunde Zellen unterliegen normalerweise einem Kontrollsystem, welches die übermäßige

Proliferation verhindert. Nährstoffaufnahme findet hier nur nach Stimulation durch

Wachstumsfaktoren statt (Vander Heiden et al. 2009). In Krebszellen ist dieser Signalweg häufig

durch Mutationen in den Rezeptoren der Wachstumsfaktoren verändert, was die unbegrenzte

Aufnahme von Nährstoffen zur Folge hat (DeBerardinis et al. 2008; Hsu und Sabatini 2008). Darüber

hinaus ist auch der Metabolismus dieser Nährstoffe dahingehend verändert, dass die Zellen

ausreichend Bausteine für schnelle Proliferation zur Verfügung haben.

So nehmen Krebszellen verstärkt Glukose auf, oxidieren diese aber nicht mehr hauptsächlich zur

Gewinnung von ATP, sondern nutzen sie vorwiegend für anabolische Prozesse wie die Produkltion

von Ribose, Glykosilierung von Proteinen und die Synthese von Serinen (Christofk et al. 2008; Vander

Heiden et al. 2010; Hitosugi et al. 2012). Dies geschieht in der Nutzung von Glykolyse auch unter

aeroben Bedingungen anstelle der oxidativen Phosphorylierung in den Mitochondrien zur

Verstoffwechslung von Glukose (Abbildung 1.5). Das Phänomen der aeroben Glykolyse bei

Krebszellen wird allgemein nach seinem Entdecker „Warburg-Effekt“ genannt (Warburg 1956) und

wird auch bei Glioblastomzellen beobachtet (Oudard et al. 1996). Es wird mittlerweile davon

ausgegangen, dass es sich bei dieser glykolytischen Verschiebung um ein sehr frühes Ereignis in der

Tumorgenese handelt (Tennant et al. 2010).


9

Abbildung 1.5: Schematische Darstellung der Unterschiede zwischen der Energiegewinnung in

differenziertem Gewebe und Tumorgewebe. In der Gegenwart von Sauerstoff nutzen normale Zellen zunächst die

Glykolyse und oxidative Phosphorylierung zur Energiegewinnung. Ist kein Sauerstoff verfügbar, wird das aus der

Glykolyse gewonnene Pyruvat mittels anaerober Glykolyse zu Laktat umgesetzt. Dieser Prozess liefert jedoch deutlich

weniger ATP-Moleküle pro eingesetztem Glukose-Molekül. Krebszellen verwenden verstärkt die anaerobe Glykolyse

auch unter aeroben Bedingungen. (modifiziert nach Vander Heiden et al. (2009))

Neben Glukose sind auch Fettsäuren ein wichtiger Energielieferant von Zellen. Unter normalen

Bedingungen liefern Fettsäuren bei ihrer Verstoffwechselung, der β-Oxidation, sogar zweimal so viel

ATP wie Kohlenhydrate. Diesen Umstand scheinen Krebszellen auszunutzen, wenn sie unter

Stressbedingungen erhöhten ATP-Bedarf haben. So konnte gezeigt werden, dass bei Tumorzellen

durch Verlust des Kontakts zur extrazellulären Matrix die Aufnahme durch Glukose und in der Folge

auch die Glukose-abhängige ATP-Produktion zunächst inhibiert wird. Gleichzeitig steigt die

Konzentration so genannter reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) an, welche wiederum die β-Oxidation

inhibiert. Greifen nun die antioxidativen Schutzmechanismen der Zelle und beseitigen ROS, wird die

β-Oxidation reaktiviert und die ATP-Konzentration in der Zelle steigt wieder an (Schafer et al. 2009).

Darüber hinaus sind Tumorzellen für Wachstum und Proliferation auf große Mengen an NADPH

angewiesen, da NADPH neben seiner Rolle bei der Bekämpfung von oxidativem Stress auch ein

wichtiges Coenzym für anabolische Enzyme in der Lipid- und Nukleinsäuresynthese darstellt (Chiarugi

et al. 2012). Die β-Oxidation liefert hier mit Acetyl-CoA den Ausgangsbaustein für zwei von vier

möglichen Wegen über die die Zelle NADPH herstellen kann. In einer Reihe von Reaktionen wird

Acetyl-CoA zu den Baustoffen umgesetzt, durch welche schlussendlich entweder das NADP+-

abhängige Malatenzym oder die Isocitrat-Dehydrogenasen 1 NADPH herstellen können. Inhibiert


10

man die β-Oxidation in Gliomzellen, sinkt auch der NADPH-Spiegel, wodurch ROS akkumulieren

können und die Zellen in der Folge absterben (Pike et al. 2011). Diese Veränderungen im

Stoffwechsel des Tumors macht man sich teilweise bereits in der Diagnostik, z.B. die erhöhte

Glukose-Aufnahme bei der Fluordesoxyglukose Positron-Emissions-Tomographie (Wienhard et al.

1989), zu Nutze.

Entstehung, Therapie und Prognose bei Glioblastomen 1.5.

Bei den meisten Glioblastomen ist keine genetische Prädisposition bekannt. Lediglich einige seltene

erbliche Erkrankungen konnten als schlechte prognostische Faktoren ausgemacht werden, darunter

das Turcot Syndrom (Hamilton et al. 1995) oder das Li-Fraumeni Syndrom (Kleihues et al. 1997). Seit

vielen Jahren wird mit Nachdruck nach Faktoren gesucht, die das Risiko für Tumorentstehung

erhöhen. Im Zuge dessen wurde der Einfluss verschiedener exogener Faktoren wie Rauchen (Zheng

et al. 2001), Diäten (Lee et al. 1997), ionisierende Strahlung (Braganza et al. 2012), Mobilfunkgeräte

(Inskip et al. 2001), elektromagnetische Felder (Theriault et al. 1994), sozioökonomischer Status und

Bildungsstand (Schlehofer et al. 2005), aber auch medizinische Risikofaktoren wie Allergien (Wiemels

et al. 2002), immunologischer Status (Schlehofer et al. 1999) und virale Infektionen (Vilchez und

Butel 2003) untersucht. All diese Studien konnten jedoch keine eindeutige Verknüpfung von

Glioblastomen zu spezifischen Risikofaktoren herstellen.

Die Standardbehandlung von Glioblastom Patienten sieht die möglichst vollständige Resektion des

Tumors sowie anschließender adjuvante Radiochemotherapie vor. Allerdings bereiten das schnelle

und maligne Wachstum, das geringe Ansprechen auf therapeutische Maßnahmen und das kurze

Intervall bis zum Rezidiv nach wie vor, große Schwierigkeiten bei der Behandlung. Generell kann man

sagen, dass die Patienten bislang von allen therapeutischen Maßnahmen am meisten von einer

Operation profitieren (Wilson et al. 2014). Bei der Chemotherapie wird überwiegend auf Zytostatika

wie z.B. Temozolomid oder Nitrosoharnstoffe zurückgegriffen, welche durch Alkylierung der DNA die

Replikation der Tumorzellen inhibieren. Studien zeigen, dass eine Chemotherapie das Leben um

weitere 2,5 Monate verlängert (Stupp et al. 2005). Bei einer Ausschöpfung aller therapeutischen

Maßnahmen kann in der Regel eine Verlängerung des Lebens um ein Jahr erreicht werden. Dennoch

kommt es in fast allen Fällen innerhalb kürzester Zeit zum Rezidiv, eine endgültige Heilung konnte bis

heute nicht erreicht werden. Weniger als 20% der Betroffenen leben länger als ein Jahr und die

durchschnittliche Lebenserwartung liegt bei ungefähr 12 Monaten (Johnson und O'Neill 2012;

Ronning et al. 2012). Lediglich 4,7 % der Patienten zeigen entgegen der Prognose einen besseren

klinischen Verlauf und können mit einer Überlebensdauer von mehr als 60 Monaten als

Langzeitüberlebenden eingestuft werden (Dolecek et al. 2012). Hierbei gelten ein Lebensalter unter


11

60 Jahren, die perioperative Konstitution des Erkrankten, welche anhand des Karnofsky-Index erfasst

wird, und eine gute Tumorlokalisation hinsichtlich der Resektion als etablierte positive prognostische

Parameter (Curran et al. 1993). Somit ist die Frage nach Faktoren, welche den Krankheitsverlauf und

die Gesamtüberlebensdauer positiv beeinflussen, nach wie vor von hoher Relevanz.

Gliomstammzellen und Resistenzen 1.6.

Krebszellen werden häufig als Zellen mit unbegrenzter Lebensdauer betrachtet, eine Eigenschaft,

welche normalerweise Stammzellen, zugeschrieben wird. Im Rahmen neuerer Studien konnte jedoch

gezeigt werden, dass innerhalb eines Tumors nur eine kleine Population von Tumor-initiierenden

Zellen stammzellähnliche Fähigkeiten aufweisen. Diese sind nicht nur in der Lage sich selbst zu

erneuern, vielmehr generieren sie auch jene schnell proliferierenden Nachkommen, die letztlich den

größten Teil des Tumors ausmachen (Lapidot et al. 1994; Al-Hajj et al. 2003; Singh et al. 2003). Es

wird davon ausgegangen, dass diese Tumor-initiierenden Zellen aufgrund ihrer Eigenschaften nicht

nur eine entscheidende Rolle bei der Krebsentstehung, sondern auch im Rahmen der

Tumorbehandlung und der Entstehung von Rezidiven spielen. Für die Tumortherapie sind besonders

Resistenzen des Tumors gegen die Behandlung für den Therapieerfolg von ausschlaggebender

Bedeutung. Theorien besagen, dass solche Gliomstammzellen in der Lage sind, Resistenzen

gegenüber nicht-operativen Therapieansätzen zu vermitteln (Ignatova et al. 2002; Singh et al. 2003;

Galli et al. 2004; Eramo et al. 2006). Sie sollen in der Lage sein, als Antwort auf Radio- und

Chemotherapie mit DNA alkylierenden Reagenzien, Proteine zu exprimieren, die spezifisch DNA-

Schäden reparieren oder Wirkstoffe gezielt aus der Zelle transportieren (Bao et al. 2006; Eramo et al.

2006; Liu et al. 2006; Zhou et al. 2009). Die Folgen sind ein vermindertes Ansprechen auf die

Behandlung und schnelles Auftreten von Rezidiven. Für die Entwicklung wirksamer Therapeutika ist

es daher von entscheidender Bedeutung, sowohl die molekularen Eigenschaften als auch ablaufende

biologische Prozesse dieser Gliomstammzellen im Detail zu verstehen. Zur Untersuchung dieser

Attribute werden in der Regel Modellsysteme herangezogen. Hierfür werden aus resektierten

Tumoren oder Gliomzelllinien Zellen mit stammzellähnlichen Eigenschaften isoliert und unter

Kulturbedingungen neuraler Stammzellen als Tumorsphären expandiert (Singh et al. 2003; Galli et al.

2004; Eramo et al. 2006; Shen et al. 2008; Qiang et al. 2009). Ähnlich dieser neuralen Stammzellen

konnte auch für diese putativen Gliomstammzellen gezeigt werden, dass sie zu klonalem Wachstum

in der Lage sind, ausgeprägtes Differenzierungpotential besitzen und diverse Stammzellmarker, wie

z.B. CD133, Nestin, Musashi-1 und Sox2 sowie α6 Integrin, exprimieren (Pellegatta et al. 2006; Wu et

al. 2008; Qiang et al. 2009; Zhou et al. 2009; Lathia et al. 2010; Muto et al. 2012).


12

Die Rolle des Immunsystems bei Glioblastomen 1.7.

Ein weiterer Parameter, dessen Einfluss auf den Verlauf der Erkrankung bisher nur wenige Daten

vorliegen, ist das Immunsystem des Patienten. Das Immunsystem hat die schwierige Aufgabe,

kontinuierlich zwischen körpereigenen und körperfremden Molekülen zu unterscheiden, um letztere

anschließend unschädlich zu machen. Die körpereigene Immunantwort wird durch ein streng

reguliertes, aber dennoch flexibles Netzwerk aus Antikörpern, Antigen präsentierenden Zellen, T-

Lymphozyten, Cytokinen, Chemokinen etc. umgesetzt. Die zielgerichtete Antwort auf (Protein-)

Antigene beruht hierbei auf der Entwicklung von Antikörpern und/ oder T-Lymphozyten gegen

Epitope des Zielantigens. T-Lymphozyten erkennen in erster Linie kurze Peptide welche von MHC-

Molekülen präsentiert werden (Anderson und LaBaer 2005). Intrazelluläre Proteine (z.B. virale

Antigene) werden vorwiegend von CD8+ positiven cytotoxischen T-Lymphozyten erkannt, exogene

Antigene von CD4+ positiven Helfer-T-Lymphozyten welche in der Folge den direkten oder indirekten

Abbau infizierter Zellen einleiten (Abbildung 1.6).

Abbildung 1.6: Schematisches Modell der Präsentation von Peptiden durch antigenpräsentierende Zellen

mittels Haupthistokompatibilitätskomplexen und ihre Erkennung durch T-Lymphozyten. Helfer-T-

Lymphozyten erkennen Peptide intrazellulärer Antigene, die von MHC-Klasse II-Molekülen präsentiert werden.

Cytotoxische-T-Lymphozyten erkennen hingegen durch MHC-Klasse I-Molekülen präsentierte Peptide extrazellulärer

Antigene.

Antikörper sind hingegen Teil der humoralen Immunantwort. Sie werden in aktivierten B-

Lymphozyten produziert und machen mit ca. 20 % eine der Hauptproteinkomponenten des Blutes

aus. Zur Aktivierung der B-Lymphozyten kommt es, wenn deren membrangebundener B-Zell-


13

Rezeptor sein spezifisches Antigen erkennt, sowie gleichzeitig ein zweites Signal seitens eines Helfer-

T-Lymphozyten eintrifft. Antikörpern kommt die Aufgabe zu, nach Bindung an ihr Epitop zum einen

das betreffende Molekül durch Kreuzvernetzung zu inaktivieren, zum anderen das

Komplementsystem und verschiedene Typen von Leukozyten, welche zur Phagozytose befähigt sind,

zu rekrutieren.

Das Immunsystem wendet einen komplexen Mechanismus an, um zwischen eigenen und fremden

Makromolekülen zu unterscheiden. Sowohl T-Lymphozyten als auch die Antikörper produzierenden

B-Lymphozyten unterliegen während ihrer Entwicklung einer negativen Selektion. Zellen, die

während der Reifung eine Bindung an körpereigene Antigene zeigen, werden unterdrückt. Erkennen

z.B. unreife B-Lymphozyten Selbstantigene, kann in einem Prozess, der Rezeptor-Editierung genannt

wird, entweder sein Rezeptor dahingehend verändert werden, dass er kein Autoantigen mehr

erkennt (Gay et al. 1993; Tiegs et al. 1993) oder die Zelle wird apoptotisch. Überlebt ein

selbstreaktiver B-Lymphozyt diese Reifung, führt im späteren Verlauf die Bindung an ein Autoantigen

ohne gleichzeitiges kostimulatorisches Signal von einem Helfer-T-Lymphozyten ebenfalls zur

Inaktivierung bzw. Apoptose der Zelle (Abbildung 1.7) (Nossal 1989).

Abbildung 1.7: Schematisches Modell der negativen Selektion zur Entwicklung immunologischer Toleranz

gegen Autoantigene. Erkennen unreife B-Lymphozyten Autoantigene erfolgt entweder die klonale Deletion

(Apoptose) des B-Lymphozyten oder der Rezeptor wird dahingehend editiert, dass er nun Fremdantigene erkennt.

Sollte ein solcher selbstreaktiver B-Lymphozyt dennoch Ausreifen, wird die Zelle nach Erkennung eines

Selbstantigens ohne gleichzeitige Stimulation durch einen Helfer-T-Lymphozyten ebenfalls deletiert.

Unreifer B-Lymphozyt

Reifer B-Lymphozyt

Aktiver Lymphozyt

Helfer T-Lymphozyt

Klonale Deletion oder Inaktivierung

Klonale Deletion

Autoantigen

Fremdantigen

Stimulation


14

Trotzdem entstehen immer wieder Situationen, z.B. bei Autoimmunerkrankungen, in denen das

Immunsystem dennoch auf körpereigene Antigene reagiert. Mögliche Ursache für die veränderte

Immunogenität der Antigene können eine abweichende Abundanz, aberrante Lokalisation oder das

Auftreten neuer modifizierter Isoformen etc. sein (van der Bruggen und Van den Eynde 1992). So

kann auch bei Krebspatienten häufig eine Antwort gegen körpereigene Proteine, so genannte

Tumorantigene, welche vom Tumor in veränderter Form oder Abundanz exprimiert werden,

beobachtet werden. Diese Tumorantigene werden, je nach Ursache für die Immunogenität, grob in

verschiedene Gruppen eingeteilt: Differenzierungsantigene, Amplifizierungsantigene, Mutations- und

Spleißvariantenantigene, virale Antigene und cancer-testis-Antigene (Piura und Piura 2010).

Allerdings sind die zu Grunde liegenden Faktoren, wann eine humorale Antwort bei Krebspatienten

ausgelöst wird, noch nicht vollständig verstanden. Die Immunantwort auf Tumoren fällt für

gewöhnlich schwächer aus als bei infektiösen, entzündlichen Prozessen. Dennoch konnten

Antikörperantworten bei verschiedenen Tumoren gegen diverse Onkogene gefunden werden. So

wurden bei Patienten mit kolorektalen Karzinomen Antikörper gegen das c-myc Protein, gegen c-

erbB2 bei Brustkrebspatientinnen und gegen c-myb bei Patienten mit Lymphomen nachgewiesen

(Ben-Mahrez et al. 1990; Sorokine et al. 1991; Disis et al. 1994). Zusätzlich konnten bei einigen

Tumorerkrankungen Antikörper gegen nichtonkogene Proteine identifiziert werden, wie z.B. den

eukaryotischen Initiationsfaktor 4γ bei Lungenkarzinomen und eine neue Hyaluronidase in

Meningiomen (Brass et al. 1997). Mittlerweile sind auch Antikörper im Blut von Patienten mit

Gliomen nachgewiesen worden. So wurde bei Gliompatienten ein erhöhter Level von Autoantikörper

gegen das azide Gliafaserprotein beschrieben (Wei et al. 2013) und bei Patienten mit niedriggradigen

Gliomen gegen src-homology 3-domain GRB2-like 1 (Matsutani et al. 2012). Patienten mit

Glioblastomen zeigen zudem eine Antikörperantwort gegen die Proteine GLEA1, GLEA2 und PHF3

(Fischer et al. 2001; Struss et al. 2001; Pallasch et al. 2005). In einigen Studien konnte darüber hinaus

gezeigt werden, dass die Anwesenheit von bestimmten Tumor-infiltrierenden Lymphozyten mit einer

verbesserten Prognose bei Glioblastompatienten korreliert (Brooks et al. 1978; Boker et al. 1984).

Allerdings existieren ebenfalls Arbeiten, in denen ein gegenläufiger Effekt gezeigt wurde (Safdari et

al. 1985) oder die Ergebnisse nicht bestätigt werden konnten (Schiffer et al. 1979). In jedem Fall muss

davon ausgegangen werden, dass das Immunsystem der Patienten einen Einfluss auf den

Krankheitsverlauf nimmt und somit entscheidend zum Gesamtüberleben eines Patienten beitragen

könnte.


15

Charakterisierung der Tumorbiologie des Glioblastom 1.8.

mithilfe der Proteomanalyse

Die Veränderungen, die während der Tumorgenese beobachtet werden können, finden auf

verschiedenen molekularen Ebenen statt. In den letzten Jahren wurde daher vermehrt versucht

durch die Integration verschiedener OMICS-Methoden, wie z.B. der Genom-, Transkriptomananalyse

aber auch Proteom- und Metabolomanalyse, ein umfassendes Bild der Tumorbiologie des GBM zu

erstellen. Insbesondere der Proteomanalyse mit dem Schwerpunkt der Bestimmung der

Veränderungen auf der Ebene der Proteine kommt bei der Beschreibung des Phänotyps eine

besondere Rolle zu. Ziel der Proteomanalyse ist es, die Gesamtheit aller Proteine, die zu einem

definierten Zeitpunkt von einem Organismus oder Gewebe exprimiert werden, zu charakterisieren.

Das Proteom selbst wird durch zahlreiche Faktoren beeinflusst (z.B.: Umwelteinflüsse, Medikamente,

Stoffwechsel etc.), und befindet sich durch den ständigen Auf- und Abbau von Proteinen in einem

dynamischen Prozess (Anderson und Anderson 1996).

So existiert oft nicht nur ein Genprodukt, sondern teilweise auch viele, durch alternatives Spleißen

entstandene, Varianten (Missler und Sudhof 1998). Darüber hinaus korreliert auch die Menge der

mRNA nicht immer mit der Menge an exprimiertem Protein (Gygi et al. 1999). Zudem spielen

posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierungen, Glykosilierungen oder Acetylierungen

eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion und anderen wichtigen Vorgängen in der Zelle. Die

Proteomanalyse ist somit eine wichtige Ergänzung zur Analyse des Genoms, denn sie ermöglicht es,

Veränderungen zu beschreiben, die auf genomischer Ebene nicht erfassbar sind.

Mit der Proteomik sind in den letzten Jahren eine Reihe von Methoden entwickelt worden, welche

Analysen von hochkomplexen Proteingemischen ermöglichen. Die Anforderungen, die an ein System

gestellt werden, mit dem eine quantitative Erfassung von Expressionsänderungen in einer komplexen

Probe möglich ist, sind hoch. Nach Zuo et al. (2001) kann man von circa 10.000–20.000

Proteinspezies im Proteom einer einzigen Säugetierzelle ausgehen, deren Abundanz sich in einem

dynamischen Bereich von 7-8 Größenordnungen bewegt (Anderson und Anderson 1996). Klassische

Methoden der Proteomanalyse sind die 2D-Gelelektrophorese (Klose und Kobalz 1995) und

massenspektrometriebasierte Quantifizierungstechniken wie z.B. die markierungsfreie Analyse (Silva

et al. 2005) oder SILAC (Ong et al. 2002). All diesen Methoden wohnt inne, dass eine komplexe

Protein- oder Peptidmischung zunächst in verschiedene Dimensionen aufgetrennt wird und

anschließend Signalintensitäten für die separierten Analyten aufgezeichnet werden. Die


16

Quantifizierung eines Proteins/ Peptids kann dann über mehrere Proben hinweg anhand dieser

Signalintensitäten vorgenommen werden (Abbildung 1.8).

Abbildung 1.8: Übersicht verschiedener Methoden zur Proteinquantifizierung in der Proteomik. Neben der 2D-

Gelelektrophorese stehen auch diverse massenspektrometriebasierte Techniken zur Verfügung. Hierbei kann

zwischen Methoden, die sich der Markierung einer Probe mit schweren Isotopen bedienen, und markierungsfreien

Ansätzen unterschieden werden.

Der Massenspektrometrie kommt hier eine besondere Rolle zu. Durch die Entwicklung von weichen

Ionisierungsmethoden wie der MALDI- oder ESI-Technologie in den 1980er Jahren ist es möglich

geworden, Proteine mittels Massenspektrometrie zu analysieren. Dem Ansatz, die Proteine zunächst

in gering komplexen Mischungen intakt zu vermessen, ist einer Methode gewichen, Proteine vor

ihrer Analyse mittels einer Protease zu verdauen und die resultierenden Peptide dann nach HPLC-

Trennung mittels MS zu analysieren. Für die Massenanalyse wurden darüber hinaus in letzten Jahren

eine Vielzahl von Analysatoren, wie TOF-Instrumente, Ionenfallen, Triple-Quadrupole aber auch die

Orbitrap entwickelt und etabliert. Mit diesen Techniken sind umfassende Analysen der Proteine

sowohl mit gerichteten Methoden wie dem selected reaction monitoring (SRM) (Anderson und

Hunter 2006) als auch mit ungerichteten Methoden, wie z.B. markierungsfreier Quantifizierung,


17

möglich. Ein Vorteil der ungerichteten Methoden gegenüber der Gelelektrophorese besteht darin,

die Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen auf einer Methodenplattform zu vereinigen. So

wurden zunächst Methoden basierend auf der Isotopenverdünnung wie z.B. ICAT, SILAC, aber auch

markierungsfreie Methoden (z.B. Quantifizierung basierend auf der Intensität des Mutterions (Silva

et al. 2005) oder spectral counting (Liu et al. 2004) entwickelt. Mittlerweile hat sich aufgrund der

Reproduzierbarkeit und Robustheit von Massenspektrometrie und nanoHPLC die markierungsfreie

Massenspektrometrie als Standardmethode durchgesetzt. Sie erlaubt es, ohne weitere Manipulation

der Proteine in der Zellkultur oder durch chem. Modifikation, die biologische Probe direkt zu

vermessen. Dieser Aspekt hat sich insbesondere bei der Verwendung von klinischem Material als

vorteilhaft erwiesen (Shapiro et al. 2012; Martinez-Pinna et al. 2014).

Zunehmend nehmen aber auch Biochips, wie sie bereits in der DNA/RNA-Analyse weit verbreitet

sind, Einzug in die Proteomanalyse. In den letzten Jahren sind verschiedene Formate von Biochips,

wie z.B. Protein Arrays, Peptid Arrays, Antikörper Arrays und Gewebe Arrays, entwickelt worden, die

je nach Typ für unterschiedliche Anwendungen geeignet sind. Diese Chips erlauben es, parallel

tausende von Proteinen hinsichtlich Protein-Antikörper, Protein-Protein oder Protein-Liganden

Interaktion zu überprüfen. So wurden Protein Arrays mittlerweile eingesetzt, um Protein-Protein-

Interaktionen zu charakterisieren (MacBeath und Schreiber 2000; Zhu et al. 2001), neue Biomarker

für Krankheiten zu detektieren (Lalive et al. 2006) und die Spezifität DNA-bindender Proteine zu

analysieren (Boutell et al. 2004). Darüber hinaus werden sie häufig eingesetzt, um die humorale

Immunantwort zu charakterisieren (Robinson et al. 2002; Sundaresh et al. 2006; Lubomirski et al.

2007), die Spezifität von Antikörpern zu testen (Michaud et al. 2003; Predki et al. 2005) und liefern

neue Erkenntnisse im Rahmen der Medikamentenentwicklung (He und Chiu 2003; Kumble 2003). So

stellen Protein Biochips mittlerweile z.B. eine interessante Alternative zu den bisher für die Detektion

von Autoantikörpern häufig verwendeten Phagenbibliotheken (Sahin et al. 1997) dar, da die

enthaltenen Proteine rekombinant in Insektenzellen hergestellt werden und somit auch

posttranslationale Modifikationen, welche relevante antigene Signaturen darstellen können,

enthalten (Predki et al. 2005).

Kapitel 2: Zielsetzung der Arbeit

18

2. Zielsetzung der Arbeit

Im Rahmen dieser Arbeit sollen mit Hilfe der Proteomanalyse Proteine identifiziert werden, die mit

dem Langzeitüberleben von Glioblastompatienten assoziiert sind. Diese Proteine sollen wichtige

Hilfestellung beim Verständnis der bisher erst zu einem Teil aufgeklärten zellulären und

immunologischen Mechanismen geben, die die Unterschiede in klinischen Verläufen von

Glioblastompatienten hervorrufen. Um dieses Ziel zu erreichen, sollen sowohl Analysen von

Tumorgewebe als auch von Plasmaproben verschiedener Patientenkollektive durchgeführt werden.

Spezielle Ziele umfassen:

Etablierung und Adaption einer Methode zur Analyse von Proteinfraktionen, erhalten bei der

Aufarbeitung von Tumorproben für die DNA-Analytik für die quantitative differentielle

Proteomanalyse, bestehend aus 2D-DIGE und Massenspektrometrie.

Erstellung des Proteomprofils von Langzeit- und Kurzzeitüberlebenden des Glioblastoms

durch markierungsfreie differentielle Proteomanalyse nach Einsatz der Lasermikrodissektion.

Identifizierung differentiell exprimierter Proteine im Tumorgewebe sowie deren

bioinformatische Charakterisierung mithilfe der Anreicherungsanalyse zur Bestimmung der

zugrundeliegenden biologischen Prozesse.

Ermittlung differentieller Proteine zwischen Glioblastomen von Langzeitüberlebenden in

Abhängigkeit der Mutation im IDH1 Gen mittels Lasermikrodissektion und markierungsfreier

massenspektrometriebasierter Proteomanalyse und deren bioinformatische Analyse mithilfe

der Anreicherungsanalyse zur Bestimmung der zugrundeliegenden biologischen Prozesse.

Die proteomanalytische Charakterisierung von Mausgliomstammzellen unter normalen und

sphärenbildenden Kulturbedingungen zur Etablierung eines Modells zur Untersuchung von

stammzellvermittelten Therapieresistenzen.

Die Untersuchung immunologischer Prozesse, die möglicherweise zu den unterschiedlichen

klinischen Verläufen beitragen, durch die Identifizierung von tumorassoziierten

Autoantigenen im Plasma von Glioblastompatienten durch den Nachweis von

Autoantikörpern.

Kapitel 3: Material und Methoden

19

3. Material und Methoden

Material 3.1.

3.1.1. Puffer und Lösungen

3.1.1.1. Zellaufschluss

2D-Probenpuffer 4x 1D-Probenpuffer

30 mM Tris Base 600 mM DTT 7 M Harnstoff 30 % Glycerin 2 M Thioharnstoff 12 % SDS 4% (w/v) CHAPS 150 mM Tris/HCl pH 8,5 mit HCl Wenig Bromphenolblau, pH 7.0

3.1.1.2. Gelelektrophorese

Separationsgel pH 2-11 Abschlussgel pH 2-11

3,5 % (w/v) Acrylamid 12,3 % (w/v) Acrylamid 0,3 % Piperazindiacrylamid 0,13 % Piperazindiacrylamid 9 M Harnstoff 9 M Harnstoff 5,0% (w/v) Glycerin 5,0% (w/v) Glycerin 0,06 % (v/v) TEMED 0,06 % (v/v) TEMED 4,0 % (v/v) Trägerampholytmix 4,0 % (v/v) Trägerampholytmix 0,03 % (w/v) APS 0,02 % (w/v) APS

Trägerampholytmix Sephadex-Suspension

8 mL Ampholine pH 3,5-10 20 g Sephadex 8 mL Servalyt pH 2-11 Gelöst in 25 % Glycerin 16 mL Pharmalyt pH 5-8 24 mL Pharmalyt pH 4-6,5

Sephadexlösung IEF Schutzlösung

270 mg Sephadex-Suspension 30 % Harnstoff 25 µl DTT (1,4 M) 5 % Glycerin 25 µl Trägerampholytmix 2 % Servalyt 2-4 311 mg Harnstoff/Thioharnstoff

Kathodenpuffer IEF Anodenpuffer IEF

3 M Harnstoff 9 M Harnstoff 0,742 M Phosphorsäure 5 % (v/v) Ethylendiamin 5 % (v/v) Glycerin

2D-Schutzlösung Inkubationspuffer

375 mM Tris Base 125 mM Tris Base 375 mM Tris HCl 40 % Glycerin 3,5 mM SDS 65 mM DTT 104 mM SDS


20

Trenngel Sammelgel

15 % Acrylamid 4 % Acrylamid 0,2 % Bisacrylamid 0,05 % Bisacrylamid 0,08 % APS 0,3 % APS ansetzen mit SDS Gelpuffer ansetzen mit SDS Gelpuffer filtrieren und entgasen filtrieren und entgasen

SDS-Gelpuffer 10x Laufpuffer für PAGE

750 mM Tris Base 250 mM Tris Base 750 mM Tris HCl 1,92 M Glycin 0,06 % TEMED 35 mM SDS 7 mM SDS

3.1.1.3. Silberfärbung

Fixierung Inkubationslösung

50 % (v/v) Ethanol absolut 0,5M Natriumacetat 10 % (v/v) Essigsäure 0,2 % (w/v) Natriumthiosulfat 30,0 % (v/v) Ethanol

Färbelösung Spüllösung

0,1 % (w/v) Silbernitrat 2,5 % (w/v) Natriumcarbonat

Entwickler Stopplösung

2,5 % (w/v) Natriumcarbonat 0,05 M EDTA 0,1 % (v/v) Formaldehyd

3.1.1.4. Massenspektrometrie

Waschlösung A Waschlösung B

10 mM Ammoniumhydrogencarbonat 5 mM Ammoniumhydrogencarbonat 50 % Acetonitril

Entfärbungslösung Trypsinlösung

15 mM Natriumthiosulfat 20 µg Trypsin 50 mM Kaliumhexacyanoferrat 600 µL Waschlösung A

DTT-Lösung Iodacetamid-Lösung

10 mM DTT 55 mM Iodacetamid 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat

3.1.1.5. Westernblotanalyse

Kathodenpuffer für Blot Anodenpuffer für Blot

300 mM Aminocapronsäure 300 mM Tris Base 30 mM Tris Base 100 mM Tricine

TBS Puffer Blockingpuffer

50 mM Tris Base 3 % (w/v) Milchpulver 150 mM NaCl 1 % (w/v) BSA 0,1 % (v/v) Tween 20 % in TBS pH 8,0 mit HCl


21

3.1.1.6. ProtoArray-Analyse

Block Puffer für ProtoArray Wasch Puffer für ProtoArray

50 mM HEPES pH 7,5 1 x PBS 200 mM NaCl 1 x Synthetic Block 0,08 % Triton X-100 0,1 % Tween 20 25 % Glycerin 20 mM Reduziertes Glutathion 1 mM DTT 1 x Synthetic Block

3.1.1.7. ELISA

Beschichtungspuffer

100 mM Natriumcarbonat 100 mM Natriumbicarbonat pH 9.6

3.1.2. Laborgeräte und Verbrauchsmaterialien

Bruker Daltonics HCT plus Ionenfalle Bruker Daltonik, Bremen, Deutschland

Array-Scanner FR202 Strix Diagnostics GmbH, Berlin, Deutschland

Aminosäure-Analyse Waters, Milford, USA

CapSure Macro LCM Caps Life Technologies, Carlsbad, USA

Durchlichtscanner (PowerLook 2100) Umax Data Systems Inc., Taiwan

ECL Hyperfilm GE Healthcare, München, Deutschland

Einmalküvetten (halbmikro) Sarstedt, Nürnberg, Deutschland

ESI Nadeln New Objective, Woburn, USA

Fluoreszenzscanner Typhoon Trio GE Healthcare, München, Deutschland

HPLC Säule 15 cm Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland

HPLC Säule 25 cm Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland

IEF-Glasröhrchen Schott Medica, Wertheim, Deutschland

IEF-Kammern Selbstbau nach Klose, Werkstatt Ruhr-Universität Bochum, Bochum, Deutschland

Arcturus PixCell II LCM System Life Technologies, Carlsbad, USA

Lasermikrodissektionsmikroskop LMD6500 Leica, Wetzlar, Deutschland

LTQ OrbitrapElite Massenspektrometer Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland

Heparin Röhrchen Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

Mikrotiterplatten Greiner, Frickenhausen, Deutschland

Mikrotiterplattenleser Multimode DTX880 Beckman-Coulter, Krefeld, Deutschland

Multifuge 3S-R Heraeus, Hanau, Deuschland

Objektträger für Mikrodissektion Leica, Wetzlar, Deutschland

PAGE-Kammer, 1D-PAGE Life Technologies, Carlsbad, USA

PAGE-Kammer, 2D-PAGE Desaga, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

ProtoArray Human Protein Microarray v5.0 Life Technologies, Carlsbad, USA

PVDF Membran Immobilon-FL Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland

RSLCnanoTM UltiMate 3000 HPLC Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland

Spannungsgerät 1 D-PAGE GE Healthcare, München, Deutschland


22

Spannungsgerät IEF und 2 D-PAGE VWR, Darmstadt, Deutschland

Spektrometer Spectronic 200 Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland

Tris-Glycin-SDS Fertiggele (4-20 %, 1,5 mm) Anamed, Darmstadt, Deutschland

UltiMate 3000 HPLC Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland

Ultraschallbad Bandelin, Berlin, Deuschland

Vakuumkonzentrator Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Kartuschenvorsäule Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland

Kapillarvorsäule Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland

X-Bridge Säule Waters, Milford, USA

Zentrifugationsfiltereinheit MicroconTM YM-10 Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Zentrifuge Eppendorf, Hamburg, Deutschland

3.1.3. Software

DeCyder 2D 6.0 GE Healthcare, München, Deutschland

Chromeleon Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland

Esquire Control 6.1 Bruker Daltonik, Bremen, Deutschland

GenePix 6.0 microarray image analysis

Molecular Devices GmbH, Biberach an der Riss, Germany

ImageQuantTM Software GE Healthcare, München, Deutschland

Mascot Matrix Science, London, UK

Progenesis Nonlinear Dynamics

ProteinScapeTM 1.3 Proteom Datenbank

Bruker Daltonik, Bremen, Deutschland

Proteome Discoverer Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland

ProtoArray Prospector V5.2 Life Technologies, Carlsbad, USA

Tune/ X-Calibur Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland


23

3.1.4. Chemikalienliste

1,4-Dithiothreitol (DTT) BioRad, München, Deutschland

AccQ-Tag Waters, Milford, USA

Aceton Merck, Darmstadt, Deutschland

Acetonitril Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Acrylamid (für die IEF) BioRad, München, Deutschland

Acrylamid-Bis Lösung (30 % Acrylamid, 0,4 % Bis) für SDS-PAGE

Serva, Heidelberg, Deutschland

Agarose BioRad, München, Deutschland

Ameisensäure Merck, Darmstadt, Deutschland

Amersham ECL PlusTM Western-Blotting Detection System

GE Healthcare, München, Deutschland

Aminocapronsäure Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Ammoniumhydrogencarbonat Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Ammoniumperoxodisulfat (APS) BioRad, München, Deutschland

Ampholine pH 3,5-10 GE Healthcare, München, Deutschland

BioRad Protein Assay BioRad, München, Deutschland

Bromphenolblau BioRad, München, Deutschland

BSA Typ VH Gerbu, Gaiberg, Deutschland

CHAPS Serva, Heidelberg, Deutschland

Cy- Farbstoffe für die Minimalmarkierung GE Healthcare, München, Deutschland

DMF Sigma-Aldrich, München, Deutschland

EDTA Merck, Darmstadt, Deutschland

ELISA Ultrablock AbD Serotec, Pucheim, Deutschland

Essigsäure 100 % Merck, Darmstadt, Deutschland

Ethanol absolut Merck, Darmstadt, Deutschland

Ethanol MEK vergällt Merck, Darmstadt, Deutschland

Ethylendiamin Merck, Darmstadt, Deutschland

FA Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Formaldehydlösung 37 % säurefrei Merck, Darmstadt, Deutschland

Glutathion Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Glycerin wasserfrei Merck, Darmstadt, Deutschland

Glycin Serva, Heidelberg, Deutschland

Hämatoxilin Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Harnstoff (für die IEF-Gele) BioRad, München, Deutschland

Harnstoff (für IEF-Puffer) Merck, Darmstadt, Deutschland

HCl Merck, Darmstadt, Deutschland

HEPES Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Interner Standard ASA Waters, Milford, USA

Iodacetamid Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Kaliumchlorid Merck, Darmstadt, Deutschland

Kaliumhexacyanoferrat Merck, Darmstadt, Deutschland

Lysin Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Magnesiumsulfat-Hexahydrat Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Methanol Merck, Darmstadt, Deutschland


24

Milchpulver AppliChem, Darmstadt, Deutschland

N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) BioRad, München, Deutschland

Natriumacetat Merck, Darmstadt, Deutschland

Natriumacetatpuffer für ASA Waters, Milford, USA

Natriumcarbonat Merck, Darmstadt, Deutschland

Natriumbicarbonat Merck, Darmstadt, Deutschland

Natriumchlorid Merck, Darmstadt, Deutschland

Natriumdodecylsulfat (SDS) Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Natriumthiosulfat Sigma-Aldrich, München, Deutschland

N-Tris(hydroxymethyl)methylglycin (Tricine) Sigma-Aldrich, München, Deutschland

PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific, Bonn, Deutschland

PBS, pH 7,4 Life Technologies, Darmstadt, Deutschand

Pharmalyt 4-6,5 GE Healthcare, München, Deutschland

Pharmalyt 5-8 GE Healthcare, München, Deutschland

Phenol Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Phosphorsäure Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Piperazin Diacrylamid BioRad, München, Deutschland

Rekombinantes ERBB2 ProQuinase, Freiburg, Deutschland

Rekombinantes FABP3 Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Rekombinantes FHL1 OriGene, Rockville, USA

Rekombinantes MAPK1 Life Technologies, Darmstadt, Deutschand

Schwefelsäure Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Sephadex GE Healthcare, München, Deutschland

Servalyt 2-11 Serva, Heidelberg, Deutschland

Servalyt 2-4 Serva, Heidelberg, Deutschland

Silbernitrat Merck, Darmstadt, Deutschland

Synthetic Block Life Technologies, Darmstadt, Deutschand

TFA Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Thioharnstoff Merck, Darmstadt, Deutschland

TMB Ultra Thermo Fisher Scientific, Bonn, Deutschland

Trifluoressigsäure Merck, Darmstadt, Deutschland

Tris HCl Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Tris(hydroxymethyl-)aminomethan (Tris Base) Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Triton X-100 Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Trypsin (aus Schweinepankreas) Promega, Mannheim, Deutschland

Tween 20 Sigma-Aldrich, München, Deutschland

Xylol Sigma-Aldrich, München, Deutschland


25

3.1.5. Antikörper & Zelllinien

Tabelle 3.1: Verwendete Antikörper

Antigen Firma Bestellnummer Spezies Verdünnung Experiment

CAPG Sigma HPA019080 Kaninchen 1:300 Primärer AK/ Immunoblotting

SFPQ Antikörper-online.de

ABIN183984 Kaninchen 1,25 µg/ml Primärer AK/ Immunoblotting

MitoProfile Total OXPHOS Human

AB Ab110411 Maus 1:500 Primärer AK/ Immunoblotting

Anti Kaninchen

Cell signaling 7074 Ziege 1:7500 Sekundärer AK/ Immunoblotting

Alexa Fluor 555 Anti-Maus IgG

Invitrogen A21424 Ziege 1:5000 Sekundärer AK/ Immunoblotting

Alexa FluorR 647 Anti-Human IgG

Invitrogen A21445 Ziege 1µg/mL Sekundärer AK/ Protein Array

HRP Anti-Human IgG

Dianova 109-036-044 Ziege 1:1000 Sekundärer AK/ ELISA

Tabelle 3.2: Verwendete Zelllinien

Zellinie Bezugsquelle Ursprungsorganismus Literatur

A172 ATCC: CRL-1620 Homo sapiens Giard et al. (1973) T98G ATCC: CRL-1690 Homo sapiens Stein (1979) GL-261 Zur Verfügung gestellt von X.

Breakefield (Boston, MA, USA)

Mus musculus Ausman et al. (1970)

SMA-497 Zur Verfügung gestellt von Dr. D. Bigner (Durham, NC, USA)

Mus musculus Serano et al. (1980)






26

Methoden 3.2.

3.2.1. Methoden zur Probenvorbereitung

3.2.1.1. Aufarbeitung der Proteinfraktion für die Proteomanalyse

Für die differentielle Proteomanalyse von Tumorgewebe von Langzeit- bzw. Kurzzeitüberlebenden

des Glioblastoms mittels 2D-PAGE wurden Proteinfraktionen, welche bei der Aufarbeitung von

DNA/RNA entstehen, etabliert. Dieses Vorgehen ermöglichte sowohl einen möglichst effizienten

Materialeinsatz des zum Teil knappen Tumormaterials als auch, aufgrund der Untersuchung

desselben Patientenmaterials, eine bessere Vergleichbarkeit von Daten aus der DNA, RNA und

Proteinanalyse. Um Störungen bei der isoelektrischen Fokussierung zu vermeiden, wurde die Salzlast

der Proteinfraktionen (4 M Guanidinisothiocyanat mit Cäsiumchlorid) vor dem Einsatz in der 2D-

PAGE reduziert (Grzendowski et al. 2009). Dazu wurde die Proteinfraktion durch Ultrafiltration mit

Microcon™ YM-10 Filtern aufkonzentriert (Durchlassgrenze von 10 kDa). 100 μl der Proteinfraktionen

wurden dazu in einem Microcon™-Filter pipettiert und anschließend zentrifugiert (120 min, 4°C,

14.000 x g). Nach Ende der Zentrifugation wurden 100 μl 2D-Probenpuffer zugefügt, die Filtereinheit

umgekehrt, in ein neues Probengefäß verbracht und ein weiteres Mal kurz zentrifugiert. Im Anschluss

wurde der Proteingehalt der Proteinfraktionen mit dem BioRad Protein Assay nach Bradford

bestimmt (siehe 3.2.2.1).

3.2.1.2. Laser Mikrodissektion

Die Laser Mikrodissektion ist ein mikroskopisches Verfahren, bei dem durch Verwendung eines

Lasers definierte Bereiche und/oder einzelne Zellen aus einem Gewebeverbund herausgelöst werden

können. Dieses Verfahren ist sowohl auf kryofixiertes Gewebe, auf formalin-fixiertes in Paraffin-

eingebettetes Gewebe als auch, unter bestimmten Voraussetzungen, auf lebende Zellkulturen

anwendbar. Im Rahmen diese Arbeit wurden zwei unterschiedliche Systeme angewendet.

Laser Capture Mikrodissektion mit einem Gerät der Firma Arcturus

Bei der Laser Capture Mikrodissektion der Firma Arcturus wird der zu isolierenden Bereich des

Gewebes mithilfe eines Infrarot-Lasers auf eine thermoplastische Membran geschmolzen. Dabei

verbindet sich die inerte Membran mit dem darunterliegenden Gewebeausschnitt und kann im

darauffolgenden Schritt samt Gewebe herausgelöst werden.


27

Für die Laser Capture Mikrodissektion wurden 7 µm dicke Schnitte mit einem Mikrotom angefertigt

und auf einen, für die Mikrodissektion geeigneten Objektträger, verbracht. Die Schnitte wurden

anschließend nach folgendem Schema (Tabelle 3.3) mit Hämatoxylin gefärbt:

Tabelle 3.3: Färbeprotokoll für Gewebeschnitte

Zeit Lösung

30'' 75% Ethanol

30'' Wasser

30'' Hämatoxylin (1:1000 verdünnt in H2O)

30'' Wasser

30'' 75% Ethanol

30'' 95% Ethanol

Ein weiterer Schnitt wurde als Referenz mit Hämatoxilin-Eosin angefärbt und tumorhaltige Bereiche

vom Neuropathologen angezeichnet. Anschließend wurden ca. 10 mm2 Zellen anhand der Vorlage

mit einem Arcturus PixCell II Gerät ausgelasert. Hierfür wurden Macro Caps und eine Laserintensität

von maximal 65 V verwendet. Für die Extraktion der Proteine von der Folie des Caps wurden 20 µL

2D-Probenpuffer auf das Cap pipettiert und die Probe mit 6x10 s Ultraschall im Eisbad und

intensivem Vortexen behandelt (Schritte wurden bei Bedarf wiederholt). Anschließend wurde die

Probe für 5 min bei 2.000 x g zentrifugiert und das Cap verworfen. Die Probe wurde bis zur weiteren

Verwendung bei -80°C gelagert.

Laser Mikrodissektion mit einem Gerät der Firma Leica

Das Gerät der Firma Leica verwendet spezielle Objektträger, welche aus einer dünnen, inerten Folie

bestehen, auf die die Gewebeschnitte zunächst aufgebracht werden müssen. Im Verlauf der

Mikrodissektion werden sowohl Gewebe als auch Folie mit Hilfe des Lasers durchschnitten und das

gewünschte Gewebestück fällt samt Folie mittels Gravitation in das darunter bereitgestellte

Reaktionsgefäß.

Für die Laser Mikrodissektion von Glioblastomen mit dem Gerät der Firma Leica wurden in der

Neuropathologie der Universitätsklinik Düsseldorf je 10 konsekutive Schnitte (7 µm Dicke) eines

Tumors auf spezielle Objektträger für die Mikrodissektion aufgebracht. Ein elfter Schnitt wurde mit

Hämatoxilin-Eosin gefärbt und tumorhaltige Bereiche vom Neuropathologen markiert. Für jede

Probe wurde in ein Reaktionsgefäß 20 µL 2D-Probenpuffer vorgelegt und anhand der markierten

Vorlage die entsprechenden Bereiche aus dem Gewebe ausgeschnitten. Für die finale

markierungsfreie Studie wurde, basierend auf den Ergebnissen der Methodenoptimierung,

angestrebt, pro Patient mindestens 10 mm2 Material zu gewinnen. Hierfür wurden je nach


28

Tumorgröße 5-7 Schnitte desselben Patienten vereint. Die am Gerät gewählten

Parametereinstellungen können der Tabelle 3.4 entnommen werden.

Tabelle 3.4: Einstellungen für die Lasermikrodissektion

Parameter Wert

Power 40 µJ

Aperture 23

Speed 26

Pulsfrequenz 964 Hz

Offset 60

Vergrößerung 10x

Die Proben wurden bis zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert.

3.2.1.3. Zellaufschluss von mikrodissektiertem Gewebe für die

markierungsfreie Quantifizierung

Für den Zellaufschluss wurden die mit 2D-Probenpuffer versetzten Gewebestücke für 6x10 s mit

Ultraschall im Eisbad behandelt. Daran anschließend wurde für 15 min bei 16.000 x g und 4°C

zentrifugiert und der Überstand in frische Reaktionsgefäße überführt. Von jeder Probe wurden

10 mm2 mikrodissektiertes Gewebe mit 4 x 1D-Probenpuffer versetzt und für 10 min bei 40 °C

inkubiert. Die weitere Prozessierung erfolgte analog zu 3.2.3.1, jedoch wurde die Trennung kurz nach

dem vollständigen Einlaufen der Proben in das Gel abgebrochen. Zur Visualisierung der Proben im

Gel wurden diese silbergefärbt.

3.2.1.4. Sammlung von Plasma

Für die Detektion von Autoantikörpern im Plasma von Glioblastompatienten wurde im Rahmen des

Deutschen Gliomnetzwerkes in den klinischen Zentren für die Sammlung von Plasma ein

standardisiertes Protokoll etabliert: Innerhalb eines 90 minütigen Zeitfensters wurden den Patienten

zwei 9 mL Heparin-Röhrchen Blut abgenommen und bei 3.000 x g für 15 min bei Raumtemperatur

zentrifugiert. Der Überstand wurde anschließend in 1 mL Aliquots aufgeteilt und bei -80°C bis zur

weiteren Verwendung gelagert. Darüber hinaus wurden umfassende Patientendaten, wie z.B. Alter,

Geschlecht, Resektionsausmaß und Karnofsky Performance Score (KPS), erhoben und dokumentiert.

Für die Proteinarray-basierte Studie wurde bei der Auswahl der 20 neu diagnostizierten

Glioblastompatienten, der 20 Patienten, deren Diagnose bereits mindestens zwei Jahre zurücklag,

sowie den 20 nicht tumorerkrankten Kontrollen auf eine gleiche Verteilung der o.g. Kriterien in den

jeweiligen Gruppen geachtet.


29

3.2.1.1. Präparation für massenspektrometrische Analysen

Für die massenspektrometrischen Analysen wurden 2D-Proteinspots entweder nach Visualisierung

durch Silberfärbung oder durch Unterlegen eines Ausdrucks des Fluoreszenzscans in Originalgröße

mit Stanzen (Ø 0,5 cm, 1 cm oder 1,5 cm) ausgestochen. Um eine Kontamination der Proben durch

Fremdproteine zu vermeiden, wurde die Stanze nach jedem Schritt gereinigt. Für die

markierungsfreie Analyse wurden die silberangefärbten Gelbanden des 1D-Kurzgels mit Hilfe eines

Skalpells ausgeschnitten und in Verdauröhrchen überführt. Gelstücke aus silbergefärbten Gelen

wurden mit Entfärbungslösung entfärbt. Hierfür wurden auf jeden Gelspot 15-30 µL der Lösung

gegeben und die Flüssigkeit nach einminütiger Inkubation wieder abgenommen. Daran anschließend

wurden die Gelstücke gewaschen, indem sie abwechselnd für je 10 min mit je 10-30 µL der

Waschlösung A oder der Waschlösung B inkubiert wurden. Abschließend wurden die Gelstücke für

30-45 min im Vakuumkonzentrator eingetrocknet. Für die markierungsfreie, quantitative Analyse

wurden die Proben zusätzlich mit 50 µL DTT-Lösung reduziert (45 min bei 56°C) und anschließend die

Cysteine durch 50 µL Iodacetamid-Lösung carbamidomethyliert (30 min bei RT, abgedunkelt). Darauf

folgend wurde erneut abwechselnd für je 10 min mit je 10-30 µL der Waschlösung A oder der

Waschlösung B inkubiert und die Gelstücke anschließend für 30-45 min im Vakuumkonzentrator

eingetrocknet. Für die Präparation zur späteren Analyse mittels nano-HPLC ESI MS/MS wurden die

Gelstücke, durch Zugabe von je 2-6 µL Trypsinlösung (0,033 µg/µL) bei 37 °C über Nacht verdaut. Für

die Extraktion wurden die Gelstücke mit 10 µl einer Lösung von Acetonitril und 0,1 %iger TFA (50:50,

v/v) versetzt und 15 min mit Ultraschall behandelt. Der Überstand wurde abgenommen und das

Gelstück erneut mit 10 µL Lösung versetzt und für 15 min mit Ultraschall behandelt. Die Überstände

wurden vereinigt und das Acetonitril im Vakuumkonzentrator entfernt.

3.2.2. Methoden zur Proteinkonzentrationsbestimmung

3.2.2.1. Proteinkonzenztrationsbestimmung nach Bradford

Zur Bestimmung der Proteinkonzentration der Proben wurde der Proteinassay nach Bradford

eingesetzt. Dieser beruht auf der Verschiebung des Absorptionsmaximums von Coomassie Brilliant

Blue G-250 (Triarylmethanfarbstoff) von 465 zu 595 nm bei Bindung an Proteine (Farbverschiebung

von Rotbraun nach Blau). Zunächst wurde eine Konzentrationsreihe durch Verdünnung einer BSA

Stammlösung (10 µg/µL) erstellt (siehe Tabelle 3.5).


30

Tabelle 3.5: Ansatzschema zur Erstellung einer Eichreihe für die Proteinbestimmung nach Bradford

Konzentration [µg/µL]

Stammlösung BSA [µL]

H2O [µL]

0 0 0 0,25 25 25 0,50 50 50 0,75 75 75 1,00 100 100 1,25 125 125 1,50 150 150 1,75 175 175 2,00 200 200

Die Proben sollten eine Proteinkonzentration im Bereich von 0,2 – 2 µg/µL aufweisen. In alle

Küvetten wurden 800 µL H2O vorgelegt. Dann wurden jeweils 200 µL Bradford Reagenz (BioRad

Protein Assay) und anschließend 10 µL der Konzentrationsreihe zugegeben, kurz gemischt und sofort

die Extinktion bei 595 nm gemessen. Für die Messung der Proben wurden anstatt der

Konzentrationsreihe je 10 µL einer entsprechenden Verdünnung der Probe zugegeben.

3.2.2.2. Aminosäureanalyse

Mit der Aminosäureanalyse (ASA) lässt sich neben der Proteinmenge auch die

Aminosäurezusammensetzung einer Probe bestimmen. Hierfür werden die einzelnen Aminosäuren

der Proteine und/oder der Peptide mittels sauerer Hydrolyse freigesetzt, mit einem Fluorophor

markiert und über eine C18-Säule mittels HPLC aufgetrennt. Die getrennten Aminosäurederivate

können dann durch ihr Absorptionssignal im UV-Chromatogramm detektiert und anhand der

enthaltenen Signalintensitäten quantifiziert werden

Im Vorfeld der Analyse wurden alle verwendeten Probengefäße bei 400 °C für mindestens 4 h erhitzt,

(Muffelofen), um Kontaminationen zu entfernen. Die Probe wurde auf den Boden eines kleinen

Reagenzglases pipettiert und vollständig im Eppendorf Konzentrator eingeengt. Für die saure

Gasphasenhydrolyse wurde das Reagenzglas mittels einer Pinzette in ein Vakuumgefäß überführt.

Dann wurden 500 µl 6 N HCl und 5 Phenolkristalle als Antioxidans in das Vakuumgefäß gegeben. Das

Vakuumgefäß wurde verschlossen und für eine vollständige Entfernung des Sauerstoffs an eine

Vakuumpumpe angeschlossen und dreimal unter Argon evakuiert. Die Hydrolyse erfolgte für 60 min

bei 180°C in einem Trockenschrank. Überschüssiges HCl wurde im Anschluss über die Vakuumpumpe

entfernt. Als Hydrolysekontrolle wurden parallel stets 0.5 µg BSA hydrolysiert. Die hydrolisierte

Probe wurde in 10 µl 20 mM HCl gelöst. Zur gelösten Probe wurden nun 30 µl Interner Standard

gegeben. Die Derivatisierung erfolgte nach Zugabe von 10 µl AccQ-Tag Reagenz im verschlossenen

Reagenzglas für 10 min bei 56 °C und 200 rpm. Die derivatisierte Probe wurde anschließend in

spezielle Probengefäße überführt. Pro Analyse wurden je 10 µl Probe auf die X-Bridge Säule injiziert


31

und bei einer Flussrate von 300 µl/min und 37 °C über einen AccQ-TagTM (Natriumacetatpuffer pH

5.0)/ Acetonitril Gradienten separiert und eluiert (siehe Tabelle 3.6). Die Detektion der

derivatisierten Aminosäuren erfolgte fluorometrisch (Extinktion 250nm, Emission 395nm).

Tabelle 3.6: HPLC Gradient für die Aminosäure-Analyse

Zeit [min]

AccQ-TagTM [%]

Acetonitril [%]

H2O [%]

0.5 99 1 0 24 95 5 0 29 91 9 0

39.5 83 17 0 48 0 60 40 51 100 0 0 60 100 0 0

Die anschließende Auswertung und Quantifizierung erfolgte mittels der Software Millenium 32 4.0

der Firma Waters.

3.2.3. Methoden zur Proteintrennung

3.2.3.1. Proteintrennung mittels 1D-SDS PAGE

Zur schnellen qualitativen Überprüfung von Proben wurde die eindimensionale SDS PAGE verwendet.

Hierbei werden die Proteine eines Proteingemischs zunächst durch Beladung mit dem anionischen

Detergenz SDS denaturiert und ihre Eigenladung maskiert. Anschließend wird die Probe auf ein

Polyacrylamidgel gegeben und die Proteine durch Anlegen einer Spannung entsprechend ihrer Größe

aufgetrennt.

Für die Polyacrylamidgelelektrophorese wurden Tris-Glycin-Fertiggele (4-20 %) von Anamed

eingesetzt. Die gewünschte Probenmenge (zwischen 10 und 20 µg) wurde mit 4 x Probenpuffer

versetzt und für 10 min bei 40 °C inkubiert. Nach dem Spülen der Taschen mit Laufpuffer wurden die

Gele beladen (inklusive 5 µL eines Größenstandards) und die Kammern mit 1 x Laufpuffer für die 1D-

PAGE befüllt. Der Eintritt der Proteine in das Gel erfolgte über 15 min bei 50 V/Gel und die

anschließende Trennung bei 60 mA/Gel.

3.2.3.2. 2D-PAGE

Bei der 2D-Gelelektrophorese werden die Proteine eines Proteingemischs zunächst mittels

isoelektrischer Fokussierung (IEF) entsprechend ihres isoelektrischen Punktes entlang eines pH-

Gradienten aufgetrennt. Anschließend erfolgt eine Trennung entsprechend des Molekulargewichtes

durch die oben beschriebene SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.


32

Die (ggf. fluoreszenzmarkierten) Proben wurden mit je 1/10 des Volumens an DTT und Servalyt 2-4

versetzt. Die Ansätze für ein Gel wurden vereinigt, gründlich durchmischt und kurz anzentrifugiert.

Für die IEF wurden präparative Rundgele mit einer Länge von 20 cm eingesetzt. Diese waren

mindestens drei Tage, maximal sieben Tage vor dem gewünschten Einsatz hergestellt worden. Im

basischen Bereich wurde das Separationsgel zum Schutz noch mit ca. 1 cm Abschlussgel

überschichtet. Zur Vermeidung von störenden Proteinpräzipitationen an der Auftragsstelle wurde vor

dem Probenauftrag 10 µL Sephadexlösung auf das Separationsgel aufgetragen. Anschließend wurden

die Proben auf das Gel aufgetragen und mit IEF Schutzlösung überschichtet. Die Kammer wurde mit

Anodenpuffer bzw. Kathodenpuffer für die IEF gefüllt und die Röhrchen mit Anodenpuffer aufgefüllt.

Danach wurde das Spannungsprogramm entsprechend der Röhrchenlänge gestartet (Tabelle 3.7):

Tabelle 3.7: Spannungsprogramm für die 20 cm IEF

Zeit Spannung

1 h 100 V

1 h 200 V

17,5 h 400 V

1 h 650 V

30 min 1000 V

10 min 1500 V

5 min 2000 V

Die Laufkammern wurden ggf. mit einer Schutzhülle abgedunkelt, um das Ausbleichen der

Fluoreszenzfarbstoffe zu verhindern. Im Anschluss an die Fokussierung wurden die Rundgele, nach

Abnahme des flüssigen Überstands, mit einem Polyacrylamidstopfen versehen und zur basischen

Seite ausgestoßen. Die IEF-Gelstränge wurden 10 min in Inkubationspuffer äquilibriert und dann

mehrfach mit 1 x Laufpuffer für die SDS PAGE gespült. Die Gele wurden entweder sofort mittels 2D-

SDS PAGE weiter prozessiert oder bis zur weiteren Verwendung für wenige Tage bei -80 °C gelagert.

Für die zweite Dimension wurden Trenngele mit den Maßen 20x30 cm inklusive 2 cm Sammelgel

verwendet, welche bereits am Tag vor der Gelelektrophorese gegossen wurden. Die Gele wurden bis

zur Verwendung mit 2D-Schutzlösung überschichtet. Für ein 2D-Experiment wurde das IEF-Gel

vorsichtig auf das SDS-Gel aufgebracht und mit einer 1 %igen Agaroselösung (mit Bromphenolblau)

fixiert. Die Laufkammern wurden mit 1 x Laufpuffer für die 2D-PAGE befüllt, die Gelkassetten

blasenfrei eingesetzt und die Kammern ggf. mit Schutzhüllen verdunkelt. Das Einwandern der

Proteine in das Gel erfolgte für 15 min bei 37,5 mA/Gel und die gesamte elektrophoretische

Trennung wurde bei 100 mA/Gel durchgeführt. Die Gelkammern wurden konstant auf 15°C

temperiert und die Trennstrecke betrug 30 cm bei einer Gelstärke von 1,5 mm.


33

3.2.3.3. Trennung niedrig-komplexer Proben mittels nano-HPLC

Jede Probe wurde mit 0,1 %iger TFA auf ein Volumen von 16 µl eingestellt. Für die Aufnahme der

Massenspektren mittels HPLC ESI-MS/MS, wurden die extrahierten Proben zunächst mittels online

Reversed-Phase nano-HPLC (Ultimate 3000, Dionex GmbH, Idstein, Deutschland) aufgetrennt. Hierfür

wurde eine Vorkonzentrierung über eine Vorsäule (Acclaim PepMap C18, 2 cm Länge, 75 µm

Innendurchmesser, 3 µm Partikelgröße, 100 Ǻ Porengröße) vorgenommen, die eigentliche Trennung

erfolgte über eine C18 Pepmap Säule (15 cm Länge, 75 µm Innendurchmesser, 3 µm Partikelgröße,

100 Ǻ Porengröße) mittels eines linearen Gradienten von B (84 % Acetonitril, 0,1% Ameisensäure)

über 60 min bei einer Flussrate von 300 nL/min.

3.2.3.4. Trennung hoch-komplexer Proben mittels nano-HPLC

Damit jeweils dieselbe Menge extrahierter Peptide auf die HPLC-Säule geladen wurde, wurde im

Vorfeld der Analyse von allen Proben eine Konzentrationsbestimmung mittels Aminosäureanalyse

(3.2.2.2) durchgeführt. Für die markierungsfreie Quantifizierung wurden 300 ng Probe mit 0,1% TFA

auf ein Endvolumen von 16 µL gebracht und zunächst mittels Reversed-Phase nano HPLC (RSLCnano

UltiMate 3000, Dionex GmbH, Idstein, Deutschland) getrennt. Hierfür wurden die Proben auf eine

C18 Vorsäule geladen (Acclaim PepMap C18, 2 cm Länge, 100 µm Innendurchmesser, 3 µm

Partikelgröße, 100 Å Porengröße) und für 10 min mit 0.1% TFA entsalzt. Anschließend wurde die

Vorsäule vor die analytische Hauptsäule (Acclaim PepMap RSLC C18; 25 cm Länge, 75 µm

Innendurchmesser, 2 µm Partikelgröße, 100 Å Porengröße) geschaltet und die Peptide im Verlauf von

120 min bei einer Flussrate von 300 nL/min aufgetrennt, bevor sie in das Massenspektrometer

gelangten. Die mobile Phase bestand aus 0,1% Ameisensäure in Wasser (Lösungsmittel A) bzw. 84%

Acetonitril, 0.1% Ameisensäure in Wasser (Lösungsmittel B). Der Gradient startete mit 4% B, wurde

innerhalb von 5 min auf 10% B, dann innerhalb von 62 min auf 20% B, weiteren 35 min auf 30% B, in

15 min auf 40% B und schließlich in 3 min auf 95% B angehoben.

3.2.4. Methoden zum Nachweis von Proteinen

3.2.4.1. Silberfärbung von Proteingelen

Die in den Gelen aufgetrennten Proteine wurden mit einer Silberfärbung nach (Heukeshoven und

Dernick 1988) gefärbt. Für die Silberfärbung wurden die Gele zunächst über Nacht in 50 mL

Fixierlösung eingelegt. Anschließend wurden die Gele 30 min in 50 mL Inkubationslösung belassen

und dann mit zweimal 100 mL Reinstwasser je 20 min gewaschen. Für die anschließende Färbung


34

wurden die Gele 30 min in 50 mL der Färbelösung geschüttelt und hinterher einige Sekunden erneut

mit Reinstwasser gewaschen. Es folgte ein einminütiger Spülschritt in 50 mL der Spüllösung und dann

die eigentliche Entwicklung durch ca. 7 min Inkubation in 50 mL Entwicklungslösung; bei beiden

Schritten wurde mit der Hand geschüttelt. Nach ausreichender Entwicklung wurde die Reaktion

durch Inkubation für 20 min in 50 mL der Stopplösung abgestoppt und abschließend

nochmals mindestens 10 min mit Reinstwasser gewaschen.

3.2.4.2. Fluoreszenzmarkierung von Proteinen

Für die spätere Visualisierung in der quantitativen 2D-PAGE wurden die Proben im Vorfeld der

Elektrophorese mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert.

Bei der hier eingesetzten Minimalfluoreszenzmarkierung finden spezielle Cyanin-

Fluoreszenzfarbstoffe Verwendung, die mit ihrer reaktiven Estergruppe kovalent an die ε-

Aminogruppe von Lysinen binden. Durch Einhalten eines bestimmten Protein-zu-Farbstoff

Verhältnisses werden nur etwa 3 % der Proteine markiert. Der Einsatz von drei unterschiedlich

fluoreszierenden Farbstoffen ermöglicht, dass mehrere Proben im selben Gel aufgetrennt und

unabhängig voneinander detektiert werden können, so dass diese Proben exakt dieselben

Bedingungen bei der Gelelektrophorese erfahren. Um ein Ausbleichen der Farbstoffe zu verhindern,

ist darauf zu achten, dass diese im Verlauf des Experiments stets lichtgeschützt sind.

Zunächst wurden die Proben mit den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt. Hierfür wurden

die Minimalfluoreszenzmarkierungssfarbstoffe entsprechend den Herstellerangaben mit DMF p.a.

angesetzt. Es wurden je 50 µg Probe und 1 µL des jeweiligen Farbstoffs (400 mM) eingesetzt. Die

Ansätze wurden 30 min abgedunkelt auf Eis inkubiert. Danach wurde 1 µL einer 10 mM Lysin-Lösung

zugegeben (Abstoppen der Reaktion) und weitere 10 min (abgedunkelt, auf Eis) inkubiert. Die

isoelektrische Fokussierung erfolgte direkt im Anschluss an die Kopplungsreaktion.

Mithilfe eines Fluoreszenzscanners wurden die Proteinmuster im Anschluss an die elektrophoretische

Trennung bei den entsprechenden Wellenlängen der Fluoreszenzfarbstoffe detektiert (siehe Tabelle

3.8).

Tabelle 3.8: Übersicht der eingesetzten Emissionsfilter zu Detektion der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe

Farbstoff Max. Absorption

[nm]

Emissionsfilter [nm]

Cy 2 491 520 BP 40 Cy 3 553 580 BP 30 Cy 5 645 670 BP 30


35

3.2.4.3. Nachweis von Proteinen mittels Massenspektromerie

Um Peptidmischungen geringer Komplexizität, insbesondere 2D-Spots, zu analysieren, wurde eine

3D-Ionenfalle verwendet. Dieser Gerätetyp zeichnet sich durch eine hohe Robustheit aus und erlaubt

eine vollautomatisierte Fragmentanalyse von Peptidionen.

Für die Elektrospray Ionisations Tandem Massenspektrometrie (ESI-MS/MS) wurde eine HCTultra

Ionenfalle der Firma Bruker Daltonics, welche mit einer Nanoelektrosprayionenquelle (Bruker

Daltonik) und online Nanospray Nadeln (FS360–20–10-D-20; New Objective, Woburn, MA, USA)

ausgestattet war, eingesetzt. Das Gerät wurde vor den Messungen über einen externen Standard

kalibriert. Die massenspektrometrischen Parameter sind Tabelle 3.9 zu entnehmen.

Tabelle 3.9: Massenspektrometrische Parameter für die ESI MS/MS-Analysen mit der HCTultra

Parameter Wert

Kapillarspannung 1000-1400 V Endkappenpotential 500 V Spülgasfluß 10.0 l/min Temperatur des Spülgases 160°C aimed ICC 150000 Maximale Fallenfüllzeit 500 ms

Für die MS/MS Analysen wurde die Software Esquire Control 6.1 (Bruker Daltonics) eingesetzt. Zur

Generierung von Fragmentionen wurde bei isolierten, mehrfach geladenen Peptidionen, welche eine

Intensität von 100.000 aufwiesen, niederenergetische kollisionsinduzierte Dissoziation (CID)

durchgeführt. Die Ausschlusszeit für vorher bereits selektierte Peptidionen betrug 1,2 min. Die

Massenspektren ergaben sich aus einer Aufsummierung von sieben individuellen Scans im Bereich

von m/z 300-1500 mit einer Scangeschwindigkeit von 8,100 (m/z)/s. Die MS/MS Spektren ergaben

sich aus einer Summe von vier Scans im Bereich von m/z 100-2200 bei einer Scangeschwindigkeit von

26,000 (m/z)/s.

3.2.5. Quantitative Nachweistechniken

3.2.5.1. Quantitativer Nachweis von Proteinen mittels Massenspektrometrie

Für die Proteomanalyse hochkomplexer Proteingemische und die markierungsfreie Quantifizierung

wurde ein Orbitrap EliteTM Hybrid Ionenfallen-Orbitrap Massenspektrometer eingesetzt, welches mit

einer nano-ESI-Quelle ausgestattet und online mit einem nano HPLC-System gekoppelt war. Dieses

Hybridmassenspektrometer besteht aus einer linearen Ionenfalle, welche in der Lage ist, sehr schnell


36

CID-Fragmentspektren aufzuzeichnen, sowie einer Orbitrap, in der hochauflösend und mit einer sehr

hohen Massengenauigkeit die Übersichtsspektren aufgenommen werden. Die Systemparameter sind

Tabelle 3.10 zu entnehmen.

Tabelle 3.10: Massenspektrometrische Parameter für die ESI MS/MS-Analysen mit der Orbitrap Elite

Parameter Wert

Spray Spannung 1,4 kV

Temperatur des ion transfer tube 275 °C

Druck des Kollisionsgases (Helium) 1.3 mTorr

Normalisierte Kollisionsenergie 35%

MS Scan Bereich 350-1700 m/z

MS Auflösung 60.000

Breite des Isolationsfenster für MS/MS 2 m/z

MS/MS Scan Bereich 150-2000 m/z

MS/MS Auflösung normal

Schwellenwert der Intensität für die MS/MS Auswahl 500 counts

Ausschlusszeit eines Ions nach Aufnahme eines MS/MS-Spektrums 45 sek

Das Orbitrap Elite Massenspektrometer wurde in einem Top 20 datenabhängigen Modus betrieben,

wobei einfach und höher als dreifach geladene Ionen von der weiteren Fragmentierung

ausgeschlossen wurden. In diesem Modus wählt das Gerät an einen MS Übersichtsscan

anschließend, die 20 intensivsten Signale für die Aufnahme von Fragmentspektren in der linearen

Ionenfalle aus. Für die interne Kalibrierung (Lock-Masse) wurde Dodecamethylcyclohexasiloxan

(445.120030 Th) aus der Raumluft verwendet.

3.2.5.2. Proteinblotting mit anschließender Immundetektion

Für einen hochsensitiven und spezifischen Nachweis und Quantifizierung von Kandidatenproteinen

wurde Proteinblotting in Verbindung mit anschließender Immundetektion eingesetzt. Hierbei werden

Proteine, nach der Trennung in einem 1D-SDS-PAGE Gel und anschließendem Transfer auf eine

Trägermembran, gezielt mit einen Antikörper nachgewiesen und quantifiziert. Der Nachweis der

Protein-Antikörper-Bindung findet meist durch sekundäre Antikörper statt, welche eine fluorophore

Gruppe oder ein Enzym zum chemiluminizenten Nachweis tragen.

Das Proteinblotting fand im Anschluss an eine 1D-SDS PAGE statt. Der Transfer der Proteine aus dem

Gel auf die PVDF-Membran erfolgte für 1 h bei 2 mA pro cm2 Gelfläche. Anschließend wurden

unspezifische Bindungsstellen auf der Membran mit Blockingpuffer für 1 h blockiert. Die Inkubation

mit dem primären Antikörper (siehe Tabelle 3.1) erfolgte bei 4°C über Nacht. Die Membran wurde


37

anschließend mit TBS Puffer für 3 x 15 min bei RT gewaschen. Im Anschluss erfolgte die Inkubation

mit dem sekundären Antikörper (siehe Tabelle 3.1) für 1 h bei RT, gefolgt von erneutem Waschen.

Die Detektion der Immunkomplexe erfolgte entweder durch Erzeugung von Chemilumineszenz mit

dem Amersham ECL PlusTM Western-Blotting Detection System und einem Amersham Hyperfilm ECL

oder durch Verwendung eines bereits fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpers und Scannen der

Blotmembran mit einem Fluoreszenzscanners.

3.2.5.3. Detektion von Immunkomplexen mittels Protein Microarrays

Für die Detektion autoimmunogener Proteine wurden die ProtoArray Human Protein Microarrays

v5.0 der Firma Invitrogen (jetzt Thermo Fisher) eingesetzt. Diese bieten die Möglichkeit, parallel über

9.000 potentielle Antigene simultan zu analysieren. Hierbei werden über ein Bacculovirus basiertes

Expressionssystem rekombinant in Insektenzellen hergestellte Proteine in Duplikaten auf

Objektträger aufgebracht. Zusätzlich werden diverse Kontrollen (z.B. Postitionierungspunkte,

humane IgG und anti-human IgG Gradienten) aufgedruckt (siehe Abbildung 3.1). Die Arrays werden

mit Plasma inkubiert und eine Antigen-Antikörperbindung über einen fluoreszenzmarkierten

Sekundärantikörper nachgewiesen.

Die Arrays wurden den Vorgaben des Herstellers entsprechend prozessiert. Jeder Array wurde

zunächst für 15 min bei 4°C und dann weitere 15 min bei RT equilibriert. Alle folgenden Schritte

erfolgten bei 4°C und bei 50 rpm auf einem kreisenden Schüttler. Zunächst wurde auf jeden Array

5 mL Block-Puffer gegeben und für 1 h inkubiert. Der Block-Puffer wurde vorsichtig abgenommen

und 5 mL Wasch-Puffer zugegeben und für weitere 5 min inkubiert. Nach dem Abnehmen des Puffers

wurden 5 mL einer 1:500 Verdünnung von Plasma in Wasch-Puffer zugegeben und für 90 min

inkubiert. Dann wurde die Probe abgenommen und insgesamt fünfmal für je 5 min mit Wasch-Puffer

gewaschen. Anschließend wurde mit 5 mL Sekundärantikörper (siehe Tabelle 3.1) für 90 min

inkubiert. Nach Abnehmen der Antikörperlösung wurde erneut fünfmal gewaschen und dann der

Array durch einminütiges Zentrifugieren bei 200 x g getrocknet. Abschließend erfolgte die Detektion

der Signale mit einem Array-Scanner FR202. Für die Aufnahme der Fluoreszenzintensität wurde die

Software GenePix 6.0 microarray image analysis eingesetzt. Hierfür wurde die Lot-spezifische

GenePix Array List Datei, welche von Life Technologies zur Verfügung gestellt wird, sowie die

Bilddateien der Arrays eingeladen und mit Hilfe der Postitionierungspunkte übereinander gelegt,

Spots detektiert und deren Größe ggf. angepasst bzw. fehlerhafte Spots von der Analyse

ausgeschlossen.


38

Abbildung 3.1: Aufbau eines ProtoArrays. Jeder Array besteht aus insgesamt 48 Subarrays welche jeweils aus

22x22 Spots bestehen. Alle Spots sind in Duplikaten gedruckt. Darüber hinaus befinden sich in jedem Subarray

Postitionierungspunkte, positiv und negativ Kontrollen sowie eine Verdünngsreihe von humanem anti-IgG.

3.2.5.4. Detektion von Immunkomplexen mittels ELISA

Für die Detektion einer Antikörperantwort in Plasmaproben wurde der Enzyme Linked

Immunosorbent Assay eingesetzt. Hierbei wird rekombinantes Protein adsorptiv an Mikrotiterplatten

gebunden und anschließend mit Plasma inkubiert. Die Detektion des Primärantikörpers erfolgt über

einen mit Meerrettichperoxidase gekoppelten humanen Zweitantikörper.

Rekombinantes Antigen wurden mit Beschichtungspuffer auf eine Konzentration von 0,3 ng/µL

verdünnt und je 100 µL in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte pipettiert. Die Bindung des Antigens

erfolgte bei 4 °C über Nacht. Anschließend wurde die Lösung entfernt und für 2 h mit je 150 µL ELISA

Ultrablock bei 4 °C geblockt. Jede Vertiefung wurde dann zweimal mit je 200 µL PBS mit 0,05 %

Tween 20 gespült. Die Plasmaproben wurden 1:500 mit PBS mit 0,05 % Tween 20 vorverdünnt und

jeweils 100 µL pro Vertiefung aufgetragen und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend

wurde weitere dreimal mit PBS mit 0,05 % Tween 20 gewaschen und dann mit je 100 µL

Sekundärantikörper (1:1000 verdünnt in PBS mit 0,05 % Tween 20; siehe Tabelle 3.1) für eine weitere

Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde erneut viermal mit PBS mit 0,05 % Tween 20

gewaschen und je 80 µL TMB Ultra in jede Vertiefung pipettiert. Nach ca. dreiminütiger Inkubation

Alexa Fluor 647 AB

(Block Positionen / Postitionierungspunkte)

Anti-human IgG Verdünnung

(Normalisierung / Bestimmung der IgG-Konzentration in der Probe)

Human IgG Verdünnung

(Normalisierung /Positivkontrolle für sek. AK)

Negativ Kontrollen

1

48


39

wurde die Reaktion mit je 40 µL 2 M Schwefelsäure gestoppt. Die Signaldetektion erfolgte im

Mikroplattenleser bei 450 nm.

3.2.6. Bioinformatische Datenanalyse

3.2.6.1. Softwaregestütze Auswertung der DIGE-Scans

Die eingescannten Gelbilder wurden mittels ImageQuantTM Software (GE Healthcare) für die

Bildanalyse beschnitten und anschließend die Bildauswertung mit Hilfe der DeCyder 2D 6.0 Software

(GE Healthcare) vorgenommen. Die Spot-Detektion und Quantifizierung wurde mit dem Differential

In-gel Analysis Modus der DeCyder Software durchgeführt. Die geschätzte Spotanzahl war hierbei auf

10.000 gesetzt, zusätzlich wurden Spots mit einem Volumen < 30.000 durch einen Ausschlussfilter

aussortiert. Der interne Standard, markiert mit dem Cy2 Farbstoff, wurde zur Standardisierung und

Normalisierung der einzelnen Spot-Intensitäten benutzt. Die anschließende statistische Analyse

(Student’s t-tests) der Spots wurde mit dem Biological Variation Analysis Modul der Software

ausgeführt. Als Proteine mit differentieller Abundanz wurden alle Proteinspots mit einem p-Wert

≤ 0,05 und mit einer Abundanzänderung von ≥ ±1,5 angesehen.

3.2.6.2. Proteinidentifizierung von Massenspektren der 3D Ionenfalle

Die Peaklisten der gemessenen MS/MS Spektren wurden mit der Software DataAnalysis 3.3 und den

voreingestellten Parametern generiert. Für die Identifikation von Peptiden und Proteinen wurde

unter Verwendung der ProteinScapeTM (Version 1.3, Bruker Daltonics) Software und der human

International Protein Index (Human IPI v.3.30 Decoy Datenbank, www.ebi.ac.uk) mithilfe des

Suchalgorithmus MASCOT (Version 2.2.0) Datenbanksuchen durchgeführt. Hier wurde eine Decoy-

Variante dieser Datenbank verwendet, die neben der humanen IPI eine Variante derselben

Datenbank enthält, in welcher die Aminosäuresequenzen aller Proteineinträge zufällig durchmischt

wurden. Für die Suche wurden folgende Parameter berücksichtigt:

Cystein modifiziert mit Propionamid

Variable Modifikationen in Folge von Methioninoxidation

Maximal eine ausgelassene Schnittstelle durch unvollständiger Trypsin-Spaltung

keine Details über Proteinmassen und pI aus der 2D- Elektrophorese.

Die Ergebnisse wurden über das Protein Extraktor Modul der Protein Scape Software

zusammengefasst. Dieses Modul entfernt automatisch Redundanzen in Proteineinträgen. Für die

http://www.ebi.ac.uk/


40

MS/MS Spektren wurde ein Ausschluss-Score von 22 sowie eine Massentoleranz von 1.2 Da für

Peptide und 0.6 Da für Fragmente festgelegt. Als identifiziert wurden Proteine erachtet, für die in

beiden Suchen mindestens 2 Peptide gefunden wurden, einen Mascot-Score >90 aufwiesen und

keine offensichtlichen Kontaminanten waren. (z.B. Keratin 1).

3.2.6.3. Proteinidentifizierung von Massenspektren des Hybrid Ionenfallen-

Orbitrap Massenspektrometer

Für die Proteinidentifizierung von Spektren, die mittels Orbitrap aufgenommen wurden, wurde die

Software Proteome DiscovererTM (Version 1.3, Thermo Fisher Scientific) und die Suchmaschine

MASCOTTM (Version 2.4.1, Matrix Science, London, UK) eingesetzt. Die MS/MS-Spektren wurden

gegen die UniProtKB/Swiss-Prot Datenbank (16608 humane Sequenzen; Datum 04/03/2013) gesucht,

mit folgenden Suchparametern: Protease: Trypsin; maximal zwei überlesene Schnittstellen;

Taxonomie: homo sapiens; 10 ppm Vorläuferion-Massentoleranz; 0.4 Da Fragment-Massentoleranz;

Variable Modifikationen: Oxidation von Methionin; Feste Modifikationen: Carbamidomethylierung an

Cystein. Die false discovery rate (FDR) wurde auf 1% (p ≤ 0.01) gesetzt. Konnten identifizierte Peptide

mehreren Proteinen zugeordnet werden, wurden diese in einer Proteingruppe zusammengefasst.

3.2.6.4. Quantitative Auswertung massenspektrometrischer Daten

Die quantitative Auswertung der mittels Massenspektrometrie generierten Daten wurde mit der

Software ProgenesisTMLC-MS v4.0 vorgenommen. Diese Software gleicht zunächst die einzelnen MS-

Läufe anhand m/z-Werten und Retentionszeiten an und nimmt anschließend eine Normalisierung der

Intensitäten vor. Die differentielle Analyse wird anschließend anhand der Flächen unter den Kurven

der einzelnen Peptidsignale vorgenommen.

Hierfür wurden zunächst alle HPLC-MS-Läufe im raw-Format in die Software importiert und eine

Messung ausgewählt, welche als Referenz fungierte. Für die Wahl des Referenzlaufs war eine geringe

Anzahl von Störsignalen (z.B. Polymeren) sowie ein möglichst vollständiges Signalmuster, gute

Signalintensitäten und gute Trennung in beiden Ebenen entscheidend. Die anderen Läufe wurden im

Anschluss an diesen Lauf mit der „automatic alignment“-Funktion der Software angeglichen und das

Ergebnis manuell überprüft und Fehler gegebenenfalls durch Setzen manueller Vektoren korrigiert.

Für die darauf folgende automatische Detektion der Peptidsignale sowie Normalisierung und

Quantifizierung wurden die Bereiche, in denen das HPLC-System gewaschen und equilibriert wurde

sowie einfach geladene Feature ausgeschlossen. Anschließend wurden die Messungen den zu

vergleichenden Gruppen (Kurzzeitüberlebende wt, Langzeitüberlebende wt, Langzeitüberlebende

IDH1mut) zugeordnet und die Ergebnisse der Datenbanksuche importiert. Die Kriterien für eine


41

differentielle Expression eines Proteins waren ein p-value ≤0,05 sowie ein Unterschied in der

Abundanz von ≥1,5. Außerdem musste die Quantifizierung über mehr als ein Peptid erfolgt sein.

3.2.6.1. Softwaregestütze Auswertung der Array-Scans

Für die weitere Auswertung der ProtoArray Daten wurde die Software ProtoArray Prospector

eingesetzt. Hierbei werden im Wesentlichen drei Schritte durchlaufen. Zunächst werden für jeden

einzelnen Array die Z-Werte, die CIP-Werte und Variationskoeffizienten für alle Spots berechnet. Der

Z-Wert wird durch die Signalintensität eines Spots minus der mittleren Signalintensität aller humanen

Spots auf dem Array, geteilt durch die Standardabweichung der Signalintensitäten aller humanen

Spots auf dem Array, errechnet. Der CIP-Wert gibt eine Aussage über die Wahrscheinlichkeit, dass es

sich tatsächlich um ein positives Signal handelt, indem er die Signalstärke eines Spots in Relation zu

den negativ Kontrollen setzt. Der Variationskoeffizient evaluiert die Standardabweichung zwischen

den Duplikaten. Ein Spot musste folgende Kriterien erfüllen, um für die weitere Auswertung

berücksichtigt zu werden: Z-Wert ≥3, CIP-Wert ≤0,05 und ein Variationskoeffizient (CV) ≤0,5. In

einem zweiten Schritt wurden die zu vergleichenden Gruppen gebildet und die Signale der einzelnen

Proteine über alle Proben in einer Gruppe angeglichen und die Intensitäten normalisiert. Hierfür

wurde die quantile Normalisierung ausgewählt. Im letzten Schritt wurden Differenzen zwischen den

gebildeten Gruppen mittels der im Programm integrierten M-Statistik ermittelt (Love und Predki

2007). Für die weitere Auswertung wurden die Proteine als mögliche Kandidaten berücksichtigt,

deren p-Wert ≤0,01 war.

3.2.6.1. Anreicherungs-Analysen

Um zu untersuchen, ob bestimmte Prozesse, Zellkompartimente oder enzymatische Funktionen

angereichert sind, wurden verschiedene Strategien eingesetzt.

Zum einen wurde das Programm String (http://string-db.org; Version 9.1; (Snel et al. 2000)) und zum

anderen DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)

(http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp; Version 6.7; (Huang da et al. 2009b; Huang da et al. 2009a))

eingesetzt, um innerhalb der Gruppe der differentiellen Proteine Anreicherungen zu detektieren. Bei

der Verwendung von DAVID wurde als Hintergrund die Gesamtheit der quantifizierten Proteine bzw.

bei der Analyse der ProtoArray Daten alle auf dem Chip existierenden Proteine (ohne Kontrollen)

verwendet. Ein Prozess wurde als angereichert berücksichtigt, wenn der Wert für den nach Benjamini

korrigierten p-Wert ≤0,001 war.

http://string-db.org/

http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp


42

Für die globalen Proteinexpressions-Analysen, welche in Kooperation mit dem Institut für

Medizinische Informatik, Statistik und Epidemiologie in Leipzig durchgeführt wurden, wurden die

normalisierten Abundanzen aller quantifizierten Proteine der markierungsfreien quantitativen

Analyse wie folgt prozessiert: Zunächst wurden die Daten von all denjenigen Proteinen bereinigt, bei

denen fehlende Abundanzen existierten. Anschließend wurden die Werte log10 transformiert und

über den Mittelwert aller Proben zentriert. Die Proteinexpression wurde dann mittels selbst-

organisierender Karten (SOM) analysiert (Wirth et al. 2011). Kollektiv exprimierte Proteine wurden

entweder in sogenannten Spot Modulen zusammengefasst oder aber auch Genset-Anreicherungs-

Analysen zur funktionellen Interpretation basierend auf der Expression einzelner Proteine

durchgeführt. Hierbei wurde der Genset-Anreicherungs-Wert (GSZ) herangezogen, welcher die

Signifikanz einer differentiellen Expression von Mitgliedern eines Gensets im Vergleich zu der

mittleren Expression aller Gene einer Probe abschätzt. Die Gensets wurden anhand der Standard

Gene Ontology (GO) Kategorien oder basierend auf ausgewählten Publikationen definiert. Alle

Analysen wurden mit dem R-Programm oposSOM durchgeführt (Wirth et al. 2012).

Kapitel 4: Ergebnisse

43

4. Ergebnisse

Die Gesamtüberlebensdauer eines Glioblastompatienten liegt im Schnitt bei lediglich etwas mehr als

einem Jahr (Johnson und O'Neill 2012; Ronning et al. 2012). Verantwortlich hierfür sind unter

anderem die hohe Proliferationsrate des Tumors und das invasive Wachstum. Dennoch gibt es eine

geringe Anzahl von Patienten, Langzeitüberlebenden genannt, deren Gesamtüberlebensdauer

deutlich über dem Durchschnitt liegt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Faktoren

hinsichtlich ihres Einflusses auf die Gesamtüberlebenszeit untersucht. So wurden die Proteome von

Tumoren von Langzeit- (LTS) und Kurzzeitüberlebenden (STS) mit verschiedenen

proteomanalytischen Methoden charakterisiert und differentiell analysiert. Da neben dem Tumor

selbst auch systemische Effekte den klinischen Verlauf beeinflussen, wurde auch nach

Veränderungen im Immunsystem von Glioblastompatienten gesucht. Hier wurde eine Studie

durchgeführt, in der das Vorkommen tumorassoziierter Autoantikörper im Plasma direkt nach

Diagnosestellung sowie mehrere Jahre danach untersucht wurde. Außerdem wurden vier

Gliomstammzellmodelle hinsichtlich ihrer Eignung zur Untersuchung der Entwicklung von

Resistenzen bei der Chemotherapie von Glioblastompatienten mit proteomanalytischen Methoden

analysiert.

Differentielle Proteomstudie von Proteinüberständen 4.1.

extrahierter Glioblastome

Um differentiell exprimierte Proteine zwischen LTS und STS Patienten zu detektieren, wurde eine 2D-

DIGE Studie mit Tumorgewebe durchgeführt. Da es sich vor allem bei Gewebe von

Langzeitüberlebenden um sehr wertvolles Material handelt, wurde ein von (Grzendowski et al. 2009)

entwickelter Ansatz gewählt, der es ermöglicht, mit einem Gewebestück sowohl DNA- und RNA- als

auch Proteinanalytik zu betreiben. Hierbei werden die Proteinüberstände, welche bei der

Aufarbeitung von DNA/RNA mittels Ultrazentrifugation entstehen, für die Proteomanalyse

eingesetzt.

4.1.1. 2D-DIGE Experiment

Für diese differentielle Studie wurden 11 Proteinüberstände von Langzeitüberlebenden des

Glioblastoms sowie dieselbe Anzahl von Kurzzeitüberlebenden aus der Gewebesammlung des

deutschen Gliomnetzes (GGN) verwendet. Die Patientenproben waren entsprechend ihrem Alter,


44

Geschlecht, Resektionsausmaß gepaart worden (siehe Tabelle 4.1). Der IDH1 Status der Patienten

war zu diesem Zeitpunkt nicht bekannt und wurde daher bei der Paarung auch nicht berücksichtigt.

Die Proben wurden nach dem etablierten Protokoll für die Behandlung von Proteinfraktionen

aufgearbeitet und anschließend eine Proteinbestimmung nach Bradford durchgeführt. Insgesamt

wurden 14 gepaarte Patientenproben von LTS (>36 Monate) und STS (>6 Monate) mittels 20x30 cm

2D-DIGE analysiert und ausgewertet.

Tabelle 4.1 Für die differentielle Studie eingesetzte LTS und STS Proben inklusive der verwendeten Paarungskriterien.

Status Geschlecht Alter bei Diagnose Resektionsausmaß IDH1-Status

LTS männlich 52.0 total wt

LTS weiblich 48.4 total mut

LTS weiblich 24.1 partial mut

LTS männlich 45.1 subtotal mut

LTS weiblich 56.0 subtotal mut

LTS weiblich 42.8 keine OP wt

LTS männlich 62.1 total wt

STS männlich 56.8 total wt


STS weiblich 69.0 total wt


STS weiblich 82.5 subtotal wt

STS männlich 57.4 subtotal wt


Auf jedes Gel wurden 50 µg Protein der LTS-Probe und 50 µg Protein der gepaarten STS-Probe

aufgetragen. Um farbstoffbedingte Effekte im Laufverhalten und daraus resultierende Differenzen

zwischen den beiden Gruppen zu vermeiden, wurde darauf geachtet, die Farbstoffe zwischen beiden

Gruppen zu wechseln. Zusätzlich wurde ein aus allen Proben erstellter interner Standard, welcher

stets mit dem Farbstoff Cy2 markiert wurde, aufgetragen. Im Folgenden ist ein Gel aus der Studie

exemplarisch gezeigt (Abbildung 4.1).


45

Abbildung 4.1: Proteinexpressionsmuster von Glioblastomproben von Patienten mit langer bzw. kurzer

Überlebensdauer. Die 2D-Gele zeigen deutliche Unterschiede im Proteinmuster. Aufgetragen wurden 50 µg mit Cy3

markierte Probe eines LTS (links, grün) und 50 µg mit Cy5 markierte Probe eines STS (rechts, rot). Gleiche

Signalintensitäten werden in der Überlagerung der Gelbilder (Mitte) in gelb dargestellt. Der interne Standard,

markiert mit Cy2, ist nicht gezeigt.

Die Auswertung der differentiellen Studie mittels der Bildanalyse Software DeCyder ließ die

Detektion von durchschnittlich 3000 Proteinspots pro Gel zu. Von diesen wiesen 32 Proteinspots

einen Abundanzunterschied ≥ ±1,5 und einen Wert für den t-Test ≤ 0,05 auf und wurden somit als

differentiell eingestuft. Insgesamt wurden 23 Proteinspots gefunden, die bei Langzeitüberlebenden

einen erhöhten Expressionsfaktor aufwiesen, und neun Proteinspots, die bei den

Kurzzeitüberlebenden einen erhöhten Expressionsfaktor gegenüber den Langzeitüberlebenden

zeigten (Abbildung 4.2). Geringe zur Verfügung stehende Proteinmengen machten für die

Identifizierung das Heranziehen eines Referenzproteoms notwendig. Aufgrund der relativ

dominanten Signale von Blutbestandteilen (Albumin, Hämoglobin) wurde auf die Nutzung eines

Gewebeaufschlusses als Referenzproteom verzichtet und Glioblastomzelllinien (siehe Tabelle 3.2)

hinsichtlich ihrer Eignung als Referenzproteom untersucht. Die Zelllinien T98G und A172 zeigten eine

gute Übereinstimmung, insbesondere in den relevanten Bereichen mit dem Standard der

differentiellen Studie und wurden daher für die Identifizierung der als differentiell abundant

ermittelten Spots als Referenzproteom ausgewählt.

LTS STS

170 kDa

130 kDa

100 kDa

70 kDa

55 kDa

40 kDa

35 kDa

25 kDa

15 kDa

10 kDa

Overlay


46

Abbildung 4.2: Position der differentiellen Proteinspots im 2D-Gel. Die 32 zwischen Tumorgewebe von LTS und

STS differentiellen Proteinspots verteilen sich auf den gesamten mittels 2D-PAGE zugänglichen Molekulargewichts

(ca. 10-200 kDa) - und pI-Bereich (ca. 4-8). Einige der differentiellen Spots weisen ein regelmäßiges

Perlenkettenmuster auf, was auf verschiedene Isoformen eines Proteins hinweist.

Im Rahmen der massenspektrometrischen Analysen der Proteinspots mittels nanoHPLC-ESI MS

wurden 31 Proteine identifiziert, was 23 nicht redundanten Proteinen entsprach (Tabelle 4.2). Wie

aus Abbildung 4.2 ersichtlich, waren in einigen Fällen ganze Spotketten differentiell reguliert. Hierbei

handelt es sich vermutlich um verschiedene Varianten desselben Proteins, wodurch der Anteil

redundanter Proteine bei der Identifizierung erklärt werden kann.

170 kDa

130 kDa

100 kDa

70 kDa

55 kDa

40 kDa

35 kDa

25 kDa

15 kDa

10 kDa

5 6 7 8

442

584

525

752

982

1953

2639

3909 3970 3888

2899

2768

3273

2550

1540

708-762

594-598 555 545

838

1113

565-571


47

Tabelle 4.2: Differentielle Proteinspots aus der 2D-DIGE -Analyse

Protein Name Gen Name Spot Nr, T-test Expressions-

faktor

Gruppe erhöhter

Abundanz

Heat shock 70 kDa protein 4 HSPA4 442 0,011 -2,0 LTS

Major vault protein MVP 525 0,014 -2,8 LTS 2-oxoglutarate dehydrogenase, mitochondrial

OGDH 545 0,0034 -1,8 LTS

tRNA (cytosine-5-)-methyltransferase NSUN2 555 0,0055 -1,7 LTS Isoform Long of Splicing factor, proline- and glutamine-rich

SFPQ 565 0,0035 -1,8 LTS

Isoform Long of Splicing factor, proline- and glutamine-rich

SFPQ 570 0,011 -2,6 LTS

Isoform Long of Splicing factor, proline- and glutamine-rich

SFPQ 571 0,035 -2,0 LTS

Transitional endoplasmic reticulum ATPase

VCP 584 0,014 -1,8 LTS

C-1-tetrahydrofolate synthase, cytoplasmic MTHFD1 594 0,0025 -2,1 LTS



Aconitase 2 ACO2 708 0,00071 -2,4 LTS




ATP-dependent RNA helicase DDX1 DDX1 719 0,00086 -2,1 LTS Aconitase 2/ ATP-dependent RNA helicase DDX11

ACO2/DDX1 725 0,0017 -2,3 LTS

Isoform 2B of Cytoplasmic dynein 1 intermediate chain 2

DYNC 1│2 752 0,0003 -1,7 LTS

Nicht identifiziert Nicht

identifiziert 762 0,00025 -2,3 LTS

Serotransferrin TF 838 0,046 -1,9 LTS Isoform 1 of Heat shock cognate 71 kDa protein

HSPA9 982 0,019 -1,5 LTS

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L/ Deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase

HNRNPL, SAMHD1

1113 0,021 -2,0 LTS


identifiziert 1540 0,037 -1,6 LTS

Macrophage-capping protein CAPG 1953 0,0046 3,0 STS

cDNA FLJ38699 fis 2550 0,0031 2,4 STS

Prohibitin PHB 2639 0,011 2,1 STS

26 kDa protein MRPL46 2768 0,043 1,7 STS Isoform 2 of Heat shock cognate 71 kDa protein

HSPB1 2899 0,028 3,1 STS

Peroxiredoxin-1 PRDX1 3273 0,041 2,0 STS


identifiziert 3888 0,039 2,9 STS

Galectin-1 LGALS1 3909 0,038 1,7 STS


identifiziert 3970 0,044 2,0 STS

4.1.2. Validierung differentieller Kandidatenproteine mittels

Proteinblotting und Transkriptomdaten

Zur unabhängigen Überprüfung der Abundanzunterschiede in den Tumoren von LTS und STS

Patienten wurden zwei Kandidatenproteine, das SFPQ Protein und das Macrophage-capping protein,

ausgewählt (siehe Abbildung 4.3).


48

A

B

Abbildung 4.3: Boxplot Darstellung der Abundanzen der zur weiteren Validierung mittels Proteinblot

ausgewählten Kandidatenproteine. Das Macrophage-capping protein (A) zeigt gegenüber den Tumorproben von

LTS in Tumorproben von STS eine dreifach erhöhte Expression. Die Proteinmenge des SFPQ Proteins (B) ist hingegen

gegenüber den Tumorproben von STS in Tumorproben von LTS um 2,6-fach erhöht. Für die Boxplot Darstellung sind

die normalisierten Spotvolumina verwendet worden. 50% der Werte befinden sich innerhalb der Box, die Whiskers

geben das Minimum und Maximum der erhaltenen Signalintensitäten an. Der Median wird durch ⎕ repräsentiert.

0.E+00

1.E+05

2.E+05

3.E+05

4.E+05

5.E+05

6.E+05

7.E+05

8.E+05

LTS STS

No

rma

lisie

rte

s S

po

tvo

lum

en

Macrophage-capping protein

0.E+00

2.E+04

4.E+04

6.E+04

8.E+04

1.E+05

1.E+05

1.E+05

2.E+05

2.E+05

2.E+05

LTS STS

Norm

alis

iert

es S

po

tvo

lum

en

SFPQ Protein

LTS STS

LTS STS


49

Die Validierung erfolgte mittels Proteinblotting und anschließender Immundetektion (Abbildung 4.4).

Die Auswahl begründete sich auf einer Kombination aus dokumentierter tumorrelevanter Funktion,

hohen Regulationsfaktoren sowie der Verfügbarkeit geeigneter Antikörper. Hierfür wurden weitere

Proben von den klinischen Zentren zur Verfügung gestellt.

A Macrophage-capping protein

B SFPQ Protein

Abbildung 4.4: Proteinblots zur Validierung von differentiellen Kandidatenproteinen aus der 2D-DIGE Studie.

Die in der 2D-Gelstudie beobachtete erhöhte Proteinmenge von Macrophage-capping protein in STS kann im Blot

bestätigt werden. Die zu erwartende Bande wurde bei 38 kDa detektiert (A). Der Nachweis des SFPQ Proteins liefert

kein eindeutiges Ergebnis hinsichtlich unterschiedlicher Mengen von SFPQ zwischen den beiden Patientengruppen.

Zusätzlich zu der zu erwartenden Bande bei 115 kDa in der Gruppe der STS kann jedoch eine zweite Bande bei

geringerem Molekulargewicht detektiert werden (B). Aufgetragen wurden je 20 µg Gesamtprotein von 7 LTS und 5

STS-Proben. Zur Ladekontrolle wurde die Blotmembran mit India Ink angefärbt.

Für den ersten Kandidaten Macrophage-capping protein lässt sich die im 2D-Experiment beobachtete

differentielle Proteinexpression bestätigen. Für das SFPQ Protein ließen sich keine

Abundanzunterschiede zwischen den beiden beobachteten Gruppen im Proteinblottingexperiment

zeigen. Auffällig war hier jedoch, dass in einigen der STS-Proben eine zusätzliche Bande unterhalb des

zu erwartenden Molekulargewichtes von 115 kDa detektiert wurde.

Zur zusätzlichen Validierung der Daten aus der 2D-DIGE Studie wurden die Ergebnisse mit den Daten

aus der ebenfalls mit diesem Material durchgeführten Transkriptomstudie (Reifenberger et al. 2014)

verglichen. Hierbei zeigte sich, dass von den 23 differentiellen Kandidatenproteinen lediglich zu 14

38 kDa

LTS STS

LTS STS

115 kDa


50

auch Transkriptomdaten vorlagen und von diesen nur das Macrophage-capping protein eine

signifikant differentielle Regulation in dieselbe Richtung auf Ebene der Transkription aufwies.

4.1.3. Erweiterte Analyse der verwendeten Tumorproben hinsichtlich

einer Mutation im Gen der IDH1

Nach Abschluss der 2D-DIGE Studie sowie der nachfolgenden Validierung mittels Westernblot wurde,

begründet durch die Ergebnisse von Parsons et al. (2008), der IDH1-Status der verwendeten

Patientenproben bestimmt. Hierbei stellte sich heraus, dass in der Gruppe der LTS der 2D-DIGE

Studie vier von sieben Patienten eine Mutation im IDH1-Gen aufwiesen, in der Gruppe der STS

Patienten aber ausschließlich IDH1wt Tumoren vorlagen. Daher muss davon ausgegangen werden,

dass detektierte Unterschiede in der Proteinexpression möglicherweise bedingt durch die Mutation

im IDH1 Gen waren.

Differentielle Proteomstudie von mikrodissektierten 4.2.

Glioblastomen

Ziel dieser Arbeit war, ein möglichst umfassendes Bild des Proteoms von Glioblastomgewebe zu

erhalten, um neue Erkenntnisse über die biologischen Prozesse, die bei Langzeitüberleben eine Rolle

spielen, gewinnen zu können. Daher wurden weitere Gewebeproben mittels markierungsfreier

Massenspektrometrie analysiert, welche die parallele Identifizierung und Quantifizierung mehrerer

tausend Proteine erlaubt.

4.2.1. Etablierung der Mikrodissektion für Glioblastomproben

Im Rahmen der gelbasierten Gewebestudie zeigte sich, dass bei der Verwendung von

Proteinüberständen von Gewebestücken in der Proteomanalyse häufig hochabundante

Blutbestandteile detektiert werden. Das heterogene Erscheinungsbild dieser Tumorentität legt nahe,

dass diese nicht durch die Tumorzellen exprimiert, sondern durch Einblutungen im Gewebe

hervorgerufen werden. Um eine besonders hohe Spezifität für Tumorzellen zu erzielen und

Kontaminationen durch umliegendes Gewebe oder Gefäße auf ein Minimum zu reduzieren, wurde

für die Analyse von soliden Tumoren im weiteren Verlauf die Laser Mikrodissektion gewählt

(Abbildung 4.5).


51

Dafür musste zunächst ein Verfahren etabliert werden, das die Gewinnung von Tumorzellen aus

Gefrierschnitten und den anschließenden Einsatz markierungsfreier quantitativer

Massenspektrometrie erlaubte.

Abbildung 4.5: Mikroskopische Aufnahmen von Glioblastomgewebe vor und nach der Mikrodissektion. Mittels

Lasermikrodissektion lassen sich selektiv bestimmten Zelltypen isolieren. Nekrotische Bereiche, gesundes Gewebe

oder Blutgefäße (Pfeil) können ausgespart werden, um so eine hohe Selektivität für den gewünschten Zelltyp zu

erzielen. Für die Lasermikrodissektion wurde jeweils ein Referenzschnitt mit Hämatoxilin/ Eosin angefärbt und

tumorhaltige Bereiche von Dr. Jörg Felsberg, einem erfahrenen Neuropathologen, angezeichnet. Für die Gewinnung

der Proben für die Proteomanalysen wurden dann, in Abhängigkeit von der Gewebegröße, 5-7 konsekutive Schnitte

desselben Tumors mikrodissektiert und vereinigt. Es wurde versucht von jedem Tumor mindestens 10 mm2

mikrodissektiertes Material für die markierungsfreie Quantifizierung mittels Massenspektrometrie zu erhalten.

Hierfür wurden zunächst Systeme von zwei Herstellern (Arcturus und Leica) mit unterschiedlichen

Funktionsprinzipien hinsichtlich Ihrer Eignung für den Einsatz in der Proteomanalyse anhand von

7 µm Gewebeschnitten von Glioblastomen getestet. Bei dem System der Firma Arcturus wird der

mikrodissektierte Gewebebereich mit der Membran eines aufgesetzten Caps verschmolzen. Das

System der Firma Leica verwendet spezielle Objektträger, deren Membran samt Gewebe nach dem

Schneiden mittels Gravitation in das Probengefäß fällt.

Für markierungsfreie Proteomanalysen werden lediglich wenige Mikrogramm Gesamtprotein

benötigt, was eine gute Voraussetzung für die Kombination mit der Laser Mikrodissektion ist. Da die

bei der Mikrodissektion entstehenden Proteinmengen zu gering für einen Nachweis mittels Bradford-

Proteinbestimmung sind, wurde die aus einer bestimmten Fläche Tumorgewebe erhaltenen

Proteinmengen über den Vergleich mit definierten Mengen an Marker bzw. Zelllysat aus

Zellkulturproben im 1D-Experiment abgeschätzt (siehe Abbildung 4.6).


52

A B

Abbildung 4.6: 1D-PAGE zur Abschätzung des Proteingehalts in mikrodissektierten Proben. A: Mikrodissektion

mit einem Gerät der Firma Arcturus (fluoreszenzmarkiert). B: Mikrodissektion von GBM-Gewebe mit einem Gerät der

Firma Leica (silbergefärbt). Anhand der Signalintensitäten kann die erhaltene Menge Protein aus vergleichbaren

Flächen Gewebes aus der Laser-Mikrodissektion mit den zwei unterschiedlichen Gerätetypen auf ca. 0,25 µg

(Arcturus) und 5 µg (Leica) abgeschätzt werden.

Aus dem 1D-Gel ergab sich, dass bei der Verwendung des Laser Capture Mikroskops der Firma

Arcturus eine Fläche von ca. 5 mm2 ungefähr 0,25 µg Protein entspricht. Die erhaltene Menge war

hierbei so gering, dass eine Silberfärbung nicht möglich war und auf Fluoreszenzmarkierung für die

Bestimmung der Proteinmenge zurückgegriffen werden musste. Bei der Verwendung eines

Mikroskops der Firma Leica konnten ca. 5 µg Gesamtprotein aus 5 mm2 gelasertem Gewebe

gewonnen werden. Darüber hinaus zeigte sich, dass bei Verwendung höherer Laserintensitäten,

welche zuweilen für ein vollständiges Verschmelzen der Membran mit dem Gewebe beim Gerätetyp

des Hersteller Arcturus notwendig war, Artefakte bei der Trennung im 2D-Gel zu erkennen waren

(Abbildung 4.7). Eine gleichbleibende Probenqualität konnte somit mit diesem Gerätetyp nicht

gewährleistet werden.

5 m

m2 P

rob

e au

s

Mik

rod

isse

ktio

n (

Arc

turu

s)

2,5

µg

A1

72 Z

ellly

sat

1 µ

g

A17

2 Z

ellly

sat

0,7

5µ

g A

17

2 Z

ellly

sat

0,5

µg

A1

72 Z

ellly

sat

0,2

5µ

g A

17

2 Z

ellly

sat

Ref

eren

z, 5

µg

Ges

amtp

rote

in

5 m

m2 P

rob

e au

s M

ikro

dis

sekt

ion

(Le

ica)


53

Abbildung 4.7: 2D-PAGE zur qualitativen Kontrolle von mikrodissektiertem Tumorgewebe. Für die Etablierung

der Lasermikrodissektion wurden Gerätetypen von zwei unterschiedlichen Herstellern getestet. Bei dem Gerät der

Firma Arcturus sind Artefakte im Proteinmuster in der 2D-PAGE in Abhängigkeit von der Laserintensität zu

beobachten. Links höhere Laserintensität (45 V), rechts niedrigere Laserintensität (65 V). Es wurden 7 µm dicke

Kryosektionen von Glioblastomen eingesetzt. Für die anschließende 2D-PAGE wurden die Proben mit

Fluoreszenzfarbstoffen markiert.

Die deutlich bessere Proteinausbeute sowie reproduzierbarere Probenqualität führten zu dem

Einsatz des Gerätes der Firma Leica für die Probenvorbereitung im Rahmen der markierungsfreien

Quantifizierung mittels Massenspektrometrie. Tumorhaltige Bereiche wurden jeweils auf einem

gefärbten Referenzschnitt von einem Neuropathologen (Dr. J. Felsberg) angezeichnet und dann in

Abhängigkeit von der Gewebegröße 5-7 konsekutive Schnitte desselben Tumors mikrodissektiert und

vereinigt. Insgesamt wurden so Proben von acht Tumoren von LTS mit (LTSmut) bzw. neun Tumoren

ohne Mutation im IDH1-Gen (LTSwt) und zehn Proben von Tumoren von STS ohne IDH1 Mutation

(STSwt) generiert (siehe Tabelle 4.3). Durchschnittlich wurden pro Lauf rund 27.000

Fragmentspektren aufgezeichnet, wovon jeweils etwas mehr als 10.000 Spektren (37 %) identifiziert

wurden. Dies führte im Schnitt zur Identifizierung von ca. 1.350 Proteingruppen je Probe (siehe

Tabelle 4.4). Der Variationskoeffizient lag hierbei stets bei etwa 30 %. Insgesamt konnten über alle 27

Messungen hinweg 3556 Protein-Gruppen identifiziert werden.


54

Tabelle 4.3: Übersicht der mikrodissektierten Tumorproben für die markierungsfreie Quantifizierung

Status IDH1 Gesamt mm2

Geschlecht Alter bei Diagnose

Resektions-ausmaß

KPS

LTS mut 15,62 männlich 45 total 80

LTS mut 15,80 weiblich 40 partial 100

LTS mut 11,13 weiblich 39 partial 90

LTS mut 28,81 weiblich 33 total 80

LTS mut 16,38 weiblich 34 total unbekannt


LTS mut 10,16 männlich 35 partial 100


LTS wt 18,04 männlich 45 subtotal 90

LTS wt 10,17 weiblich 46 total 70

LTS wt 13,14 männlich 46 unbekannt 90

LTS wt 7,53 weiblich 59 subtotal 80

LTS wt 12,94 männlich 65 total 80

LTS wt 7,18 männlich 50 total 100

LTS wt 10,32 weiblich 54 subtotal 80



STS wt 22,90 männlich 51 partial 70

STS wt 16,43 weiblich 43 total 90

STS wt 18,94 männlich 52 total 80

STS wt 11,61 männlich 42 partial 50

STS wt 14,93 männlich 47 total 90

STS wt 14,19 weiblich 59 partial 90

STS wt 24,48 weiblich 46 subtotal 80

STS wt 30,32 weiblich 38 total 80

STS wt 21,23 männlich 57 subtotal 80

STS wt 3,03 weiblich 57 subtotal 100

Tabelle 4.4: Übersicht der in 27 Messungen von mikrodissektierten Tumoren durchschnittlich aufgenommenen und identifizierten Spektren sowie die resultierende Anzahl an Peptid- und Proteinidentifikationen.

Statistische Größe

Anzahl aufgenommener

MS/MS- Spektren

Anzahl identifizierter

Spektren


Peptide


Protein Gruppen

Mittelwert 27.027 10.474 7.071 1.350

Standardabweichung 4.045 3.279 2.339 402

Variationskoeffizient 15 % 31 % 33 % 30 %


55

4.2.2. Differentielle Proteomanalyse von Wildtyp-Glioblastomen

Um Hinweise auf die Ursachen des unterschiedlichen klinischen Verlaufs von LTS und STS Patienten

ohne IDH1 Mutation zu gewinnen, wurden die zuvor gewonnenen mikrodissektierten Tumorproben

mittels markierungsfreier Massenspektrometrie identifiziert und quantifiziert. So konnten für LTSwt

und STSwt 2417 bzw. 2903 Proteine identifiziert werden. Quantitative Daten konnten für 2755

Proteine erhoben werden. Der Vergleich zwischen 9 LTSwt und 10 STSwt ergab, dass 178 Proteine

zwischen LTS und STS (siehe Anhang, Tabelle 7.1) eine differentielle Proteinexpression zeigen.

Kriterien für eine differentielle Regulation waren hierbei ein Abundanzunterschied >1,5, ein p-Wert<

0,05 und eine Quantifizierung über mehr als ein Peptid. Kontaminanten laut (Keller et al. 2008)

wurden ebenfalls von der weiteren Auswertung ausgeschlossen. Von diesen 177 Proteinen zeigten

15 eine erhöhte Abundanz in den Tumoren der LTS und 162 Proteine eine erhöhte Abundanz in den

Tumoren von STS.

Weiterhin wurden die quantitativen Informationen der markierungsfreien Analyse genutzt, um zu

untersuchen, ob innerhalb einer Patientengruppe eine Anreicherung bestimmter Signalwege oder

Prozesse sowie anderer definierter Eigenschaften vorliegt. Hierfür wurden SOM-Analysen in

Kooperation mit dem Institut für Medizinische Informatik, Statistik und Epidemiologie in Leipzig

durchgeführt. Die Auswertung des Differenzbildes der beiden gemittelten Gruppenportraits zeigt,

dass einige Gensets eine differentielle Expression zwischen den beiden Patientengruppen aufweisen

(Abbildung 4.8). Hierbei wurde deutlich, dass besonders Proteine mit mitochondrialer Lokalisation

(Auflistung der im Genset „Mitochodrium“ enthaltenen Proteine siehe Anhang, Tabelle 7.2) in der

Gruppe der Kurzzeitüberlebenden stark angereichert sind. Weitere angereicherte Gensets innerhalb

der Gruppe der STS sind apoptotische Signalwege und die Biosynthese von Aminosäuren. In der

Gruppe der LTS finden sich Gensets zu Fibrinolyse sowie der Aggregation von Blutplättchen

überrepräsentiert.


56

Abbildung 4.8: SOM-Analyse der in LTSwt und STSwt exprimierten Proteine. Links: Die Metagen

Überexpressions-Profilmappe der 9 LTSwt und 10 STSwt Glioblastompatienten zeigt, dass zwischen den beiden

beobachteten Patientengruppen einige definierte Gensets angereichert sind. Die Überrepräsentations Mappe des

Gensets “Mitochondrien” zeigt eine Anreicherung mitochondrialer Proteine in der Gruppe der STS. Das Genset

beinhaltet 40 Gene, die Überrepräsentation der einzelnen Mosaikteile ist in Einheiten von log(pHG) unter Benutzung

einer hypergeometrischen Verteilung und farbkodiert (braun > rot > gelb > grün >blau) angegeben. In weißen

Bereichen sind Metagene lokalisiert, die nicht diesem Set angehören. Rechts: Gensetanreicherungs-Wert (GSZ) für das

Genset „Mitochondrium“ für die einzelnen Patienten.

Um festzustellen, ob die differentiellen Proteine interagieren und somit in einem

Funktionszusammenhang stehen, wurde mithilfe der Software String ein Interaktionsnetzwerk für die

178 Kandidatenproteine erstellt. Hierbei zeigte sich, dass für viele der differentiellen Proteine bereits

Interaktionen bekannt bzw. vermutet werden. Bei der Analyse von Bereichen, die einen besonders

hohen Vernetzungsgrad zeigten, fiel auf, dass es sich hierbei häufig um mitochondriale Proteine

handelte. Insgesamt kann 65 der differentiell in STS hochregulierte Proteinen eine Lokalisation in den

Mitochondrien zugeordnet werden (siehe Anhang, Tabelle 7.3).

LTSwt STSwt

Mitochondrium

Genset: Mitochondrium


57

Abbildung 4.9: Netzwerkanalyse der zwischen LTSwt und STSwt differentiell exprimierten Proteine. Ein

Großteil der differentiell exprimierten Proteine zeigt in der Netzwerkanalyse eine Verknüpfung untereinander. Die

Netzwerkanalyse wurde mit dem freiverfügbaren Online-Tool String durchgeführt. Eingegangen sind alle 178

Proteine, die im markierungsfreien Vergleich von mikrodissektiertem STSwt und LTSwt Gewebe von einen

Abundanzunterschied >1,5 und p-Wert <0,05 aufwiesen. Gezeigt ist der confidence view, stärkere Assoziationen

zwischen den einzelnen Proteinen werden durch dickere Linien repräsentiert.

Die Signalweg-Analyse mittels String (Abbildung 4.9) ergab zudem, dass die differentiellen Proteine

nicht nur auf einen speziellen mitochondrialen Signalweg oder funktionellen Komplex beschränkt

sind, sondern diversen mitochondrialen Prozessen wie z.B. der Atmungskette (z.B. UQCRC2), Citrat

Cyclus (Aconitase) sowie Transporter (OGCP) oder Proteine des Aminosäure-Katabolismus

(Glutaminase). zugeordnet werden können.

Zur Validierung dieser Beobachtung sowie zur Klärung, ob mit der Atmungskette eine definierte

Funktionseinheit der Mitochondrien in den Tumoren von Kurzzeitüberlebenden überexprimiert wird,


58

wurden Proteinblottingexperimente mit Antikörpern gegen Proteine der verschiedenen Komplexe

der Atmungskette durchgeführt (siehe Abbildung 4.11). Hierfür wurden Proteinüberstände von 10

LTSwt Patienten und 7 STSwt Patienten vom Deutschen Gliomnetz zur Verfügung gestellt. Die

verwendeten Antikörper richteten sich gegen NDUFB8 (Komplex I), SDHB (Komplex II), COXII

(Komplex IV), sowie UQCRC2 (Komplex III) und ATPA5 (Komplex V), von denen andere Untereinheiten

bereits in der markierungsfreien Studie als differentiell ermittelt wurden (siehe Abbildung 4.10).

Abbildung 4.10: Boxplotdarstellung der Abundanzen der als differentiell reguliert ermittelten Proteine der

Atmungskette. Die Proteine ATPA2 und UQCRC2 zeigen in der markierungsfreien Analyse eine erhöhte Abundanz in

den Tumoren von STSwt-Patienten gegenüber LTSwt Patienten. Für die Boxplot Darstellung sind die normalisierten

Spotvolumina aus der markierungsfreien Quantifizierung verwendet worden. 50% der Werte befinden sich innerhalb

der Box, die Whiskers geben das Minimum und Maximum der erhaltenen Signalintensitäten an. Der Median wird

durch ⎕ repräsentiert.

Eine generelle differentielle Proteinexpression von Proteinen der Atmungskette ließ sich im Rahmen

dieses Proteinblottingexperiments nicht beobachten. Der höhere Materialbedarf des

Proteinblottingexperiments machte die Verwendung von Proteinüberständen erneut notwendig,

daher kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine Bestätigung der Ergebnisse der

markierungsfreien Studie aufgrund unterschiedlichen verwendeten Materials nicht möglich war. Die

Validierung differentiell regulierter Kandidatenproteine mittels materialsparender SRM-Technologie

steht noch aus.

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

LTS STS

norm

alis

iert

es S

potv

olu

men

ATPA2

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

LTS STS

norm

alis

iert

es S

potv

olu

men

UQCRC2


59

Abbildung 4.11: Proteinblottingexperiment mit Antikörpern gegen Proteine aus den fünf verschiedenen

Komplexen der Atmungskette (NDUFB8 (Komplex I), SDHB (Komplex II), UQCRC2 (Komplex III), COXII (Komplex

IV) und ATPA5 (Komplex V)). Aufgetragen wurden jeweils 20 µg Gesamtprotein aus Überständen von 10 LTSwt

Tumoren und 7 STSwt Tumoren. Anhand des Proteinblot lässt sich keine differentielle Regulation eines

Atmungskettenkomplexes zwischen den Tumoren der beiden untersuchten Patientengruppen ableiten.

4.2.3. Differentielle Proteomanalyse von Glioblastomen in Abhängigkeit

von der IDH1 Mutation

Im Lauf des Projekts konnte gezeigt werden, dass die IDH1 Mutation eine wichtige Rolle in der

Tumorbiologie von Glioblastomen spielt. Insbesondere im Hinblick auf den klinischen Verlauf zeigt

sich, dass eine Mutation dieses Gens sich begünstigend auswirkt und mit einem längeren

Gesamtüberleben korreliert. Aus diesem Grund wurden die Tumoren langzeitüberlebender Patienten

in Abhängigkeit der IDH1 Mutation mittels markierungsfreier quantitativer Massenspektrometrie

untersucht.

Untersucht wurden Tumoren von 9 LTS Patienten mit nicht mutierter IDH1 und von 8 Patienten mit

mutiertem IDH1-Gen. In den 9 LTSwt Proben konnten insgesamt 2834, in den 8 LTSmut Proben 2417

Proteine identifiziert werden. Eine Quantifizierung war für 2755 Proteine möglich. Diese Daten

wurden zunächst mittels SOM-Analysen eingehender analysiert (Abbildung 4.12). Hier zeigten

mutierte Tumoren eine signifikante Anreicherung von Proteingruppen mit RNA spleißenden

Proteinen sowie eine Anreicherung von Proteingruppen, welche Proteine enthalten, die in die Zell-

Adhäsion involviert sind, gegenüber Wildtyp-Tumoren. In diesen ließ sich wiederum eine

Anreicherungen von Proteingruppen, welche Proteine, die in die Cytokin-vermittelten

LTS STS Mar

ker


60

Signaltransmission involviert sind, sowie Proteine welche an inflammatorischen Prozessen und

Immunantwort beteiligt sind, als hochreguliert gegenüber mutierten Tumoren beobachten.

Abbildung 4.12: SOM-Analyse der quantitativen Daten von in Glioblastomen exprimierten Proteinen. Die

Metagen Überexpressions-Profilmappe zeigt, dass zwischen den beiden beobachteten Patientengruppen

(LTSwt/LTSmut) einige definierte Gensets angereichert sind. Insbesondere in der Gruppe der LTSmut Tumoren

zeigen sich zwei Gensets (A: RNA Spleißen, E: Zell-Adhäsion) als besonders stark angereichert gegenüber der wt

Gruppe.

Nach Filtern der erhobenen quantitativen Daten hinsichtlich p-Wert < 0,01 und einem

Abundanzunterschied >1,5 sowie einer Quantifizierung über mindestens zwei unique Peptide zeigen

130 Proteine eine differentielle Regulation (siehe Anhang, Tabelle 7.4). Von den 130 differentiellen

Proteinen sind 85 in den mutierten Tumoren hochreguliert und 45 in den wt Tumoren erhöht. Die

auch für diese Studie durchgeführte Netzwerkanalyse mit den Programmen String (siehe Abbildung

4.13) und DAVID führte ebenfalls zu der Beobachtung, dass eine signifikante Anreicherung RNA und

DNA bindender Proteine bzw. bezogen auf den biologischen Prozess mRNA prozessierende Proteine

in den Tumoren mit einer Mutation im IDH1 Gen vorliegt (siehe Anhang,

Tabelle 7. 7.5). Insgesamt konnten 34 von 85 (40%) Proteinen der GO-Annotierung molecular

function: RNA binding (Tabelle 4.5) und 26 von 85 (31%) dem GO-Term biological process: mRNA

metabolic process zugeordnet werden. Im Gegenzug dazu konnte keine signifikante Anreicherung

innerhalb der in wt Tumoren hochregulierten Proteine beobachtet werden.


61

Abbildung 4.13: Netzwerkanalyse der in mutierten Tumoren differentiell hochregulierten Proteine. Die

Netzwerkanalyse zeigt, dass sich innerhalb der in IDH1 mutierten Tumoren hochregulierten Proteinen, eine Gruppe

stark vernetzter Proteine befindet. Hierbei handelt es sich hauptsächlich um Proteine aus der Gruppe der Serin-

/Argininreichen Spleißfaktoren und heterogene nukleäre Ribonukleoproteine. Für die Analyse wurden die 85

Proteine berücksichtigt, die im markierungsfreien Vergleich von mikrodissektiertem LTSwt und LTSmut Gewebe

einen Abundanzunterschied >1,5 und p-Wert <0,01 aufwiesen. Weiterhin musste die Quantifizierung durch mehr als

ein uniques Peptid erfolgt sein. Gezeigt ist der „confidence view“, stärkere Assoziationen zwischen den einzelnen

Proteinen werden durch dickere Linien repräsentiert.


62

Tabelle 4.5: Mittels DAVID als mRNA assoziiert klassifizierte Proteine

Swissprot ID

Gen Name Protein Name

Q15717 ELAVL1 ELAV (embryonic lethal, abnormal vision, Drosophila)-like 1 (Hu antigen R)

P26378 ELAVL4 ELAV (embryonic lethal, abnormal vision, Drosophila)-like 4 (Hu antigen D)

Q07666 SAM68 KH domain containing, RNA binding, signal transduction associated 1

P55769 NHP2L1 NHP2 non-histone chromosome protein 2-like 1 (S. cerevisiae)

Q96I25 RBM17 RNA binding motif protein 17

Q13148 TARDBP TAR DNA binding protein

Q14011 CIRBP cold inducible RNA binding protein

P38919 EIF4A3 eukaryotic translation initiation factor 4A, isoform 3

P35637 FUS fusion (involved in t(12;16) in malignant liposarcoma)

P22626 HNRNPA2B1

heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1

P07910 HNRNPC heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C (C1/C2)

Q14103 HNRNPD heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D (AU-rich element RNA binding protein 1, 37kDa)

O14979 HNRNPDL heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D-like

P31942 HNRNPH3 heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H3 (2H9)

P61978 HNRNPK heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K

O43390 HNRNPR heterogeneous nuclear ribonucleoprotein R

Q00839 HNRNPU heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U (scaffold attachment factor A)

Q12906 ILF3 interleukin enhancer binding factor 3, 90kDa

Q8N1G4 LRRC47 leucine rich repeat containing 47

P43243 MATR3 matrin 3

Q9P2K5 MYEF2 myelin expression factor 2

P51513 NOVA1 neuro-oncological ventral antigen 1

P19338 NCL nucleolin

Q8WXF1 PSPC1 paraspeckle component 1; paraspeckle protein 1 pseudogene

Q9NSD9 FARSB phenylalanyl-tRNA synthetase, beta subunit

Q9UKA9 PTBP2 polypyrimidine tract binding protein 2

Q15424 SAFB scaffold attachment factor B

Q01844 EWSR1 similar to Ewing sarcoma breakpoint region 1; Ewing sarcoma breakpoint region 1

P08621 SNRNP70 small nuclear ribonucleoprotein 70kDa (U1)

P23246 SFPQ splicing factor proline/glutamine-rich (polypyrimidine tract binding protein associated)

P84103 SRSF3 splicing factor, arginine/serine-rich 3

Q13247 SRSF6 splicing factor, arginine/serine-rich 6; similar to arginine/serine-rich splicing factor 6

Q16629 SRSF7 splicing factor, arginine/serine-rich 7, 35kDa

Q13242 SRSF9 splicing factor, arginine/serine-rich 9


63

Proteomanalytische Charakterisierung von murinen 4.3.

Gliomstammzelllinien unter sphärenbildenden Bedingungen

Ein weiterer Faktor, der entscheidenden Einfluss auf das Gesamtüberleben der Patienten hat, ist die

Resistenz des Tumors gegenüber der Therapie. Diese Resistenzen werden häufig durch

Tumorstammzellen vermittelt. Um diese Resistenzmechanismen näher untersuchen zu können,

werden geeignete Zellkulturmodelle benötigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden vier murine

Gliomstammzelllinien, welche zur Sphärenbildung in der Lage sind, mittels proteomanalytischen

Methoden charakterisiert und hinsichtlich einer verstärkten Proteinexpression von

Stammzellmarkern nach Induktion der Sphärenbildung untersucht.

Die murinen Gliomstammzelllinien (NS) GL-261, SMA 497, SMA 540 und SMA 560 (Tabelle 3.2)

wurden durch Ändern der Kultivierungsbedingungen in Tumorsphären (SC) überführt. Für jede

Bedingung wurden insgesamt drei Replikate analysiert, lediglich für die SC der Linie GL-261 konnten

wegen technischer Probleme nur zwei Replikate vermessen werden. In der Folge konnten mittels

markierungsfreier Analyse 2699 Proteine quantifiziert werden. Die Auswertung der

massenspektrometrischen Analyse ergab, dass die Unterschiede zwischen den vier verwendeten

Zelllinien größer waren als die Unterschiede zwischen NS- und SC-Zellen innerhalb einer Linie.

Insbesondere die Zelllinie GL-261 unterscheidet sich deutlich in ihrem Proteinexpressionsmuster von

den drei SMA Zelllinien (Abbildung 4.14).

Abbildung 4.14: Hauptkomponentenanalyse der vier verwendeten Mausstammzelllinien. GL-261 in rosa, SMA

497 in blau, SMA 540 in lila und SMA 560 in orange. Ein deutlicher Unterschied basierend auf dem

Proteinexpressionsprofil ist nur zwischen der Zelllinie GL-261 und den drei anderen Zelllinien zu erkennen.


64

Das Hauptaugenmerk in dieser Studie lag auf dem Vergleich innerhalb der Zelllinien vor und nach der

Sphäreninduktion. Für die Zelllinie GL-261 konnten hier 38 differentielle Proteine (29 in SC

hochreguliert und 9 in SC herunterreguliert), für die Zelllinie SMA 560 insgesamt 150 differentielle

Proteine (92 in SC hochreguliert und 58 in SC herunterreguliert), für die Zelllinie SMA 540 insgesamt

220 differentielle Proteine (178 in SC hochreguliert und 42 in SC herunterreguliert) und für die

Zelllinie SMA 497 insgesamt 304 differentielle Proteine (253 in SC hochreguliert und 51 in SC

herunterreguliert) identifiziert werden. Die SOM-Analysen des Datensatzes zeigten, dass einige

ausgewählte Sets von humanen embryonischen Stammzellmarkern (hESC9, hESC10 und myc2) in SC

auf Proteinebene hochreguliert sind (siehe Abbildung 4.15).

Abbildung 4.15: Proteinexpressionsprofil ausgewählter Stammzellmarker (Wang 2011) in den vier

untersuchten Zelllinien. Die Gensets enthalten Gene, welche in hESC9 differentiell hochreguliert sind, abundant in

hESC vorkommen sowie Myc-regulierte Ziele. Diese Gensets zeigen in den SC-Zelllinien durchweg eine erhöhte

Expression gegenüber den NS-Zelllinien.

Darüber hinaus kann eine tendenziell erhöhte Expression nach Sphärenbildung bei den SMA-

Zelllinien auch für den Stammzellmarker 6-Integrin (Lathia et al. 2010) gezeigt werden (SMA-497

(FC=1,5; p=0,07), SMA-540 (FC=1,5; p=0,02) und SMA-560 (FC=1,8; p=0,03)) (siehe Abbildung 4.16,

A). Für den Stammzellmarker Nestin (Wang 2011) konnte keine signifikante Hochregulierung in SC

Zellen gezeigt werden (siehe Abbildung 4.16, B).

Gen

set

An

reic

her

un

gs-W

ert

SMA

-49

7_

NS

SMA

-54

0_

NS

SMA

-56

0 _

NS

GL-

26

1_N

S

SMA

-49

7_

SC

SMA

-54

0_

SC

SMA

-56

0_

SC

GL-

26

1_S

C

Set hESC9

Set hESC10

myc 2


65

A B

Abbildung 4.16: Boxplots der Stammzellmarker α6-Integrin und Nestin für die SMA-Zelllinien. Für die Boxplot

Darstellung sind die normalisierten Spotvolumina der markierungsfreien Quantifizierung verwendet worden. 50%

der Werte befinden sich innerhalb der Box, die Whiskers geben das Minimum und Maximum der erhaltenen

Signalintensitäten an. Der Median wird durch ⎕ repräsentiert. A: Für α6-Integrin kann in der markierungsfreien

Analyse eine erhöhte Abundanz in den SC-Zellen gezeigt werden. B: Der Stammzelllmarker Nestin zeigt keine

differentielle Regulation zwischen den beiden untersuchten Bedingungen.

Identifizierung von tumorassoziierten Autoantigenen 4.4.

Neben der Proteinexpression des Tumors muss auch das Immunsystem des Patienten als weiterer

möglicher Einflussfaktor auf den klinischen Verlauf berücksichtigt werden. Hierbei ist insbesondere

das Vorhandensein von Autoantikörpern im Plasma von Patienten gegen tumorassoziierter

Autoantigene (TAA) interessant. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher auch Plasma von

Glioblastompatienten untersucht und es wurden umfassende Autoantikörperprofile mithilfe der

Proteinarray Technologie erstellt.

4.4.1. Sammlung von Patientenplasma und Demographie

Für die Identifizierung von tumorassoziierten Autoantigenen bei Glioblastompatienten wurde im

Rahmen des deutschen Gliomnetzes die prospektive Sammlung von Plasma von

Glioblastompatienten initiiert. Hierfür wurde zunächst ein standardisiertes Protokoll zur

Probensammlung (Standard Operation Procedure, SOP; siehe 3.2.1.4) erstellt, wodurch gewährleistet

werden soll, dass die gesammelten Plasmaproben eine gleichbleibende Qualität aufweisen. Zur

qualitativen Kontrolle der erhaltenen Plasmen wurde eine 1D-PAGE durchgeführt und jeweils

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

SC NS

norm

alis

iert

es S

potv

olu

men

alpha6-Integrin

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

30000000

SC NS

norm

alis

iert

es S

potv

olu

men

Nestin


66

stichprobenartig Proben aus allen sammelnden Zentren hinsichtlich gleichbleibender Qualität

überprüft (siehe Abbildung 4.17).

Abbildung 4.17: 1D-PAGE zur qualitativen Kontrolle der gesammelten Plasmaproben aus den verschiedenen

klinischen Zentren des deutschen Gliomnetzes. Die gesammelten Plasmaproben wiesen untereinander eine gute

Reproduzierbarkeit hinsichtlich ihres Proteinbandenmusters im 1D-SDS-Gel auf. Die Trennung erfolgte im 4-20%

Acrylamidgel. Von jeder Probe wurden 10 µg Protein eingesetzt, für die Detektion der Proteine wurde die

Silberfärbung nach Heukeshoven verwendet.

Im Rahmen des deutschen Gliomnetzes (GGN) konnten bis zum jetzigen Zeitpunkt (30.5.2014) 900

Plasmaproben aus den verschiedenen Zentren gesammelt und dokumentiert werden. Darunter

befinden sich über 30 Proben von Langzeitüberlebenden des Glioblastoms (Abbildung 4.18).

Abbildung 4.18: Prozentuale Verteilung der gesammelten Plasmaproben nach 5 Jahren Sammlung bezogen

auf die Überlebensdauer der Patienten. Insgesamt wurden 900 Proben von GBM Patienten nach einem

standardisierten Protokoll in den klinischen Zentren gesammelt.

58%

7%

10%

8%

12%

5%

Prozentuale Verteilung der gesammelten Plasmaproben nach fünf Jahren Sammlung bezogen auf die Überlebensdauer der Patienten

Abnahme bei Diagnosestellung

bis 5 Monate Überlebensdauer

6-11 Monate Überlebensdauer



Angaben unvollständig

1 Marker 2 Zentrum Dresden 3 Zentrum Dresden 4 Zentrum Bonn 5 Zentrum Bonn 6 Zentrum Hamburg 7 Zentrum Hamburg 8 Zentrum München 9 Zentrum München

1 2 3 4 5 6 7 8 9


67

Für die geplante Analyse konnte somit auf Plasma von 20 GBM-Patienten zugegriffen und mittels

ProtoArray Technik hinsichtlich vorhandener Autoantikörper analysiert werden. Um Autoantigene

nachzuweisen, die GBM spezifisch sind, wurden diese mit Proben von 20 Nicht-Tumor-Patienten

(Gesundkontrollen) verglichen. Anschließend wurden Proben weiterer 20 Patienten mit einer

Gesamtüberlebensdauer von >22 Monaten analysiert, um das Auftreten tumorspezifischer

Autoantikörper mehrere Monate nach der Erkrankung zu untersuchen. Bei der Auswahl der Proben

wurde darauf geachtet, dass eine möglichst gute Übereinstimmung hinsichtlich Alter und Geschlecht

der Patienten vorlag (Tabelle 4.6). Zum Zeitpunkt der Analysen stand noch keine ausreichende Anzahl

von parallel zur Resektion gesammelten Plasmaproben von Langzeitüberlebenden zur Verfügung.

Tabelle 4.6: Übersicht der Patienten für die Analyse mittels Proteinarray

Gruppe Anzahl männlicher/

weiblicher Patienten

Durchschnittliches

Alter in Jahren

Nicht-Tumor-Patienten 7/13 59.8 (± 9.9)

Neu diagnostizierte GBM Patienten

13/7 63.0 (± 10.3)

Patienten mit einem Gesamtüberleben von >22 Monate

11/9 51.3 (± 12.8)

4.4.2. Detektion und differentielle Analyse von tumorspezifischen

Autoimmunreaktionen mittels Proteinarrays

Für die Detektion tumorassoziierter Autoantigene mithilfe des Nachweises von Autoantikörpern

wurden Protein Arrays zur Analyse von Patienten Plasma eingesetzt. Insgesamt umfasste der Array

9483 rekombinante Proteine was einer Anzahl von 8122 nicht redundanten Proteinen entspricht.

Nach der Inkubation der Arrays mit jeweils 10 µl Plasma/Serum konnten, nach Interaktion von

Autoantiköpern mit den auf dem Array aufgetragenen Proteinen, 876 Autoantikörper-Antigen

Reaktionen nachgewiesen werden, die einen signifikanten Unterschied zwischen neu

diagnostizierten Tumorpatienten und gesunden Patienten zeigten. Davon riefen 367 Antigene in

Tumorpatienten eine stärkere Antwort hervor, für 509 Antigene war in Tumorpatienten gegenüber

den Gesund-Kontrollen eine geringere Immunreaktion zu detektieren. Um innerhalb dieser

Kandidaten die korrespondierenden Antigene herauszufiltern, welche spezifisch für den Tumor sind,

wurden im weiteren Verlauf nur die Proteine berücksichtigt, die im Vergleich zu den Nicht-Tumor-

Kontrollen eine Antigen-Autoantikörper-Interaktion in mehr als 50% der Tumorpatienten aufzeigten.

Hierdurch konnten insgesamt 107 tumorassoziierten Kandidatenautoantigene identifiziert werden

(siehe Anhang, Tabelle 7.6)


68

4.4.3. Bioinformatische Analyse der tumorassoziierten Autoantigene

Für die nähere Charakterisierung der identifizierten potentiellen tumorassoziierten Autoantigene

wurde eine Anreicherungsanalyse durchgeführt. Mithilfe des Programms DAVID zeigt sich innerhalb

der 107 tumorassoziierten Kandidatenautoantigene eine signifikante Anreicherung von

zinkbindenden Proteinen (siehe Tabelle 4.7).

Tabelle 4.7: Tumorassoziierte Kandidaten-Autoantigene welche dem GO-Term “Zink-Ionen bindend” zugeordnet werden können.

Swissprot ID Protein Name

Q15057 ArfGAP with coiled-coil, ankyrin repeat and PH domains 2

Q9NZU5 LIM and cysteine-rich domains 1

Q9HBH9 MAP kinase interacting serine/threonine kinase 2

Q8IV61 RAS guanyl releasing protein 3 (calcium and DAG-regulated)

Q86UA6 RPA interacting protein

Q9BYM8 RanBP-type and C3HC4-type zinc finger containing 1

P53992 SEC24 family, member C (S. cerevisiae)

Q99469 SH3 and cysteine rich domain

Q12933 TNF receptor-associated factor 2

Q2QGD7 ZXD family zinc finger C

P11532 dystrophin

P11474 estrogen-related receptor alpha

Q13642 four and a half LIM domains 1

Q13643 four and a half LIM domains 3

Q8WW33 gametocyte specific factor 1

Q9H1H1 gametocyte specific factor 1-like

O14964 hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate

Q96JB3 hypermethylated in cancer 2

Q8N339 metallothionein 1M

Q9Y2Y1 polymerase (RNA) III (DNA directed) polypeptide K, 12.3 kDa

Q04759 protein kinase C, theta

Q96PM5 ring finger and CHY zinc finger domain containing 1

Q96DX4 ring finger and SPRY domain containing 1

Q969K3 ring finger protein 34

Q12874 splicing factor 3a, subunit 3, 60kDa

Q8TBC5 zinc finger and SCAN domain containing 18

Q96JL9 zinc finger protein 333

Q6GPI5, Q9NT83

zinc finger protein 839

Insgesamt konnten 28 (26%) der tumorassoziierten Kandidatenautoantigene als Zink-Ionen bindend

klassifiziert werden. Darunter befinden sich auch einige der Proteine, z.B. FHL1, FHL3 und LMCD1,


69

welche die höchste Prävalenz für GBM zeigten. Eine signifikante Anreicherung hinsichtlich zellulärer

Lokalisation oder biologischer Prozesse wurde nicht beobachtet.

4.4.4. Vergleich der Proteom- mit Transkriptomdaten

Um herauszufinden, ob die Abundanz der Antigene im Proteom des Glioblastoms eine Ursache für

die nachgewiesene Autoimmunreaktivität ist, wurden die tumorassoziierten Kandidatenautoantigene

mit den Proteinexpressionsdaten der vorangegangenen markierungsfreien Studie von Tumorgewebe

sowie einer publizierten Transkriptomstudie (Reifenberger et al. 2014) korreliert. Aus den

Transkriptomdaten ergab sich, dass 14617 Gene vom Tumor exprimiert werden. Für die

Proteomdaten wurden die Proteinidentifizierungen aus den Analysen von Gewebe der neun

Kurzzeitüberlebenden herangezogen.

Abbildung 4.19: Venn Diagramm der Daten aus Proteomanalyse, Transkriptomanalyse sowie auf dem Array

befindlichen rekombinanten Proteinen. Der Abgleich von den aus der Proteomanalyse von Tumorgewebe

erhaltenen Daten, Transkriptomdaten sowie den auf dem ProtoArray enthaltenen Proteinen ergibt, dass mindestens

73% der auf dem ProtoArray enthaltenen Proteine tatsächlich vom Tumor exprimiert werden. Bei 73 % konnte die

Expression von mRNA und bei 18 % das translatierte Protein per Massenspektrometrie in Glioblastomgewebe

nachgewiesen werden. Die restlichen 27 % der Proteine konnten weder auf Transkriptom- noch auf Proteomebene

detektiert werden.

Insgesamt konnte so, basierend auf der Anzahl identifizierter MS/MS Spektren, eine quantitative

Aussage für 2875 Proteine getroffen werden. Von den 8122 nicht redundanten Proteinen auf dem


70

ProtoArray wurden 5895 (72,6 %) auf mRNA Ebene in GBM Gewebe und 1441 (18 %) auf

Proteinebene mittels Massenspektrometrie nachgewiesen. Von 2193 (27 %) der gespotteten

Proteine konnte eine Expression in Glioblastomgewebe weder auf RNA- noch auf Protein-Ebene

gezeigt werden (Abbildung 4.19). Somit kann anhand der RNA- und Proteinexpressionsdaten gezeigt

werden, dass mindestens 73,0% (5929 Proteine) der auf dem ProtoArray als potentielle Antigene

befindlichen Proteine im Tumor exprimiert werden.

Anschließend wurden die 107 potentiellen tumorassoziierten Kandidatenautoantigene mit den

Transkriptom- und Proteomdaten verglichen. Hier konnte für insgesamt 22 (21%) Kandidaten die

Expression auf Proteom- bzw. für 82 (80%) auf Transkriptomebene nachgewiesen werden (Abbildung

4.20).

Abbildung 4.20: Venn Diagramm der Daten aus Proteomanalyse, Transkriptomanalyse und den 107

ermittelten potentiellen tumorassoziierten Autoantigenen. Von den 107 nicht-redundanten

Kandidatenautoantigenen konnte bei 80% die Expression von mRNA mittels Affymetrix-Chips und bei 21% das

translatierte Protein mittels Massenspektrometrie nachgewiesen werden. Bei lediglich 20 potentiellen tumor-

assoziierten Autoantigenen konnte mit keiner der beiden Methoden der Nachweis über eine tatsächliche Expression

im Tumorgewebe erbracht werden.

Zieht man die Anzahl identifizierter Spektren je Protein als quantitatives Maß heran, ergibt sich, dass

die 22 auf Proteinebene nachgewiesenen Kandidatenantigene annähernd den ganzen dynamischen

Bereich der Proteinidentifizierung abdecken. Es finden sich sowohl sehr niedrig konzentrierte (z.B.


71

Optineurin) als auch sehr hoch abundante Proteine (z.B. Moesin) (Abbildung 4.21). Eine generelle

Abhängigkeit der Immunreaktivität der potentiellen tumorassoziierten Autoantigene von ihrer

Konzentration im Tumorgewebe ließ sich somit nicht bestätigen.

Abbildung 4.21: Abundanzbereich der potentiellen tumorassoziierten Autoantigene anhand der

Proteomdaten. Die Kandidatenantigene überspannen einen dynamischen Bereich von mehreren Größenordnungen

von sehr niedrig bis hin zu hoch abundanten Proteinen. Für die relative Quantifizierung wurde die Anzahl

identifizierter MS/MS Spektren (spectral counts) der mittels nano HPLC-ESI/MS in Glioblastomgewebe identifizierten

Proteine zu Grunde gelegt. Zur besseren Übersicht wurde für die Darstellung der spectral counts eine logarithmierte

Skala gewählt.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

logP

SM

WARS, ACTN4, MSN, HSP90AA1

ERH, PRPSAP2, DIABLO, SF3A3, EGFR, T790M, EGFR(ErbB1), T790M, L858R, SF3B3, QARS, QARS, DBI, SNX1, CTNNA1, QKI, ANXA7, FHL1

OPTN, KIAA0513, IFIT3, SEC24C, HGS


72

4.4.5. Nachweis von tumorassoziierten Autoantikörpern im Plasma von

progressionsfreien, resektierten Glioblastompatienten mit mehr als

22 Monaten Gesamtüberleben

Mit der Identifizierung von tumorassoziierten Autoantikörpern im Plasma von neudiagnostizierten

Patienten stellte sich die Frage, inwieweit auch im Plasma von GBM Patienten, deren Resektion

schon mehrere Monate zurückliegt, diese tumorassoziierte Autoantikörper noch nachgewiesen

werden können.

Daher wurde ebenfalls Plasma von 20 GBM Patienten (siehe Tabelle 4.6), welches mindestens 22

Monate nach der Diagnose entnommen und die entweder eine vollständige (11 Patienten) oder

partielle (9 Patienten) Resektion hatten, analysiert und mit den nicht-tumor Kontrollen verglichen.

Unter der Anwendung derselben Kriterien wie in 4.4.2 beschrieben, konnten insgesamt 119

potentielle tumorassoziierte Autoantigene detektiert werden. Innerhalb dieser 119 potentiellen

Autoantigene fanden sich 48 Proteine wieder, die bereits beim Vergleich neu diagnostizierter

Patienten mit nicht-tumor Kontrollen identifiziert wurden (siehe 4.8).


73

Tabelle 4.8: Gemeinsame Tumor-assoziierte Autoantigene zwischen neu diagnostizierten Glioblastom Patienten und Patienten mehr als >22 Monaten nach Diagnosestellung.

Gen Symbol Swissprot ID Prävalenz in neu

diagnostizierten GBM Fällen

Prävalenz nach >22 Monaten

Im Transkriptom nachgewiesen


Spektren

APOBEC3A A8MYU8 72.73% 63.64% nein 0 BNIP3L O60238 86.36% 86.36% ja 0 C10orf26 Q9NX94 54.55% 72.73% ja 0 C11orf30 Q7Z589 59.09% 59.09% ja 0 C12orf41 Q9H9L4 68.18% 72.73% ja 0 C14orf131 Q6GPI5 50.00% 95.46% nein 0 C20orf18 Q9BYM8 54.55% 68.18% ja 0 C9orf97 Q5T7W7 63.64% 86.36% ja 0 CCDC69 A6NI79 50.00% 86.36% ja 0 DIABLO Q9NR28 63.64% 81.82% ja 13 DMD P11532 54.55% 90.91% ja 0 EGFR(ErbB1), T790M,L858R

P00533 54.55% 81.82% ja 17

EGFR,T790M P00533 59.09% 81.82% ja 17 EIF4G3 O43432 59.09% 63.64% ja 0 EP400NL A8MSW4 54.55% 86.36% nein 0 ERBB2 P04626 68.18% 72.73% ja 0 FAM112A Q9H1H1 50.00% 72.73% ja 0 FHL1 Q13642 81.82% 95.46% ja 49 FHL3 Q13643 72.73% 95.46% ja 0 HSP90AA1 P07900 59.09% 86.36% ja 556 IL1B P01584 59.09% 68.18% ja 0 LMCD1 Q9NZU5 72.73% 90.91% ja 0 MAPK7 Q13164 50.00% 86.36% ja 0 MGC10334 A0A024R043 63.64% 95.46% nein 0 MGC39821 Q96RF0 68.18% 77.27% ja 0 MT1M Q8N339 50.00% 86.36% ja 0 N/A Q8N0T2 50.00% 90.91% nein 0 NIP30 Q9GZU8 54.55% 63.64% ja 0 OPTN Q96CV9 68.18% 95.46% ja 1 POLR3K Q9Y2Y1 50.00% 81.82% ja 0 PRPSAP2 O60256 59.09% 72.73% ja 13 RASGRP3 Q8IV61 54.55% 81.82% ja 0 RCHY1 Q96PM5 68.18% 86.36% ja 0 RETN Q9HD89 50.00% 72.73% nein 0 RNF34 Q969K3 50.00% 77.27% ja 0 RSPRY1 Q96DX4 50.00% 81.82% ja 0 SEC24C P53992 50.00% 90.91% ja 3 SMR3B P02814 50.00% 77.27% nein 0 SNAP23 O00161 68.18% 95.46% ja 0 SNX1 Q13596 59.09% 86.36% ja 31 STAC Q99469 63.64% 77.27% ja 0 TCOF1 Q13428 54.55% 77.27% ja 0 TNIP2 Q8NFZ5 50.00% 90.91% ja 0 WARS P23381 54.55% 68.18% ja 106 XTP3TPA Q9H773 50.00% 81.82% ja 0 ZNF333 Q96JL9 59.09% 68.18% ja 0 ZSCAN18 Q8TBC5 50.00% 81.82% ja 0 ZXDC Q2QGD7 50.00% 63.64% ja 0


74

4.4.6. Validierung von potentiellen tumorassoziierten Autoantigenen

Für die Validierung von potentiellen tumorassoziierten Autoantigenen wurden solche Proteine

ausgewählt, die eine hohe Spezifität für den Tumor (hohe Prävalenz in der Patienten- niedrige

Prävalenz in der Kontrollgruppe) aufwiesen, in einem interessanten biologischen Kontext (bereits

bekannte Überexpression in Tumoren, bekanntes Autoantigen etc.) standen und kommerziell

erhältlich waren.

Abbildung 4.22: Boxplot Darstellung der Signalintensitäten der zur weiteren Validierung mittels ELISA

ausgewählten Kandidatenautoantigene. Die Konzentration von Autoantikörpern gegen die Proteine FHL1, FHL3,

ERBB2, und EGFR ist im Blut von Glioblastompatienten gegenüber gesunden Menschen signifikant erhöht. In der

Boxplot Darstellung sind die normalisierten Signalintensitäten des Microarrayexperiments nach quantiler

Normalisation dargestellt. 50% der Werte befinden sich innerhalb der Box, die Whiskers geben das Minimum und

Maximum der erhaltenen Signalintensitäten an. Der Median wird durch ⎕ repräsentiert.

Die höchste Spezifität von allen Kandidaten konnte für das four and a half LIM domains protein 1

(FHL1) detektiert werden. Ein positives Signal wurde in 19 der 20 analysierten Patientenproben aber

nur in einer der Kontrollproben nachgewiesen. Dies entspricht 91% Prävalenz für den Tumor und

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

norm

alis

iert

e S

ignalin

tensität

Kontrolle GBM-Patienten

FHL1

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

norm

alis

iert

e S

ignalin

tensität


FHL3

0.00

1000.00

2000.00

3000.00

4000.00

5000.00

6000.00

norm

alis

iert

e S

ignalin

tensität


ERBB2

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

norm

alis

iert

e S

ignalin

tensität


EGFR


75

weniger als 10% Prävalenz für die Kontrollgruppe (p-Wert: 2.91*10-09). Der Vergleich mit den

Expressionsdaten aus der Proteomstudie ergibt, dass FHL1 zu den 12% höchst abundanten Proteinen

gehört (Abbildung 4.21 und Abbildung 4.22).

Mit dem four and a half LIM domains-protein (FHL3) wurde ein weiteres Protein aus der Familie der

four and a half LIM domain Proteine für die Validierung ausgewählt. Es wies ebenfalls eine hohe

Prävalenz für GBM auf (Tumor Prävalenz: 86.36%; Kontroll Prävalenz: 13.64%; p-Wert 8.32*10-06)

(Abbildung 4.22). Die Expression von FHL3 konnte nur auf mRNA-Ebene nicht aber auf Proteom-

Ebene gezeigt werden.

Um sicher zu gehen, dass für die detektierte Antigenität der beiden Proteine FHL1 und FHL3 kein

gemeinsames Epitop aufgrund homologer Sequenzabschnitte verantwortlich ist, wurden die

Sequenzen verglichen (siehe Abbildung 4.23). Ein Alignment mit dem Online-Tool BLASTP (Altschul et

al. 1997; Altschul et al. 2005) ergab, dass 44% der Sequenzen beider Proteine identisch sind, aber nie

mehr als vier aufeinanderfolgende Aminosäuren identisch. Daher scheint ein gemeinsames Epitop

eher unwahrscheinlich.

Abbildung 4.23: Sequenz-Alignment von FHL1 und FHL3. Das Sequenz-Alignment mit BLASTP zeigt, dass FHL1

(Subject) und FHL3 (Query) lediglich 44% Sequenzidentität aufweisen und maximal 4 aufeinanderfolgende identische

Aminosäuren haben.

Die Rezeptor Tyrosin-Kinase erbB-2 (ERBB2) zeigte ebenfalls eine starke autoimmune Antwort in der

Patientengruppe (p=1.64*10-04). Seine Prävalenz für den Tumor liegt über 80% im Vergleich zu 14% in

der Kontrollgruppe (siehe Abbildung 4.22). ERBB2 konnte sowohl im Rahmen der Proteomstudie als

auch der Transkriptomstudie detektiert werden. Interessanter Weise wurden von ERBB2 zwei

Sequenzen auf dem Array gespottet, aber nur für eine Sequenz konnte eine signifikante autoimmune

Antwort in Tumorpatienten beobachtet werden. Ein Sequenzvergleich mit dem online Programm

BLASTP ergab, dass die nicht reaktive Sequenz komplett in der zweiten Sequenz enthalten ist, die

reaktive Sequenz aber noch zusätzliche Aminosäuren am N- und C-Terminus enthält (siehe Abbildung

Query 1 MAEKFDCHYCRDPLQGKKYVQKDGHHCCLKCFDKFCANTCVECRKPIGADSKEVHYKNRF 60 M+E FDC C + L G+KY+Q D C+ C+D ANTC EC++ IG DS+E+ Y++R Sbjct 1 MSESFDCAKCNESLYGRKYIQTDSGPYCVPCYDNTFANTCAECQQLIGHDSRELFYEDRH 60 Query 61 WHDTCFRCAKCLHPLANETFVAKDNKILCNKCTTREDSPKCKGCFKAIVAGDQNVEYKGT 120 +H+ CFRC +C LA+E F +D+++LCN C S +C C + ++ G + +EY G Sbjct 61 FHEGCFRCCRCQRSLADEPFTCQDSELLCNDCYCSAFSSQCSACGETVMPGSRKLEYGGQ 120 Query 121 VWHKDCFTCSNCKQVIGTGSFFPKGEDFYCVTCHETKFAKHCVKCNKAITSGGITYQDQP 180 WH+ CF CS C+Q +G+ SF P YCV C+E KFA C +C+K +T GG+TY+DQP Sbjct 121 TWHEHCFLCSGCEQPLGSRSFVPDKGAHYCVPCYENKFAPRCARCSKTLTQGGVTYRDQP 180 Query 181 WHADCFVCVTCSKKLAGQRFTAVEDQYYCVDCYKNFVAKKCAGCKNPITGFGKGSSVVAY 240 WH +C VC C LAGQ+FT+ ++ YCV C+ A KC+ CK PI G G G V++ Sbjct 181 WHRECLVCTGCQTPLAGQQFTSRDEDPYCVACFGELFAPKCSSCKRPIVGLG-GGKYVSF 239 Query 241 EGQSWHDYCFHCKKCSVNLANKRFVFHQEQVYCPDCAK 278 E + WH CF C +CS +L + FV +QV C C++ Sbjct 240 EDRHWHHNCFSCARCSTSLVGQGFVPDGDQVLCQGCSQ 277


76

4.24). Daher liegt die Schlussfolgerung nahe, dass die autoimmun reaktive Sequenz im N- oder C-

terminalen Bereich lokalisiert ist.

MLVPRGSPWIRNSKAYVDKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERAKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV

Abbildung 4.24: Sequenz-Alignment der zwei gespotteten Sequenzen von ERBB2. Der Vergleich der zwei

gespotteten Sequenzen von ERBB2 mit BLASTP zeigt, dass die Sequenz, bei der kein Antikörpersignal detektiert

werden konnte, vollständig innerhalb der Sequenz liegt, bei der ein Antikörpersignal beobachtet wurde (100%

Identity). Letztere weist aber zusätzlich N- und C-terminale Bereiche auf (grau hervorgehoben).

Mit ERBB1 zeigte darüber hinaus noch ein weiteres Protein der EGF-Rezeptor-Familie eine erhöhte

Immunantwort in dem Kollektiv der GBM Patienten. Bei vier der fünf auf dem Array gespotteten

ERBB1 Mutanten wurde eine signifikante Reaktion mit dem Plasma der Tumorpatienten detektiert (

Tabelle 4.9). Die stärksten Reaktionen zeigten sich mit der T790M Mutation. Die Expression von

ERBB1 konnte sowohl auf Proteom- als auch auf Transkriptomebene gezeigt werden.

Tabelle 4.9: Detektierte Immunantworten gegen die fünf verschiedenen, gespotteten Varianten von EGFR auf dem ProtoArray

Gen-Variante Prävalenz für Kontrollen

Prävalenz für neu diagnostizierte

Tumorpatienten

p-Wert

EGFR,T790M 22,73 % 81,82 % 1,64*10-04

EGFR(ErbB1), T790M,L858R 18,18 % 72,73 % 6,16*10-04

EGFR(ErbB1),L858R 18,18 % 63,64 % 1,53*10-04

EGFR 18,18 % 59,09 % 3,96*10-04

EGFR(ErbB1),L861Q 18,18 % 45,46 % 4,12*10-04

Eine Immunantwort gegen die häufigen tumorassoziierten Antigene p53 und cancer/testis antigen 1

ebenso wie gegen die kürzlich in Glioblastompatienten entdeckten Antigene PHF3, GLEA1 und GLEA2

konnten nicht detektiert bzw. bestätigt werden, da diese Proteine nicht auf dem Array vorhanden

waren.

Für die Validierung der Kandidaten an einem unabhängigen Probenkollektiv wurde das

antikörperbasierte Nachweisverfahren des Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ausgewählt.

Hierfür wurden rekombinant erworbene Kandidatenantigene adsorptiv an Mikrotiterplatten


77

gebunden und jeweils 20 Plasmaproben von Patienten und nicht tumorerkrankten Kontrollen

hinsichtlich einer Bindung von Autoantikörpern an das jeweilige Antigen untersucht. Zunächst

wurden die Proteine ERBB2 und FHL1 mittels ELISA validiert. Zusätzlich wurden mit MAPK1 und

FABP3 zwei Proteine als Negativkontrolle ausgewählt, welche keine differentielle Antikörperantwort

im Rahmen des Protein-Arrays zeigten. Für ERBB2 konnte ein signifikant differentielle Signal zwischen

den beiden untersuchten Gruppen beobachtet werden (t-Test 0,03), für FHL1 konnten die Ergebnisse

aus dem Protein-Array Experiment nicht bestätigt werden (t-Test 0,98). Die Negativkontrollen zeigten

erwartungsgemäß ebenfalls keine signifikanten Unterschiede (siehe Tabelle 4.10). Die Validierung

der zwei anderen Kandidaten, FHL3 und ERBB1, stehen noch aus.

Tabelle 4.10: Übersicht der Ergebnisse der Validierung von Kandidatenantigenen an einem unabhängigen Probenkollektiv mittels ELISA

Antigen Mittelwert der Signalintensität bei

Tumorpatienten

Mittelwert der Signalintensität bei

Kontrollen

Verhältnis der Signalintensität Tumor

zu Kontrolle

t-Test

ERBB2 0,81 0,44 1,84 0,03

FHL1 0,61 0,61 0,99 0,98

MAPK1 0,23 0,28 0,82 0,11

FABP3 0,25 0,26 0,97 0,79

Kapitel 5: Diskussion

78

5. Diskussion

Methodische Aspekte der proteomanalytischen 5.1.

Charakterisierung des Glioblastoms

Das Ziel dieser Arbeit war es, molekulare Ursachen für das Langzeitüberleben bei

Glioblastompatienten zu finden. Die Fragestellung des LTS ist mittlerweile in diversen Studien unter

Berücksichtigung zahlreicher Aspekte wie etwa demographische Daten von Patienten, schädliche

Umwelteinflüsse, klinische Parameter und Behandlungsstrategien adressiert worden. Im Rahmen

dieser Studien konnte bisher gezeigt werden, dass ein junges Alter bei Diagnosestellung und eine

gute allgemeine Konstitution den Krankheitsverlauf begünstigen (Curran et al. 1993). Darüber hinaus

gibt es erste Ansätze, die versuchen, das LTS auf molekulargenetischer Ebene zu charakterisieren. Bei

Arbeiten zur Analyse genetischer Veränderungen der Tumoren sowie der mRNA Expression (Krex et

al. 2007; Reifenberger et al. 2014) konnten Hinweise auf einen positiven Einfluss der MGMT

Promotormethylierung und IDH1 Mutation auf die Gesamtüberlebensdauer detektiert werden. Um

weitere Informationen über die klinische Gruppe der LTS zu erhalten, wurde in dieser Arbeit ein

proteomanalytischer Ansatz gewählt.

5.1.1. Klinische Proteomanalyse von Glioblastomen

Eine besondere Herausforderung bei der Aufklärung der molekularen Ursachen des klinisch

definierten Phänomens des Langzeitüberlebens mithilfe der Proteomanalyse ist, dass keine

Modelsysteme wie z.B. Zellkultur oder Tiermodelle etabliert sind, die in der Lage wären, dieses

komplexe systemische Bild darzustellen. Aus diesem Grund wurde bisher für molekulare Studien

ausschließlich auf die ex vivo Analyse von Tumormaterial gesetzt. Im Rahmen des deutschen

Gliomnetzwerks wurde hierfür eine prospektive Gewebe- und Plasmasammlung etabliert, welche

mittlerweile über 1800 Gewebeproben und 900 Plasmaproben umfasst.

Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit bzw. Eignung der klinischen Proben stellt sich für die

molekulare Analyse die Herausforderung, Methoden einzusetzen, die materialsparend sind, aber

dennoch eine umfassende Analyse erlauben. Bezogen auf die Materialverfügbarkeit ist Plasma

unproblematisch und gehört zu der Gruppe der leicht zugänglichen biologischen Proben. Allerdings

hat sich in der Vergangenheit gezeigt, dass die direkte molekulare Analyse von Plasma mit den

heutigen Methoden der Proteomanalyse nicht zielführend ist. Die hohe Konzentration weniger

Plasmaproteine wie z.B. Hämoglobin, Albumin und Bestandteile des Komplementsystems,


79

überdecken häufig die Signale gering konzentrierter Proteine und lassen nur bedingt Aussagen über

pathologische Signaturen zu (Anderson und Anderson 2002). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass

Plasma sehr gut geeignet ist, um die humorale Immunantwort zu untersuchen. Hier ermöglicht die

hohe Bindungsaffinität von (Auto-) Antikörpern das analytische Problem des hohen dynamischen

Konzentrationsbereichs von Proteinen in Plasma zu umgehen. So konnten z.B. Lennon et al. (2004)

im Blut von Multiple Sklerose Patienten, die unter Neuromyelitis optica litten, Antikörper gegen den

Wasserkanal Aquaporin 4 nachweisen (Lennon et al. 2004). Die Anwesenheit von Antikörpern gegen

Aquaporin 4 sind mittlerweile ein etablierter Biomarker für Neuromyelitis optica und ein

entscheidendes Kriterium für die Diagnosestellung.

Für die Analyse von klinischen Gewebeproben mittels Proteomanalyse existieren diverse gut

etablierte Methoden (Apweiler et al. 2009). Für eine besonders materialschonende Analyse von

Tumorgewebe wurde im Vorfeld dieser Arbeit eine Methode zur kombinierten Analyse von DNA/RNA

und Proteinen entwickelt (Grzendowski et al. 2009). Mit dieser Methode ist es möglich, die bei der

Aufarbeitung von DNA/RNA entstehenden Proteinfraktionen durch Entsalzungsschritte für die

quantitative Proteomanalyse einzusetzen. Diese Vorgehensweise wurde in dieser Arbeit für die

Analyse von GBM-Gewebe erfolgreich adaptiert. Die nachträgliche Analyse der im

Validierungsexperiment verwendeten Proben ergab hingegen, dass es sich ausschließlich um

Tumoren ohne Mutation im IDH1-Gen handelte. Da für die Transkriptomanalyse mögliche IDH1-

Mutationen bereits berücksichtigt wurden, waren sowohl Proteinblotting als auch der Abgleich mit

den Transkriptomdaten rückblickend für die Validierung der Ergebnisse der 2D-DIGE Studie nur

bedingt geeignet.

Für die Analyse bestimmter Zelltypen hat sich eine Kombination aus Mikrodissektion und

quantitativer Proteomanalyse bewährt. So konnte von der Arbeitsgruppe Stühler eine Methode zur

Analyse von 1000 mikrodissektierten Pankreaszellen mittels anschließender 2D-DIGE-Technik

etabliert werden (Sitek et al. 2005). Anders als bei der Zellsortierung fluoreszenz-markierter Zellen

durch Durchflusszytometrie, die den Einsatz von Frischgewebe erfordert, kann die Laser

Mikrodissektion auch an Kryoschnitten durchgeführt werden (Stingl et al. 2011). Dieser Umstand

erlaubte die erfolgreiche Adaption der Mikrodissektion von GBM Gewebe und ihre Übertragung auf

markierungsfreie Analysen im Rahmen dieser Arbeit. Hierdurch konnten bei der Analyse von 500 ng

Gesamtprotein, isoliert aus Kryoschnitten des GBM, rund 3500 Proteine mittels HPLC-MS/MS

identifiziert und quantifiziert werden. In einer Arbeit von Liu et al. (2013) wurden markierungsfreie

MS-Analysen an 0,5 mm2 mikrodissektiertem Brustkrebsgewebe durchgeführt, was ca. 200-400 ng

Gesamtprotein entspricht. Diese erlaubten die Identifizierung von 2337 Proteinen. Ferner konnten

mithilfe der Laser-Capture Mikrodissektion quantitative Proteomanalysen an 500 bis 3000


80

mikrodissektierten Kolonkarzinomzellen von Wisniewski et al. (2011) durchgeführt werden. Hier war

nach Fraktionierung eine Identifizierung von über 4000 Proteinen mittels Massenspektrometrie

möglich. Da die Zelldichte in verschiedenen Geweben sehr stark variieren kann, ist hier ein Vergleich

jedoch nur sehr bedingt möglich.

5.1.2. Quantitative Proteomanalyse von Glioblastomen

Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein möglichst umfassendes Bild des Proteoms von

Langzeitüberlebenden im Vergleich zu Kurzzeitüberlebenden erstellt werden. Aus diesem Grund

wurde zum einen die 2D-DIGE-Technik zum anderen die markierungsfreie Quantifizierung von

Proteinen mittels Massenspektrometrie eingesetzt. Vorteil der 2D-DIGE-Technik ist, dass eine

Analyse intakter Proteine (top down) möglich ist. Durch ihr sehr gutes Auflösungsvermögen wird die

Detektion posttranslationaler Modifikationen und Proteinisoformen ermöglicht. In dieser Arbeit

konnte gezeigt werden, dass durchschnittlich 3000 Proteinspots quantifiziert werden können. Zabel

und Klose (2009) konnten sogar eine Auftrennung von über 10.000 Proteinspots mittels 2D-

Gelelektrophorese erreichen. Allerdings muss berücksichtigt werden, dass bei dieser Methode die

Quantifizierung zunächst unabhängig von der Identifizierung der Proteine abläuft. Diese ist stark von

den Eigenschaften des betreffenden Proteins, seiner Abundanz in der Probe sowie dem verwendeten

Massenspektrometer abhängig. In der vorliegenden Arbeit lag die Identifizierungsrate bei etwa 90%.

Im Vergleich hierzu konnten mittels Massenspektrometrie basierter top-down-Analyse zu dem

damaligen Stand der Technik lediglich etwa 25 Proteine standardmäßig identifiziert werden (Parks et

al. 2007). Dennoch ist diese Methode sicherlich eine der vielversprechendsten im Bereich der

Analytik intakter Proteine. Die Zahl der identifizierten Proteine ist mit fortschreitenden technischen

Entwicklungen stetig angestiegen. So konnten im Jahr 2012 von Ahlf et al. (2012) 690 Proteine, im

Jahr 2013 von Catherman et al. (2013) bereits 1220 Proteine aus der humanen Zelllinie H1299 mittels

top-down Massenspektrometrie identifiziert werden. Momentan gilt für die Analyse von klinischen

Proben aber die peptidbasierte Analytik (bottom up) mittels Massenspektrometrie als Goldstandard

(Megger et al. 2013). Der entscheidende Vorteil dieser Methode liegt vor allem in der parallelen

Identifizierung und Quantifizierung der vermessenen Analyten. Aus diesem Grund wurde für diese

Arbeit die markierungsfreie Quantifizierung mittels Massenspektrometrie für die Analyse der

mikrodissektierten Proben gewählt. Markierungsfreie Analysen besitzen gegenüber

isotopenbasierten Methoden den Vorteil, dass jede Art von Probe ohne weitere Manipulation wie

z.B. der Inkorporation von schweren Aminosäuren im Falle von metabolischen Markierungsstrategien

(SILAC) oder chemischen Modifikationen des Analyten (z.B. bei iTRAQ oder der Dimethyl-Markierung)

und ohne Nachteile bzgl. des zur Verfügung stehenden dynamischen Bereichs der Quantifizierung


81

eingesetzt werden kann (Old et al. 2005). So sind metabolische Markierungen im Moment noch auf

Zellkultursysteme beschränkt. Die Analyse von humanem Gewebe ist nur unter Zuhilfenahme eines

markierten Zellkulturstandards möglich (Geiger et al. 2010). Darüber hinaus erfordern alle diese

Quantifizierungsstrategien, dass die jeweilige Markierungsreaktion vollständig und reproduzierbar

abläuft. Bei der markierungsfreien Quantifizierung wird auf eine Markierung der Proteine bzw.

Peptide gänzlich verzichtet. Sie kann daher ebenfalls für alle Arten von biologischen Proben

eingesetzt werden. Von entscheidender Bedeutung ist hierbei ein höchst reproduzierbares HPLC-MS

System. Im Gegensatz zu isobaren Markierungstechniken, bei der für die Quantifizierung die

Aufnahme eines Fragmentspektrums notwendig ist, ist die erfolgreiche Quantifizierung eines

Proteins bereits nach der Identifizierung mittels eines einzigen Peptidspektrums möglich. Darüber

hinaus wird die Komplexität der Probe nicht durch das Mischen der verschiedenen Proben zusätzlich

erhöht. Daraus resultiert unter anderem der sehr hohe dynamische Bereich dieser Methode, der

typischerweise höher liegt als der jener Methoden, die sich der Markierung mit stabilen Isotopen

bedienen (Old et al. 2005; Liu et al. 2013).

Im Rahmen dieser Studie war eine relative Quantifizierung für 2755 Proteine möglich. In einer

ähnlichen Arbeit von Liu et al. (2013), in der mikrodissektiertes Brustkrebsgewebe analysiert wurde,

konnten 1624 Proteine mittels markierungsfreier Quantifizierung analysiert werden. In einer

anderen, ebenfalls auf Mikrodissektion von Brustkrebsgewebe basierenden Studie von Cha et al.

(2010) konnten 1623 Proteine quantifiziert (2588 Proteine identifiziert) werden, wobei rund 18% als

differentiell ermittelt wurden. Somit konnten in der hier vorliegenden Arbeit trotz eines ähnlichen

Ansatzes eine etwas überdurchschnittliche Anzahl an Proteinen quantifiziert werden. In der Arbeit

von Liu et al. (2013) wird darüber hinaus der CV der Peptide mit 31,7 % angegeben, in der

vorliegenden Arbeit lag dieser bei 33 %. Variationskoeffizienten für Proteine werden in einer Arbeit

von Ijsselstijn et al. (2013) an hoch abundanten Serumproteinen zwischen 22,55 % und 43,22 %

angegeben, von Lai et al. (2011) zwischen 11,4 % und 63,4 % je nach betrachtetem Protein. Beide

Gruppen geben an, dass der CV in Abhängigkeit des betrachteten Proteins sehr stark schwanken

kann, so dass der über alle Proteinidentifizierungen gerechnete CV von 30 % in dieser Arbeit als

durchschnittlich anzusehen ist.

5.1.3. Proteinarrays zur Detektion zum Nachweis von Tumorantigenen

Zur Detektion Glioblastom-assoziierter Antikörper wurden in dieser Arbeit Protein Arrays eingesetzt,

die das parallele Screening von Autoantikörpern gegen rund 9000 potentielle Antigene ermöglichten.

Im Gegensatz zu der bisher für diese Fragestellungen häufig verwendeten Methode SEREX (Sahin et

al. 1997), die als Antigenquelle cDNA-Banken benutzt, handelt es sich bei den Protein Arrays um eine


82

alternative Methode, bei der rekombinante Proteine im Arrayformat gespottet werden (Sundaresh et

al. 2006). Obwohl die Verwendung von cDNA Banken eine sehr hohe Sensitivität und eine

ausgezeichnete Antigenabdeckung bietet, muss doch berücksichtigt werden, dass sich die

rekombinanten Antigene möglicherweise, z.B. durch das Fehlen von PTMs, von den tatsächlich im

Tumor exprimierten unterscheiden (Rauch und Gires 2008). Durch die Verwendung von Protein

Arrays, deren Antigene in Insektenzellen produziert werden, sollte hier auch dieser Sachverhalt

berücksichtigt werden. Im Vergleich mit den 9000 auf dem Array gespotteten Proteinen liegt die

Anzahl untersuchter Antigene in einem typischen SEREX-Experiment deutlich höher, da hier ganze

cDNA Banken mit mehreren hunderttausend Klonen getestet werden (Sahin et al. 1997; Rauch und

Gires 2008). Jedoch ist es unwahrscheinlich, dass die in der verwendeten cDNA Datenbank

enthaltenen Sequenzen allesamt auch tatsächlich in Proteine translatiert werden. Andere Methoden

wie PROTEOMEX (Klade et al. 2001; Unwin et al. 2003) oder AMIDA (Gires et al. 2004) verwenden

Tumorlysate als Antigenquelle. Bei beiden Methoden erfolgt die Identifizierung eines potentiellen

Antigens mittels Massenspektrometrie erst im Anschluss an die Signaldetektion und ist somit zum

einen von deren Güte abhängig, zum anderen auf eine wesentlich kleinere Anzahl analysierter

Antigene beschränkt. Bei der Verwendung von Array Plattformen werden sowohl die Anzahl als auch

die Herkunft der analysierbaren Antigene durch den Hersteller des Arrays vorgegeben. Daher wurde

bei der Auswahl des Arrays und im Rahmen der Auswertung durch den Vergleich mit den in dieser

Arbeit erstellten Proteinprofilen und mRNA Expressionsdaten von Glioblastomen darauf geachtet,

dass die potentiellen Antigene auch tatsächlich im Tumor exprimiert werden.

Bezogen auf die einzusetzende Menge an Patientenmaterial unterscheiden sich die verschiedenen

Techniken kaum. Wenige Mikroliter Plasma oder Serum reichen, da die Proben in der Regel stark

verdünnt (1:500-1:1000) eingesetzt werden (Sahin et al. 1997; Rauch und Gires 2008; Le Roux et al.

2010). Für autoimmunologische Screenings mit Hilfe von Protein Arrays kann grundsätzlich sowohl

Plasma oder Serum verwendet werden (Marina et al. 2008; Le Roux et al. 2010). Da die im Rahmen

dieser Arbeit gesammelten Proben auch für andere Studien und Experimente zur Verfügung stehen

sollten, wurde letztendlich die Entscheidung getroffen, Plasma zu sammeln. Vortests zu dieser Arbeit

zeigten, dass bei Verwendung von Serum und Plasma desselben Patienten keine signifikanten

Unterschiede im Immunprofil zu detektieren waren. Dies ermöglichte im Folgenden den Einschluss

von Arraydaten von Serumproben nicht-tumorerkrankter Patienten. Als kritisch erwies sich lediglich

die Verwendung von Arrays, welche zu unterschiedlichen Zeitpunkten produziert wurden. Daher

wurde darauf geachtet, dass alle eingesetzten Arrays derselben Produktionscharge entstammten.


83

Für die Validierung von Ergebnissen, die mittels Protein Array Technologie gewonnen wurden hat

sich der Enzyme-linked immunosorbent assay mittlerweile als Standardmethode durchgesetzt

(Querol et al. 2013; Kinloch et al. 2014). Diese stellt aufgrund der substantiellen Unterschiede in der

Art wie die Antigene präsentiert werden dennoch eine besondere Herausforderung dar (Querol et al.

2013). So konnten von Kinloch et al. (2014) einige der mittels ProtoArray gewonnenen Ergebnisse

nicht mittels ELISA bestätigt werden. Auch in dieser Arbeit konnte bisher nur eines der zwei bereits

getesteten Kandidatenantigene mittels ELISA validiert werden. Da seitens des Herstellers nur

unvollständige Mengenangaben zu den Antigenen vorlagen und darüber hinaus Autoantikörper sehr

unterschiedliche Sensitivitäten aufweisen können (Liu et al. 2014), ist es jedoch denkbar, dass die

eingesetzte Menge von Antigen in diesem Fall nicht ausreichend war und eine höhere Proteinmenge

eingesetzt werden muss (Querol et al. 2013; Liu et al. 2014).

Biologische Aspekte der proteomanalytischen 5.2.

Charakterisierung des Glioblastoms

Ziel dieser Arbeit war es, durch die proteomanalytische Untersuchung von Gewebe- und

Plasmaproben molekulare Signaturen zu identifizieren, die Aufschluss über die biologischen Prozesse

beim Langzeitüberleben von Glioblastompatienten geben. Wie oben bereits beschrieben, ist die

molekularbiologische Untersuchung von GBM LTS nur mithilfe von Patientenproben möglich und

sinnvoll. Daher sind jedoch, insbesondere im Hinblick auf die Gewebeproben, Aussagen über

Veränderungen gegenüber gesundem Gewebe nicht möglich, da dieses aus ethischen Gründen nicht

zur Verfügung stand. In der gewebebasierten Studie wurde sich daher darauf beschränkt,

Unterschiede zwischen den analysierten Tumorentitäten zu detektieren. Die Unterscheidung der

Tumoren fand nach ihrem klinischen Verlauf statt. Die Gruppe der LTS-Patienten umfasste Gewebe

von Patienten, die ein progressionsfreies Gesamtüberleben von mehr als 36 Monaten aufwiesen, in

der Gruppe der STS befanden sich nur Patienten, die innerhalb von 12 Monaten nach

Diagnosestellung verstarben. Im Rahmen der gewebebasierten Studie wurden dann sowohl LTS und

STS Patienten jeweils ohne Mutation im IDH1-Gen verglichen als auch ein Vergleich zwischen LTS mit

und ohne IDH1-Mutation durchgeführt.


84

5.2.1. Differentielle Proteomanalyse des Tumorgewebes von

Glioblastomen hinsichtlich des Langzeitüberleben

Das Langzeitüberleben von Glioblastompatienten wurde bisher überwiegend hinsichtlich eines

Einflusses genetischer Veränderungen sowie exogener Faktoren untersucht. Bisher sind lediglich zwei

Studien, die das LTS mithilfe der Proteomanalyse untersucht haben, publiziert. Park et al. (2009)

berichtete basierend auf einer 2D-PAGE-Studie dass das Protein Mangan-Superoxid-Dismutase (Mn-

SOD) hochreguliert in STS gegenüber LTS Patienten sei. Aufgrund der geringen Anzahl der

analysierten Patienten (2 LTS und 2 STS) wurde die notwendige Statistik in dieser Studie jedoch nicht

durchgeführt. Patel et al. (2013). untersuchten 2013 mit Hilfe von kombinatorischer Netzwerkanalyse

und anschließenden markierungsfreier Proteomik von 16 GBM Patienten ebenfalls Langzeitüberleben

und konnten zeigen, dass in LTS eine erhöhte Expression von DNM1 und MAPK1 sowie eine

verminderte Proteinexpression von HSPA9, PSMD3 und CANX zu beobachten war. In einer Studie von

Barbus et al. (2011), wurden die mRNA Profile von 11 LTS und 12 STS Patienten untersucht und

Unterschiede in Retinsäure abhängigen Signalwegen aufgedeckt. In einer ähnlichen, aber deutlich

umfangreicheren Studie von Reifenberger et al. (2014), in der die mRNA von insgesamt 94 Patienten,

davon 28 LTS und 20 STS, untersucht und in der auch der Einfluss der IDH1 Mutation berücksichtigt

wurde, konnten dann allerdings keine Unterschiede zwischen LTSwt und STSwt Patienten auf

Genexpressionsebene detektiert werden.

In dieser Arbeit konnten mithilfe der markierungsfreien Analyse entsprechende Proteinprofile von

Tumorgewebe von GBM LTS und GBM STS erstellt werden. So konnten für LTSwt und STSwt 2417

bzw. 2903 Proteine identifiziert werden, von denen 178 eine unterschiedliche Abundanz aufwiesen.

Die detaillierte Auswertung der 162 in GBM STS hochregulierten Proteine ergab, dass 64 Proteine

mitochondrialen Ursprungs sind. Diese signifikante Anreicherung innerhalb der differentiell in STS

hochregulierten Proteine lässt einen mitochondrialen Phänotyp postulieren.

Seit langem ist bekannt, dass das Mitochondrium bei der Tumorgenese eine wichtige Rolle spielt

(Warburg 1956). So wurde bereits 1924 von Otto Warburg bei Krebszellen ein Wechsel von der

oxidativen Phosphorylierung der Mitochondrien hin zur aeroben Glykolyse beschrieben. Hiermit kann

die Tumorzelle neben ATP auch wichtige Metabolite für die Synthese von Nukleotiden, Fettsäuren

usw. generieren und so einen proliferativen Phänotypen aufrechterhalten. Dieser Wechsel ist für

Gliome ebenfalls beschrieben und wird auch bei deren Diagnose ausgenutzt. So ermöglicht z.B. die

erhöhte Glukoseaufnahme im Tumor die Verwendung von 18F-markierter 2-Deoxyglukose bei der

Positronen Emissions Tomographie (PET) zur Unterscheidung von Tumor und gesunden oder


85

nekrotischen Regionen (Wienhard et al. 1989). Nicht-invasive Magnetresonanz Techniken wie z.B. die

H-MR Spektroskopie (MRS) des Gehirns machen sich ebenfalls die vermehrte aerobe Glykolyse von

Gliomen zu nutze. Hier werden die Zunahme von Cholin und Laktat sowie die Abnahme von N-Acetyl-

Aspartat als Marker für die Synthese von neuronenspezifischen Aminosäurederivaten gemessen.

Unter allen Gliomen zeigen Glioblastome hierbei die höchsten Level an Cholin und Laktat (Bulik et al.

2013).

Die erhöhte Abundanz mitochondrialer Proteine bei STS-Patienten könnte auf eine Rolle der

Mitochondrien bei der Tumorgenese von Glioblastomen hindeuten, welche Einfluss auf den

unterschiedlichen klinischen Verlauf von GBM Patienten mit verkürzter Gesamtüberlebenszeit

nimmt. Neben der erhöhten Proliferation von Tumorzellen muss sich eine Krebszelle auch gegenüber

antiapoptotischen Prozessen schützen. So wurde in diesem Zusammenhang vor kurzem ein Prozess

beschrieben, der die Tumorzelle durch Benutzung der Fettsäureoxidation und Erzeugung des

Reduktionsmittel NADPH vor oxidativen Stress schützt (Carracedo et al. 2013). Es konnte gezeigt

werden, dass sich Krebszellen durch die mitochondriale Fettsäureoxidation und den damit

verbundenen Anstieg der cytosolischen NADPH-Konzentration einen Überlebensvorteil verschaffen

und somit die Tumorigenität steigern. NADPH spielt zum einen eine wichtige Funktion als Co-Enzym

anaboler Enzyme, welche die Bausteine für das Wachstum der Krebszelle bereitstellen, zum anderen

hat es eine entscheidende Rolle beim Schutz der Zellen vor oxidativem Stress (Chiarugi et al. 2012). In

dieser Arbeit wurden sowohl die Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase, welche im Rahmen des

Pentose-Phosphat-Wegs NADPH generiert, als auch mit β-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase und

Enoyl-CoA Hydratase zwei Proteine der Fettsäure-Oxidation, welche indirekt über die Bereitstellung

von Substratvorläufern von IDH1/2 NADPH erzeugt, mit erhöhter Abundanz in STS-Patienten

nachgewiesen. Ein erhöhter NADPH-Level scheint in STS Patienten somit wahrscheinlich.

In einer Arbeit, bei der die Fettsäureoxidation mittels Ectomoxir in der Glioblastomzellinie SF188

inhibiert wurde, konnte gezeigt werden, dass das Absinken der NADPH Konzentration und der damit

verbundenen fehlende Schutz vor oxidativem Stress durch Glutathion zum Zelltod führt (Pike et al.

2011). Durch den zusätzlichen Einsatz des ROS senkenden Chelatbildners Tiron konnte außerdem der

Beweis geführt werden, dass die ATP-Produktion durch die mitochondriale Fettsäureoxidation nicht

ursächlich für den Zelltod war, sondern lediglich die NADPH-Konzentration darüber entscheidet, ob

die Krebszelle überlebt. Dieser Mechanismus verschafft den Krebszellen einen Überlebensvorteil

gegenüber anderen Zellen. Übertragen auf die hier untersuchte Fragestellung könnte dies bedeuten,

dass der klinische Verlauf von GBM Patienten mit kürzerer Überlebenszeit damit zu begründen ist,

dass diese Tumorzellen sich durch die Hochregulation der mitochondrialen Fettsäureoxidation und


86

die damit verbundene Produktion von NADPH einen Schutz vor oxidativen Stress verschaffen, wie er

durch die Chemo- und Strahlentherapie verursacht wird (Abbildung 5.1). So konnten mit der

Phospholipid-Hydroxyperoxid-Glutathion-Peroxidase und der Glutathion-S-Transferase zwei

Gluthathion-abhängige Proteine in STS als hochreguliert detektiert werden, welche die Zelle vor ROS

schützen und bei der Zellentgiftung eine wichtige Rolle spielen. Darüber hinaus zeigt mit DJ1 ein

weiteres Protein in STS Patienten eine erhöhte Proteinexpression, das Schutz vor oxidativem Stress

vermittelt.

Offen bleibt in diesem Zusammenhang die Frage, wie die Krebszelle die konkurrierenden Prozesse

Fettsäureoxidation und –synthese aufeinander abstimmt, um zum einen den „Survival-Phänotyp“

und zum anderen den proliferativen Phänotyp (Warburg-Effekt) zu ermöglichen. In einer Arbeit von

Jeon et al. (2012) konnte jedoch kürzlich gezeigt werden, dass Krebszellen je nach

Umweltbedingungen in der Lage sind, AMPK vermittelt alternativ Fettsäureoxidation oder –synthese

durchzuführen.

Abbildung 5.1: Möglicher Schutzmechanismus des Tumors vor ROS und Zellgifte durch erhöhte Fettsäureoxidation in Kurzzeitüberlebenden des Glioblastoms. Die β-Oxidation liefert mit Acetyl-CoA den Ausgangstoff für das Substrat der IDH1 und IDH2. Somit könnte eine erhöhte Abundanz, der an der β-Oxidation beteiligten Proteine sowie der ebenfalls NADPH erzeugenden G6PDH eine Erhöhung der intrazellulären NADPH-Konzentration zur Folge haben. Diese ist entscheidend für die Reduktion von Glutathion (GSH) durch die Glutathion Reduktase (GSR). Reduziertes Glutathion regeneriert wiederum diverse Proteine, die Schutz vor ROS und toxischen Substanzen vermitteln. Proteine und Prozesse, die in dieser Arbeit als in Kurzzeitüberlebenden hochreguliert gezeigt werden konnten, sind fett gezeichnet.


87

Interessanterweise könnte somit dem Phänotyp LTS bei Patienten mit fehlender IDH1 Mutation eine

ähnliche Ursache zu Grunde liegen, wie sie für die klinisch besser verlaufenden Patienten mit einer

IDH1-Mutation diskutiert wird. IDH1 ist neben Glukose-6-Phosphatdehydrogenase (G6PD) und 6-

Phosphoglukonolaktone Dehydrogenase (6PGLDH) sowie dem NADP+-abhängigen Malatenzym (ME1)

eines der vier wichtigen Enzyme zur Erhaltung der NADPH-Konzentration und der damit

verbundenen REDOX-Homöostase (Lee et al. 2002). Es ist bekannt, dass die IDH1-Mutation R132H zu

einer Änderung der enzymatischen Funktionalität des Enzyms führt, welches zur Folge hat, dass

neben α-Ketoglutarat nicht mehr NADPH produziert, sondern 2-Hydroxyglutarat gebildet wird und

NADPH verbraucht wird (Dang et al. 2009). Dies legt nahe, dass sich die Tumorzelle durch die IDH1

Mutation und der dadurch verringerten Konzentration von NADPH weniger gegen oxidativen Stress

und der damit einhergehenden vermehrten möglichen Schädigung der DNA schützen kann. Durch

oxidative Schäden an Lipiden und Proteinen können apoptoische Prozesse initiiert werden und die

Krebszellen dadurch eine verringerte Überlebenszeit und Tumorigenität aufweisen. Bisher ist der

Zusammenhang zwischen einer Mutation im IDH1-Gen und oxidativen Stress jedoch kaum belegt.

Lediglich durch Gilbert et al. (2014) wurde kürzlich gezeigt, dass die Überexpression von R132H IDH1

in der Glioblastomzelllinie U87MG zu oxidativen Stress, Apoptose und Autophagie führt.

Die von Park et al. (2009) und Patel et al. (2013) als differentiell zwischen LTS und STS Patienten

ermittelten Proteine SOD2, DNM1, MAPK1, HSPA9, PSMD3 und CANX wurden in dieser Arbeit

durchweg detektiert, zeigten aber keine signifikanten Unterschiede in der Proteinexpression

zwischen den beiden Gruppen. Ursache hierfür könnten zum einen das gewählte Patientenkollektiv

oder zum anderen die gewählten Methoden sein. So wurde in keiner der Arbeiten die IDH1

Mutation, die zu 34 % bei den LTS auftritt, berücksichtigt. Ferner wurde keine spezifische Isolation

von Tumorzellen durchgeführt. Bemerkenswert ist jedoch, dass es sich bei der in STS-Patienten als

hochreguliert beschriebenen Mn-SOD ebenfalls um ein Protein handelt, welches der Zelle beim

Schutz vor ROS hilft (Sato et al. 1995) und steht somit im Einklang mit der hier aufgestellten

Hypothese.

5.2.1.1 Fazit

Die erhöhte Abundanz mitochondrialer Proteine und der daraus abgeleitete tumorbiologische

Kontext deuten auf einen, durch vermehrte Fettsäureoxidation initiierten Schutz der Tumorzellen

von Kurzzeitüberlebenden vor oxidativem Stress hin. Dieser Schutz wird vermutlich maßgeblich durch

einen erhöhten Level von NADPH, welches in der Lage ist, Glutathion-abhängig protektive Proteine

zu regenerieren, vermittelt.


88

5.2.2. Differentielle Proteomanalyse des Tumorgewebes von

Glioblastomen in Abhängigkeit von der IDH1 Mutation

Während der Laufzeit des Projekts wurde durch die Identifizierung der IDH1-Mutation eine wichtige

Entdeckung gemacht (Parsons et al. 2008), die in der Folge einen direkten Einfluss auf die weitere

Experimentplanung hatte. Es zeigte sich, dass sie bei einem Großteil (50-90%) adulter Astrozytome,

Oligodendrogliomen des WHO Typs II und III und sekundären Glioblastomen auftritt. Bei den

primären Glioblastomen tragen lediglich 3-16% eine IDH1 Mutation. Allerdings tritt die IDH1-

Mutation mit 34% gehäuft in Tumoren von primären GBM LTS-Patienten auf (Parsons et al. 2008;

Weller et al. 2009). Durch Hartmann et al. (2013) konnte kürzlich gezeigt werden, dass das

molekulare Profil von IDH1 mutierten primären LTS Tumoren eher dem von sekundären

Glioblastomen entspricht und durch TP53 Mutationen und fehlende EGFR Amplifikationen

gekennzeichnet sind.

Dieser Aspekt hatte insbesondere für die Auswertung der 2D-DIGE-Studie zur Folge, dass die zuvor

erstellte Gruppierung unter Berücksichtigung der IDH1 Mutation korrigiert werden musste. In diesem

Zusammenhang wurde eine Schwäche der 2D-DIGE offensichtlich und zwar führte die erneute

Bildauswertung zu neuen Kandidatenspots, für die eine neue Identifizierung per MS hätte

durchgeführt werden müssen. Da allerdings nicht ausreichend Material zur Verfügung stand, wurde

auf die erneute Auswertung verzichtet und die Aspekte der IDH1-Mutation bei der nachfolgenden

quantitativen Proteomanalyse mittels Massenspektrometrie berücksichtigt. Die bereits

identifizierten Proteine werden hier zusammen mit den Ergebnissen der markierungsfreien

quantitativen Analyse diskutiert.

Um den Einfluss der IDH1 Mutation bei GBM LTS zu untersuchen, wurden ebenfalls Gewebeproben

nach Mikrodissektion mittels markierungsfreier Analyse untersucht. Ergänzend muss angemerkt

werden, dass eine Untersuchung von STS mit IDH1 Mutation nicht möglich war, da diese Fälle nur

sehr selten auftreten und daher keine ausreichende Zahl von Fällen akquiriert werden konnte.

Mithilfe der markierungsfreien Analyse konnte für 10 GBM LTS mit IDH1-Mutation erfolgreich ein

Proteinprofil, welches 2834 Proteine enthält, erstellt werden. Der Vergleich der Gruppe LTSmut mit

LTSwt ergab, dass 130 Proteine einen signifikanten Abundanzunterschied aufwiesen. Von diesen

Proteinen waren in der Gruppe der mutierten Tumoren 85 hoch- und 45 herunterreguliert. Eine

Studie, die versucht die Unterschiede zwischen IDH1 mutierten und IDH1 Wildtyp-Glioblastomen mit

proteomanalytischen Methoden zu adressieren, wurde bisher noch nicht durchgeführt. Lediglich von

Oligodendrogliomen wurde von Thirant et al. (2011) eine 2D-gelbasierte Studie zu IDH1 mutierten


89

Tumoren durchgeführt und führte zu einer Identifizierung von insgesamt 42 differentiellen

Proteinen.

Die bioinformatische Analyse konnte zeigen, dass in der Gruppe der 85 in den mutierten Tumoren

hochregulierten Proteine eine signifikante Anreicherung von Proteinen existiert, die in Verbindung

mit der mRNA-Prozessierung und hier insbesondere mit dem Spleißen von mRNA stehen.

Insbesondere das alternative Spleißen stellt eine der wichtigsten Ebenen der Genregulation dar und

spielt eine wichtige Rolle bei Differenzierungsvorgängen in höheren Organismen. Es ermöglicht, dass

Gene in eine Vielzahl von Isoformen exprimiert werden können. Darüber hinaus ist das alternative

Spleißen auch eine integrale Komponente von Signaltransduktionskaskaden und in der Lage, auf

posttranskriptionaler Ebene Signale zu verstärken und weiterzuleiten. Auf diese Weise ermöglicht

das alternative Spleißen der Zelle Adaption als Reaktion auf Stimuli und Stressbedingungen durch die

Verknüpfung von Signalwegen und epigenetische Mechanismen (Biamonti et al. 2014).

Defekte im Spleißmechanismus sind mittlerweile bei einer Vielzahl von Krankheiten als Ursache oder

Verstärker bekannt. Durch das vermehrte Auffinden von mit Krebs assoziierten gespleißten

Proteinisoformen gibt es auch zunehmend Hinweise darauf, dass deregulierte Spleißmuster eng mit

der Tumorigenese verknüpft sein könnten. So konnten mittlerweile für diverse Tumorentitäten, wie

z.B. Brustkrebs, verschiedene alternative Spleißprodukte als Progressionsmarker ausfindig gemacht

werden (Venables et al. 2009; Brown et al. 2011). Für Gliome wird in diversen Arbeiten das Auftreten

bestimmter Spleißisoformen beschrieben, welche mit den diversen Aspekten der Gliomgenese, wie

z.B. onkogene Suppression (Chunduru et al. 2002; Tchirkov et al. 2010), Apoptose-Evasion (Yamada

et al. 2003), Proliferation (Camacho-Vanegas et al. 2007; Yu et al. 2007), Metabolismus (Clower et al.

2010; David et al. 2010) und Migration/Invasion (Yu et al. 2007; Cheung et al. 2009; Lo et al. 2009), in

Verbindung gebracht werden können. Demgegenüber steht jedoch eine Studie von Cheung et al.

(2008) die ausführt, dass gliomspezifische alternative Spleißprozesse eine eher untergeordnete Rolle

bei der Gliomgenese zu spielen scheinen.

Die Regulation alternativer Spleißprozesse findet zum einen durch die intrinisische Stärke der

Spleißseiten (cis-regulatorische Elemente) und zum anderen durch die kombinatorische Kontrolle

einer Reihe von trans-aktivierenden Faktoren statt. Bei Letzteren handelt es sich vornehmlich um

Proteine aus der Gruppe der Serin-/Argininreichen Spleißfaktoren (SR Proteine) oder Proteine aus

der Gruppe heterogener nukleärer Ribonukleoproteine (Martinez-Contreras et al. 2007; Long und

Caceres 2009). Verschiedene Vertreter (HNRNP-A2B1, -C, -D, -D-like, -H3, -K, -R und –U sowie SRSF 3,


90

6, 7, und 9 ) beider Gruppen wurden im Rahmen dieser Arbeit als hochreguliert in IDH1 mutierten

Tumoren gegenüber Wildtyp-Tumoren ermittelt.

Veränderungen im Spleißprozess entstehen häufig durch Variationen der relativen Menge oder der

Aktivität dieser regulatorischen Spleißfaktoren und obwohl ein kausaler Zusammenhang in vielen

Fällen noch bewiesen werden muss, scheint klar, dass die Expression spezifischer Spleißvarianten

vieler Krebs-assoziierter Gene direkt zu einem onkogenen Phänotyp beitragen und häufig in die

Tumorgenese und die Entwicklung von Resistenzen involviert sind (Ghigna et al. 2008). So konnte z.B.

durch Karni et al. (2007) gezeigt werden, dass der Spleißfaktor SF2/ASF in Folge der Amplifikation

seines Gens SRSF1 häufig in Tumoren überexprimiert wird und in Folge dessen onkogene

Eigenschaften erhält. SF2/ASF zeigten auch in dieser Arbeit eine höhere Abundanz (1,87) in

mutierten Tumoren, lediglich der p-Wert war mit 0,0103 knapp oberhalb des gesetzten Schwellwerts

von 0,01, um als differentiell berücksichtigt zu werden.

Weiterhin konnten in dieser Arbeit die beiden als „Spleiß–Hubs“ bezeichneten Faktoren hnRNPK und

SAM68 bei GBM LTS mit Mutation mit erhöhter Abundanz nachgewiesen werden. Für hnRNP K

konnte gezeigt werden, dass es an prä-mRNA Spleiß-Verstärker binden kann und Phosphorylierung

durch die Src-Kinase, Protein Kinase C (PKC), ERK1/2 und JNK seine Protein-Protein und Protein-RNA

Bindungseigenschaften verändern (Bomsztyk et al. 2004). Eine mögliche Phosphorylierung von

hnRNP K bzw. Phosphorylierungen im Allgemeinen wurden im Rahmen dieser Arbeit nicht analysiert,

da hierfür eine gezielte Anreicherung von Phosphopeptiden im Vorfeld der

massenspektrometrischen Analysen unter deutlich höherem Materialeinsatz notwendig gewesen

wäre.

In ähnlicher Weise bindet auch SAM68 Elemente innerhalb der prä-mRNA und kann durch Kinasen

wie z.B. ERK phosphoryliert werden (Matter et al. 2002). Spleiß-Hubs, wie Sam68 und hnRNP K, sind

in mehrfacher Hinsicht an der Krebspathologie beteiligt. Nicht nur werden häufig veränderte

Expressionsniveaus beobachtet (Wen et al. 2010; Hope und Murray 2011), auch können durch

veränderte vorgeschaltete Signale in Krebszellen posttranslationale Modifikationen verändert und in

dessen Folge die Lokalisierung und Aktivität von Spleißfaktoren beeinflusst werden. Sowohl hnRNP K

(Lewis et al. 2000) als auch Sam68 (Matter et al. 2002) sind Ziele von ERK, einer Komponente des Ras

/ MAPK-Signalwegs, welcher in Glioblastomen häufig eine verstärkte Aktivität zeigt (Guha et al. 1997;

Feldkamp et al. 1999). Über diesen Signalweg wird z.B. in Melanomen das Verhältnis des

Mikrophthalmie-assoziierten Transkriptionsfaktors MITF (-) zugunsten der gespleißten Isoform MITF

(+) verschoben (Primot et al. 2010). Mit Bezug auf die pro-proliferative Aktivität der MITF (-)-Isoform


91

schlagen Galibert und Kollegen vor, dass die Hochregulierung von MEK in Melanomen, welche zu der

veränderten Expression der Spleißvarianten von MITF führt, Teil eines Mechanismus ist, mit dem die

Tumorzellen eine erhöhte Proliferation erzielen (Primot et al. 2010). Darüber hinaus können die

veränderte Expression und Aktivität der Spleiß-Faktoren hnRNP K und Sam68 das normale

Spleißmuster ihrer Ziele stören. Für Sam68 sind z.B. CD44, welches in den Zellen an Migration,

Invasion und Proliferation beteiligt ist und Cyclin D1, beteiligt bei der Regulation des Zellzyklus, und

BCL-X, beteiligt an der Apoptose, interessante Ziele (Bielli et al. 2011). Für Sam68 konnte von Modem

et al. (2011) gezeigt werden, dass seine Überexpression in Glioblastomen zu vermehrter Proliferation

der Zellen führte. Eine besondere Rolle von hnRNP K bei Glioblastomen konnte bisher nicht belegt

werden.

Dass die Überexpression bestimmter Spleißfaktoren direkten Einfluss auf die Tumorbiologie haben

kann, wurde ebenfalls für die in dieser Arbeit als in IDH1 mutierten Tumoren hochregulierte

Spleißfaktoren hnRNPA2 und PTB gezeigt. So spielt ihre vermehrte Expression in Tumoren eine

entscheidende Schlüsselrolle für die Umschaltung von oxidativer Phosphorylierung zu aerober

Glykolyse (David et al. 2010). Durch Christofk et al. (2008) konnte gezeigt werden, dass die

ausschließlich in Tumorzellen exprimierte embryonale Isoform 2 der Pyruvatkinase durch Austausch

gegen die Isoform 1 in Tumorzellen zu einer Umkehrung des Warbug-Effekts, einhergehend mit

verminderter Laktat Produktion und vermehrtem Sauerstoffverbrauch, führt. In der Folge führte dies

zu verminderter Tumorbildung in Maus Xenotransplantaten. Auch in dieser Arbeit konnte

ausschließlich PKM2 detektiert werden. Peptide, die auf die PKM1-Isoform hinweisen, wurden nicht

gefunden. Die Isoformen der PKM sind ein Produkt alternativen Spleißens, bei dem entweder das

Exon 9 (PKM1) oder Exon 10 (PKM2) translatiert werden. David et al. (2010) zeigten, dass drei

Proteine aus der Gruppe der heterogenen nukleären Ribonukleoproteine (hnRNPA1, hnRNPA2 und

PTB) durch ihre repressive Bindung in der Nähe von Exon 9 den Einschluß von Exon 10 und damit die

Expression der PKM2 bewirken. Verantwortlich für die Überexpression dieser Spleißfaktoren ist

hierbei die Überexpression des onkogenen Transkriptionsfaktors c-Myc. Die Überexpression dieses

Transkriptionsfaktors sowie der drei Spleißfaktoren wurde von David et al. (2010) ebenfalls in

humanen Gliomen belegt.

Mit dem Spleißfaktor hnRNPH wurde im Rahmen dieser Arbeit in IDH1 mutierten Tumoren weiterhin

ein Spleißfaktor hoch reguliert gefunden, welcher bereits in Glioblastomen als überrepräsentiert

beschrieben wurde (Lefave et al. 2011). Eine Erniedrigung der Konzentration von hnRNPH führt zu

verändertem Spleißen und in Folge zu erhöhten Leveln der nicht-tumorgenen Varianten von MADD


92

und RON. Somit scheint hnRNPH durch die Inhibition von Apoptose und vermehrter Invasion einen

direkten Einfluss auf die Malignität von Glioblastomen zu haben (Lefave et al. 2011).

Ob neben dem gehäuften Auftreten von mit Spleißen assoziierten Proteinen in IDH1 mutierten

Tumoren auch vermehrt Produkte alternativen Spleißens vorkommen, konnte im Rahmen dieser

Arbeit nicht adressiert werden. Bei der bottom-up Proteomanalyse, die hier verwendet wurde, findet

die Identifizierung eines Proteins nur anhand eines kleinen, repräsentativen Teils der Proteinsequenz

statt. Informationen über bestimmte Isoformen von Proteinen sind daher meist nicht vorhanden.

Inwieweit die IDH1 Mutation in Verbindung mit dem alternativen Spleißen steht, ist bisher nicht

belegt. Der Zusammenhang könnte sich möglicherweise durch den Einfluss der IDH1-Mutation auf

die Epigenetik ergeben. So konnte gezeigt werden, dass der von mutierten IDH1 erzeugte Metabolit

2HG diverse Dioxygenasen inhibiert, die eine Rolle in der DNA-und Histon-Methylierung spielen. So

führt die Inhibition von TET2 durch 2HG zur Hypermethylierung von DNA. Folgender Mechanismus

wurde für dieses Phänomen vorgeschlagen: Der größte Teil der DNA Methylierungsstellen beim

Menschen sind 5-Methylcytosine (5mC) an CpG Dinukleotiden. TET 2 spielt eine wichtige Rolle bei

der Regulierung der Methylierung der DNA durch die Konversion von 5mC zu 5-

Hydroxymethylcytosin (5hmC), welches als intermediäres Produkt der DNA-Demethylierung

betrachtet wird. Weil TET2 ebenfalls eine α-Ketoglutarat abhängige Dioxygenase ist, ist es denkbar,

dass dieser Demethylierungsprozess durch die Anwesenheit des von der mutierten IDH1 Variante

erzeugten 2HG inhibiert wird und es in Folge dessen zu einer globalen Hypermethylierung der DNA

kommt (Xu et al. 2011).

In diesem Kontext spielt möglicherweise ein weiterer Aspekt der 2HG-vermittelen Inhibition von

Dioxygenasen eine wichtige Rolle. So ist bekannt, dass auch eine Vielzahl von Histon-Demethylasen,

welche ebenfalls zur Familie der Dioxygenasen gehören, durch die Anwesenheit von 2HG inhibiert

werden. Daraus resultiert in der Folge eine Veränderung des Methylierungsstatus der Lysinreste in

Histonen (Xu et al. 2011). Durch Lu et al. (2012), konnte gezeigt werden, dass ein erhöhter Level von

H3K9 Trimethylierungen in immortalisierten Astrozyten, welche die mutierte IDH1 Form exprimieren,

bereits nach Passage 12 nach der Transduktion mit IDH1 detektiert werden konnte. Eine erhöhte

DNA Methylierung wurde hingegen erst nach Passage 22 beobachtet (Lu et al. 2012). Dies lässt

vermuten, dass eine veränderte Histon Methylierung möglicherweise einer DNA Methylierung

vorangeht und eventuell auch unabhängig von dieser auftritt (Ichimura 2012).


93

Der mögliche Funktionszusammenhang könnte sich nun daraus ergeben, dass gezeigt werden

konnte, dass die Methylierung von Exonen Einfluss auf die Positionierung der Nucleosomen und

somit auch auf das alternative Spleißen hat. So konnte mittels bioinfomatorischen und genomweiten

Analysen gezeigt werden, dass eine Anreicherung von 5mC und Nucleosomen auf Exons relativ zu

den Introns bevorzugt an den Grenzen der Exons stattfindet (Schwartz et al. 2009). Diese

Positionierung der Nucleosomen hat einen senkenden Effekt auf die Elongationsrate der RNA Pol II

(Schwartz et al. 2009). Die reduzierte RNA-Syntheserate ermöglicht wiederum die Benutzung von

schwachen anstatt starken Spleißseiten (Kornblihtt 2007). Somit kann die Hypothese aufgestellt

werden, dass IDH1 Mutationen zur Tumorgenese durch eine epigenetische Deregulation beitragen,

welche durch die inhibierte Demethylierung von 5mC und Histonen initiiert wird. Diese IDH1-

assozierten Veränderungen des Methylierungsmusters und der damit verbundene Einfluss auf das

alternative Spleißen könnten in der Folge zu einem veränderten Expressionsmuster der

Spleißfaktoren führen. Inwieweit es sich hierbei um verstärkende oder abschwächende Effekte in

Hinsicht auf die Tumorbiologie handelt, kann derzeit nicht abschließend entschieden werden.

Generell lässt das experimentelle Design dieser Studie (Vergleich zweier LTS-Gruppen), aber nur sehr

bedingt Aussagen über eine prognostische Bedeutung zu. Erwähnenswert in diesem Zusammenhang

scheint jedoch die Tatsache, dass unter den bei GBM LTS mit IDH1 Mutation am stärksten

hochregulierten Kandidatenproteinen mit SMARCC2 und SMCE1 auch zwei Untereinheiten des

SWI/SNF-Komplexes gefunden wurden. SWI/SNF ist in diversen Tumorentitäten ein bekannter

Tumorsuppressor (Versteege et al. 1998; Varela et al. 2011; Shain et al. 2012). Ähnlich der

positionierten Nucleosome stellt die Brm Untereinheit von SWI/SNF eine Schnittstelle zwischen

Transkription und RNA Prozessierung dar, indem sie die Elongationsrate der RNA Pol II moduliert und

dadurch die Rekrutierung der Spleißmaschinerie zu Exonen mit suboptimalen Spleißseiten erleichtern

kann (Batsche et al. 2006). Die Überexpression des Tumorsuppressors SWI/SNF könnte somit einen

Hinweis auf einen Zusammenhang zwischen dem beobachteten aberranten Spleißen und der

besseren Prognose von Patienten mit mutierter IDH1 schaffen.

5.2.2.1 Fazit

Die Ergebnisse dieser Studie bestätigen die Hypothese, dass es sich bei IDH1 mutierten Tumoren um

eine klar von nicht mutierten GBM differenzierbare Tumorgruppe handelt. In dieser Arbeit konnte

nun zum ersten Mal auch auf Proteinebene gezeigt werden, dass sich die Proteinexpressionsprofile

der beiden Tumorgruppen deutlich voneinander unterscheiden. So scheint die Mutation im IDH1

Gen, möglicherweise durch veränderte Methylierungsmuster, zu weitreichenden Veränderungen im

gesamten Spleißaparat führen. Diese Beobachtung lässt sich gut mit dem in der Literatur

beschriebenen gehäuften Auftreten tumorspezifischer Spleißisoformen übereinbringen. Die


94

betroffenen Proteine sind häufig in zentralen Signaltransduktionswegen integriert, so dass

weitreichende Auswirkungen auf die Tumorbiologie der Krebszelle wahrscheinlich sind.

5.2.3. Differentielle Proteomanalyse von Mausstammzellen

Obwohl viele Tumoren monoklonalen Ursprungs sind, ist ihre Zusammensetzung meist heterogen.

Dieser Umstand trifft auch in hohem Ausmaß auf Glioblastome zu. Hinsichtlich des hier untersuchten

Phänomens „Langzeitüberleben“, ist besonders eine bestimmte Subpopulation, die so genannten

Gliomstammzellen, von großem Interesse. Von verschiedenen Gruppen wurde die Hypothese

vorgeschlagen, dass diese Stammzellen in die Vermittlung von Therapieresistenzen und

Tumorprogression involviert sind (Ignatova et al. 2002; Singh et al. 2003; Galli et al. 2004). So sind sie

nicht nur in der Lage, weitere differenzierte Tumorzellen innerhalb des Tumors zu generieren,

sondern exprimieren vermutlich auch spezielle DNA-Reparatur- und Drug-Efflux-Proteine als Antwort

auf Radio- und Chemotherapie (Bao et al. 2006; Eramo et al. 2006; Liu et al. 2006). Somit könnten

Gliomstammzellen nicht nur interessante Ziele für neue Therapiestrategien sein, sondern auch ein

weiterer Aspekt, der zur Gesamtüberlebensdauer von Glioblastompatienten beiträgt.

Um einen besseren Einblick in die Tumorbiologie der potentiell resistenzvermittelnden

Gliomstammzellen zu bekommen, wurden im Rahmen dieser Arbeit vier verschiedene

Mausstammzelllinien proteomanalytisch charakterisiert. Ziel war es, ein möglichst vollständiges

Proteom der Gliomstammzellen zu erhalten sowie Unterschiede hinsichtlich möglicher

Resistenzmechanismen zwischen den verschiedenen Zelllinien zu untersuchen.

Insgesamt konnten mittels markierungsfreier Analyse 2699 Proteine quantifiziert werden. Generell

konnte beobachtet werden, dass interindividuelle Unterschiede zwischen den vier verwendeten

Zelllinien größer waren als der intraindividiuelle Unterschied innerhalb der NS- und SC-Typen

innerhalb einer Linie. Insbesondere die Zellinie GL-261 unterscheidet sich deutlich in ihrem

Proteinexpressionsprofil von den drei SMA Zelllinien (Abbildung 4.14). Im Gegensatz dazu zeigen

lichtmikroskopische Aufnahmen der verschiedenen Zelltypen durch (Ahmad et al. 2014) stärkere

morphologische Unterschiede zwischen NS und SC Zelltypen.


95

Abbildung 5.2: Lichtmikroskopische Aufnahmen der eingesetzten Zelllinien SMA-497, SMA-540, SMA-560 und GL-261 unter NS und SC Bedingungen. Im Vergleich zu den normalen Kulturbedingungen ist unter SC-Bedingungen eine deutliche Sphärenbildung zu beobachten (Ahmad et al. 2014).

Die detaillierte Analyse der 155 in SC differentiell hochreguliert gefunden Proteine zeigt, dass

insbesondere Prozesse, die mit dem Metabolismus von Kohlenhydraten assoziiert sind, verstärkt in

SC-Zellen exprimiert sind. Eine ähnliche Beobachtung konnten auch (Morfouace et al. 2012) machen,

die Gliomstammzellen von Ratten und neurale Stammzellen verglichen. In einer 2D-Gel basierten

Studie von (Thirant et al. 2012) wurden humane Gliomstammzellen mit Tumorgewebe verglichen.

Hier konnte ebenfalls gezeigt werden, dass sich Gliomstammzellen und Ursprungszellen in ihrem

Proteinexpressionsprofilen deutlich unterscheiden. Wie auch in der vorliegenden Arbeit wurden von

Thirant et al. (2012) Proteine des Proteasoms (PSME1 und PSME2) sowie Proteine der 14-3-3

Proteinfamilie (YWHAG) als in Gliomstammzellen hoch exprimiert beschrieben.

Darüber hinaus zeigt ein Vergleich mit Genset-Anreicherungs Analysen von Transkriptomdaten

derselben Zelllinien (siehe Abbildung 5.3), dass die SC-Zellen sowohl auf Transkriptom als auch auf

Proteinebene vermehrt Gene exprimieren, die spezifisch für Stammzellen sind (Wang 2011). Hierbei

zeigten die SMA-Zelllinien stärkere Stammzelleigenschaften als die GL-Zelllinie (Ahmad et al. 2014).


96

Abbildung 5.3: Genexpressionsrate und Proteinexpressionsprofil ausgewählter Stammzellmarker (Wang, 2011) in den vier untersuchten Zelllinien. Die Gensets enthalten Gene, welche differentiell hochreguliert in hESC9 sind (A, set hESC9), abundant in hESC vorkommen (B, set hESC10) sowie Myc-regulierte Ziele (C, myc2) (Ahmad et al. 2014).

GFAP, Tubulin β-3 und CNPase, die bekannte Marker für astrozytäre, neuronale und

oligodendrogliale Differenzierung sind (Reifenberger et al. 1987; Scherer et al. 1994), konnten jedoch

in dieser Studie nicht generell als differentiell exprimiert zwischen NS und SC-Bedingungen ermittelt

werden. Für GFAP und CNPase war keine Identifizierung möglich, für Tubulin β-3 wurde eine erhöhte

Expression unter SC Bedingungen beobachtet, jedoch war diese nur in der Zelllinie SMA560

signifikant.

5.2.4. Fazit

Im Rahmen dieser Studie konnte das Proteom vier verschiedener muriner Gliomstammzelllinien

sowohl unter normalen als auch unter SC-Bedingungen umfassend charakterisiert werden. Es konnte

gezeigt werden, dass trotz deutlicher morphologischer Veränderungen, die Unterschiede in der

Proteinexpression zwischen den vier verschiedenen Zelllinien größer sind als die zwischen den

Kulturbedingungen. Zudem konnte eine verstärkte Proteinexpression von spezifischen

Stammzellproteinen unter sphärenbildenden Bedingungen nachgewiesen werden.

mRNA Protein

SMA

-49

7_N

S

SMA

-54

0_N

S

SMA

-56

0 _

NS

GL-

26

1_N

S

SMA

-49

7_S

C

SMA

-54

0_S

C

SMA

-56

0_S

C

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26

1_

SC

SMA

-49

7_N

S

SMA

-54

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S

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S

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26

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S

SMA

-49

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C

SMA

-54

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-56

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GL-

26

1_

SC

Gen

set

An

reic

her

un

gs-W

ert

A

B

C


97

5.2.5. Identifizierung von tumorassoziierten Autoantigenen des

Glioblastoms

Ein weiterer Mechanismus, der als Ursache für Langzeitüberleben bei GBM-Patienten diskutiert wird,

sind mögliche Unterschiede in der Immunogenität des Tumors. So ist zum einen bekannt, dass

Tumoren eine klassische Immunantwort auslösen, welche u.a. durch die Produktion von

Autoantikörpern gekennzeichnet ist (Soussi 2000), zum anderen aber auch in der Lage sind, eine

Immunantwort zu unterdrücken. Auch Glioblastompatienten zeigen eine unterdrückte zelluläre

Immunantwort sowohl innerhalb der Mikroumgebung des Tumors als auch die humorale Antwort

betreffend (Dix et al. 1999; Gomez und Kruse 2006; Waziri 2010). So konnte für maligne Gliome

bereits gezeigt werden, dass diese unterschiedliche Mengen tumorinfiltrierender Immunzellen

enthalten, deren Anzahl mit der Überlebenszeit der Patienten korreliert (Dunn et al. 2007). Weiterhin

konnte nachgewiesen werden, dass Glioblastome immunmodulatorische Substanzen wie PGE2, TGF-

beta2 und IL-10 sekretieren können, welche z.B. die zytotoxische Aktivität von tumorinfiltrierender

Immunzellen hemmen und zusätzlich die Zahl Lymphokin-aktivierter-Killerzellen reduzieren (Fontana

et al. 1982; Fontana et al. 1984; Castelli et al. 1989). Darüber hinaus können dennoch tumor-

spezifische T-Zellen im Kreislauf von Glioblastompatienten (Dunn et al. 2007) gefunden werden.

Bereits 1983 konnte durch Kornblith et al. gezeigt werden, dass Gliompatienten zytotoxische

Antikörper gegen ihre eigenen Tumorzellen aufweisen, wobei Glioblastompatienten die schwächste

Immunantwort innerhalb der untersuchten Gruppe von 42 Patienten aufwiesen. Darüber hinaus

wurde gezeigt, dass eine Korrelation zwischen dem Vorliegen einer Immunantwort gegen die eigenen

Tumorzellen und der Überlebensdauer vorlag (Kornblith et al. 1983). Verschiedene Faktoren werden

als Ursache für die Immunogenität von Antigenen diskutiert. So gelten Mutationen (Winter et al.

1992), alternatives Spleißen (Ng et al. 2004; Yang et al. 2006), die Expression fetaler Proteine in

adultem Gewebe (Chen et al. 1997), posttranslationale Modifikationen, Überexpression, veränderte

Apoptose und Nekrose, Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), spezifische Sequenz Motive und

veränderte zelluläre Lokalisation (Anderson und LaBaer 2005; Tan et al. 2009) als mögliche Ursache

für das Hervorrufen einer humoralen Immunantwort.

Ziel dieser Arbeit war es, durch das Erstellen von Autoantikörperprofilen von GBM Patienten

tumorspezifische immunreaktive Antigene zu identifizieren. Diese Kandidatenantigene sollen später

mit den klinischen Verläufen der Patienten korreliert werden, um Informationen zu generieren, in

wie weit der Immunstatus der Patienten als mögliche Ursache für Langzeitüberleben in Frage kommt.

Für die Erstellung der Autoantikörperprofile von Tumorpatienten wurde Plasma von Patienten kurz

nach der Diagnosestellung sowie von nicht tumorerkrankten Kontrollpersonen entnommen. Darüber


98

hinaus wurde zur Erstellung von Langzeit-Antikörperprofilen auch Plasma von Patienten, deren

Diagnose mindestens drei Jahre zurück lag, analysiert. Hierdurch sollten unter anderem auch erste

Hinweise erhalten werden, ob sich die Immunogenität der klinischen Entitäten LTS und STS

unterscheiden, da die Bereitstellung der Plasmaproben von LTS Patienten im Projektezeitraum nicht

vorgenommen werden konnte.

Immunreaktive Autoantigene von GBM wurden bereits in verschiedenen Arbeiten untersucht, wovon

der Großteil auf die Identifizierung von Antigenen, welche vom Tumor exprimiert werden, abzielte.

Jedoch konnte nur in wenigen dieser Arbeiten das Auftreten von Autoantikörpern gegen bestimmte

TAAs auch mit einer besseren Prognose in Korrelation gebracht werden. Lediglich Glioblastom

Patienten mit Autoantikörpern gegen GLEA1, GLEA2 und PHF3 (Fischer et al. 2001; Struss et al. 2001;

Pallasch et al. 2005) sowie bei Patienten mit niedriggradigen Gliomen gegen SH3GLB1 (Matsutani et

al. 2012) wiesen ein längeres progressionsfreies Gesamtüberleben auf.

Diese Arbeiten basieren allesamt auf SEREX als Methode zur Detektion für Autoantigene. Arbeiten,

bei denen Proteinarrays zur Detektion von Glioblastom TAAs eingesetzt wurden, existieren bisher

ebenso wenig wie ein gezielter Vergleich von Autoantikörperprofilen von LTS und STS Patienten.

Hier konnten mittels Protein Arrays 367 signifikante differentielle Signale von Autoantikörpern gegen

potentielle TAA nachgewiesen werden, wovon 107 eine hohe Prävalenz für GBM zeigen. Für diese

107 Kandidatenautoantigene wurde untersucht, ob eine Anreicherung bestimmter biologischer

Prozesse, Strukturmotive und zellulärer Lokalisationen vorliegt. Diese detaillierte Analyse ergab, dass

innerhalb der Kandidaten zinkbindende Proteine signifikant angereichert sind. Auffällig ist, dass es

sich auch bei den drei bereits publizierten TAAs GLEA1, GLEA 2 und PHF3, welche mit einer besseren

Prognose von GBM Patienten in Verbindung gebracht werden können, ebenfalls um

Zinkfingerproteine handelt. Backes et al. (2011) konnten durch Metaanalysen zeigen, dass

sequenzbasierte Eigenschaften wie coiled-coil Motive, ELR Motive aber auch Zinkfinger Motive sehr

häufig bei bereits bekannten TAA anzutreffen sind. Für einige dieser Eigenschaften, z.B. coiled-coil

Domänen oder Granzym B Schnittstellen, gibt es Theorien, nach denen sie für eine erhöhte

Immunogenität von Autoantigenen verantwortlich sein könnten (Dohlman et al. 1993; Niland et al.

2010). So wird davon ausgegangen, dass coiled-coil Strukturen eine größere Oberfläche aufweisen

und dadurch mehr Ladung präsentieren können, was die Erkennung durch einen Antikörper

erleichtert (Dohlman et al. 1993). Zinkfingerproteine existieren in vielen strukturellen Varianten und

können ebenso viele unterschiedliche Funktionen übernehmen. Besonders häufig sind sie in die

Bindung von DNA und RNA oder die Vermittlung von Protein-Protein Interaktionen involviert (Klug

1999; Hall 2005; Gamsjaeger et al. 2007). In dieser Arbeit konnte ebenfalls ein nicht unerheblicher


99

Teil der zinkbindenden Proteine als Transkriptionsfaktoren eingeordnet werden. Ähnliche

Beobachtungen wurden ebenfalls von Backes et al. (2011) gemacht, in der im Rahmen einer in-silico

Studie bekannte Autoantigene hinsichtlich häufig auftretender struktureller und funktioneller

Eigenschaften untersucht wurden. Möglicherweise fungieren auch hier die polaren Bereiche, die für

die Nukleinsäure-Interaktion notwendig sind, als besonders geeignete Epitope. Für die weitere

Validierung wurde sich auf die TAAs fokussiert, die eine hohe Prävalenz in GBM Patienten aufwiesen.

Die höchste Spezifität für den Tumor unter allen detektierten Proteinen hatte das zinkbindende four

and a half LIM domain protein 1 (FHL1). Für FHL1 konnte kürzlich gezeigt werden, dass es, neben

seiner Rolle im skelettalen und kardialen Muskelwachstum (McGrath et al. 2003), ebenfalls in die

Karzinogenese involviert ist und als Tumorsuppressor fungiert. Durch Shen et al. (2006) konnte

gezeigt werden, dass FHL1 in Mäusen abwärts von SRC und CAS das Krebszellwachstum und die

Migration blockiert. Damit übereinstimmend ist die Expression von FHL1 in vielen Tumorentitäten

wie z.B. Lungenkrebs (Niu et al. 2012), Brustkrebs (Ding et al. 2011) oder auch Blasenkrebs

(Matsumoto et al. 2010), herunterreguliert. Der Vergleich mit Expressionsdaten aus dem

Proteomexperiment ergab, dass FHL1 zu den abundantesten 12 % der Proteine gehört, laut dem

Human Proteinatlas wird es aber im Gewebe des zentralen Nervensystems kaum exprimiert (Uhlen

et al. 2010). Ein weiteres Protein aus der Familie der FHL-Proteine, FHL3, zeigte ebenfalls eine

deutlich erhöhte Immunantwort in den Tumorpatienten. Dem Proteinatlas zufolge wird FHL3

allerdings nur in etwa 18% der analysierten Gliome exprimiert und ließ sich auch im Rahmen dieser

Arbeit nicht auf Proteomebene nachweisen (Uhlen et al. 2010).

In diesem Zusammenhang konnte in dieser Arbeit durch den Vergleich von Proteom- und

Transkriptomdaten gezeigt werden, dass das Auftreten der potentiellen Autoantikörper generell

nicht direkt von der Konzentration des jeweiligen Antigens bzw. dessen mRNA-Level abhängt. Zudem

konnte im Gegensatz zu einer Arbeit von Backes et al. (2011), in der gezeigt wurde, dass es sich bei

Antigenen vorwiegend um sekretierte oder extrazellulär lokalisierte Proteine handelt, die

vorwiegend in Signalwegen des Immunsystems involviert sind, in dieser Arbeit keine Anreicherung

innerhalb der potentiellen TAAs hinsichtlich einer zellulären Lokalisation detektiert werden.

Dass TAAs eine wichtige Rolle innerhalb der Tumorbiologie spielen, ist eine häufige Beobachtung.

Durch Taylor et al. (2008) wurde kürzlich vorgeschlagen, dass Autoantikörper-Signaturen genutzt

werden könnten um Hinweise auf deregulierte Signalwege in Tumoren zu bekommen. So wird eine

humorale Immunantwort, z.B. in Prostatakarzinomen, häufig durch im Tumor überexprimierte oder

modifizierte Antigene hervorgerufen (McNeel et al. 2000; Sreekumar et al. 2004).


100

Auch in dieser Arbeit fanden sich unter den potentiell tumorassoziierten Antigenen weitere Proteine,

welche bekannten tumorbiologischen Prozessen zugeordnet werden. So zeigt z.B. ERBB2 (Her2neu)

ein Mitglied der EGFR/ErbB Familie eine signifikante Prävalenz für STS Patienten. Es handelt sich bei

ERBB2 um eine Plasmamembran-gebundene Rezeptor-Tyrosinkinase, welche in verschiedenen

Rezeptorkomplexen der Zelloberfläche assembliert ist und so eine wichtige Rolle in verschiedenen

Signalwegen wie z.B. dem MAP-Kinase-, dem Phosphoinositid 3-Kinase- (PI3K/Akt) oder dem STAT-

Signalweg (Grant et al. 2002) einnimmt. Eine Überexpression von ERBB2 konnte für diverse Tumore,

wie z.B. Brustkrebs, oder papilläre urotheliale Karzinome gezeigt werden und korreliert häufig mit

einer schlechten Prognose (Bitran et al. 1996; Schneider et al. 2014). Erhöhte Expression von ERBB2

bzw. c-ERBB2 konnte auch in Astrozytomen gezeigt werden und wird auch hier mit einer

schlechteren Prognose für die Patienten in Verbindung gebracht (Shiras et al. 2003; Gulati et al.

2010; Fang et al. 2012). Mit ERBB1 zeigte darüber hinaus ein weiteres Protein der EGF Rezeptor-

Familie eine differentielle Antwort. Die Amplifikation des EGFR Gens gehört zu den häufigsten

genetischen Aberrationen in Glioblastomen (Ekstrand et al. 1991) und tritt häufig zusammen mit der

Expression des mutierten EGFRvIII Gens auf (Wikstrand et al. 1997). Diese Variante weist durch die

Deletion der Exone 2-7 eine trunkierte extrazelluläre Domäne auf und zeigt eine liganden-

unabhängige konstitutive Aktivität auf (Ekstrand et al. 1994). Man geht davon aus, dass sowohl

ERBB2 als auch EGFR entscheidende Rollen bei der Gliomgenese spielen (Fang et al. 2012). Die

Inaktivierung von ERBB2 durch therapeutische Antikörper (Trastuzumab) ist nicht nur eine gängige

Immuntherapie im Kampf gegen Brustkrebs, auch konnten bereits Autoantikörper gegen ERBB2 im

Blut von Brustkrebspatientinnen detektiert werden (Disis et al. 1994; Lu et al. 2008).

Der Vergleich mit den Autoantikörperprofilen von Patienten, bei denen die Tumorerkrankung bereits

mindestens zwei Jahre zurückliegt, ergab, dass rund 40% der tumorassoziierten Autoantigene,

darunter auch die für die Validierung ausgewählten Kandidaten FHL1, FHL2, ERBB2 und EGFR, von

neu diagnostizierten GBM Patienten auch im Plasma von LTS nach mehr als drei Jahren noch

differentiell im Plasma gegenüber der Kontrollgruppe nachzuweisen sind. Vergleichbare Arbeiten, die

gezielt Antikörpertiter gegen bekannte TAAs in Langzeitstudien untersuchten, existieren zum

momentanen Zeitpunkt noch nicht. Nichtsdestotrotz schließt diese Arbeit die Möglichkeit mit ein,

dass erhöhte Antikörpertiter gegen Tumorantigene einen positiven Einfluss auf den Krankheitsverlauf

haben und so das Entstehen von Rezidiven verzögern.

Bereits bekannte Gliom TAAs wie z.B. GFAP, Calnexin (Schmits et al. 2002), bekannte C-T Antigene

wie z.B. MAGE (van der Bruggen et al. 1991) oder mutierte Varianten von p53 (Winter et al. 1992)

konnten hier nicht detektiert werden, da sie auf dem Proteinarray nicht vorhanden waren. Auch eine

Bestätigung der bereits bekannten TAAs GLEA 1 und 2 sowie PHF3 konnte aus diesem Grund nicht

http://en.wikipedia.org/wiki/Phosphoinositide_3-kinase


101

vorgenommen werden. Darüber hinaus gibt es Theorien, nach denen insbesondere tumorspezifische

Spleißvarianten eine erhöhte Immunogenität besitzen (Yang et al. 2006). So wurde durch Ng et al.

(2004) ein Mechanismus vorgeschlagen, bei dem alternatives Spleißen die strukturelle Basis liefert,

die bei verschiedenen Tumoren zu immunreaktiven Proteinisoformen führt (Ng et al. 2004).

Allerdings konnte eine potentiell erhöhte Immunogenität von Spleißisoformen im Rahmen dieser

Methode nicht adressiert werden, da auf dem Array nur in seltenen Fällen unterschiedliche

Isoformen, häufig sogar nur kurze Teilsequenzen, eines Proteins aufgebracht sind. Dennoch liefert

diese Theorie eine mögliche Erklärung zwischen den Beobachtungen aus der gewebebasierten Studie

von IDH1 mutierten und wt Glioblastomen und den vermuteten protektiven Eigenschaften von

Autoantikörpern bei Glioblastompatienten. So könnte die hier nachgewiesene Überrepräsentation

von mit Spleißen assoziierten Proteinen ein gehäuftes Vorkommen von Spleißisoformen zur Folge

haben, was, ausgelöst durch deren erhöhte Immunogenität, wiederum in einer stärkeren Antwort

des körpereigenen Immunsystems resultiert.

5.2.6. Fazit

Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die erstellten Antikörperprofile Unterscheide

sowohl zwischen neu diagnostizierten als auch progressionsfreien Glioblastompatienten und nicht

tumorerkrankten Kontrollen aufweisen. Innerhalb der Gruppe der immunreaktiven Antigene war

keine Abundanzabhängigkeit, wohl aber eine Anreicherung von zinkbindenden Motiven zu

beobachten. Darüber hinaus zeigte sich, dass eine Immunantwort häufig durch Proteine ausgelöst

wird, die tumorbiologisch relevant sind.


102

5.2.7. Ausblick

Mithilfe der Proteomanalyse und anschließender eingehender bioinformatorischer Analyse ist es

gelungen, einen tieferen Einblick in die molekularen Prozesse beim Langzeitüberleben des

Glioblastoms zu erhalten. Diese im Zusammenhang mit dem Langzeitüberleben bei

Glioblastompatienten unbekannten Prozesse sollen in weiteren Experimenten untersucht werden.

Hierbei ist zu beachten, dass für die funktionelle Validierung überwiegend auf Patientenmaterial,

welches zum jetzigen Zeitpunkt der Arbeit nicht in ausreichender Anzahl und Menge zur Verfügung

steht, zurückgegriffen werden muss. Entsprechende in vitro Modelle des Langzeitüberlebens stehen

nicht zur Verfügung. Dies gilt ebenfalls für die Untersuchung vor dem Hintergrund der IDH1

Mutation. Auch hier stehen keine in vitro Modelle zur Verfügung (Piaskowski et al. 2011). Um die

identifizierten Prozesse zu validieren, kommen folgende Experimente in Frage.

Für die Validierung der in STSwt hochregulierten mitochondrialen Proteine kommen

immunhistochemische Experimente in Frage. Hierbei steht der Fokus u.a. auf der Untersuchung der

hier aufgestellten Hypothese einer erhöhten Konzentration des Coenzyms NADPH in Tumoren von

STS Patienten im Vergleich zu LTS Patienten an einem unabhängigen Gewebekollektiv. Weiterhin

können auch die hier postulierten, erhöhten ROS-Konzentrationen im Rahmen weiterer

proteomanalytischer Analysen, z.B. durch den massenspektrometrischen Nachweis von

Tyrosinnitrierung, untersucht werden (Hemnani und Parihar 1998).

Die Beobachtung der vermehrt auftretenden RNA-bindenden Proteine und hier insbesondere die

Spleißfaktoren in IDH1-mutierten Glioblastomproben kann ebenfalls durch einen

massenspektrometriebasierten Ansatz untersucht werden. Ausgehend von den zur Verfügung

stehenden MS-Daten können Proteindatenbanken, welche zusätzliche Informationen über

Spleißvarianten enthalten, durchsucht werden. Hierbei können neben der Identifizierung von

Spleißvarianten auch mögliche quantitative Unterschiede zwischen den zwei Patientengruppen (IDH1

wt und IDH1 mut) detektiert werden. Veränderte Spleißvarianten könnten dann weitere

Informationen zum Verständnis der Tumorbiologie des Glioblastoms und ferner eine mögliche

Erklärungen für Immunreaktionen gegen einige der in dieser Arbeit detektierten tumorspezifische

Antigene liefern. Deren prognostische Relevanz ließe sich mit einem glioblastomspezifischen

Proteinarrays überprüfen, der für die Untersuchung der mittlerweile rund 1000 Plasmaproben

innerhalb des Deutschen Gliomnetzes einsetzbar wäre. Hierbei könnte dann ganz gezielt der

Vergleich von Autoantikörperprofilen neu diagnostizierter Patienten, deren progressionsfreies

Gesamtüberleben bei über drei Jahren lag, mit Profilen von Patienten, die innerhalb des ersten

Jahres nach der initialen Blutabnahme verstarben, durchgeführt werden. Die Entnahme von Plasma


103

zu mehreren Zeitpunkten, bei den in die Studie eingeschlossenen Patienten erlaubt zudem

Konzentrationen von Autoantikörpern gegen hier ermittelte Kandidatenautoantigene im Plasma von

GBM Patienten über längere Zeiträume hinweg zu untersuchen. Diese Verlaufsdaten wären

besonders unter dem Aspekt der klinischen Anwendung relevant, da eine Eignung eines oder

mehrerer Autoantikörper als Biomarker für die Frühdiagnose von Glioblastomen bzw. Therapie

unterstützend als Verlaufskontrolle denkbar wäre.

Diese Arbeit legt somit die Grundlage für eine Vielzahl von weiteren Studien zur Aufklärung der

molekularen Prozesse beim Langzeitüberleben von Glioblastompatienten.

Kapitel 6: Literatur

104

6. Literatur

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Anhang A

116

Anhang

A. Tabellen Tabelle 7.1: Proteine die eine differentielle Regulation zwischen LTSwt und STSwt Tumoren aufwiesen (Filterkriterien: p-Wert<0,05; Abundanzunterschied>1,5; mind.2 quantifizierte Peptide) (wird fortgesetzt).

Proteinbeschreibung Uniprot-ID p-Wert Abundanz-

unterschied

Gruppe mit höherer

Abundanz

Gruppe mit niedrigerer Abundanz

14 kDa phosphohistidine phosphatase OS=Homo sapiens GN=PHPT1 PE=1 SV=1 - [PHP14_HUMAN] Q9NRX4 0,0455 235 STS wt LTS wt

14-3-3 protein theta OS=Homo sapiens GN=YWHAQ PE=1 SV=1 - [1433T_HUMAN] P27348 0,0145 1,59 STS wt LTS wt

26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 11 OS=Homo sapiens GN=PSMD11 PE=1 SV=3 - [PSD11_HUMAN] O00231

0,0132 1,56 STS wt LTS wt

2-oxoglutarate dehydrogenase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=OGDH PE=1 SV=3 - [ODO1_HUMAN] Q02218


3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 OS=Homo sapiens GN=HSD17B10 PE=1 SV=3 - [HCD2_HUMAN] Q99714


4-aminobutyrate aminotransferase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ABAT PE=1 SV=3 - [GABT_HUMAN] P80404


6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating OS=Homo sapiens GN=PGD PE=1 SV=3 - [6PGD_HUMAN] P52209


Abhydrolase domain-containing protein 10, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ABHD10 PE=1 SV=1 - [ABHDA_HUMAN] Q9NUJ1

0,00383 2,81 STS wt LTS wt

Abhydrolase domain-containing protein 11 OS=Homo sapiens GN=ABHD11 PE=1 SV=1 - [ABHDB_HUMAN] Q8NFV4


Acetyl-CoA acetyltransferase, cytosolic OS=Homo sapiens GN=ACAT2 PE=1 SV=2 - [THIC_HUMAN] Q9BWD1 0,0317 1,77 STS wt LTS wt

Acetyl-CoA acetyltransferase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ACAT1 PE=1 SV=1 - [THIL_HUMAN] P24752 0,0297 1,84 STS wt LTS wt

Aconitate hydratase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ACO2 PE=1 SV=2 - [ACON_HUMAN] Q99798 0,00344 1,63 STS wt LTS wt

Actin, alpha cardiac muscle 1 OS=Homo sapiens GN=ACTC1 PE=1 SV=1 - [ACTC_HUMAN] P68032 0,0169 2,52 STS wt LTS wt

Actin-related protein 2 OS=Homo sapiens GN=ACTR2 PE=1 SV=1 - [ARP2_HUMAN] P61160 0,0478 1,71 STS wt LTS wt

Actin-related protein 2/3 complex subunit 2 OS=Homo sapiens GN=ARPC2 PE=1 SV=1 - [ARPC2_HUMAN] O15144 0,0349 1,61 STS wt LTS wt

Actin-related protein 2/3 complex subunit 3 OS=Homo sapiens GN=ARPC3 PE=1 SV=3 - [ARPC3_HUMAN] O15145 0,0336 1,58 STS wt LTS wt

Acylglycerol kinase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=AGK PE=1 SV=2 - [AGK_HUMAN] Q53H12 0,0285 5,23 STS wt LTS wt

Anhang A

117

Tabelle 7.1: Proteine die eine differentielle Regulation zwischen LTSwt und STSwt Tumoren aufwiesen (Filterkriterien: p-Wert<0,05; Abundanzunterschied>1,5; mind.2 quantifizierte Peptide) (Fortsetzung).


unterschied

Gruppe mit höherer

Abundanz


Acylpyruvase FAHD1, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=FAHD1 PE=1 SV=2 - [FAHD1_HUMAN] Q6P587 0,0465 2,57 STS wt LTS wt

Adenylyl cyclase-associated protein 1 OS=Homo sapiens GN=CAP1 PE=1 SV=5 - [CAP1_HUMAN] Q01518 0,0204 1,68 STS wt LTS wt

ADP/ATP translocase 1 OS=Homo sapiens GN=SLC25A4 PE=1 SV=4 - [ADT1_HUMAN] P12235 0,0162 3,07 STS wt LTS wt

ADP/ATP translocase 2 OS=Homo sapiens GN=SLC25A5 PE=1 SV=7 - [ADT2_HUMAN] P05141 0,0247 1,59 STS wt LTS wt

Aflatoxin B1 aldehyde reductase member 2 OS=Homo sapiens GN=AKR7A2 PE=1 SV=3 - [ARK72_HUMAN] O43488


Alcohol dehydrogenase class-3 OS=Homo sapiens GN=ADH5 PE=1 SV=4 - [ADHX_HUMAN] P11766 0,0169 1,75 STS wt LTS wt

Alpha-centractin OS=Homo sapiens GN=ACTR1A PE=1 SV=1 - [ACTZ_HUMAN] P61163 0,00669 2,44 STS wt LTS wt

Alpha-enolase OS=Homo sapiens GN=ENO1 PE=1 SV=2 - [ENOA_HUMAN] P06733 0,0271 1,7 STS wt LTS wt

Angiotensinogen OS=Homo sapiens GN=AGT PE=1 SV=1 - [ANGT_HUMAN] P01019 0,0243 2,24 STS wt LTS wt

Annexin A6 OS=Homo sapiens GN=ANXA6 PE=1 SV=3 - [ANXA6_HUMAN] P08133 0,0321 1,76 STS wt LTS wt

AP-2 complex subunit beta OS=Homo sapiens GN=AP2B1 PE=1 SV=1 - [AP2B1_HUMAN] P63010 0,00506 1,89 STS wt LTS wt

Arfaptin-1 OS=Homo sapiens GN=ARFIP1 PE=1 SV=2 - [ARFP1_HUMAN] P53367 0,0102 2,27 LTS wt STS wt

Arf-GAP domain and FG repeat-containing protein 1 OS=Homo sapiens GN=AGFG1 PE=1 SV=2 - [AGFG1_HUMAN] P52594

0,0442 1,78 LTS wt STS wt

Aspartate aminotransferase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=GOT2 PE=1 SV=3 - [AATM_HUMAN] P00505 0,00547 2,01 STS wt LTS wt

Ataxin-10 OS=Homo sapiens GN=ATXN10 PE=1 SV=1 - [ATX10_HUMAN] Q9UBB4 0,00107 2,86 STS wt LTS wt

ATP synthase subunit alpha, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ATP5A1 PE=1 SV=1 - [ATPA_HUMAN] P25705 0,032 1,74 STS wt LTS wt

ATP synthase subunit f, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ATP5J2 PE=1 SV=3 - [ATPK_HUMAN] P56134 0,00644 2,56 STS wt LTS wt

ATP synthase subunit gamma, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ATP5C1 PE=1 SV=1 - [ATPG_HUMAN] P36542


ATPase family AAA domain-containing protein 3A OS=Homo sapiens GN=ATAD3A PE=1 SV=2 - [ATD3A_HUMAN] Q9NVI7

0,00607 2,24 STS wt LTS wt

Beta-centractin OS=Homo sapiens GN=ACTR1B PE=1 SV=1 - [ACTY_HUMAN] P42025 0,043 2,06 STS wt LTS wt

Anhang A

118



unterschied

Gruppe mit höherer

Abundanz


BRO1 domain-containing protein BROX OS=Homo sapiens GN=BROX PE=1 SV=1 - [BROX_HUMAN] Q5VW32 0,0353 1,6 STS wt LTS wt

Calcyclin-binding protein OS=Homo sapiens GN=CACYBP PE=1 SV=2 - [CYBP_HUMAN] Q9HB71 0,0178 1,54 STS wt LTS wt

cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit alpha OS=Homo sapiens GN=PRKACA PE=1 SV=2 - [KAPCA_HUMAN] P17612


Carbonic anhydrase 2 OS=Homo sapiens GN=CA2 PE=1 SV=2 - [CAH2_HUMAN] P00918 0,0122 1,95 STS wt LTS wt

CB1 cannabinoid receptor-interacting protein 1 OS=Homo sapiens GN=CNRIP1 PE=1 SV=1 - [CNRP1_HUMAN] Q96F85


CD166 antigen OS=Homo sapiens GN=ALCAM PE=1 SV=2 - [CD166_HUMAN] Q13740 0,017 3,92 STS wt LTS wt

Clathrin interactor 1 OS=Homo sapiens GN=CLINT1 PE=1 SV=1 - [EPN4_HUMAN] Q14677 0,0137 3,83 STS wt LTS wt

Cleavage stimulation factor subunit 2 OS=Homo sapiens GN=CSTF2 PE=1 SV=1 - [CSTF2_HUMAN] P33240 0,0121 2,24 LTS wt STS wt

Coactosin-like protein OS=Homo sapiens GN=COTL1 PE=1 SV=3 - [COTL1_HUMAN] Q14019 0,00237 2,35 STS wt LTS wt

Cystatin-B OS=Homo sapiens GN=CSTB PE=1 SV=2 - [CYTB_HUMAN] P04080 0,0319 1,54 STS wt LTS wt

Cysteine and glycine-rich protein 1 OS=Homo sapiens GN=CSRP1 PE=1 SV=3 - [CSRP1_HUMAN] P21291 0,05 1,82 STS wt LTS wt

Cytochrome b-c1 complex subunit 1, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=UQCRC1 PE=1 SV=3 - [QCR1_HUMAN] P31930


Cytochrome b-c1 complex subunit 2, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=UQCRC2 PE=1 SV=3 - [QCR2_HUMAN] P22695

0,00189 1,97 STS wt LTS wt

Cytochrome b-c1 complex subunit Rieske, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=UQCRFS1 PE=1 SV=2 - [UCRI_HUMAN] P47985


Cytochrome c oxidase subunit 2 OS=Homo sapiens GN=MT-CO2 PE=1 SV=1 - [COX2_HUMAN] P00403 0,0281 2,53 STS wt LTS wt

Cytosolic acyl coenzyme A thioester hydrolase OS=Homo sapiens GN=ACOT7 PE=1 SV=3 - [BACH_HUMAN] O00154


Dihydrolipoyl dehydrogenase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=DLD PE=1 SV=2 - [DLDH_HUMAN] P09622 0,0478 1,86 STS wt LTS wt

Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=DLST PE=1 SV=4 - [ODO2_HUMAN] P36957

0,00825 1,67 STS wt LTS wt

Dual specificity protein phosphatase 3 OS=Homo sapiens GN=DUSP3 PE=1 SV=1 - [DUS3_HUMAN] P51452 0,00136 1,62 STS wt LTS wt

Dynactin subunit 1 OS=Homo sapiens GN=DCTN1 PE=1 SV=3 - [DCTN1_HUMAN] Q14203 0,0301 1,99 STS wt LTS wt

Dynamin-1-like protein OS=Homo sapiens GN=DNM1L PE=1 SV=2 - [DNM1L_HUMAN] O00429 0,00119 2,01 STS wt LTS wt

Anhang A

119



unterschied

Gruppe mit höherer

Abundanz


Dynein light chain 2, cytoplasmic OS=Homo sapiens GN=DYNLL2 PE=1 SV=1 - [DYL2_HUMAN] Q96FJ2 0,0282 2,83 STS wt LTS wt

Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 6 OS=Homo sapiens GN=ENPP6 PE=1 SV=2 - [ENPP6_HUMAN] Q6UWR7


EF-hand domain-containing protein D2 OS=Homo sapiens GN=EFHD2 PE=1 SV=1 - [EFHD2_HUMAN] Q96C19 0,000337 2,64 STS wt LTS wt

Electron transfer flavoprotein subunit alpha, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ETFA PE=1 SV=1 - [ETFA_HUMAN] P13804


Endophilin-B2 OS=Homo sapiens GN=SH3GLB2 PE=1 SV=1 - [SHLB2_HUMAN] Q9NR46 0,00717 3,76 STS wt LTS wt

Enoyl-CoA delta isomerase 1, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ECI1 PE=1 SV=1 - [ECI1_HUMAN] P42126 0,0215 2,35 STS wt LTS wt

Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ECHS1 PE=1 SV=4 - [ECHM_HUMAN] P30084 0,00531 2,11 STS wt LTS wt

Estradiol 17-beta-dehydrogenase 12 OS=Homo sapiens GN=HSD17B12 PE=1 SV=2 - [DHB12_HUMAN] Q53GQ0 0,0433 2,64 STS wt LTS wt

Eukaryotic initiation factor 4A-I OS=Homo sapiens GN=EIF4A1 PE=1 SV=1 - [IF4A1_HUMAN] P60842 0,0419 2,13 STS wt LTS wt

Eukaryotic translation initiation factor 5A-1 OS=Homo sapiens GN=EIF5A PE=1 SV=2 - [IF5A1_HUMAN] P63241 0,00623 1,95 STS wt LTS wt

Flavin reductase (NADPH) OS=Homo sapiens GN=BLVRB PE=1 SV=3 - [BLVRB_HUMAN] P30043 0,022 2,46 STS wt LTS wt

Fumarate hydratase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=FH PE=1 SV=3 - [FUMH_HUMAN] P07954 0,000912 2,08 STS wt LTS wt

Galactocerebrosidase OS=Homo sapiens GN=GALC PE=1 SV=2 - [GALC_HUMAN] P54803 0,0196 2,92 STS wt LTS wt

Galectin-1 OS=Homo sapiens GN=LGALS1 PE=1 SV=2 - [LEG1_HUMAN] P09382 0,00518 1,97 STS wt LTS wt

Gamma-adducin OS=Homo sapiens GN=ADD3 PE=1 SV=1 - [ADDG_HUMAN] Q9UEY8 0,0229 2,29 STS wt LTS wt

Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase OS=Homo sapiens GN=G6PD PE=1 SV=4 - [G6PD_HUMAN] P11413 0,0159 1,91 STS wt LTS wt

Glutaminase kidney isoform, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=GLS PE=1 SV=1 - [GLSK_HUMAN] O94925 0,0307 2,29 STS wt LTS wt

Glutathione S-transferase Mu 3 OS=Homo sapiens GN=GSTM3 PE=1 SV=3 - [GSTM3_HUMAN] P21266 0,00355 2,15 STS wt LTS wt

Glyoxylate reductase/hydroxypyruvate reductase OS=Homo sapiens GN=GRHPR PE=1 SV=1 - [GRHPR_HUMAN] Q9UBQ7


Guanine nucleotide-binding protein G(i) subunit alpha-1 OS=Homo sapiens GN=GNAI1 PE=1 SV=2 - [GNAI1_HUMAN] P63096

0,00281 9,53 STS wt LTS wt

Heat shock protein 105 kDa OS=Homo sapiens GN=HSPH1 PE=1 SV=1 - [HS105_HUMAN] Q92598 0,0444 1,51 STS wt LTS wt

Heat shock protein HSP 90-alpha OS=Homo sapiens GN=HSP90AA1 PE=1 SV=5 - [HS90A_HUMAN] P07900 0,0316 1,5 STS wt LTS wt

Anhang A

120



unterschied

Gruppe mit höherer

Abundanz


Hemoglobin subunit gamma-1 OS=Homo sapiens GN=HBG1 PE=1 SV=2 - [HBG1_HUMAN] P69891 0,024 3,81 STS wt LTS wt

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2 OS=Homo sapiens GN=HNRNPH2 PE=1 SV=1 - [HNRH2_HUMAN] P55795


Histone H2B type 2-E OS=Homo sapiens GN=HIST2H2BE PE=1 SV=3 - [H2B2E_HUMAN] Q16778 0,0156 2 STS wt LTS wt

Hydroxyacylglutathione hydrolase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=HAGH PE=1 SV=2 - [GLO2_HUMAN] Q16775


Immunoglobulin superfamily member 8 OS=Homo sapiens GN=IGSF8 PE=1 SV=1 - [IGSF8_HUMAN] Q969P0 0,0315 4,52 STS wt LTS wt

Importin subunit alpha-4 OS=Homo sapiens GN=KPNA4 PE=1 SV=1 - [IMA4_HUMAN] O00629 0,0227 2,44 STS wt LTS wt

Importin-5 OS=Homo sapiens GN=IPO5 PE=1 SV=4 - [IPO5_HUMAN] O00410 0,0303 2,46 STS wt LTS wt

Inositol polyphosphate 1-phosphatase OS=Homo sapiens GN=INPP1 PE=1 SV=1 - [INPP_HUMAN] P49441 0,0224 1,91 STS wt LTS wt

Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit alpha, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=IDH3A PE=1 SV=1 - [IDH3A_HUMAN] P50213

0,00623 2,14 STS wt LTS wt

Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit beta, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=IDH3B PE=1 SV=2 - [IDH3B_HUMAN] O43837


Keratin, type II cytoskeletal 5 OS=Homo sapiens GN=KRT5 PE=1 SV=3 - [K2C5_HUMAN] P13647 0,0106 2,24 LTS wt STS wt

Keratinocyte proline-rich protein OS=Homo sapiens GN=KPRP PE=1 SV=1 - [KPRP_HUMAN] Q5T749 0,00000206 4508340,13 LTS wt STS wt

Kynurenine--oxoglutarate transaminase 3 OS=Homo sapiens GN=CCBL2 PE=1 SV=1 - [KAT3_HUMAN] Q6YP21 0,00805 2,29 STS wt LTS wt

L-lactate dehydrogenase B chain OS=Homo sapiens GN=LDHB PE=1 SV=2 - [LDHB_HUMAN] P07195 0,00529 1,76 STS wt LTS wt

Malate dehydrogenase, cytoplasmic OS=Homo sapiens GN=MDH1 PE=1 SV=4 - [MDHC_HUMAN] P40925 0,0445 1,51 STS wt LTS wt

Malate dehydrogenase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=MDH2 PE=1 SV=3 - [MDHM_HUMAN] P40926 0,0127 1,71 STS wt LTS wt

Malignant T-cell-amplified sequence 1 OS=Homo sapiens GN=MCTS1 PE=1 SV=1 - [MCTS1_HUMAN] Q9ULC4 0,0102 2,47 STS wt LTS wt

Methylosome protein 50 OS=Homo sapiens GN=WDR77 PE=1 SV=1 - [MEP50_HUMAN] Q9BQA1 0,0301 1,79 STS wt LTS wt

Microtubule-associated protein 6 OS=Homo sapiens GN=MAP6 PE=1 SV=2 - [MAP6_HUMAN] Q96JE9 0,0316 3,87 STS wt LTS wt

Mitochondrial 2-oxoglutarate/malate carrier protein OS=Homo sapiens GN=SLC25A11 PE=1 SV=3 - [M2OM_HUMAN] Q02978


Mitochondrial fission 1 protein OS=Homo sapiens GN=FIS1 PE=1 SV=2 - [FIS1_HUMAN] Q9Y3D6 0,0327 1,99 STS wt LTS wt

Mitochondrial import receptor subunit TOM22 homolog OS=Homo sapiens GN=TOMM22 PE=1 SV=3 - Q9NS69 0,0309 3,14 STS wt LTS wt

Anhang A

121



unterschied

Gruppe mit höherer

Abundanz


[TOM22_HUMAN]

NAD(P)H-hydrate epimerase OS=Homo sapiens GN=APOA1BP PE=1 SV=2 - [NNRE_HUMAN] Q8NCW5 0,0301 1,8 STS wt LTS wt

NAD-dependent protein deacetylase sirtuin-2 OS=Homo sapiens GN=SIRT2 PE=1 SV=2 - [SIR2_HUMAN] Q8IXJ6 0,0114 3,17 STS wt LTS wt

NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 9, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=NDUFA9 PE=1 SV=2 - [NDUA9_HUMAN] Q16795


NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 3 OS=Homo sapiens GN=NDUFB3 PE=1 SV=3 - [NDUB3_HUMAN] O43676


NADH-cytochrome b5 reductase 3 OS=Homo sapiens GN=CYB5R3 PE=1 SV=3 - [NB5R3_HUMAN] P00387 0,00945 2,36 STS wt LTS wt

NADH-ubiquinone oxidoreductase 75 kDa subunit, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=NDUFS1 PE=1 SV=3 - [NDUS1_HUMAN] P28331

0,00533 2,29 STS wt LTS wt

Neuroblast differentiation-associated protein AHNAK OS=Homo sapiens GN=AHNAK PE=1 SV=2 - [AHNK_HUMAN] Q09666


Neurochondrin OS=Homo sapiens GN=NCDN PE=1 SV=1 - [NCDN_HUMAN] Q9UBB6 0,0315 2,23 STS wt LTS wt

Neurotrimin OS=Homo sapiens GN=NTM PE=1 SV=1 - [NTRI_HUMAN] Q9P121 0,0363 9,68 STS wt LTS wt

Neutrophil collagenase OS=Homo sapiens GN=MMP8 PE=1 SV=1 - [MMP8_HUMAN] P22894 0,037 2,59 LTS wt STS wt

Nuclear pore complex protein Nup93 OS=Homo sapiens GN=NUP93 PE=1 SV=2 - [NUP93_HUMAN] Q8N1F7 0,00963 5,36 STS wt LTS wt

OCIA domain-containing protein 2 OS=Homo sapiens GN=OCIAD2 PE=1 SV=1 - [OCAD2_HUMAN] Q56VL3 0,0485 4,25 LTS wt STS wt

PDZ domain-containing protein GIPC1 OS=Homo sapiens GN=GIPC1 PE=1 SV=2 - [GIPC1_HUMAN] O14908 0,0153 1,94 STS wt LTS wt

Peroxiredoxin-1 OS=Homo sapiens GN=PRDX1 PE=1 SV=1 - [PRDX1_HUMAN] Q06830 0,0227 1,85 STS wt LTS wt

Peroxiredoxin-5, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PRDX5 PE=1 SV=4 - [PRDX5_HUMAN] P30044 0,0297 1,74 STS wt LTS wt

Peroxiredoxin-6 OS=Homo sapiens GN=PRDX6 PE=1 SV=3 - [PRDX6_HUMAN] P30041 0,0377 1,66 STS wt LTS wt

Peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase 1 OS=Homo sapiens GN=ACOX1 PE=1 SV=3 - [ACOX1_HUMAN] Q15067 0,0485 1,89 STS wt LTS wt

Phosphatidylethanolamine-binding protein 1 OS=Homo sapiens GN=PEBP1 PE=1 SV=3 - [PEBP1_HUMAN] P30086


Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=GPX4 PE=1 SV=3 - [GPX4_HUMAN] P36969

0,00567 1,52 STS wt LTS wt

PITH domain-containing protein 1 OS=Homo sapiens GN=PITHD1 PE=1 SV=1 - [PITH1_HUMAN] Q9GZP4 0,0109 1,76 STS wt LTS wt

Anhang A

122



unterschied

Gruppe mit höherer

Abundanz


Platelet-activating factor acetylhydrolase IB subunit alpha OS=Homo sapiens GN=PAFAH1B1 PE=1 SV=2 - [LIS1_HUMAN] P43034


Prenylcysteine oxidase 1 OS=Homo sapiens GN=PCYOX1 PE=1 SV=3 - [PCYOX_HUMAN] Q9UHG3 0,0287 1,54 STS wt LTS wt

Propionyl-CoA carboxylase alpha chain, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PCCA PE=1 SV=4 - [PCCA_HUMAN] P05165


Prostaglandin reductase 1 OS=Homo sapiens GN=PTGR1 PE=1 SV=2 - [PTGR1_HUMAN] Q14914 0,0306 1,53 STS wt LTS wt

Proteasome subunit beta type-1 OS=Homo sapiens GN=PSMB1 PE=1 SV=2 - [PSB1_HUMAN] P20618 0,0421 1,63 STS wt LTS wt



Protein CDV3 homolog OS=Homo sapiens GN=CDV3 PE=1 SV=1 - [CDV3_HUMAN] Q9UKY7 0,042 2,68 LTS wt STS wt

Protein DJ-1 OS=Homo sapiens GN=PARK7 PE=1 SV=2 - [PARK7_HUMAN] Q99497 0,00407 2,43 STS wt LTS wt

Protein QIL1 OS=Homo sapiens GN=QIL1 PE=1 SV=1 - [QIL1_HUMAN] Q5XKP0 0,0255 3,08 STS wt LTS wt

Purine nucleoside phosphorylase OS=Homo sapiens GN=PNP PE=1 SV=2 - [PNPH_HUMAN] P00491 0,00703 2,64 STS wt LTS wt

Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha, somatic form, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PDHA1 PE=1 SV=3 - [ODPA_HUMAN] P08559

0,00336 2,82 STS wt LTS wt

Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PDHB PE=1 SV=3 - [ODPB_HUMAN] P11177

0,00084 2,04 STS wt LTS wt

Quinone oxidoreductase OS=Homo sapiens GN=CRYZ PE=1 SV=1 - [QOR_HUMAN] Q08257 0,00839 1,96 STS wt LTS wt

Rab GDP dissociation inhibitor alpha OS=Homo sapiens GN=GDI1 PE=1 SV=2 - [GDIA_HUMAN] P31150 0,00711 1,86 STS wt LTS wt

Rab GDP dissociation inhibitor beta OS=Homo sapiens GN=GDI2 PE=1 SV=2 - [GDIB_HUMAN] P50395 0,00772 1,85 STS wt LTS wt

Ras-related protein Rab-18 OS=Homo sapiens GN=RAB18 PE=1 SV=1 - [RAB18_HUMAN] Q9NP72 0,035 1,92 STS wt LTS wt

Ras-related protein Rab-1B OS=Homo sapiens GN=RAB1B PE=1 SV=1 - [RAB1B_HUMAN] Q9H0U4 0,00935 2,64 STS wt LTS wt

Ras-related protein Rab-2A OS=Homo sapiens GN=RAB2A PE=1 SV=1 - [RAB2A_HUMAN] P61019 0,0117 2,57 STS wt LTS wt

Ras-related protein Rab-7a OS=Homo sapiens GN=RAB7A PE=1 SV=1 - [RAB7A_HUMAN] P51149 0,0163 1,65 STS wt LTS wt

Ras-related protein Ral-A OS=Homo sapiens GN=RALA PE=1 SV=1 - [RALA_HUMAN] P11233 0,0204 3,2 STS wt LTS wt

Septin-8 OS=Homo sapiens GN=SEPT8 PE=1 SV=4 - [SEPT8_HUMAN] Q92599 0,0407 1,89 STS wt LTS wt

Anhang A

123



unterschied

Gruppe mit höherer

Abundanz


Serine/threonine-protein phosphatase 2B catalytic subunit alpha isoform OS=Homo sapiens GN=PPP3CA PE=1 SV=1 - [PP2BA_HUMAN] Q08209


Sex hormone-binding globulin OS=Homo sapiens GN=SHBG PE=1 SV=2 - [SHBG_HUMAN] P04278 0,0145 6,63 STS wt LTS wt

SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein 2 OS=Homo sapiens GN=SH3BGRL2 PE=1 SV=2 - [SH3L2_HUMAN] Q9UJC5


SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein OS=Homo sapiens GN=SH3BGRL PE=1 SV=1 - [SH3L1_HUMAN] O75368


Sideroflexin-1 OS=Homo sapiens GN=SFXN1 PE=1 SV=4 - [SFXN1_HUMAN] Q9H9B4 0,00861 1,82 STS wt LTS wt

Sorbitol dehydrogenase OS=Homo sapiens GN=SORD PE=1 SV=4 - [DHSO_HUMAN] Q00796 0,00642 3,23 STS wt LTS wt

Spectrin alpha chain, brain OS=Homo sapiens GN=SPTAN1 PE=1 SV=3 - [SPTA2_HUMAN] Q13813 0,00909 1,6 STS wt LTS wt

Structural maintenance of chromosomes protein 3 OS=Homo sapiens GN=SMC3 PE=1 SV=2 - [SMC3_HUMAN] Q9UQE7

0,00303 3,67 LTS wt STS wt

Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=SUCLA2 PE=1 SV=3 - [SUCB1_HUMAN] Q9P2R7


Sulfide:quinone oxidoreductase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=SQRDL PE=1 SV=1 - [SQRD_HUMAN] Q9Y6N5

0,00424 3,06 STS wt LTS wt

Synaptobrevin homolog YKT6 OS=Homo sapiens GN=YKT6 PE=1 SV=1 - [YKT6_HUMAN] O15498 0,0193 2,55 STS wt LTS wt

Synemin OS=Homo sapiens GN=SYNM PE=1 SV=2 - [SYNEM_HUMAN] O15061 0,0257 1,97 LTS wt STS wt

Thioredoxin OS=Homo sapiens GN=TXN PE=1 SV=3 - [THIO_HUMAN] P10599 0,0398 1,93 STS wt LTS wt

Thioredoxin-dependent peroxide reductase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PRDX3 PE=1 SV=3 - [PRDX3_HUMAN] P30048

0,00976 2,33 STS wt LTS wt

Thymidine phosphorylase OS=Homo sapiens GN=TYMP PE=1 SV=2 - [TYPH_HUMAN] P19971 0,0472 2,01 LTS wt STS wt

Transforming protein RhoA OS=Homo sapiens GN=RHOA PE=1 SV=1 - [RHOA_HUMAN] P61586 0,0302 3,72 STS wt LTS wt

Transmembrane emp24 domain-containing protein 2 OS=Homo sapiens GN=TMED2 PE=1 SV=1 - [TMED2_HUMAN] Q15363


Tropomyosin alpha-4 chain OS=Homo sapiens GN=TPM4 PE=1 SV=3 - [TPM4_HUMAN] P67936 0,00962 2,41 LTS wt STS wt

TSC22 domain family protein 4 OS=Homo sapiens GN=TSC22D4 PE=1 SV=2 - [T22D4_HUMAN] Q9Y3Q8 0,0259 1,75 LTS wt STS wt

Tubulin alpha-4A chain OS=Homo sapiens GN=TUBA4A PE=1 SV=1 - [TBA4A_HUMAN] P68366 0,0309 3 STS wt LTS wt

Anhang A

124



unterschied

Gruppe mit höherer

Abundanz


Tumor protein D54 OS=Homo sapiens GN=TPD52L2 PE=1 SV=2 - [TPD54_HUMAN] O43399 0,00558 4,27 LTS wt STS wt

Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11 OS=Homo sapiens GN=PTPN11 PE=1 SV=2 - [PTN11_HUMAN] Q06124


Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 14 OS=Homo sapiens GN=USP14 PE=1 SV=3 - [UBP14_HUMAN] P54578 0,0163 1,55 STS wt LTS wt

Ubiquitin-associated protein 2-like OS=Homo sapiens GN=UBAP2L PE=1 SV=2 - [UBP2L_HUMAN] Q14157 0,0198 2,12 LTS wt STS wt

Up-regulated during skeletal muscle growth protein 5 OS=Homo sapiens GN=USMG5 PE=1 SV=1 - [USMG5_HUMAN] Q96IX5


Vacuolar protein sorting-associated protein 26A OS=Homo sapiens GN=VPS26A PE=1 SV=2 - [VP26A_HUMAN] O75436

0,00195 3,42 STS wt LTS wt

Voltage-dependent anion-selective channel protein 1 OS=Homo sapiens GN=VDAC1 PE=1 SV=2 - [VDAC1_HUMAN] P21796

0,00602 1,72 STS wt LTS wt

Voltage-dependent anion-selective channel protein 3 OS=Homo sapiens GN=VDAC3 PE=1 SV=1 - [VDAC3_HUMAN] Q9Y277

0,00563 2,03 STS wt LTS wt

V-type proton ATPase subunit B, brain isoform OS=Homo sapiens GN=ATP6V1B2 PE=1 SV=3 - [VATB2_HUMAN] P21281


V-type proton ATPase subunit C 1 OS=Homo sapiens GN=ATP6V1C1 PE=1 SV=4 - [VATC1_HUMAN] P21283 0,0315 1,72 STS wt LTS wt

V-type proton ATPase subunit E 1 OS=Homo sapiens GN=ATP6V1E1 PE=1 SV=1 - [VATE1_HUMAN] P36543 0,00493 2,45 STS wt LTS wt

V-type proton ATPase subunit H OS=Homo sapiens GN=ATP6V1H PE=1 SV=1 - [VATH_HUMAN] Q9UI12 0,00364 4,95 STS wt LTS wt

V-type proton ATPase subunit S1 OS=Homo sapiens GN=ATP6AP1 PE=1 SV=2 - [VAS1_HUMAN] Q15904 0,0273 3,03 STS wt LTS wt

Anhang A

125

Tabelle 7.2: Genset mitochondriale Proteine für SOM-Analysen (wird fortgesetzt)

Proteinbeschreibung Uniprot-ID Rang Abundanz-

unterschied STS/LTS

p-Wert

abhydrolase domain containing 10 [Source:HGNC Symbol;Acc:25656] Q9NUJ1 92 3,71 0,025375

acyl-CoA thioesterase 7 [Source:HGNC Symbol;Acc:24157] O00154 574 1,97 0,22052896

ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial Fo complex, subunit F2 [Source:HGNC Symbol;Acc:848] P56134 89 3,80 0,0242358

ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial Fo complex, subunit G [Source:HGNC Symbol;Acc:14247] O75964 648 1,94 0,25271117

carbohydrate kinase domain containing [Source:HGNC Symbol;Acc:25576] Q8IW45 650 1,99 0,25298477

cathepsin A [Source:HGNC Symbol;Acc:9251] P10619 156 4,32 0,0502

chromosome 19 open reading frame 70 [Source:HGNC Symbol;Acc:33702] Q5XKP0 83 4,11 0,02346333

cytochrome b5 type A (microsomal) [Source:HGNC Symbol;Acc:2570] P00167 41 5,49 0,00860011

cytochrome c oxidase subunit VIc [Source:HGNC Symbol;Acc:2285] P09669 311 2,67 0,12001089

dihydroorotate dehydrogenase (quinone) [Source:HGNC Symbol;Acc:2867] Q02127 453 2,43 0,17354125

dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1 [Source:HGNC Symbol;Acc:2715] O94760 709 1,72 0,27374214

dynamin 3 [Source:HGNC Symbol;Acc:29125] Q9UQ16 28 6,82 0,00310705

galactosylceramidase [Source:HGNC Symbol;Acc:4115] P54803 223 3,06 0,08451885

histidine triad nucleotide binding protein 3 [Source:HGNC Symbol;Acc:18468] Q9NQE9 530 2,30 0,20478666

mitochondrial pyruvate carrier 2 [Source:HGNC Symbol;Acc:24515] O95563 77 6,13 0,02056085

mitochondrial ribosomal protein S23 [Source:HGNC Symbol;Acc:14509] Q9Y3D9 64 6,91 0,01448438

mitochondrially encoded ATP synthase 6 [Source:HGNC Symbol;Acc:7414] P00846 418 2,62 0,15929575

monoamine oxidase B [Source:HGNC Symbol;Acc:6834] P27338 1630 1,31 0,61709278

NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 12 [Source:HGNC Symbol;Acc:23987] Q9UI09 148 3,50 0,04863466

NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 13 [Source:HGNC Symbol;Acc:17194] Q9P0J0 1383 1,42 0,52618321

NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 6, 14kDa [Source:HGNC Symbol;Acc:7690] P56556 362 2,62 0,13801353

NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 8, 19kDa [Source:HGNC Symbol;Acc:7692] P51970 545 1,97 0,21070772

NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 4, 18kDa (NADH-coenzyme Q reductase) [Source:HGNC Symbol;Acc:7711] O43181 327 2,72 0,12514471

N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein, gamma [Source:HGNC Symbol;Acc:7642] Q99747 1286 1,59 0,49506766

NFS1 nitrogen fixation 1 homolog (S. cerevisiae) [Source:HGNC Symbol;Acc:15910] Q9Y697 479 2,98 0,18447989

prohibitin 2 [Source:HGNC Symbol;Acc:30306] Q99623 1001 1,57 0,38390266

prostaglandin E synthase 2 [Source:HGNC Symbol;Acc:17822] Q9H7Z7 529 1,99 0,20469818

protein tyrosine phosphatase, mitochondrial 1 [Source:HGNC Symbol;Acc:26965] Q8WUK0 620 2,31 0,23933121

pterin-4 alpha-carbinolamine dehydratase/dimerization cofactor of hepatocyte nuclear factor 1 alpha (TCF1) 2 [Source:HGNC Symbol;Acc:24474]

Q9H0N5 1255 1,63 0,48042243

Anhang A

126

Tabelle 7.2: Genset mitochondriale Proteine für SOM-Analysen (Fortsetzung)

Proteinbeschreibung Uniprot-ID Rang Abundanz-

unterschied STS/LTS

p-Wert

pyruvate dehydrogenase complex, component X [Source:HGNC Symbol;Acc:21350] O00330 1000 1,88 0,38364459

quinoid dihydropteridine reductase [Source:HGNC Symbol;Acc:9752] P09417 532 1,98 0,20542787

RAB1B, member RAS oncogene family [Source:HGNC Symbol;Acc:18370] Q9H0U4 182 3,08 0,05828872

ras homolog family member A [Source:HGNC Symbol;Acc:667] P61586 108 3,71 0,03130816

ribosomal protein S15a [Source:HGNC Symbol;Acc:10389] P62244 252 2,76 0,09449992

solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; adenine nucleotide translocator), member 4 [Source:HGNC Symbol;Acc:10990] P12235 21 8,85 0,00183946

solute carrier family 25 (mitochondrial carrier; oxoglutarate carrier), member 11 [Source:HGNC Symbol;Acc:10981] Q02978 123 3,16 0,0370303

translocase of inner mitochondrial membrane 13 homolog (yeast) [Source:HGNC Symbol;Acc:11816] Q9Y5L4 283 3,10 0,11057395

ubiquinol-cytochrome c reductase binding protein [Source:HGNC Symbol;Acc:12582] P14927 900 1,64 0,34613443

ubiquinol-cytochrome c reductase, complex III subunit X [Source:HGNC Symbol;Acc:30863] Q9UDW1 187 3,90 0,05923736

zinc binding alcohol dehydrogenase domain containing 2 [Source:HGNC Symbol;Acc:28697] Q8N4Q0 804 1,67 0,30788195

Anhang A

127

Tabelle 7.3 Proteine mit mitochondrialer Lokalisation aus der Gruppe der in STSwt differentiell hochregulierten Proteine (Filterkriterien: p-Wert<0,05; Abundanzunterschied>1,5; mind. 1 quantifizierte Peptide) (wird fortgesetzt).

Proteinbeschreibung Uniprot-

ID p-Wert

Abundanz-unterschied

2-oxoglutarate dehydrogenase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=OGDH PE=1 SV=3 - [ODO1_HUMAN] Q02218 0,0493185 1,92

3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 OS=Homo sapiens GN=HSD17B10 PE=1 SV=3 - [HCD2_HUMAN] Q99714 0,02750335 1,72

4-aminobutyrate aminotransferase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ABAT PE=1 SV=3 - [GABT_HUMAN] P80404 0,03269914 2,26

Abhydrolase domain-containing protein 10, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ABHD10 PE=1 SV=1 - [ABHDA_HUMAN] Q9NUJ1 0,00383425 2,81

Acetyl-CoA acetyltransferase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ACAT1 PE=1 SV=1 - [THIL_HUMAN] P24752 0,02968135 1,84

Acetyl-coenzyme A synthetase 2-like, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ACSS1 PE=1 SV=2 - [ACS2L_HUMAN] Q9NUB1 0,02911815 6,59

Aconitate hydratase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ACO2 PE=1 SV=2 - [ACON_HUMAN] Q99798 0,0034399 1,63

Acylglycerol kinase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=AGK PE=1 SV=2 - [AGK_HUMAN] Q53H12 0,02849418 5,23

Acylpyruvase FAHD1, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=FAHD1 PE=1 SV=2 - [FAHD1_HUMAN] Q6P587 0,04646738 2,57

ADP/ATP translocase 1 OS=Homo sapiens GN=SLC25A4 PE=1 SV=4 - [ADT1_HUMAN] P12235 0,01620438 3,07



Aflatoxin B1 aldehyde reductase member 2 OS=Homo sapiens GN=AKR7A2 PE=1 SV=3 - [ARK72_HUMAN] O43488 0,01577238 1,59

Aspartate aminotransferase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=GOT2 PE=1 SV=3 - [AATM_HUMAN] P00505 0,00547246 2,01

ATP synthase subunit alpha, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ATP5A1 PE=1 SV=1 - [ATPA_HUMAN] P25705 0,03198815 1,74

ATP synthase subunit f, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ATP5J2 PE=1 SV=3 - [ATPK_HUMAN] P56134 0,00644263 2,56

ATP synthase subunit gamma, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ATP5C1 PE=1 SV=1 - [ATPG_HUMAN] P36542 0,02527186 2,18

ATP synthase subunit s, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ATP5S PE=1 SV=3 - [ATP5S_HUMAN] Q99766 0,00316216 3,89

ATP-binding cassette sub-family E member 1 OS=Homo sapiens GN=ABCE1 PE=1 SV=1 - [ABCE1_HUMAN] P61221 0,04779007 1,9

Bcl-2-like protein 13 OS=Homo sapiens GN=BCL2L13 PE=1 SV=1 - [B2L13_HUMAN] Q9BXK5 0,00528076 3,32

cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit alpha OS=Homo sapiens GN=PRKACA PE=1 SV=2 - [KAPCA_HUMAN] P17612 0,02618255 2,46

Cytochrome b5 OS=Homo sapiens GN=CYB5A PE=1 SV=2 - [CYB5_HUMAN] P00167 0,03570398 5,67

Cytochrome b-c1 complex subunit 1, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=UQCRC1 PE=1 SV=3 - [QCR1_HUMAN] P31930 0,02637675 1,57

Cytochrome b-c1 complex subunit 2, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=UQCRC2 PE=1 SV=3 - [QCR2_HUMAN] P22695 0,00188887 1,97

Cytochrome b-c1 complex subunit 9 OS=Homo sapiens GN=UQCR10 PE=1 SV=3 - [QCR9_HUMAN] Q9UDW1 0,04984692 12,51

Cytochrome b-c1 complex subunit Rieske, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=UQCRFS1 PE=1 SV=2 - [UCRI_HUMAN] P47985 0,03370207 2,42

Cytochrome c oxidase subunit 2 OS=Homo sapiens GN=MT-CO2 PE=1 SV=1 - [COX2_HUMAN] P00403 0,02805793 2,53

Anhang A

128

Tabelle 7.3: Proteine mit mitochondrialer Lokalisation aus der Gruppe der in STSwt differentiell hochregulierten Proteine (Filterkriterien: p-Wert<0,05; Abundanzunterschied>1,5; mind. 1 quantifizierte Peptide) (Fortsetzung).


ID p-Wert


Cytosolic acyl coenzyme A thioester hydrolase OS=Homo sapiens GN=ACOT7 PE=1 SV=3 - [BACH_HUMAN] O00154 0,03984679 2,07

Dihydrolipoyl dehydrogenase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=DLD PE=1 SV=2 - [DLDH_HUMAN] P09622 0,04779886 1,86

Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of 2-oxoglutarate dehydrogenase complex, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=DLST PE=1 SV=4 - [ODO2_HUMAN]

P36957 0,00825042 1,67

Dynamin-1-like protein OS=Homo sapiens GN=DNM1L PE=1 SV=2 - [DNM1L_HUMAN] O00429 0,00118562 2,01

Electron transfer flavoprotein subunit alpha, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ETFA PE=1 SV=1 - [ETFA_HUMAN] P13804 0,04424481 1,57

Enoyl-CoA delta isomerase 1, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ECI1 PE=1 SV=1 - [ECI1_HUMAN] P42126 0,02153966 2,35

Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ECHS1 PE=1 SV=4 - [ECHM_HUMAN] P30084 0,00530987 2,11

Fumarate hydratase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=FH PE=1 SV=3 - [FUMH_HUMAN] P07954 0,00091211 2,08

Glutaminase kidney isoform, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=GLS PE=1 SV=1 - [GLSK_HUMAN] O94925 0,03070775 2,29

Hydroxyacylglutathione hydrolase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=HAGH PE=1 SV=2 - [GLO2_HUMAN] Q16775 0,00963593 2,6

Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit alpha, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=IDH3A PE=1 SV=1 - [IDH3A_HUMAN] P50213 0,00622604 2,14

Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit beta, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=IDH3B PE=1 SV=2 - [IDH3B_HUMAN] O43837 0,01863346 4,66

Malate dehydrogenase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=MDH2 PE=1 SV=3 - [MDHM_HUMAN] P40926 0,01267695 1,71

Mitochondrial 2-oxoglutarate/malate carrier protein OS=Homo sapiens GN=SLC25A11 PE=1 SV=3 - [M2OM_HUMAN] Q02978 0,02134188 2,45

Mitochondrial fission 1 protein OS=Homo sapiens GN=FIS1 PE=1 SV=2 - [FIS1_HUMAN] Q9Y3D6 0,03274604 1,99

Mitochondrial import receptor subunit TOM22 homolog OS=Homo sapiens GN=TOMM22 PE=1 SV=3 - [TOM22_HUMAN] Q9NS69 0,03093709 3,14

Mitochondrial pyruvate carrier 2 OS=Homo sapiens GN=MPC2 PE=1 SV=1 - [MPC2_HUMAN] O95563 0,0289065 10,42

NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 9, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=NDUFA9 PE=1 SV=2 - [NDUA9_HUMAN]

Q16795 0,03475121 4,15

NADH-cytochrome b5 reductase 3 OS=Homo sapiens GN=CYB5R3 PE=1 SV=3 - [NB5R3_HUMAN] P00387 0,00945441 2,36

Peroxiredoxin-5, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PRDX5 PE=1 SV=4 - [PRDX5_HUMAN] P30044 0,02967725 1,74

Peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase 1 OS=Homo sapiens GN=ACOX1 PE=1 SV=3 - [ACOX1_HUMAN] Q15067 0,04848902 1,89

Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=GPX4 PE=1 SV=3 - [GPX4_HUMAN] P36969 0,00567358 1,52

Protein DJ-1 OS=Homo sapiens GN=PARK7 PE=1 SV=2 - [PARK7_HUMAN] Q99497 0,00407046 2,43

Protein-tyrosine phosphatase mitochondrial 1 OS=Homo sapiens GN=PTPMT1 PE=1 SV=1 - [PTPM1_HUMAN] Q8WUK0 0,03238109 3,98

Anhang A

129

Tabelle 7.3: Proteine mit mitochondrialer Lokalisation aus der Gruppe der in STSwt differentiell hochregulierten Proteine (Filterkriterien: p-Wert<0,05; Abundanzunterschied>1,5; mind. 1 quantifizierte Peptide) (Fortsetzung).


ID p-Wert


Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha, somatic form, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PDHA1 PE=1 SV=3 - [ODPA_HUMAN]

P08559 0,00336152 2,82

Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PDHB PE=1 SV=3 - [ODPB_HUMAN] P11177 0,00084003 2,04

Serine/threonine-protein phosphatase 2B catalytic subunit alpha isoform OS=Homo sapiens GN=PPP3CA PE=1 SV=1 - [PP2BA_HUMAN] Q08209 0,03872187 2,45

Sideroflexin-1 OS=Homo sapiens GN=SFXN1 PE=1 SV=4 - [SFXN1_HUMAN] Q9H9B4 0,008614 1,82

Succinyl-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=SUCLA2 PE=1 SV=3 - [SUCB1_HUMAN] Q9P2R7 0,04527218 1,9

Thioredoxin-dependent peroxide reductase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PRDX3 PE=1 SV=3 - [PRDX3_HUMAN] P30048 0,00976133 2,33

Tricarboxylate transport protein, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=SLC25A1 PE=1 SV=2 - [TXTP_HUMAN] P53007 0,0197129 3,64

Tyrosine-protein kinase Lyn OS=Homo sapiens GN=LYN PE=1 SV=3 - [LYN_HUMAN] P07948 0,00909144 5,19

Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11 OS=Homo sapiens GN=PTPN11 PE=1 SV=2 - [PTN11_HUMAN] Q06124 0,01686089 2,34

Up-regulated during skeletal muscle growth protein 5 OS=Homo sapiens GN=USMG5 PE=1 SV=1 - [USMG5_HUMAN] Q96IX5 0,01792869 2,57

Voltage-dependent anion-selective channel protein 1 OS=Homo sapiens GN=VDAC1 PE=1 SV=2 - [VDAC1_HUMAN] P21796 0,00601559 1,72

Voltage-dependent anion-selective channel protein 3 OS=Homo sapiens GN=VDAC3 PE=1 SV=1 - [VDAC3_HUMAN] Q9Y277 0,00562827 2,03

V-type proton ATPase subunit E 1 OS=Homo sapiens GN=ATP6V1E1 PE=1 SV=1 - [VATE1_HUMAN] P36543 0,00493257 2,45

Anhang A

130

Tabelle 7.4: Proteine die eine differentielle Regulation zwischen LTSmut und LTSwt Tumoren aufwiesen (Filterkriterien: p-Wert<0,01; Abundanzunterschied>1,5; mind.2 quantifizierte Peptide) (wird fortgesetzt).

Proteinbeschreibung Uniprot

ID p-Wert


Gruppe mit höherer

Abundanz


14-3-3 protein theta OS=Homo sapiens GN=YWHAQ PE=1 SV=1 - [1433T_HUMAN] P27348 0,00223 2,05 LTS mut LTS wt

26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 11 OS=Homo sapiens GN=PSMD11 PE=1 SV=3 - [PSD11_HUMAN]

O00231 0,00188 2,02 LTS mut LTS wt

Abl interactor 1 OS=Homo sapiens GN=ABI1 PE=1 SV=4 - [ABI1_HUMAN] Q8IZP0 0,000543 3,29 LTS mut LTS wt

Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A OS=Homo sapiens GN=ANP32A PE=1 SV=1 - [AN32A_HUMAN]

P39687 0,00659 2,3 LTS mut LTS wt

Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member E OS=Homo sapiens GN=ANP32E PE=1 SV=1 - [AN32E_HUMAN]

Q9BTT0 0,00663 5,05 LTS mut LTS wt

Alpha-actinin-1 OS=Homo sapiens GN=ACTN1 PE=1 SV=2 - [ACTN1_HUMAN] P12814 0,0014 2,23 LTS wt LTS mut

Annexin A1 OS=Homo sapiens GN=ANXA1 PE=1 SV=2 - [ANXA1_HUMAN] P04083 0,00000736 7,04 LTS wt LTS mut



Apolipoprotein L2 OS=Homo sapiens GN=APOL2 PE=1 SV=1 - [APOL2_HUMAN] Q9BQE5 0,00852 2,69 LTS wt LTS mut

Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD OS=Homo sapiens GN=PYCARD PE=1 SV=2 - [ASC_HUMAN]

Q9ULZ3 0,000101 21,75 LTS wt LTS mut

Ataxin-10 OS=Homo sapiens GN=ATXN10 PE=1 SV=1 - [ATX10_HUMAN] Q9UBB4 0,0078 4,35 LTS mut LTS wt

ATP synthase subunit beta, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ATP5B PE=1 SV=3 - [ATPB_HUMAN] P06576 0,00236 2,25 LTS mut LTS wt

Beta-adducin OS=Homo sapiens GN=ADD2 PE=1 SV=3 - [ADDB_HUMAN] P35612 0,00247 2,7 LTS mut LTS wt

Brevican core protein OS=Homo sapiens GN=BCAN PE=1 SV=2 - [PGCB_HUMAN] Q96GW7 0,00643 5,64 LTS mut LTS wt

BTB/POZ domain-containing protein KCTD12 OS=Homo sapiens GN=KCTD12 PE=1 SV=1 - [KCD12_HUMAN] Q96CX2 0,00502 1,86 LTS wt LTS mut

Carbonyl reductase [NADPH] 1 OS=Homo sapiens GN=CBR1 PE=1 SV=3 - [CBR1_HUMAN] P16152 0,00000799 4,76 LTS wt LTS mut

Carboxypeptidase Q OS=Homo sapiens GN=CPQ PE=1 SV=1 - [CBPQ_HUMAN] Q9Y646 0,000536 3,63 LTS wt LTS mut

Casein kinase II subunit beta OS=Homo sapiens GN=CSNK2B PE=1 SV=1 - [CSK2B_HUMAN] P67870 0,00676 2,06 LTS mut LTS wt

CD166 antigen OS=Homo sapiens GN=ALCAM PE=1 SV=2 - [CD166_HUMAN] Q13740 0,000311 8,71 LTS mut LTS wt

CD44 antigen OS=Homo sapiens GN=CD44 PE=1 SV=3 - [CD44_HUMAN] P16070 0,00607 4,89 LTS wt LTS mut

Chitinase-3-like protein 1 OS=Homo sapiens GN=CHI3L1 PE=1 SV=2 - [CH3L1_HUMAN] P36222 0,00031 11,24 LTS wt LTS mut

Anhang A

131

Tabelle 7.4: Proteine die eine differentielle Regulation zwischen LTSmut und LTSwt Tumoren aufwiesen (Filterkriterien: p-Wert<0,01; Abundanzunterschied>1,5; mind.2 quantifizierte Peptide) (Fortsetzung).


ID p-Wert


Gruppe mit höherer

Abundanz


Chloride intracellular channel protein 1 OS=Homo sapiens GN=CLIC1 PE=1 SV=4 - [CLIC1_HUMAN] O00299 0,00000185 3,41 LTS wt LTS mut

Chromobox protein homolog 1 OS=Homo sapiens GN=CBX1 PE=1 SV=1 - [CBX1_HUMAN] P83916 0,00718 3,7 LTS mut LTS wt

Chromobox protein homolog 3 OS=Homo sapiens GN=CBX3 PE=1 SV=4 - [CBX3_HUMAN] Q13185 0,00354 2,25 LTS mut LTS wt

Cold-inducible RNA-binding protein OS=Homo sapiens GN=CIRBP PE=1 SV=1 - [CIRBP_HUMAN] Q14011 0,00879 2,57 LTS mut LTS wt

Core histone macro-H2A,1 OS=Homo sapiens GN=H2AFY PE=1 SV=4 - [H2AY_HUMAN] O75367 0,00479 2,2 LTS mut LTS wt

Core histone macro-H2A,2 OS=Homo sapiens GN=H2AFY2 PE=1 SV=3 - [H2AW_HUMAN] Q9P0M6 0,000815 6,71 LTS mut LTS wt

C-terminal-binding protein 1 OS=Homo sapiens GN=CTBP1 PE=1 SV=2 - [CTBP1_HUMAN] Q13363 0,00306 3,4 LTS mut LTS wt

Cysteine and glycine-rich protein 1 OS=Homo sapiens GN=CSRP1 PE=1 SV=3 - [CSRP1_HUMAN] P21291 0,00732 1,74 LTS wt LTS mut

Cytochrome c1, heme protein, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=CYC1 PE=1 SV=3 - [CY1_HUMAN] P08574 0,0061 2,46 LTS mut LTS wt

Cytoplasmic dynein 1 light intermediate chain 1 OS=Homo sapiens GN=DYNC1LI1 PE=1 SV=3 - [DC1L1_HUMAN]

Q9Y6G9 0,00247 3,7 LTS mut LTS wt

Cytosol aminopeptidase OS=Homo sapiens GN=LAP3 PE=1 SV=3 - [AMPL_HUMAN] P28838 0,00524 2,06 LTS wt LTS mut

DBIRD complex subunit KIAA1967 OS=Homo sapiens GN=KIAA1967 PE=1 SV=2 - [K1967_HUMAN] Q8N163 0,00803 2,72 LTS mut LTS wt

Delta(3,5)-Delta(2,4)-dienoyl-CoA isomerase, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=ECH1 PE=1 SV=2 - [ECH1_HUMAN]

Q13011 0,00877 2,42 LTS mut LTS wt

DnaJ homolog subfamily C member 8 OS=Homo sapiens GN=DNAJC8 PE=1 SV=2 - [DNJC8_HUMAN] O75937 0,00361 2,26 LTS mut LTS wt

Drebrin OS=Homo sapiens GN=DBN1 PE=1 SV=4 - [DREB_HUMAN] Q16643 0,00101 3,8 LTS mut LTS wt

Dynactin subunit 2 OS=Homo sapiens GN=DCTN2 PE=1 SV=4 - [DCTN2_HUMAN] Q13561 0,00825 2,14 LTS mut LTS wt

Dynamin-1-like protein OS=Homo sapiens GN=DNM1L PE=1 SV=2 - [DNM1L_HUMAN] O00429 0,00205 2,06 LTS mut LTS wt

Dynamin-3 OS=Homo sapiens GN=DNM3 PE=1 SV=4 - [DYN3_HUMAN] Q9UQ16 0,00814 9,23 LTS mut LTS wt

ELAV-like protein 1 OS=Homo sapiens GN=ELAVL1 PE=1 SV=2 - [ELAV1_HUMAN] Q15717 0,00948 2,07 LTS mut LTS wt

ELAV-like protein 4 OS=Homo sapiens GN=ELAVL4 PE=1 SV=2 - [ELAV4_HUMAN] P26378 0,00998 2,86 LTS mut LTS wt

Eukaryotic initiation factor 4A-III OS=Homo sapiens GN=EIF4A3 PE=1 SV=4 - [IF4A3_HUMAN] P38919 0,00323 2,27 LTS mut LTS wt

Anhang A

132



ID p-Wert


Gruppe mit höherer

Abundanz


Filamin-A OS=Homo sapiens GN=FLNA PE=1 SV=4 - [FLNA_HUMAN] P21333 0,00463 3,12 LTS wt LTS mut

Galectin-1 OS=Homo sapiens GN=LGALS1 PE=1 SV=2 - [LEG1_HUMAN] P09382 0,00912 2,52 LTS wt LTS mut

Galectin-3 OS=Homo sapiens GN=LGALS3 PE=1 SV=5 - [LEG3_HUMAN] P17931 0,00000902 18,35 LTS wt LTS mut

Glutathione S-transferase Mu 1 OS=Homo sapiens GN=GSTM1 PE=1 SV=3 - [GSTM1_HUMAN] P09488 0,00299 11,88 LTS wt LTS mut

Glutathione synthetase OS=Homo sapiens GN=GSS PE=1 SV=1 - [GSHB_HUMAN] P48637 0,00311 2,28 LTS wt LTS mut

Glycogen phosphorylase, liver form OS=Homo sapiens GN=PYGL PE=1 SV=4 - [PYGL_HUMAN] P06737 0,00289 6,86 LTS wt LTS mut

Heat shock-related 70 kDa protein 2 OS=Homo sapiens GN=HSPA2 PE=1 SV=1 - [HSP72_HUMAN] P54652 0,00993 2,47 LTS wt LTS mut

Hemoglobin subunit alpha OS=Homo sapiens GN=HBA1 PE=1 SV=2 - [HBA_HUMAN] P69905 0,00969 3,72 LTS wt LTS mut

Heterochromatin protein 1-binding protein 3 OS=Homo sapiens GN=HP1BP3 PE=1 SV=1 - [HP1B3_HUMAN] Q5SSJ5 0,00847 2,38 LTS mut LTS wt

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D0 OS=Homo sapiens GN=HNRNPD PE=1 SV=1 - [HNRPD_HUMAN]

Q14103 0,00222 2,14 LTS mut LTS wt

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D-like OS=Homo sapiens GN=HNRPDL PE=1 SV=3 - [HNRDL_HUMAN]

O14979 0,0065 2,13 LTS mut LTS wt

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H3 OS=Homo sapiens GN=HNRNPH3 PE=1 SV=2 - [HNRH3_HUMAN]

P31942 0,000709 2,81 LTS mut LTS wt

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K OS=Homo sapiens GN=HNRNPK PE=1 SV=1 - [HNRPK_HUMAN] P61978 0,00263 2,65 LTS mut LTS wt

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein R OS=Homo sapiens GN=HNRNPR PE=1 SV=1 - [HNRPR_HUMAN] O43390 0,0062 2,61 LTS mut LTS wt

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U OS=Homo sapiens GN=HNRNPU PE=1 SV=6 - [HNRPU_HUMAN] Q00839 0,00332 2,36 LTS mut LTS wt

Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1 OS=Homo sapiens GN=HNRNPA2B1 PE=1 SV=2 - [ROA2_HUMAN]

P22626 0,000633 1,93 LTS mut LTS wt

Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins C1/C2 OS=Homo sapiens GN=HNRNPC PE=1 SV=4 - [HNRPC_HUMAN]

P07910 0,0024 2,52 LTS mut LTS wt

Histone H2A,Z OS=Homo sapiens GN=H2AFZ PE=1 SV=2 - [H2AZ_HUMAN] P0C0S5 0,00238 2,3 LTS mut LTS wt

HLA class II histocompatibility antigen, DR alpha chain OS=Homo sapiens GN=HLA-DRA PE=1 SV=1 - [DRA_HUMAN]

P01903 0,00498 3,17 LTS wt LTS mut

Host cell factor 1 OS=Homo sapiens GN=HCFC1 PE=1 SV=2 - [HCFC1_HUMAN] P51610 0,00663 2,97 LTS mut LTS wt

Interleukin enhancer-binding factor 3 OS=Homo sapiens GN=ILF3 PE=1 SV=3 - [ILF3_HUMAN] Q12906 0,0082 2,73 LTS mut LTS wt

Anhang A

133



ID p-Wert


Gruppe mit höherer

Abundanz


KH domain-containing, RNA-binding, signal transduction-associated protein 1 OS=Homo sapiens GN=KHDRBS1 PE=1 SV=1 - [KHDR1_HUMAN]

Q07666 0,00485 2,83 LTS mut LTS wt

Lamin-B2 OS=Homo sapiens GN=LMNB2 PE=1 SV=3 - [LMNB2_HUMAN] Q03252 0,000481 1,97 LTS mut LTS wt

Leucine-rich repeat-containing protein 47 OS=Homo sapiens GN=LRRC47 PE=1 SV=1 - [LRC47_HUMAN] Q8N1G4 0,00487 3,47 LTS mut LTS wt

Leukocyte elastase inhibitor OS=Homo sapiens GN=SERPINB1 PE=1 SV=1 - [ILEU_HUMAN] P30740 0,000976 3,85 LTS wt LTS mut

Macrophage-capping protein OS=Homo sapiens GN=CAPG PE=1 SV=2 - [CAPG_HUMAN] P40121 0,0000243 3,71 LTS wt LTS mut

Major vault protein OS=Homo sapiens GN=MVP PE=1 SV=4 - [MVP_HUMAN] Q14764 0,00139 2,81 LTS wt LTS mut

Matrin-3 OS=Homo sapiens GN=MATR3 PE=1 SV=2 - [MATR3_HUMAN] P43243 0,00952 2,39 LTS mut LTS wt

Metalloproteinase inhibitor 1 OS=Homo sapiens GN=TIMP1 PE=1 SV=1 - [TIMP1_HUMAN] P01033 0,00201 28 LTS wt LTS mut

Microfibrillar-associated protein 1 OS=Homo sapiens GN=MFAP1 PE=1 SV=2 - [MFAP1_HUMAN] P55081 0,00178 3,08 LTS mut LTS wt

Microtubule-associated protein 2 OS=Homo sapiens GN=MAP2 PE=1 SV=4 - [MAP2_HUMAN] P11137 0,00000641 4,44 LTS mut LTS wt

Moesin OS=Homo sapiens GN=MSN PE=1 SV=3 - [MOES_HUMAN] P26038 0,00000502 3,29 LTS wt LTS mut

Myelin expression factor 2 OS=Homo sapiens GN=MYEF2 PE=1 SV=3 - [MYEF2_HUMAN] Q9P2K5 0,0000629 2,4 LTS mut LTS wt

Myosin light polypeptide 6 OS=Homo sapiens GN=MYL6 PE=1 SV=2 - [MYL6_HUMAN] P60660 0,000816 2,54 LTS wt LTS mut

Neural cell adhesion molecule 1 OS=Homo sapiens GN=NCAM1 PE=1 SV=3 - [NCAM1_HUMAN] P13591 0,00125 3,33 LTS mut LTS wt

NHP2-like protein 1 OS=Homo sapiens GN=NHP2L1 PE=1 SV=3 - [NH2L1_HUMAN] P55769 0,00443 2,64 LTS mut LTS wt

Nicotinamide phosphoribosyltransferase OS=Homo sapiens GN=NAMPT PE=1 SV=1 - [NAMPT_HUMAN] P43490 0,0000111 5,75 LTS wt LTS mut

Nuclear autoantigenic sperm protein OS=Homo sapiens GN=NASP PE=1 SV=2 - [NASP_HUMAN] P49321 0,00872 2,81 LTS mut LTS wt

Nuclear mitotic apparatus protein 1 OS=Homo sapiens GN=NUMA1 PE=1 SV=2 - [NUMA1_HUMAN] Q14980 0,00597 3,05 LTS mut LTS wt

Nuclear transcription factor Y subunit gamma OS=Homo sapiens GN=NFYC PE=1 SV=3 - [NFYC_HUMAN] Q13952 0,00605 2,24 LTS mut LTS wt

Nucleolin OS=Homo sapiens GN=NCL PE=1 SV=3 - [NUCL_HUMAN] P19338 0,00828 2,19 LTS mut LTS wt

Paraspeckle component 1 OS=Homo sapiens GN=PSPC1 PE=1 SV=1 - [PSPC1_HUMAN] Q8WXF1 0,000543 2,98 LTS mut LTS wt

PDZ and LIM domain protein 4 OS=Homo sapiens GN=PDLIM4 PE=1 SV=2 - [PDLI4_HUMAN] P50479 0,0000292 7,5 LTS wt LTS mut

Phenylalanine--tRNA ligase beta subunit OS=Homo sapiens GN=FARSB PE=1 SV=3 - [SYFB_HUMAN] Q9NSD9 0,00767 2,13 LTS mut LTS wt

Anhang A

134



ID p-Wert


Gruppe mit höherer

Abundanz


Plastin-2 OS=Homo sapiens GN=LCP1 PE=1 SV=6 - [PLSL_HUMAN] P13796 0,00798 4,63 LTS wt LTS mut

Polypyrimidine tract-binding protein 2 OS=Homo sapiens GN=PTBP2 PE=1 SV=1 - [PTBP2_HUMAN] Q9UKA9 0,00177 4,12 LTS mut LTS wt

Prelamin-A/C OS=Homo sapiens GN=LMNA PE=1 SV=1 - [LMNA_HUMAN] P02545 0,00308 1,78 LTS wt LTS mut

Pre-mRNA-processing factor 19 OS=Homo sapiens GN=PRPF19 PE=1 SV=1 - [PRP19_HUMAN] Q9UMS4 0,00732 2,25 LTS mut LTS wt

Prohibitin OS=Homo sapiens GN=PHB PE=1 SV=1 - [PHB_HUMAN] P35232 0,00798 1,94 LTS mut LTS wt

Propionyl-CoA carboxylase beta chain, mitochondrial OS=Homo sapiens GN=PCCB PE=1 SV=3 - [PCCB_HUMAN]

P05166 0,00373 3,87 LTS mut LTS wt

Protein enabled homolog OS=Homo sapiens GN=ENAH PE=1 SV=2 - [ENAH_HUMAN] Q8N8S7 0,00211 3,44 LTS mut LTS wt

Protein NipSnap homolog 3A OS=Homo sapiens GN=NIPSNAP3A PE=1 SV=2 - [NPS3A_HUMAN] Q9UFN0 0,009 2,93 LTS wt LTS mut

Protein S100-A11 OS=Homo sapiens GN=S100A11 PE=1 SV=2 - [S10AB_HUMAN] P31949 0,000105 4,47 LTS wt LTS mut

Ras GTPase-activating-like protein IQGAP1 OS=Homo sapiens GN=IQGAP1 PE=1 SV=1 - [IQGA1_HUMAN] P46940 0,0000208 3,1 LTS wt LTS mut

Retinol-binding protein 4 OS=Homo sapiens GN=RBP4 PE=1 SV=3 - [RET4_HUMAN] P02753 0,00425 3,11 LTS wt LTS mut

Rho GDP-dissociation inhibitor 2 OS=Homo sapiens GN=ARHGDIB PE=1 SV=3 - [GDIR2_HUMAN] P52566 0,00898 1,7 LTS wt LTS mut

Ribosome-binding protein 1 OS=Homo sapiens GN=RRBP1 PE=1 SV=4 - [RRBP1_HUMAN] Q9P2E9 0,000218 3,7 LTS wt LTS mut

RNA-binding protein EWS OS=Homo sapiens GN=EWSR1 PE=1 SV=1 - [EWS_HUMAN] Q01844 0,00393 2,23 LTS mut LTS wt

RNA-binding protein FUS OS=Homo sapiens GN=FUS PE=1 SV=1 - [FUS_HUMAN] P35637 0,00535 3 LTS mut LTS wt

RNA-binding protein Nova-1 OS=Homo sapiens GN=NOVA1 PE=1 SV=1 - [NOVA1_HUMAN] P51513 0,00302 3,54 LTS mut LTS wt

Scaffold attachment factor B1 OS=Homo sapiens GN=SAFB PE=1 SV=4 - [SAFB1_HUMAN] Q15424 0,00497 3,97 LTS mut LTS wt

Scavenger receptor cysteine-rich type 1 protein M130 OS=Homo sapiens GN=CD163 PE=1 SV=2 - [C163A_HUMAN]

Q86VB7 0,00527 8,51 LTS wt LTS mut

Selenide, water dikinase 1 OS=Homo sapiens GN=SEPHS1 PE=1 SV=2 - [SPS1_HUMAN] P49903 0,000706 2,85 LTS mut LTS wt

Serine/arginine-rich splicing factor 3 OS=Homo sapiens GN=SRSF3 PE=1 SV=1 - [SRSF3_HUMAN] P84103 0,00769 2,62 LTS mut LTS wt

Serine/arginine-rich splicing factor 6 OS=Homo sapiens GN=SRSF6 PE=1 SV=2 - [SRSF6_HUMAN] Q13247 0,00198 2,85 LTS mut LTS wt



Anhang A

135



ID p-Wert


Gruppe mit höherer

Abundanz


SPARC-related modular calcium-binding protein 1 OS=Homo sapiens GN=SMOC1 PE=1 SV=1 - [SMOC1_HUMAN]

Q9H4F8 0,000469 14,37 LTS mut LTS wt

Spermidine synthase OS=Homo sapiens GN=SRM PE=1 SV=1 - [SPEE_HUMAN] P19623 0,00939 3,15 LTS mut LTS wt

Splicing factor 3A subunit 3 OS=Homo sapiens GN=SF3A3 PE=1 SV=1 - [SF3A3_HUMAN] Q12874 0,00197 5,91 LTS mut LTS wt

Splicing factor 45 OS=Homo sapiens GN=RBM17 PE=1 SV=1 - [SPF45_HUMAN] Q96I25 0,0000376 4,74 LTS mut LTS wt

Splicing factor, proline- and glutamine-rich OS=Homo sapiens GN=SFPQ PE=1 SV=2 - [SFPQ_HUMAN] P23246 0,0086 2,05 LTS mut LTS wt

Stathmin OS=Homo sapiens GN=STMN1 PE=1 SV=3 - [STMN1_HUMAN] P16949 0,000242 3,95 LTS mut LTS wt

SUMO-activating enzyme subunit 2 OS=Homo sapiens GN=UBA2 PE=1 SV=2 - [SAE2_HUMAN] Q9UBT2 0,00826 2,95 LTS mut LTS wt

Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial OS=Homo sapiens GN=SOD2 PE=1 SV=2 - [SODM_HUMAN] P04179 0,000146 3,99 LTS wt LTS mut

SWI/SNF complex subunit SMARCC2 OS=Homo sapiens GN=SMARCC2 PE=1 SV=1 - [SMRC2_HUMAN] Q8TAQ2 0,0000664 3,36 LTS mut LTS wt

SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily E member 1 OS=Homo sapiens GN=SMARCE1 PE=1 SV=2 - [SMCE1_HUMAN]

Q969G3 0,00303 3,47 LTS mut LTS wt

TAR DNA-binding protein 43 OS=Homo sapiens GN=TARDBP PE=1 SV=1 - [TADBP_HUMAN] Q13148 0,00433 2,69 LTS mut LTS wt

Thymidine phosphorylase OS=Homo sapiens GN=TYMP PE=1 SV=2 - [TYPH_HUMAN] P19971 0,000272 4,98 LTS wt LTS mut

Thyroid hormone receptor-associated protein 3 OS=Homo sapiens GN=THRAP3 PE=1 SV=2 - [TR150_HUMAN]

Q9Y2W1 0,00411 3,32 LTS mut LTS wt

Tubulin beta chain OS=Homo sapiens GN=TUBB PE=1 SV=2 - [TBB5_HUMAN] P07437 0,00537 2,01 LTS mut LTS wt

Tubulin polymerization-promoting protein family member 3 OS=Homo sapiens GN=TPPP3 PE=1 SV=1 - [TPPP3_HUMAN]

Q9BW30 0,00297 3,2 LTS wt LTS mut

U1 small nuclear ribonucleoprotein 70 kDa OS=Homo sapiens GN=SNRNP70 PE=1 SV=2 - [RU17_HUMAN] P08621 0,00571 3,2 LTS mut LTS wt

Ubiquitin-conjugating enzyme E2 E2 OS=Homo sapiens GN=UBE2E2 PE=1 SV=1 - [UB2E2_HUMAN] Q96LR5 0,00679 5,46 LTS mut LTS wt

Uncharacterized protein C1orf198 OS=Homo sapiens GN=C1orf198 PE=1 SV=1 - [CA198_HUMAN] Q9H425 0,0000649 6,31 LTS mut LTS wt

UPF0553 protein C9orf64 OS=Homo sapiens GN=C9orf64 PE=1 SV=1 - [CI064_HUMAN] Q5T6V5 0,0021 13,28 LTS wt LTS mut

V-set and immunoglobulin domain-containing protein 4 OS=Homo sapiens GN=VSIG4 PE=1 SV=1 - [VSIG4_HUMAN]

Q9Y279 0,00434 6,42 LTS wt LTS mut

Anhang A

136

Tabelle 7.5: Differentiell in LTS mut Tumoren angereicherte Prozesse, Funktionen und Lokalisation laut Anreicherungsanalyse mit der Software DAVID (Filterkriterium: FDR ≤0,001)

Kategorie Term Count Anreicherungs-

faktor FDR

BiologischerProzess GO:0016071~mRNA metabolic process 26 5,17 0,000000000799

BiologischerProzess GO:0006397~mRNA processing 25 5,37 0,000000000552

Molekulare Funktion GO:0003723~RNA binding 34 3,64 0,000000000449

BiologischerProzess GO:0008380~RNA splicing 23 5,33 0,00000000489

BiologischerProzess GO:0006396~RNA processing 26 4,28 0,0000000165

Molekulare Funktion GO:0003677~DNA binding 24 3,8 0,000000771

BiologischerProzess GO:0000398~nuclear mRNA splicing, via spliceosome 17 5,44 0,00000225

BiologischerProzess GO:0000377~RNA splicing, via transesterification reactions with bulged adenosine as nucleophile 17 5,44 0,00000225

BiologischerProzess GO:0000375~RNA splicing, via transesterification reactions 17 5,44 0,00000225

Zellkompartiment GO:0031981~nuclear lumen 28 2,93 0,0000144

Molekulare Funktion GO:0000166~nucleotide binding 39 1,94 0,000252

Zellkompartiment GO:0030530~heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex 7 12,99 0,000655

Zellkompartiment GO:0005681~spliceosome 11 5,88 0,000526

Zellkompartiment GO:0005654~nucleoplasm 18 3,21 0,00074

Zellkompartiment GO:0070013~intracellular organelle lumen 31 2,11 0,000593

Anhang A

137

Tabelle 7.6: Antigene die in mehr als 50 % der Tumorpatienten im Vergleich zu den nicht tumorerkrankten Kontrollen im ProteinArray-Experiment eine Immunantwort hervorriefen und einen p-Wert ≤0,01 aufwiesen (wird fortgesetzt).

Proteinbeschreibung Uniprot ID Gen Symbol Kontrolle Prävalenz

Tumor Prävalenz

p-Wert Im Transkriptom

detektiert

Im Proteom detektiert [Anzahl identifizierter

Spektren]

AHNAK nucleoprotein (AHNAK), transcript variant 2 A1A586 AHNAK 27,27% 77,27% 0,00477 nein 0

coiled-coil domain containing 69 (CCDC69) A6NI79 CCDC69 9,09% 59,09% 0,000216 ja 0

thyroid hormone receptor interactor 10 (TRIP10) A7VJC9 TRIP10 27,27% 81,82% 0,000532 nein 0

cell division cycle 25 homolog A (S, pombe) (CDC25A), transcript variant 2

A8K3D9 CDC25A 40,91% 90,91% 0,000624 nein 0

Rab9 effector protein with kelch motifs (RABEPK) A8K403 RABEPK 18,18% 77,27% 0,000616 nein 0

rabphilin 3A-like (without C2 domains) (RPH3AL) A8K7D5 RPH3AL 40,91% 90,91% 0,00983 nein 0

EP400 N-terminal like (EP400NL) A8MSW4 EP400NL 18,18% 72,73% 0,000164 nein 0

apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3A (APOBEC3A)

A8MYU8 APOBEC3A 9,09% 72,73% 0,0000343 nein 0

hypothetical protein MGC10334 (MGC10334) NA MGC10334 22,73% 86,36% 0,00000832 nein 0

synaptosomal-associated protein, 23kDa (SNAP23), transcript variant 1

O00161 SNAP23 18,18% 86,36% 0,0000343 ja 0

interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3 (IFIT3)

O14879 IFIT3 18,18% 72,73% 0,000164 ja 3

hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate (HGS)

O14964 HGS 13,64% 72,73% 0,0000343 ja 8

eukaryotic translation initiation factor 4 gamma, 3 (EIF4G3) O43432 EIF4G3 13,64% 72,73% 0,000164 ja 0

actinin, alpha 4 (ACTN4) O43707 ACTN4 9,09% 77,27% 0,0000011 ja 308

BCL2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3-like (BNIP3L)

O60238 BNIP3L 36,36% 86,36% 0,00287 ja 0

phosphoribosyl pyrophosphate synthetase-associated protein 2 (PRPSAP2)

O60256 PRPSAP2 4,55% 63,64% 0,00000644 ja 13

KIAA0513 (KIAA0513) O60268 KIAA0513 4,55% 54,55% 0,000624 ja 3

Exocyst complex component 3 O60645 EXOC3 18,18% 68,18% 0,00519 ja 0

STARD3 N-terminal like (STARD3NL) O95772 STARD3NL 18,18% 90,91% 0,000624 ja 0

cyclin E2 (CCNE2) O96020 CCNE2 40,91% 95,46% 0,000218 ja 0

epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v-erb-b) oncogene homolog, avian) (EGFR); see catalog number for detailed information on wild-type or point mutant status

P00533 EGFR,T790M 22,73% 81,82% 0,000164 ja 17

Anhang A

138

Tabelle 7.6: Antigene die in mehr als 50 % der Tumorpatienten im Vergleich zu den nicht tumorerkrankten Kontrollen im ProteinArray-Experiment eine Immunantwort hervorriefen und einen p-Wert ≤0,01 aufwiesen (Fortsetzung).


Tumor Prävalenz


detektiert


Spektren]

epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v-erb-b) oncogene homolog, avian) (EGFR); see catalog number for detailed information on wild-type or point mutant status

P00533 EGFR(ErbB1), T790M,L858R

18,18% 72,73% 0,000616 ja 17

interleukin 1, beta (IL1B) P01584 IL1B 13,64% 72,73% 0,0000343 ja 0

submaxillary gland androgen regulated protein 3 homolog B (mouse) (SMR3B)

P02814 SMR3B 22,73% 72,73% 0,000616 nein 0

v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2, neuro/glioblastoma derived oncogene homolog (avian) (ERBB2), transcript variant 2

P04626 ERBB2 13,64% 81,82% 0,000164 ja 0

diazepam binding inhibitor (GABA receptor modulator, acyl-Coenzyme A binding protein) (DBI), transcript variant 1

P07108 DBI 13,64% 63,64% 0,00153 ja 23

Heat shock protein HSP 90-alpha P07900 HSP90AA1 22,73% 81,82% 0,00935 ja 556

estrogen-related receptor alpha (ESRRA) P11474 ESRRA 9,09% 63,64% 0,00153 ja 0

dystrophin (muscular dystrophy, Duchenne and Becker types) (DMD), transcript variant Dp71b

P11532 DMD 22,73% 77,27% 0,00018 ja 0

annexin A7 (ANXA7), transcript variant 1 P20073 ANXA7 18,18% 68,18% 0,00519 ja 49

small proline-rich protein 1B (cornifin) (SPRR1B) P22528 SPRR1B 45,46% 95,46% 0,000218 nein 0

tryptophanyl-tRNA synthetase (WARS), transcript variant 3 P23381 WARS 22,73% 77,27% 0,00182 ja 106

Tryptophanyl-tRNA synthetase, cytoplasmic P23381 WARS 22,73% 77,27% 0,00018 ja 106

moesin (MSN) P26038 MSN 27,27% 81,82% 0,00153 ja 443

catenin (cadherin-associated protein), alpha 1, 102kDa (CTNNA1)

P35221 CTNNA1 18,18% 68,18% 0,00182 ja 33

choline kinase alpha (CHKA), transcript variant 1 P35790 CHKA 22,73% 72,73% 0,000616 ja 0

Glutaminyl-tRNA synthetase P47897 QARS 31,82% 86,36% 0,000386 ja 21

Glutaminyl-tRNA synthetase P47897 QARS 31,82% 81,82% 0,000532 ja 21

SEC24 related gene family, member C (S, cerevisiae) (SEC24C), transcript variant 1

P53992 SEC24C 31,82% 81,82% 0,00153 ja 3

enhancer of rudimentary homolog (Drosophila) (ERH) P84090 ERH 45,46% 95,46% 0,0000727 ja 10

protein kinase C, theta (PRKCQ) Q04759 PRKCQ 31,82% 81,82% 0,00935 ja 0

splicing factor 3a, subunit 3, 60kDa (SF3A3) Q12874 SF3A3 18,18% 68,18% 0,000532 ja 17

TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) Q12933 TRAF2 36,36% 86,36% 0,0011 ja 0

mitogen-activated protein kinase 7 (MAPK7), transcript Q13164 MAPK7 36,36% 86,36% 0,000386 ja 0

Anhang A

139



Tumor Prävalenz


detektiert


Spektren]

variant 3

Treacher Collins-Franceschetti syndrome 1 (TCOF1), transcript variant 3

Q13428 TCOF1 36,36% 90,91% 0,00167 ja 0

sorting nexin 1 (SNX1), transcript variant 1 Q13596 SNX1 27,27% 86,36% 0,0000343 ja 31

four and a half LIM domains 1 (FHL1) Q13642 FHL1 9,09% 90,91% 0,00000000291 ja 49

Four and a half LIM domains protein 3 Q13643 FHL3 13,64% 86,36% 0,00000832 ja 0

DR1-associated protein 1 (negative cofactor 2 alpha) (DRAP1)

Q14919 DRAP1 13,64% 63,64% 0,00477 ja 0

centaurin, beta 2 (CENTB2) Q15057 CENTB2 27,27% 77,27% 0,00477 ja 0

splicing factor 3b, subunit 3, 130kDa (SF3B3) Q15393 SF3B3 36,36% 86,36% 0,00287 ja 18

SMAD family member 1 (SMAD1), transcript variant 1 Q15797 SMAD1 27,27% 77,27% 0,00182 ja 0

Cytoplasmic polyadenylation element-binding protein 4 Q17RY0 CPEB4 31,82% 86,36% 0,00691 ja 0

Zinc finger protein ZXDC Q2QGD7 ZXDC 13,64% 63,64% 0,000386 ja 0

Protein BEAN Q3B7T3 BEAN 9,09% 59,09% 0,00396 ja 0

chromosome 9 open reading frame 97 (C9orf97) Q5T7W7 C9orf97 31,82% 95,46% 0,00000644 ja 0

chromosome 14 open reading frame 131 (C14orf131) Q6GPI5 C14orf131 31,82% 81,82% 0,00153 nein 0

SH3 domain and tetratricopeptide repeats 1 (SH3TC1) Q6NVH2 SH3TC1 22,73% 81,82% 0,00153 nein 0

chromosome 10 open reading frame 118 (C10orf118) Q7Z3E2 C10orf118 36,36% 90,91% 0,0000685 ja 0

chromosome 11 open reading frame 30 (C11orf30) Q7Z589 C11orf30 22,73% 81,82% 0,0000438 ja 0

paxillin (PXN) Q7Z7K5 hCG_1778014 22,73% 81,82% 0,000164 nein 0

RPA interacting protein (RPAIN) Q86UA6 RPAIN 9,09% 59,09% 0,000216 ja 0

calcium/calmodulin-dependent protein kinase ID (CAMK1D), transcript variant 2

Q8IU85 CAMK1D 27,27% 77,27% 0,00477 ja 0

RAS guanyl releasing protein 3 (calcium and DAG-regulated) (RASGRP3)

Q8IV61 RASGRP3 13,64% 68,18% 0,000122 ja 0

family with sequence similarity 80, member A (FAM80A) Q8IXN7 FAM80A 36,36% 90,91% 0,000216 ja 0

cDNA clone MGC:25008 IMAGE:4453355, complete cds Q8N0T2 N/A 40,91% 90,91% 0,000216 nein 0

cDNA clone MGC:35221 IMAGE:5172092, complete cds Q8N2W8 N/A 4,55% 59,09% 0,0000225 nein 0

metallothionein 1M (MT1M) Q8N339 MT1M 45,46% 95,46% 0,00164 ja 0

sterile alpha motif domain containing 3 (SAMD3), transcript variant 2

Q8N6K7 SAMD3 27,27% 81,82% 0,00153 ja 0

EF-hand calcium binding protein 1 (EFCBP1) Q8N987 EFCBP1 9,09% 59,09% 0,000216 nein 0

Anhang A

140



Tumor Prävalenz


detektiert


Spektren]

TNFAIP3-interacting protein 2 Q8NFZ5 TNIP2 36,36% 86,36% 0,000386 ja 0

zinc finger and SCAN domain containing 18 (ZSCAN18) Q8TBC5 ZSCAN18 36,36% 86,36% 0,0011 ja 0

RAB3A interacting protein (rabin3)-like 1 (RAB3IL1) Q8TBN0 RAB3IL1 9,09% 77,27% 0,0000011 ja 0

Guanine nucleotide exchange factor for Rab3A Q8TBN0 RAB3IL1 22,73% 77,27% 0,000616 ja 0

actin filament associated protein 1-like 1 (AFAP1L1) Q8TED9 AFAP1L1 36,36% 90,91% 0,000624 ja 0

lectin, mannose-binding, 1 like (LMAN1L) Q8WVH0 CPLX3 9,09% 63,64% 0,00153 ja 0

family with sequence similarity 112, member B (FAM112B) Q8WW33 FAM (GTSF1) 22,73% 90,91% 0,0000011 nein 0

naked cuticle homolog 2 (Drosophila) (NKD2) Q969F2 NKD2 18,18% 81,82% 0,000164 ja 0

ring finger protein 34 (RNF34), transcript variant 1 Q969K3 RNF34 45,46% 95,46% 0,000614 ja 0

Optineurin Q96CV9 OPTN 22,73% 90,91% 0,00000501 ja 1

chromosome 10 open reading frame 35 (C10orf35) Q96D05 C10orf35 13,64% 68,18% 0,00182 ja 0

ring finger and SPRY domain containing 1 (RSPRY1) Q96DX4 RSPRY1 9,09% 59,09% 0,0011 ja 0

Hypermethylated in cancer 2 protein Q96JB3 HIC2 40,91% 95,46% 0,000218 ja 0

zinc finger protein 333 (ZNF333) Q96JL9 ZNF333 27,27% 86,36% 0,0011 ja 0

ubiquitin specific peptidase 47 (USP47) Q96K76 USP47 31,82% 81,82% 0,00153 ja 0

ring finger and CHY zinc finger domain containing 1 (RCHY1) Q96PM5 RCHY1 27,27% 95,46% 0,00164 ja 0

RING finger and CHY zinc finger domain-containing protein 1 Q96PM5 RCHY1 27,27% 81,82% 0,00396 ja 0

quaking homolog, KH domain RNA binding (mouse) (QKI), transcript variant 4

Q96PU8 QKI 36,36% 86,36% 0,00287 ja 36

Sorting nexin-18 Q96RF0 MGC39821 22,73% 90,91% 0,0000197 ja 0

SH3 and cysteine rich domain (STAC) Q99469 STAC 18,18% 81,82% 0,0000438 ja 0

four and a half LIM domains 3 (FHL3) Q9BVA2 FHL3 22,73% 72,73% 0,000616 nein 0

RanBP-type and C3HC4-type zinc finger-containing protein 1 Q9BYM8 C20orf18 40,91% 95,46% 0,000218 ja 0

serine/threonine kinase 33 (STK33) Q9BYT3 STK33 31,82% 86,36% 0,000122 ja 0

NEFA-interacting nuclear protein NIP30 (NIP30) Q9GZU8 NIP30 27,27% 81,82% 0,000532 ja 0

family with sequence similarity 112, member A (FAM112A), transcript variant 1

Q9H1H1 FAM112A 31,82% 81,82% 0,000532 ja 0

XTP3-transactivated protein A (XTP3TPA) Q9H773 XTP3TPA 27,27% 77,27% 0,00182 ja 0

chromosome 12 open reading frame 41 (C12orf41) Q9H9L4 C12orf41 27,27% 95,46% 0,00000644 ja 0

MAP kinase-interacting serine/threonine-protein kinase 2 Q9HBH9 MKNK2 13,64% 63,64% 0,00153 ja 0

resistin (RETN) Q9HD89 RETN 4,55% 54,55% 0,0000727 nein 0

diablo homolog (Drosophila) (DIABLO), nuclear gene Q9NR28 DIABLO 18,18% 81,82% 0,000532 ja 13

Anhang A

141



Tumor Prävalenz


detektiert


Spektren]

encoding mitochondrial protein, transcript variant 2

chromosome 14 open reading frame 131 (C14orf131) Q9NT83 C14orf131 22,73% 72,73% 0,000616 nein 0

Pleckstrin homology domain-containing family J member 1 Q9NW61 PLEKHJ1 13,64% 63,64% 0,000386 ja 0

chromosome 10 open reading frame 26 (C10orf26), transcript variant 2

Q9NX94 C10orf26 18,18% 72,73% 0,000616 ja 0

LIM and cysteine-rich domains 1 (LMCD1) Q9NZU5 LMCD1 9,09% 81,82% 0,000000203 ja 0

Paladin Q9ULE6 KIAA1274 18,18% 86,36% 0,00000832 ja 0

glucosamine (UDP-N-acetyl)-2-epimerase/N-acetylmannosamine kinase (GNE)

Q9Y223 GNE 36,36% 90,91% 0,000216 ja 0

polymerase (RNA) III (DNA directed) polypeptide K, 12,3 kDa (POLR3K)

Q9Y2Y1 POLR3K 13,64% 63,64% 0,000386 ja 0

Anhang B

142

B. Publikationen

Waldera-Lupa, D. M., Stefanski, A., Meyer, H. E., and Stühler, K. (2013) The fate of b-ions in

the two worlds of collision-induced dissociation. Biochimica et biophysica acta 1834, 2843-

2848.

Neise, D., Sohn, D., Stefanski, A., Goto, H., Inagaki, M., Wesselborg, S., Budach, W., Stühler,

K., and Janicke, R. U. (2013) The p90 ribosomal S6 kinase (RSK) inhibitor BI-D1870 prevents

gamma irradiation-induced apoptosis and mediates senescence via RSK- and p53-

independent accumulation of p21WAF1/CIP1. Cell death & disease 4, e859.

Erkelenz, S., Poschmann, G., Theiss, S., Stefanski, A., Hillebrand, F., Otte, M., Stühler, K., and

Schaal, H. (2013) Tra2-mediated recognition of HIV-1 5' splice site D3 as a key factor in the

processing of vpr mRNA. Journal of virology 87, 2721-2734.

Poulsen, C., Akhter, Y., Jeon, A. H., Schmitt-Ulms, G., Meyer, H. E., Stefanski, A., Stühler, K.,

Wilmanns, M., and Song, Y. H. (2010) Proteome-wide identification of mycobacterial

pupylation targets. Molecular systems biology 6, 386.

Grzendowski, M., Riemenschneider, M. J., Hawranke, E., Stefanski, A., Meyer, H. E.,

Reifenberger, G., and Stühler, K. (2009) Simultaneous extraction of nucleic acids and proteins

from tissue specimens by ultracentrifugation: A protocol using the high-salt protein fraction

for quantitative proteome analysis. Proteomics 9, 4985-4990.

Ahmad, M., Frei, K., Willscher, E., Stefanski, A., Kaulich, K., Roth, P., Stühler, K., Reifenberger,

G., Binder, H., and Weller, M., (2014) How Stemlike Are Sphere Cultures From Long-term

Cancer Cell Lines? Lessons From Mouse Glioma Models. Neuropathol Exp Neurol 73 (11),

1062-1077

Zur Veröffentlichung angenommen:

Poschmann, G., Grzendowski, M., Stefanski, A., Hawranke, E., Meyer, H.E., and Stühler, K.

(2014) Redox proteomics reveal stress responsive proteins linking peroxiredoxin-1 status in

glioma to chemosensitivity and oxidative stress. Biochimica et biophysica acta

Sonstiges

Gewinner des Nachwuchspreises „Proteinanalytik 2011“ der Arbeitstagung 2011

„Mikromethoden in der Proteinbiochemie“

Reisestipendium der Deutschen Gesellschaft für Proteomforschung für die „Proteomic

Summer School 2011“

Anhang C

143

C. Lebenslauf

Persönliche Daten

Name: Anja Stefanski

Anschrift: Düngelstr.25

44623 Herne

Geburtsdatum: 03.01.1982

Geburtsort : St. Avold (Frankreich)

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: verheiratet

Schulische Ausbildung

08/1988 – 12/1990 Volksschule Nürnberg, Holzgartenstraße in Nürnberg

01/1991 – 07/1992 Grundschule Am Busch in Castrop-Rauxel

08/1992 – 07/1997 Ernst-Barlach-Gymnasium in Castrop-Rauxel

08/1997 – 06/2002 Pestalozzi-Gymnasium in Herne

Abschluss: allgemeine Hochschulreife

Studium

09/2002 – 04/2008 Ruhr-Universität Bochum

Studienfach: Biochemie

Abschluss: Master of Science

08/2008 –12/ 2014 Promotion zum Thema „Proteomanalytische Charakterisierung des

Glioblastoms im Hinblick auf das Langzeitüberleben“

Beruflicher Werdegang

08/2007 – 04/2008 Studentische Hilfskraft am Medizinischen Proteom-Center, AG

Neuroproteomics an der Ruhr-Universität Bochum

07/2008 – 12/2011 Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Medizinischen Proteom-Center,

AG Neuroproteomics an der Ruhr-Universität Bochum

seit 01/2012 Leiterin der Arbeitsgruppe „Quantitative Proteomics“ am Molecular

Proteomics Laboratory an der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

Anhang D

144

D. Danksagung

Mein erster Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Helmut E. Meyer für die Überlassung des

interessanten Themas, die hervorragende Infrastruktur während meiner Zeit am Medizinischen

Proteom-Center sowie den hilfreichen Diskussionen im Rahmen der Laborseminare.

Besonderer Dank gilt darüber hinaus Prof. Dr. Kai Stühler, der mich stets motiviert und inspiriert hat.

Ich bin unendlich dankbar für Deine wissenschaftlichen Ratschläge, die vielen lehrreichen

Diskussionen und Deine Unterstützung und Geduld während der gesamten Zeit meiner Arbeit.

Prof. Dr. Christian Herrmann möchte ich für die Übernahme des Zweitgutachtens herzlich danken.

Besonderer Dank geht auch an Eva Bruns für ihre großartige Unterstützung im Labor und (Klaus-)

Gereon Poschmann für die vielen wertvollen Ratschläge und Hilfestellungen, nicht nur bei

statistischen Problemen, aber natürlich auch an meine anderen Kollegen des Molecular Proteomics

Laboratory, Daniel Waldera, Mareike Brocksieper, Katrin Nau, Nina Quednow, Marzena Malek sowie

meinen ehemaligen Kollegen vom MPC. Ich bin mir bewusst, wie entscheidend das tolle

Arbeitsumfeld und die gute Teamarbeit zu dieser Arbeit beigetragen haben. Dafür bin ich Euch

wirklich sehr dankbar.

Ein Dankeschön gilt auch allen Mitgliedern des Deutschen Gliomnetzes für die erfolgreiche

Kooperation und die Bereitstellung des umfangreichen Probenmaterials sowie der Deutschen

Krebshilfe für die Förderung dieses Projektes.

Danken möchte ich auch all den Patienten, die durch Ihre Einwilligung zu einer Beteiligung an dieser

Studie diese Arbeit überhaupt erst möglich gemacht haben. Ich wünsche Ihnen und Ihren Familien

alles Gute!

Lieben Dank an meine Eltern und meine Geschwister. Euer Glaube an mich ist mein Halt und die

Quelle meiner Kraft. Eine Familie wie Euch zu haben ist wunderbar!

Bedanken möchte ich mich auch bei all meinen Freunden, aber besonders bei Sarah, Silvia, Ela,

Annika, Anna, Andy, Thor, Kibar, Daniel und Felix für unendliche viele schöne Stunden, viel Spaß und

die Gewissheit, dass richtig guten Freunden ein Doktortitel total egal ist.

Ein letztes, besonders herzliches und liebes Dankeschön gilt Marcel Stefanski für seine

bedingungslose Unterstützung und Zuneigung. Ich liebe Dich.

Anhang E

145

E. Erklärung

Hiermit bestätige ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel: „Proteomanalytische

Charakterisierung des Glioblastoms im Hinblick auf das Langzeitüberleben“ ohne unerlaubte

Hilfe ausgeführt und an keiner anderen Universität zur Erlangung eines akademischen Grades

eingereicht habe. Die Stellen der Arbeit, die anderen Werken dem Wortlaut oder dem Sinne

nach entnommen sind, wurden in jedem Fall unter Angabe der Quellen kenntlich gemacht.

Dies gilt auch für die beigegebenen Zeichnungen, bildlichen Darstellungen, Skizzen und

dergleichen.

Bochum, den 05.12.2014

proteomanalytische charakterisierung des glioblastoms im ... · proteomanalytische...

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