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Proteinchemie an Oberflächen - von der spezifischen Interaktion zur Proteinresistenz Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Fakultät für Chemie Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Dipl.-Biochem. Rolf Chelmowski Lehrstuhl für Physikalische Chemie I Bochum 2008

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Proteinchemie an Oberflächen -

von der spezifischen Interaktion

zur Proteinresistenz

Dissertation zur Erlangung des Grades eines

Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

der Fakultät für Chemie Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Dipl.-Biochem. Rolf Chelmowski

Lehrstuhl für Physikalische Chemie I Bochum 2008

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Der Zweifel ist der Beginn der Wissenschaft.

Wer nichts anzweifelt, prüft nichts.

Wer nichts prüft, entdeckt nichts.

Wer nichts entdeckt, ist blind und bleibt blind.

Teilhard de Chardin (1881-1955),

frz. Theologe, Paläontologe u. Philosoph

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I

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 7

1.1 Einführung in die Protein-Oberflächen Wechselwirkung 7 1.2 Zielsetzung 8 2 Theoretische Grundlagen 10

2.1 Mechanismen der Proteinadsorption auf Festkörperoberflächen 10 2.2 Triebkräfte der Adsorption von Proteinen an Festkörperoberflächen 11 2.2.1 „Schwache“ Wechselwirkungen 11 2.2.2 Ionische Wechselwirkungen 11 2.2.3 Hydrophobe Wechselwirkungen 11 2.2.4 Konformationsentropie 12 2.2.5 Gesamtbild des Mechanismus der unspezifischen Proteinadsorption an 13 Oberflächen 2.2.6 Einfluss des umgebenden Mediums auf die Proteinadsorption 13 2.3 „Klassische“ proteinresistente Oberflächen 14 2.3.1 Beobachtungen zur „klassischen“ Proteinresistenz und OEG-SAMs 15 2.3.2 Erklärungsansätze für das Phänomen der „klassischen“ Proteinresistenz 15 2.3.3 Alternative proteinresistente Oberflächen 16 2.4 Herstellung ultradünner organischer Filme mittels Selbstorganisation 17 2.4.1 Herstellung von selbstassemblierenden Monolagen aus Peptidthiolen 18 2.5 Streptavidin/Biotin-System 19 2.6 Strepatvidin/Meerrettichperoxidase (HRP) System 21 2.7 Darstellung anderer verwendeter Proteine 22 2.7.1 Rinder-Serum-Albumin (BSA) 22 2.7.2 Fibronectin 23 2.8 Substrate für die Oberflächenexperimente 23

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II

2.9 Messmethoden zur Oberflächenanalytik 24 2.9.1 Mikrokontaktstempeln 24 2.9.2 Oberflächenplasmonenresonanz - Spektroskopie 27 2.9.3 Rastersondenmikroskopie 30 2.9.3.1 Rastertunnelmikroskopie 30 2.9.3.2 Rasterkraftmikroskopie 31 2.9.3.3 Rasterkraftmikroskopie im Kontaktmodus 33 2.9.3.4 Rasterkraftmikroskopie im Tapping-Modus 34 2.9.4 Infrarot-Spektroskopie 37 2.9.5 Röntgen-Photoelektronenspektroskopie 38 2.9.6 Röntgenabsorptionsspektroskopie 39 3 Die biologische Aktivität oberflächengebundener Mehrschichtensysteme: das Biotin- Streptavidin-Peroxidase System 40 3.1 Präparation der Substrate 42 3.1.1 Substrate für die SPR-Messungen 42 3.1.2 Substrate für die AFM_Messungen 43 3.1.2.1 Mikrokontaktstempeln (µCP) 43 3.1.3 Substrate für die Aktivitätstests 44 3.2 Oberflächenplasmonenresonanz-Messungen 45 3.2.1 Variierung der Biotinthiol-Konzentration 45 3.2.2 Kontrolle der Streptavidinbelegung 46 3.2.2.1 Echt-Zeit Adsoptionskinetik von Streptavidin 47 3.2.2.2 Diffusionslimitierte Streptavidinbeladung 49 3.2.3 Unspezifische Adsorption der Proteine auf einem OH-terminierten SAM 51 3.2.4 Das Streptavidin/Peroxidase-System 51 3.2.4.1 Adsorption der Peroxidase 51 3.2.4.2 Unspezifische Adsorption der Peroxidase 52 3.2.4.3 Korrelation zwischen Streptavidin und Peroxidase 53 3.2.4.4 Diskussion 54 3.2 Rasterkraftmikroskopie 55 3.3 Aktivitätstests 57

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III

4 Click-Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung 61 4.1 Addition von Azodoferrocen an 11-thioacetyl-undekansäurepropargylamid in Lösung 63 4.1.1 Azidoferrocen 63 4.1.2 11-thioacetyl-undekansäure-propargylamid 64 4.1.3 Ferrocenthiol 66 4.1.3.1 IRRAS-Messungen 66 4.1.3.2 XPS-Messungen 68 4.1.3.3 NEXAFS-Messungen 69 4.1.4 Zusammenfassung: Click-Chemie in Lösung 71 4.2 Addition von Azidoferocen 11-thioacetyl-undekansäure-propargylamid an der Oberfläche 71 4.2.1 Click-Reaktion am vollständigen Alkinthiol-SAM 71 4.2.1.1 IRRAS-Messungen 71 4.2.1.2 XPS-Messungen 72 4.2.2 Click-Reaktion am gemischt terminierten Alkinthiol-SAM 73 4.2.2.1 50% Alkinthiol-SAM 73 4.2.2.2 10% Alkinthiol-SAM 75 4.2.3 Zusammenfassung 77 4.3 Reaktion von Ethinyl-ferrocen an Azidoundekanthiol an der Oberfläche 77 4.3.1 Ethinyl-Ferrocen 77 4.3.2 Azido-terminiertes Undekandisulfid 77 4.3.3 N-((1H-1,2,3-triazol-4-yl) ferrocenyl)-11-mercapto-undekanthiol 78 4.3.4 Zusammenfassung 80 4.4 Addition von Azido-Essigsäure an 11-thioacetylundekansäureprpargylamid an der Oberfläche 80 4.4.1 Azido-Essigsäure 80 4.4.2 11-thioacetyl-undekansäure-propargylamid 81 4.4.3 N-((1H-1,2,3-triazol-4-yl) acetyl)-11-mercapto-undekanamid 81 4.4.4 Zusammenfassung 82

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IV

5 Synthese und Charakterisierung proteinresistenter Peptidthiole auf 83 der Basis von Peptiden 5.1 Synthese und Charakterisierung der Peptide 85 5.2 Synthese und Charakterisierung der Peptidthiole 85 5.2.1 Peptid-1-Thiol 86 5.2.2 Peptid-2-Thiol 89 5.3 Herstellung der Peptid-SAMs 91 5.4 Oberflächenplasmonenresonanz 93 5.4.1 Adsorption von Streptavidin 93 5.4.2 Adsorption von BSA 96 5.4.3 Adsorption von Fibronectin 97 6 Zusammenfassung und Ausblick 99 6.1 Die biologische Aktivität oberflächengebundener Mehrschichtensysteme: das Biotin- Streptavidin-Peroxidase System 99 6.2 Cklick-Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung 100 6.3 Proteinresistente Peptidthiole 101 7 Literaturverzeichnis 102 Anhang A: Abkürzungsverzeichnis 115Anhang B: Abbildungsverzeichnis 117Anhang C: Tabellenverzeichnis 121Anhang D: Liste der Publikationen 122Anhang E: Lebenslauf 123Anhang F: Danksagung 124

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Kapitel 1 Einleitung

- 7 -

1 Einleitung

1.1 Einführung in die Protein-Oberflächen Wechselwirkung

Die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Oberflächen spielen sowohl in der Natur als

auch bei vielen Anwendungen - insbesondere im Bereich der Sensorik - eine wichtige Rolle 1-

6. Künstliche Oberflächen (z.B. SiO2, SAMs, Polymere) weisen in ihrer Wechselwirkung mit

Proteinen sehr unterschiedliche Eigenschaften auf 5, 6. In der Regel haften Proteine an

Oberflächen, ein proteophobes Verhalten wird nur in wenigen Fällen beobachtet. Die

verschiedenen und vielfältigen Implikationen von Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen

werden im Folgenden an zwei anwendungsorientierten Beispielen verdeutlicht: Dem

Einwachsen medizinischer Implantate und der Herstellung von Biosensoren.

In der Medizin werden neben Metallen (z.B. Silber, Gold, Titan) auch zahlreiche hydrophobe

Kunststoffe zur Herstellung von Implantaten aller Art genutzt 7. Im Allgemeinen ist der

Einheilungserfolg, die Wiederherstellung der verlorenen Organfunktion und die dauerhafte

Gewebeverträglichkeit der „Fremdkörper“ nicht gegeben, die wesentlichen Probleme

bestehen in der Ausbildung von Biofilmen auf den Implantatoberflächen 4, 8-11. Wegen der

großen Bedeutung für den Heilungserfolg wurde in den vergangenen Jahren und Jahrzehnten

zum Teil sehr aufwendige empirische Untersuchungen durchgeführt, um die Biofilmbildung

auf den Implantatoberflächen zu verhindern und die entsprechenden Reaktionen des

Immunsystem zu unterdrücken. In den USA werden jährlich ca. 20 Millionen chirurgische

Eingriffe durchgeführt, wobei vorübergehend und/oder dauerhaft ein Implantat in den

Patientenkörper eingesetzt wird 11. In 10% aller Fälle kommt es zur Biofilmbildung und

nachfolgender Entzündung in der Implantatumgebung. Bis heute gibt es keine Therapieform,

die einen einmal im Organismus gebildeten Biofilm vollständig zu zerstören vermag. Oftmals

sind weitere Operationen nötig; im Extremfall muss das Implantat chirurgisch entfernt

werden. Die Kosten für die Weiterbehandlung von durch Implantate verursachten Infektionen

belaufen sich in den USA auf jährlich 11 Milliarden US Dollar. Es wird davon ausgegangen,

dass diese Summe in Zukunft mit der Zahl der operativen Eingriffe noch weiter ansteigt.

Der größte Anteil der für Implantate verwendeten Kunststoffe ist hydrophob und ermöglicht

damit eine relativ starke, unspezifische Adsorption von Proteinen. Diese unselektive

Proteinadsorption bildet die molekulare Basis für eine spätere Verankerung des Biofilms. Zur

Zeit werden verschiedene Strategien zur Vermeidung der Proteinadsorption erprobt: Die

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Kapitel 1 Einleitung

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Beschichtung von Implantatoberflächen mit anti-bakteriellen Substanzen brachte nicht den

gewünschten Erfolg und birgt die Gefahr der körperinternen Resistenzbildung 12, 13. Eine

weitere Strategie zielt darauf ab, das Gewebe zum Zeitpunkt der Operation stärker mit dem

Implantat zu verbinden, damit ein Biofilm erst gar nicht entstehen kann 10.

Bei Anwendungen im Bereich der Biosensorik werden maßgeschneiderte Sensoroberflächen

hergestellt, die den gezielten Nachweis von spezifischen Biomolekülen erlauben 14. Bei der

Entwicklung derartiger Sensoren gilt es eine schnelle, kostengünstige, parallel durchführbare

und sichere Detektion von Biomolekülen zu ermöglichen. Von den zu detektierenden

Biomolekülen bilden die Proteine aus medizinischer und pharmakologischer Sicht die

interessanteste Gruppe. Der spezifische Nachweis von Proteinen bietet die Grundlage für

Allergie-Tests, HIV-Tests, Immunitäts-Tests, Krebs-Früherkennung, Medikamenten-

Wirksamkeits-Test usw. Bei vielen dieser Sensoren geht es nicht nur darum, ein einzelnes

Protein nachzuweisen, sondern in vielen Fällen ist der parallele Nachweise vieler

unterschiedlicher Proteine erforderlich. Aus diesem Grund stoßen insbesondere sogenannte

Proteinchips, die Kombination mehrerer, miniaturisierter Sensoren für verschiedene Proteine

in einem Bauteil, momentan auf großes Interesse.

Für den Aufbau hochspezifischer Biosensoren ist es nicht nur erforderlich, das erwünschte

Protein mit hoher Spezifität an die Oberfläche anzukoppeln und dann zu detektieren, sondern

auch die unspezifische Ankopplung anderer Proteine möglichst weitestgehend zu

unterdrücken. Die letzt genannte Anforderung ist nicht trivial, da - wie oben aufgeführt -

Proteine grundsätzlich sehr stark an Oberflächen haften. Die Entwicklung proteinresistenter

Oberflächen ist deswegen für die Biosensorik von großer Bedeutung.

Die Charakterisierung unspezifisch angekoppelter Proteine (Biomoleküle) und das

Verständnis der dahinter befindlichen Vorgänge sind entsprechend genauso wichtig wie die

Entwicklung proteinresistenter Oberflächen. Für letzteres spielt insbesondere die Entwicklung

von Molekülen eine Rolle, die eine Langzeitanwendung ermöglichen (Stabilität des

Moleküls).

1.2 Zielsetzung

Wie in Kapitel 1.1 beschrieben, sind die Wechselwirkungen von Proteinen mit Oberflächen

von essentieller Bedeutung für viele Teilgebiete der Naturwissenschaften und der Medizin.

Ein tieferes Verständnis dieser Wechselwirkung ist entsprechend sehr interessant.

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Kapitel 1 Einleitung

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Ein Teil dieser Arbeit widmet sich genau dieser Fragestellung und beschäftigt sich mit der

Adsorption von Proteinen auf unspezifischen Oberflächen und der ebenso wichtigen

unspezifischen Adsorption von Proteinen auf eigentlich spezifischen Oberflächen (wie z.B.

speziellen Biosensorchips).

Hierbei wird ein System aus Biotin und dem biotinbindenden Protein Streptavidin verwendet.

Zusätzlich wird ein weiteres Protein verwendet (Meerrettichperoxidase), welches über einen

Biotinanker an das Streptavidin binden kann. Dieses 3-teilige Baukasten-System steht

stellvertretend für andere Biosensoren, die zumeist nah genau dem gleichen Prinzip arbeiten

(„Lock-and-Key-System“).

Die spezifischen/unspezifischen Oberflächen, auf denen die Proteine (Streptavidin/

Meerrettichperoxidase) adsorbiert werden, werden über selbstorganisierende Thiol-

Monolagen (SAMs) generiert.

Im zweiten Teilbereich dieser Arbeit wird die Proteinresistenz in Bezug auf

Langzeitanwendungen untersucht. Hierzu wird die Synthese und Charakterisierung

alternativer proteinresistenter Thiole betrachtet, da die klassischen proteinresistenten Thiole

(Oligoethylen-Glykole, OEG-Thiole) genau an dieser Stelle versagen. Zur Generierung von

alternativen proteinresistenten Thiolen sollen die klassischen Ansätze analysiert werden. Die

Ergebnisse dieser Analyse werden dann auf eine alternative Molekülklasse übertragen.

Konkret wurde in dieser Arbeit versucht, die Eigenschaften der klassischen proteinresistenten

Thiole auf Peptide zu übertragen. Peptide bieten sich gerade im Bereich Medizin an, da sie

körperverwandte Bausteine sind. Zusätzlich sind die Synthesen längerer Peptidsequenzen

automatisiert und standardisiert verfügbar. Gesamtziel der Arbeit ist es also, Peptidsequenzen

zu ermitteln, die es ermöglichen, aus den entsprechenden Peptidthiolen selbstassemblierende

Monoschichten mit proteophoben Eigenschaften auf Goldsubstraten aufzubauen.

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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2 Theoretische Grundlagen

2.1 Mechanismen der Proteinadsorption auf Festkörperoberflächen

Wenn eine wässrige Proteinlösung mit einer Festkörperoberfläche in Kontakt kommt, wird für

fast alle Materialien eine spontane Adsorption der Proteine beobachtet 5. Nach dem

derzeitigen Stand der Forschung resultiert diese Oberflächenaktivität aus einer Reihe von

direkten (elektrostatische Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen) und indirekten

(mit der Verdrängung von Wasser in Zusammenhang stehende, entropische Effekte)

Ursachen, die nicht an einem bestimmten einzelnen Strukturmerkmal der Proteine

festgemacht werden können.

In vielen Fällen wird das Protein durch die Adsorption auf der Festkörperoberfläche

denaturiert, d.h. so in seiner Form verändert, dass es seine eigentliche Funktion verliert.

Generell besitzen Proteine einen sehr komplexen Aufbau, der sich aus der betreffenden

Aminosäurensequenz und der daraus resultierenden Sekundär- und Tertiärstruktur ergibt. Die

20 verschiedenen Aminosäuren können in 3 unterschiedliche Gruppen unterteilt werden:

- Aminosäuren mit unpolaren, hydrophoben Seitenketten

- Aminosäuren mit positiv oder negativ geladenen Seitenketten

- Aminosäuren mit polaren, hydrophilen Seitenketten.

Der Proteinkern ist oft hydrophob und stabilisiert die Proteintertiärstruktur. Die äußere

Oberfläche des Proteins besteht vornehmlich aus polaren und geladenen Aminosäuren. Dieser

amphiphile Charakter der Proteine ist zum Teil für ihre hohe Oberflächenaktivität

verantwortlich. Das Ausmaß der Proteinadsorption an einer festen Grenzschicht hängt aber

nicht nur von der Struktur des Proteins ab, sondern wird wesentlich von den physikalisch-

chemischen Eigenschaften der Festkörperoberfläche bestimmt. Generell gilt, dass die

Oberflächenaffinität der Proteine für hydrophobe Oberflächen größer ist als für hydrophile.

Allerdings gibt es auch hier Ausnahmen, zum Beispiel beobachtet man auch auf einigen

hydrophilen Oberflächen die Adsorption von Proteinen (z.B. Glas (Si-OH) 5).

Auf der Basis der in den zum Teil sehr umfangreichen Untersuchungen der letzten Jahre

erzielten Ergebnisse sind einige allgemeine Regeln aufgestellt worden, die das Phänomen der

Proteinadsorption recht gut beschreiben. Die wichtigsten dieser - weitgehend empirischen -

Befunde sind im nächsten Abschnitt zusammengefasst.

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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2.2 Triebkräfte der Adsorption von Proteinen an Festkörperoberflächen

Im folgenden Abschnitt werden die unterschiedlichen, mit der Adsorption von Proteinen auf

Festkörperoberflächen in Zusammenhang stehenden Wechselwirkungen vorgestellt.

2.2.1 „Schwache“ Wechselwirkungen

Die „schwachen“ Wechselwirkungen (WW), die in ihrer Summe jedoch beachtlich sein

können, umfassen 15:

- WW zwischen zwei permanenten Dipolen

- WW zwischen einem permanenten und einem induzierten Dipol

- WW zwischen zwei induzierten Dipolen (London- oder Dispersions-Kräfte bzw. van-

der-Waals-Kräfte)

-

Die Wechselwirkungen hängen von der Geometrie der wechselwirkenden Strukturen ab und

spielen vor allem bei kleinen Abständen zur Oberfläche eine wichtige Rolle.

2.2.2 Ionische Wechselwirkungen

Die elektrostatischen WW hängen nicht nur von der Ladungsdichte, d.h. der Anzahl an

geladenen Aminosäuren im Protein ab, sondern auch von der elektrolytischen Umgebung des

Proteins (Puffer) bzw. von der Ladungsdichte an der Interaktionsoberfläche. Gelöste mono-

(Na+, K+) oder divalente (Ca2+, Mg2+) Metallionen können die geladenen Aminosäuren

gegenüber Wechselwirkungen mit der Oberfläche abschirmen. Im Vergleich zu den

„schwachen“ Wechselwirkungen sind auch die elektrostatischen WW geometrie- und

richtungsabhängig, allerdings besitzen sie eine größere Reichweite und können betragsmäßig

größer als die van-der-Waals-Kräfte sein.

2.2.3 Hydrophobe Wechselwirkungen

Die hydrophobe Wechselwirkung bildet die wichtigste Triebkraft für die Adsorption von

Proteinen an Grenzflächen 5, 6. Unpolare Gruppen besitzen in wässrigen Puffern allgemein nur

eine sehr schwache Löslichkeit. Dies wird durch eine starke Entropieabnahme erklärt, die

durch die Ausbildung hochgeordneter „Wasserkäfige“ (engl. „low-entropy water“) entlang

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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der hydrophoben Kontaktflächen zustande kommt. Hydrophobe Wechselwirkungen können

durch die Tatsache erklärt werden, dass WW zwischen unpolaren Gruppen und WW zwischen

polaren Gruppen (z.B. Wasser-Wasser) günstiger sind als WW zwischen unpolaren und

polaren Gruppen. Hydrophobe Aminosäureseitenketten kommen auf der Proteinoberfläche in

der Regel nur vereinzelt vor, im Proteinkern dagegen sind hydrophobe Seitenketten häufiger

anzutreffen. Der hydrophobe Proteinkern „fällt auseinander“, wenn die hydrophoben

Aminosäureseitenketten mit der Oberfläche in Wechselwirkung treten. Bei diesem Vorgang

geht die Tertiärstruktur des Proteins meist irreversibel verloren. Der Betrag der hydrophoben

WW zur Gesamtbindungsenergie von Proteinen an Oberflächen dominiert deutlich über

elektrostatische und van-der-Waals WW. Die hydrophobe WW hängt stark von der Polarität

der Oberfläche ab. Am stärksten ist die WW mit hydrophoben Oberflächen, da die Oberfläche

durch die Proteinadsorption vor dem direkten, entropisch ungünstigen Kontakt mit Wasser

bewahrt wird. Im Vergleich zu den polaren WW besitzen die hydrophoben WW nur eine

extrem niedrige Reichweite und sind außerdem nicht orientierungsabhängig.

2.2.4 Konformationsentropie

Wie bereits zuvor erwähnt, handelt es sich bei Proteinen um komplexe Makromoleküle, deren

Tertiärstruktur durch intramolekulare Wechselwirkungen im Proteinkern (oft hydrophobe

WW) stabilisiert wird. Die Faltungsstabilität eines Proteins, d.h., der Unterschied zwischen

der Enthalpie eines gelösten, ungefalteten und eines gelösten, gefalteten Proteins liegt

zwischen 20 und 60 kJ/mol und ist damit nicht besonders groß. Daraus folgt, dass es sich bei

den Proteinen nicht etwa um starre dreidimensionale Objekte mit fester Faltung handelt,

sondern vielmehr um dynamische, flexible und intrinsisch instabile Objekte, die bereits auf

leichte Veränderungen in ihrer Umgebung reagieren. Solch eine „leichte“ Veränderung in der

Umgebung kann z.B. das Anbieten einer organischen Oberfläche darstellen. Als Folge der

Adsorption wird es in der Regel zu Konformationsänderungen in der Proteinstruktur

(Denaturierung) kommen, was durch viele experimentelle Studien belegt ist 5, 16. Diese

adsorptionsinduzierten Konformationsveränderungen werden in der Regel zu einer Zunahme

der Bindungsenergie des Proteins an die Oberfläche führen. Neben rein energetischen

Effekten kommen dabei auch wieder entropische Effekte (Konformationsentropie des

Proteins) zum Tragen. In einigen Fällen wird eine deutliche Zunahme der Entropie als Folge

der Proteinadsorption vermutet 5, 16. Die Gesamtzunahme der Enthalpie als Folge der

Adsorption kann so groß sein, dass die Adsorption an einer Festkörperoberfläche unter

physiologischen Bedingen praktisch irreversibel ist 17, 18.

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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2.2.5 Gesamtbild des Mechanismus der unspezifischen Proteinadsorption an

Oberflächen

Der erste Schritt bei der unspezifischen Adsorption eines Proteins an einer Oberfläche besteht

i.A. im „Einfangen“ des gelösten Proteins durch langreichweitige, von Ionen an der

Oberfläche herrührende, elektrostatische Kräfte. Je näher das Protein an die Oberfläche gerät,

umso stärker werden die attraktiven „schwachen“ Wechselwirkungen. Spätestens jetzt kommt

es zu Geometrieverzerrungen in der Proteinstruktur. Sobald ein direkter Kontakt mit der

Oberfläche hergestellt ist, kommt es zusätzlich zu der polaren Wechselwirkung zu einer

direkten Ankopplung einzelner, an der Proteinoberfläche vorhandener hydrophober

Aminosäurereste an die Substratoberfläche. Spätestens wenn dann auch die „schwachen“

Wechselwirkungen (van-der-Waals-Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen)

hinzukommen, wird das Protein stark verzerrt. In der Folge dieser Denaturierung reißt die

Proteinstruktur auf und es werden weitere hydrophobe Aminosäuren aus dem Proteinkern

freigelegt, die ebenfalls in Wechselwirkung mit der Oberfläche treten können. Insgesamt kann

der Energiegewinn so groß werden, dass die Proteinadsorption - unter physiologischen

Bedingungen - ein spontaner, irreversibel ablaufender Prozess ist.

2.2.6 Einfluss des umgebenden Mediums auf die Proteinadsorption

Einige Techniken zur Untersuchung biologischer Grenzflächen (z.B. Neutronenstreuung)

werden mit deuteriertem Wasser durchgeführt. Auch bei NMR-Experimenten von

Biomolekülen ist D2O das Lösungsmittel der Wahl. Bisher wurden Experimente, die sich mit

der unspezifischen Adsorption von Proteinen beschäftigen vorwiegend mit normalen

wässerigen Puffern durchgeführt. Aber auch das Adsorptionsverhalten aus deuterierten

Puffern konnte bereits charakterisiert und mit dem Adsorptionsverhalten aus wässrigen

Puffern verglichen werden19. Dabei wurde die Adsorption vier verschiedener Proteine

(Streptavidin, RNase, BSA, GST) untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Substitution

von H2O durch D2O zu einer Verlangsamung der Proteinadsorption führt. Der Austausch von

H2O durch D2O liefert für das Verhältnis kh/kd Werte zwischen 1,7 (BSA) und 2,6 (RNase).

Auch wenn die Ergebnisse dieser Arbeit nicht auf einen allgemeingültigen Einfluss von

schwerem Wasser auf die Proteinadsorption schliessen lassen, so zeigen sie doch, dass

Experimente mit schwerem Wasser wichtige Informationen liefern können, um den

Mechanismus der unspezifischen Adsorption von Proteinen auf Oberflächen besser verstehen

zu können.

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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2.3 „Klassische“ proteinresistente Oberflächen

Seit den frühen 80er Jahren wurden Polyethylenglykole (PEGs) mit großen

Molekulargewichten genutzt, um die Adsorption von Proteinen und Zellen aus gepufferten

wässrigen Lösungen an Oberflächen zu unterbinden 20. Erklärt wurde das proteophobe

Verhalten der PEGs durch „sterische Repulsion“ 21. Mit diesem Begriff wird der Umstand

bezeichnet, dass infolge der Adsorption des Proteins die hohe Bewegungsfreiheit der an der

PEG-Oberfläche in das Wasser ragenden PEG-Polymerketten eingeschränkt wird, was eine

entsprechende Abnahme der Entropie mit sich bringt. Ein tieferes Verständnis der Ursachen

für die proteinabstoßenden Eigenschaften von PEG-Oberflächen wurde durch die Arbeiten

aus der Gruppe um Whitesides möglich. In diesen Arbeiten wurde ein Modellsystem

verwendet, das auf selbst assemblierenden Monoschichten (SAM) aus Oligoethylenglykol-

Alkanthiolen (OEGs) basiert, die auf Gold adsorbiert wurden. Diese SAM-Schichten bieten

den Vorteil, dass der Einsatz oberflächenphysikalischer Messmethoden möglich wird. Durch

Einsatz verschiedener Oligoethylenglykoleinheiten enthaltender Organothiole konnte eine

systematische Untersuchung durchgeführt werden 22, 23. Im Vergleich zum PEG mit hohem

Molekulargewicht bieten die Monoschichten den Vorteil, dass sie monodispers sind und eine

gut definierte Grenzschicht zur Flüssigkeit aufweisen.

Ein wesentliches Ergebnis dieser Untersuchungen war, dass auch die entsprechenden OEG-

SAMs Proteinresistenz zeigten, obwohl die Bewegungsfreiheit der Ethylenglykol-Einheiten

hier von Anfang an erheblich eingeschränkt ist 6. Diese Experimente belegten, dass die

sterische Repulsion zumindest nicht den einzigen Beitrag zur Proteinresistenz von PEG-

Oberflächen liefert.

OOH

HS 6

OOH

HS 3

OOH

HS 2

OOH

HS Abb.2.1: Gezeigt sind OEG-Thiole mit unterschiedlicher Anzahl an Ethylenglykol-Gruppen. Mit

steigender Anzahl an Ethylenglykol-Gruppen nimmt die Proteinresistenz zu. Im Laufe der Zeit kommt

es durch die chemische Instabilität der OEG-Thiole zur Degradation (Abbau von Ethylenglykol-

Einheiten) und die Proteinresistenz geht verloren.

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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2.3.1 Beobachtungen zur „klassischen“ Proteinresistenz und OEG-SAMs

In weiteren Experimenten zeigte es sich, dass es mehrere Parameter gibt, die für die Effizienz

der Proteinresistenz der kurzen, monodispersen Filme kritisch sind 6.

Eine deutliche Proteinresistenz wird nur beobachtet, wenn das ω-Ende des Alkanthiols mehr

als zwei Ethylenglykol-Einheiten aufweist (siehe Bild 1). Bei Untersuchungen, die für

Alkanthiole mit drei Ethylenglykol-Einheiten und einer terminalen Methoxy-Funktion

durchgeführt wurden, zeigte es sich, dass zusätzlich die sich innerhalb der selbst-

assemblierenden Monoschicht ausbildende Konformation der Oligoethylen-Thiole eine

wichtige Rolle spielt. Für auf Gold aufgebrachte SAMs zeigte eine infrarotspektroskopische

Untersuchung eine helikale Konformation, die proteophobe Eigenschaften besitzt. Unter

Verwendung desselben Thiols auf Silber aufgebrachte SAMs zeigen in der

Infrarotspektroskopie eine planare („all trans“) Konformation, die sich überraschender Weise

nicht mehr proteophob verhält, sondern an der nennenswerte Mengen von Proteinen

adsorbieren 24. Der Unterschied der Konformationen der Oligoethylenglykol-Ketten in den

auf die unterschiedlichen Metalloberflächen aufgebrachten SAMs wurde durch Unterschiede

der Packungsdichte erklärt. Auf Silberoberflächen kommt es infolge der hohen

Packungsdichte zu einer lateralen Kompression, unter der die helikalen Konformationen

kollabieren. Auch bei proteinresistenten polydispersen Monoschichten aus PEG konnte man

amorphe und helikale Konformationen nachweisen 25.

Untersuchungen, die mittels eines Rasterkraftmikroskopes (AFM) an methoxy-terminierten

Alkanthiolen mit drei Ethylenglykolgruppen durchgeführt wurden, belegten, dass

elektrostatische Abstoßungskräfte mit Reichweiten von mehreren 10 nm auftreten 26, 27. Bei

diesen Arbeiten wurden Elektrolytlösungen als Medium verwendet. Die bei diesen

Messungen gefundene Abstoßung wurde auf negative Oberflächenladungen zurückgeführt,

die durch die präferentielle Adsorption von Hydroxid-Ionen aus der Lösung (Autoprotolyse)

entstehen. Die Messergebnisse konnten durch entsprechende Rechnungen bestätigt werden 28.

2.3.2 Erklärungsansätze für das Phänomen der „klassischen“ Proteinresistenz

Die zum Thema der Proteinresistenz bisher durchgeführten, recht umfangreichen Arbeiten

ergeben noch kein vollständiges Bild; die „klassische“ Proteinresistenz von PEG und OEG-

Oberflächen ist immer noch Gegenstand aktueller Forschung. Es sind aber, vor allem in den

Gruppen um Grunze 6 in Heidelberg und um Whitesides 29, 30 in Boston, „Richtlinien“

erarbeitet worden, in denen eine Reihe wichtiger Kriterien benannt werden. Die wichtigsten

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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dieser Richtlinien sollen im Folgenden kurz aufgeführt werden.

Im Hinblick auf eine gute Proteinresistenz muss das Innere des SAMs hydrophil sein. Einer

der wesentlichsten Belege für diese Regel ist die Beobachtung, dass beim Übergang vom

hydrophilen Oligoethylenglykol zum hydrophoben Oligopropylenglykol die Proteinresistenz

verloren geht 6. Zusätzlich spielt die laterale Packungsdichte im SAM eine wichtige Rolle für

die Proteinresistenz. Erstaunlicherweise wird gerade für entspannte laterale Packungsdichten

bzw. bei SAMs mit einiger Unordnung oder mit Defektstrukturen eine bessere

Proteinresistenz gefunden 6. Aus diesen beiden Beobachtungen wird gefolgert, dass Wasser in

den SAM eindringen können muss. Durch Monte-Carlo-Simulationen wurde belegt, dass das

Eindringen von Wasser und die laterale Packungsdichte miteinander korrelieren 31, 32.

Außerdem bleibt unter den „entspannten“ Bedingungen die helikale Konformation der OEG-

Einheiten in den SAMs erhalten, wodurch Hydroxid-Ionen durch mehrere

Wasserstoffbrückenbindungen im OEG-Film gefangen und gegen laterale Verschiebung

gesichert werden 28. Da ein sich näherndes negativ geladenes Protein die Hydroxid-Ionen

nicht verdrängen kann, besitzt der Film insgesamt proteinresistente Eigenschaften. Es soll

allerdings nicht unerwähnt bleiben, dass es auch einige negativ geladene Oberflächen gibt

(z.B. Siliziumoberflächen), die nicht proteinresistent sind 5, 33.

2.3.3 Alternative proteinresistente Oberflächen

Wie oben ausgeführt, ist das Phänomen der Proteinresistenz auf molekularer Ebene noch nicht

vollständig verstanden. Die Erklärungsansätze sind - insbesondere im Fall der

Polyethylenglykole - plausibel und können eine Reihe von experimentellen Beobachtungen

erklären. Insgesamt wäre es außerordentlich interessant, organische Oberflächen aus anderen

Materialien im Hinblick auf ihre Proteinresistenz hin zu untersuchen. Außerdem besitzen die

Ethylenglykol-Oberflächen ein Problem im Hinblick auf ihre chemische Stabilität 34, 35. Die

Ethylenglykol-Einheiten sind oxidationsempfindlich, wodurch die Anzahl der terminalen

Ethylenglykol-Einheiten sich mit der Zeit verringert und die Oberflächen mehr und mehr ihre

proteophoben Eigenschaften verlieren. Vor allem wegen dieser intrinsischen

Oxidationsempfindlichkeit der Ethylenglykol-Einheiten wurde und wird intensiv nach

alternativen proteophoben Oberflächen gesucht. Einige alternative proteinresistente SAM-

Oberflächen sind bereits vorgeschlagen worden 22, 36-40. Unter alternativen proteophoben

Oberflächen sollen hierbei solche verstanden werden, in denen keine Ethylenglykol-Einheiten

vorhanden sind. Zu dieser Klasse zählen z.B. Maltose-terminierte SAMs 22,

Tripropylensulfoxid SAMs 36 und zwitterionische SAMs 37-39. Whitesides und Mitarbeiter

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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haben in einer Studie, in der sie nach Molekülen suchten, die für die Bildung proteophober

SAMs taugen, eine allgemeine These zum Phänomen der Proteinresistenz aufgestellt 29, 30.

Demnach ist es erforderlich, dass das Rückgrat eines Organothiols Wasserstoffbrücken-

Akzeptoren besitzen muss, damit der daraus aufgebaute SAM proteinabstoßende

Eigenschaften besitzt. Dagegen führt der Einbau von Wasserstoffbrücken-Donoren zu einem

Verlust der Proteinresistenz. Allerdings existiert auch zu dieser sehr allgemeinen Regel

bereits eine Ausnahme: Mannitol-Gruppen terminierte SAMs 41.

2.4 Herstellung ultradünner organischer Filme mittels Selbstorganisation

Ultradünne organische Filme, die durch Eintauchen von metallischen Substraten in Lösungen

von Organothiolen hergestellt werden können, finden ein immer breiteres Interesse im Hin-

blick auf ein wachsendes Feld von Anwendungen 42, 43. Ausschlaggebend für die vielfältigen

Einsatzmöglichkeiten dieser Filme ist die hohe strukturelle Qualität der organischen

Dünnstschichten, die sogar einen Einsatz als Resist in der Elektronenstrahllithographie

ermöglichen 44.

Abb.2.2: Selbstorganisation von Alkanthiolen. Die Moleküle werden über die Ankergruppe an der

Oberfläche festgehalten. Die funktionelle Gruppe bestimmt die Eigenschaften des SAM’s.

Diese Anwendung ist nur möglich, weil die Defektdichte in den molekular dünnen Filmen im

Hinblick auf den nach der Strukturierung mit dem Elektronenstrahl durchzuführenden

Ätzprozess ausreichend klein ist. Für viele Anwendungen ist eine entsprechende

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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Funktionalisierung der Organothiole erforderlich. Im Hinblick auf eine Anwendung in der

Sensorik muss etwa bei den häufig verwendeten Alkanthiolen die sehr stabile terminierende

Methyleinheit -CH3 durch eine Funktion ersetzt werden, die ein Ankoppeln der

nachzuweisenden Substanz ermöglicht. In diesem Bereich gibt es schon eine Reihe von

Vorarbeiten, die etwa in dem Buch von Ulman 43 und dem Übersichtsartikel von Nuzzo und

Dubois 42 diskutiert werden. Einen guten Überblick über die inzwischen sehr stark

angewachsene Literatur in diesem Bereich geben die Übersichtsartikel von Whitesides 45,

Wöll 46 und Schreiber 47.

2.4.1 Herstellung von selbstassemblierenden Monolagen aus Peptidthiolen

Seit Mitte der 90er Jahre wird in der Literatur von den Problemen und Erfolgen bei der

Erzeugung von Peptidoberflächen auf der Basis von selbstassemblierenden Peptidmolekülen

berichtet 48. Bei den in der Nukleinsäureanalytik häufig verwendeten PNA-Molekülen

(Peptide Nucleic Acid, Nukleinsäure mit Peptidrückgrat) handelt es sich chemisch formal um

Peptide. Diese Peptide sind im Zusammenhang mit dem hier vorgelegten Thema jedoch nicht

von Interesse, da durch die Peptidfunktion nur das geladene Rückgrat einer DNS gegen ein

neutrales substituiert wird. Obwohl chemisch formal ein Peptid vorliegt, lässt sich dieses

Molekül funktional nur als einzelsträngiges modifiziertes DNS-Fängermolekül einsetzen.

Die in der Einleitung angesprochene Biologisierung von künstlichen Oberflächen gelingt am

besten mit Aminosäure-basierten Peptidoberflächen, weil dadurch die Oberfläche

„proteinartig“ gemacht wird. Dementsprechend vielfältig sind die Berührungsflächen dieses

jungen Forschungsfeldes mit verwandten Forschungsfeldern und Anwendungen. Im

Folgenden soll ein grober Überblick über die derzeit verfügbare Literatur gegeben werden.

Neben einigen Arbeiten 49-54, die sich ausschließlich mit präparativen Aspekten, der

Peptidverankerung sowie der Orientierung und Anordnung der Peptid-SAMs beschäftigen,

gibt es eine Vielzahl von Arbeiten 48, 54-64, in denen die Oberflächenchemie und -physik der

resultierenden Filme charakterisiert wurden. Bisher kristallisieren sich bei den Anwendungen

von Peptid-SAMs zwei Hauptanwendungsgebiete heraus: Einerseits versucht man,

verschiedene Zellen dauerhaft und selektiv auf (strukturierten) Peptidfilmen zu verankern 65-

70, andererseits werden neue (bio)sensorische Aspekte auf der Basis von Peptidfilmen

erforscht 71-84. Ein besonders neues Feld (~seit 2000) ist die molekulare Elektronik auf Basis

von Peptidelementen 85-88. Im Hinblick auf das Ausbilden proteophober Oberflächen sind

reine Peptid-SAMs bislang nicht eingesetzt worden.

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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2.5 Streptavidin/Biotin-System

Streptavidin wird von dem Bakterium Streptomyces avidinii gebildet und aus diesem isoliert.

Streptavidin ist ein tetrameres Protein (4 Monomere zu je 13kDa), welches in der Biochemie

viele verschiedene Anwendungen findet. Diese Vielfältigkeit beruht darauf, dass Streptavidin

ein hohe Affinität zu Biotin (Ka~1013M-1) besitzt. Von jedem Monomer kann ein Molekül

Biotin gebunden werden. Die Biotin-bindenden Eigenschaften des Streptavidins sind in der

Literatur etabliert 89-92. Die Bindungstasche ist so aufgebaut, dass sie drei verschiedene

Bindungsarten mit dem Liganden zeigt, wie es von Weber et al., 1989 und Hendrickson et al.,

1989 in ihren Arbeiten zur Struktur des Streptavidin-Biotin-Komplexes gezeigt wird.

Abb.2.3: Schematische Darstellung der Biotin-Bindungstasche des Streptavidins nach der Gruppe

von Freitag 93, 94. Die Pfeile symbolisieren antiparallele β-Faltblattstrukturen, wobei die unter

physiologischen Bedingungen irreversible Biotin-Streptavidin-Komplexbildung ausschließlich durch

nicht kovalente polare (linkes Bild) und unpolare (rechtes Bild) Wechselwirkungen zustande kommt.

Streptavidin bindet mit 1-2 seiner 4 Biotin-Bindungsplätze an eine biotinylierte Thiolschicht.

Die gegenüberliegenden 2 freien Bindungsplätze können als universelle Bindematrix dienen.

Die hohe Affinität dieser Komponenten macht das Biotin-Streptavidin-System zu einem Maß

für die spezifische Bindung von Proteinen an eine Oberfläche, da davon ausgegangen werden

kann, dass jedes zugängliche Biotin an einer Oberfläche durch Streptavidin gebunden wird.

Es ist bekannt, dass Streptavidin unter geeigneten experimentellen Bedingungen an

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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biotinylierten Oberflächen nur eine Monolage ausbildet 35, da Streptavidin keine Di- oder

Multimere bildet, wenn keine Bindungsstellen mehr an der Oberfläche verfügbar sind.

Abb.2.4: Tetramere Struktur des Streptavidins (nach 92) mit vier gebundenen Biotinmolekülen. Es ist

zu erkennen, dass die Bindungstasche des Streptavidins relativ tief ist.

Gegenüber anderen Biotin-bindenden Proteinen (z.B.: Avidin) besitzt Streptavidin einige

Vorteile. Das Gen des Streptavidins ist vollständig aufgeschlüsselt und somit in

Standardexpressionssystemen expremierbar. Dass heißt, dass die Geninformation bekannt ist

und gezielt in bakterien eingebaut werden kann, damit diese dann das Streptavidin

produzieren. Zusätzlich können gezielte Modifikationen an den Geniformationen

vorgenommen werden, um das Strepatvidin spezifisch zu verändern.

Tab. 2.1: Dissoziationseigenschaften des Streptavidin - Biotin - Komplexes 89,95.

pH 1,7 2,0 3,0 5,0 7,0 9,2 10,5

Geschwindigkeitskonstante k (sek-1 x 107)

35,0 - 19,0 8,7 28,0 64,0 100,0

Halbwertszeit t1/2 (in Tagen)

2,3 - 4,2 9,2 2,9 1,25 0,8

Streptavidin besitzt es noch einen weiteren, großen Vorteil. Verwandte Proteine wie z.B. das

Avidine werden aus dem Eiweiß bzw. Eidotter von Vögeln oder Reptilien isoliert. In diesen

werden sie als Glykoproteine exprimiert und besitzen deshalb viele heterogene

Kohlenhydratmodifikationen, die für unspezifische Bindungseffekte verantwortlich gemacht

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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werden89. Streptavidin hingegen wird wie bereits erwähnt in Bakterien exprimiert und besitzt

diese Modifikationen entsprechend nicht.

Die Dissoziation des Streptavidin von Biotin ist von vielen Faktoren abhängig. Die

Freisetzung der Liganden steigt mit zunehmender Nettoladung des Proteins. Am

isoelektrischen Punkt ist die Wechselwirkung zwischen Ligand und Protein am stärksten. Das

Dissoziationsverhalten im pH-Bereich ist in Tabelle 2.1 dargestellt.

Auf Grund der hohen Enthalpie (ΔH) der Bindung von Biotin an Streptavidin, ist die

Dissoziationsgeschwindigkeit auch stark von der Temperatur abhängig. Eine Erhöhung der

Temperatur von gerade einmal 5K führt zu einer Verdoppelung der Dissoziationsrate 89,96.

Auch sperrige Gruppen am Biotin sind für die Bindung hinderlich. Dieser Umstand wird

durch die Verwendung von Abstandshaltergruppen (engl. spacer) verhindert. Diese Spacer

bestehen meist aus einfachen Methylengruppen, die sechsfach oder häufiger hintereinander

aufgereiht sind.

Wie bereits erwähnt wird Strepatvidin in der Natur vom Bakterium Streptomyces avidinii

gebildet. Bis heute konnte allerdings nicht herausgefunden werden, warum das Bakterium

Streptavidin synthesisiert, was die genaue Funktion des Streptavidins im Bakterium ist und

welche Selektionsvorteile sich daraus ergeben. Dies ist ungewöhnlich, da solch starke

(irreversible) Protein-Ligand-Wechselwirkungen, wie sie für das Streptavidin-Biotin-System

beobachtet wurden, in der Natur - auf Grund der erhöhten Schwere des biochemischen

Regulierungsmecnaismus - nicht häufig vorkommen.

2.6 Strepatvidin/Meerrettichperoxidase (HRP) System

Meerrettichperoxidase Isoenzym C ist das meistuntersuchte Protein bei der Charakterisierung

der enzymatischen Aktivität von Peroxidasen. Es ist ebenfalls das meistuntersuchte Protein

aus der Superfamilie der extrazelluären Peroxidasen von Pflanzen. Die Peroxidase wird mit

einem Ankermolekül konjugiert, welches eine Biotingruppe enthält; diese Ankergruppe ist

Biotinamidocaproyl (Abb. 2.3). Dieses Molekül enthält eine -COOH-Gruppe. Diese Gruppe

kann an jede freie Aminogruppe des Proteins konjugiert werden. Bei der HRP stehen hierfür

der N-Terminus und die frei zugänglichen Seitenkette der Aminosäure Lysin (H2N-(CH2)4-

CH(NH2)-COOH) zur Verfügung. Aus Kristallstrukturanalysen können die Maße der

Peroxidase entnommen werden (Abb. 2.3). Aus den Daten der Kristallstrukturanalyse wird

ersichtlich, dass die meisten Lysine auf der langen Seite der Peroxidase lokalisiert sind (4

Lysine auf der langen Seite, kein Lysin auf den beiden kurzen Seiten, ein Lysin in einer Ecke,

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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also für lange und kurze Seite zugänglich, 1 Lysin ist im Inneren der HRP lokalisiert und steht

für eine Interaktion nicht zur Verfügung); der N-Terminus ist ebenfalls an der langen Seite

des Proteins lokalisiert. Das Verhältnis der Bindungsmöglichkeiten für das Aminocaproyl von

langer zu kurzer Seite ist somit 6:1. Es sollte also davon ausgegangen werden, dass die

meisten Aminocaproyle auf der langen Seite konjugiert sind und die Peroxidase über diese

Seite an die Streptavidin-Matrix bindet.

Abb.2.5: Monomere Struktur der HRP (links). Rechts ist der Biotinanker, das Biotinamidocaproyl

dargestellt. Die Biotinfunktion (roter Kreis) ist über eine C-N-Bindung mit dem restlichen Anker

verbunden. Die HRP besitzt die folgenden Maße (RCBS-Proteindatabank): 4,1nm x 4,1nm x 6,2nm.

2.7 Kurzdarstellung anderer verwendeter Proteine

2.7.1 Rinder-Serum-Albumin (BSA)

Rinder-Serum-Albumin (bovine serum albumine, BSA) ist ein globuläres Protein mit einem

Molekulargewicht von etwa 67 kDa. Albumine sind mit ca. 45 g/l das häufigste Protein im

Blutplasma. Die Funktionen des Albumins bestehen der pH-Regulation des Blutes, indem es

als Puffer agiert, sowie in im Aufrechterhalten des kolloidosmotischen Drucks. Neben der

Bindung anorganischer Ionen (Mg2+ und Ca2+), dient das Albumin auch als Trägerprotein für

wasserunlösliche bzw. schwerlösliche Komponenten, da es Bindungsstellen für lipophile

Substanzen besitzt. Albumine sind beispielsweise am Transport von, Fettsäuren,

Steroidhormonen und Pharmaka beteiligt.

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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2.7.2 Fibronectin

Fibronectin ist ein Glycoprotein der extrazellulären Matrix. Fibronectin besteht zu 5% aus

Carbohydraten, welche an membrangebundene Rezeptorproteine (Integrin) binden. Neben

den Integrinen bindet Fibronectin auch an andere Proteine der extrazellulären Matrix

(Collagen, Fibrin, Heparansulfat) 97. In seiner löslichen Form (2 Monomere mit je 230kDA)

findet man Fibronectin auch im Blutplasma. Die unlösliche Form des Fibronectins ist ein

großer Komplex von miteinander vernetzten Untereinheiten. Die Eigenschaft, Zellen mit der

extrazellulären Matrix zu verbinden, brachte Fibronectin anfangs den Namen Zellkleber ein.

2.8 Substrate für die Oberflächenexperimente

Die für die Beobachtung der Adsorption des Streptavidins verwendeten Substrate müssen

über bestimmte Eigenschaften verfügen.

Für die Experimente mit dem Ratsrekraftmikroskop sollte die Oberfläche der Substrate

möglichst glatt sein, da das Streptavidin selber eine Höhe von nur 4 nm besitzt. Bei einer zu

großen Rauhigkeit der Oberfläche wäre eine Unterscheidung zwischen der Rauhigkeit des

Substrates und absorbierten Streptavidinmolekülen nicht mehr möglich.

Zur Generierung eines strukturierten SAM ist es notwendig, eine massive Metallschicht zu

benutzen, da die zur Herstellung des SAM verwendete Mikrokontaktstempelmethode eine

relativ starke mechanische Belastung der Oberfläche darstellt. In der vorliegenden Arbeit

wurden hierfür mit Gold beschichtete Siliziumwafer verwendet. Auf die Verwendung von

Goldeinkristallen wurde wegen der zu hohen Kosten verzichtet.

Das Substrat muss weiterhin resistent gegen Oxidation durch Luftsauerstoff sein, da diese zur

Veränderung und Zerstörung der Adsorbatschicht führen kann 98. Diese Resistenz wird über

das Bedampfen mit Gold erreicht, da dieses von den Edelmetallen am unempfindlichsten

gegenüber Luftsauerstoff ist.

Bei der Auswahl geeigneter Substrate konnte einerseits auf in der Literatur beschriebene

Präparate, so wie auf die vorhandene Erfahrung in der Präparation am Lehrstuhl für

Physikalische Chemie I (Ruhr-Universität Bochum) zurückgegriffen werden.

in der vorliegenden Arbeit wurden polierte Siliziumeinkristalle, die durch Oxidation zu SiO2

(an der Oberfläche) passiviert wurden, verwendet. Durch die Härte des Siliziumeinkristalls

lässt sich dieser einfach präparieren. Da Gold zwar auf Silizium haftet, aber schon durch

leichte mechanische Belastungen (z.B.: laminare Strömungen in der Flusszelle) wieder

abblättert, wird zwischen das Silizium (2mm dick) und dem Goldfilm (60-100nm) eine dünne

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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Schicht Titan (~10nm) als Haftvermittler aufgedampft. Soweit nicht anders beschrieben

wurden die Präparate nach folgendem protokol bedampft: Die Wafer wurden mit reinem

Aceton und abs. Ethanol (EtOH) gewaschen und anschließend im Stickstoffstrom getrocknet.

Die Substrate wurden dann in einen Metall-Verdampfer (Leybold Univac) eingebaut. Das

Gerät besitzt eine Drehschieber-Vakuumpumpe (bis etwa 10-3bar) und eine

Turbomolekularpumpe (bis 10-7-10-8bar) über die das benötigte Vakuum (etwa 10-7bar)

erzeugt wird. Weitere wichtige Bestandteile sind zwei Wolframschiffchen. Die beiden

Wolframschiffchen sind mit bis zu 120 Ampere auf 400°C aufheizbar. In ihnen befinden sich

die zwei zu verdampfenden Metalle, in einem das Gold, in dem anderen das Titan. Die

Substrate befinden sich auf einem drehbaren Teller etwa 30cm über den Wolframschiffchen.

Der Teller ist so konstruiert, dass er sich nur bei „niedrigen“ Temperaturen (≤ 50°C) drehen

lässt. Beim Bedampfen können verschiedene Schichtdicken eingestellt werden, mit denen die

Substrate bedeckt werden sollen. Die Bestimmung dieser Schichtdicke erfolgt über eine

Quarzwaage. In Abhängigkeit von den aufgedampften Schichtdicken verändert hierbei ein

schwingender Quarzkristall seine Schwingfrequenz. Aus dieser Veränderung kann dann die

Schichtdicke bestimmt werden. Die Aufdampfrate (Å/Sekunde) wird über den Heizstrom, der

an den Wolframschiffchen angelegt wird, eingestellt. Zuerst wurde eine Schicht von 100Å

Titan mit einer Rate von 2Ås-1 aufgedampft, um die Adhäsion des anschließend

aufgedampften Goldfilms zu erhöhen. Der Goldfilm wurde mit einer Rate von 15Ås-1

aufgedampft, bis die endgültige Schichtdicke von 1200Å (Silizium Wafer) bzw. 600Å (Glas-

Wafer) erreicht worden war.

Für die durchgeführten Experimente mit dem Rasterkraftmikroskop wurden dementsprechend

mit Gold/Titan bedampfte Siliziumeinkristall-Wafer verwendet. Zur Charakterisierung im

Oberflächenplasmonenresonanz-Spektrometer, sowie für die AKtivitätstests wurden Glas-

Wafer (T283 Dünnglas) verwendet.

2.9 Messmethoden zur Oberflächenanalytik

2.9.1 Mikrokontaktstempeln

In dieser Arbeit wurden lateral strukturierte Goldsubstrate verwendet. Die Herstellung solcher

Strukturen gelingt über die Mikrokontaktstempeltechnik. Mit dieser Technik können auf sehr

einfache Art und Weise kleinste Strukturen hergestellt werden, wobei als unteres Limit derzeit

überall 30 nm genannt werden 99.

Die Technik beruht auf der Übertragung der gewünschten Strukturen auf die Goldsubstrate

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mittels eines Polymerstempels aus Polydimethylsiloxan (PDMS, z.B.: Dow Corning,

Poly(dimethylsiloxan) Sylgard 184) und der Fähigkeit von Alkanthiolen, selbstordnende,

monomolekulare Dünnfilme auszubilden. Hierzu wird der Stempel mit dem gewünschten

Alkanthiol beladen und mit dem Goldsubstrat in Kontakt gebracht, wo sich dann die

monomolekulare Alkanthiollage ausbilden kann. Abbildung 2.4 zeigt die Herstellung des

PDMS - Stempels. Zur Herstellung der Maske wird mittels eines Zeichenprogramms

Abb.2.6: Herstellung a) des Masters (Photolithographie) und b) des Stempels (PDMS).

(z.B.: CAD oder COREL DRAW) eine Vorlage erstellt. Diese Vorlage wird dann je nach

Strukturgröße auf Chrom (≤ 20 µm) oder eine Polymerfolie (≥ 20 µm) übertragen99.

Die Herstellung der Polymerfolie ist preisgünstiger und nicht so zeitaufwendig wie die einer

Chrommaske. Von dieser Maske wird wie in Abbildung 2.4.a) dargestellt, über einen

photolithographischen Prozess ein sogenannter „Master“ hergestellt. Hierzu wird ein

Silizium-Wafer mittels Spin Coating mit einem Photolack beschichtet und anschließend durch

die Maske mit UV-Licht belichtet. Der Wafer wird anschließend entwickelt, wodurch je nach

Photolack (Positiv - oder Negativphotoresist) der nicht belichtete bzw. belichtete Bereich als

Struktur zurückbleibt. Der Master wird dann mit dem PDMS übergossen (Abbildung 2.4.b)),

das PDMS polymerisiert und der fertige, strukturierte Stempel kann vom Master getrennt

werden. Der Master wird zuvor silanisiert, um ihn leichter aus dem PDMS lösen zu können.

Der strukturierte Stempel wird anschließend mit dem benötigten Thiol beladen (Abb. 2.5.a).

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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Hierzu muss der Stempel lediglich kurz in die Thiol - Lösung eingelegt oder mit dieser benetzt

werden.

Abb.2.7: Mikrokontakt-Printing eines Thiols auf Gold (schematische Darstellung). Nur an den

Kontaktflächen des Stempels mit der Goldoberfläche kann das Thiol an das Goldsubstrat binden.

Anschließend wird der Stempel auf einen Silizium- bzw. Glas-Wafer gelegt, wodurch die

Struktur auf das Substrat übertragen wird. Zur einfachen Qualitätsprüfung der gestempelten

Strukturen kann nach Übertragung der Thiole das restliche Gold weggeätzt und das Ergebnis

unter dem Lichtmikroskop betrachtet werden.

Die PDMS - Stempel sind sehr langlebig. Ein Stempel kann mehr als hundert Mal zum

Stempeln verwendet werden. Die relativ günstigen Bedingungen zur Herstellung der Stempel

und der gestempelten Strukturen haben die Mikrokontaktstempeltechnik zu einer industriell

interessanten Technik werden lassen. Zu den Vorteilen zählen die relativ günstigen

Materialien (Si-Wafer, PDMS), die Langlebigkeit sowie die Flexibilität der PDMS - Stempel,

wodurch auch unebene Flächen (z.B.: Kugeloberflächen) bestempelt werden können. Auch

das Bestempeln größerer Flächen kann realisiert werden. Hierzu wird ein Stempel mit

zylindrischer Form verwendet, welcher über das Substrat gerollt wird100,101. Es wurde bereits

ein sog. „Stamp-Aligner“ entwickelt, der unter definierten Bedingungen die Muster größerer

Arrays reproduzierbar stempeln kann 102.

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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Die Entwicklung dieser Technik ist schon weit vorangeschritten und wird möglicherweise

schon bald industrielle Anwendung (z.B. Erstellung von Sensorarrays103) finden.

2.9.2 Oberflächenplasmonenresonanz - Spektroskopie

Das Phänomen der Oberflächenplasmonenresonanz wurde bereits 1909 und 1941 von den

Theoretikern Sommerfeld und Fano als Lösung der Maxwell-Gleichungen vorausgesagt.

Dabei wurden stetige Randbedingungenan der Oberfläche vorausgesetzt. Trotz dieser frühen

Voraussagen gelang die experimentelle Umsetzung des Oberflächenplasmonenresonanz-

Konzeptes erst in den 60er Jahren und ist seitdem kontinuierlich weiterentwickelt worden.

Heute gibt es verschiedene kommerzielle Systeme (z. B. Geräte der Firmen Reichert,

BIAcore® und Texas Instruments). Die Bestimmung kinetischer und thermodynamischer

Interaktionseigenschaften zwischen zwei Bindungspartnern ist dabei das vorherrschende Ziel

der Untersuchungen.

Im Folgenden werden die wichtigsten Aspekte dieser Technik zusammengefasst. Bei Metallen

sind die äußeren Valenzelektronen aufgrund der abgeschlossenen inneren Schalen vom Kern

abgeschirmt und werden somit von der Kernladung nicht beeinflusst. Wegen dieses

Phänomens können die Valenzelektronen von Metallen (z.B.: Silber, Gold) - unter

Vernachlässigung der positiven Atomrümpfe - als Elektronengas aufgefasst werden

(Plasmakonzept). In diesem Plasma können sich Verschiebungen der Ladungsdichte in Form

elektromagnetischer Wellen (EM) ausbreiten. Diese EM werden als Plasmonen bezeichnet;

man unterscheidet dabei zwischen Volumenplasmonen und Oberflächenplasmonen.

Volumenplasmonen (VP) sind longitudinale Wellen und im inneren des Metalls lokalisiert,

während Oberflächenplasmonen (SP) transversale Wellen sind und parallel zur Grenzfläche

des Metalls und dem angrenzendem Dielektrikum verlaufen. Die beiden Plasmawellen

interagieren nicht miteinander. Eine Besonderheit der SP ist die Abnahme der Amplitude im

Volumen senkrecht zur Ausbreitungsrichtung, die einem exponentiellen Verlauf folgt. Die

Oberflächenplasmonen können normalerweise optisch nicht angeregt werden. Aufgrund des

Welle-Teilchen-Dualismus können die anregende Lichtwelle und die

Oberflächenplasmonenwelle als jeweils ein Lichtteilchen (Photon) angesehen werden. Wenn

das anregende Photon mit dem Oberflächenplasmon ideal wechselwirken soll, muss es zur

vollständigen Energie- und Impulsübertragung kommen, d.h. anregende Lichtwelle und

Oberflächenplasmon müssen bzgl. Energie, Impuls und Ploarisation übereinstimmen. Eine

solche Übereinstimmung ist normal nicht möglich; dies wird relativ schnell ersichtlich, wenn

man die Disperisonkurven für die Plasmonenwellen und eine Lichtwelle betrachtet (siehe

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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Abb. 2.9). Um nun doch eine Anregung zu ermöglichen muss ein optischer Koppler

eingesetzt werden (Prisma). Der Koppler sorgt dafür, dass - auf Grund der Dämpfung im

dichteren Medium - die Steigung der Lichtgeraden verkleinert wird, so dass sich die beiden

Dispersionsgraphen schneiden und eine Anregung möglich wird. Durch einen speziellen

Aufbau (Kretchmann-Raether-Anordnung, p-Polarisation des anregenden Lichts) und der an

der Grenzfläche Prisma/Probe auftretenden Totalreflektion können so Impuls, Energie und

Polarisation aufeinander abgeglichen werden, so dass es zu einer anregung kommt.

Abb.2.8: Dispersionskurven von Oberflächen- (SP) und Volumenplasmonen (VP) im Vergleich zur

Dispersiongerade des Lichts. Die Lichtgerade und die Dispersionskurve für die SP schneiden sich

nicht, es kann also keine Energie- und Impulsübetragung auftreten.

Eine solche Anregung wird als Oberflächenplasmonenresonanz bezeichnet. Wird die

Intensität des total reflektierten Laserstrahls (R) als Funktion des Einfallswinkels aufgetragen,

so zeigt sich im Falle der resonanten Plasmonenanregung ein scharfes Minimum (Abb.2.10).

Diese sogenannte Abschwächung der Totalreflektion (attenuated total reflection, ATR) bildet

die Grundlage der SPR-Spektroskopie. Bei einem bestimmten Winkel α stimmt die

Komponente des Lichtwellenvektors entlang der Grenzfläche mit dem Wellenvektor des

Oberflächenplasmons überein. Der Resonanzwinkel ist dabei von mehreren Faktoren

abhängig, wie z.B. dem Brechungsindex des Systems. Die zwei wichtigsten Faktoren sind die

Belegung der Grenzschicht Gold/Luft und das den Goldfilm umgebende Medium, da beide

Faktoren den Brechungsindex des Systems beeinflussen. Wird nun auf den Metallfilm eine

dielektrische Schicht aufgetragen, so führt dies zu einer Verschiebung der

Plasmonenresonanz. Diese Verschiebung ist durch eine Änderung des Winkels α erkennbar.

Für die Kinetikmessung wird der Winkel α nicht variiert, sondern auf einen bestimmten

Winkel fixiert und die Veränderung der Intensität gemessen. Da bei der Bindung von

Molekülen an die Oberfläche diese optisch dichter wird und sich somit die

Plasmonenresonanz zu höheren Werten verschiebt, verändert sich auch die für den

Beobachtungswinkel gemessene Intensität.

SP

kx

VPω Licht: ω=c*k

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

- 29 -

Abb. 2.9: Links: Schematische Darstellung der Plasmonenresonanzkurve zu zwei verschiedenen

Zeiten T1 und T2 eines Adsorptionsprozesses. Die Minima beim entsprechenden Resonanzwinkel

α1/α2 und die Verschiebung des Resonanzwinkels sind deutlich zu erkennen. Im rechten Bild ist die

Entstehung der entsprechenden Oberflächenkinetik dargestellt.

In Abbildung 2.11 ist beispielhaft die Aufnahme einer Oberflächenkinetik mittels SPR

gezeigt, bei der ein Thiol einen SAM auf einer sauberen Goldoberfläche bildet.

Abb.2.10: Die Bildung eines SAMs lässt sich in Realzeit mitels SPR verfolgen: nach Kontakt einer

sauberen Goldoberfläche mit reinem Ethanol ist das SPR-Signal erstmal konstant. Nach Zugabe einer

alkoholischen Lösung vom 11-Mercapto-undekanol (linker Pfeil) nimmt das SPR-Signal stark an

Intensität zu. Nach Ende des Kontakts mit der Thiollösung (rechter Pfeil) nimmt die Intensität des

Signals wieder ab, bleibt aber weit über dem Ausgangsniveau. Es hat sich eine organische

Dünnstschicht auf der goldoberfläche gebildet.

Die Hauptvorteile der SPR bei der Charakterisierung von Biomolekül-Interaktionen liegen

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

- 30 -

darin, dass die Verschiebung des Plasmonenresonanzminimums proportional zur molaren

Masse der angelagerten Bindungspartner (Proteine) ist und keine Marker-Moleküle (Tags

oder Labels) an die Bindungspartner (Proteine) angeheftet werden müssen, um ihre

Adsorption in Realzeit verfolgen zu können.

2.9.3 Rastersondenmikroskopie

Rastersondenverfahren sind die Instrumente zum Vorstoß in die Nanotechnik, dem Terrain

einzelner Moleküle104.

Ein wichtiges Ereignis in dem Bereich der Rastersondenmikroskopie war die Entwicklung des

Rastertunnelmikroskops (Scanning Tunneling Microscope, STM) durch Binnig und Rohrer 105

(1981). Auf Grund des sehr guten Auflösungsvermögens bis in den atomaren Bereich und der

spektroskopischen Eigenschaften war dies das erste Rastersondenmikroskop, welches auf ein

breites Interesse in der Wissenschaft stieß 106.

2.9.3.1 Rastertunnelmikroskopie

Bei der Rastertunnelmikroskopie wird eine feine Metallspitze („Sonde“) mit Hilfe

piezokeramischer Stellglieder in sehr geringem Abstand (≤ 1 nm) über die Oberfläche

gerastert. Legt man an diese Sonde einen elektrischen Strom an, entsteht ein sogenannter

Tunnelstrom. Dieser Strom beruht auf dem quantenmechanischen Tunneleffekt und ist

exponentiell vom Abstand der Spitze zur Probe abhängig. Dieser Tunnelstrom kann detektiert

werden. Wird nun die Probe relativ zur Spitze bewegt, erfolgt eine Veränderung des

Tunnelstroms entsprechend der Oberflächentopographie. Da sich der Tunnelstrom

exponentiell zum Abstand der Spitze zur Probe verändert, tragen nur die vordersten Atome

der Spitze zum gemessenen Signal bei. Aus diesem Grund beträgt das vertikale

Auflösungsvermögen dieser Technik weniger als 10-3 nm, ein Wert, der von keiner anderen

mikroskopischen Methode erreicht wird 107.

Da das Prinzip des Rastertunnelmikroskops auf dem quantenmechanischen Tunneleffekt

beruht, ist die Anwendung auf leitende und halbleitende Proben beschränkt. Biologische

Proben können daher nur untersucht werden, wenn sie vorher mit einer leitenden Schicht

(z.B.: Kohlenstoff /Platin) überzogen wurden Dies führt normalerweise zum Verlust

sämtlicher biomolekularen Eigenschaften der zu untersuchenden Probe.

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

- 31 -

2.9.3.2 Rasterkraftmikroskopie

Binnig, Gerber und Calvin gelang es 1986 das Prinzip der Rastertunnelmikroskopie auf nicht

leitende (isolierende) Oberflächen zu übertragen. Bei dieser sogenannten

Rasterkraftmikroskopie (engl. Atomic Force Microscopy, AFM) tastet eine feine Spitze die zu

untersuchende Oberfläche ab. Wie der Name es schon nahe legt, wird also die direkte

Kraftwechselwirkung zwischen der Spitze und der zu untersuchenden Oberfläche gemessen.

Die Spitze ist über einen Federhebel (Cantilever) mit einem piezokeramischen Element

verbunden. Die Auslenkung des Federhebels durch das Profil der Oberfläche wird detektiert.

Für die Detektion der Auslenkung hat sich eine optische Methode durchgesetzt, während

diese früher über eine STM-Spitze verfolgt wurde. Bei der optischen Methode

k

Abb. 2.11: Schematische Darstellung des optischen Detektionsverfahrens für die Auslenkung des

Cantilevers (aus 108).

Methode wird der Lichtstrahl eines Lasers von der Rückseite des Hebelarms reflektiert. Der

reflektierte Strahl wird von einer meist viergeteilten Photodiode detektiert. Prinzipiell gibt es

zwei Möglichkeiten, die Auslenkung des Cantilevers zu erfassen (siehe Abb. 2.12). Der

Reflexionswinkel α wird in Abhängigkeit von der Auslenkung des Cantilevers variiert,

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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wodurch der Laser auf der Photodiode wandert. Die oberen und unteren zwei Felder der

Photodiode liefern durch diese Wanderung unterschiedliche Spannungswerte. Aus diesen

Werten wird ein Differenzsignal gebildet. Dieses Signal kann dann entweder direkt in ein

Höhenprofil umgerechnet werden oder eine Rückkopplungsschleife regelt das

piezokeramische Element so nach, dass die Aufdruckkraft des Cantilevers konstant bleibt. In

diesem Fall wird die Oberflächentopographie aus dem Steuerungssignal des

piezokeramischen Elements berechnet. Mit dieser Technik ist ein Auflösungsvermögen bis

hin zur atomaren Ebene erreichbar. Bei der Rasterkraftmikroskopie ist die Auflösung von

mehreren Faktoren abhängig. Den direktesten Einfluss nehmen die verwendeten

Spitzen/Federhebel, die aus Silizium, Siliziumoxid oder Siliziumnitrid (Si3N4) hergestellt

werden. Hierbei sind die Morphologie der Spitze und die Härte des Federhebels entscheidend

für die erreichbare Auflösung. Weitere Parameter, die die Auflösung entscheidend

beeinflussen können, sind vor allem Schwingungen, Schall und Temperatur. Störungen durch

Schwingungen werden durch Lagerung des Rasterkraftmikroskops auf speziellen

schwingungsgedämpften Tischen minimiert.

Die Störungseffekte durch Temperatur machen sich als “topographische Drift“ bemerkbar.

Eine solche Drift entsteht, wenn sich die Probe durch Wärme ausdehnt. In diesem Fall kann es

geschehen, dass die Spitze beim Rastern langsamer ist als die Ausdehnungsgeschwindigkeit

der Probe, wodurch eine punktuelle Auflösung nicht mehr möglich ist. Diesem Effekt kann

auf zwei Arten entgegengewirkt werden. Durch Erhöhung der Rastergeschwindigkeit ist es

möglich, die Probe schneller abzurastern, als diese sich ausdehnt.

Abb.2.12: Schematische Darstellung und REM-Aufnahme der für Rasterkraftmikroskopie

verwendeten Spitzen für (Abbildungen links) den Tapping-Modus und (Abbildungen rechts) den

Kontakt-Modus (aus 109).

Die Erhöhung der Rastergeschwindigkeit kann allerdings ebenfalls zu einer schlechteren

Abbildungsqualität führen. Die zweite Möglichkeit ist, zu warten, bis sich im gesamten

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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System (Mikroskop/Probe/Messraum) ein thermisches Gleichgewicht eingestellt hat. Um die

Temperatureffekte der räumlichen Umgebung zu minimieren, besteht zusätzlich die

Möglichkeit das Mikroskop mit einer speziellen Abdeckung zu versehen.

Diese Abdeckung ist ebenfalls geeignet das Mikroskop vor Störungen durch Schall zu

schützen.

Prinzipiell sind in der Rasterkraftmikroskopie drei unterschiedlichen Modi für die Betriebsart

vorhanden, der Kontakt-, der Nicht-Kontakt und der Tapping-Modus. Kontakt- und Tapping-

Modus sollen im Folgenden näher beschrieben werden.

2.9.3.3 Rasterkraftmikroskopie im Kontaktmodus

Im Kontakt-Modus wird die Spitze des Rasterkraftmikroskops direkt auf die Oberfläche der

zu untersuchenden Probe gebracht und dann über diese gerastert. Wie bereits erwähnt, kann

dabei entweder die Höhe des Cantilevers konstant gehalten werden (constant height) oder die

Kraft, mit der dieser auf die Probe gedrückt wird (engl. constant force). Die zur Auswertung

von der Photodiode aufgenommenen Spannungswerte können auf verschiedene Weisen

interpretiert werden. Zum einen kann direkt die Topographie der Oberfläche dargestellt

werden. Zum anderen treten, da die Spitze beim Rastern permanent mit der Oberfläche in

Kontakt ist, Scherkräfte auf, die zu einer Torsion des Cantilevers führen. Die

Reibungskraftmikroskopie (Friction Force Microscopy, FFM) ist ein wichtiges Werkzeug der

Nanotribologie, der Erforschung von Reibungs- und Verschleißeigenschaften von

Kontaktflächen 110. Höhensignal und Reibungssignal können gleichzeitig und unabhängig

voneinander aufgenommen werden. Beim Rasterkraftmikroskop wird jede Linie zweimal

gemessen (Vor- und Zurückbewegung des Cantilevers). Die erste Messung wird als „trace“

und die zweite als „retrace“ bezeichnet. Es kann nun beim trace das Höhensignal und beim

retrace das Reibungssignal aufgenommen werden (oder umgekehrt). Der Reibungsmodus

wird auch als Lateralkraft-Modus (LFM) bezeichnet. Die Torsion des Cantilevers beruht auf

den direkten Wechselwirkungen der Spitze mit der zu untersuchenden Probenoberfläche.

Diese Wechselwirkungen sind materialabhängig und variieren je nach Probenbeschaffenheit.

Auf diese Weise können zwei lateral strukturierte Adsorbate mit gleicher Höhe unterschieden

werden, sofern sich ihre Reibungseigenschaften unterscheiden (z.B. die

Reibungseigenschaften der funktionellen Gruppe eines OH- bzw. CH3-terminierten Thiols).

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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Abb.2.13: Der „Quad-Detektor“ des verwendeten Rasterkraftmikroskops der Firma Digital

Instruments. Verschiedene Segmente der Photodiode sind für die Gewinnung des Höhen- bzw.

Reibungssignals verantwortlich. Zur Gewinnung des Reibungssignals wird das Differenzsignal dCD = D

- C ausgewertet, während das Höhensignal über das Differenzsignal dAB = B - A berechnet wird 111.

Die Bilder der zwei verschiedenen Scanrichtungen (trace/retrace) sind invertiert, da die

Torsion des Cantilevers von der einen Richtung zur anderen umgekehrt wird. Die Qualität der

erhaltenen Reibungssignale ist neben den Materialeigenschaften auch vom Scan-Winkel

zwischen Spitze und Probe abhängig. Optimal ist ein Scan-Winkel, der senkrecht zum

Cantilever verläuft. Hierbei werden Kanten und kleinere Strukturmerkmale besser aufgelöst,

da der Cantilever an solchen Merkmalen eine stärkere seitliche Auslenkung erfährt.

Die Auflösung der Aufnahme eines Reibungssignals ist neben dem Scan-Winkel und den

Materialeigenschaften der Probe noch von weiteren Faktoren abhängig. Hierzu zählt zum

Beispiel die Spitzengeometrie, die Probeneigenschaften (Homogenität, Rauhigkeit) oder auch

Wasserfilme, die sich auf der Oberfläche ausbilden.

2.9.3.4 Rasterkraftmikroskopie im Tapping-Modus

Im so genannten Tapping - Modus (siehe Abbildung 2.10) wird ein besonderer Typ von

Cantilevern verwendet (Tapping Mode Cantilever, TM-Cantilever). Durch ein

piezokeramisches Element wird der Cantilever in Schwingung versetzt. Die Schwingung

erfolgt bei der Eigenfrequenz ω0 (typischerweise zwischen 50-500 kHz) und der

entsprechenden konstanten Amplitude.

Attraktive van-der-Waals-Wechselwirkungen sind in einem Abstand von 2 - 20 nm zur Probe

bestimmend. Im Tapping-Modus wird die Abhängigkeit des Van-der-Waals-Potentials vom

Abstand zur Abbildung der Oberflächentopographie ausgenutzt. Außerhalb des

Wirkungsbereiches des van-der-Waals-Potentials ist die durch Schwingung des Cantilevers

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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erzeugte Amplitude durch die Federkonstante des Cantilevers und die verwendete

Anregungsenergie bestimmt. Wird die Spitze an die Oberfläche angenähert, so überlagert sich

das Van-der-Waals-Potential mit dem Spitzenpotential.

Abb.2.15: Schematischer Aufbau eines Rasterkraftmikroskops im Tapping-Modus. Diese Art der

Mikroskopie ist hochempfindlich und fast vollkommen kontaktfrei, da bei optimaler Einstellung der

Parameter nur eine sehr kurze und leichte Berührung mit der Probe stattfindet 108.

Dies führt zu einer Erniedrigung der Resonanzfrequenz und zur Abnahme der Amplitude der

Schwingung bei ω0. Die Schwingungsamplitude stellt also ein Maß für den Abstand der

Spitze zur Probe dar. Der von dem Cantilever reflektierte Laserstrahl bewegt sich auf der

Photodiode mit der Schwingungsfrequenz des Cantilevers auf und ab. Diese Auslenkung ist

ein Maß für die Schwingungsamplitude. Das erhaltene Signal ist das eigentliche Messsignal,

welches ständig mit einem vorgegebenen Messwert (engl. setpoint) verglichen wird. Die

Software berechnet aus der minimalen und maximalen Auslenkung auf der Photodiode die

RMS-Amplitude (root mean square amplitude) nach folgender Gleichung:

( ) ( )2

22 max,Signalmin,SignalAmplitudeRMS +=− (2.1)

Dieser Wert wird über bestimmte Parameter vor Beginn der Messungen vom Nutzer des

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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Gerätes eingestellt (Sollwert - Setpoint). Ein Rückkopplungsmechanismus hält diesen Wert

während der Messung über Regulierung eines piezokeramischen Elements konstant. Die

hieraus resultierenden Steuersignale des piezokeramischen Elements dienen der Software zur

Abbildung der Oberflächentopographie. Neben dem Höhensignal, welches über die

Schwingungsamplitude definiert ist, kann auch ein Phasensignal ausgewertet werden. Dieses

Signal gibt die Phasenverschiebung von der Schwingungsanregung und der real ausgeführten

Schwingung des Cantilevers wieder. Diese Phasenverschiebung hängt von verschiedenen

Eigenschaften der Probe ab (Zusammensetzung, Reibung, Härte, Adhäsionseigenschaft),

weshalb -wie im Lateralkraft-Modus des Kontakt-Modus- unterschiedliche Materialien bei

gleicher Höhe unterschieden werden können. Wie das Höhen- bzw. Reibungssignal im

Kontakt-Modus können auch Höhen- und Phasensignal zur gleichen Zeit an der gleichen

Probenstelle gemessen werden, in dem z.B. das Höhensignal beim trace und das Phasensignal

beim retrace gemessen wird. Da bei der Rasterkraftmikroskopie im Tapping-Modus

Scherkräfte eliminiert und vertikal wirkende Kräfte minimiert werden, ist diese Methode

besonders für die Untersuchung von empfindlichen Materialien - wie biologische Oberflächen

- oder instabilen Oberflächenstrukturen (z.B.: kleine Partikel) von Interesse 106,112-115. Eine

Veränderung der Probe durch die Messung kann aber auch bei dieser Methode nicht

ausgeschlossen werden 116. In Abbildung 2.16 ist beispielhaft ein AFM Bild dargestellt bei

dem eine strukturierte Proteinschicht in dest. Wasser mit Tapping-AFM gemessen wurde. Das

zugehörige Linienspektrum zeigt sehr schön die zur Strukturierung gehörenden Dimensionen.

Abb.2.15: Darstellung eine strukturierten Proteinfilms mittels Tapping-AFM in dest. Wasser. Im

Topgraphiemoduskann sehr schön die laterale Strukturierung der Oberfläche erkannt werden,

während im Linienspektrum (links) die Höhe der gemessenen Struktur ermittelt werden kann.

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

- 37 -

2.9.4 Infrarot-Spektroskopie

Bei Bestrahlung mit infrarotem Licht gehen Moleküle durch Absorption in einen höheren,

angeregten Zustand über, indem es zu Schwingungen angeregt wird. Diese Absorption findet

nur dann statt, wenn sich das Dipolmoment der betreffenden Molekülgruppe während der

Schwingung ändert. Die Intensität der Absorptionsbande ist dabei proportional zur Änderung

des Dipolmoments relativ zum Gleichgewichtszustand. Bei Deformations- und

Biegeschwingungen geschieht diese Änderung durch Modifizierung der Bindungswinkel, bei

Streckschwingungen hingegen durch Veränderung der Bindungslängen. Die Frequenz, bei der

eine Schwingung absorbiert, hängt von vielen verschiedenen Faktoren ab. Diese sind die

Kopplung mit anderen Molekülschwingungen, die reduzierten Massen der beteiligten Atome,

die Bindung zu Nachbaratomen, die Kopplung mit anderen Molekülschwingungen und

natürlich die Art der Bindung selbst (z.B.Kraftkonstante). Infrarot-Vibrationsspektren sind

daher sehr sensitiv gegenüber der chemischen Umgebung einer Bindung oder eines Moleküls

und daher auch sehr selektiv.

Vibrationspektren selbst-assemblierter Monolagen auf Metalloberflächen unterliegen neben

den schon erwähnten Kriterien noch der Oberflächenauswahlregel. Diese Auswahlregel

besagt, dass in der Nähe elektrisch leitender Oberflächen -wie z. B. einer Goldoberfläche- alle

Feldkomponenten des anregenden elektrischen Feldes, die parallel zur Oberfläche orientiert

sind, unterdrückt werden. Die einfallende anregende p-polarisierte IR-Lichtwelle kann in

einen tangentialen und einen normalen Anteil aufgespalten werden. Tangential zur Oberfläche

wirkende elektrische Felder führen zur Verschiebung von oberflächennahen Ladungsträgern,

bis das äußere tangentiale Feld kompensiert ist. Der normale Anteil des elektrischen Feldes

erzeugt ebenfalls eine Spiegelpolarisation, die sich allerdings zum äußeren Feld konstruktiv

addiert. Vornehmlich werden bei der IR-Spektroskopie an einer leitenden Oberfläche

Molekülschwingungen mit einem zur Oberfläche senkrechten Übergangsdipolmoment

angeregt. Ein Volumenspektrum zeigt daher die vollständige Anzahl an Absorptionsbanden,

während im zugehörigen Oberflächenspektrum aufgrund der zuvor diskutierten Effekte

einzelne oder mehrere Absorptionsbanden fehlen können.

Insgesamt besitzen n-atomige gewinkelte moleküle 3n-6 Freiheitsgerade der Bewegung. Bei

Proteinen 8und anderen komplexeren Biomolekülen) bedeutet dies eine sehr große Anzahl

einzelner Schwingungsbanden. Somit ist eine Unterscheidung einzelner Schwingungen nur

schwer möglich. Es treten trotzdem eine Reihe charakteristischer Banden auf, aus denen man

Informationen über Struktur und Wechselwirkungen des Proteins sammeln kann (Amid-A-

Bande und Amid-I bis Amid-IV Bande). Die bestuntersuchteste Bande ist dabei die Amid-I-

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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Bande (~1650cm-1), der im Wesentlichen die C=O-Streckschwingung zugrunde liegt. Da die

C=O- und N-H-Gruppen der proteine an der Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen

in der α-helikalen und β-Faltblatt-Struktur beteiligt sind, stellt das Peptidrückgrat eine Reihe

gekoppelter Oszillatoren dar. Damit hängen frequenz und Bandenform der IR-Banden stark

von der Sekundeärstruktur des Proteins ab 117.

Die IR-Spektroskopie bietet zudem folgendem Vorteil: Im Gegensatz zu anderen

strukturaufklärenden Methoden kann auf den Einsatz von Sonden (z.B. ESR oder

Fluoreszenz-Mikroskopie) verzichtet werden, was sonst unter Umständen zu unerwünschten

Artefakten führen könnte.

2.9.5 Röntgen-Photoelektronenspektroskopie

Die Röntgen-Photoelektronenspektroskopie (X-ray photo electron spectroscopy, XPS) beruht

auf dem erstmals von Einstein richtig gedeuteten photoelektrischen Effekt. Setzt man eine

Probe elektromagnetischer Strahlung genügend hoher Energie aus, so werden Elektronen

(Photoelektronen) aus dem Material herausgelöst. Bei ultraviolettem Licht (UPS) werden nur

Valenzelektronen herausgelöst, bei Röntgenstrahlung (XPS; Photonenenergien: AlKα=1486,

6eV; MgKα=1253,6eV) ist die Energie hingegen ausreichend, um Kernelektronen ins

Vakuum zu beschleunigen. Das Loch in der inneren Schale wird durch ein Elektron aus einer

äußeren Schale gefüllt. Die bei diesem Prozess frei werdende Energie wird als

Röntgenstrahlung oder durch Emission eines Auger–Elektrons, welches zu charakteristischen

Auger–Peaks führt (AES), abgegeben. Mit einem Analysator wird die kinetische Energie

(Ekin) der Photoelektronen bestimmt, die Auflösung wird dabei von der Passenergie (Epass) des

Analysators beeinflusst. Über Gleichung 2.2 kann dann die Bindungsenergie (EB) der

Elektronen berechnet werden:

Ekin = hν − EB − eφ; mit φ=Austrittsarbeit (2.2)

Da die Bindungsenergien charakteristisch für jedes Element sind, kann man die chemische

Zusammensetzung einer Probe analysieren. Ausserdem können auf Grund der chemischen

Verschiebung der Signale 118 Aussagen über die chemische Umgebung eines Atoms getroffen

werden. Neben der rein qualitativen Analyse ist es auch möglich, die quantitative

Zusammensetzung einer Probe (Stöchiometrie) zu berechnen. Dies kann über die Auswertung

der Intensitäten, dIA, geschehen:

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Kapitel 2 Theoretische Grundlagen

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dIA∝TA*σA · nA(z) · e− (z/λe·cosΘ)dz. (2.3)

Die Anzahl der Atome in der Matrix ist mit nA bezeichnet; λe ist die mittlere freie Weglänge

der Elektronen 119 im jeweiligen Material. σ ist der Scofield-Faktor40, der den

Absorptionsquerschnitt des jeweiligen Orbitals wiedergibt, und TA ist die Apparatefunktion,

die u.a. von der Passenergie und der Messgeometrie abhängt. Werden Intensitäten ins

Verhältnis gesetzt, so sind die unter Vernachlässigung von TA erhaltenen Werte in der Regel

mit einem Fehler von 10 % – 20 % behaftet 120.

Um den Bedeckungsgrad des Substrats mit einem Adsorbat abzuschätzen, kann man die

Abschwächung eines Substratpeaks durch das Adsorbat untersuchen. Des Weiteren kann die

kann die Schichtdicke bestimmt werden, wenn man die jeweiligen Grenzintensitäten für dicke

Adsorbatschichten und zusätzlich den Bedeckungsgrad kennt.

2.9.6 Röntgenabsorptionsspektroskopie

Auch die Röntgenabsorptionsspektroskopie (Near Edge X-ray Absorption Fine Structure;

NEXAFS). beruht auf dem photoelektrischen Effekt. Bei der Anregung von Rumpfelektronen

eines Atoms durch Photonen mit Energien im Röntgenbereich enstehen die sogenannten

Röntgenkanten (K, L, M, ...). Die Wahrscheinlichkeit für die dafür verantwortliche Anregung

von Elektronen in das Vakuumniveau wird beschrieben durch den photoelektrischen

Röntgenabsorptionskoeffizienten:

µ≈Zx/E3; mit µ=Röntgenabsorptionsquerschnitt, Z=Ordnungszahl, E=Photonenergie (2.4)

Die Abhängigkeit von der Ordnungzahl des angeregten Atoms und der Energie der

anregenden Strahlung ist aus Gleichung (2.4) zu entnehmen. Die Untersuchung dieses

Absorptionskoeffizienten erlaubt Aussagen über die elektronische Struktur des Adsorbat-

Substrat-Systems sowie den Bindungscharakter und die geometrische Orientierung der

adsorbierten Moleküle.

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

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3 Die biologische Aktivität oberflächengebundener Mehr-

schichtensysteme: das Biotin- Streptavidin-Peroxidase System

Die starke Bindung zwischen Biotin und biotinbindenden Proteinen (z.B. Avidin, Streptavidin

oder anti-Biotin Antikörper) wird zum Aufbau supramolekularer Strukturen89, 90 benutzt. Die

kovalente oder nicht-kovalente Bindung von Biomolekülen (DNA121-124, Proteine/Enzyme 125-

127 wird in vielen Arbeitsgruppen angewandt und gilt als routinemäßiger Prozess für

analytische Anwendungen 128-130. In diesen Assays dient das Strepatvidin als “Andocklage“

für biotinylierte Analyte und/oder als System zur Signalvertärkung (siehe Abb.3.1). Dabei

werden die meisten Assays auch heutzutage noch im Volumen und nicht an der Oberfläche

durchgeführt. Die Herstellung biotinylierter Oberflächen bietet also die Möglichkeit, weitere

biotinylierte Moleküle an die Oberfläche zu binden, um Schritt für Schritt

Mehrschichtensysteme aufzubauen.

Abb.3.1: Schematischer Aufbau eines Mehrschichtsystems auf Basis der Streptavidin/Biotin-Bindung.

In diesem Fall wurde ein weiteres Protein mit einem Biotinanker versehen (biotinylierte

Meerrettichperoxidase) und an die bereits adsorbierte Streptavidinschicht angelagert.

Beim Aufbau solcher Mehrschichtensysteme kommt es neben der Bindung and die jeweilgen

Biotinmotive auch zu unspezifischen Bindungen der Biomoleküle untereinander oder an die

nicht biotinylierten Bereiche der Oberfläche. Die Kontrolle dieser unspezifischen Adsorption

ist ein wichtige Frage in der modernen Medizin, wie z.B. in der Zellkultivierung 131 oder der

Beschichtung von Implataten 132, 133. Oft wird dabei die total adsorbierte Menge an

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

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unspezifisch adsorbiertem Protein bestimmt (SPR 98, AFM 134, Fluoreszenz 35). Eine wichtige

Frage ist aber auch, ob unspezifisch adsorbierte Proteine ihre biologischen Funktionen

aufrechterhalten können. In den meisten Fällen führt die unspezifische Adsorption der

Proteine zur Denaturierung, wodurch die biologischen Funktionen verloren gehen sollten.

Eine Bestimmung der Aktivität unspezifisch adsorbierter Proteine ist also von großem

Interesse für die heutige Medizin.

Als Modellprotein wurde in dieser Arbeit eine Peroxidase gewählt (horse radish peroxidase,

HRP), da sowohl die Struktur als auch der enzymatische Mechanismus dieses Enzyms gut

bekannt sind 135. Des Weiteren sind Peroxidasen als Indikatorenzyme weit verbreitet (z.B.

ELISA Assays), wodurch alle benötigten Substanzen kommerziell erhältlich sind (z.B.:

SIGMA P9568 und T8665). Die enzymatische Aktivität wird dabei über eine Farbreaktion

nachgewiesen. Das farblose Chromogen 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) wird dabei von

der Peroxidase in ein blaues Zwischenprodukt (TMB Ladungstransfer-Komplex) überführt.

Nach Zugabe einer säureghaltigen (H2SO4) “Stoplösung” wird die enzymatische Reaktion

beendet und der Ladungstransfer-Komplex geht in einen gelben Farbstoff 3,3',5,5'-

Tetramethyl 1,1-4,4 Diimin) über, der im Photometer bei 450nm detektiert werden kann. Der

gesamte Reaktionsmechanismus 136 ist in Abbildung 3.2 dargestellt.

Abb.3.2: Mechanismus der Farbreaktion von TMB, die von der HRP katalysiert wird. Das TMB wird

oxidiert und es wird ein Ladungstransfer-Komplex (im Gleichgewicht zum entsprechenden Radikal-

Kation) erhalten. Die Zugabe von Säure führt zum Farbstoff Tetramethyldiimin 136.

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

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3.1 Präparation der Substrate

3.1.1 Substrate für die SPR-Messungen

D263T Dünnglas (Schott AG) mit den Dimensionen 10mmx10mmx0,3mm wurden mit abs.

Ethanol (Riedel de Haën) gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet. Anschließend

wurden die Glasscheiben in einen Metallverdampfer (Leybold Inficon XTC/2) eingebaut.

Dann wurde zuerst eine Lage von 12Å Titan mit einer Rate von 1 Ås-1 aufgedampft, damit die

Haftung des anschließend aufgedampften Goldfilms erhöht wird. Der Goldfilm wurde mit

einer Rate von 15Ås-1 aufgedampft, bis eine Schichtdicke von 485Å erreicht war. Die

Bedampfung erfolgte bei Raumtemperatur und einem Druck von 10-7 mbar.

Abb.3.3: Darstellung der in diesem Kapitel verwendeten Thiole. Die OH-Thiole wurden zum

verdünnen des Biotin-Thiols verwendet.

Nach dem Bedampfen wurden die Goldsubstrate zuerst mit Ethanol gewaschen und

anschließend für 48h in eine ethanolische Lösung eingelegt, welche aus einer Mischung OH-

und biotin-terminierten Thiol (s. Abbildung 3.3) bestand. Die Konzentration an Thiol wurde

konstant bei 1mM gehalten, während die relative Konzentration an Biotinthiol von 0 bis

100 Mol-% variiert wurde. Anschließend wurden die so präparierten Substrate mit abs.

Ethanol gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet. Anschließend wurden sie mit

doppelseitigen Klebeband (tape 415, 3M) auf Plastik-Chips (Biacore) fixiert. Auf diese Weise

wurden auch alle weiteren Oberflächenterminierungen (z.B. Oktadekanthiol, Abbildung 3.1)

hergestellt. Die Herstellung der Substrate sowie die Messungen erfolgten in Kooperation mit

Herrn Dr. Ch. Grunwald.

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

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3.1.2 Substrate für die AFM Messungen

Die Bedampfung und Präparartion der Goldsubstrate erfolgte wie in Kapitel 3.1.1

beschrieben. Anstelle der Glaswafer wurden polierte Siliziumwafer mit einer (100)

Oberflächenterminierung (Prolog Semicor LTD, Ukraine) benutzt. Vor dem Bedampfen

wurden diese mit abs. Aceton (Fluka) and Ethanol (Riedel-de Haën) gewaschen und im

Stickstoffstrom getrocknet. Das Titan wurde bis zu einer Dicke von 80Å mit einer Rate von

2Ås-1 aufgedampft; anschließend wurde eine Lage von 1200Å Gold mit einer Rate von

15Ås-1 aufgedampft. Die goldbeschichteten Siliziumwafer wurden in Stücke von

10mmx10mm geschnitten. Die Funktionalisierung und Herstellung der SAMs erfolgte über

Mikrokontaktstempeln (micro contact-printing, µCP).

3.1.2.1 Mikrokontaktstempeln (µCP)

Die im vorigen Abschnitt hergestellten Goldwafer wurden anschließend mittels µCP 137

lateral strukturiert. Wie im Kapitel 2.9.1 beschrieben, wurde ein Stempel aus

Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellt (siehe Abbildung 3.4). Für die vorliegende Arbeit

wurde ein Siliziumwafer als Master benutzt, dessen periodische Struktur aus Quadraten (3µm

Seitenlänge) besteht. Die Quadrate sind dabei in x- und y-Richtung jeweils 3 µm vom

nächsten Quadrat entfernt.

Abb.3.4: REM-Aufnahmen des verwendeten Stempeltyps. Die Stempelflächen sind“quadratisch“ und

besitzen eine Seitenlänge von 3µm. Die Stempel sind wegen der besseren Stabilität nur 800nm hoch.

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

- 44 -

Zum Stempeln wurde der PDMS-Stempel für 30s mit 30µl einer 1mM ethanolischen OEG(6)-

Thiollösung (Struktur siehe Abbildung 3.2) beladen. Der Überstand wurde vorsichtig mit

einem fusselfreien Tuch entfernt und der Stempel im Stickstoffstrom getrocknet.

Anschließend wurde der Stempel vorsichtig auf die Goldoberfläche gedrückt. Nach 90s wurde

der Stempel vorsichtig wieder entfernt und die Goldwafer mit abs. Ethanol gespült und unter

Stickstoff getrocknet. Anschließend wurden die Wafer für 90s in eine 1mM ethanolische

Lösung aus OH- und Biotinthiol (10% in Bezug auf das Biotinthiol) eingelegt.

Nach der Inkubation wurden die lateral strukturierten SAMs mit abs. Ethanol gewaschen und

im Stickstoffstrom getrocknet.

3.1.3 Substrate für die Aktivitätstests

Die Präparation der Substrate erfolgte wie in Abschnitt 3.1.1 beschrieben. Anstelle der D263T

Glasscheiben wurde konventionelles Mikroskopieglas (BK7, Menzel, 76mmx76mmx1mm)

verwendet. Nach dem Bedampfen wurden die Scheiben in Stücke von 2mmx2mmx10mm

geschnitten und wie im Kapitel 3.1.1 beschrieben inkubiert. Nach der Inkubation wurden die

Proben mit abs. Ethanol gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet.

3.2 Oberflächenplasmonenresonanz-Messungen Für die SPR-Messungen wurde ein kommerzielles Spektrometer verwendet (Biacore 3000).

Für die Experimente wurde eine 200nM Lösung von Streptavidin in einem Phosphat-Puffer

verwendet. Der Phosphatpuffer bestand dabei aus 0,1 M K2HPO4 (SIGMA), 0,1 M KH2PO4

(SIGMA), 300 mM NaCl (Baker). Der pH wurde mit NaOH und HCl auf 6,0 eingestellt.

Abb. 3.5: Darstellung des für die Peroxidse verwendeten Biotinankers 6-(6-(5-(hexahydro-2-oxo-1H-

thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamido)hexanamido)hexanoic acid (Trvialname: Biotinamidocaproyl).

Zur Herstellung der Lösungen wurde hochreines Wasser aus einem MilliQ-System

verwendet. Der Puffer wurde zudem nach Fertigstellung nochmal durch sterile Filter

(Porengröße: 0,2µm) gefiltert, anschließend entgast und bis zur Verwendung bei 4°C gelagert.

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

- 45 -

Die SPR Experimente wurden bei Rauntemperatur durchgeführt. Das zum Einsatz

gekommene Streptavidin ist kommerziell erhältlich (Invitrogen) und enthält einen

Fluoreszenzmarker (Alexa-fluor-488). Die verwendete biotinylierte Meerrettichperoxidase ist

ebenfalls kommerziell erhältlich (SIGMA; P-9568). Der Biotinanker besteht bei dieser

Peroxidase aus einem Biotinamidocaproyl.

3.2.1 Variierung der Biotinthiol-Konzentration

Die Adsorption des Streptavidins erfolgt wie bereits erwähnt an einen SAM, der aus einer

Mischung von Biotinthiol und 11-mercapto-Undekanol (OH-Thiol) besteht. Daher wurde

zuerst untersucht, welches Mischungsverhältnis für die Adsorption des Streptavidins optimal

ist. Hierzu wurden Proben hergestellt, die unterschiedliche Konzentrationen an Biotinthiol

enthielten. Anschließend wurde Streptavidin für 900s inkubiert. Die relative Konzentration an

Biotin wurde dabei von 0 bis 100mol-% variiert. In Abbildung 3.3 sind die Ergebnisse dieser

Messungen zusammengefasst. Eine optimale Mischung ergibt sich somit bei 5% Biotinthiol

0 20 40 60 80 100

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

SA

Ads

orpt

ion

[RU

]

SA A

dsor

ptio

n [n

g/cm

2 ]

Mol% - Biotinthiol

Abb.3.6: Adsorption von Streptavidin (c=200nM) auf unterschiedlich biotinylierte SAMs nach einer

Inkubationszeit von 15min. Die Fehlerbalken zeigen die Streuung von je 4 Messungen. Die

Biotinmenge bezieht sich auf eine binäre Lösung mit dem OH-Thiol.

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

- 46 -

und 95% OH-Thiol. Eine weitere Erhöhung der Biotinthiol-Konzentration führt zu einer

verminderten Adsorption an Streptavidin. Umgekehrt führt auch eine Verminderung der

relativen Biotinthiol-Konzentration zu einer Verringerung an adsorbiertem Streptavidin. Der

erste Fall (Biotin-Mol-% >5%), ist in der Literatur bekannt und wird sterischen Effekten

zugeordnet 138. Der zweite Fall (Biotin-Mol-% <5%) führt dazu, dass die Bindungsstellen für

das Streptavidin mehr und mehr verarmen. Dies führt dann zu der verminderten (spezifischen)

Adsorption. Im Bereich der niedrigen Konzentration an Biotinthiol ist die Menge an

unspezifischer Adsorption stark abhängig von den Bedingungen unter denen die Experimente

stattgefunden haben. Dabei spielt sowohl das Handling (Staubpartikel oder andere kleinste

Verunreinigungen der Lösungen oder der verwendeten Geräte), als auch die Inkubationszeit

der SAM-Herstellung eine entscheidende Rolle. Bei geringen Inkubationszeiten ist die

Ordnung im SAM geringer, wodurch die unspezifische Adsorption verstärkt wird (5min:

(24,9±0,8)ng/cm2; 2 Tage: (4,6±1,1)ng/cm2)139.

Die Kontrolle der Streptavidin-Adsorption über die relative Konzentration an Biotinthiol ist

nicht trivial und es müssen unangenehme Nebeneffekte beachtet werden.

Zuerst einmal stehen die Ergebnisse in guter Übereinstimmung mit in der Literatur

veröffentlichten Studien 138, in denen ähnliche Ergebnisse erhalten wurden.

Aus dem in Abbildung 3.3 eingezeichneten linearen Fit (gepunktete Linie; R2=0,975) kann

eine Veränderung der Adsorption von 153ng/cm² pro Mol-% Biotinthiol abgeleitet werden.

Dieser hohe Wert zeigt eindeutig, dass eine genaue Kontrolle der total adsorbierten

Streptavidin-Menge über die Variation der relativen Biotinthiol-Konzentration nicht möglich

ist. Schon kleine Änderungen der gewünschten Biotinthiol-Konzentration durch z.B.

Verdampfen des Lösungsmittels oder Adsorption von Molekülen an die Gefäßwand führen zu

starken Veränderungen der total adsorbierten Menge an Streptavidin. Hier wird ein

allgemeines Problem deutlich, wenn mit stark verdünnten Lösungen gearbeitet wird. Der

Verlust von Molekülen z.B. durch unspezifische Adsorption (z.B. an Gefäßwände),

Staubpartikel und Unreinheiten ist schwer zu quantifizieren.

Vorangegangene Arbeiten 140 zeigten zudem, dass das molare Verhältnis von koadsorbierten

Thiollösungen nicht immer mit den molaren Gleichgewichtsverhältnissen der gebildeten

SAMs übereinstimmmen.

3.2.2 Kontrolle der Streptavidinbelegung

Als Alternative zur Variierung der Biotinthiol-Konzentration wurde versucht, die Adsorption

über Diffusion (konzentration der Lösung bzw Inkubationszeit) zu kontrollieren. Hierzu

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

- 47 -

wurde die Konzentration an Biotinthiol konstant gehalten. Die Konzentration der

Streptavidinlösung (25 und 50 nM) sowie die Inkubationszeit wurden variiert. Zur Kontrolle

der Bindung wurden folgende Experimente durchgeführt: Als „Positiv“-Kontrolle wurde die

biotinylierte Peroxidase (bHRP) direkt auf die mit Streptavidin inkubierte Oberflche gegeben;

als „Negativ“-Kontrolle (unspezifische Adsorption der bHRP) wurde die mit Streptavidin

beladene Oberfläche zuerst mit D-Biotin abgesättigt und anschließend die bHRP inkubiert.

Zusätzlich wurde die unspezifische Adsorption von Streptavidin und bHRP auf einem reinen

OH-terminierten SAM charakterisiert.

3.3.2.1 Echt-Zeit Adsorptionskinetik von Streptavidin

Die Bindung von Streptavidin an einen Biotinthiol-SAM ist in Abbildung 3.4 dargestellt. Es

ist schnell ersichtlich, dass die Adsorption ein Prozess mit 2 Phasen ist. Der erste Teil der

Streptavidin-Adsorption ist stark linear. Dieser lineare Teil geht dann in einen exponentiellen

Teil über, indem die Adsorption immer mehr abnimmt, bis die Oberfläche vollständig

abgesättigt ist. In Langzeitexperimenten wurden die mit Streptavidin beladenen Oberflächen

mit Puffer gespült (Laufzeit >1Stunde). Hierbei ging ein kleiner Teil der adsorbierten

Moleküle auf Grund von Dissoziation wieder verloren (Mdis≈2,5%).

Tab.3.1: Vergleich des 1-und 2-fach exponentiellen Fits für die nicht lineare Phase der Streptavidin-

Kinetik. Vor dem Fitten wurde die Kinetik normiert und besitzt daher keine Dimension mehr.

1-fach exponentieller Fit, R2 = 0,873 y = a * (1 – exp(-b*x)) a 0,9350 +/- 0,0028 b/s-1 0,0212 +/- 0,00004 2-fach exponentieller Fit, R2 = 0,997 y = a*(1-exp(-b*x)) + c*(1-exp(-d*x)) a 0,5397 +/- 0,0031 b/s-1 0,0814 +/- 0,0011 c 0,4613 +/- 0,0025 d/s-1 0,0062 +/- 0,0001

Die lineare Phase zeigt ein diffusionslimitiertes Verhalten für die Strepatividin-Adsorption.

Die Bindung des Strepatavidins erfolgt im Vergleich zur Diffusion des Streptavidins in der

Lösung sehr schnell. Dies führt zu einem Bereich, in dem die Streptavidin-Konzentration

verarmt ist. Dies wiederum bedeutet, dass die Adsorption über den Massentransfer

kontrolliert wird. Im nicht linearen Teil der Kinetik liefert erst ein 2-fach exponentieller

Ansatz einen guten Fit. Tabelle 3.1 fasst die 1- und 2-fach exponentiellen Ansätze zusammen.

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

- 48 -

Dabei ist zu beachten, dass die Kinetikdaten zuerst normiert wurden und daher dimensionslos

sind.

Abb.3.7: Detaillierte Analyse der 2 Phasen der Adsorptionskinetik von Strepatvidin (5% Biotinthiol,

200nM Streptavidin). Vor dem Fitten wurde die Kinetik normiert. Die lineare Phase macht 80% der

Kinetik aus, während die restlichen 20% ein 2-fach exponentielles Verhalten zeigen.

Als Startpunkt für den exponentiellen Fit wurde der Punkt gewählt, der als erstes vom

linearen Fit abwich. Diese zweite Phase ist entsprechend schwierig zu interpretieren. Es ist

klar, dass sie durch zwei verschiedene Prozesse bestimmt wird, die beide verschiedenen

Zeitkonstanten folgen. Die Prozesse selbst eindeutig zu bestimmen, ist aus den Kinetikdaten

allerdings nicht möglich. Im einfachsten Fall kann man aber annehmen, dass es sich bei den

beiden Prozessen zum einen um die spezifische Adsorption des Streptavidins an die

Biotinthiole und zum anderen die unspezifische Adsorption des Streptavidins an die OH-

terminierten Bereiche der Oberfläche handelt.

Zusammengefasst kann die Adsorption durch das folgende einfache Modell dargestellt

werden: 80% der Streptavidin-Adsorption folgen einem linearen Verlauf mit einer

Diffusionsrate von 0,0049s-1. 20% der Streptavidin-Adsorption folgen einem 2-fach

exponentiellen Verlauf. Während die Amplituden des nicht linearen Fits fast gleich sind (0,54

zu 0,46; Parameter a und c aus Tabelle 3.1 für den 2-fach exponentiellen Fit), unterscheiden

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

- 49 -

sich ihre Diffusionsraten sehr stark (0,081s-1 zu 0,006s-1; Parameter b und d aus Tabelle 3.1

für den 2-fach exponentiellen Fit). Nimmt man nun an, dass die spezifische Adsorption

schneller verläuft als die unspezifische, kann der erste Term der spezifischen und der zweite

Term der unspezifischen Adsorption zugeteilt werden.

Dies ist allerdings nur ein sehr einfaches Modell, da es weitere Phänomene gibt, die mit der

unspezifischen Adsorption einhergehen (z.B. Denaturierung oder andere strukturelle

Umordnungen) und ebenfalls sehr schnell verlaufen 5, 141. Eine genaue Erklärung der

-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 35000

102030405060708090

100110120130140150

Puffer

Streptavidin

2

1d

1c1b

1a

200 nM Streptavidin 100 nM Peroxidase

Ads

orpt

ion

[RU

]

Zeit [s]

Abb.3.8: Die obere Kurve zeigt die unspezifische Adsorption von Streptavidin auf einem SAM aus

OH-Thiol (1a-1c) und die Bindung von bHRP auf dem unspezifisch adsorbierten Streptavidin (1d). In

der unteren Kurve (2) ist die unspezifische Adsorption von bHRP auf dem OH-Thiol SAM dargestellt.

exponentiellen Terme, die mit den verschiedenen Adsorptionsphänomenen einhergehen, kann

daher nicht dargelegt werden. Das dargestellte Modell liefert eine gute Übereinstimmung mit

den Adsorptionskinetiken für die unspezifische Adsorption (siehe Abb.3.8) und den

Ergebnissen aus den AFM-Experimenten (siehe Kapitel 3.2).

3.3.2.2 Diffusionslimitierte Streptavidinbeladung

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

- 50 -

Abbildung 3.9 zeigt die Ergebnisse für die diffusionslimitierte Adsorptionskinetik des

Streptavidins. Die geringen Oberflächenbeladungen von 325-1273RU wurden über Lösungen

0 200 400 600 800

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

m(ads)

Streptavidin 200 nM Streptavidin 50 nM Streptavidin 25 nM

325

641

97412731448

18942072

Ads

orpt

ion

[RU

]

Zeit [s]

2320

Abb.3.9: Diffusionslimitierte Adsorption des Streptavidins auf den biotinylierten SAM. Die

Immobilisierungsdichte kann kontrolliert werden; m(ads) ist dabei die total adsorbierte Menge an

Protein.

erhalten, die eine Konzentration von 25nM Streptavidin enthielten. Die Inkubationszeit wurde

dabei von 34-109sek. variiert. Die höheren Streptavidinbeladungen von 1448-2072RU

wurden mittels 50nM-Lösungen von Streptavidin erhalten. Auch die Inkubationszeiten

wurden auf 102-170sek erhöht. Zum besseren Vergleich wird in Abbildung 3.6 die bereits

besprochene Adsorptionskurve (cStrep=200nM), die zur maximalen Beladung führt, nochmals

gezeigt. Alle Kinetiken zeigen einen unterschiedlichen Verlauf während der Adsorption. Dies

ist auf Instabilitäten der sehr gering konzentrierten Lösungen zurückzuführen. Auch wenn für

jedes Experiment (Zeitskala: 1-2 Stunden) die Proteinlösung frisch angesetzt wurde, kommt

es zur Adsorption der Proteine aus den gering konzentrierten Lösungen an die Gefäßwände

der verwendeten Geräte. Ebenfalls verdampft ein Teil des Lösungsmittels. Obwohl diese

beiden Phänomene gegenteilige Effekte haben, heben sie sich nicht genau gegenseitig auf. Es

konnte beobachtet werden, dass sich die Verarmung der Proteinkonzentration (durch

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

- 51 -

Adsorption an Gefäßwände) stärker auswirkt als der Effekt der Aufkonzentrierung durch

Verdampfen des Lösungsmittels. Auch für die beiden Kurven mit der größten Beladung an

Streptavidin kann am Ende der Streptavidin-Injektion eine Abweichung vom linearen

Verhalten beobachtet werden. In beiden Fällen wird die Adsorptionsgeschwindigkeit gesenkt,

da es immer weniger freie Bindungsstellen gibt, die erst noch gefunden“ werden müssen,

während vorher jedes Molekül Streptavidin sofort an die Oberfläche binden konnte.

Effektiv kann bei entsprechend vorsichtigem Handling die Beladungsmenge von Strepavidin

an der Oberfläche durch entsprechende Auswahl der Streptavidin-Konzentration und der

Inkubationszeit mit einer Genauigkeit von weniger als 5% bestimmt werden.

3.2.3 Unspezifische Adsorption der Proteine auf einem OH-terminierten SAM

Die unspezifische Adsorption der verwendeten Proteine auf einem OH-terminierten SAM

wurde bereits dargestellt (Abbildung 3.5; Streptavidin 1a-1c; bHRP 2). Auch die Adsorption

von bHRP auf einem mit nativem d-Biotin gesättigten Streptavidinfilm ist in Abbildung 3.5

(1d) zu sehen. Die Inkubationszeit der einzelnen Schritte betrug dabei immer 5 Minuten. Die

Mehrfachinkubation im Falle des Streptavidins wurde durchgeführt, um auch die

unspezifische Adsorption von Streptavidin auf Streptavidin zu zeigen. Die

Gesamtinkubationszeit ist dabei genauso lang (15min) wie für die Experimente der

spezifischen Adsorption von Streptavidin auf dem 5%-igen Biotinthiol SAM (siehe auch

Abbildung 3.4). Die Peroxidase wurde dann für 4 Minuten injiziert. Die beobachtbare

unspezifische Adsorption der beiden Proteine ist schwach (Mads≤10RU), aber dennoch

deutlich erkennbar.

3.2.4 Das Streptavidin/bHRP-System

Die unspezifische Adsorption der biotinylierten Peroxidase auf die OH-terminierten Bereiche

der Oberfläche kann durch die Stärke der Streptavidinbelegung beeinflusst werden.

Desweiteren kann die biotinylierte Peroxidase auch unspezifisch direkt auf die

Streptavidinschicht adsorbieren. beide Fälle wirken sich auf die Adsorptionskinetik der

biotinylierten peroxidase aus, was im folgendem näher betrachtet werden soll.

3.2.4.1 Adsorption der Peroxidase

Die Kinetik für die Adsorption der Peroxidase auf verschieden starken Streptavidin-

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

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Adsorbatschichten ist in Abbildung 3.7 gezeigt. Die Adsorption der Peroxidase (c=100nM)

-100 0 100 200 2000 2200 2400

0

200

400

600

800

1000

81175284358430

735740

bHR

P-A

dsor

ptio

n [R

U]

Zeit [s]

896956

800793

480

413320

19696

-6%-8%-7%

-10%-13%-11%-11%-16%

Abb.3.10: Adsorption der bHRP (c=100nM) auf verschieden prä-immobilisierte Mengen an

Streptavidin. Mit steigender Streptavidinmenge an der Oberfläche steigt auch die Menge der

adsorbierten biotinylierten Peroxidase. Ein Teil unspezifisch adsorbierter bHRP kann durch Spülen

wieder von der Oberfläche entfernt werden.

verläuft schnell und ist diffusionslimitiert. Diese Diffusionslimitierung kann am linearen

Verlauf im ersten Teil der Adsorptionskurve erkannt werden (vgl. Abschnitt 3.3.2.1). Der

Sättigungsbereich wird bereits 9-56sek nach der Injektion der biotinylierten Peroxidase-

Lösung erreicht. Im Anschluss an die Sättigung - insbesondere bei den Experimenten mit

hoher Dichte an oberflächengebundenem Streptavidin - geht ein gewisser Teil der

gebundenen biotinylierten Peroxidase wieder in Lösung. Auch noch nach 30 Minuten kann

diese Desorption beobachtet werden.

3.2.4.2 Unspezifische Adsorption der biotinylierten Peroxidase

Um die unspezifische Adsorption der biotinylierten Peroxidase (bHRP) auf Streptavidin zu

charakterisieren wurde bHRP für 4 Minuten auf eine Streptavidinschicht adsorbiert. Die

Streptavidinschicht wurde vorher mit nativem D-Biotin gesättigt (2 Injektionen zu je 1min).

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Das Ergebnis dieser Messungen ist in Abbildung 3.11 dargestellt. Die Säulendiagramme Abb.3.11: Biotinylierte SAMs (5% Biotinthiol) wurden diffusionslimitiert mit vier verschiedenen Mengen

an Streptavidin beladen (Säulendiagramme). Anschließend wurden die Biotinbindungstaschen mit

nativem D-Biotin gesättigt (Daten nicht gezeigt). Zum Schluss wurden die Streptavidinlagen noch mit

100nM Peroxidase-Lösung inkubiert (eingefügtes Liniendiagramm).

zeigen die verschiedenen Mengen an Streptavidin, die an die Oberfläche adsorbiert wurden.

Das eingefügte Liniendiagramm zeigt das Ergebnis für die anschließende Inkubation der

Peroxidase auf die mit D-Biotin geblockte Strepatvidin-Oberfläche. Die Adsorption der bHRP

ist schwach, aber mit bis zu 13RU deutlich messbar.

3.2.4.3 Korrelation zwischen Streptavidin und biotinylierter Peroxidase

Neben den kinetischen Daten kann auch das molekulare Verhältnis zwischen dem

Streptavidin und der bHRP berechnet werden, indem man die maximal adsorbierten Mengen

aus den Adsorptionskurven berechnet und miteinander vergleicht. In Abbildung 3.9 wurde die

bHRP-Adsorption gegen die Streptavidin-Adsorption aufgetragen. Für die kleinsten 5

Wertepaare der bHRP-/Streptavidin-Adsorption ergibt sich ein linearer Fit mit einer Steigung

von dy/dx=0,326. Die höchsten 4 Wertepaare ergeben einen linearen Fit mit einer Steigung

von dy/dx=0,536. Aus den Steigungen kann ein Verhältnis gebildet werden (siehe Abbildung

3.8). Zieht man dann noch die Massen der einzelnen Proteine hinzu (Streptavidin 60 kDa und

-100 0 100 200 300 400-50

0

50

100

150

200

250

300

350

400

1 2 3 4

400

800

1200

1600

2000

2400

2800

Experiment

Imm

obili

sier

tes

Stre

ptav

idin

4321

bHR

P-A

dsor

ptio

n [R

U]

Zeit [sek]

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

- 54 -

Peroxidase 44 kDa), kann man die genaue Anzahl und damit das molare Verhältnis der

miteinander interagierenden Protein-Moleküle ausrechnen. Für die geringeren

Konzentrationen ergibt sich ein Wert von 4 Molekülen bHRP zu 9 Molekülen Streptavidin,

was einem Verhältnis von 1:2,25 entspricht. Für die höheren Konzentrationen ergibt sich,

dass 3 Moleküle der bHRP mit 4 Molekülen Streptavidin interagieren,

0 500 1000 1500 2000 2500

0

200

400

600

800

1000

=> n(Perox.) / n(SA) = 4 / 9

dy/dxHIGH = 0,5395

bHR

P-A

dsor

ptio

n [R

U]

Streptavidin-Adsorption [RU]

dy/dxLOW = 0,326

=> n(Perox.) / n(SA) = 3 / 4

Abb.3.12: Die spezifische bHRP/Streptavidin-Adsorption wurde gegen die Menge an

oberflächengebundenem Streptavdin aufgetragen.

was einem Verhältnis von 1:1,3 entspricht. Das Interaktionsverhältnis ändert sich von den

geringen zu den höheren Adsorptionspaaren. Dies weist auf eine Reorientierung der

biotinylierten Peroxidase hin, da die Peroxidase selbst ein asymmetrisches Molekül ist.

3.2.4.4 Diskussion

Die biotinylierte Peroxidase adsorbiert unter den gewählten Inkubationsbedingungen schnell

und sehr selektiv an die bereits an der Oberfläche verankerten Streptavidine. Das SPR-Signal

nimmt nach beendeter Inkubation der Peroxidase geringfügig ab; dies kann von mehreren

Phänomenen herrühren, welche im Folgenden besprochen werden.

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

- 55 -

Zuerst einmal könnte die Interaktion zwischen biotinylierter Peroxidase und Streptavidin

teilreversibel sein. Diese Möglichkeit fällt allerdings aus folgenden Gründen nicht ins

Gewicht: Die Biotinbindung besitzt Halbwertszeiten in der Größenordnung mehrerer Tage

(Literatur: 200 Tage in Lösung 89); hierdurch liegt das Gleichgewicht der Kopplungsreaktion

stark auf der Seite der Biotin Bindung. Nur leicht gebundene Proteinteilchen sollten also

innerhalb weniger Sekunden dissoziieren und nicht in einem Zeitkorridor von 30 Minuten.

Des Weiteren muss man beachten, dass die Peroxidase nicht nur an einer Stelle, sondern an

mehreren Stellen mit dem Biotinanker konjugiert ist (im Mittel an 2,25 Stellen). Diese Stellen

sind auf Grund der Natur des Mechanismus, mit dem der Anker an die Peroxidase bindet

- Bindung an alle freien Aminogruppen (wie Seitenketten der Aminosäure Lysin) - rein

statistisch verteilt. Als Ergebnis dieser statistischen Verteilung kann nicht mit einem

einfachen Interaktionsmechanismus gerechnet werden. Die multiplen Botinylierungsstellen

sorgen nicht nur für eine größere Anzahl an Bindungsmöglichkeiten, sondern auch zu

kinetisch langsamen Reorientierungen der bHRP an der Oberfläche. Solche Reorientierungen

können zu kompakteren Strukturen führen, was dazu führen kann, dass sich das SPR-Signal

verkleinert 142. Dieser Mechanismus wird durch die molaren Verhältnisse bestärkt. Hier

findet mit dem Übergang zu höheren Konzentrationen eine Veränderung des Verhältnisses

von 1:2,25 zu 1:13 bezogen auf die Peroxidase statt. Da die unspezifische Adsorption sehr

klein ist, muss die Peroxidase eine strukturelle Veränderung (z.B. in der Packungsdichte)

vollziehen, wenn sie auf den höheren Streptavidinkonzenztrationen adsorbiert.

3.2 Rasterkraftmikroskopie

Abbildung 3.13 zeigt die Ergebnisse für die AFM-Messungen an einem strukturierten SAM.

Das erste Bild (Abb.3.13-A) zeigt die strukturierte SAM-Oberfläche, bevor Proteine inkubiert

wurden. Da im Topographie-Modus kein signifikanter Höhenunterschied zwischen den

verschiedenen Thiolen gemessen werden konnte, wurde das Bild im Phasen-Modus

aufgenommen. Das Phasenbild zeigt deutlich die Bereiche unterschiedlicher

Thiolfunktionalisierungen des OEG(6)-Thiols (Quadrate) und des 10%-igen Biotinthiols

(Stege). Nach der Inkubation mit Streptavidin (Abb.3.13-B1) können die biotinylierten

Bereiche der Oberfläche im Topographie-Modus deutlich erkannt werden. Die Inkubation mit

der bHRP (Abb.3.13-C1) führt zu einer weiteren Änderung der Steghöhe. Die laterale

Struktur, die über das µCP hergestellt wurde, kann also über den Gesamten

Inkubationsmechanismus gut nachvollzogen werden. Es gibt keine unspezifische Adsorption

der Proteine auf den mit OEG(6)-Thiol inkubierten Bereichen. Zusätzlich können auf Grund

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

- 56 -

der lateralen Strukturierung die Höhen der absorbierten Proteinmonolagen charakterisert

werden. Die Höhenmessungen (cross section) liefern für das Streptavidin (Abb.3.13-B2) eine

Abb.3.13: A) Phasenbild der Oberfläche nach Inkubation mit dem OEG(6)-Thiol (helle Quadrate) und

dem 10%-Biotinthiol (dunkle Stege). B1) Topographiebild nach Inkubation mit Streptavidin.

C1) Topgraphiebild nach Adsorption der bHRP auf dem Streptavidin. Der Höhenkontrast verbessert

sich mit jedem Schritt der Proteinadsorption, was in den Bildern B2 (Streptavidin) und C2 (bHRP)

dargestellt ist.

Höhe von (42.2±3)Å. Dieses Ergebnis stimmt mit Messungen der Kristallstruktur des

Streptavidins143 (43-45Å) überein. Nach der Peroxidase Inkubation (Abb.3.13-C2) steigt die

Höhe der Gesamtproteinlage auf (75.5±4)Å an. Der Unterschied zur Höhe der

Streptavidinlage beträgt demnach (33.3±3)Å. Dieses Ergebnis stimmt mit der Länge der

kürzeren Seite der Peroxidase (die aus Daten der Kristallstrukturanalyse bekannt ist143 (40-

42 Å)) überein.

Die AFM-Bilder zeigen nur sehr wenige Defekte in den adsorbierten Proteinlagen. Defekte

sind hierbei Stellen, an denen entweder kein Protein adsorbiert ist (Defekt im Biotinthiol-

SAM) oder es haben Proteine an Stellen adsorbiert, wo sie eigentlich nicht hätten adsorbieren

dürfen (Defekt im OEG(6)-Thiol-SAM). Die Adsorption des Streptavidins führt zu einer

Monolage, in der das Protein seine biologische Aktivität beibehält. Dies wird durch die

Adsorption der Peroxidase gezeigt. Auch hier wird eine vollständige Monolage ausgebildet.

Wie erwartet kann auf den Bereichen des OEG(6)-Thiols keine Adsorption festgestellt

werden.

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

- 57 -

3.3 Aktivitätstests

Für die Aktivitätstests wurde das farblose Chromogen 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)

verwendet, welches von der Peroxidase in ein blaues Zwischenprodukt (TMB

Ladungstransfer- Komplex) umgewandelt wird. Der TMB Ladungstransfer- Komplex kann

dann durch Zugabe von Säure in ein stabiles gelbes Endprodukt überführt werden. Dieses

kann photometrisch detektiert werden (λmax=450nm). Als „negative“ Kontrolle wurde eine

Probe vermessen, die wie die Peroxidase-Proben behandelt wurde, ohne aber die bHRP zu

enthalten. Wie zu erwarten, zeigt sich hier kein Maximum bei 450nm (siehe Abb. 3.14). Für

die „positiven“ Messungen wurde die enzymatische Aktivität in Abhängigkeit von der

Inkubationszeit gemessen. Die Ergebnisse dieser Messungen sind in Abbildung 3.14

zusammengefasst. Die oberen drei Spektren zeigen die Ergebnisse für die

300 350 400 450 500 550 600-0,3-0,2-0,10,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,01,1

Basislinie entspricht"negative" Kontrolle

5min Oberfläche 10min Oberfläche 15min Oberfläche 5min Lösung 10min Lösung 15min Lösung

rel.

Inte

nsitä

t

Wellenlänge [nm]

Abb.3.14: Peroxidase katalysiert die Produktion eines gelben Farbstoffs, der dann photometrisch

detektiert wird. Die Höhe der Banden korreliert mit der enzymatischen Aktivität. Es wurde die Aktivität

der Enzyme in Lösung (obere 3 Linien) mit der Aktivität der Enzyme an der Oberfläche verglichen

(untere 3 Linien).

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

- 58 -

Messungen in Lösung. Mit steigender Inkubationszeit (5, 10 und 15min) steigt erwartungs-

gemäß auch die Intensität des Maximums bei 452nm von 0,34 (5min) über 0,67 (10min) bis

hin zu 1,0 (15min). Diese Spektren können als Referenz für die maximale Enzymaktivität

gesetzt werden. Vergleicht man die Aktivität der Peroxidase in Lösung mit den Ergebnissen

für die Aktivität des Enzyyms an der Oberfläche, ist eine starke Abnahme der Banden bei

452nm zu erkennen. Mit steigender Inkubationszeit steigt auch für die

oberflächengebundenen

P P P

P

P

P

Abb.3.15: Jedes Peroxidase-Molekül (P) besitzt eine “Diffusionssphäre”. Substrate innerhalb dieser

Sphäre können die aktive Seite der Peroxidase erreichen. In Lösung (linke Darstellung) ist soviel Platz

zwischen den einzelnen Molekülen, dass sich die Sphären nicht überlappen. Bei den

oberflächengebundenen Molekülen (rechte Darstellung) liegen die Moleküle so eng zusammen, dass

es zu einer Überlappung der Sphären kommt. Dadurch konkurrieren die einzelnen Peroxidase-

Moleküle um das Substrat.

oberflächengebundenen Enzyme die Aktivität an (Maxima: 0,14 (5min); 0,20 (10min); 0,24

(15min)). Für die Messungen in Lösung können die Maxima linear gefittet werden

(λmax=0,0699*Inkubationszeit/min; R=0,9998). Für die Messungen an der Oberfläche folgen

die Maxima keinem linearen Verlauf. Dies ist darauf zurückzuführen, dass in Lösung alle

Seiten der Peroxidase frei zugänglich sind; an der Oberfläche sind die Peroxidase-Moleküle

jedoch dicht gepackt, wodurch nur die obere Seite vollständig frei zugänglich ist. Alle

weiteren Seiten werden durch die Nachbarmoleküle (lateral) und die Streptavidinlage

(Unterseite) geblockt. Folgt man der Michaelis-Menten Kinetik, so ist der maximale

enzymatische Umsatz dann erreicht, wenn das Enzym (E) vollständig mit Substrat (S)

gesättigt ist ([S] >> [E]). In Lösung ist diese Bedingung erfüllt, da alle Peroxidase-Moleküle

weit voneinander entfernt sind und imaginäre Diffusionssphären der Moleküle (siehe

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

- 59 -

Abbildung 3.15) nicht überlappen. Nimmt man solche Diffusionssphären an, so können nur

die Moleküle umgesetzt werden, die sich innerhalb dieser Sphäre aufhalten. Der lineare Fit,

welcher für die Maxima bestimmt wurde, zeigt, dass die Umsatzrate während der Inkubation

konstant bleibt, was diese Annahme verifiziert.

Für die oberflächengebundenen Peroxidase-Moleküle ergibt sich ein vollständig anderes Bild.

Die Peroxidase-Moleküle sind nun immobilisiert und liegen dicht gepackt nebeneinander und

auf dem Streptavidinfilm. Hierdurch überlappen die Diffusionssphären und es kommt zur

Konkurrenz um einzelne eindringende Substratmoleküle. Dadurch kommt es zu einer

anfänglich sehr hohen Enzymaktivität, wodurch die Substratmoleküle, die sich in der Nähe

zur Oberfläche befinden schnell verarmen. Hierdurch wird die enzymatische Aktivität stark

verlangsamt. Die Umsatzrate der enzymatischen Reaktion ist als nicht konstant; dies erklärt,

warum kein linearer Fit kalkuliert werden konnte.

Die Aktivitätstests zeigen aber eindeutig, dass die Peroxidase auch nach der Adsorption an die

Oberfläche ihre biologische Aktivität beibehält.

350 400 450 500 5500,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

rel.

Inte

nsitä

t

Wellenzahl [nm]

Referenz Test

Abb.3.16: Absorptionskurven für die Referenz-Probe (Kreise) und die Test-Probe (Quadrate). Die

Aktivität der Test-Probe liegt im Vergleich zur Referenzprobe (100% Aktivität) immer noch bei 22%.

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Kapitel 3 Proteinresistente Petidthiole

- 60 -

Zur weiteren Bestimmung der Aktivität oberflächengebundener Proteine wurden noch Proben

vermessen, bei denen die Bindungstaschen des Streptavidins vor Inkubation mit der

Peroxidase durch natives D-Biotin abgesättigt wurden (Test-Probe). Das Ergebnis dieser

Messungen ist in Abbildung 3.16 gezeigt. Zum besseren Vergleich wurde die gleiche

Messung ohne das vorherige Absättigen wiederholt (Referenz-Probe). Es ist eindeutig zu

erkennen, dass die Referenz-Probe eine viel stärkere Adsorption zeigt (0,49). Setzt man diese

Aktivität zu 100%, so besitzt die Test-Probe (0,11) immerhin noch eine Aktivität von 22%.

Auf der Test-Probe wurden die Biotinbindungstaschen des Streptavidins mit D-Biotin

abgesättigt. Die enzymatische Peroxidase Reaktion kann hier also nur von solchen Molekülen

durchgeführt werden, die unspezifisch an die Oberfläche gebunden haben. Dies korreliert gut

mit den Beobachtungen aus den SPR-Experimenten.

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 61 -

4 Click-Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

Für die hier vorliegende Forschungsarbeit sind die Thio-Funktionalisierungen der Peptide und

die Selbstassemblierung der Peptidthiole auf Goldoberflächen unter Ausbildung

zweidimensionaler Peptidfilme hoher struktureller Qualität von zentraler Bedeutung. Im

Hinblick auf eine spätere Phase des Projekts muss die spezielle Methode der Thiolierung

verträglich mit dem Einsatz einer Peptidbibliothek sein, d.h. sie muss schnell sein und hohe

Ausbeuten besitzen. Zuerst wurde daher daran gedacht die Thiolieung über die gleiche

Synthesestrategie zu verfolgen, wie Aminosäuren untereinander gekoppelt werden, wenn aus

ihnen Peptide synthetisiert werden. Diese Synthesestrategie ist in Abbildung 4.1 dargestellt.

Abb.4.1: Darstellung der Reaktionssequenz zur Festphasen-Synthese von Peptid-Thiol Oligoamiden

Dabei kommen folgende Reagenzien zum Einsatz: a) PyBop, DMF b) Piperidin, DMF

c)Trifluoressigsäure, CH2Cl2.

Der verwendete Thiolanker wird dabei zuerst trityliert. Anschließend wird das gewünschte

Peptid über Festphasensynthese produziert. Im nächsten Schritt werden beide Moleküle

miteinander verknüpft. Zuletzt wird die Schutzgruppe am Thiol, sowie das Harz, an dem das

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 62 -

Peptid hängt sauer abgespalten. Aus den so synthetisierten Peptidthiolen sollten dann SAMs

präpariert und vermessen werden. Obwohl dieser Zugang zum Erfolg führte , erwies er sich

leider als sehr schwierig, da die Synthese aus vielen Stufen und Aufreinigungsschritten

besteht, bei denen Material verloren ging oder die nicht zum erwünschten Produkt führten.

Einen einfacheren Zugang sollte die Click-Chemie von Aziden mit Alkinen (Huisgen-

Reaktion) liefern: Click-Chemie ist eine sich immer weiter verbreitende Technik, um

selektive Reaktionen durchzuführen. Durch Click-Chemie können unter milden Bedingungen

und mit geringem Aufwand schnell und selektiv Verbindungen synthetisiert werden. Auf

Grund des dabei verwendeten modularen Aufbaus der beteiligten Reaktionspartner kann in

kürzester Zeit eine Vielzahl verschiedener Moleküle aufgebaut werden.

Abb.4.2: Modifizierte 1,3-Cycloaddition nach Huisgen. Im Gegensatz zur thermisch kontrollierten

Huisgen-Reaktion entstehen hier nicht 2 Enantiomere, sondern selektiv das 1,4 Regioisomer.

Die Gruppe um Sharpless hat eine Vielzahl von Reaktionen entwickelt, die den Kriterien

einer Click-Reaktion gerecht werden. Die bekannteste und am weitesten verbreitete ist die

durch Kupfer katalysierte Variante der 1,3-dipolaren Cycloaddition 144 (Huisgen-Reaktion;

siehe Abbildung 4.2). Hierbei werden Alkine mit Aziden zu 1,2,3-Triazolen umgesetzt.

Diese Reaktion soll eingesetzt werden, um Peptide mit einem Thiolanker zu versehen, so dass

die enstandenen Peptidthiole anschließend an eine Oberfläche adsobiert werden können (siehe

Kapitel 5). Click-Chemie an Peptiden ist in der Literatur bekannt 145, 146; insbesondere die

Konjugation von Ferrocen mit Biomaterialien wurde eingehend untersucht 147-150. In diesem

Kapitel der Arbeit wurden insgesamt drei verschiedene Click-Reaktionen durchgeführt und

charakterisiert:

- Ferrocenazid + 11-thioacetyl-undekansäure-propargylamid

- Ethinyl-Ferrocen + Azidoundekanthiol

- Azido-Essigsäure + thioacetyl-undekansäure-propargylamid

Dabei wurden zusätzlich zwei Kopplungsvarianten unterschieden. Im ersten Fall erfolgt die

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 63 -

Kopplung in Anlehnung an die Literaturvorschrift in Lösung. Anschließend wird auf einem

Goldsubstrat mit dem fertigen Clickprodukt ein SAM hergestellt und dieser dann

charakterisiert (siehe Abbildung 4.5). Im zweiten Fall wird aus einem Thiol ein SAM erstellt.

Die Kopplungsreaktion soll dann an der Oberfläche erfolgen, indem das Goldsubstrat mit dem

fertigen SAM in der Reaktionslösung für mehrere Stunden inkubiert wird). In Abbildung 4.3

sind die in dieser Arbeit verwendeten Moleküle dargestellt. In Abhängigkeit vom Experiment

wurden azid-terminierte (1) oder alkin-terminierte (2) SAMs und die dazu passenden alkin-

terminierten (5) oder azid-terminierten (3, 4) Click-Partner benötigt. Die Abbildungen 4.4

and 4.5 geben einen Überblick über die in dieser Arbeit untersuchten Reaktionen. Die

Synthese von 2, 3 and 4 sind in der Literatur beschrieben (2 151, 3152, 153, 4 153); 1 und 5 sind

hingegen kommerziell erhältlich (1 Asemblon, 5 ACROS).

S

O

HN

O

S

SN3

N3

HO

O

N3

N3

Fe

1

2

3 4 5Fe

Abb.4.3: Darstellung der für das Projekt benutzen Moleküle: Azido-Undekanthiol (1), 11-thioacetyl-

undekansäure-propargylamid (2), Azidoessigsäure (3), Azidoferrocen (4) und Ethinyl Ferrocen (5).

4.1 Addition von Azidoferrocen an 11-thioacetyl-undekansäure-propargyl-

amid in Lösung

4.1.1 Azidoferrocen

Das Azidoferrocen wurde in Kooperation mit Herrn D. Köster am Lehrstuhl für Anorganische

Chemie I synthetisiert. Die Synthese erfolgte nach Literaturvorschrift 153. Das Produkt wurde

mittels ATR-IR charakterisiert.

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 64 -

Abb.4.4: Click Reaktionen von 2 mit 3 und 4. Es werden N-((1H-1,2,3 triazol-4-yl)acetyl)-11-mercapto-

undekanamid (6) und N-((1H-1,2,3-triazol-4-yl) ferrocenyl)-11-mercapto-undekanamid (7) erhalten.

Abb.4.5: Additionsreaktion von 5 an 1. Als Produkt wird N-((1H-1,2,3-triazol-4-yl) ferrocenyl)-11-

mercapto-undekanthiol (8) erhalten.

4.1.2 11-thioacetyl-undekansäure-propargylamid

Das 11-thioacetyl-undekansäure-propargylamid (im Folgenden: Alkinthiol) wurde am

Lehrstuhl für Anorganische und Angewandte Chemie der Universität Hamburg in

Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Dr. A. Terfort synthetisiert und charakterisiert 151. Von dem

Alkinthiol wurden drei verschiedene IR-Messreihen angefertigt.

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 65 -

Abb.4.6: Schematische Darstellung für die Synthese des Ferrocenthiols in Lösung mit anschließender

Formierung des SAMs.

Zuerst wurde das IR-Spektrum des Thiols über eine Simulation (Gaussian98 Paket 154/

B3LYP/6-31G(d) Basis) generiert. Anschließend wurden KBr-IR-Messungen des Alkinthiols

durchgeführt. Im letzten Schritt wurde aus dem Alkinthiol ein SAM hergestellt und dieser

SAM dann mit IRRAS charakterisiert. Die resultierenden IR-Spektren sind in Abbildung 4.7

zusammengefasst. Die wichtigsten Banden wurden durch Striche gekennzeichnet.

Das IR Spektrum zeigt eindeutig, dass sowohl im KBr als auch im SAM das Alkinthiol sauber

und rein vorliegt.

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 66 -

Tab.4.1: Vergleich der wichtigsten IR-Banden des Alkinthiols mit Literatur und Simulation.

Literatur[cm-1] Simulation[cm-1] KBr[cm-1] SAM

ν-CH (Alkingruppe) 3300 3470 3304 Auswahlregel

ν-CH (Aliphaten) 3000 3058 2919 2929

ν-CC (Alkingruppe) 2200 2208 - -

ν-CO 1700 - 1691 (Acetat)

1700 1634 1634 (Thiol) 1692

δ-NH 1600 1518 1534 1523

375035003250300027502500225020001750150012501000 750-1

0

1

2

3

(ohne Acetylat)

SAM

Simulation

KBr

norm

. Int

ensi

tät

Wellenzahl [1/cm]

Abb.4.7: Simuliertes IR-Spektrum, KBr-IR-Spektrum und SAM-IR-Spektrum des Alkinthiols im

direkten Vergleich. Die wichtigsten Banden sind mit Strichen gekennzeichnet.

4.1.3 Ferrocenthiol

4.1.3.1 IRRAS-Messungen

Das Alkinthiol wurde mit dem Azido-Ferrocen unter den in Abbildung 4.1 beschriebenen

Reaktionsbedingungen umgesetzt. Einzig die Reaktionszeit wurde von 8 Stunden auf 24

Stunden erhöht. Anschließend wurde ein Goldsubstrat (Si-Wafer) für weitere 24 Stunden in

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 67 -

der nicht aufgereinigten Ferrocenthiol-Lösung inkubiert. Auf eine Aufreinigung wurde

verzichtet, da die Umsetzung des Thiols zu 100% erfolgt und somit keine anderen Moleküle

außer dem Ferrocenthiol an das Gold adsorbieren sollten.

Von dem Ferrocenthiol-SAM wurden IRRAS-Messungen durchgeführt und das erhaltene IR-

Spektrum mit einem simulierten Spektrum verglichen (Abbildung 4.8). Die wichtigsten

Banden wurden mit Strichen gekennzeichnet. Tabelle 4.2 fasst die wichtigsten,

charakteristischen Banden zusammen.

3500 3000 2500 2000 1500 1000-0,20,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,02,22,42,62,83,03,23,4

x5

Simulation

SAM

norm

. Int

ensi

tät

Wellenzahl [cm-1]

Abb.4.8: Simuliertes IR-Spektrum und SAM-IR-Spektrum des Ferrocenthiol im direkten Vergleich. Die

wichtigsten Banden wurden durch Linien gekennzeichnet.

Die Schwingungen für die Aromaten des Ferrocens und die CC-Doppelbindung im Triazol-

Ring sind eindeutig identifizierbar. Ebenso fehlen die charakteristischen Schwingungen, die

auf reines Alkinthiol hinweisen (CC-Dreifachbindung). Es kann also davon ausgegangen

werden, dass sich ein SAM aus reinem Ferrocenthiol gebildet hat. Zur Bestätigung und

weiteren Charakterisierung wurden XPS-Messungen am Ferrocenthiol-SAM durchgeführt

(siehe Kapitel 4.1.3.2 und 4.1.3.3).

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

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Tab.4.2: Vergleich der wichtigsten IR-Banden des Ferrocenthiol-SAMs mit Literatur und Simulation.

Literatur [cm-1] Simulation [cm-1] SAM [cm-1]

ν-CH (Aromaten/in plane) 3200-3300 3255 3103

ν-CH (Aliphaten) 3000 3060 2925

Peak durch Adsorption aus dem Probenraum (Gerätepeak) 1731

ν-CO 1700 1646 1678

δ-CC 1620 (Triazol) 1572 1603 (Schulter)

δ-NH 1600 1543 1532 (Schulter)

δ-CH (Aromaten/out of plane) >900 817 821

4.1.3.2 XPS-Messungen

Die Proben aus den IR-Messungen wurden zur weiteren Charakterisierung noch mit XPS

vermessen. In Abbildungen 4.9 sind die charakteristischen Bereiche für Kohlenstoff,

Sauerstoff, Stickstoff und Eisen dargestellt. Die Spektren sind im Vergleich zum reinen

Alkinthiol aufgetragen. Das Fe2p-Spektrum zeigt, dass Cyclopentadienyleisen auf die

Oberfläche gebracht wurde. Die Bande bei 708,1 zeigt, dass Eisen(II) (nicht Eisen(III))

vorliegt (155: Fe(II) 710,9eV; Fe(III) 849,eV). Der zweite Peak bei 720,9eV gehört ebenfalls

zum Esien(II) und beruht auf der Spin Bahn Kopplung.

Während die S2p-Region annähernd unverändert bleibt, zeigt die C1s-Region eine deutliche

Intensitätszunahme, die durch die zusätzlichen Cyclopentadienylringe verursacht wird.

Zusätzlich wird durch die Cyclopentdienylringe der Peak auch noch verbreitert (FHWM

+0,3eV). In der N1s-Region ist ebenfalls eine deutliche Veränderung erkennbar. Neben der

deutlichen Intensitätszunahme (von einem N-Atom auf vier N-Atome im Molekül) ist neben

einer Verschiebung von 0,9eV auch eine Peakverbreiterung (FHWM +0,4eV) erkennbar.

Diese Effekte beruhen auf den neu hinzugekommenen N-Atomen des heterozyklischen,

teilaromatischen Triazolringes.

Die quantitative Auswertung ergibt eine Stöchiometrie von C24N4,18O6S0,98Fe0,92 (Soll:

C24H33N4OSFe). Auffällig ist hier der zu hohe Sauerstoffanteil. Die Spektren belegen aber

wie beschrieben, dass es sich nicht um Eisenoxide oder SO-Spezies handelt, sondern um

sauerstoffhaltige Kohlenwasserstoffe. Es liegt die Vermutung nahe, dass physisorbierte oder

an N/O brückenbindende Moleküle vorliegen. Dies könnte sehr wahrscheinlich die gleiche

Verunreinigung wie bei den IR-Messungen sein, da ja die Proben erst im IR und anschießend

im XPS vermessen wurden.

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 69 -

292 290 288 286 284 282 2800,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

2,4

C1s-XPSK

cou

nts

pro

s

Bindungs Energie / eV

27

730 725 720 715 710 7050,0

0,1

0,2Fe2p XPS

K c

ount

s pr

o s

Bindungs Energie / eV

538 536 534 532 530 528 526 5240,0

0,2

0,4

0,6

0,8

O1s-XPS

K c

ount

s pr

o s

Bindungs Energie / eV

7

2

408 405 402 399 396 393

0,0

0,1

0,2

N1s-XPS

K c

ount

s pr

o s

Bindungs Energie / eV

2

7

Abb.4.9: XPS-Spektren der verwendeten Thiole. Es sind die charakteristischen Bereiche für

Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Eisen dargestellt. Die unteren Kurven stellen die Ergebnisse für

das reine Alkinthiol dar, während die oberen Linien das Ferrocenthiol darstellen.

4.1.3.3 NEXAFS-Messungen

Zur weiteren Detailanalyse wurden die Proben noch mit NEXAFS vermessen (in

Kooperation mit Herrn D. Käfer). Abbildung 4.10 zeigt das C1s NEXAFS-Spektrum des

Ferrocenthiols. Im Spektrun sind der π*-Peak bei 284,95eV (aromatischer Kohlenstoff im

Trioazol-/Cp-Ring) und eine Schulter bei 287,06eV sowie die σ*-Peaks bei 288,30 und

292,06eV vom Alkylteil gut identifizierbar; ein Literaturspektrum von reinem Ferrocen ist in

grau dargestellt; besonders die Schulter bei 297,7eV ist im Alkanthiol nicht existent und

gehört zum Ferrocen, auch wenn die π*-Resonanzen nicht ganz übereinstimmen.

Aus dem Dichroismus lässt sich ableiten, dass das Alkanrückgrat des Ferrocenthiols 36°

gegen die Oberflächennormale verkippt ist.

In Abbildung 4.11 ist das Fe2p NEXAFS-Spektrum des Ferrocenthiols dargestellt. Als

deutliche Peaks können die Schulter bei 708,83eV, und die Peaks bei 710,30eV und 722,96eV

dem Ferrocen zugeordnet werden. Man sieht jedoch eine starke Verbreiterung im SAM, die

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 70 -

270 280 290 300 310 320 330

0

1

2

3

4

5

30° 55° 90° Ferrocen

Inte

nsitä

t

Photonen Energie [eV]

Abb.4.10: C1s NEXAFS-Spektrum von Ferrocenthiol auf einem Gold/Silicium-Wafer.

700 710 720 730 740 750

0

1

55° Ferrocen

Inte

nsitä

t

Photonen Energie [eV]

Abb.4.11: Fe2p NEXAFS-Spektrum von Ferrocenthiol auf einem Gold/Silicium-Wafer.

auf Kopplungen zu Nachbarmolekülen zurückzuführen ist. Die Intensität im Kantensprung ist

relativ gering, d.h. es liegt wenig Fe im Vergleich zum C1s vor (passend zum

stöchiometrischen Verhältnis von C24Fe).

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 71 -

Ein Dichroismus ist hier nicht vorhanden, d.h., dass eine statistische Orientierung des

Ferrocens vorliegt. Um einen besseren Vergleich zu haben, wurde zusätzlich noch ein

NEXAFS Spektrum des reinen Alkinthiols aufgenommen. Das Alkinthiol gleicht bis auf

etwas höhere π*-Resonanzen einem Alkanthiol-C1s-NEXAFS. Der Dichroismus liefert einen

Verkippungswinkel von 31°.

4.1.4 Zusammenfassung: Click-Chemie in Lösung

IR-, XPS- und NEXAFS-Daten zeigen deutlich, dass die gewünschte Reaktion gezielt, ohne

Nebenprodukte und unter einfachen Bedingungen abläuft. Die NEXAFS Daten liefern neben

der Bestätigung der IR- und XPS Daten zusätzlich die Verkippungswinkel der Moleküle zur

Oberflächennormalen.

4.2 Addition von Azidoferrocen an 11-thioacetyl-undekansäure-propargyl

amid an der Oberfläche

In den vorherigen Experimenten wurde das Ferrocenthiol in Lösung synthetisiert und

anschließend an die Oberfläche gebracht. Ein besserer Zugang wäre, das Alkinthiol an die

Oberfläche zu binden und erst dann das Azidoferrocen durch die Click-Chemie anzubinden.

Hierdurch wäre es möglich, Alkinthiolchips „vorzuproduzieren“. Anschließend könnte das

gewünschte Azid synthetisiert und direkt an die Oberfläche geklickt werden.

4.2.1 Click-Reaktion am vollständigen Alkinthiol-SAM

Im ersten Versuch wurde ein vollständiger SAM aus Alkinthiol präpariert. Die so hergestellte

Probe wurde für 120h in der nach Literaturvorschrift angesetzten Reaktionslösung (siehe Abb.

4.2) inkubiert. Anschließend wurde die Probe zuerst mit abs. Ethanol gespült, dann im

Stickstoffstrom getrocknet und anschließend mittels IRRAS und XPS untersucht.

4.2.1.1 IRRAS-Messungen

Abbildung 4.13 zeigt die IR-Spektren der Proben mit Alkinthiol vor und nach Inkubation mit

Azidoferrocen (Inkubationsbedingungen wie in Abb.4.2 beschrieben). Es ist relativ klar

ersichtlich, dass das Spektrum nach Inkubation keine zusätzlichen Banden enthält, die für eine

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 72 -

Reaktion des Azidoferrocens mit dem oberflächen-immobiliserten Alkinthiol, wie z.B Banden

bei 3100cm-1 (CH-aromatisch/in plane) oder ~800cm-1 (CH-aromatisch/out of plane)

sprechen.

Abb.4.12: Schematische Darstellung der Synthese des Ferrocenthiols an der Oberfläche nach

Inkubation eines Goldwafers mit Alkinthiol.

4.2.1.2 XPS-Messungen

Das Fe2p Spektrum zeigt nur eine extrem geringe Intensität (Daten nicht gezeigt). Eine

stöchiometrische Auswertung würde zu C24Fe0,18 führen. Die XPS-Spektren bestätigen den

Verdacht, dass so gut wie keine Reaktion des Azido-Ferrocens an den vorinkubierten

Alkinthiol-Wafer stattgefunden hat.

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 73 -

4000 3500 3000 2500 2000 1500 10000,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

nach Reaktion vor Reaktion

Inte

nsitä

t

Wellenzahl [cm-1]

Abb.4.13: IR-Spektren des Alkinthiols vor (oben) und nach (unten) Reaktion mit dem Azidoferrocen.

4.2.2 Click-Reaktion am gemischt terminierten Alkinthiol-SAM

Im nächsten Schritt wurde eine Koadsorption von zwei verschiedenen Thiolen durchgeführt.

Neben dem Alkinthiol wurde ein -OH terminiertes Thiol (Mercapto-Undekanol; Abbildung

4.14) verwendet (im Folgendem: OH-Thiol). Beide Thiole liegen mit einer Konzentration von

1mM als ethanolische Lösung vor und werden für jeden Versuch frisch in der benötigten

Zusammensetzung gemischt. Die Endkonzentration an Thiol beträgt daher insgesamt 1mM.

SH OH Abb.4.14: Darstellung des für den gemischt terminierten SAM verwendeten Mercapto-Undekanols.

4.2.2.1 50% Alkinthiol-SAM

Zuerst wurden Versuche mit einer 50%-igen Mischung (Angaben in % beziehen sich immer

auf das Alkinthiol) durchgeführt. Hierbei wurde ein Wafer für 24h in der Thiolmischung

inkubiert.

Die so inkubierten Wafer wurden anschließend für 60-72h in der für die Click-Chemie

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 74 -

notwendige Reaktionslösung inkubiert (Das Schraubdeckelgläschen wurde dabei auf einen

Schüttler gelagert). Es wurden IR- und XPS Spektren gemessen. Ein solches IR-Spektrum ist

in Abbildung 4.15 dargestellt. Die für die Ferrocengruppe charakteristischen Banden sind in

Tabelle 4.3 zusammengefasst und werden mit den experimentellen Daten verglichen.

3750 3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 7500,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

100% Ferrocenthiolaus Lösung

50% Ferrocenthiolan Oberfläche

norm

. Int

ensi

tät

Wellenzahl [cm-1]

Abb.4.15: IR Spektrum eines SAMs aus 50%Alkinthiol, welcher für 72h in der Reaktionslösung für die

Click-Chemie inkubiert wurde. Zum Vergleich ist das Spektrum eines SAM aus Ferrocenthiol gezeigt,

welches in Lösung synthetisiert und dann an die Oberfläche adsorbiert wurde. Die senkrechten Linien

zeigen 2 der charakteristischsten Peaks für die Aromaten des Ferrocenthiols.

Es ist deutlich ersichtlich, dass keiner der auf das Ferrocen hinweisenden Banden im

Spektrum deutlich zu finden ist. Die 50%-Alkinthiolprobe hat also nicht mit dem

Ferrocenazid reagiert.

Tab.4.3: Vergleich der charakteristischen Banden für die Ferrocengruppe aus Literatur, Simulation

und Experiment.

Wellenzahl [cm-1]

Literatur Simulation SAM (aus Lösung) 50%-Alkinthiol

ϖ-CH (in plane) 3200-3300 3250 3103 -

δ-CC (Triazol) 1620 1572 1603 (Schulter) -

δ-CH (out of plane) >900 817 815 (Qualität)

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 75 -

Die XPS-Messungen zeigen keine Intensität im Bereich des Fe2p und nur geringe Intensität

im Bereich des N1s. Im Bereich des O1s ist im XPS eine große Intensität zu verzeichnen auf

Grund des koadsorbierten OH-Thiols. Die XPS-Messungen bestätigen also den Verdacht,

dass keine Reaktion des Azido-Ferrocens mit dem 50%-Alkinthiollayer erfolgt ist.

4.2.2.2 10% Alkinthiol-SAM

Da die 50%-Alkinthiolprobe keine Reaktion mit dem Ferrocenazid zeigte, wurde die gesamte

Messreihe mit einer 10%-igen Alkinthiollösung wiederholt. Die Ergebnisse sind in den

Abbildungen 4.16 und 4.17 dargestellt.

4000 3800 3600 3400 3200 3000 2800 26002000 1800 1600 1400 1200 1000 800

0,0

0,8

1,6

norm

. Int

ensi

tät

Wellenzahl [cm-1]

. Abb.4.16: IR Spektrum eines SAMs aus 10%Alkinthiol, welcher für 60h in der Reaktionslösung für die

Click-Chemie inkubiert wurde (unteres Spektrum). Zum Vergleich ist das Spektrum eines SAM aus

Ferrocenthiol (oberes Spektrum) gezeigt, welches in Lösung synthetisiert und dann an die Oberfläche

adsorbiert wurde. Die senkrechten Linien zeigen 2 der charakteristischsten Banden für die Aromaten

des Ferrocenthiols.

Abbildung 4.16 zeigt das gesamte Spektrum des SAMs aus 10% Alkinthiol, während in

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 76 -

Abbildung 4.17 zwei Teilspektren für die Bereiche um 1625 cm-1 und 3100 cm-1 gezeigt sind.

Auch für das 10%-ige Alkinthiol sind keine eindeutigen Banden ersichtlich, die auf

angelagertes Ferrocen hindeuten. Deutlich zu sehen ist hingegen ein Peak bei ca. 3600cm-1,

3500 3000 2500

0,0

0,8

norm

. Int

ensi

tät

Wellenzahl [cm-1]

1800 1600

0,0

0,8

1,6

norm

. Int

ensi

tät

Wellenzahl [cm-1]

Abb.4.17: Vergrößerung der Bereiche um 1625 cm-1 und 3100 cm-1 der Spektren aus Abbildung 11. Im Spektrum des 10%-igen Alkinthiol-SAMs sind keine Peaks des Ferrocens zu erkennen.

der auf die OH-Streckschwingungen des koadsorbierten OH-Thiols hinweist. Zum Vergleich

ist in Abbildung 4.18 das IR-Spektrum eines reinen OH-thiol-SAM dargestellt. Es sind die

drei charakteristischen Banden bei 3600 cm-1 (OH-Streckschwingung), 3000 cm-1

(aliphatisches Rückgrat) und 1500 cm-1 (OH-Deformationsschwingung) für das OH- Thiol zu

erkennen. Die IR-Messungen zeigen auch hier, dass zwar eine koadsorption der beiden Thiole

stattgefunden hat, aber die Reaktion des Azidoferrocens mit dem oberflächen-immobilisierten

Alkinthiol nicht erfolgt ist.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 10000,015

0,020

0,025

Inte

nsitä

t

Wellenzahl [cm-1]

Abb.4.18: IR-Spektrum eines SAMs aus 11-mercapto-Undekanol (OH-Thiol).

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 77 -

4.2.3 Zusammenfassung

Die IR-Messungen der koadsorbierten SAMs aus Alkinthiol und OH-Thiol zeigen keine

Reaktion mit dem Azidoferrocen. Dies wird durch die XPS-Messungen bestätigt, da auch im

XPS kein Cyclopentadienyl-Eisen gemessen werden konnte.

4.3 Reaktion von Ethinyl-Ferrocen an Azidoundekanthiol an der

Oberfläche

Da auch die Reaktionen an verdünnten SAMs aus 11-thioacetyl-undekansäure-propargyl-

amid keinen Erfolg zeigten, wurde die Strategie umgedreht. Es wurde ein azido terminiertes

Alkanthiol an die Oberfläche gebunden, um anschließend ein Ethinyl-ferrocen über Click-

reaktion zu addieren.

4.3.1 Ethinyl-Ferrocen

Ethinyl-Ferrocen ist kommerziell erhältlich (ACROS). Vom reinen Ethinyl-ferrocen wurden

eine Simulation und ein KBr-Spektrum angefertigt (Siehe Abbildung 4.20) Beide Spektren

stimmen gut überein. Das KBr-Spektrum wird später noch verwendet, um es mit dem IR-

Spektrum des Click-Produktes zu vergleichen.

4.3.2 Azido-terminiertes Undekandisulfid

Zur Herstellung des SAMs wurden Si/Au Wafer für 24h in eine 1mM ethanolische Lösung des

Azidoundekandisulfids (Asemblon) eingelegt. Der so entstandene SAM wurde mit IRRAS

charakterisiert. In Abbildung 4.18 werden die Spektren des reinen Disulfids und des SAMs

miteinander verglichen. Die charakteristischen Peaks sind in Tabelle 4.4 zusammengefasst.

Zusätzlich sind in Tabelle 4.4 noch die Ergebnisse für die charakteristischen Banden eines

simulierten Spektrums gezeigt. Alle drei Spektren stimmen gut überein und zeigen, dass die

charakteristischen Banden deutlich zu erkennen sind.

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 78 -

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

Azidothiol-KBr

Azidothiol-SAM (x100)

no

rm. I

nten

sitä

t

Wellenzahl [cm-1]

Abb.4.19: IR-Spektren des Azidoundekanthiols im Volumen (KBr) und an der Oberfläche (SAM).

Tab.4.4: Vergleich der wichtigsten IR-Banden des Azidothiols im Volumen (KBr), an der Oberfläche

(SAM) und mit der Simulation (Spektrum nicht gezeigt).

Literatur [cm-1] Simulation [cm-1] SAM [cm-1]

ν-CH (Aliphaten) 3000 2997 2925

ν-N3 2100 2087 2106

δ-CN 1000-1500 1416,1359,1264 1463,1346,1256

4.3.3 N-((1H-1,2,3-triazol-4-yl) ferrocenyl)-11-mercapto-undekanthiol

Die wie in Kapitel 4.3.2 hergestellten Proben wurden für 120h in der nach abgewandelter

Literaturvorschrift angesetzten Reaktionslösung (siehe Abb. 4.1) inkubiert, um 8 zu erhalten.

Anschließend wurde die Probe gereinigt und mittels IRRAS charakterisiert. Abbildung 4.19

zeigt das Ergebnis dieser Messungen im Vergleich zu den beiden Ausgangsprodukten. Tabelle

4.5 fasst die wichtigsten Banden im Vergleich zum simulierten Spektrum und zu den Spektren

der Ausgangssubstanzen 1 und 5 zusammen.

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 79 -

Tab.4.5: Vergleich der wichtigsten IR-Banden des Azidothiols im Volumen (KBr), an der Oberfläche

(SAM) und mit der Simulation (Spektrum nicht gezeigt).

Substanz und Wellenzahl [cm-1]

Gruppe Etyhnyl- Ferrocen

(5)

Azido-undekanthiol

(1)

Click- Produkt

(8)

Simulation des Click-Produktes

(8) ν-CH (Aromaten /in plane) 3098 - 3102 3124 ν−N=N=N - 2104 - - ν-CC (Alkin)/ ν-CH (Alkin) 2103/3279 - - - δ-CH (Aromaten/out of plane) 1105 - 1104 1011 δ-CH (Aromaten /out of plane) 1000 - 1001 979 δ-CH (Aromaten /out of plane) 814 - 810 801

Es ist ersichtlich, dass die Azido-Bande (N=N=N; 2106 cm-1) und die Banden für die Alkin-

Gruppe (C≡C; 2102 cm-1/ 3279cm-1) im IR-Spektrum des Click-produktes nicht mehr

vorhanden sind. Die Banden um 1000 cm-1 und die Bande bei 3102 cm-1(δ-CH aromatisch/in

plane) zeigen die Anwesenheit des Ferrocens an (δ-CH aromatisch/out of plane). Das

experimentell bestimmte Spektrum stimmt außerdem gut mit dem simulierten Spektrum

(siehe Tab.4.5) überein.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Ferrocenthiol (Simulation)

Ethynyl-Ferrocen (KBr)

Ferrocenthiol (SAM)

Azidothiol

Ethynyl-Ferrocen (Simulation)

norm

. Int

ensi

tät

Wellenzahl [cm-1]

Abb.4.20: IR-Spektrum von 8 (unten) im Vergleich zu den beiden Ausgangsprodukten 1 (Mitte) und 5

(oben).

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 80 -

4.3.4 Zusammenfassung

Die Versuche konnten zeigen, dass das Azidoundekandisulfid ohne Probleme an die

Oberfläche bindet und dort einen SAM ausbildet. Auch die Reaktion des Ethinyl-Ferrocens

mit dem azido-terminierten SAM läuft unter milden Bedingungen ohne Nebenprodukte ab.

4.4 Addition von Azido-Essigsäure an 11-thioacetyl-undekansäure-

propargyl amid an der Oberfläche

4.4.1 Azido-Essigsäure

Die Azido-Essigsäure wurde in Kooperation mit Herrn D. Köster am Lehrstuhl für

Anorganische Chemie I synthetisiert. Die Synthese erfolgte nach Literaturvorschrift 152. Das

Produkt wurde mittels ATR-IR charakterisiert. Zusätzlich wurde ein IR-Spektrum simuliert

und mit den gemessenen Spektren verglichen. Diese Spektren sind in Abbildung 4.21 gezeigt.

2500 2000 1500 1000 500-0,4-0,20,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,02,2

Simulation ATR-Spektrum

Inte

nsitä

t

Wellenzahl [cm-1]

Abb.4.21: Simuliertes Spektrum der Azidoessigsäure. Die beiden stärksten Banden liegen bei

2105cm-1 (Azid) und 1705cm-1 (Carbonsäure).

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 81 -

Die Banden für die Azid-Gruppe (2105cm-1) und die Carbonsäure (1709cm-1) sind deutlich zu

erkennen. Das experimentelle Spektrum zeigt diese Banden bei 2104cm-1 (Azid) und

1719cm-1 (Carbonsäure).

4.4.2 11-thioacetyl-undekansäure-propargylamid

Das 11-thioacetyl-undekansäure-propargylamid (Alkinthiol) wurde bereits in den Kapitel

4.1.2 und 4.2.1 ausführlich beschrieben.

4.4.3 N-((1H-1,2,3 triazol-4-yl)acetyl)-11-mercapto-undekanamid

Abbildung 4.22 zeigt das experimentelle IR-Spektrum des N-((1H-1,2,3-triazol-4-yl)acetyl)-

11- mercaptoundekanamid (6) im Vergleich mit einem simulierten Spektrum. Zum besseren

Vergleich wurden die wichtigsten Banden der Spektren in Tabelle 4.6 zusammengefasst.

2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2 SAM Simulation

norm

. Int

ensi

tät

Wellenzahl [cm-1]

Abb.4.22: IR-Spektrum des Click-Produktes (Experiment) im Vergleich zu einem simulierten Spektrum

des Click-Produktes.

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Kapitel 4 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

- 82 -

Tab. 4.6: Zusammenfassung der wichtigsten IR-Banden für das Reaktionsprodukt 6 aus 2 und 3 und

der Simulation von 6.

Gruppe Wellenzahl [cm-1]

Literatur Simulation

von 6

Experiment von 6

ν-COOH 1600-1750/ - 1702/1128 1717/1111 ν-C=O (Alkanrückgrat) 1600 1629,45 1624,06 ν-C-N (Alkanrückgrat) 1500 1538,95 - δ-C-N (Alkanrückgrat) 1000-1500 1157,13 1167,89 ν-N-N (Triazolring) - 1215 1210

Die durch die Carboxylgruppe der angelagerten Essigsäure verursachten Banden sind sowohl

in der Sumulation bei 1702 cm-1/1128 cm-1 als auch im experimentellen Spektrum bei

1717cm-1/1111 cm-1 gut erkennbar. Banden bei 1215cm-1 (Simulation) and 1210cm-1

(Schulter/SAM) werden durch N-N-Streckschwingungen im Triazolring verursacht. In der

Simulation finden sich drei Banden bei 1157cm-1, 1538cm-1 und 1629cm-1. Diese werden

durch die C=O-Streckschwingung (1629cm-1), die C-N-Streckschwingung (1538cm-1) und

die C-N-Deformationsschwingung (1157cm-1) der R-CO-NH-R-Gruppe im Alkanrückgrat

verursacht. Im experimentellen Spektrum finden sich hingegen nur 2 Banden bei 1167cm-1

(C-N-Deformationsschwingung) und 1624cm-1 (C=O-Streckschwingung). Die Bande, die zur

C-N-Streckschwingung gehört ist nicht auffindbar, was an der Oberflächenauswahlregel

liegen könnte. Eine eventuelle Dimerisierung freier Essigsäuremoleküle mit bereits an den

SAM addierten Säurefunktionen tritt nicht auf, da man sonst die sehr auffällige Azidbande

(2100cm-1) sehen müsste.

4.4.4. Zusammenfassung

Die Versuche konnten zeigen, dass die Azidoessigsäure (3) selektiv an den SAM aus

11-thioacetyl-undekansäure-propargylamid (2) bindet. Es treten auch keine Säuredimere auf;

der Click-Chemie Ansatz ist also sehr geeignet, um säure-terminierte SAMs zu generieren.

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Kapitel 5 Proteinresistente Thiole

- 83 -

5 Synthese und Charakterisierung proteinresistenter Thiole auf

der Basis von Peptiden

In Kapitel 4 wurde die 1,3-dipolare Cycloaddition (Huisgen-Reaktion) eingehend an

verschiedenen Alkin/Azid-Systemen untersucht. In diesem Teil der Arbeit wird diese

Reaktion verwendet, um Thiole mit Peptiden zu verbinden. Von den so synthetisierten

Peptidthiolen werden SAMs hergestellt. Anschließend soll die Proteinresistenz gegen

Streptavidin, Rinder Serum Albumin (bovin serum albumin, BSA) und Fibronectin gemessen

werden. Die Grundlagen und Motivation zu diesem Thema wurden in Kapitel 2 eingehend

erklärt.

Im ersten Schritt wird dafür eine Aminosäure-Sequenz mit einer Länge von 10 Aminosäuren

ausgewählt und zum Aufbau der Peptid-SAMs eingesetzt.

Bei der Auswahl der ersten Aminosäuren-Sequenzen werden die bisher bekannten

Erklärungsansätze zur Proteinresistenz von organischen Oberflächen berücksichtigt. Nach

einer eingehenden Charakterisierung von Struktur und Proteinresistenz dieser ersten

Generation von Peptid-SAMs sollen dann in weiteren Optimierungsschritten die Stabilität und

die Proteinresistenz verbessert werden. Zudem werden die Eigenschaften dieses Peptid-SAMs

mit denen eines Peptid-SAMs verglichen, von dem man auf Grund hoher Hydrophobizität

davon ausgehen kann, dass Proteine stark unspezifisch auf ihnen adsorbieren. Die gewählten

Peptidsequenzen und der verwendete Thiolanker sind in Abbildung 5.1 dargestellt. Das

hydroph

Abb.5.1: Schematische Darstellung der verwendeten Peptide und des Thiolankers (vgl. Kapite 4

Substanz 2). Peptid-1 (A) ist aus hydrophilen Aminosäuren (Serin (Ser), Lysin (Lys), Threonin (Thr))

und Gly aufgebaut. Gly ist nicht hydrophil, aber wichtig für die helikale Struktur des Peptids. Peptid-2

(B) ist eine einfache Kette aus den Aminosäuren mit hydrophoben Seitenketten: Leucin (Leu), Alanin

(Ala) und Prolin (Pro).

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Kapitel 5 Proteinresistente Thiole

- 84 -

hydrophile Peptid A wird im Folgenden der Einfachheit halber als Peptid-1 (M=1,2kDa)

bezeichnet, das hydrophobe (B) als Peptid-2 (M=1,2kDa). Die Auswahl der ersten Peptid-

Aminosäuresequenz für die Peptid-SAMs wurde auf der Basis der folgenden Überlegungen

vorgenommen: Auf hydrophobe Seitenketten kann verzichtet werden, da hydrophobe

Wechselwirkungen die unspezifische Proteinadsorption (siehe Kapitel 2) nur verstärken

würden. Beschränkt man sich auf die 20 proteinogenen Aminosäuren, so scheiden durch

dieses Kriterium Phe, Tyr, Trp, Pro, Ile, Leu und Val aus. Die beiden kleinsten Aminosäuren,

Gly und Ala, werden zwar formal auch als hydrophob charakterisiert, trotzdem soll auf diese

beiden Aminosäuren - wegen ihrer hohen Bedeutung für die Flexibilität der Peptidstrukturen -

nicht verzichtet werden. Wenn diese Aminosäuren vereinzelt in das Peptid eingebaut werden,

sollte aber immer, durch Einbau hydrophiler Nachbarn, der polare Charakter überwiegen. Bei

der terminalen Position sollte eine neutrale Aminosäure (z.B. Ser oder Thr) verwendet

werden.

Da die Peptid-SAMs auf Goldoberflächen aufgebracht werden sollen, ist es sinnvoll, in

diesem Projekt auf schwefelhaltige Aminosäuren zu verzichten, da ansonsten der

Filmbildungsprozess gestört werden kann (derartige Aminosäuren können - unter Ausbildung

von Thiolaten - direkt an die Au-Oberfläche binden156, 157). Aus diesem Grund sollen Cys und

Met nicht verwendet werden. Damit verbleiben noch 11 Aminosäuren: Ala, Arg, Asn, Asp,

Gln, Glu, Gly, His, Lys, Ser und Thr.

Die günstigen Eigenschaften, die die helikale Konformation der Oligoethylenglykoleinheiten

im Hinblick auf die Proteinresistenz aufweisen (siehe oben), legen es nahe, auch für die hier

zum Einsatz kommenden Peptide eine α-helikale Struktur anzustreben. Derartige α-helikale

Peptide sind bereits auf Oberflächen aufgebracht und hinsichtlich ihrer Orientierung und ihrer

lateralen Packungsdichte charakterisiert worden 49-56, 59, 60, 64. Bei diesen Experimenten wurde

bei den helikalen Peptiden ein zum Dipolmoment der Ethylenglykole analoges

„Helixdipolmoment“ festgestellt.

Abb.5.2: Schematische Darstellung eines kurzen Peptidthiols bestehend aus wenigen Aminosäuren.

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Kapitel 5 Proteinresistente Thiole

- 85 -

Die strukturbildenden Eigenschaften von Aminosäuren sind gut untersucht. Starke α-

Helixbildner sind Ala, Lys, Glu, Leu und Met, darüber hinaus gibt es eine Reihe von

schwachen bzw. „helix-neutralen“ Aminosäuren. Wegen der hydrophoben Eigenschaften der

Helixbildner ist es vorzuziehen, dass diese Aminosäuren sich eher im Inneren des Peptid-

SAMs befinden, um unerwünschte, hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Wasser bzw. mit

den Proteinmolekülen zu vermeiden.

Im Hinblick auf den Aufbau der proteophoben Peptid-SAMs soll eine Sequenzlänge von etwa

10 Aminosäuren angestrebt werden, damit innerhalb eines einzelnen Peptids eine komplette

Windung einer Peptid α-Helix realisiert werden kann.

Ein rein kombinatorischer Zugang ergibt damit selbst unter den oben genannten

Einschränkungen noch deutlich zu viele Peptidsequenzen. Aus diesen Gründen wurde

zusätzlich auf den Einsatz geladener Aminosäuren verzichtet. Als Nebeneffekt wird damit

auch eine elektrostatisch vermittelte Proteinadsorption verhindert. An dieser Stelle soll noch

einmal speziell darauf hingewiesen werden, dass nicht nur die letzten 3 bis 4 Aminosäuren,

die dem Protein an der Petid-SAM-Oberfläche direkt zugänglich sind, bei der Adsorption eine

wichtige Rolle spielen. Frühere Untersuchungen (siehe Kapitel 2) haben eindeutig gezeigt,

dass auch die innere Struktur der SAMs relevant ist (z.B. im Zusammenhang mit der

Einlagerung von Wassermolekülen).

5.1 Synthese und Chrakterisierung der Peptide

Die Peptide wurden in einem kommerziellen Mikrowellen Peptid Synthesizer (Firma CEM)

hergestellt. Der Ansatz bestand dabei aus 0,1 mM Leu-Wang-Harz (Beladung 0,69 mmol/g),

0,2 M Aminosäure-lösungen in DMF and 0,5 M Aktivator TBTU/HOBt und 2 M DIPEA

Lösung 158. Die fertigen Peptide wurden anschließend über Electrospray Ionisierungs

Massenspektrometrie (ESI-MS) 159, MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/ Ionization)

und Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) charakterisiert. Die Synthese und

Charakterisierung solcher Oligo-Peptide ist in der Literatur weit verbreitet und standardisiert,

weshalb hier nicht weiter darauf eingegangen werden soll.

5.2 Synthese und Charakterisierung der Peptidthiole

Für die Click-Reaktion wurden die Peptide für 72 Stunden in einer Lösung aus CuI

(0,2123mmol), DIPEA (12,735mmol) und 11-thioacetyl-undekansäure-propargyl amid

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Kapitel 5 Proteinresistente Thiole

- 86 -

(0,1698 mmol) in DMF (1,1ml) inkubiert. Für die Experimente wurde eine Stammlösung der

Peptide in Ethanol angesetzt (c=36mM). Für die weiteren Experimente wurden je 200µl der

Stammlösung mit 7ml Ethanol verdünnt, um eine 1mM Lösung an Peptidthiol zu erhalten.

5.2.1 Peptid-1-Thiol

Abbildung 5.2 zeigt das Ergebnis der HPLC von Peptid-1. Es ist klar ersichtlich, dass die

Substanz in großer Reinheit vorliegt. Zur Bestätigung, dass es sich um das gewünschte

Produkt handelt wurde zusätzlich ein ESI-MS aufgenommen.

0 5 10 15 20-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0Molekülbande: 6,634

Basislinie

norm

. Int

ensi

tät

Zeit [min]

Abb.5.3: HPLC-Spektrum des Produktes aus der Synthese von Peptid-1.

d

In Abbildung 5.4 ist das Massenspektrum des synthetisierten Peptidthiols dargestellt. Im

Folgenden sind die drei wichtigsten Peaks aufgeführt:

[M+H]+/2 bei m/z= 617,26

[M+H]+ bei m/z= 1233,80

[M+Na]+ bei m/z= 1258,90

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Kapitel 5 Proteinresistente Thiole

- 87 -

1000 1200

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1258,90

1233,80

x 7,5

norm

. Int

ensi

tät

Masse [m/z]

600 610 620 630 640 650

617,23

norm

.Inte

nsitä

t

Masse [m/z]

Abb.5.4: ESI-MS-Spektren des Peptid-1-Thiol. Im oberen Spektrum ist der Bereich von m/z = 1000-

1300 gezeigt, indem der Massenpeak deutlich zu erkennen ist. Im unteren Spektrum ist eine

Vergrößerung des Bereichs von m/z = 600-650 gezeigt, indem der „Halbmassen“-Peak von

m/z = 617,23 zu erkennen ist.

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Kapitel 5 Proteinresistente Thiole

- 88 -

Sowohl der Massenpeak (1233,8) als auch der „Halbmassen-Peak“ bei 617,26 sind deutlich

und leicht identifizierbar. Weitere Teilfragmente können identifiziert werden. Die drei

stärksten sind im Folgenden exemplarisch dargestellt:

Peak bei 256,15

Peak bei 383,18

Peak bei 532,24

Aus den Massenspektren kann eindeutig auf das gewünschte Peptidthiol geschlossen werden.

Die HPLC zeigt zusätzlich, dass die Substanz in großer Reinheit vorliegt.

Abb.5.5: XPS Spektren des Peptid-1-Thiol SAM und des CH3 terminierten SAM (Oktadekanthiol) im

direkten Vergleich. Es sind die Au4f, die C1s, die S2p, die O1s und die N1s Region gezeigt.

O

S

O

HN

O

S

O

NN

NH2CC

O

HN CH2 C

O

HN CH C

CH2

O

CH2

CH2

CH2

NH2

HN CH2 C

O

HN CH C

CH2

O

OH

HN CH C

CH2

O

OH

HN CH2 C

O

HN CH

CH2

OH

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Kapitel 5 Proteinresistente Thiole

- 89 -

Zur weiteren Charakterisierung wurden mit dem Peptid-1-Thiol-SAM XPS Messungen

durchgeführt. Hierzu wurde zusätzlich ein SAM aus Oktadekanthiol hergestellt. Beide Proben

wurden dann zusammen auf denselben Probenhalter aufgebaut. Anschließend wurden sie

zusammen in die XPS-Apparatur eingeschleust und vermessen. Dieser Aufbau erlaubt die

Bestimmung der Höhe des Peptid-1-Thiol-SAMs, indem die Höhe des Oktadekanthiol SAMs

als Referenz genommen wird. Die Berechnung erfolgt über folgende Formel160:

( ) ( ) ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −÷⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛∗⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛÷⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛ −=÷

−−−− )()(

)()(

)()(

)()(

11)()( )()(

)()( ads

refdmetrefd

metsampled

adssampled

eeeerefsample metIadsI

metIadsI λλλλ .

Für die Analyse der Daten wurden die Flächen unter den Au4f- und C1s-Banden integriert.

Anschließend wurde oben stehende Gleichung numerisch gelöst. Um die Schichtdicke des

Peptid-1-Thiol SAMs zu bestimmen wurde zudem für das Oktdekanthiol eine Schichtdicke

von 22Å und eine mittlere freie Weglänge von λ(met) = 39,9Å und λ(ads) = 35,5Å

angenommen161.

Mit diesen Werten aus der Literatur ergibt sich die Schichtdicke des Peptid-1-Thiol-SAMs zu

(56,6±6)Å. Dieses Ergebnis korreliert gut mit der Länge, die man für den reinen Thiolanker

(20,8Å) und ein Dekapeptid erwarten würde, welches zu einem β-Faltblatt (~30Å) geordnet

ist (oder eine nur leicht gedrehte α-Helix). Ein starke α-Helix (wie man sie in nativen

Proteinen vorfindet) hätte nur eine Länge von etwa 16Å (zusammen mit dem Thiolanker also

nur etwa 37Å).

Auf Grund der höheren Schichtdicke ist das Au4f-Signal im Peptid-1Thiol-SAM kleiner als

im Oktadekanthiol-SAM. Diese hohe Schichtdicke ist ebenfalls dafür verantwortlich, dass das

Schwefelsignal des Thiolankers nicht mehr detektiert werden kann. Die Anwesenheit der

Aminosäuren -welche Kohlenstoffatome in verschiedenen Oxidationsstufen enthalten- führt

zu einer Verbreiterung der C1s-Bande. Die Anwesenheit der Amninosäuren wird auch in den

N1s- und O1s-Banden sichtbar, da die Banden an typischen Positionen für –NH; -NR2, -OH

und -COOH-Gruppen liegen.

Die stöchiometrische Auswertung führt zu CnO0,37nN0,19n; es ist also fast doppelt soviel

Sauerstoff wie Stickstoff enthalten, was gut mit der Sequenz des Peptid-1-thiols

übereinstimmt.

5.2.2 Peptid-2-Thiol

Abbildung 5.6 zeigt das ESI-MS des Peptid-2-thiols. Gemessen wurde im Negativmodus (An

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Kapitel 5 Proteinresistente Thiole

- 90 -

der Kapillare wird eine negative Spannung angelegt, so dass negative Molekülionen [M-H]-

entstehen, die dann zum Detektor hin beschleunigt werden). Der Massenpeak bei

m/z = 1202,46 ist gut sichtbar. Die anderen Peaks können einzelnen Fragmenten zugeordnet

werden. Zur weiteren Bestätigung wurde noch ein MALDI-Spektrum (Positivmodus; es wird

eine positive Spannung angelegt, so dass positive Moleküionen [M-H]+ entstehen)

angefertigt. Dieses ist in Abbildung 5.6 dargestellt.

Das ESI-MS zeigt einen deutlichen Massen-Peak bei [M-H]-=1202,46. Dieser Peak entspricht

der Masse des Peptid-2-thiols (M=1202,5g/mol). Im MALDI-Spektrum ist der Hauptpeak bei

m/z = 1205,8 zu erkennen. Dieser Peak bei m/z = 1205,8 kann [M+H]+ zugeordnet werden.

Die Masse des [M+H]+-Peaks ist 2g/mol daneben, was aber im MALDI nichts

Ungewöhnliches ist.

0 500 1000 15000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1202,46

norm

. Int

ensi

tät

Masse [m/z]

Abb.5.6: ESI-MS-Spektrum des Peptid-2-Thiols. Der Peak bei m/z = 1202,46 gehört zu [M-H]-

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Kapitel 5 Proteinresistente Thiole

- 91 -

600 800 1000 1200 1400

0

50

100

150

200

250

1268,77

1205,77

Inte

nsitä

t

Masse [m/z]

Abb.5.7: MALDI-Spektrum des Peptid-2-Thiols. Der Peak bei m/z = 1205,8 gehört zu [M+H]+. 5.3 Herstellung der Peptid-SAMs

Die Au/Si Wafer wurden wie beschrieben (Siehe Kapitel 3.1) hergestellt und anschließend in

Stücke von 20mm x 30mm geschnitten; dann wurden sie mit abs. Ethanol gesäubert und

letztlich im Stickstoffstrom getrocknet. Die Wafer wurden dann für 24 Stunden in einer 1mM

Lösung der Peptidthiole eingelegt. Anschließend wurden die fertigen Substrate mit abs.

Ethanol gewaschen und bis zum Gebrauch in Ethanol gelagert. Die so präparierten SAMs

wurden mittels IR-Spektroskopie charakterisiert.

Abbildung 5.7 zeigt das KBr-IR-Spektrum des Peptid-1-Thiols im Vergleich zum

IR-Spektrum des Peptid-1-SAMs. Die Peaks sind in Tabelle 5.1 zusammengefasst. Die für

Oliogopeptide (bzw. Proteine) charakteristischen Amid-Banden (-A, -I, -II, -III and -IV) sind

deutlich zu erkennen.

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Kapitel 5 Proteinresistente Thiole

- 92 -

Abb.5.8: Vergleich der IR Spektren des Peptid-1-Thiols im Volumen (KBr-Pressling) und im SAM. Tab.5.1: Zusammenfassung der wichtigsten Banden für das Peptid-1-Thiol im Volumen und im SAM.

Wellenzahl [cm-1]

Gruppe KBr SAM

Amid-A 3330 3291

Amid-I 1673 1690

Amid-II 1546 1545

Amid-III 1130 1078

Amid-IV 826 802

C=C (Triazolring) 3069 3073

CH (aliphatisch) 2931 2917

Die gleichen Experimente wurden mit dem Peptid-2-Thiol wiederholt und führten zum selben

Ergebnis; da aus den Daten keine neuen Erkenntnisse gewonnen werden können, kann auf

eine detaillierte Darstellung verzichtet werden.

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Kapitel 5 Proteinresistente Thiole

- 93 -

5.4 Oberflächenplasmonenresonanz

Dünne Glasscheiben (D263T) mit den Maßen 10x10x0,9mm (Schott) wurden mit Ethanol

gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet. Anschließend wurden sie, wie in Kapitel 3.1

beschrieben, bedampft. Die endgültige Schichtdicke des Titanfilms betrug dabei 12Å, die des

Goldfilms 500Å. Die beschichteten Glassubstrate wurden dann für 24 Stunden in der

jeweiligen Peptidthiollösung (c=1mM) inkubiert. Die so präparierten Substrate wurden

anschließend mit abs. Ethanol gewaschen, im Stickstoffstrom getrocknet und in ein

kommerzielles Oberflächenplasmonenresonanz-Spektrometer (Reichert SR7000DC, Xantec

bioanalytics) eingebaut.

Als erstes wurde die Adsorption von SA (c=200nM≈0.01mg/ml, Invitrogen) gemessen,

anschließend die Adsorption von BSA (c=2µM≈130mg/ml, SIGMA) und zuletzt die

Adsorption von Fibronectin (c=200nM, SIGMA).

Die Adsorptionsmessungen wurden dabei nach folgendem Protokoll durchgeführt: Zuerst

wurde die Oberfläche mit TRIS-Puffer (pH 7,9, 50mM TRIS, 5mM MgCl2) für 5 min gespült;

dann wurden die Proteinlösungen für 1 min injiziert und die Oberfläche anschließend für

1 Minute mit Puffer gewaschen. Abschließend wurde die Oberfläche für weitere 5 Minuten

mit TRIS-Puffer gespült. Die Flussrate betrug bei allen Experimenten 0,2ml/min.

Zur Kontrolle der Ergebnisse aus der SPR-Technik wurden IR-Experimente mit längeren

Adsorptionszeiten (15, 30 Minuten) durchgeführt.

5.4.1 Adsorption von Streptavidin

Zuerst wurde die Adsorption von Streptavidin auf dem Peptid-1-SAM gemessen. Zum

Vergleich wurden Messungen auf dem Peptid-2-SAM, einem CH3-terminierten SAM und

einem OEG(6)-terminierten SAM vorgenommen. Der CH3-terminierte SAM gilt dabei als

SAM, auf dem sehr leicht und sehr stark unspezifische Adsorption stattfindet, während der

OEG(6)-SAM proteinresistent ist. Die Ergebnisse der Messungen sind in Abbildung 5.8

dargestellt. Tabelle 5.2 fasst die Ergebnisse der Adsorptionsmessungen zusammen. Auf dem

CH3-terminierten SAM und dem Peptid-2-SAM ist die unspezifische Adsorption

erwartungsgemäß stark (CH3: mAds=66,3ng/cm²; Peptid-2: 62,3ng/cm²). Auf dem OEG(6)-

SAM kann keine Adsorption festgestellt werden (mAds= 0ng/cm²). Lediglich ein geringer

Puffersprung kann beobachtet werden, der nach Beendigung der Protein-Injektion aber wieder

vollständig verschwindet. Die Messungen für den Peptid-1-SAM zeigen das gleiche Ergebnis

wie für den OEG(6)-SAM. Es ist keine Adsorption feststellbar, der Puffersprung ist

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Kapitel 5 Proteinresistente Thiole

- 94 -

wesentlich geringer. Gegen Streptavidin zeigt der Peptidthiol-SAM also eine 100%-ige

Proteinresistenz. Für einen besseren Vergleich mit der Literatur wurden die Messungen mit

einer Streptavidinkozentration von c(SA)=1mg/ml wiederholt, die Injektionszeit wurde bei

diesen Messungen auf 10min erhöht, um ebenfalls der Literatur besser zu

entsprechen.

0 50 100 150 2000

50100150200250300350400450500550600650700

mAds66,3ng/cm²

EndeBeginn

Peptid-1 SAM

OEG(6) SAM

CH3 SAM

Ads

orpt

ion

[ng/

cm²]

Zeit [sec]

Abb.5.9: Zusammenfassung der Adsorptionskurven für Streptavidin auf den verschieden terminierten

SAMs. Der Beginn und das Ende der Inkubation der Streptavidinlösung sind mit senkrechten Linien

gekennzeichnet. Der Übersicht halber ist die Kurve für den Peptid-2-SAM nicht gezeigt.

Tab.5.2: Zusammenfassung der Streptavidinadsorption.

SAM CH3 Peptid-2 OEG(6) Peptid-1 mAds [ng/cm²] c=0,01 mg/ml 66,3 62,3 ≤0,1 ≤0,1 mAds [ng/cm²] c=1,00 mg/ml 131,02 - ≤0,1 4,06

Die Messungen mit den höheren Konzentrationen bestätigen dabei tendenziell die Ergebnisse,

die mit den niedrigeren Konzentrationen erzielt wurden.

Für die IR-Messungen wurden Wafer, wie in Kapitel 5.3 beschrieben, präpariert.

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Kapitel 5 Proteinresistente Thiole

- 95 -

Anschließend wurde ein IR-Spektrum aufgenommen. Danach wurde der Wafer in einer

200nM-Streptavidinlösung inkubiert. Nach 15 Minuten wurde ein weiteres IR-Spektrum

aufgenommen (Abbildung 5.10). Es ist eindeutig zu erkennen, dass sich die Signale auch mit

fortschreitender Inkubationszeit nicht verändern, dass heißt, dass kein Protein auf die

Oberfläche adsorbiert. Die Banden der IR-Messungen sind in Tabelle 5.3 zusammengefasst.

Abb.5.10: IR Spektren des Peptid-1-Thiol-SAMs als Volumenspektrum (KBr, oberes Spektrum) und

an der Oberfläche vor (unteres Spektrum) und nach (mittleres Spektrum) Inkubation des Streptavidins

(15min).

Tab.5.3: Vergleich der IR-Spektren im Volumen und an der Oberfläche vor und nach Adsorption des Streptavidins. Gruppe KBr vor

Inkubationnach

InkubationAmid-A 3330 3291 3303 C=C (Triazol-Ring) 3069 3073 3067 CH (aliphatisch) 2931 2927 2924 Amid-I 1673 1690 1689 Amid-II 1546 1545 1545 Amid-III 1130 1078 1081 Amid-IV 826 802 811

Die charakteristischen Amid-Banden (-A, -I, -II, -III and -IV) sind deutlich zu erkennen. Das

Spektrum des Peptid-1-Thiol-SAMs wird durch die Adsorption des Streptavidins nicht

beeinflusst.

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Kapitel 5 Proteinresistente Thiole

- 96 -

5.4.2 Adsorption von BSA

Im nächsten Schritt wurde die Adsorption von BSA auf dem Peptid-1-SAM gemessen und

mit der Adsorption auf einem CH3-terminierten, einem OH-terminierten und einem OEG(6)-

terminierten SAM verglichen. Abbildung 5.9 zeigt die Ergebnisse dieser Messungen.

Tabelle 5.3 fasst die Ergebnisse dieser Messungen zusammen. Es ist sehr gut ersichtlich, dass

keine vollständige Proteinresistenz des Peptid-1-SAMs gegen BSA vorliegt. Die

Größenordnung der Adsorption liegt nahe am Bereich wie für den OEG(6)-SAM (Daten nicht

gezeigt); Dies ist ein gutes Ergebnis, vor allem wenn man berücksichtigt, dass die

Proteinkonzentration mit c(BSA)=2µM sehr hoch ist.

50 100 150600

650

700

750

800

850

- 60,0 ng/cm²- 13,5 ng/cm²- 6,3 ng/cm²

CH3 OH Peptid1

Ads

orpt

ion

[ng/

cm²]

Zeit [sec]

Abb.5.11: Zusammenfassung der Adsorption von BSA auf die verschieden terminierten SAMs. Zur

Veranschaulichung wurde im Falle des Peptid-1-SAMs eine Basislinie (vor der Proteininjektion)

eingefügt. Tab.5.4: Zusammenfassung der Adsorption von BSA.

SAM CH3 OH OEG(6) Peptid-1 mAds [ng/cm²] 60 13,5 ≤0,1 6,3

Auf IR-Messungen wurde hier verzichtet, da schon die vorherigen Experimente gezeigt

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Kapitel 5 Proteinresistente Thiole

- 97 -

haben, dass die 1-minütigen Inkubationen vollkommen ausreichend sind. Für BSA erhält man

also keine vollständige Proteinresistenz des Peptid-1-SAM. Die Größenordnung liegt aber

nahe an der auf einem OEG(6)-terminierten SAM und unter der auf einem OH-terminierten

SAM.

5.4.3 Adsorption von Fibronectin

20 40 60 80 100 120700

720

740

760

780

800- 12,6 ng/cm²- 2,3 ng/cm²

OH Peptid1

adso

rptio

n [n

g/cm

²]

time [sec]

Abb.5.12: Adsorptionskurven für Fibronectin auf einem OH- und dem Peptid-1-terminierten SAM.

Als letztes wurde die Adsorption von Fibronectin auf dem Peptid-1-SAM gemessen. Zum

Vergleich wurde zusätzlich die Adsorption auf einem CH3-terminierten und einem OEG(6)-

terminierten SAM gemessen. Abbildung 5.10 fasst die erhaltenen Adsorptionskurven

zusammen. In Tabelle 5.4 sind die adsorbierten Mengen zusammengefasst. Für den Peptid-1-

terminierten SAM ergibt sich eine Adsorption von mAds=2,3ng/cm². Für den OH-terminierten

SAM beträgt die Adsorption bereits mAds= 12,6ng/cm² und für den CH3-terminierten

mAds= 55,3ng/cm². Auf dem OEG-terminierten SAM kann keine Adsorption festgestellt

werden. Auch hier erhält man keine vollständige Proteinresistenz des Peptid-1-SAM, dennoch

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Kapitel 5 Proteinresistente Thiole

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kann ein starkes proteophobes Verhalten des SAMs charakterisiert werden. Tab.5.5: Zusammenfassung der Adsorption von Fibronectin.

SAM CH3 OH OEG(6) Peptid-1 mAds [ng/cm²] 55,3 12,6 ≤0,1 2,3

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Kapitel 6 Zusammenfassung und Ausblick

- 99 -

6 Zusammenfassung und Ausblick

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Untersuchung der Interaktion von Proteinen mit

verschieden terminierten organischen Oberflächen. Diese Interaktionen wurden differenziert

mittels spektroskopischer Verfahren charakterisiert.

Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie (SPR) diente dabei als Methode, um die

biologischen Aspekte/Eigenschaften und das Adsorptionsverhalten der verwendeten Proteine

auf die organischen/bioorganischen SAMs in physiologischer Umgebung zu bestimmen. Die

chemische Identität der verwendeten Substanzen und der hergestellten SAMs wurde an Luft

über Infrarot-Reflexions-Absorptions Spektroskopie (IRRAS) nachgewiesen. Strukturelle

Eigenschaften der verwendeten Substanzen, sowie der hergestellten SAMs wurden im

Ultrahochvakuum über Röntgenphotoelektronen-Spektroskopie (XPS) bzw.

Röntgenabsorptions-Spektroskopie (NEXAFS) charakterisiert.

6.1 Die biologische Aktivität oberflächengebundener Mehrschichten-

systeme: das Biotin- Streptavidin-Peroxidase System

Die Verankerung einer biotinylierten Peroxidase (bHRP) an zweidimensional strukturierte

Streptavidin-Assays wurde untersucht. Die Assays wurden dabei über einen 2-Schritt

Mechanismus hergestellt. Zuerst wurde eine zweidimensional strukturierte Oberfläche über

µCP aufgebaut, die zu einem Teil aus 10%-Biotinthiol und zum anderen Teil aus

OEG(6)-Thiol bestand. An den biotinthiolhaltigen Bereich wurde dann in einem zweiten

Schritt das Streptavidin spezifisch adsorbiert. Durch die Kombination verschiedener

Techniken (SPR, AFM, Photometrie) konnte dann ein konsistentes Bild der Peroxidase-

adsorption erstellt werden.

Die Interaktion von bHRP und Streptavidin ist höchst spezifisch, was über Versuche mit

verschiedenen Mengen an oberflächengebundenen Streptavidin nachgewiesen werden konnte.

Die Orientierung der adsorbierten bHRP hängt dabei mit der Menge an adsorbiertem

Streptavidin zusammen: Das molare Verhältnis zwischen bHRP und Streptavidn ändert sich

von 1:2,25 zu 1:1,13, wenn man zu höheren Streptavidinoberflächenbelegungen übergeht.

Die zweidimensionale Struktur der Proben konnte im AFM eindeutig nachgewiesen werden.

Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass sich echte Monolagen an Protein ausbilden und die

einzelnen Lagen zudem sehr homogen sind und keine großen Defekte aufweisen.

Die biologische Aktivität der adsorbierten bHRP-Moleküle wurde über photometrische

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Kapitel 6 Zusammenfassung und Ausblick

- 100 -

Messungen bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass die bHRP ihre katalytische Aktivität

beibehält, selbst wenn sie unspezifisch an die Oberfläche gebunden wird. Nichtsdestotrotz ist

die Aktivität an der Oberfläche bis zu 5mal kleiner als in Lösung, da die dichtgepackten

Moleküle um das Substrat konkurrieren.

Für zukünftige Arbeiten könnte es interessant sein, den Einfluss der Orientierung auf der

Oberfläche auf die Aktivität der adsorbierten bHRP zu untersuchen. dafür könnten

Peroxidase-Moleküle benutzt werden, die mit speziellen Biotinankern versehen sind (z.B. an

Cystein) oder durch gezielte Mutation nur noch bestimmte Bindungsstellen besitzen. Die

Oberflächenaktivität könnte dann eventuell für bessere quantitative Aktivitätsmessungen

kontrolliert werden.

6.2 Click Chemie zur Oberflächenfunktionalisierung

Die Addition von säure- und ferrocenterminierten Oberflächen wurde über verschiedene

Ansätze -Preformation in Lösung und Click-Chemie am SAM- verfolgt. Beide Strategien

beruhen auf der 1,3-dipolaren Cycloaddition von Aziden und Alkinen. Diese Art der Synthese

von Thiolen und Generierung von SAMs läuft unter sanften Bedingungen, ist billig und

höchst spezifisch.

Sowohl die Präformation der Thiole in Lösung mit anschließender Generierung des SAMs als

auch die Präformation der SAMs mit anschließender Click-Reaktion funktionieren in

Abhängigkeit der verwendeten Moleküle (und Reaktionsbedingungen 151).

Im Falle der Funktionaliserung mit Ferrocen ist die Strategie der Preformation in Lösung der

Reaktion am SAM deutlich überlegen. Erst der Wechsel der funktionellen Gruppe des

präinkubierten SAMs vom Alkin zum Azid und dem entsprechenden Wechsel der

funktionellen Gruppe des Additions-Substrats vom Azid zum Alkin führte zu einer

erfolgreichen Click-Reaktion an der Oberfläche. Dies ist deshalb überraschend, weil man eher

davon ausgehen könnte, dass das Alkin in Lösung vom Cu(I) komplexiert wird und sich

absetzt 151.

Die Kombination aus IR, XPS und NEXAFS-Daten hat sich als Methode zur

Charakteriserung der Ferrocenthiols-SAMs gut bewährt, da insbesondere im XPS/NEXAFS

das Cyclopentadienyleisen sehr gut charakterisiert werden kann.

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Kapitel 6 Zusammenfassung und Ausblick

- 101 -

6.3 Proteinresistente Peptidthiole Tab.6.1: Zusammenfassung der Adsorptionsmessungen.

mAds [ng/cm²] (niedrige Konzentrationen) SAM Streptavidin Fibronectin BSA Peptid-1 ≤0,1 2,3 6,3

In diesem Teil der Arbeit wurde ein neuer Ansatz für die Generierung proteinresistenter

SAMs untersucht. Hierzu wurden kurze Petide aus 10 Aminosäuren synthetisiert und

charakterisiert. Nach der Charakterisierung wurden die Peptide über die im vorigen Kapitel

dargestellte 1,3-dipolare Addition mit Thiolankern verbunden, um diese anschließend auf

Goldwafern zu verankern. Die so hergestellten Peptid-SAMs wurden dann mittels IRRAS

charakterisiert. Letztendlich wurde dann die Proteinresistenz gegen drei verschiedene Proteine

gemessen (Streptavidin, BSA und Fibronectin). Die SPR-Messungen konnten zeigen, dass die

hergestellten Peptid-SAMs durchaus proteinresistente Eigenschaften besitzen. In Tabelle 6.1

sind die Ergebnisse der Adsorptionsmessungen nochmals zusammengefasst.

Die Adsorption aller Proteine liegt sehr nah an der Größenordnung der Adsorption auf einem

OEG(6)-terminierten SAM (≤0,1ng/cm²). Für Streptavidin ist der Peptid-1-SAM sogar fast

vollständig proteinresistent (≤4,06ng/cm²). Der Ansatz der Synthese von Dekapeptiden und

den entsprechenden Thiolen führt also zur Generierung stark proteophober SAMs, die im

Weiteren verbessert werden kann (Kombinatorik).

Die Möglivhkeit die Peptidsequenzen frei gestalten zu können bietet ausserdem die

Möglichkeit Oberflächen zu generieren, die spezifisch bestimmte Arten von komplexeren

Biomolekülen (spezielle Proteine, DNA, Thrombozyten oder sogar vollständige Zellen)

spezifisch binden und somit als Biosensoren eingesetzt werden können.

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Kapitel 7 Literaturverzeichnis

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Anhang A Abkürzungsverzeichnis

- 115 -

Anhang A - Abkürzungsverzeichnis

Abkürzung Bedeutung Übersetzung Abb. Abbildung AFM atomic force microscop(y)e Rasterkraft - Mikoskop(ie) ATR attenuated total reflection Abnahme der Totalreflektion BSA bovine serum albumin Rinderserum-Albumin bHRP biotinylated horse radish peroxidase biotinylierte Meerrettichperoxidase bzw. beziehungsweise ca. circa ungefähr dest. destilliert DNA desoxyribonucleotidacid Desoxyribonukleinsäure EM elektromagnetische Welle(n) et al et alumni und Mitarbeiter etc. et cetera und so weiter EM elctron microscop(y)e Elektronenmikroskop(ie) engl. englisch: FFM friction force microscopy Reibungskraft-Mikroskopie LFM lateral force modus Lateralkraft - Modus Lit. Literatur NEXAFS near edge X-ray fine structure Röntgenabsorptionsspektroskopie OEG Oligoethylenglykol PDMS Polydimethylsiloxan PEG Poly-Ethylenglykol(e) PGMEA Propylenglykolmethyetheracetat PNA peptide nucleic acid Peptid-Nukleinsäure REM Rasterelektronenmikroskop(ie) RMS root mean square Quadratmittel SAM self assembled monolayer(s) selbstordnende Monolage(n) sog. sogenannte(r/s) s.o. siehe oben SP surface plasmon(s) Oberflächenplasmon(en) SPR surface plasmon resonance Oberflächenplasmonenresonanz

(-spectroscopy) (- Spektroskopie) STM scanning tunneling micrsoscop(y)e Rastertunnelmikroskop(ie) TEM Transmissionelektronenmikroskop(ie) u.a. und andere/s UV Ultraviolett VP volume plasmon(s) Volumenplasmon(en) WW Wechselwirkung(en)

XPS X-ray photo electron spectroscopy Röntgen- photoelektronenspektroskopie

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Anhang B Abbildungsverzeichnis

- 116 -

Anhang B - Abbildungsverzeichnis Abb.2.1: Gezeigt sind OEG-Thiole mit unterschiedlicher Anzahl an Ethylenglykol-Gruppen. Mit

steigender Anzahl an Ethylenglykol-Gruppen nimmt die Proteinresistenz zu. Im Laufe der Zeit kommt

es durch die chemische Instabilität der OEG-Thiole zur Degradation (Abbau von Ethylenglykol-

Einheiten) und die Proteinresistenz geht verloren.

Abb.2.2: Selbstorganisation von Alkanthiolen. Die Moleküle werden über die Ankergruppe an der

Oberfläche festgehalten. Die funktionelle Gruppe bestimmt die Eigenschaften des SAM’s

Abb.2.3: Schematische Darstellung der Biotin-Bindungstasche des Streptavidins nach der Gruppe

von Freitag 93, 94. Die Pfeile symbolisieren antiparallele β-Faltblattstrukturen, wobei die unter

physiologischen Bedingungen irreversible Biotin-Streptavidin-Komplexbildung ausschließlich durch

nicht kovalente polare (linkes Bild) und unpolare (rechtes Bild) Wechselwirkungen zustande kommt.

Abb.2.4: Tetramere Struktur des Streptavidins (nach 92) mit vier gebundenen Biotinmolekülen. Es ist

zu erkennen, dass die Bindungstasche des Streptavidins relativ tief ist.

Abb.2.5: Monomere Struktur der HRP (links). Rechts ist der Biotinanker, das Biotinamidocaproyl

dargestellt. Die Biotinfunktion (roter Kreis) ist über eine C-N-Bindung mit dem restlichen Anker

verbunden. Die HRP besitzt die folgenden Maße (RCBS-Proteindatabank): 4,1nm x 4,1nm x 6,2nm.

Abb.2.6: Herstellung a) des Masters (Photolithographie) und b) des Stempels (PDMS).

Abb.2.7: Mikrokontakt-Printing eines Thiols auf Gold (schematische Darstellung). Nur an den

Kontaktflächen des Stempels mit der Goldoberfläche kann das Thiol an das Goldsubstrat binden.

Abb.2.8: Dispersionskurven von Oberflächen- (SP) und Volumenplasmonen (VP) im Vergleich zur

Dispersiongerade des Lichts. Die Lichtgerade und die Dispersionskurve für die SP schneiden sich

nicht, es kann also keine Energie- und Impulsübetragung auftreten.

Abb.2.9: Links: Schematische Darstellung der Plasmonenresonanzkurve zu zwei verschiedenen

Zeiten T1 und T2 eines Adsorptionsprozesses. Die Minima beim entsprechenden Resonanzwinkel

α1/α2 und die Verschiebung des Resonanzwinkels sind deutlich zu erkennen. Im rechten Bild ist die

Entstehung der entsprechenden Oberflächenkinetik dargestellt.

Abb.2.10: Die Bildung eines SAMs lässt sich in Realzeit mitels SPR verfolgen: nach Kontakt einer

sauberen Goldoberfläche mit reinem Ethanol ist das SPR-Signal erstmal konstant. Nach Zugabe einer

alkoholischen Lösung vom 11-Mercapto-undekanol (linker Pfeil) nimmt das SPR-Signal stark an

Intensität zu. Nach Ende des Kontakts mit der Thiollösung (rechter Pfeil) nimmt die Intensität des

Signals wieder ab, bleibt aber weit über dem Ausgangsniveau. Es hat sich eine organische

Dünnstschicht auf der goldoberfläche gebildet.

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Anhang B Abbildungsverzeichnis

- 117 -

Abb.2.11: Schematische Darstellung des alten (links) und des neuen optischen Detektionsverfahrens

für die Auslenkung des Cantilevers (aus 108).

Abb.2.12: Schematische Darstellung und REM-Aufnahme der für Rasterkraftmikroskopie

verwendeten Spitzen für (Abbildungen links) den Tapping-Modus und (Abbildungen rechts) den

Kontakt-Modus (aus 109).

Abb.2.13: Der „Quad-Detektor“ des verwendeten Rasterkraftmikroskops der Firma Digital

Instruments. Verschiedene Segmente der Photodiode sind für die Gewinnung des Höhen- bzw.

Reibungssignals verantwortlich. Zur Gewinnung des Reibungssignals wird das Differenzsignal dCD = D

- C ausgewertet, während das Höhensignal über das Differenzsignal dAB = B - A berechnet wird 111.

Abb.2.14: Schematischer Aufbau eines Rasterkraftmikroskops im Tapping-Modus. Diese Art der

Mikroskopie ist hochempfindlich und fast vollkommen kontaktfrei, da bei optimaler Einstellung der

Parameter nur eine sehr kurze und leichte Berührung mit der Probe stattfindet 108.

Abb.2.15: Darstellung eine strukturierten Proteinfilms mittels Tapping-AFM in dest. Wasser. Im

Topgraphiemoduskann sehr schön die laterale Strukturierung der Oberfläche erkannt werden,

während im Linienspektrum (links) die Höhe der gemessenen Struktur ermittelt werden kann.

Abb.3.1: Schematischer Aufbau eines Mehrschichtsystems auf Basis der Streptavidin/Biotin-Bindung.

In diesem Fall wurde ein weiteres Protein mit einem Biotinanker versehen (biotinylierte

Meerrettichperoxidase) und an die bereits adsorbierte Streptavidinschicht angelagert.

Abb.3.2: Mechanismus der Farbreaktion von TMB, die von der HRP katalysiert wird. Das TMB wird

oxidiert und es wird ein Ladungstransfer-Komplex (im Gleichgewicht zum entsprechenden Radikal-

Kation) erhalten. Die Zugabe von Säure führt zum Farbstoff Tetramethyldiimin 136.

Abb.3.3: Darstellung der in diesem Kapitel verwendeten Thiole. Die OH-Thiole wurden zum

verdünnen des Biotin-Thiols verwendet.

Abb.3.4: REM-Aufnahmen des verwendeten Stempeltyps. Die Stempelflächen sind“quadratisch“ und

besitzen eine Seitenlänge von 3µm. Die Stempel sind wegen der besseren Stabilität nur 800nm hoch.

Abb. 3.5: Darstellung des für die Peroxidse verwendeten Biotinankers 6-(6-(5-(hexahydro-2-oxo-1H-

thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamido)hexanamido)hexanoic acid (Trvialname: Biotinamidocaproyl).

Abb.3.6: Adsorption von Streptavidin (c=200nM) auf unterschiedlich biotinylierte SAMs nach einer

Inkubationszeit von 15min. Die Fehlerbalken zeigen die Streuung von je 4 Messungen. Die

Biotinmenge bezieht sich auf eine binäre Lösung mit dem OH-Thiol.

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Anhang B Abbildungsverzeichnis

- 118 -

Abb.3.7: Detaillierte Analyse der 2 Phasen der Adsorptionskinetik von Strepatvidin (5% Biotinthiol,

200nM Streptavidin). Vor dem Fitten wurde die Kinetik normiert. Die lineare Phase macht 80% der

Kinetik aus, während die restlichen 20% ein 2-fach exponentielles Verhalten zeigen.

Abb.3.8: Die obere Kurve zeigt die unspezifische Adsorption von Streptavidin auf einem SAM aus

OH-Thiol (1a-1c) und die Bindung von bHRP auf dem unspezifisch adsorbierten Streptavidin (1d). In

der unteren Kurve (2) ist die unspezifische Adsorption von bHRP auf dem OH-Thiol SAM dargestellt.

Abb.3.9: Diffusionslimitierte Adsorption des Streptavidins auf den biotinylierten SAM. Die

Immobilisierungsdichte kann kontrolliert werden; m(ads) ist dabei die total adsorbierte Menge an

Protein.

Abb.3.10: Adsorption der bHRP (c=100nM) auf verschieden prä-immobilisierte Mengen an

Streptavidin. Mit steigender Streptavidinmenge an der Oberfläche steigt auch die Menge der

adsorbierten biotinylierten Peroxidase. Ein Teil unspezifisch adsorbierter bHRP kann durch Spülen

wieder von der Oberfläche entfernt werden.

Abb.3.11: Biotinylierte SAMs (5% Biotinthiol) wurden diffusionslimitiert mit vier verschiedenen Mengen

an Streptavidin beladen (Säulendiagramme). Anschließend wurden die Biotinbindungstaschen mit

nativem D-Biotin gesättigt (Daten nicht gezeigt). Zum Schluss wurden die Streptavidinlagen noch mit

100nM Peroxidase-Lösung inkubiert (eingefügtes Liniendiagramm). Abb.3.12: Die spezifische Peroxidase/Streptavidin-Adsorption wurde gegen die Menge an

oberflächengebundenem Streptavdin aufgetragen. Abb.3.13: A) Phasenbild der Oberfläche nach Inkubation mit dem OEG(6)-Thiol (helle Quadrate) und

dem 10%-Biotinthiol (dunkle Stege). B1) Topographiebild nach Inkubation mit Streptavidin.

C1) Topgraphiebild nach Adsorption der bHRP auf dem Streptavidin. Der Höhenkontrast verbessert

sich mit jedem Schritt der Proteinadsorption, was in den Bildern B2 (Streptavidin) und C2 (bHRP)

dargestellt ist.

Abb.3.14: Peroxidase katalysiert die Produktion eines gelben Farbstoffs, der dann photometrisch

detektiert wird. Die Höhe der Banden korreliert mit der enzymatischen Aktivität. Es wurde die Aktivität

der Enzyme in Lösung (obere 3 Linien) mit der Aktivität der Enzyme an der Oberfläche verglichen

(untere 3 Linien).

Abb.3.15: Jedes Peroxidase-Molekül (P) besitzt eine “Diffusionssphäre”. Substrate innerhalb dieser

Sphäre können die aktive Seite der Peroxidase erreichen. In Lösung (linke Darstellung) ist soviel Platz

zwischen den einzelnen Molekülen, dass sich die Sphären nicht überlappen. Bei den

oberflächengebundenen Molekülen (rechte Darstellung) liegen die Moleküle so eng zusammen, dass

es zu einer Überlappung der Sphären kommt. Dadurch konkurrieren die einzelnen Peroxidase-

Moleküle um das Substrat.

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Anhang B Abbildungsverzeichnis

- 119 -

Abb.3.16: Absorptionskurven für die Referenz-Probe (Kreise) und die Test-Probe (Quadrate). Die

Aktivität der Test-Probe liegt im Vergleich zur Referenzprobe (100% Aktivität) immer noch bei 22%. Abb.4.1: Darstellung der Reaktionssequenz zur Festphasen-Synthese von Peptid-Thiol Oligoamiden

Dabei kommen folgende Reagenzien zum Einsatz: a) PyBop, DMF b) Piperidin, DMF

c)Trifluoressigsäure, CH2Cl2.

Abb.4.2: Modifizierte 1,3 Cycloaddition nach Husigen. Im Gegensatz zur thermisch kontrollierten

Huisgen-Reaktion entstehen hier nicht 2 Enantiomere, sondern es wird das 1,4 Regioisomer erreicht.

Abb.4.3: Darstellung der für das Projekt benutzen Moleküle: azido-Undekanthiol (1), 11-thioacetyl-

undekansäure-propargylamid (2), Azidoessigsäure (3), Azidoferrocen (4) und Ethinyl Ferrocen (5).

Abb.4.4: Click Reaktionen von 2 mit 3 und 4. Als Produkte warden dann N-((1H-1,2,3 triazol-4-

yl)acetyl)-11-mercapto-undekanamid (6) und N-((1H-1,2,3-triazol-4-yl) ferrocenyl)-11-mercapto-

undekanamid (7) erhalten.

Abb.4.5: Additionsreaktion von 5 an 1. Als Produkt wird N-((1H-1,2,3-triazol-4-yl) ferrocenyl)-11-

mercapto-undekanthiol (8) erhalten.

Abb.4.6: Schematische Darstellung für die Synthese des Ferrocenthiols in Lösung mit anschließender

Formierung des SAMs. Abb.4.7: Simuliertes IR-Spektrum, KBr-IR-Spektrum und SAM-IR-Spektrum des Alkinthiols im

direkten Vergleich. Die wichtigsten Banden sind mit Strichen gekennzeichnet.

Abb. 4.8: Simuliertes IR-Spektrum und SAM-IR-Spektrum im direkten Vergleich. Die wichtigsten

Banden wurden durch Linien gekennzeichnet.

Abb.4.9: XPS-Spektren der verwendeten Thiole. Es sind die charakteristischen Bereiche für

Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Eisen dargestellt. Die unteren Kurven stellen die Ergebnisse für

das reine Alkinthiol dar, während die oberen Linien das Ferrocenthiol darstellen.

Abb.4.10: C1s NEXAFS-Spektrum von Ferrocenthiol auf einem Gold/Silicium-Wafer. Abb.4.11: Fe2p NEXAFS-Spektrum von Ferrocenthiol auf einem Gold/Silicium-Wafer. Abb.4.12: Schematische Darstellung der Synthese des Ferrocenthiols an der Oberfläche nach

Inkubation eines Goldwafers mit Alkinthiol. Abb.4.13: IR-Spektren des Alkinthiols vor (links) und nach (rechts) Reaktion mit dem Azido-Ferrocen.

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Anhang B Abbildungsverzeichnis

- 120 -

Abb.4.14: Darstellung des für den gemischt terminierten SAM verwendeten Mercapto-Undekanols.

Abb.4.15: IR Spektrum eines SAMs aus 50%Alkinthiol, welcher für 72h in der Reaktionslösung für die

Click-Chemie inkubiert wurde. Zum Vergleich ist das Spektrum eines SAM aus Ferrocenthiol gezeigt,

welches in Lösung synthetisiert und dann an die Oberfläche adsorbiert wurde. Die senkrechten Linien

zeigen 2 der charakteristischsten Peaks für die Aromaten des Ferrocenthiols.

Abb.4.16: IR Spektrum eines SAMs aus 10%Alkinthiol, welcher für 60h in der Reaktionslösung für die

Click-Chemie inkubiert wurde (unteres Spektrum). Zum Vergleich ist das Spektrum eines SAM aus

Ferrocenthiol (oberes Spektrum) gezeigt, welches in Lösung synthetisiert und dann an die Oberfläche

adsorbiert wurde. Die senkrechten Linien zeigen 2 der charakteristischsten Peaks für die Aromaten

des Ferrocenthiols. Abb.4.17: Vergrößerung der Bereiche um 1625 cm-1 und 3100 cm-1 der Spektren aus Abbildung 11. Im Spektrum des 10%-igen Alkinthiol-SAMs sind keine Peaks des Ferrocens zu erkennen.

Abb.4.18: IR-Spektrum eines SAMs aus 11-mercapto-Undekanol (OH-Thiol).

Abb.4.19: IR-Spektren des Azidoundekanthiols im Volumen (KBr) und an der Oberfläche (SAM).

Abb.4.20: IR-Spektrum von 8 (Kreise) im Vergleich zu den beiden Ausgangsprodukten 1 (Quadrate)

und 5 (Dreiecke). Abb.4.21: Simuliertes Spektrum der Azidoessigsäure. Die beiden stärksten Banden liegen bei

2105cm-1 (Azid) und 1705cm-1 (Carbonsäure).

Abb.4.22: IR-Spektrum des Click-Produktes (Experiment) im Vergleich zu einem simulierten Spektrum

des Click-Produktes.

Abb.5.1: Schematische Darstellung der verwendeten Peptide und des Thiolankers (vgl. Kapitel 4

Substanz 2). Peptid-1 (A) ist aus hydrophilen Aminosäuren (Serin (Ser), Lysin (Lys), Threonin (Thr))

und Gly aufgebaut. Gly ist nicht hydrophil aber wichtig für die helikale Struktur des Peptids. Peptid-2

(B) ist eine einfache Kette aus den Aminosäuren mit hydrophoben Seitenketten: Leucin (Leu), Alanin

(Ala) und Prolin (Pro).

Abb.5.2: Schematische Darstellung eines kurzen Peptidthiols bestehend aus wenigen Aminosäuren.

Abb.5.3: HPLC-Spektrum des Produktes aus der Synthese von Peptid-1.

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Anhang B Abbildungsverzeichnis

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Abb.5.4: ESI-MS-Spektren des Peptid-1-Thiol. Im oberen Spektrum ist der Bereich von 1000-

1300g/mol gezeigt, indem der Massenpeak deutlich zu erkennen ist. Im unteren Spektrum ist eine

Vergrößerung des Bereichs von 600-650g/mol gezeigt, indem der „Halbmassen“-Peak von

617,23g/mol zu erkennen ist. Abb.5.5: XPS Spektren des Peptid-1-Thiol SAM und des CH3 terminierten SAM (Oktadekanthiol) im

direkten Vergleich. Es sind die Au4f, die C1s, die S2p, die O1s und die N1s Region gezeigt.

Abb.5.6: ESI-MS-Spektrum des Peptid-2-Thiols. Der Peak bei 1202.47g/mol gehört zu [M-H]-. Abb.5.7: MALDI-Spektrum des Peptid-2-Thiols. Der Peak bei 1205.8 gehört zu [M+H]+. Abb.5.8: Vergleich der IR Spektren des Peptid-1-Thiols im Volumen (KBr-Pressling) und im SAM. Abb.5.9: Zusammenfassung der Adsorptionskurven für Streptavidin auf den verschieden terminierten

SAMs. Der Beginn und das Ende der Inkubation der Streptavidinlösung sind mit senkrechten Linien

gekennzeichnet.

Abb.5.10: IR Spektren des Peptid-1-Thiol-SAMs als Volumenspektrum (KBr, oberes Spektrum) und

an der Oberfläche vor (unteres Spektrum) und nach (mittleres Spektrum) Inkubation des Streptavidins

(15min).

Abb.5.11: Zusammenfassung der Adsorption von BSA auf die verschieden terminierten SAMs. Zur

Veranschaulichung wurde im Falle des Peptid-1-SAMs eine Basislinie (vor der Proteininjektion)

eingefügt.

Abb.5.12: Adsorptionskurven für Fibronectin auf einem OH- und dem Peptid-1-terminierten SAM.

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Anhang C Tabellenverzeichnis

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Anhang C - Tabellenverzeichnis Tab.2.1: Dissoziationseigenschaften des Streptavidin - Biotin - Komplexes (89,95).

Tab.3.1: Vergleich des 1-und 2-fach exponentiellen Fits für die nicht lineare Phase der Streptavidin-

Kinetik. Vor dem Fitten wurde die Kinetik normiert und besitzt daher keine Dimension mehr. Tab.4.1: Vergleich der wichtigsten IR-Banden des Alkinthiols mit Literatur und Simulation.

Tab.4.2: Vergleich der wichtigsten IR-Banden des Ferrocenthiol-SAMs mit Literatur und Simulation.

Tab.4.3: Vergleich der charakteristischen Banden für die Ferrocengruppe aus Literatur, Simulation

und Experiment. Tab.4.4: Vergleich der wichtigsten IR-Banden des Azidothiols im Volumen (KBr), an der Oberfläche

(SAM) und mit der Sumulation (Spektrum nicht gezeigt).

Tab.4.5: Vergleich der wichtigsten IR-Banden des Azidothiols im Volumen (KBr), an der Oberfläche

(SAM) und mit der Sumulation (Spektrum nicht gezeigt).

Tab. 4.6: Zusammenfassung der wichtigsten IR-Banden für das Reaktionsprodukt 6 aus 2 und 3 und

der Simulation von 6.

Tab.5.1: Zusammenfassung der wichtigsten Banden für das Peptid-1-Thiol im Volumen und im SAM.

Tab.5.2: Zusammenfassung der Streptavidinadsorption.

Tab.5.3: Vergleich der IR-Spektren im Volumen und an der Oberfläche vor und nach Adsorption des Streptavidins. Tab.5.4: Zusammenfassung der Adsorption von BSA.

Tab.5.5: Zusammenfassung der Adsorption von Fibronectin.

Tab.6.1: Zusammenfassung der Adsorptionsmessungen.

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Anhang D Liste der Publikationen

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Anhang D - Liste der Publikationen

(1) R. Chelmowski, A. Prekelt, Ch. Grunwald und Ch. Wöll, A Case Study on Biological Activity in a Surface-Bound Multicomponent System: TheBiotin-Streptavidin-Peroxidase System, J. Phys. Chem. A, 2007, 111, 12295-12303

(2) R. Chelmowski, D. Köster, A. Kerstan, A. Prekelt, Ch. Grunwald, N. Metzler-Nolte,

A. Terfort und Ch. Wöll, Peptide-based SAMs that resist the adsorption of proteins, JACS, accepted

(3) R. Chelmowski, D. Käfer, D. Köster, T.Klasen, T. Winkler, A. Terfort, N. Metzler-Nolte und Ch. Wöll, Post-synthesis modification of SAMs: Using click-chemistry to functionalize organic surfaces, in progress

(4) S. Hermes, F. Schröder, R. Chelmowski, Ch. Wöll und R. A. Fischer, Selective Nucleation and Growth of Metal-Organic Open Framework Thin Films on Patterned COOH/CF3 Terminated Self-Assembled Monolayers on Au(111), J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 13744-13745

(5) I. Saldan, J. Frenzel, O. Shekhah, R. Chelmowski, A. Birkner, Ch. Wöll, Surface of

Ti–Ni alloys after their preparation, Journal of Alloys and Compounds 2008, in press

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Anhang E Lebenslauf

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Anhang E - Lebenslauf Persönliche Daten Name: Chelmowski, Rolf Anschrift: Am Gartenkamp 8 44807 Bochum 0234/2989059 Mail: [email protected] Geburtsdatum: 19.09.1980 in Bochum Familienstand: ledig

Voraussichtlicher Berufsabschluss SS08 Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer.nat.) Hochschulstudium SS05 - SS08 Promotion im Fachbereich Chemie

an der Ruhr-Universität Bochum WS00/01 - SS05 Diplom im Fachbereich Chemie an der Ruhr-Universität Bochum Abschluss: Diplom Biochemiker Studienschwerpunkte: Biophysikalische Chemie Zivildienst 10/1999 – 10/2000: Caritas e.V. Bochum, Kurzzeitpflegestation in Bochum Schulbildung 08/1990 – 05/1999: Gymnasium am Ostring in Bochum, Abitur 08/1986 – 05/1990: Gemeinschaftsgrundschule am Volkspark in Bochum Besondere Kenntnisse und Interessen Fach: Toxikologie und Chemikalienrecht, eingeschränkte

Fachkenntnis EDV: Word, Excel, PowerPoint, Corel Draw, Auto Desk Inventor,

Chem Draw, Isis Draw, Nanoscope IIIa Sprachen: Englisch, Latein Interessen: Lesen, Schreiben, Musik Hören, Judo

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Anhang F Danksagung

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Anhang F - Danksagung Ich möchte an dieser Stelle einigen Personen danken, die mir bei der Entstehung dieser Arbeit

in der vorliegenden Form sehr geholfen haben.

Herrn Prof. Dr. Christof Wöll (Lehrstuhl für Physikalische Chemie I an der Ruhr - Universität

Bochum) danke ich für das interessante und aktuelle Arbeitsthema, dem Interesse an diesem

Thema, der Möglichkeit die experimentellen Techniken und die Gestaltung der Experimente

frei wählen zu können, seinem Engagement, seiner Diskussionsbereitschaft und für meine

finanzielle und wissenschaftliche Unterstützung.

Herrn Prof. Dr. Andreas Terfort (Institut für Anorganische und Angewandte Chemie an der

Universität Hamburg) für die Synthese einiger Chemikalien und der PDMS-Stempel, die

Anregungen und Ideen und die Geduld und Diskussionsbereitschaft.

Herrn Prof. Nils Metzler-Nolte und Herrn Dipl.-Chem. David Köster für die Zusammenarbeit

und die Hilfe im Bereich der Cklick-Chemie

Herrn Dr. rer. nat. Christian Grunwald (Lehrstuhl für Biochemie Biocenter, Johann Wolfgang

Goethe - Universität, Frankfurt a.M.) für den Beistand während dieser Arbeit, beinhaltend

Diskussionen, Unterstützung, zur Verfügung stehende Chemikalien und Präparation der

Substrate (Kapitel 3).

Dr. rer. nat. Alexander Birkner, Dr. rer. nat. Asif Bashir (beide: Lehrstuhl für Physikalische

Chemie I an der Ruhr - Universität Bochum) für die Bereitschaft zur Diskussion der AFM

Messungen.

Herrn B.Sc. Tim Klasen für die Untestützung während der Experimente zur Click-Chemie.

Andreas Prekelt, Konstantinos Zacharoupolos, Tatjana Ladnorg, Melanie Thoß, Christopher

Finke, Andreas Kerstan, Tim Klasen und Asif Bashir danke ich für die Freundschaft und

Hilsbereitschaft, die sie mir während meines gesamten Studiums haben zukommen lassen.

Und letztlich auch meinen Freunden und meiner Familie, insbesondere meinen Eltern und

meiner Freundin, die mir durch die finanzielle und moralische Unterstützung das Studium

ermöglicht haben.