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  • Proteinchemie an Oberflchen -

    von der spezifischen Interaktion

    zur Proteinresistenz

    Dissertation zur Erlangung des Grades eines

    Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

    der Fakultt fr Chemie Ruhr-Universitt Bochum

    vorgelegt von

    Dipl.-Biochem. Rolf Chelmowski

    Lehrstuhl fr Physikalische Chemie I Bochum 2008

  • Der Zweifel ist der Beginn der Wissenschaft.

    Wer nichts anzweifelt, prft nichts.

    Wer nichts prft, entdeckt nichts.

    Wer nichts entdeckt, ist blind und bleibt blind.

    Teilhard de Chardin (1881-1955),

    frz. Theologe, Palontologe u. Philosoph

  • . .

    I

    Inhaltsverzeichnis

    1 Einleitung 7

    1.1 Einfhrung in die Protein-Oberflchen Wechselwirkung 7 1.2 Zielsetzung 8 2 Theoretische Grundlagen 10

    2.1 Mechanismen der Proteinadsorption auf Festkrperoberflchen 10 2.2 Triebkrfte der Adsorption von Proteinen an Festkrperoberflchen 11 2.2.1 Schwache Wechselwirkungen 11 2.2.2 Ionische Wechselwirkungen 11 2.2.3 Hydrophobe Wechselwirkungen 11 2.2.4 Konformationsentropie 12 2.2.5 Gesamtbild des Mechanismus der unspezifischen Proteinadsorption an 13 Oberflchen 2.2.6 Einfluss des umgebenden Mediums auf die Proteinadsorption 13 2.3 Klassische proteinresistente Oberflchen 14 2.3.1 Beobachtungen zur klassischen Proteinresistenz und OEG-SAMs 15 2.3.2 Erklrungsanstze fr das Phnomen der klassischen Proteinresistenz 15 2.3.3 Alternative proteinresistente Oberflchen 16 2.4 Herstellung ultradnner organischer Filme mittels Selbstorganisation 17 2.4.1 Herstellung von selbstassemblierenden Monolagen aus Peptidthiolen 18 2.5 Streptavidin/Biotin-System 19 2.6 Strepatvidin/Meerrettichperoxidase (HRP) System 21 2.7 Darstellung anderer verwendeter Proteine 22 2.7.1 Rinder-Serum-Albumin (BSA) 22 2.7.2 Fibronectin 23 2.8 Substrate fr die Oberflchenexperimente 23

  • . .

    II

    2.9 Messmethoden zur Oberflchenanalytik 24 2.9.1 Mikrokontaktstempeln 24 2.9.2 Oberflchenplasmonenresonanz - Spektroskopie 27 2.9.3 Rastersondenmikroskopie 30 2.9.3.1 Rastertunnelmikroskopie 30 2.9.3.2 Rasterkraftmikroskopie 31 2.9.3.3 Rasterkraftmikroskopie im Kontaktmodus 33 2.9.3.4 Rasterkraftmikroskopie im Tapping-Modus 34 2.9.4 Infrarot-Spektroskopie 37 2.9.5 Rntgen-Photoelektronenspektroskopie 38 2.9.6 Rntgenabsorptionsspektroskopie 39 3 Die biologische Aktivitt oberflchengebundener Mehrschichtensysteme: das Biotin- Streptavidin-Peroxidase System 40 3.1 Prparation der Substrate 42 3.1.1 Substrate fr die SPR-Messungen 42 3.1.2 Substrate fr die AFM_Messungen 43 3.1.2.1 Mikrokontaktstempeln (CP) 43 3.1.3 Substrate fr die Aktivittstests 44 3.2 Oberflchenplasmonenresonanz-Messungen 45 3.2.1 Variierung der Biotinthiol-Konzentration 45 3.2.2 Kontrolle der Streptavidinbelegung 46 3.2.2.1 Echt-Zeit Adsoptionskinetik von Streptavidin 47 3.2.2.2 Diffusionslimitierte Streptavidinbeladung 49 3.2.3 Unspezifische Adsorption der Proteine auf einem OH-terminierten SAM 51 3.2.4 Das Streptavidin/Peroxidase-System 51 3.2.4.1 Adsorption der Peroxidase 51 3.2.4.2 Unspezifische Adsorption der Peroxidase 52 3.2.4.3 Korrelation zwischen Streptavidin und Peroxidase 53 3.2.4.4 Diskussion 54 3.2 Rasterkraftmikroskopie 55 3.3 Aktivittstests 57

  • . .

    III

    4 Click-Chemie zur Oberflchenfunktionalisierung 61 4.1 Addition von Azodoferrocen an 11-thioacetyl-undekansurepropargylamid in Lsung 63 4.1.1 Azidoferrocen 63 4.1.2 11-thioacetyl-undekansure-propargylamid 64 4.1.3 Ferrocenthiol 66 4.1.3.1 IRRAS-Messungen 66 4.1.3.2 XPS-Messungen 68 4.1.3.3 NEXAFS-Messungen 69 4.1.4 Zusammenfassung: Click-Chemie in Lsung 71 4.2 Addition von Azidoferocen 11-thioacetyl-undekansure-propargylamid an der Oberflche 71 4.2.1 Click-Reaktion am vollstndigen Alkinthiol-SAM 71 4.2.1.1 IRRAS-Messungen 71 4.2.1.2 XPS-Messungen 72 4.2.2 Click-Reaktion am gemischt terminierten Alkinthiol-SAM 73 4.2.2.1 50% Alkinthiol-SAM 73 4.2.2.2 10% Alkinthiol-SAM 75 4.2.3 Zusammenfassung 77 4.3 Reaktion von Ethinyl-ferrocen an Azidoundekanthiol an der Oberflche 77 4.3.1 Ethinyl-Ferrocen 77 4.3.2 Azido-terminiertes Undekandisulfid 77 4.3.3 N-((1H-1,2,3-triazol-4-yl) ferrocenyl)-11-mercapto-undekanthiol 78 4.3.4 Zusammenfassung 80 4.4 Addition von Azido-Essigsure an 11-thioacetylundekansureprpargylamid an der Oberflche 80 4.4.1 Azido-Essigsure 80 4.4.2 11-thioacetyl-undekansure-propargylamid 81 4.4.3 N-((1H-1,2,3-triazol-4-yl) acetyl)-11-mercapto-undekanamid 81 4.4.4 Zusammenfassung 82

  • . .

    IV

    5 Synthese und Charakterisierung proteinresistenter Peptidthiole auf 83 der Basis von Peptiden 5.1 Synthese und Charakterisierung der Peptide 85 5.2 Synthese und Charakterisierung der Peptidthiole 85 5.2.1 Peptid-1-Thiol 86 5.2.2 Peptid-2-Thiol 89 5.3 Herstellung der Peptid-SAMs 91 5.4 Oberflchenplasmonenresonanz 93 5.4.1 Adsorption von Streptavidin 93 5.4.2 Adsorption von BSA 96 5.4.3 Adsorption von Fibronectin 97 6 Zusammenfassung und Ausblick 99 6.1 Die biologische Aktivitt oberflchengebundener Mehrschichtensysteme: das Biotin- Streptavidin-Peroxidase System 99 6.2 Cklick-Chemie zur Oberflchenfunktionalisierung 100 6.3 Proteinresistente Peptidthiole 101 7 Literaturverzeichnis 102 Anhang A: Abkrzungsverzeichnis 115Anhang B: Abbildungsverzeichnis 117Anhang C: Tabellenverzeichnis 121Anhang D: Liste der Publikationen 122Anhang E: Lebenslauf 123Anhang F: Danksagung 124

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    - 5 -

  • . .

    - 6 -

  • Kapitel 1 Einleitung

    - 7 -

    1 Einleitung

    1.1 Einfhrung in die Protein-Oberflchen Wechselwirkung

    Die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Oberflchen spielen sowohl in der Natur als

    auch bei vielen Anwendungen - insbesondere im Bereich der Sensorik - eine wichtige Rolle 1-

    6. Knstliche Oberflchen (z.B. SiO2, SAMs, Polymere) weisen in ihrer Wechselwirkung mit

    Proteinen sehr unterschiedliche Eigenschaften auf 5, 6. In der Regel haften Proteine an

    Oberflchen, ein proteophobes Verhalten wird nur in wenigen Fllen beobachtet. Die

    verschiedenen und vielfltigen Implikationen von Protein-Oberflchen-Wechselwirkungen

    werden im Folgenden an zwei anwendungsorientierten Beispielen verdeutlicht: Dem

    Einwachsen medizinischer Implantate und der Herstellung von Biosensoren.

    In der Medizin werden neben Metallen (z.B. Silber, Gold, Titan) auch zahlreiche hydrophobe

    Kunststoffe zur Herstellung von Implantaten aller Art genutzt 7. Im Allgemeinen ist der

    Einheilungserfolg, die Wiederherstellung der verlorenen Organfunktion und die dauerhafte

    Gewebevertrglichkeit der Fremdkrper nicht gegeben, die wesentlichen Probleme

    bestehen in der Ausbildung von Biofilmen auf den Implantatoberflchen 4, 8-11. Wegen der

    groen Bedeutung fr den Heilungserfolg wurde in den vergangenen Jahren und Jahrzehnten

    zum Teil sehr aufwendige empirische Untersuchungen durchgefhrt, um die Biofilmbildung

    auf den Implantatoberflchen zu verhindern und die entsprechenden Reaktionen des

    Immunsystem zu unterdrcken. In den USA werden jhrlich ca. 20 Millionen chirurgische

    Eingriffe durchgefhrt, wobei vorbergehend und/oder dauerhaft ein Implantat in den

    Patientenkrper eingesetzt wird 11. In 10% aller Flle kommt es zur Biofilmbildung und

    nachfolgender Entzndung in der Implantatumgebung. Bis heute gibt es keine Therapieform,

    die einen einmal im Organismus gebildeten Biofilm vollstndig zu zerstren vermag. Oftmals

    sind weitere Operationen ntig; im Extremfall muss das Implantat chirurgisch entfernt

    werden. Die Kosten fr die Weiterbehandlung von durch Implantate verursachten Infektionen

    belaufen sich in den USA auf jhrlich 11 Milliarden US Dollar. Es wird davon ausgegangen,

    dass diese Summe in Zukunft mit der Zahl der operativen Eingriffe noch weiter ansteigt.

    Der grte Anteil der fr Implantate verwendeten

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