Proteasominhibitorbehandlung

bei Patienten mit therapierefraktärem

systemischen Lupus erythematodes

der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades Dr. med.

vorgelegt von

Ramona Sarfert, geb. Peukert

aus

Münchberg

Als Dissertation genehmigt

von der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 10. Juli 2014

Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler

Gutachter: Prof. Dr. med. B. Manger

Prof. Dr. med. G. Schett

Inhaltsverzeichnis

1. Zusammenfassung ................................................................................................. 1

1.1 Zusammenfassung .............................................................................................. 1

1.2 Abstract ............................................................................................................... 3

2. Einleitung ................................................................................................................ 5

2.1 Systemischer Lupus erythematodes (SLE) .......................................................... 5

2.1.1 Definition ....................................................................................................... 5

2.1.2 Überblick über das Immunsystem und die Entstehung von

Autoimmunkrankheiten .......................................................................................... 7

2.1.3 Autoantikörper .............................................................................................. 8

2.1.4 Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI) ............... 10

2.1.5 Behandlungsstrategien bei SLE .................................................................. 12

2.2 Proteasom und Proteasominhibition durch Bortezomib ..................................... 14

2.3 Fragestellung und Zielsetzung dieser Arbeit ...................................................... 16

3. Materialien und Methoden .................................................................................... 18

3.1 Materialien......................................................................................................... 18

3.1.1 Verbrauchsmaterialien ................................................................................ 18

3.1.2 Tetanus-Toxoid-ELISA ................................................................................ 18

3.1.2.1 Puffer und Lösungen ............................................................................ 18

3.1.2.2 Antigene und Antikörper ....................................................................... 19

3.1.2.3 Geräte .................................................................................................. 19

3.1.3 Varelisa ANA Profile Assay ......................................................................... 19

3.1.3.1 Puffer und Lösungen ............................................................................ 19

3.1.3.2 Antigene und Antikörper ....................................................................... 20

3.1.3.3 Geräte .................................................................................................. 20

3.2 Methoden .......................................................................................................... 21

3.2.1 Patientenkollektiv ........................................................................................ 21

3.2.2 Behandlung mit Bortezomib ........................................................................ 21

3.2.3 Bestimmung von lupusassoziierten Serumparametern ............................... 23

3.2.3.1 Antikörper gegen extrahierbare nukleäre Antigene (ENA) .................... 23

3.2.3.2 Antikörper gegen doppelsträngige DNA (dsDNA) ................................. 24

3.2.3.3 Komplementfaktoren C3 und C4 .......................................................... 25

3.2.4 Bestimmung der Proteinausscheidung im 24-Stunden-Urin ........................ 25

3.2.5 Bestimmung protektiver Antikörper ............................................................. 26

3.2.5.1 Tetanus-Toxoid-Antikörper ................................................................... 26

3.2.5.2 Antikörper gegen Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen .............................. 28

3.2.6 Dokumentation im SLEDAI ......................................................................... 28

4. Ergebnisse ............................................................................................................ 30

4.1 Auswirkungen der Behandlung mit Bortezomib auf die Konzentration der Autoantikörper gegen dsDNA und ENA ................................................................... 30

4.2 Komplementfaktoren C3 und C4 ....................................................................... 35

4.3 Renale Proteinausscheidung bei Patientinnen mit aktiver Lupusnephritis im Verlauf .................................................................................................................... 38

4.4 Einfluss von Bortezomib auf protektive Antikörper ............................................. 41

4.5 Verlauf der Krankheitsaktivität anhand des SLEDAI .......................................... 42

4.6 Unerwünschte Wirkungen unter der Therapie mit Bortezomib ........................... 44

4.7 Zusammenfassung ............................................................................................ 45

5. Diskussion ............................................................................................................ 47

5.1 Einfluss von Bortezomib auf die Antikörperproduktion durch Elimination von Plasmazellen ........................................................................................................... 48

5.2 Effekt von Bortezomib auf den Krankheitsverlauf bei aktiver Nephritis .............. 50

5.3 Proteasominhibition als zukünftige Therapieoption bei refraktärem SLE? ......... 53

6. Literaturverzeichnis .............................................................................................. 56

7. Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................ 65

1

1. Zusammenfassung

1.1 Zusammenfassung

Hintergrund und Ziele:

Die Behandlung von Antikörper-vermittelten Autoimmunerkrankungen stellt auch in der

gegenwärtigen Medizin noch immer eine große Herausforderung dar. Bislang

einsetzbare Therapieverfahren müssen oft aufgrund schwerer Nebenwirkungen oder

Wirkungslosigkeit abgebrochen werden. Autoantikörper-produzierende langlebige

Plasmazellen, die gegenüber konventionellen Therapeutika wie Glucocortikoiden und

Cyclophosphamid weitestgehend resistent sind, dürften entscheidend zu den häufigen

therapierefraktären Krankheitsverläufen beitragen (Hiepe et al., 2011).

Der systemische Lupus erythematodes ist eine vorwiegend Antikörper-vermittelte

Autoimmunerkrankung. Insbesondere durch Ablagerung von Immunkomplexen im

Gewebe kommt es zu einer Schädigung zahlreicher Organe. In Mausmodellen für den

SLE konnte gezeigt werden, dass der Proteasominhibitor Bortezomib, der für die

Behandlung des multiplen Myeloms zugelassen ist, nicht nur kurzlebige, sondern auch

die langlebigen Plasmazellen eliminiert und so zu einer Verbesserung der

Lupusnephritis und Abnahme der Autoantikörpertiter führt (Neubert et al., 2008).

Diese Ergebnisse gaben Anlass zu der Annahme, dass Bortezomib auch beim

Menschen zu einer deutlichen Verminderung der Autoantikörperproduktion führen kann

und die Proteasominhibition somit zukünftig eine neue Behandlungsmethode für

Antikörper-vermittelte Autoimmunerkrankungen, wie den SLE, darstellen könnte.

Materialien und Methoden:

Im Rahmen individueller Heilversuche wurde bei fünf Patientinnen mit

therapierefraktärem SLE eine Behandlung mit Bortezomib durchgeführt. Jede Patientin

wurde vor Therapiebeginn über die off-label-Behandlung aufgeklärt und willigte

schriftlich ein. Bortezomib wurde in einer Dosis von 1,3 mg/m2 Körperoberfläche an

den Tagen 1, 4 und 8, sowie bei den Patientinnen 4 und 5 zu Beginn auch an Tag 11

intravenös (i.v.) verabreicht. Dazu erhielten die Patientinnen oral (p.o.) 20 mg

Dexamethason und 2x 400 mg/Tag Aciclovir zur Prophylaxe einer

Herpesvirusreaktivierung. In einem Abstand von zwei bis vier Wochen wurden die

Therapiezyklen bis zu fünfmal wiederholt. Im Verlauf wurden folgende Parameter

bestimmt: Antikörper gegen ENA bei Patientin 1-3, Anti-dsDNA-Antikörper,

2

Komplementfaktoren C3 und C4, Proteinurie/24h bei Patientin 2-4, Impfantikörper

gegen Tetanus-Toxoid und HBs-Antigen und der Krankheitsaktivitätsindex SLEDAI.

Ergebnisse:

Während der Behandlung mit Bortezomib traten außer Fieber, Kopfschmerz, Übelkeit

und Durchfall innerhalb eines Tages nach der Injektion keine nennenswerten

Nebenwirkungen auf.

Anhand des Krankheitsaktivitätsindexes SLEDAI zeigte sich bei allen Patientinnen drei

Monate nach Therapiebeginn eine verminderte Krankheitsaktivität. Die Antikörper

gegen dsDNA lagen bei einer Patientin nach der Therapie im physiologischen Bereich,

während die Antikörper gegen ENA bei den Patientinnen 1-3 nur geringe

Veränderungen zeigten. Die Komplementfaktoren C3 und C4 stiegen unter der

Therapie tendenziell wieder an. Bei den Patientinnen 2-4 mit aktiver Lupusnephritis

ging die Proteinausscheidung im 24h-Urin deutlich zurück, wobei Patientin 2 bis sechs

Monate nach Therapiebeginn sogar eine Proteinausscheidung im physiologischen

Bereich zeigte. Die Bestimmung der Tetanus-Toxoid- und HBs-Antikörper-

Konzentrationen ergab nach der Behandlung mit Bortezomib eine mäßiggradige

Abnahme, die Konzentrationen blieben aber im protektiven Bereich.

Schlussfolgerungen:

Sowohl die Autoantikörperproduktion, als auch die klinischen Symptome sowie die

Lupusnephritis wurden bei den SLE-Patienten durch die Behandlung mit Bortezomib

meist erheblich gebessert. Kontrollierte klinische Studien sollten demnach prüfen, ob

die Proteasominhibition zukünftig eine neue Option zur Behandlung therapierefraktärer

Antikörper-vermittelter Erkrankungen darstellt.

3

1.2 Abstract

Introduction:

Successful treatment of antibody-mediated diseases is a great challenge even in

modern medicine. Current treatments often have to be interrupted because of severe

side effects or insufficient treatment response. Autoantibody-secreting long-lived

plasma cells are quite resistant to conventional treatments and hence, they may

frequently cause refractory disease (Hiepe et al., 2011).

Systemic lupus erythematosus is a classical autoimmune disease mainly driven by

pathogenic autoantibodies. Production of autoantibodies and deposition of

immuncomplexes lead to damage of several organs. We showed that the proteasome

inhibitor bortezomib, which is approved for the treatment of multiple myeloma,

efficiently eliminates short- as well as long-lived plasma cells, reduces autoantibody

titres and ameliorates lupus nephritis in mouse models of SLE (Neubert et al., 2008).

Due to these auspicious results in mice, off label therapy with bortezomib was offered

to SLE patients who had failed conventional treatments. The favorable responses

implicate that proteasome inhibition might represent a new way to manage antibody-

mediated diseases like SLE.

Methods:

Five refractory SLE patients received bortezomib intravenously at a dose of 1.3 mg/m2

body surface. Three patients were injected at day 1, 4 and 8, two patients additionally

at day 11. The patients had given informed consent to off label treatment before start of

treatment. The patients received 20 mg dexamethasone at the day of bortezomib

injection and 2x 400 mg aciclovir p.o. daily for herpes prophylaxis during the treatment

period. Treatment cycles were repeated up to five times with a time interval of two to

four weeks. The following parameters were monitored: antibodies to ENA in patient 1-

3, antibodies to dsDNA, complement C3 and C4, proteinuria/24h in patient 2-4,

antibodies to tetanus toxoid and hepatitis B surface antigen, and the disease activity

SLEDAI.

Results:

No serious adverse effects have been observed during bortezomib treatment. Some

patients experienced fever, cephalgia, nausea and diarrhea within one day after

injection. The SLEDAI illustrated reduced disease activity in all patients. Antibodies to

dsDNA strongly decreased or even nearly disappeared, while antibodies to ENA in

4

patients 1-3 showed only moderate alterations. In general concentrations of

complement C3 and C4 have increased upon treatment with bortezomib. Protein

excretion decreased considerably in the three patients with active lupus nephritis, even

reaching the physiological range in one patient. Antibody concentrations to tetanus

toxoid and hepatitis B surface antigen decreased, but remained within protective range.

Conclusion:

Autoantibody production as well as clinical symptoms and lupus nephritis were

markedly ameliorated in SLE patients treated with bortezomib. Clinical trials should be

initiated to investigate if proteasome inhibition may be a new option in treatment of

refractory autoantibody-mediated diseases.

5

2. Einleitung

2.1 Systemischer Lupus erythematodes (SLE)

2.1.1 Definition

Der systemische Lupus erythematodes (SLE) ist eine Multisystemerkrankung, bei der

Autoantikörper an verschiedenen Krankheitsmanifestationen entscheidend beteiligt

sind. So initiieren Immunkomplexe die Lupusnephritis und vaskulitische

Manifestationen (Wallace, 2002, S. 687), während zytotoxische Antikörper

Immunthrombopenie und autoimmunhämolytische Anämie verursachen (Quismorio,

2002, S. 800-802). Auch der neonatale Lupus mit kongenitalem Herzblock wird wohl

durch zytotoxische Antikörper gegen Ro/SS-A induziert (Reichlin, Harley, 2002, S. 468-

469). Im Verlauf der Erkrankung kommt es immer wieder zu Remissionen und

Exazerbationen, die lebensgefährlich sein können (Grossmann, Kalunian, 2002, S. 19).

Betroffen sind vor allem junge Frauen im gebärfähigen Alter. Als late-onset-SLE wird

eine Form bezeichnet, die nach dem 50. Lebensjahr auftritt. Die

Erkrankungswahrscheinlichkeit liegt bei Frauen ca. um den Faktor zehn höher als bei

Männern, die Inzidenz liegt bei etwa zwei bis acht Fällen pro 100.000 Einwohnern pro

Jahr (Rus, Hochberg, 2002, S. 67-68).

Bis heute ist die Ätiologie dieser Autoimmunerkrankung unbekannt. Aufgrund der

familiären Häufung und des gehäuften Auftretens innerhalb bestimmter ethnischer

Gruppen besteht eine genetische Komponente, unter anderem findet sich eine

Assoziation mit den HLA-Antigenen DR2 und DR3. Bei monozygoten Zwillingen wurde

eine ca. 50-prozentige Konkordanz für das Auftreten von SLE festgestellt, jedoch in

unterschiedlicher Ausprägung, wenn die eineiigen Zwillinge getrennt voneinander

aufgewachsen sind (Rus, Hochberg, 2002, S. 77). Dies weist darauf hin, dass auch

Umwelteinflüsse, besonders UV-Exposition, Infektionen und Medikamente, z.B.

Antihypertensiva, Antikonvulsiva oder bestimmte Antibiotika, an der Manifestation des

SLE beteiligt sind (Mongey, Hess, 2002, S. 33-35; Rubin, 2002, S.886).

Der systemische Lupus erythematodes ist eine lebensbedrohende Erkrankung, bei der

neben Haut und Gelenken vor allem die inneren Organe betroffen sein können.

Hingegen ist beim kutanen chronisch diskoiden Lupus erythematodes in über 90% der

Fälle nur die Haut betroffen. Beim SLE treten häufig Müdigkeit, Gewichtsverlust und

Fieber auf, das durch die Ausschüttung von Entzündungsmediatoren, wie Interleukine,

Interferone und Prostaglandine und deren Wirkung auf temperaturregulierende Zentren

im Gehirn ausgelöst wird (Wallace, 2002, S. 625-626). Mit am häufigsten betroffen sind

6

beim SLE die Muskeln und Gelenke. Dabei kann eine zumeist nicht-erosive Arthritis

beobachtet werden, bei der es zu Morgensteifigkeit, Schwellung, Gelenkerguss und bei

fortgeschrittener Krankheit zu Deformitäten kommt (Wallace, 2002, S. 629-630).

Hautmanifestationen, wie das charakteristische Schmetterlingserythem,

Lichtempfindlichkeit oder diskoider Lupus mit roten Papeln und schuppenden Plaques,

kommen auch beim SLE vor (Dutz, Sontheimer, 2002, S. 549). Bei kardiovaskulären

und pulmonalen Manifestationen müssen leichtere Symptome wie Perikarditis oder

Pleuritis von den schweren und unter Umständen lebensbedrohlichen Komplikationen,

wie Myokardinfarkt, Arrhythmien, Herzklappenerkrankungen und Embolien abgegrenzt

werden (D’Cruz et al., 2002, S. 645). Sowohl neurologische als auch

Nierenveränderungen gelten als prognosebestimmend. Eine zerebrale Vaskulitis kann

in kurzer Zeit über Fieber, Verwirrtheit und Kopfschmerz bis zu Krampfanfällen und

schließlich zu Koma und Tod führen (West, 2002, S. 698). Auch zerebrovaskuläre

Insulte oder MS-ähnliche Verläufe sind möglich. Bei über 40% der Patienten kommt es

zum Auftreten einer Lupusnephritis. Dabei handelt es sich oft um eine Immunkomplex-

Glomerulonephritis, in deren Folge es zu einer rasch progredienten, meist diffusen

Schädigung der Glomeruli (WHO Grad IV) und zu einer eingeschränkten

Nierenfunktion bis hin zur chronischen Niereninsuffizienz und Dialysepflichtigkeit

kommen kann. Klinisch äußert sich eine Nierenbeteiligung durch eine

asymptomatische Proteinurie oder Hämaturie, sowie durch Akanthozyten im

Urinsediment (Ehrenstein, 1995; Kashgarian, 2002, S. 1070).

Im Jahre 1971 entstanden durch das American College of Rheumatology (ACR) die

ersten Klassifikationskriterien für klinische Studien. Die ursprünglich 14 Kriterien

wurden bis 1997 um drei reduziert. Ein SLE ist dann als wahrscheinlich anzunehmen,

wenn mindestens vier der elf Kriterien zutreffen. Dazu gehören:

Schmetterlingserythem, diskoider Lupus erythematodes, Fotosensibilität, orale oder

nasale Schleimhautulzera, nichterosive Arthritis von zwei oder mehr Gelenken,

Serositis (Pleuroperikarditis), Nierenbeteiligung (pathologische Proteinurie), ZNS-

Beteiligung (Krampfanfälle, Psychosen), Blutbildveränderungen (Anämie,

Thrombopenie, Leukopenie), immunologische Befunde (Antikörper gegen

doppelsträngige DNA, Antikörper gegen extrahierbare nukleäre Antigene,

Antiphospholipidantikörper) und positive antinukleäre Antikörper (Grossmann,

Kalunian, 2002, S. 19). Die Diagnose und Entscheidung zur Therapie sollte in jedem

Fall anhand einer Zusammenschau von Laborparametern und klinischen Symptomen

gestellt werden.

7

2.1.2 Überblick über das Immunsystem und die Entstehung von

Autoimmunkrankheiten

Das Immunsystem kann in das unspezifische, angeborene und das spezifische,

erworbene Immunsystem unterteilt werden. Während das angeborene Immunsystem

mithilfe einiger Dutzend Muster-Erkennungsrezeptoren Gruppen von

Krankheitserregern erkennt, besitzen die Lymphozyten des adaptiven Immunsystems

viele Millionen verschiedener Rezeptoren, deren Spezifitäten durch somatische

Rekombination entstehen und die hochspezifisch bestimmte Antigene bzw. Erreger

erkennen. Vor allem besitzt das adaptive Immunsystem eine hochspezifische

Gedächtnisfunktion, die den Organismus effektiv vor wiederholten Infektionen mit den

gleichen Erregern, besonders Viren, schützt. In Knochenmark und Thymus, die auch

als primäre lymphatische Organe bezeichnet werden, reifen die B- und T-Zellen heran,

die bei der spezifischen Immunantwort eine zentrale Rolle spielen. Autoreaktive Zellen,

die gegen körpereigene Antigene gerichtet sind, werden in Thymus und Knochenmark

im Rahmen der negativen Selektion weitgehend eliminiert. Binden unreife

Lymphozyten Selbstantigene mit hoher Affinität, so werden sie durch Apoptose

eliminiert. Dieser Vorgang wird auch als zentrale Toleranz bezeichnet (Hof et al., 2009,

S. 48-51). Gelangen trotz dieser negativen Selektion autoreaktive T- oder B-Zellen in

die Peripherie, so stellt dies zunächst kein Problem dar, solange die Zellen nicht

aktiviert werden. Bei Autoimmunerkrankungen kann allerdings eine Störung der

Mechanismen, die für die immunologische Toleranz verantwortlich sind, dazu führen,

dass zirkulierende CD4+ T-Helferzellen durch die Erkennung körpereigener Antigene,

die über MHC-II-Moleküle der dendritischen Zellen präsentiert werden, aktiviert

werden. Es kann auch zu einer Umgehung der T-Zell-Toleranz kommen, wenn

Antigene durch Umweltfaktoren, Medikamente oder Mikroorganismen modifiziert

werden und T-Zellen diese modifizierten Selbstantigene als körperfremd erkennen

(Böcker et al., 2004, S. 1116). Die aktivierten T-Helferzellen interagieren selektiv mit B-

Zellen, die ihnen das Antigen, das sie über Ihren B-Zellrezeptor internalisiert haben, in

MHC-II-Molekülen präsentieren. Diese B-Zellen werden anschließend über

Zelloberflächenrezeptoren sowie die Produktion von Wachstumsfaktoren aktiviert,

unterlaufen gegebenenfalls in den Keimzentren der Lymphknoten die Affinitätsreifung

und differenzieren schließlich zu Plasmazellen, die Antikörper gegen das präsentierte

körpereigene Antigen bilden (Hof et al., 2009, S.105). Durch die Ausbildung eines

Immungedächtnisses in Form von autoreaktiven T- und B-Zellklonen, kann die

Immunantwort gegen körpereigene Antigene immer wieder ablaufen. Die von den

Plasmazellen produzierten Autoantikörper binden z. B. an Oberflächenstrukturen von

Zellen oder formen Immunkomplexe und lösen so die Aktivierung des

8

Komplementsystems aus. Komplementfaktoren binden die Immunkomplexe und führen

sie der Phagozytose zu. Durch die überschießende Immunkomplexbildung bei einigen

Autoimmunerkrankungen, kann deren Abbau durch phagozytierende Zellen jedoch

unter Umständen nicht kompensiert werden, was die Ablagerung der Immunkomplexe

im Gewebe zahlreicher Organe begünstigen dürfte (Hof et al., 2009, S. 140).

Die Organschädigung beim SLE wird vor allem durch Autoantikörper, die mit nukleären

Bestandteilen, wie doppelsträngiger DNA (dsDNA) oder Histonen Immunkomplexe

bilden und durch proinflammatorische Moleküle, wie Zytokine, Chemokine oder

Sauerstoffradikale hervorgerufen. Umweltfaktoren, wie UV-Licht oder Medikamente,

sowie genetische Faktoren und ein gestörter Metabolismus weiblicher Sexualhormone

können zu einer abnormalen Immunantwort führen, bei der immunregulierende

Mechanismen beeinträchtigt sind (Hahn, 2002, S. 90-91). Regulatorische T-Zellen, die

normalerweise die überschießende Aktivität von Effektor-T-Zellen supprimieren,

wurden bei SLE-Patienten in verminderter Zahl bzw. herabgesetzter Aktivität gefunden

(Scheinecker et al., 2010). Daraus resultiert eine mangelnde Kontrolle der B-Zellen,

was eine vermehrte Produktion von Autoantikörpern durch Plasmazellen zur Folge hat.

Durch die Ablagerung von Antigen-Antikörper-Komplexen im Gewebe kommt es

schließlich zu den typischen SLE-Manifestationen (Hahn, 2002, S. 87-88). Weitere

Mechanismen bei der Entstehung des SLE sind wahrscheinlich eine fehlregulierte bzw.

gesteigerte Apoptose und besonders die beeinträchtigte Phagozytose apoptotischer

sowie nekrotischer Zellen. Vor allem Nukleosomen bzw. dsDNA und Histone, die bei

der Apoptose entstehen, bilden eine Autoantigen-Quelle, die beim SLE zur

Autoantikörperbildung gegen Zellkernbestandteile beiträgt (Böcker et al., 2004, S.

1118). Insbesondere Antikörper gegen dsDNA spielen eine große Rolle, da sie mit der

Krankheitsaktivität des SLE korrelieren.

2.1.3 Autoantikörper

Im Rahmen der humoralen Immunantwort kommt es beim systemischen Lupus

erythematodes zur Bildung von Antikörpern gegen körpereigene Strukturen,

insbesondere gegen Zellkernbestandteile. Einige dieser Autoantikörper spielen

besonders für die Diagnosestellung des SLE eine wichtige Rolle, z.B. antinukleäre

Antikörper (ANA) und Anti-dsDNA-Antikörper, während die Anti-dsDNA-Antikörper,

Anti-Phospholipidantikörper sowie Antikörper gegen Erythrozyten, Leukozyten oder

Thrombozyten eine Bedeutung in der Immunpathogenese und bei der Zell- bzw.

Organschädigung haben.

9

Antikörper sind Proteine, die durch Plasmazellen entweder in membrangebundener

oder löslicher Form gebildet werden. Die antinukleären Antikörper beim SLE gehören

überwiegend der Immunglobulinklasse G (IgG) an, die von autoreaktiven Plasmazellen

gebildet werden. Über ihr Fc-Fragment können sie die Phagozytose der Antigen-

Antikörper-Komplexe und die Aktivierung des Komplementsystems einleiten (Peeva et

al., 2002, S. 391). Mit Hilfe eines Suchtests für ANA, dem Immunfluoreszenztest, kann

bei klinischem Verdacht auf einen SLE ein erster Schritt in Richtung der Diagnose

erfolgen. Werden ANA im Serum der Patienten in einem Verhältnis von mindestens

1:160 nachgewiesen, so werden diese Autoantikörper genauer spezifiziert, z.B. in

solche, die gegen dsDNA und Histone gerichtet sind und solche, die mit extrahierbaren

nukleären Antigenen (ENA) reagieren (Aringer et al., 2007, S. 16/17; Mierau et al.,

2002).

Die größte klinische Bedeutung kommt wohl den Antikörpern gegen doppelsträngige

(ds) DNA zu. Die Höhe der Anti-dsDNA-Antikörper-Titer ist mit der Krankheitsaktivität

und Exazerbationen des SLE assoziiert. Arbuckle et al. konnten in einer Studie mit 633

Patienten zeigen, dass 55% der Patienten bereits detektierbare Anti-dsDNA-Antikörper

aufwiesen, bevor klinische Zeichen des SLE erkennbar waren. Steigende Antikörper-

Konzentrationen kündigten den baldigen Ausbruch klinischer Zeichen des SLE an.

Zudem hatten Patienten mit einem sehr starken Anstieg der Anti-dsDNA-Antikörper-

Titer ein hohes Risiko, im weiteren Verlauf eine renale Manifestation des SLE zu

entwickeln (Arbuckle et al., 2001). Die Bindung der Antikörper bzw. die Ablagerung von

Immunkomplexen führt zu einer Entzündungsreaktion und letztlich zu schweren

Schäden an der glomerulären Basalmembran. Eine Glomerulonephritis mit

fortschreitender Niereninsuffizienz ist die Folge (Aringer et al., 2007, S. 17). Antikörper

gegen dsDNA können außerdem Apoptose induzieren, so dass durch programmierten

Zelltod weitere Autoantigene aus dem Zellkern freigesetzt werden, die wiederum durch

Antikörper komplexiert werden können (Hahn, Tsao, 2002, S. 426).

Auch Antikörper gegen Nukleosomen korrelieren mit der Krankheitsaktivität des SLE

und mit der Ausprägung von Lupusnephritis und neuropsychiatrischen Manifestationen.

Nukleosomen stellen eine Untereinheit des Chromatins dar und bestehen aus Histonen

und doppelsträngiger DNA. Spezifische autoreaktive T-Zellen führen über die

Aktivierung von B-Zellen zur Antikörperproduktion. Über die Histonproteine erfolgt wohl

eine Bindung der Immunkomplexe zum Beispiel an die glomeruläre Basalmembran

(Bruns et al., 2000; Mierau et al., 2002).

Zu den extrahierbaren nukleären Antigenen gehören unter anderem Ro/SS-A, La/SS-

B, snRNP und Sm. Antikörper gegen Ro-Antigene finden sich bei ca. 40-60% der SLE-

Patienten und können mit Lichtempfindlichkeit und Hautläsionen in Verbindung

10

gebracht werden. Eine wichtige Rolle spielen Anti-Ro und auch Anti-La bei

schwangeren SLE-Patientinnen. Hier besteht ein erhöhtes Risiko, dass sich bei dem

Foeten ein kongenitaler Herzblock entwickelt. Bei einigen Kindern mit neonatalem

Lupus erythematodes wurden, ebenso wie bei den Müttern, Antikörper gegen Ro und

La nachgewiesen (Aringer et al., 2007, S. 20; Reichlin, Harley, 2002, S. 468). Die

snRNP (small nuclear Ribonukleoproteine) sind Komponenten des Spleißosoms,

welches RNA im Zellkern prozessiert und für die Translation vorbereitet. Sm-Proteine

sind wiederum Bestandteile der snRNP. Anti-Sm sind hochspezifisch für den SLE, so

dass sie in die ACR-Kriterien aufgenommen wurden. Fluktuationen in der Höhe der

Titer sind im Verlauf der Erkrankung möglich, ein komplettes Verschwinden wird

jedoch, auch unter intensiver Therapie, praktisch nie beobachtet. Anti-U1-RNP

kommen außer bei SLE auch noch bei der Mixed connective tissue disease (MCTD)

vor, gelten aber, besonders wenn sie gemeinsam mit Anti-Sm auftreten, als spezifische

Marker für SLE. Weder Anti-Sm noch Anti-U1-RNP korrelieren mit der

Krankheitsaktivität. In einigen klinischen Studien konnte gezeigt werden, dass der

Nachweis von Anti-Sm bei SLE-Patienten mit einer geringeren Ausprägung von

Nephritis und neuropsychologischen Manifestationen assoziiert ist. Allerdings konnte

diese negative Assoziation nicht in allen Untersuchungen nachvollzogen werden. Trotz

der unklaren Bedeutung für die klinischen Manifestationen des SLE, sind die Anti-Sm

eine hilfreiche Ergänzung in der Diagnostik (Craft, 2002, S. 487-488). Bei Patienten mit

hohen Konzentrationen an Anti-U1-RNP, konnte eine erniedrigte Rate an

Lupusnephritis festgestellt werden (Aringer et al., 2007, S. 19).

Zur Diagnosefindung werden zunächst ANA und, bei positivem Befund, auch die

extrahierbaren nukleären Antigene (ENA) bestimmt, während insbesondere der Titer

der Anti-dsDNA-Antikörper und Antikörper gegen Nukleosomen zur Einschätzung von

Krankheitsaktivität und -verlauf herangezogen werden können. Der Nachweis einer

Korrelation der Anti-dsDNA-Antikörper-Titer mit der immunologischen Aktivität des SLE

dürfte der Grund für die Aufnahme in einen Aktivitätsscore gewesen sein.

2.1.4 Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI)

Der SLEDAI wurde von Bombardier et al. im Jahre 1992 an der Universität von Toronto

entwickelt, um die Krankheitsaktivität des SLE anhand einer Gesamtpunktzahl fassbar

zu machen. Ziel war es, einen validierten klinischen Index zu finden, der zur

Abschätzung der Krankheitsaktivität des SLE bzw. zur Verdeutlichung von

Veränderungen im Krankheitsverlauf vor oder nach therapeutischen Maßnahmen

11

herangezogen werden kann. In diesem Index werden 1, 2, 4 oder 8 Punkte für

lupusspezifische Symptome bzw. Laborparameter in insgesamt neun Organsystemen

vergeben. Die Definitionen und Regeln für die Erfassung der 24 wichtigsten Parameter

des SLE basieren auf den ACR-Kriterien.

Ursprünglich wurden 37 Deskriptoren in Form von lupusspezifischen Symptomen und

Laborparametern festgelegt, die schließlich auf die 24 wichtigsten Parameter reduziert

wurden. Zum Beispiel wurden Deskriptoren wie Enteritis, erhöhte

Blutkörperchensenkungsgeschwindigkeit, Hypergammaglobulinämie oder arterielle

Hypertonie über 140/90 mmHg aus der Wertung genommen, da man davon ausging,

dass es sich bei den genannten Veränderungen vor allem um Schädigungen im

Rahmen des SLE bzw. um Folgen der Erkrankung handelte, durch die jedoch nicht

zwangsweise die aktuelle Krankheitsaktivität widergespiegelt wird. Die in der Studie

untersuchten Patienten zeigten vor allem immunologische und Hautmanifestationen,

weshalb diese klinischen Zeichen des SLE als erste in den SLEDAI aufgenommen

wurden. Danach wurden auch Serositis, ZNS-Beteiligung und renale,

muskuloskelettale und hämatologische Veränderungen in die Wertung einbezogen. In

der Endfassung des SLEDAI von 1992 werden 8 Punkte für ZNS- und vaskuläre, 4

Punkte für renale und muskuloskelettale Symptome, 2 Punkte für Serosa- und

Hautbeteiligung bzw. immunologische Symptome und 1 Punkt für konstitutionelle und

hämatologische Veränderungen vergeben (Bombardier et al., 1992). Der SLEDAI

erfasst als einziger der Scores zur Erfassung lupusspezifischer Symptome, nur

objektive Parameter. Subjektive Empfindungen, wie zum Beispiel Müdigkeit,

Arthralgien oder Myalgien werden nicht berücksichtigt (Grossmann, Gordon, 2007, S.

926). Dadurch werden Schwankungen der Werte aufgrund subjektiver Änderung der

Krankheitssymptome vermieden. Der Score kann zur Verlaufsbeobachtung speziell im

Hinblick auf das Ansprechen auf eine Therapie verwendet werden. Eine Erhöhung des

SLEDAI um 3 Punkte spricht für eine Verschlechterung des SLE, während eine

Erhöhung um mehr als 12 Punkte einen schweren Schub anzeigt (Grossmann,

Gorden, 2007, S. 926). Insgesamt können 105 Punkte vergeben werden, wobei aber

nur sehr wenige Patienten letztendlich einen Wert über 45 Punkten erreichen

(Bombardier et al., 1992).

Eine große Rolle spielt der SLEDAI im Hinblick auf den Krankheitsverlauf unter

Therapie. Insbesondere fällt ein Rückgang von klinischen Symptomen ins Gewicht.

Kann zum Beispiel durch ein bestimmtes Therapieverfahren eine vollständige

Remission der neurologischen oder renalen Organmanifestation erreicht werden, so

spiegelt sich dies in einer deutlich niedrigeren SLEDAI-Gesamtpunktzahl wider. So

12

können unterschiedliche Therapieansätze miteinander in Bezug auf ihre Wirksamkeit

verglichen werden.

2.1.5 Behandlungsstrategien bei SLE

Wichtig bei der Behandlung des SLE ist eine gezielte, aber stadiengerechte

interdisziplinäre Therapie. Zur Behandlung des SLE sind in Deutschland verschiedene

Medikamente zugelassen, zu denen Glukokortikosteroide, die Antimalariamedikamente

Chloroquin und Hydroxychloroquin, die Immunsuppressiva Azathioprin und

Cyclophosphamid und seit kurzem der monoklonale Antikörper Belimumab gehören

(Aringer et al., 2011). Erforderlichenfalls werden bei Therapieversagen Medikamente

ohne Zulassung („off lable“) für die Behandlung des SLE eingesetzt, wie Mycophenolat

Mofetil, Rituximab, Methotrexat, Ciclosporin A oder Leflunomid. Bei schwerer,

therapierefraktärer SLE-Aktivität wurden außerdem Erfolge mit Immunadsorption in

Kombination mit Cyclophosphamid erzielt (Aringer et al., 2007, S. 51). Insbesondere

bei jungen Patienten mit sehr schwerem Krankheitsverlauf und ungenügendem

Therapieansprechen ist im Einzelfall auch eine Hochdosischemotherapie mit autologer

Stammzelltransplantation zu erwägen.

Notwendig ist, vor allem bei vorliegender Hautbeteiligung grundsätzlich ein adäquater

UV-Lichtschutz in Form von Lichtschutzsalben bzw. entsprechender Kleidung oder

Kopfbedeckung. In leichten Fällen ohne viszeralen Befall können z.B. bei Arthritiden

und Myalgien nichtsteroidale Antiphlogistika (NSAR), wie Diclofenac oder Etoricoxib,

sowie Hydroxycholoroquin oder Methotrexat als Basistherapeutika oder niedrig

dosierte Glukokortikoide ausreichend sein. Zur Prävention von entzündlichen Schüben

können Chloroquin und Hydroxychloroquin erfolgreich eingesetzt werden. Die

immunsuppressive und antiinflammatorische Wirkung ist wahrscheinlich zum einen auf

die Hemmung der Antigenpräsentation durch pH-Wert-Erhöhung in den Lysosomen

antigenpräsentierender Zellen und zum anderen auf die Blockade von sog. Toll-like-

Rezeptoren (TLR) zurückzuführen. Die TLR aktivieren das angeborene Immunsystem

und damit die Produktion von Immunglobulinen und Zytokinen, wodurch

Entzündungsreaktionen verursacht werden (Senq-J et al., 2011).

Bei schweren Krankheitsverläufen mit Organbeteiligung kommen eine hochdosierte

Prednisolon-Stoßtherapie und Immunsuppressiva, insbesondere Cyclophosphamid

bzw. auch Azathioprin und Mycophenolat-Mofetil (MMF) zum Einsatz (Kirou, Boumpas,

2002, S.1180; McCune, Riskalla, 2002, S.1206, 1210). Vor allem bei schwerer

Lupusnephritis, ZNS-Beteiligung und hämorrhagischer Pneumonitis verbesserte sich

13

die Prognose entscheidend mit Einführung der Cyclophosphamidtherapie. Im Vergleich

zu einer alleinigen Cortisonstoßtherapie konnte in Studien gezeigt werden, dass unter

Cyclophosphamid ein deutlich besseres Outcome in Bezug auf die terminale

Niereninsuffizienz im Rahmen der Lupusnephritis erzielt werden kann (Aringer et al.,

2007, S. 34). Ein großes Problem stellen jedoch die zahlreichen und schwerwiegenden

unerwünschten Wirkungen des Zytostatikums dar. Übelkeit und Erbrechen, Infektionen,

hämorrhagische Zystitis bis hin zur Blasenfibrose und Urothelkarzinom, sowie die

Gefahr der vorzeitigen Menopause bei Frauen mit Kinderwunsch, sind ernste

Nebenwirkungen. Wegen dieser Nebenwirkungen stellt man nach erfolgreicher

Remissionsinduktion mit mehreren Cyclophosphamid-Boli auf eine weniger toxische

Erhaltungstherapie mit Azathioprin oder MMF um (Aringer et al., 2007, S. 35). Sowohl

Azathioprin als auch MMF sind aus der Transplantationsmedizin als wirkungsvolle

Immunsuppressiva durch Hemmung der Lymphozytenproliferation bekannt. Aufgrund

der Knochenmarkstoxizität mit konsekutiver Panzytopenie sind engmaschige

Blutbildkontrollen indiziert.

Bei therapierefraktärer Nephritis konnten in Kasuistiken und Fallserien gute Erfolge mit

dem monoklonalen Anti-CD20-Antikörper Rituximab, zugelassen für das B-Zell-Non-

Hodgkin-Lymphom und die Rheumatoide Arthritis, erzielt werden. Rituximab eliminiert

hierbei B-Zellen, wobei Gedächtnis-B-Zellen in sekundären lymphatischen Organen

zumindest teilweise resistent sein dürften (Vallerskog et al., 2006). In einigen,

allerdings unkontrollierten Studien konnten durch Rituximabtherapie Langzeit-

Remissionen erreicht werden (Jónsdóttir et al., 2007). Im Durchschnitt regenerieren

sich die B-Lymphozyten nach ca. vier bis zwölf Monaten wieder, was möglicherweise

mit erneuter SLE-Aktivität assoziiert ist. Da CD20 auf Plasmazellen nicht exprimiert ist,

werden die Antikörper-Konzentrationen im Serum nur unwesentlich vermindert.

Besonders wenn pathogene Autoantikörper von langlebigen Plasmazellen sezerniert

werden, dürfte Rituximab die Autoantikörperspiegel kaum beeinflussen (Vallerskog et

al., 2006; Aringer et al., 2007, S. 49). Zudem konnte gezeigt werden, dass bestimmte

B-Lymphozytensubpopulationen auch nach der Therapie mit Rituximab noch

nachweisbar waren, insbesondere im entzündeten Gewebe und in sekundären

lymphatischen Organen, was entweder für eine primäre Resistenz gegen CD20-

Antikörper spricht oder dafür, dass diese B-Lymphozyten in Nischen überleben, die

durch die Therapie nicht erreicht werden (Dolff et al., 2009; Vallerskog et al., 2006).

Eine neue Behandlungsoption stellt der neu zugelassene monoklonale Antikörper

Belimumab dar, der gegen BLyS (B-Lymphozyten-Stimulator), ein Mitglied der TNF-

Familie, gerichtet ist. Dadurch soll die Aktivierung der B-Zellen gehemmt werden.

Erfolge konnten insbesondere im Hinblick auf die muskuloskelettale und

14

Hautbeteiligung des SLE erzielt werden (Aringer et al., 2011). Ob mit Hilfe dieses

Antikörpers unter Umständen Komplettremissionen erreichbar sind, wird sich in den

nächsten Jahren zeigen.

Mit zahlreichen Therapieoptionen ist es bisher immer wieder gelungen, eine

Verminderung der Krankheitsaktivität bei SLE zu erreichen. Wie jedoch gezeigt werden

konnte, ist bislang eine vollständige Remission des SLE nicht möglich. Eine wichtige

Rolle spielen dabei wohl die langlebigen Plasmazellen, die durch die bisherigen

Behandlungsstrategien nicht oder nur unzureichend eliminiert werden (Hiepe et al.,

2011). Zudem müssen erfolgreiche Therapieoptionen oft aufgrund erheblicher

Nebenwirkungen wieder abgebrochen werden.

Aus diesem Grund ist es dringend notwendig nach alternativen Therapieoptionen zu

suchen, die eine vollständige Remission der SLE-Symptome, insbesondere durch eine

Depletion von langlebigen Plasmazellen, ermöglichen könnten.

2.2 Proteasom und Proteasominhibition durch Bortezomib

Ein wichtiger pathogener Mechanismus bei der Entstehung des SLE dürfte eine

fehlregulierte bzw. gesteigerte Apoptose und ein mangelnder Abbau von Bestandteilen

apoptotischer Zellen sein.

Das 26S-Proteasom ist ein Proteinkomplex der im Inneren von eukaryotischen Zellen

die Induktion und Suppression der Apoptose reguliert. Bestehend aus einer 19S-

Untereinheit zur Erkennung und Entfaltung von Proteinen und einer 20S-Untereinheit

mit proteolytischer Aktivität, baut das Proteasom im Zytoplasma und im Zellkern

Proteine zu Peptidfragmenten ab, die nach Freisetzung ins Zytosol durch

Endopeptidasen und Aminopeptidasen zu Aminosäuren abgebaut und zur

Neusynthese von Proteinen verwendet werden (Naujokat et al., 2002; Lecker et al.,

2006). Ungefaltete oder falsch gefaltete Proteine sowie Transkriptionsfaktoren,

Tumorsuppressor-Proteine und andere Regulatoren des Zellzyklus, werden über

Enzyme mit Ubiquitin-Polypeptid-Ketten markiert und dem proteasomalen Verdau

zugeführt (Naujokat et al., 2002; Lecker et al., 2006). Das Proteasom spielt außerdem

eine wichtige Rolle in der Immunkontrolle. Die aus dem Proteinabbau generierten

Peptide werden zum Endoplasmatischen Retikulum (ER) transportiert, wo sie an MHC-

I-Moleküle gekoppelt werden, über die sie dem Immunsystem präsentiert werden

(Lecker et al., 2006). Vor allem Nukleosomen bzw. dsDNA und Histone, die bei der

Apoptose entstehen, bilden eine Autoantigen-Quelle, die beim SLE zur

15

Autoantikörperbildung gegen Zellkernbestandteile beiträgt (Böcker et al., 2004, S.

1118).

Das Proteasom trägt durch den Abbau von Wachstumsfaktorinhibitoren zur

Zellproliferation bei. Insbesondere bei malignen Erkrankungen spielt dies eine zentrale

Rolle. So wird z.B. der Transkriptionsfaktor NF-κB (nuclear factor kappa B)

normalerweise durch ein inhibitorisches Molekül IκB gehemmt. Wird IκB durch

Ubiquitin-Markierung im Proteasom degradiert, kann NF-κB als Transkriptionsfaktor die

Zellproliferation fördern sowie antiapoptotische Faktoren induzieren und damit das

Tumorwachstum fördern (Naujokat et al., 2002). Durch die Entwicklung des

Proteasominhibitors Bortezomib, auch bekannt unter dem Handelsnamen Velcade®,

war es möglich, in die molekularen Abbau- und Synthesewege der Zelle einzugreifen

und gegen die Krebsentstehung vorzugehen. Bortezomib ist ein Borsäuredipeptid aus

Phenylalanin und Leucin, das reversibel an die Chymotrypsin-ähnliche Protease des

Proteasoms bindet und dadurch die Funktion des Proteasoms hemmt. Bislang ist

Bortezomib für die Behandlung des therapierefraktären multiplen Myeloms und des

Mantelzelllymphoms zugelassen (Simons et al., 2006). Durch die Proteasominhibition

wird der Abbau von IκB verhindert, wodurch die NF-κB-Aktivität reguliert wird (Meister,

Voll, 2007). Da NF-κB ein Mediator zur Produktion proinflammatorischer Zytokine und

Adhäsionsmoleküle ist, spielt dieser Transkriptionsfaktor wohl auch in der Pathogenese

des SLE eine wichtige Rolle (Lecker et al., 2006). Zudem bewirkt Bortezomib die

indirekte Aktivierung der sog. unfolded protein response (UPR). Dabei handelt es sich

um unterschiedliche Mechanismen, die die Faltung von Proteinen bzw. den Abbau

ungefalteter Proteine regulieren. Durch die Proteasominhibition kumulieren die zum

Abbau anstehenden fehlerhaften Proteine in der Zelle. Dadurch kommt es zu einer

hohen Belastung des Endoplasmatischen Retikulums, wo die Proteine durch die

Blockade des letztlich Proteasom-abhängigen ERAD (endoplasmatic reticulum

associated degradation) akkumulieren. Bei übermäßigem ER-Stress wird schließlich

durch die UPR die zum Zelltod führende Apoptose eingeleitet (Meister, Voll, 2007;

Neubert et al., 2008). Vor allem bei Zellen mit einer hohen Proteinsyntheserate ist die

UPR nötig, um die große Anzahl an ungefalteten oder falsch gefalteten Proteinen zu

eliminieren und so ein Überleben der Zelle zu ermöglichen. Damit sind z.B. die Zellen

des multiplen Myeloms, die eine extrem hohe Anzahl an monoklonalen Antikörpern

synthetisieren, sehr sensibel für die Einleitung der Apoptose durch die sog. UPR

(Meister, Voll, 2007; Neubert et al., 2008).

Wie im SLE-Mausmodell gezeigt werden konnte, aktiviert Bortezomib die terminale

UPR auch in nicht malignen Plasmazellen, die eine noch höhere Proteinsyntheserate

als Myelomzellen aufweisen (Neubert et al., 2008; Voll, Hiepe, 2009).

16

Daraus ergibt sich möglicherweise eine neue Therapieoption, insbesondere zur

Elimination von autoantikörperproduzierenden langlebigen Plasmazellen bei Patienten

mit SLE.

2.3 Fragestellung und Zielsetzung dieser Arbeit

Die Therapie des systemischen Lupus erythematodes stellt noch immer eine große

Herausforderung dar. Zahlreiche unterschiedliche Therapieverfahren führen zu einer

Abnahme der Autoantikörpertiter und zu einer Verbesserung lebensbedrohlicher

Symptome, wie Nephritis oder ZNS-Vaskulitis. Doch häufig müssen diese, zum Teil

hochtoxischen Medikamente aufgrund schwerer Nebenwirkungen wieder abgesetzt

werden. Zudem wird oft keine länger anhaltende oder komplette Remission erreicht.

Aus diesem Grund wird nach besser verträglichen und effizienteren

Therapiemöglichkeiten gesucht.

Bortezomib, bislang für die Behandlung des therapierefraktären Multiplen Myeloms und

des Mantelzelllymphoms zugelassen, hemmt reversibel die katalytische Aktivität des

26S-Proteasoms und damit den proteolytischen Abbau von IκB, dem Inihibitor des

Transkriptionsfaktors NF-κB, der zu einer Proliferation von Myelomzellen bzw. zur

Induktion proinflammatorischer Zytokine führt. Zudem induziert Bortezomib die

terminale unfolded protein response (UPR) durch Überladung des Endoplasmatischen

Retikulums (ER) mit zu degradierenden Proteinen, wodurch die Zelle in die Apoptose

geht (Meister, Voll, 2007; Lecker et al., 2006; Simons et al., 2006).

Wie gezeigt werden konnte, eliminiert Bortezomib insbesondere Zellen mit einer hohen

Proteinsyntheserate. Damit sind die Myelomzellen ebenso wie alle normalen

antikörperproduzierenden Plasmazellen extrem sensibel für eine Apoptoseeinleitung

durch Aktivierung der terminalen UPR (Meister, Voll, 2007).

Neubert et al. zeigten in Tiermodellen mit weiblichen New-Zealand-Black/White-

Mäusen (NZB/W) und der MRL/lpr-Linie, dass eine Elimination der

autoantikörperproduzierenden Plasmazellen zu einem deutlichen Rückgang der

klinischen Symptome in den Lupus-Mäusen führt. Durch eine Therapie mit dem

Proteasominhibitor Bortezomib kam es zu einem deutlichen Rückgang der ds-DNA-

Antikörper-Titer sowie der Proteinausscheidung bei Nephritis. Während die Mäuse der

Kontrollgruppe, die Placebo erhielten, nach wenigen Wochen starben, kam es bei

Mäusen, die mit Bortezomib behandelt wurden, teilweise zu einer kompletten

Remission der Lupusnephritis. Zudem konnte gezeigt werden, dass Bortezomib auch

die langlebigen Plasmazellen durch Induktion der terminalen UPR erfolgreich eliminiert.

17

Im Vergleich mit einer Kontrollgruppe, die Cyclophosphamid und Dexamethason

erhielt, war Bortezomib deutlich überlegen. Blutbildkontrollen ergaben keine negativen

Auswirkungen und damit keine lebensbedrohlichen toxischen Nebenwirkungen durch

den Proteasominhibitor.

Die effiziente und nebenwirkungsarme Wirkung des bereits klinisch zugelassenen

Proteasominhibitors Bortezomib im Lupus-Mausmodell gab den Anlass, Patientinnen

mit schwerem therapierefraktären SLE im Rahmen eines individuellen Heilversuchs zu

behandeln. Begleitend zu der off-label-Therapie mit Bortezomib wurde untersucht, ob

durch Proteasominhibition eine Abnahme der Autoantikörper-Titer, sowie der

Proteinausscheidung bei aktiver Lupusnephritis und damit eine Verminderung der

Krankheitsaktivität erreicht werden kann. Im Rahmen individueller Heilversuche wurde

bei fünf Patientinnen mit therapierefraktärem SLE eine Behandlung mit Bortezomib

durchgeführt. Dazu wurden in bis zu fünf Zyklen jeweils 1,3 mg/m2 Körperoberfläche

Bortezomib an den Tagen 1, 4 und 8, bzw. bei zwei Patientinnen zu Beginn auch an

Tag 11 intravenös (i.v.) verabreicht. In regelmäßigen Abständen wurden die

Konzentrationen von Antikörpern gegen doppelsträngige DNA (dsDNA) und

extrahierbare nukleäre Antigene (ENA), Komplement C3 und C4, die protektiven

Antikörper gegen Tetanus-Toxoid und HBs-Antigen sowie die Proteinausscheidung im

24h-Urin bei den Patientinnen mit aktiver Lupusnephritis bestimmt, um das

Therapieergebnis zu evaluieren. Die Krankheitsaktivität wurde mit Hilfe des Systemic

Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI) erfasst. Durch regelmäßige

Blutbildkontrollen sowie ausführliche Anamnese und klinische Untersuchung sollten

evtl. aufgetretene unerwünschte Wirkungen, insbesondere eine periphere Neuropathie,

Thrombozytopenie, Diarrhoe, Übelkeit und Müdigkeit durch die Behandlung mit

Bortezomib erkannt werden.

Ziel war es, eine deutliche Verbesserung der klinischen Symptome, insbesondere der

Proteinausscheidung bei aktiver Nephritis, bestenfalls bis in den physiologischen

Bereich, zu erreichen. Dabei sollte das Ausmaß unerwünschter Wirkungen durch den

Heilversuch mit Bortezomib so gering wie möglich gehalten werden.

18

3. Materialien und Methoden

3.1 Materialien

3.1.1 Verbrauchsmaterialien

96F-Maxisorp-Platte für ELISA (Nunc, Dänemark)

Varelisa ANA Profile Assay (Phadia, Freiburg)

Pipettenspitzen, 2 bis 200 µl (Ratiolab, Frankfurt)

Pipettenspitzen, 100 bis 1000 µl (Ratiolab, Frankfurt)

Reaktionsgefäße, 1,5 ml (Brand, Wertheim)

Falcon-Röhrchen, 50 ml (Greiner, Frickenhausen)

3.1.2 Tetanus-Toxoid-ELISA

3.1.2.1 Puffer und Lösungen

10x PBS 80 g NaCl

2 g KCl

2,4 g KH2PO4

26,8 g Na2HPO4 * 7 H2O

ad 1000 ml H2O dest.

PBS/BSA (2%) PBS

20 g BSA (Sigma Aldrich, St. Louis)

pH 7,4

PBST (0,1%) 1,0 ml Tween 20 (Sigma Aldrich, St. Louis)

ad 1000 ml PBS

Kopplungspuffer 15 mM Na2CO3

35 mM NaHCO3

pH 9,6

Substratpuffer 20 mM Na2HPO4

10 mM Zitronensäure-Monohydrat

19

Substratlösung 10 ml Substratpuffer

10 mg ortho-Phenylendiamin

(Sigma Aldrich, Taufkirchen)

10 µl H2O2 30%

Stopplösung 2 M H2SO4

3.1.2.2 Antigene und Antikörper

Antigen (feste Phase) Tetanus-Toxoid

Sekundärantikörper Anti-human-IgG-Peroxidase (Jackson

ImmunoResearch Laboratories, UK)

1:5000 in PBS/BSA (2%)

3.1.2.3 Geräte

Pipettierhilfe Pipetman (Gilson, Frankreich)

Waschgerät ELISA-Washer (Tecan Group, Schweiz)

Photometer Emax precision microplate reader MW6-

Biotech

3.1.3 Varelisa ANA Profile Assay

3.1.3.1 Puffer und Lösungen

Waschpuffer 1 Fläschchen, 20x PBS-Konzentrat mit

0,095% (w/v) Natriumazid und Detergens,

75 ml

ad 1425 ml H2O dest.

Probenpuffer 1 Fläschchen mit BSA, 0,095% (w/v)

Natriumazid und Detergens, 100 ml (gelb

eingefärbt), gebrauchsfertig

Substratlösung 1 Fläschchen TMB (3, 3‘, 5, 5‘-

20

Tetramethylbenzidin), 20 ml,

gebrauchsfertig

Stopplösung 1 Fläschchen 0,5 M H2SO4, 20 ml (farblos),

gebrauchsfertig

Negativ-Kontrolle 1 Fläschchen mit BSA, 0,095% (w/v)

Natriumazid, Detergens und Humanserum

in PBS, 3,5 ml, gebrauchsfertig

Kalibrator 1 Fläschchen mit BSA, 0,095% (w/v)

Natriumazid, Detergens und Humanserum

in PBS, 3,5 ml, gebrauchsfertig

3.1.3.2 Antigene und Antikörper

Antigene (feste Phase) RNP 70

U1RNP (RNP70, A, C)

SmD

SS-A/Ro (52 kDa, 60 kDa)

SS-B/La

Scl-70

CENP-B

Jo-1

Sekundärantikörper Anti-human-IgG-Peroxidase,

20 ml, gebrauchsfertig

3.1.3.3 Geräte

Pipettierhilfe Pipetman (Gilson, Frankreich)

Photometer Emax precision microplate reader MW6-

Biotech

Software Synelisa 5.2 D

(Pharmacia Diagnostics, Freiburg)

21

3.2 Methoden

3.2.1 Patientenkollektiv

Im Rahmen individueller Heilversuche wurde bei fünf Patientinnen im Alter zwischen 26

und 34 Jahren mit therapierefraktärem systemischen Lupus erythematodes eine

Behandlung mit dem Proteasominhibitor Bortezomib durchgeführt. Alle Patientinnen

waren zuvor bereits in der Medizinischen Klinik 3 des Universitätsklinikums Erlangen

behandelt worden.

Aus Datenschutzgründen wurden die Patientinnen anonymisiert und den Zahlen 1 bis 5

zugeordnet. Jede Patientin wurde vor Therapiebeginn über die off-label-Behandlung

mit dem Proteasominhibitor aufgeklärt und unterzeichnete eine schriftliche

Einverständniserklärung.

Bei jeder Patientin wurde ein internistischer Status mit EKG und Echokardiographie

erhoben, sowie eine neurologische Untersuchung, vor allem im Hinblick auf eine

möglicherweise bestehende Neuropathie, z.B. SLE-assoziiert, durchgeführt. Zudem

wurde eine umfangreiche Labordiagnostik, inklusive Antikörper-Status,

Urinuntersuchung und Differentialblutbild veranlasst.

Vor jeder Behandlung mit Bortezomib wurden Anamnese, körperliche Untersuchung

und Blutentnahmen durchgeführt. Dabei sollten vor allem die Vitalparameter sowie die

Entzündungsparameter vor der Injektion bestimmt werden.

3.2.2 Behandlung mit Bortezomib

Allen Patientinnen wurde in einer Dosierung von 1,3 mg/m2 Körperoberfläche

Bortezomib an den Tagen 1, 4 und 8, sowie den Patientinnen 4 und 5 zu Beginn auch

an Tag 11 intravenös (i.v.) appliziert. Dazu erhielten die Patientinnen oral (p.o.) 20 mg

Dexamethason und 2x 400 mg Aciclovir zur Prophylaxe einer

Herpesvirenreaktivierung.

Die Therapiezyklen wurden nach einer Pause von zwei bis vier Wochen bis zu fünfmal

wiederholt. Dabei sollten Patientin 1 und 2 jeweils zwei Therapiezyklen erhalten,

Patientin 3 insgesamt drei und Patientin 4 und 5 jeweils vier Zyklen (Abb 3.1). Bei

Patientin 5 wurde der dritte Zyklus aus persönlichen und gesundheitlichen Gründen,

die nicht auf die Behandlung mit Bortezomib zurückzuführen waren, abgebrochen. Erst

nach einer Pause von fünf Monaten wurde bei dieser Patientin ein neuer

Therapiezyklus begonnen. Aufgrund schwerer SLE-Aktivität erhielt Patientin 5

schließlich noch einen weiteren Therapiezyklus.

22

Abb. 3.1: Therapieschema für die Behandlung mit Bortezomib

Injektionen jeweils an den Tagen 1, 4 und 8, sowie bei Patient 4 und 5 zusätzlich an Tag 11.

Wiederholung des Zyklus im Abstand von zwei bis vier Wochen.

Pause von 5 Monaten bei Patient 5 (roter Balken) nach Abbruch des dritten Zyklus.

Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob durch die Behandlung mit

Bortezomib eine Abnahme der Antikörper-Titer sowie der Proteinausscheidung bei

aktiver Lupusnephritis und damit eine Verminderung der Krankheitsaktivität erreicht

werden kann, was zuvor in SLE-Mausmodellen bereits gelungen war (Neubert et al.,

2008).

Bei den Patientinnen wurde vor Behandlungsbeginn sowie in regelmäßigen Abständen

nach den Injektionen die Konzentrationen von Antikörpern gegen doppelsträngige DNA

(dsDNA), Komplementfaktoren C3 und C4, sowie die Gesamtpunktzahl im Systemic

Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI) bestimmt. Bei den Patientinnen

mit aktiver Lupusnephritis WHO Grad IV (Patient 2-4) wurde die Proteinausscheidung

im 24h-Urin quantifiziert. Die Antikörpertiter gegen extrahierbare nurkleäre Antigene

(ENA) wurden bei den Patientinnen 1 bis 3 bestimmt. Zusätzlich erfolgte bei allen

Patientinnen die Bestimmung von protektiven Impfantikörpern gegen Tetanus-Toxoid

und Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen (HBs-Antigen).

23

Für Patientin 1 konnten sämtliche Laborwerte nur bis 8 Wochen nach der ersten

Injektion bestimmt werden, da die Patientin nicht mehr zu Nachuntersuchungen in

unsere Klinik kam.

3.2.3 Bestimmung von lupusassoziierten Serumparametern

3.2.3.1 Antikörper gegen extrahierbare nukleäre Antigene (ENA)

Die Antikörper gegen extrahierbare nukleäre Antigene wurden mit Hilfe eines ELISA

(enzyme-linked immunosorbent assay) bestimmt. Dabei handelt es sich um einen

quantitativen Immunoassay in Sandwich-Technik, bei dem die Komplexbildung

zwischen Antigenen und Antikörpern zur Bestimmung von Antigen- oder

Antikörperkonzentrationen in Serum- und Plasmaproben genutzt wird. Die Anfänge

dieser Technik gehen auf die frühen 1970er Jahre zurück. Im Jahre 1971 beschrieben

Engvall und Perlman in Schweden sowie Avrameas und Guilbert in Frankreich die

ersten erfolgreichen Versuche. Antigene bzw. Antikörper werden an eine feste Phase

gebunden. Dabei handelt es sich überwiegend um Mikrotiterplatten aus Polystyrol,

welches eine hohe Bindungskapazität für Proteine aufweist. An diese beschichtete

feste Phase binden die Antigene bzw. Primärantikörper im Serum, deren

Bindungskapazität mit Hilfe eines Enzym-markierten Sekundärantikörpers quantitativ

bestimmt werden kann. Nach Zugabe eines spezifischen chromogenen Substrates wird

dieses vom Enzym umgesetzt, was zu einer Farbreaktion führt, die photometrisch bei

einer bestimmten Wellenlänge gemessen wird (Luttmann et al., 2006, S. 106-116).

Zur Bestimmung der Antikörper gegen verschiedene ENA (RNP 70, U1RNP, SmD, SS-

A/Ro, SS-B/La, Scl-70, CENP-B und Jo-1) im Serum der Patientinnen 1, 2 und 3,

wurde ein Varelisa ANA Profile Assay der Firma Phadia aus Freiburg verwendet. Dabei

handelt es sich um einen indirekten, nichtkompetitiven Enzym-Immunoassay, bei dem

ein Enzym-markierter Antikörper spezifisch an die Antikörper gegen ENA im Serum

bindet (Arnold, Rauch, 2007, S.51). Auf einem vorgefertigten Kit mit humanen

rekombinanten Antigenen oder synthetischen Peptiden (SmD) als antigene Festphase,

wurden Serumproben der ersten drei Patientinnen in einer Verdünnung mit

Probenpuffer von 1:100 aufgetragen, die vor der Behandlung mit Bortezomib, nach ca.

vier, acht und zwölf Wochen entnommen wurden. Zur Qualitätskontrolle wurden ein

Kalibrator, der alle acht antinukleären Antikörper in erhöhten Konzentrationen enthält

und eine Negativ-Kontrolle als PBS/BSA-Gemisch mitgeführt (siehe 3.1.3.1). Die im

Serum vorhandenen Antikörper gegen nukleäre Antigene binden spezifisch an die

antigene Festphase. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten bei Raumtemperatur

24

und dreimaligem Waschen mit je 300 µl Waschpuffer wurde anschließend der

Sekundärantikörper Anti-human-IgG-Peroxidase zugegeben und für weitere 30

Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss an einen weiteren Waschvorgang

wurden je 100 µl TMB-Enzymsubstrat in die einzelnen Vertiefungen pipettiert und die

Platte für 10 Minuten im Dunkeln inkubiert. Nach Zugabe der Stopplösung und

Inaktivierung des Enzyms wurde bis ca. 30 Minuten nach dem Abstoppen die optische

Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 450 nm bestimmt.

Zur Auswertung der Ergebnisse durch Berechnung des Cut-off (ODCut-off) und der Ratio

wurde die Synelisa Software von Pharmacia Diagnostics aus Freiburg verwendet.

3.2.3.2 Antikörper gegen doppelsträngige DNA (dsDNA)

Die Antikörper gegen doppelsträngige (ds) DNA wurden im Labor der Medizinischen

Klinik 3 des Universitätsklinikums Erlangen mittels eines kommerziellen Farr-

Radioimmunoassays (RIA) bestimmt. Dabei handelt es sich um eine Immunoassay-

Technik, bei der ein Antigen, das mit einem Radioisotop (=Tracer) markiert ist, zu den

zu untersuchenden Serumproben gegeben wird. Nach Inkubation und erfolgter

Immunreaktion zwischen den Anti-dsDNA-Antikörpern und den radioaktiv markierten

Antigenen im Teströhrchen, muss als nächstes eine Trennung der markierten

Immunkomplexe von den nicht gebundenen Antigenen und Tracermolekülen erfolgen

(Luttmann et al., 2006, S. 111). Hierfür gibt es unterschiedliche Methoden. Zum einen

kann Ammoniumsulfat zugegeben werden, das selektiv an die radioaktiv markierten

Immunkomplexe bindet und diese ausfällt. Alternativ können auch Polyethylenglycol

(PEG), Ethanol, Methanol oder Aceton verwendet werden. Eine weitere Möglichkeit ist

die Zugabe eines Sekundärantikörpers, der spezifisch den Fc-Teil des

Primärantikörpers, in diesem Fall an die Anti-dsDNA-Antikörper, bindet. Durch

Vernetzung der beiden Antikörper kommt es zur Präzipitation der Immunkomplexe. In

modernen Farr-Assays wird der Primärantikörper an das Teströhrchen gebunden,

während die ungebundenen Antigene und Tracermoleküle frei im Überstand bleiben

und abpipettiert werden können, ein Vorgehen, das auch unter dem Begriff

Festphasentrennung bekannt ist (Luttmann et al., 2006, S. 112-113).

Die Messung der Radioaktivität der Immunkomplexe erfolgte mittels eines

Szintillationszählers. Die Auswertung der Daten und die Berechnung der Antikörper-

Konzentration erfolgte über eine Computersoftware (Luttmann et al., 2006, S. 112-

113).

25

3.2.3.3 Komplementfaktoren C3 und C4

Das Komplementsystem, ein Bestandteil der humoralen Abwehr, besteht aus mehreren

Faktoren, die auf verschiedenen Wegen aktiviert werden können. Der klassische

Reaktionsweg umfasst die Bindung von C1 durch das Fc-Fragment von Antikörpern

nach erfolgter Komplexbildung mit Antigenen. Dieser Weg spielt unter anderem bei

Autoimmunerkrankungen eine zentrale Rolle. Durch die Aktivierung der

Komplementkaskade werden die Komplementfaktoren zur Opsonierung und Zytolyse

von Antigen-Antikörper-Komplexen benötigt und somit verbraucht. Eine verminderte

C3-Konzentration im Serum zeigt eine Aktivierung des Systems an. Ist gleichzeitig

auch C4 vermindert, so spricht dies für eine Aktivierung des klassischen Weges und

somit für den Kontakt mit Immunkomplexen (Hallbach, 2006, S. 103; Schur, Klickstein,

2002, S.243-244).

Die Bestimmung der Komplementfaktoren C3 und C4 erfolgte im Labor der

Medizinischen Klinik 3 des Universitätsklinikums Erlangen mittels der

Immunnephelometrie. Dabei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem quantitativ

Einzelproteine in Serum- oder Plasmaproben bestimmt werden können. Die

Komplementfaktoren bilden mit spezifischen Antikörpern Immunkomplexe, an denen

eingestrahltes Licht unterschiedlich stark gestreut wird. Dieses Phänomen ist auch

unter der Bezeichnung Tyndall-Effekt bekannt. Mit einem speziellen Photometer, dem

Nephelometer, kann die Streulichtintensität bestimmt werden. Durch die Mitführung

eines Standards mit bekannter Konzentration wurden die C3- und C4-Konzentrationen

über eine Computer-Software berechnet.

3.2.4 Bestimmung der Proteinausscheidung im 24-Stunden-Urin

Die Ausscheidung einer geringen Menge an Proteinen im Urin ist in einem

Grenzbereich von 120 bis 150 mg/24h physiologisch (Kuhlmann et al., 2008, S.8). Die

einfachste Nachweismethode mittels Teststreifen erfasst vor allem die vermehrte

Ausscheidung von Albumin, während eine Mikroalbuminurie jedoch nicht erfasst

werden kann. Zur quantitativen Bestimmung von Proteinen im Urin wurde in

regelmäßigen Abständen über 24 Stunden Urin von Patientin 2, 3 und 4 gesammelt.

Patientin 1 wurde aufgrund einer dialysepflichtigen Niereninsuffizienz nicht

berücksichtigt, Patientin 5 zeigte während des Heilversuchs keine renale Manifestation

des SLE. Die Patientinnen wurden dazu angehalten, sich während des

Sammelvorganges keiner extremen körperlichen Belastung auszusetzen, welche zu

einem Anstieg der Kreatinin- und Proteinausscheidung und somit zu falsch hohen

26

Ergebnissen führen kann. Desweiteren sollte auf eine ausreichende Trinkmenge von

1,5 bis 2 Litern pro Tag geachtet werden.

Die Bestimmung der Proteinurie/24h erfolgte im Zentrallabor des Universitätsklinikums

Erlangen mittels der Farbstoffbindungsmethode. Dabei macht man es sich zunutze,

dass Farbstoffe nach der Bindung an Proteine ihr Absorptionsverhalten ändern, ein

Vorgang, der auch als Metachromasie bezeichnet wird. Der Farbstoff Coomassie-

Brillant-Blue (CBB) hat im ungebundenen Zustand ein Absorptionsmaximum bei einer

Wellenlänge von 465 nm (Hallbach, 2006, S.98-99). Sind in der zu untersuchenden

Urinprobe Plasmaproteine nachweisbar, so bindet CBB diese und es erfolgt eine

Farbänderung von orangebraun nach blau und eine Erhöhung des

Absorptionsmaximums auf 595 nm. Die Änderung der optischen Dichte kann

photometrisch bestimmt werden (Hallbach, 2006, S.98-99).

3.2.5 Bestimmung protektiver Antikörper

3.2.5.1 Tetanus-Toxoid-Antikörper

Zur Bestimmung der Antikörper gegen Tetanus-Toxoid wurden von allen Patientinnen

Serumproben vor der Behandlung mit Bortezomib, zwei bis vier Wochen nach Beginn

der Therapie und weitere drei bis sechs Monate später abgenommen. Zur Beurteilung

der Antikörperkonzentrationen unter Bortezomib wurde ein Festphasen-Enzym-

Immunoassay durchgeführt. Dazu wurden zwei NuncImmunoTM Platten mit MaxisorpTM

Oberfläche und 8x12 Matrix = 96 Vertiefungen (engl.: wells) mit 100 µl/well Tetanus-

Toxoid, verdünnt mit Kopplungspuffer beschichtet und bei 4°C im Kühlschrank über

Nacht inkubiert. Anschließend wurde die antigene Festphase mit 200 µl/well PBS/BSA

(2%) zwei Stunden bei Raumtemperatur geblockt, um eine Hintergrundaktivität durch

unspezifisch adsorbierte, enzymmarkierte Antikörper- bzw. Antigenmoleküle zu

reduzieren (Luttmann et al., 2006, S.114). Nach einem dreimaligen Waschvorgang mit

dem Universalwaschpuffer PBST im ELISA-Washer (Tecan Group, Schweiz) wurden

die in PBS/BSA (2%) verdünnten Patientenseren im Verhältnis 1:100, 1:1000 und

1:10000 in die Vertiefungen der Platten pipettiert. Zur späteren Ermittlung des

Hintergrundsignals wurde ein Leerwert mit PBS/BSA (2%) ohne Serum auf beiden

Platten mitgeführt. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur, während der die

Antikörper gegen das Tetanus-Toxoid aus den Patientenseren an die feste Phase

binden konnten, erfolgten weitere vier Waschvorgänge mit PBST. Anschließend wurde

ein Enzym-konjugierter Antikörper, der den Fc-Teil humaner IgG-Antikörper bindet, in

einer Verdünnung mit PBS/BSA (2%) von 1:10000 in 100 µl/well zugegeben und eine

27

Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der Enzym-konjugierte Antikörper bindet die

Tetanus-Toxoid-Antikörper, die eine Bindung mit der antigenen Festphase

eingegangen sind (Abb. 3.2).

Abb. 3.2: Schematische Darstellung des indirekten Festphasen-ELISA zur

Bestimmung der Tetanus-Toxoid-Antikörper

Dargestellt ist die Bindung der Tetanus-Toxoid-Antikörper (TT-AK) im Patientenserum an die mit

Tetanus-Toxoid (Antigen) beschichtete ELISA-Platte. An das Fc-Fragment der Tetanus-Toxoid-

IgG-Antikörper bindet spezifisch der Detektor-Antikörper, an den das Enzym ( ) gebunden ist,

das die photometrisch messbare Umsetzung des Substrates katalysiert.

Bei dem Enzym handelt es sich um eine Meerrettich-Peroxidase (horse raddish

peroxidase, HRP), die nach Zugabe eines geeigneten Substrates, eine photometrisch

messbare Reaktion katalysiert. Dazu wurde ortho-Phenylendiamin mit Substratpuffer

und Wasserstoffperoxid vermischt und je 100 µl dieser Substratlösung in die

Vertiefungen der Platten pipettiert. Vor Substratzugabe wurde zur Entfernung

ungebundener Antikörper wiederum viermal im ELISA-Washer gewaschen. Nach einer

Inkubationszeit von 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Enzymreaktion

mit je 100 µl/well 2 M Schwefelsäure gestoppt. Nach einem sichtbaren Farbumschlag

von blau nach gelb erfolgte die Messung im Photometer Emax bei einer optischen

Dichte von 490 nm (OD490) und die Auswertung über eine entsprechende Software am

Computer.

Da kein Standard-Antikörper mitgeführt wurde, wurden keine genauen Konzentrationen

der Tetanus-Toxoid-Antikörper-Titer bestimmt, sondern Veränderungen im Verlauf in %

ermittelt.

28

3.2.5.2 Antikörper gegen Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen

Die Antikörper gegen das Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen (HBs) wurden aus

Serumproben vor und nach der Behandlung mit Bortezomib bestimmt. Patientin 4

wurde dabei nicht berücksichtigt, da bei ihr keine Impfung gegen Hepatitis B erfolgt

war.

Die Bestimmung wurde mittels eines quantitativen indirekten Enzym-Immunoassays im

Zentrallabor des Universitätsklinikums Erlangen unter der Leitung von Herrn Dr. med.

Hans Parsch durchgeführt.

3.2.6 Dokumentation im SLEDAI

Zur Einschätzung der Krankheitsaktivität im Verlauf der Behandlung wurde der

Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI) verwendet. Tabelle

3.1 zeigt lupusspezifische Symptome und Laborwerte, für die eine unterschiedliche

Anzahl an Punkten vergeben wird. Die Summe der einzelnen Punkte ergibt den

SLEDAI. Die Höhe des erhaltenen Wertes korreliert mit der Krankheitsaktivität.

Bei jeder Patientin wurde 12 Wochen vor der Behandlung mit Bortezomib, sowie vier

bis acht Wochen, drei bis vier Monate und sechs Monate nach Therapiebeginn der

SLEDAI bestimmt und graphisch dargestellt.

Tab. 3.1: Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI)

Beschreibung Definition

8 Krampfanfall kürzlicher Beginn; metabolische, infektiöse, medikamentöse

Ursache ausgeschlossen

8 Psychose eingeschränkte Fähigkeit, normale Aktivitäten auszuführen,

aufgrund einer schweren Störung der Realitätswahrnehmung;

einschließlich Halluzinationen, Verworrenheit, deutlich verminderte

Assoziationsfähigkeit, verarmter Gedankeninhalt, ausgeprägtes

unlogisches Denken, bizarres, desorganisiertes oder katatonisches

Verhalten; Urämie und medikamentöse Ursachen ausgeschlossen

8 Psychoorganisches

Syndrom

veränderte geistige Funktion mit Beeinträchtigung von Orientierung,

Gedächtnis oder anderen intellektuellen Funktionen, mit raschem

Beginn und fluktuierenden klinischen Merkmalen; einschließlich

Beeinträchtigung des Bewusstseins mit reduzierter Fähigkeit, zu

fokussieren und Unfähigkeit zu anhaltender Konzentration auf die

Umgebung; zusätzlich zwei der folgenden Kriterien:

Wahrnehmungsstörung, verworrene Sprache, Schlaflosigkeit oder

Abgeschlagenheit am Tag, gesteigerte oder verminderte

psychomotorische Aktivität; metabolische, infektiöse oder

medikamentöse Ursachen ausgeschlossen

29

8 Sehstörung Netzhautveränderungen bei SLE; einschließlich Schwellung der

Nervenfasern, Netzhautblutungen, erhebliche Exsudate oder

Blutungen in der Aderhaut oder Opticus-Neuritis; Bluthochdruck,

infektiöse oder medikamentöse Ursachen ausgeschlossen

8 Hirnnervenstörung neu aufgetretene, die Hirnnerven betreffende, sensorische oder

motorische Neuropathie

8 Lupus-

Kopfschmerz

andauernder, heftiger Kopfschmerz, eventuell migräneartig, aber

ohne Ansprechen auf Analgetika

8 Zerebrovaskulärer

Insult

neu aufgetretene zerebrovaskuläre Ereignisse; Arteriosklerose

ausgeschlossen

8 Vaskulitis Ulzerationen, Gangrän, schmerzhafte Knötchen an den Fingern,

periunguale Infarkte, Splitterblutungen oder durch Biopsie oder

Angiogramm nachgewiesene Vaskulitis

4 Arthritis mehr als zwei schmerzhafte oder entzündlich veränderte Gelenke

(Überwärmung, Schwellung, Erguss)

4 Myositis Schmerzen/Ermüdung der proximalen Muskulatur, assoziiert mit

erhöhter Kreatinin-Phosphorylase/Aldolase oder Veränderungen im

Elektromyogramm oder in der Biopsie, die für eine Myositis

sprechen

4 Harnzylinder granuläre oder Erythrozyten-Zylinder

4 Hämaturie >5 Erythrozyten/Gesichtsfeld im Mikroskop; Nierensteine, infektiöse

oder medikamentöse Ursachen ausgeschlossen

4 Proteinurie >500mg/24h; neu aufgetreten oder kürzlicher Anstieg um mehr als

500mg/24h

4 Pyurie >5 Leukozyten/Gesichtsfeld im Mikroskop; infektiöse Ursache

ausgeschlossen

2 Erythem Neubeginn oder erneutes Auftreten eines Erythems

2 Alopezie Neubeginn oder erneutes Auftreten von pathologischem

Haarausfall, ungleichmäßigem oder diffusem Haarausfall

2 Schleimhautulzera Neubeginn oder erneutes Auftreten von oralen oder nasalen Ulzera

2 Pleuritis pleuritischer Brustschmerz mit Pleurareiben oder Pleurerguss oder

Pleuraverdickungen

2 Perikarditis perikardialer Schmerz mit mindestens einem der folgenden

Merkmale: Perikardreiben, Erguss oder Bestätigung im EKG

2 Komplement-

erniedrigung

verminderte Werte für CH50, C3 oder C4, unterhalb der für die

Labortests normalen unteren Referenzbereiche

2 erhöhte dsDNA-

Antikörper

oberhalb des Normbereichs im Labortest

1 Fieber >38°C; infektiöse Ursache ausgeschlossen

1 Thrombozytopenie <100000 Thrombozyten/µl

1 Leukopenie <3000 Leukozyten/µl; medikamentöse Ursache ausgeschlossen

eigene Darstellung gemäß Bombardier et al., 1992, S. 637

30

4. Ergebnisse

4.1 Auswirkungen der Behandlung mit Bortezomib auf die Konzentration der

Autoantikörper gegen dsDNA und ENA

Die Produktion von Autoantikörpern spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese des

SLE. Durch die Ablagerung von Antigen-Antikörper-Komplexen im Gewebe kommt es

zu schweren Organschäden, z.B. an der glomerulären Basalmembran. Dabei korreliert

vor allem die Höhe der Antikörper gegen doppelsträngige DNA mit der

Krankheitsaktivität und Schwere der Manifestationen (Arbuckle et al., 2001). Der

Therapieversuch mit Bortezomib sollte zeigen, ob ein Rückgang der Antikörper gegen

dsDNA und damit eine Verminderung der Krankheitsaktivität erreicht werden kann.

Abb. 4.1: Auswirkung der Behandlung mit Bortezomib auf die Konzentration der

Antikörper gegen dsDNA im Serum bei Patientin 1-5 (A-E)

A

31

B

C

D

32

E

Dargestellt sind die Konzentrationen der Antikörper gegen dsDNA in U/ml in einem Zeitraum

von ca. einem Jahr vor der Behandlung mit Bortezomib bis sechs Monate nach der letzten

Injektion. Die einzelnen Injektionen sind rot dargestellt (Bz). Medikamente vor bzw. nach

Bortezomib, sowie Begleitmedikation sind wie folgt abgekürzt: Cyc (Cyclophosphamid), MMF

(Mycophenolat-Mofetil), RTX (Rituximab), Tc (Tacrolimus).

Referenzbereich Anti-dsDNA-Antikörper: 0-7 U/ml.

Wie die Kurvenverläufe zeigen, waren die dsDNA-Antikörper-Titer unter der Therapie

mit Bortezomib bei allen fünf Patientinnen rückläufig.

Bei Patientin 3 (Abb. 4.1 C) wurde vier Wochen nach der ersten Injektion eine

Konzentration von nur 4,6 U/ml im Serum gemessen, was einem Wert im

Referenzbereich (0-7 U/ml) entspricht. Kurz nach der letzten Bortezomib-Injektion stieg

die Konzentration der Antikörper gegen dsDNA wieder an, blieb jedoch bis sechs

Monate nach Therapieende stets unterhalb der nachgewiesenen Konzentration vor der

Behandlung mit dem Proteasominhibitor.

Für Patientin 1 (Abb. 4.1 A) konnte der Verlauf der Antikörper nur bis acht Wochen

nach der ersten Injektion bestimmt werden, da sie nicht mehr zu Nachuntersuchungen

in unsere Klinik kam. Unter der Therapie mit Bortezomib zeigen sich auch hier

rückläufige Werte.

Bereits zehn Tage nach der ersten Injektion war im Serum von Patientin 2 (Abb. 4.1 B)

eine deutliche Abnahme der Antikörperkonzentration nachweisbar. Ein weiterer Abfall

konnte bis vier Wochen nach der letzten Bortezomib-Gabe beobachtet werden. Zur

Erhaltungstherapie wurde Tacrolimus, ein Calcineurininhibitor eingesetzt, da

Azathioprin, Mycophenolat-Mofetil sowie Antimalariamittel aufgrund von

Nebenwirkungen nicht toleriert wurden.

33

Patientin 4 und 5 erhielten aufgrund hoher Krankheitsaktivität zwischen den einzelnen

Zyklen mit Bortezomib zusätzlich eine Erhaltungstherapie mit Mycophenolat-Mofetil.

Bei Patientin 4 (Abb. 4.1 D) zeigte sich bis acht Wochen nach der ersten Injektion ein

deutlicher Rückgang der Anti-dsDNA-Antikörper.

Patientin 5 (Abb. 4.1 E) wurde aufgrund schwerster Arthritis, Arthralgien und Myalgien

zwischen den einzelnen Bortezomib-Zyklen zusätzlich mit zwei Infusionen Rituximab

behandelt. Daraufhin kam es zu einer deutlichen Abnahme der Anti-dsDNA-Antikörper-

Titer im Serum. Der dritte Zyklus mit Bortezomib musste aufgrund psychischer

Probleme der Patientin zunächst unterbrochen werden. Während dieser Pause stiegen

die Antikörper wieder extrem an, sodass zwei Zyklen Immunadsorption notwendig

wurden. Nach einer Pause von fünf Monaten wurde Patientin 5 in weiteren drei Zyklen

mit Bortezomib behandelt, was wiederum einen Abfall der Anti-dsDNA-Antikörper

bewirkte. Unmittelbar im Anschluss wurde eine erneute Therapie mit Rituximab

eingeleitet, in deren Verlauf bis acht Wochen nach der letzten Bortezomib-Injektion die

Konzentration der Antikörper im Serum abnahm.

Um zu untersuchen, ob Bortezomib auch eine Abnahme der Antikörper-Titer gegen

extrahierbare nukleäre Antigene bewirkt, wurden diese zusätzlich bei drei Patientinnen

bestimmt (Abb. 4.2). Dazu wurden Serumproben, die den Patientinnen 1 bis 3 vor der

ersten Injektion, sowie ca. vier, acht und zwölf Wochen nach Therapiebeginn

entnommen wurden, mit Hilfe eines Festphasen-ELISA auf Antikörper gegen ENA

getestet.

34

Abb. 4.2: Auswirkung der Behandlung mit Bortezomib auf die Konzentration der

Antikörper gegen ENA im Serum bei Patientin 1-3 (A-C)

A

B

35

C

Dargestellt sind insgesamt vier Messungen zur Bestimmung der Antikörper gegen ENA in der

Konzentration U/ml vor der ersten Bortezomib-Injektion sowie ca. vier, zwölf und acht Wochen

nach Therapiebeginn.

A: Nachweis von Antikörpern gegen SS-A/Ro im Serum von Patientin 1.

B: Nachweis von Antikörpern gegen RNP-70, Sm, SS-A/Ro und SS-B/La im Serum von

Patientin 2.

C: Nachweis von Antikörpern gegen RNP-70 und Sm im Serum von Patientin 3.

Die Konzentration der Antikörper gegen ENA, wie in den Kurvenverläufen zu sehen,

blieb während der Therapie mit Bortezomib im Durchschnitt weitgehend konstant.

Dennoch konnte bereits innerhalb von vier bis zwölf Wochen nach Therapiebeginn bei

jeder Patientin zumindest eine geringe Abnahme der Antikörper-Titer verzeichnet

werden.

4.2 Komplementfaktoren C3 und C4

Bei Autoimmunerkrankungen wie dem SLE kann durch die Bildung von Antigen-

Antikörper-Komplexen das Komplementsystem aktiviert werden. Die

Komplementfaktoren werden an die Immunkomplexe gebunden, umgesetzt und somit

verbraucht. Eine verminderte C3-Konzentration im Serum zeigt eine Aktivierung des

Systems an. Ist gleichzeitig auch C4 vermindert, so spricht dies für eine Aktivierung

des klassischen Weges und somit für den Kontakt mit Immunkomplexen (Hallbach,

2006, S.103).

36

Da Bortezomib im Mausmodell eine Eliminierung der Plasmazellen und damit eine

Reduktion der freien Antikörper bewirkte, sollte es im Rahmen der Behandlung zu einer

verminderten Immunkomplexbildung und damit zu einem geringeren

Komplementverbrauch kommen. Um die Komplementaktivierung unter Bortezomib zu

evaluieren, wurde die Konzentration der Faktoren C3 und C4 im Serum bestimmt.

Abb. 4.3: Entwicklung der Komplementfaktoren C3 und C4 unter Bortezomib bei

Patientin 1-5 (A-E)

A

B

37

C

D

E

Dargestellt sind die Konzentrationen der Komplementfaktoren C3 und C4 in mg/dl in einem

Zeitraum von ca. einem Jahr vor der Behandlung mit Bortezomib bis etwa sechs Monate nach

der letzten Injektion. Die einzelnen Injektionen sind rot dargestellt (Bz). Medikamente vor bzw.

38

nach Bortezomib, sowie Begleitmedikation sind wie folgt abgekürzt: Cyc (Cyclophosphamid),

MMF (Mycophenolat-Mofetil), RTX (Rituximab), Tc (Tacrolimus).

Referenzbereich C3: 79-152 mg/dl.

Referenzbereich C4: 16-47 mg/dl.

Tendenziell kam es bei den Patientinnen 1, 2, 4 und 5 unter der Behandlung mit

Bortezomib zu einem Anstieg der Komplementfaktoren.

Bei Patientin 1 (Abb. 4.3 A) stieg nur das C4-Komplement an, während das C3 noch

weiter abfiel.

Patientin 2 (Abb. 4.3 B) zeigte einen deutlichen Anstieg beider Komplementfaktoren,

der unter der anschließenden Behandlung mit Tacrolimus zumindest für C3 bis in den

physiologischen Bereich (79-152 mg/dl) reichte.

Patientin 4 (Abb. 4.3 D) und 5 (Abb. 4.3 E) zeigten unter der Behandlung Fluktuationen

im Konzentrationsverlauf von C3 und C4. Tendenziell konnte beobachtet werden, dass

wenige Tage nach der Injektion die Konzentrationen eher wieder zunahmen.

Unter der Behandlung mit Rituximab unmittelbar nach der letzten Bortezomib-Injektion,

lagen die Komplementfaktoren C3 und C4 bei Patientin 5 (Abb. 4.3 E) im

physiologischen Bereich.

Bei Patientin 3 (Abb. 4.3 C) lagen die Werte sowohl vor der Behandlung mit

Bortezomib, als auch danach immer im physiologischen Bereich. Unklar bleibt ob die

geringen Schwankungen in der C3- und C4-Konzentration SLE-assoziiert sind.

4.3 Renale Proteinausscheidung bei Patientinnen mit aktiver Lupusnephritis im

Verlauf

Die Lupusnephritis gehört zu den schwersten Manifestationen des SLE. Bei Patientin 1

bis 4 wurde im Verlauf der Erkrankung eine diffuse Glomerulonephritis WHO Grad IV

durch eine Nierenbiopsie gesichert. Durch Ablagerung von Immunkomplexen und

Induktion einer Entzündungsreaktion kommt es zur Zerstörung der glomerulären

Basalmembran. Damit werden auch größere Proteine, die normalerweise die Barriere

nicht passieren können, mit dem Urin ausgeschieden. Die Ausscheidung einer

geringen Menge an Proteinen im Urin ist in einem Grenzbereich von 120 bis 150

mg/24h physiologisch (Kuhlmann et al., 2008, S.8). Die Menge der

Proteinausscheidung korreliert mit dem Ausmaß der Schädigung der glomerulären

Basalmembran. Zur quantitativen Bestimmung von Proteinen im Urin unter der

Behandlung mit Bortezomib, wurde in regelmäßigen Abständen über 24 Stunden Urin

39

von Patientin 2, 3 und 4 gesammelt. Patientin 1 wurde aufgrund einer bereits

bestehenden dialysepflichtigen Niereninsuffizienz nicht berücksichtigt, Patientin 5

zeigte keine renale Manifestation des SLE.

Abb. 4.4: Proteinausscheidung im 24h-Urin bei Patientin 2-4 (A-C) im Verlauf

A

B

40

C

Dargestellt ist die Proteinausscheidung im 24h-Urin bei drei Patientinnen mit aktiver

Lupusnephritis (Proteinkonzentration im Urin in mg/24h). Die Messung umfasst einen Zeitraum

von ca. einem Jahr vor der Behandlung mit Bortezomib bis etwa sechs Monate nach der letzten

Injektion. Die einzelnen Injektionen sind rot dargestellt (Bz). Medikamente vor bzw. nach

Bortezomib, sowie Begleitmedikation sind wie folgt abgekürzt: Cyc (Cyclophosphamid), MMF

(Mycophenolat-Mofetil), RTX (Rituximab), Tc (Tacrolimus).

Referenzbereich Proteinurie/24h: < 150 mg/24h.

Bei den drei Patientinnen mit aktiver Lupusnephritis ließ sich während der Therapie mit

Bortezomib bereits nach kurzer Zeit eine deutliche Abnahme der Proteinurie

nachweisen.

Patientin 2 (Abb. 4.4 A) zeigte unter Bortezomib bereits einen Monat nach der ersten

Injektion eine deutlich geringere Proteinausscheidung. Sechs Monate nach der letzten

Injektion, kurz nachdem eine Therapie mit Tacrolimus begonnen wurde, lag die

Proteinausscheidung im physiologischen Bereich.

Auch bei Patientin 3 (Abb 4.4 B) und 4 (Abb 4.4 C) ging die Proteinausscheidung. nach

der Behandlung mit Bortezomib deutlich zurück.

Damit konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit Bortezomib wie schon im

Mausmodell auch beim Menschen zu einer Abnahme der Proteinausscheidung im Urin

führt.

41

4.4 Einfluss von Bortezomib auf protektive Antikörper

Um zu untersuchen, welchen Einfluss die Behandlung mit Bortezomib auf protektive

Plasmazellen hat, wurden die Impfantikörper gegen Tetanus-Toxoid und Hepatitis-B-

Oberflächen-Antigen bestimmt. Zudem sollte ermittelt werden, ob die Konzentration der

Impfantikörpertiter durch die Behandlung mit Bortezomib soweit abnimmt, dass eine

Auffrischimpfung zur Gewährleistung eines ausreichenden Impfschutzes notwendig

wird.

Abb. 4.5: Protektive Antikörper gegen Tetanus-Toxoid (A) und gegen HBs-

Antigen (B) im Verlauf

A

B

42

Dargestellt ist die Konzentration protektiver Antikörper im Serum.

A: Konzentration der Antikörper gegen Tetanus-Toxoid im Serum von Patientin 1-5, wobei der

Ausgangswert vor Bortezomib als 100% gewertet wurde, um die relative Änderung zwei bis vier

Wochen und drei bis sechs Monate nach Therapiebeginn zu erfassen. Letzter Wert bei

Patientin 1 nach ca. acht Wochen.

B: Konzentration der Antikörper gegen HBs-Antigen in U/l im Serum der Patientinnen 1-3 und 5

vor der Behandlung mit Bortezomib und jeweils unmittelbar nach Therapieende.

Nach der Behandlung mit Bortezomib nahm die Konzentration der Tetanus-Toxoid-

Antikörper (Abb. 4.5 A) im Serum der fünf Patientinnen ab.

Bei Patientin 1 bis 4 nahm der prozentuale Anteil an Tetanus-Toxoid-Antikörpern

bereits zwei bis vier Wochen nach Therapiebeginn ab. Nach Abschluss der

Behandlung stieg der Antikörper-Titer prozentual wieder an, ohne dass eine erneute

Impfung erfolgt war.

Bei Patientin 5 nahm der Antikörper-Titer erst später ab, möglicherweise ein Hinweis

auf ein verspätetes Ansprechen auf die Behandlung mit Bortezomib oder ein Effekt der

Immunadsorption, die ca. drei Monate nach der ersten Bortezomib-Injektion

durchgeführt wurde.

Die Konzentration der Antikörper gegen HBs-Antigen (Abb. 4.5 B) im Serum von

Patientin 2 und 5 nahm nach der Behandlung mit Bortezomib deutlich ab. Bei Patientin

1 und 3 zeigte sich ein geringerer Abfall der HBs-Antikörper im Serum. Patientin 4

wurde nicht gegen Hepatitis B geimpft und daher in dieser Messung nicht

berücksichtigt.

Damit konnte gezeigt werden, dass durch die Behandlung mit Bortezomib auch die

Konzentration protektiver Antikörper reduziert wird. Die Konzentrationen blieben aber

sowohl bei den Tetanus-Toxoid-Antikörpern als auch bei den Anti-HBs-Antikörpern im

protektiven Bereich.

4.5 Verlauf der Krankheitsaktivität anhand des SLEDAI

Zur Einschätzung der Krankheitsaktivität im Verlauf der Behandlung wurde der

Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI) verwendet.

In diesem Index werden 1, 2, 4 oder 8 Punkte für lupusspezifische Symptome bzw.

Laborparameter in insgesamt neun Organsystemen vergeben (siehe auch Tab. 3.1).

43

Um die Wirkung von Bortezomib auf die Krankheitsaktivität zu analysieren, wurde die

SLEDAI-Gesamtpunktzahl für jede Patientin während und nach der Behandlung mit

dem Proteasominhibitor graphisch dargestellt.

Abb.: 4.6 Graphische Darstellung der Krankheitsaktivität im Verlauf anhand der

Gesamtpunktzahl im SLEDAI

Dargestellt ist der Verlauf der SLEDAI-Gesamtpunktzahl von Patientin 1-5. Die Bestimmung des

SLEDAI erfolgte ca. zwölf Wochen vor Bortezomib, am Tag der ersten Injektion, sowie vier bis

acht Wochen, drei bis vier Monate und sechs Monate nach Therapiebeginn.

Anhand des Krankheitsaktivitätsindexes SLEDAI zeigte sich drei Monate nach

Therapiebeginn bei allen Patientinnen eine verminderte Krankheitsaktivität (Abb. 4.6).

Da subjektive Empfindungen der Patientinnen in diesem Score nicht berücksichtigt

werden, kann der SLEDAI zur Verlaufsbeobachtung, speziell im Hinblick auf das

Ansprechen einer Therapie verwendet werden (Grossmann, Gordon, 2007, S. 926).

Die hohe Gesamtpunktzahl vor der Behandlung mit Bortezomib setzt sich bei Patientin

1 aus folgenden Parametern zusammen: Arthritis, Erythem, Schleimhautulzera,

Pleuritis, Perikarditis, Komplementerniedrigung, Antikörper gegen dsDNA,

Thrombozytopenie und Leukopenie (zur Punkteverteilung siehe auch Tab. 3.1). Bereits

vier bis acht Wochen nach Behandlungsbeginn, waren Arthritis, Erythem, Pleuritis,

Perikarditis und Thrombozytopenie nicht mehr nachweisbar.

Patientin 2 zeigte nach vier bis acht Wochen keine Hämaturie, Erythem, Alopezie und

Leukopenie mehr. Nach drei bis vier Monaten verschwand auch die Arthritis und sechs

Monate nach Therapiebeginn war keine Proteinurie mehr nachweisbar. Die noch

44

verbliebenen 4 Punkte erklären sich aus den weiterhin positiven Antikörpern gegen

dsDNA und der noch bestehenden Verminderung der Komplementfaktoren C3 und C4.

Bei Patientin 3 lagen die Antikörper gegen dsDNA zeitweise im physiologischen

Bereich, sodass sich der Punktwert nach vier bis acht Wochen von 14 auf 12 Punkte

verbesserte. Drei bis sechs Monate nach Behandlungsbeginn konnten Hämaturie und

Arthritis nicht mehr nachgewiesen werden, sodass von den ursprünglichen Symptomen

nur die erhöhte Proteinausscheidung für den SLEDAI noch relevant war. Zudem lagen

die Anti-dsDNA-Antikörper wieder oberhalb des Referenzbereichs, sodass die

Gesamtpunktzahl letztendlich bis sechs Monate nach Therapiebeginn bei 6 Punkten

lag.

Patientin 4 zeigte eine pathologische Proteinurie, Komplementerniedrigung, Antikörper

gegen dsDNA und Leukopenie. Im Verlauf verschwand unter der Therapie mit

Bortezomib nur die Leukopenie.

Die Punktzahl vor Therapiebeginn bei Patientin 5 setzt sich aus den Parametern

Arthritis, Komplementerniedrigung und Antikörper gegen dsDNA zusammen. Nach vier

bis acht Wochen trat Fieber ohne infektiöse Ursache auf, das mit einem Punkt in den

Index einging. Nach sechs Monaten traten wieder Fieber und zusätzlich Leukopenie

auf, während die Arthritis nicht mehr nachweisbar war. Insgesamt war damit bei

Patientin 5 nur ein geringer Rückgang des SLEDAI zu beobachten.

Da im SLEDAI nur Punkte abgezogen werden können, wenn das entsprechende

klinische Symptom vollständig verschwunden ist bzw. Laborparameter nur noch im

physiologischen Bereich nachweisbar sind, stellt die Gesamtpunktzahl einen absoluten

Wert dar. Eine geringe Verbesserung der Krankheitsaktivität, z.B. durch rückläufige

dsDNA-Antikörper-Konzentrationen oder eine Abnahme der Proteinausscheidung

werden nicht berücksichtigt. Dennoch konnte auch anhand des SLEDAI, vor allem bei

Patientin 1 bis 4 gezeigt werden, dass eine Behandlung mit Bortezomib einen

deutlichen Einfluss auf die Krankheitsaktivität hat.

4.6 Unerwünschte Wirkungen unter der Therapie mit Bortezomib

Unter der Therapie mit Bortezomib traten bei Patienten mit multiplem Myelom

verschiedene unerwünschte Wirkungen auf. Relativ häufig war dabei die

dosisabhängige periphere, vor allem sensorische Polyneuropathie, die jedoch bei

rechtzeitigem Abbruch der Therapie vollständig reversibel war. Zudem traten Übelkeit

und Diarrhoe sowie Müdigkeit und Leistungsminderung auf. Als eher seltene

45

Nebenwirkungen wurden Thrombozytopenie, Hypotension mit Synkope und

Leberversagen angegeben (Rajappa, 2010).

Daher wurde bei unseren Patientinnen vor Beginn der Therapie ein internistischer

Status mit EKG und Echokardiographie erhoben, sowie eine neurologische

Untersuchung, vor allem im Hinblick auf eine bereits bestehende SLE-assoziierte

Neuropathie, durchgeführt. Zudem wurde vor jeder weiteren Injektion eine

umfangreiche Labordiagnostik, inklusive Differentialblutbild, sowie eine ausführliche

Anamnese und körperliche Untersuchung durchgeführt.

Insgesamt traten während der Behandlung mit Bortezomib bei keiner der fünf

Patientinnen ernste Nebenwirkungen auf. Patientin 1 bis 4 gaben wenige Tage nach

der ersten Injektion geringe Übelkeit sowie Kopfschmerzen und Fieber für einen Tag

an. Bei Patientin 2 trat nach einer Injektion Durchfall auf. Patientin 5 zeigte keine

Nebenwirkungen. Regelmäßige Blutbildkontrollen ergaben keine wesentlichen

Auswirkungen der Bortezomib-Behandlung auf Erythrozyten, Leukozyten und

Thrombozyten. Während der gesamten Therapie gab es laborchemisch keinen Anhalt

für eine Leber- oder Nierenschädigung durch die Behandlung.

4.7 Zusammenfassung

Der individuelle Heilversuch mit dem Proteasominhibitor Bortezomib bei fünf

Patientinnen mit therapierefraktärem systemischen Lupus erythematodes zeigte, wie

schon im Tierversuch, eine positive Auswirkung auf den Krankheitsverlauf. Bei allen

fünf Patientinnen nahmen die Konzentrationen an Autoantikörpern gegen

doppelsträngige (ds) DNA ab und die Patientinnen mit histologisch gesicherter

Glomerulonephritis WHO Grad IV zeigten eine deutlich niedrigere Proteinausscheidung

im Verlauf. Die Antikörper-Titer gegen ENA nahmen nur gering ab. Der

Komplementverbrauch durch Immunkomplexbildung nahm tendenziell unter der

Therapie bei der Mehrzahl der Patienten ab, sodass die Komplementfaktoren C3 und

C4 im Verlauf wieder anstiegen.

Insgesamt sind die größten Erfolge bei Patientin 2 und 3 zu verzeichnen. Durch den

Rückgang der Antikörper gegen dsDNA im Serum von Patientin 3 bis in den

physiologischen Bereich konnte die aus den Lupus-Mausmodellen bekannte Wirkung

von Bortezomib auf die Antikörperproduktion auch beim Menschen nachgewiesen

werden. Patientin 2 zeigte wenige Monate nach der ersten Injektion eine

Proteinausscheidung im physiologischen Bereich.

46

Bei allen Patienten wurde durch Bortezomib die Produktion von Antikörpern gegen

Tetanus-Toxoid und HBs-Antigen vermindert, ein Hinweis darauf, dass Bortezomib

nicht nur die Produktion von Autoantikörpern verhindert, sondern auch eine

Verminderung nicht autoreaktiver Plasmazellen bewirkt, wie vom Wirkmechanismus zu

erwarten war. Die Konzentration der Impfantikörper blieb während der gesamten

Therapie im protektiven Bereich.

Anhand des Krankheitsaktivitätsindexes SLEDAI zeigte sich bei allen Patientinnen

bereits drei Monate nach Therapiebeginn eine deutlich verminderte Krankheitsaktivität.

Die SLEDAI-Gesamtpunktzahl, korrelierend mit der Krankheitsaktivität, war bei allen

Patientinnen im Verlauf rückläufig.

Während der Behandlung mit Bortezomib traten außer Fieber, Kopfschmerz, Übelkeit

und Durchfall innerhalb eines Tages nach der Injektion keine nennenswerten

Nebenwirkungen auf.

Damit könnte Bortezomib in Zukunft einen neuen Therapieansatz für die Behandlung

des therapierefraktären systemischen Lupus erythematodes darstellen.

47

5. Diskussion

Trotz der Entwicklung und Erforschung zahlreicher Therapieverfahren in den letzten

Jahren, kann der systemische Lupus erythematodes in vielen Fällen immer noch nicht

ausreichend behandelt werden. Vor allem die Beteiligung der Nieren in Form einer

Glomerulonephritis stellt eine häufige und schwerwiegende Komplikation dar

(Kashgarian, 2002, S.1061), die bis zur dialysepflichtigen Niereninsuffizienz führen

kann. Da mit den bisher üblichen Therapieverfahren eine Heilung des SLE bislang

nicht möglich ist und zudem häufig schwere Nebenwirkungen den Einsatz wirksamer

Medikamente limitieren, ist es erforderlich nach effizienteren und

nebenwirkungsärmeren Alternativen zu suchen.

Die wohl größte Rolle in der Pathogenese des SLE spielt die Produktion von

Autoantikörpern. Eine gestörte zentrale Toleranz in Thymus und Knochenmark kann

dazu führen, dass zirkulierende CD4+ T-Helferzellen durch die Erkennung

körpereigener Antigene, die über MHC-II-Moleküle der dendritischen Zellen präsentiert

werden, aktiviert werden (Böcker et al., 2004, S. 1116). Die aktivierten T-Helferzellen

interagieren mit B-Zellen, die durch Wachstumsfaktoren bzw.

Zelloberflächenrezeptoren ebenfalls aktiviert werden. Im Verlauf differenzieren diese B-

Zellen zu Plasmazellen, die autoreaktive Antikörper produzieren (Hof et al., 2009,

S.105). Durch überschießende Immunkomplexbildung kann der Abbau durch

Phagozyten nicht kompensiert werden, sodass die Ablagerung der Immunkomplexe im

Gewebe zahlreicher Organen begünstigt wird (Hof et al., 2009, S. 140; Gaipl, 2003).

Weitere pathogene Mechanismen, die häufig diskutiert werden, sind wahrscheinlich

eine fehlregulierte oder gesteigerte Apoptose (Hieronymus, 2000) und eine gestörte

Phagozytose toter Zellen (Herrmann et al., 1998). Antigenes Zellmaterial das dem

programmierten Zelltod zugeführt wurde, wird anschließend über MHC-I-Moleküle

präsentiert und so dem Immunsystem zugänglich gemacht. Handelt es sich dabei um

autologe Antigene, z.B. um Bestandteile von apoptotischem Zellkernmaterial, ist eine

Immunreaktion die Folge, in deren Verlauf es zu einer Antikörperproduktion durch

Plasmazellen gegen körpereigene Antigene kommt (Hahn, 2002, S.90-91; Böcker et

al., 2004, S. 1118).

Die Induktion und Suppression der Apoptose und damit die Menge an antigenem

Zellmaterial wird unter anderem durch das 26S-Proteasom, einen Proteinkomplex im

Inneren von eukaryotischen Zellen, reguliert (Naujokat et al., 2002; Lecker et al., 2006).

Da das Proteasom auch die Aktivierung von Wachstumsfaktoren kontrolliert, spielt es

zudem eine wichtige Rolle in der Entstehung maligner Zellen (Naujokat et al., 2002).

48

Durch den Proteasominhibitor Bortezomib konnte bei Patienten mit multiplem Myelom

die Proliferation maligner Zellen reduziert werden, wobei die Antikörper-

produzierenden Myelomzellen durch ihre extrem hohe Proteinbiosynthese sehr

empfindlich gegenüber Proteasominhibition werden (Simons et al., 2006; Meister, Voll,

2007). Das gab Anlass zu der Annahme, dass auch nicht maligne Zellen mit einer

hohen Proteinsyntheserate, wie zum Beispiel nicht maligne antikörperproduzierende

Plasmazellen, einen Angriffspunkt für Bortezomib darstellen könnten (Meister, Voll,

2007). Wie in Lupus-Mausmodellen gezeigt wurde, führte die Proteasominhibition zu

einer Eliminierung von Plasmazellen, einschließlich der langlebigen und damit zu einer

Reduktion lupusspezifischer Symptome in Mäusen (Neubert et al., 2008).

In dieser Arbeit wurden die Ergebnisse von individuellen Heilversuchen an fünf

Patientinnen mit therapierefraktärem systemischen Lupus erythematodes ausgewertet.

Hierbei zeigte sich, dass Bortezomib auch beim Menschen zu einer deutlichen

Verbesserung SLE-assoziierter Manifestationen führen kann.

5.1 Einfluss von Bortezomib auf die Antikörperproduktion durch Elimination von

Plasmazellen

Neubert et al. konnten in Versuchen mit NZB/W F1-Mäusen zeigen, dass Bortezomib

erfolgreich zu einer Elimination von autoreaktiven Plasmazellen und dadurch zu einer

Reduktion lupusrelevanter Autoantikörper führt.

In malignen Plasmazellen bei Patienten mit multiplem Myelom induziert Bortezomib

durch Inhibition des Proteasoms die terminale UPR (unfolded protein response), durch

die letztendlich die Apoptose der Zelle eingeleitet wird (Meister, Voll, 2007). Die UPR

ist ein Signaltransduktionsweg im Inneren der Zelle, bei dem ungefaltete oder falsch

gefaltete Proteine, die in Stresssituationen vermehrt anfallen, abgebaut werden und so

das Überleben der Zelle ermöglicht wird (Walter, Ron, 2011). Je höher die

Syntheserate der Zelle ist, desto höher ist auch der Anteil falsch gefalteter Proteine, die

zum ER-Stress führen. Zellen mit einer hohen Proteinsyntheserate sind daher auf die

UPR angewiesen, damit die Homöostase der Zelle aufrechterhalten wird (Meister, Voll,

2007; Walter, Ron, 2011). Eine lange andauernde übermäßige Aktivierung der UPR

durch anhaltenden extremen ER-Stress hat den Tod der Zelle durch Apoptose zur

Folge (Walter, Ron, 2011; Elkon, 2002, S.146).

Im SLE-Mausmodell wurde gezeigt, dass Bortezomib die sogenannte terminale UPR

aktiviert und so zur Apoptose von Plasmazellen führt, die ebenso wie die Zellen des

multiplen Myeloms eine hohe Proteinsyntheserate haben (Neubert et al., 2008). Bereits

49

48 Stunden nach der ersten Injektion war bei den Mäusen eine deutliche Abnahme der

Autoantikörper-Titer gegen dsDNA zu verzeichnen. Zudem bewirkte Bortezomib

zusätzlich zu der Zerstörung kurzlebiger Plasmazellen auch eine Elimination der

langlebigen Plasmazellen, die für die anhaltende Antikörperproduktion, das humorale

Gedächtnis, entscheidend sind. Eine Kontrollgruppe, die mit Cyclophosphamid und

Dexamethason behandelt wurde, zeigte keine Reduktion der langlebigen Plasmazellen

(Neubert et al., 2008).

In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Behandlung mit Bortezomib bei

Patientinnen mit therapierefraktärem systemischen Lupus erythematodes zu einem

Rückgang der Autoantikörperproduktion führt und damit eine mögliche neue

Therapieoption darstellen könnte.

Bei allen fünf Patientinnen fielen die Antikörper gegen dsDNA im Serum bereits nach

der ersten Injektion mit Bortezomib ab. Wie im Mausmodell konnte auch hier gezeigt

werden, dass bereits nach wenigen Tagen ein deutlicher Effekt von Bortezomib

erkennbar ist. Während im Serum aller NZB/W-Mäuse nach acht Wochen keine Anti-

dsDNA-Antikörper mehr nachweisbar waren (Neubert et al., 2008), erreichten wir

zumindest bei einer Patientin nach dem zweiten Zyklus Werte im physiologischen

Bereich. Insgesamt lagen die Autoantikörper-Titer aller Patientinnen am Ende deutlich

unter den Werten vor der Behandlung mit Bortezomib.

Im Mausmodell zeigte sich, dass die IgG-Gesamtkonzentration nur auf etwa die Hälfte

reduziert werden konnte, was teilweise mit einer Regeneration von Plasmazellen

innerhalb der Pause von drei bis vier Tagen zwischen den Injektionen

zusammenhängen dürfte (Neubert et al., 2008). Vor allem die mucosaassoziierten

lymphatischen Gewebe, z.B. im Darm sind wahrscheinlich dafür verantwortlich, dass

Plasmazellen schnell wieder regeneriert werden. Der erneute Anstieg der Anti-dsDNA-

Antikörper im Serum von Patientin 3 ca. drei Wochen nach dem zweiten Zyklus mit

Bortezomib sowie die zwischen den Zyklen aufgetretenen Schwankungen in der Anti-

dsDNA-Antikörper-Konzentration bei Patientin 4 und 5, könnten ebenfalls auf eine

Regeneration von Plasmazellen im Zeitraum zwischen den Injektionen zurückzuführen

sein. Zudem wird ein Wiederanstieg bzw. eine unvollständige Elimination von Anti-

dsDNA-Antikörpern auf eine Resistenz der Marginalzonen-B-Zellen in der Milz

diskutiert, die jedoch bisher nur für die Maus gezeigt ist (Lang et al., 2010). Wie gezeigt

werden konnte, führt die Behandlung mit Bortezomib in Lupus-Mäusen zu einer

Proteasominhibition und Depletion von Plasmazellen im Rahmen der T-zellabhängigen

Immunantwort. Die Marginalzonen-B-Zellen, die jedoch T-zellunabhängig Antikörper

produzieren, werden durch Bortezomib nicht eliminiert. Ein möglicher Grund dafür

50

dürfte sein, dass in Marginalzonen-B-Zellen die proapoptotische terminale UPR durch

Proteasominhibition nicht aktiviert wird (Lang et al., 2010).

Die Antikörper gegen extrahierbare nukleäre Antigene (ENA) bei Patientin 1-3 zeigten

insgesamt nur eine geringe Veränderung unter der Therapie mit Bortezomib. Vier

Wochen nach der ersten Injektion fand sich bei allen drei Patientinnen zunächst eine

Abnahme der Konzentration, die jedoch nicht konsequent bis zwölf Wochen nach der

ersten Injektion zu verfolgen war. Während Antikörper gegen dsDNA unmittelbar mit

der Krankheitsaktivität korrelieren, werden Antikörper gegen ENA mit der möglichen

Entwicklung bestimmter Manifestationen des SLE in Verbindung gebracht (Craft, 2002,

S. 488). Die ENA dürften im Gegensatz zu den dsDNA-Antikörpern ganz überwiegend

von sehr resistenten langlebigen Plasmazellen sezerniert werden. Die beim Menschen

verwendeten Bortezomibkonzentrationen genügen offenbar nicht, um den Großteil der

langlebigen Plasmazellen zu eliminieren. Zudem gibt es verschiedene Hinweise, dass

sich auch die Gedächtnis-Plasmazellen hinsichtlich Apoptoseresistentz unterscheiden,

wobei die Ursachen hierfür noch unklar sind.

Da Bortezomib in den Versuchen mit NZB/W-Mäusen nachweislich nicht nur zu einer

Elimination autoreaktiver Plasmazellen führte, sondern auch zu einer Verminderung

nicht autoreaktiver IgG-Antikörper (Neubert et al., 2008), war davon auszugehen, dass

auch die Konzentration der protektiven Impfantikörper im Serum der Patientinnen

während der Behandlung mit Bortezomib abnimmt. Der Verlauf der Antikörpertiter

gegen Tetanus-Toxoid und Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen zeigte deutlich den

Einfluss der Proteasominhibition auf diese Anti-Tetanus-Toxoid- bzw. Anti-HBs-

Antigen-spezifischen Plasmazellen (siehe Abb. 4.5). Folglich könnte unter der Therapie

mit dem Proteasominhibitor der Impfschutz durchaus bestehen bleiben, was eine

generelle Auffrischimpfung nach der Therapie nicht zwingend notwendig machen

dürfte. Allerdings sollten die Titer entweder getestet werden oder sicherheitshalber

Auffrischimpfungen erfolgen.

5.2 Effekt von Bortezomib auf den Krankheitsverlauf bei aktiver Nephritis

Eine schwere und potentiell lebensbedrohliche Manifestation des systemischen Lupus

erythematodes ist die Beteiligung der Nieren, in Form einer Glomerulonephritis. Etwa

50-80% der Patienten mit SLE zeigen eine renale Beteiligung (Kashgarian, 2002, S.

1061, S.1070). Die häufigste Form ist die diffus proliferative Glomerulonephritis, WHO

Grad IV, bei der die meisten bzw. häufig auch alle Glomeruli betroffen und

mikroskopisch durch nekrotische und sklerotische Areale gekennzeichnet sind. Durch

51

subendotheliale Immunkomplexablagerungen werden zirkulierende zelluläre oder

humorale Entzündungsmediatoren wie Makrophagen, zytotoxische T-Zellen,

Komplementfaktoren und antikörperproduzierende Plasmazellen aktiviert, die

wiederum proinflammatorische Zytokine aktivieren. Diese erhöhen durch Induktion von

Entzündungsreaktionen die Permeabilität der Basalmembran, wodurch z.B. höher

molekulare Proteine die Basalmembran passieren können und über den Urin

ausgeschieden werden (Kashgarian, 2002, S. 1065). Anti-dsDNA-Immunkomplexe

können direkt an die glomeruläre Basalmembran binden und so Schäden verursachen

(Ehrenstein et al., 1995). Durch Immunkomplexablagerungen an den Gefäßwänden

kann es zu Vaskulitiden, Thrombenbildungen und schließlich zur Nekrose kommen

(Kashgarian, 2002, S. 1068). Nephrotisches Syndrom und eine verminderte

glomeruläre Filtrationsrate bis hin zur Niereninsuffizienz sind die Folge (Kashgarian, S.

1065).

Bisher konnten gute Erfolge mit Cyclophosphamid erzielt werden (Aringer et al., 2007,

S. 34), jedoch stellen die zum Teil schweren Nebenwirkungen des Zytostatikums, wie

Übelkeit und Erbrechen, hämorrhagische Zystitis, Kanzerogenität und die Gefahr der

vorzeitigen Menopause Probleme dar, die den Einsatz dieses Medikamentes limitieren.

Zudem gelingt es manchmal nicht, die Aktivität der Nephritis ausreichend zu

kontrollieren. Ein Grund dafür dürften die extrem therapieresistenten langlebigen

Plasmazellen sein, die in größeren Zahlen im Nierengewebe von NZB/W F1 Mäusen

(Starke et al., 2011) und auch in den Nieren von SLE-Patienten (Espeli M. et al., 2011)

gefunden wurden. In histologischen Präparaten aus Nieren der SLE-Mäuse war der

Anteil der Plasmazellen, die Anti-dsDNA-Antikörper produzieren, höher als im

Knochenmark oder in der Milz. Zudem war der Anteil an langlebigen Plasmazellen

weitaus höher als der der kurzlebigen Plasmazellen (Starke et al., 2011).

Wie gezeigt werden konnte, reduziert eine Behandlung mit Bortezomib die Produktion

von Anti-dsDNA-Antikörpern durch Elimination von Plasmazellen sowohl in SLE-

Mäusen (Neubert et al., 2008) als auch bei unseren Patientinnen und bietet damit

möglicherweise eine Chance, auch langlebige Plasmazellen im nephritischen Gewebe,

zumindest teilweise, anzugreifen.

Wie histologische Untersuchungen zeigten, verhinderte Bortezomib erfolgreich die

Ablagerung von Immunkomplexen im Nierengewebe von NZB/W F1 Mäusen, wodurch

die Nephritis-bedingte Proteinurie abnahm. Während die Mäuse der Kontrollgruppe, die

Placebo erhielten, nach wenigen Wochen starben, kam es bei Mäusen, die mit

Bortezomib behandelt wurden, zu einer kompletten Remission der Lupusnephritis

(Neubert et al., 2008). Da durch die Proteasominhibition bei unseren Patientinnen die

Konzentration der Anti-dsDNA-Antikörper und damit sehr wahrscheinlich auch die Zahl

52

der zirkulierenden Immunkomplexe abnahmen, war davon auszugehen, dass im

Verlauf auch die Menge der Proteinausscheidung im Urin abnehmen würde. Bereits

nach der ersten Injektion zeigte sich ein deutlicher Effekt durch den Proteasominhibitor.

Wie schon im Mausmodell (Neubert et al., 2008) korrelierte auch bei unseren

Patientinnen die Hemmung der Antikörperproduktion mit einer klinischen Besserung

der Nephritis. Patientin 2 zeigte sechs Monate nach Therapiebeginn sogar eine

Proteinausscheidung im physiologischen Bereich. Inwieweit ein weiterer off-lable-

Versuch mit Tacrolimus zwei Monate nach der letzten Bortezomib-Injektion in diesem

Fall einen weiteren Rückgang der Proteinurie bis in den physiologischen Bereich

beeinflusste, ist nicht ganz klar. Bei diesem Medikament handelt es sich um einen

Immunmodulator der im Rahmen der Organtransplantation zur Prävention und

Therapie von Abstoßungsreaktionen verwendet wird. 1997 wurden erstmals zwei

Patientinnen mit therapierefraktärem SLE erfolgreich mit Tacrolimus behandelt

(Duddridge, Powell, 1997). Bei Kindern mit Lupusnephritis konnte eine Verminderung

der Proteinausscheidung erreicht werden (Yoon, 2010). Da Tacrolimus jedoch die B-

Zell-Aktivität und damit die Antikörperproduktion nur indirekt über die Modulation von T-

Zellen und Zytokinen beeinflusst (Yoon, 2010), könnte Bortezomib im Vergleich durch

die Eliminierung von langlebigen Plasmazellen und durch die schnelle Verminderung

der Autoantikörperkonzentration möglicherweise eine effektivere

Behandlungsmöglichkeit darstellen. Ob Tacrolimus unter Umständen zur

Erhaltungstherapie nach einer Behandlung mit Bortezomib geeignet ist, sollte in

klinischen Studien geprüft werden.

Mit einer erhöhten Aktivität der Lupusnephritis werden erniedrigte Konzentrationen der

Komplementfaktoren C3 und C4 in Zusammenhang gebracht (Wallace, 2002, S. 1085).

Dabei handelt es sich um Proteine, die der humoralen Immunabwehr des Körpers

angehören und durch Aktivierung zu einer Opsonierung von Antigen-

Antikörperkomplexen bzw. zur Membranperforation von Pathogenen führen.

Desweiteren wird diskutiert, dass die Komplementfaktoren direkt an nekrotische Zellen

und deren Kerne binden, die durch eine unzureichende Clearance von apoptotischen

Zellen bei Patienten mit SLE entstehen (Munoz et al., 2005). Die Höhe der C3-

Konzentration korreliert mit der histologisch gesicherten Aktivität der

Glomerulonephritis, während eine länger anhaltende Konzentration innerhalb des

Referenzbereichs mit einer besseren Prognose assoziiert wird (Wallace, 2002, S.

1085).

Dementsprechend sollte die C3- und C4-Konzentration auch mit dem Verlauf der Anti-

dsDNA-Antikörper bzw. zirkulierenden Immunkomplexen korrelieren. Ein Abfall der

53

Antikörper sollte demnach mit einem Anstieg der Komplementfaktoren im Serum

assoziiert sein.

Wie in den Heilversuchen mit Bortezomib gezeigt werden konnte, stieg die

Konzentration der beiden Komplementfaktoren im Serum von Patientin 2, 4 und 5 an,

während korrespondierend dazu die Konzentration der Anti-dsDNA-Antikörper relativ

zeitgleich sank. Patientin 4 und 5 zeigten vor allem wenige Tage nach der Injektion

einen geringeren Komplementverbrauch an, was möglicherweise durch die akute

Wirkung von Bortezomib auf die autoantikörperproduzierenden Plasmazellen und die

damit akute Verminderung der zirkulierenden Immunkomplexe erklärbar ist. Bei

Patientin 1 stieg nur das C4-Komplement korrespondierend zu einem Abfall der Anti-

dsDNA-Antikörper an, während C3 nach den beiden Bortezomib-Zyklen noch weiter

abfiel. Der Anstieg von ungebundenem C4 im Serum wird mit einer verminderten Zahl

an zirkulierenden Immunkomplexen in Zusammenhang gebracht (Hallbach, 2006, S.

103). Die Erniedrigung von C3 unter der Therapie, könnte eine Erklärung dafür sein,

dass der starke Komplementverbrauch nicht nur sekundär durch die

Komplementbindung an Immunkomplexe bzw. an nekrotische Zellen und deren Kerne

bedingt ist (Munoz et al., 2005), sondern dass es möglicherweise auch zu einer

primären Komplementerniedrigung im Rahmen des SLE kommt, deren Ursache jedoch

bislang nicht geklärt ist (Schur, 2002, S. 245, 252).

5.3 Proteasominhibition als zukünftige Therapieoption bei refraktärem SLE?

Noch immer stellt die Behandlung des systemischen Lupus erythematodes eine große

Herausforderung dar. Mit zahlreichen Therapieverfahren konnten ein Rückgang der

Autoantikörperproduktion und eine Verbesserung lebensbedrohlicher Symptome, wie

Nephritis oder ZNS-Vaskulitis erreicht werden. Doch häufig limitieren schwere

Nebenwirkungen den Einsatz dieser Medikamente.

Mit dem Proteasominhibitor Bortezomib gelang Neubert et al. im Mausmodell die

effiziente Elimination langlebiger Plasmazellen, die gegenüber den gängigen

Therapieverfahren resistent blieben. Mäuse mit aktiver Glomerulonephritis zeigten

nach der Behandlung mit Bortezomib eine renale Proteinausscheidung im

physiologischen Bereich (Neubert et al., 2008).

In individuellen Heilversuchen an fünf Patientinnen mit therapierefraktärem SLE konnte

erstmals gezeigt werden, dass Bortezomib auch beim Menschen zu einer deutlichen

Verbesserung lupusspezifischer Laborparameter und klinischer Symptome führt.

54

Während der Behandlung mit Bortezomib traten außer Fieber, Kopfschmerz, Übelkeit

und Durchfall innerhalb eines Tages nach der Injektion keine ernsten Nebenwirkungen

auf. Bei einer Patientin (Patientin 5) traten während der gesamten Dauer der

Behandlung keine Nebenwirkungen auf. Die aus der Myelomtherapie bekannte

reversible periphere, vor allem sensorische Neuropathie trat bei unseren Patientinnen

nicht auf. Da diese unerwünschte Wirkung des Proteasominhibitors bei

Myelompatienten dosisabhängig unter Dauertherapie auftrat (Rajappa, 2010), ist bei

einem möglichen Einsatz von Bortezomib als langfristige Therapie bei SLE darauf zu

achten, dass regelmäßig neurologische Untersuchungen durchgeführt werden.

Keine der Patientinnen zeigte Blutbildveränderungen während der Behandlung. Damit

ließ sich auch in der Anwendung am Menschen die gute Verträglichkeit des

Proteasominhibitors im Vergleich zu anderen Medikamenten darstellen. Zum Beispiel

führte Cyclophosphamid im Mausmodell zu einer starken Reduktion von Granulozyten,

Lymphozyten und Marginalzonen-B-Zellen, die sich nur sehr langsam wieder erholten

(Lang et al., 2010). In NZB/W F1 Mäusen, die mit Bortezomib behandelt wurden,

blieben diese Zellen jedoch weitgehend unverändert (Neubert et al., 2008).

Insbesondere die Marginalzonen-B-Zellen der Milz konnten durch Bortezomib nicht

eliminiert werden, wodurch die Antikörperproduktion für die unmittelbare Immunantwort

auf Bakterien, die über das Blut im Körper verteilt werden, erhalten bleiben dürfte

(Lang et al., 2010). Dadurch könnte die Gefahr schwerer Infektionen, die bei

Zytostatika und Immunsuppressiva besteht, unter der Behandlung mit Bortezomib

relativ gering sein.

Neubert et al. konnten im Mausmodell zeigen, dass durch eine komplette Remission

der Lupusnephritis die Lebenserwartung der NZB/W F1 Mäuse deutlich erhöht war.

Zudem war eine präventive Behandlung mit Bortezomib, bevor lupusspezifische

Symptome auftraten, mit einem verlängerten Überleben der Mäuse verbunden.

Inwiefern Bortezomib zu einer erhöhten Lebenserwartung, insbesondere durch den

präventiven Einsatz vor der Manifestation schwerer Symptome, wie Glomerulonephritis

oder ZNS-Beteiligung, im Menschen beiträgt, sollte in kontrollierten klinischen Studien

untersucht werden.

In einer anderen Publikation konnte in Zellkulturen des multiplen Myeloms gezeigt

werden, dass Bortezomib zusammen mit dem Calciumkanalblocker Verapamil zu einer

effizienteren Induktion des Zelltodes führt (Meister et al., 2010). Verapamil verhindert

den Einstrom von Calcium ins Zellinnere, wodurch die Induktion des sog. MDR1-Gens

verhindert wird. Dieses Gen kodiert für den multidrug-resistance-Transporter, der

bestimmte Medikamente aus Zellen wieder hinausschleust und so zu einer

Resistenzentwicklung der Zelle beiträgt (Meister et al., 2010). Indem Verapamil

55

zusätzlich die Expression proapoptotischer Faktoren verbessert, unterstützt dieses

Medikament die Wirkung von Bortezomib auf die Induktion der Apoptose durch

Aktivierung der UPR (Meister et al., 2010). Aus diesem Grund kann angenommen

werden, dass Verapamil zusätzlich zu Bortezomib auch in der Behandlung des

therapierefraktären SLE einen positiven Effekt zeigen könnte. Da der Abbau von

Verapamil durch die Leber erfolgt, ist der Einsatz bei Niereninsuffizienz nicht

kontraindiziert (Karow, Lang-Roth, 2011, S.123-124). Folglich könnte dieser

Calciumkanalantagonist auch bei Patienten mit aktiver Lupusnephritis in Kombination

mit Bortezomib eingesetzt werden. Allerdings dürften die benötigten Verapamil-

Konzentrationen im obersten tolerierbaren Dosisbereich liegen und somit auch

erhebliche Nebenwirkungen verursachen.

Kontrollierte klinische Studien sollten zukünftig prüfen, in welcher Dosierung mit

Bortezomib der bestmögliche Therapieeffekt bei einer möglichst geringen

Nebenwirkungsrate erzielt werden kann. Unter der Dosierung von 1,3 mg/m2

Körperoberfläche konnte in unseren Heilversuchen bereits eine deutliche

Verminderung der Krankheitsaktivität erreicht werden. Möglicherweise könnte eine

Langzeittherapie den erneuten Anstieg der Anti-dsDNA-Antikörper verhindern.

Desweiteren könnte z.B. durch Analyse der Plasmazellzahl im Knochenmark während

der Therapie untersucht werden, wie effizient diese durch Bortezomib beim Menschen

eliminiert werden bzw. wie schnell sich die Plasmazellen innerhalb der Therapiepausen

regenerieren.

Wie in dieser Arbeit gezeigt wird, führt eine Behandlung mit dem Proteasominhibitor

Bortezomib bei Patienten mit therapierefraktärem SLE zu einer Abnahme der

Antikörperkonzentrationen sowie zu einem Rückgang der Glomerulonephritis. Bei einer

Patientin lag der Anti-dsDNA-Antikörper-Titer nach dem zweiten Zyklus im

physiologischen Bereich. Eine weitere Patientin zeigte sechs Monate nach

Therapiebeginn keine klinisch relevante Proteinurie mehr, was auf eine Remission der

Glomerulonephritis hindeutet. Klinische Symptome wie Arthritis, Erythem oder Alopezie

waren ebenfalls nicht mehr nachweisbar. Zudem konnte gezeigt werden, dass eine

Behandlung mit Bortezomib, im Gegensatz zu den bisher eingesetzten Medikamenten,

deren erhebliche unerwünschte Wirkungen häufig zum Therapieabbruch führen, nur

mit relativ geringen Nebenwirkungen verbunden ist.

Damit könnte der Einsatz von Proteasominhibitoren zukünftig einen entscheidenden

Fortschritt in der Behandlung des therapierefraktären systemischen Lupus

erythematodes darstellen.

56

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7. Abkürzungsverzeichnis

Verwendete Abkürzungen

Abkürzung Fachbegriff/Bezeichnung

Abb. Abbildung

ACR American College of Rheumatology

ANA antinukleäre Antikörper

BSA bovine serum albumine

CD cluster of differentiation

CENP-B centromere protein B

DNA Desoxyribonukleinsäure

ds doppelsträngig

EKG Elektrokardiogramm

ELISA enzyme linked immunosorbent assay

ENA extractable nuclear antigens

ER Endoplasmatisches Retikulum

ERAD endoplasmatic reticulum associated degradation

Fc „Fuß“ des Antikörpers, eine der drei Bindungsstellen

HBs-Antigen hepatitis B surface antigen

HLA human leukocyte antigen

HRP horse raddish peroxidase

i.v. intravenös

Ig Immunglobulin

IL Interleukin

IκB inhibitor of kappa B

Jo-1 Histidyl-Transfer-RNA-Synthetase

MDR multidrug resistance

MHC major histocompatibility complex

MMF Mycophenolat-Mofetil

NF-κB nuclear factor kappa B

NZB/W New Zealand Black/White

OD optische Dichte

p.o. per os

PBS phosphate buffered saline

RNP Ribonukleoprotein

Scl-70 DNA-Topoisomerase I

SLE systemischer Lupus erythematodes

66

SLEDAI systemic lupus erythematosus disease activity index

Sm Spliceosom

SS-A/Ro Robert-Antigen

SS-B/La Lane-Antigen

Tab. Tabelle

TLR toll like receptor

TNF Tumornekrosefaktor

Tween 20 Polyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaurat

UPR unfolded proteine response

WHO world health organization

ZNS zentrales Nervensystem

Maßeinheiten

Abkürzung Bezeichnung

°C Grad Celsius

µl Mikroliter (Multiplikationsfaktor: 10-6)

Da Dalton

dl Deziliter (Multiplikationsfaktor: 10-1)

g Gramm

h Stunde(n) (hour)

IE internationale Einheit

kg Kilogramm (Multiplikationsfaktor: 103)

l Liter

m Meter

M molar (mol/l)

m2 Quadratmeter

min Minute(n)

ml Milliliter (Multiplikationsfaktor: 10-3)

mmHg Millimeter Quecksilbersäule (Druck)

nm Nanometer (Multiplikationsfaktor: 10-9)

U Einheit (unit)