programa preliminar - s3-eu-west-1.amazonaws.com · 2 9a edición del curso de biotecnología...

Este Curso es posible gracias a una aportación educacional de

Con el auspicio de:

Acreditación de la Comisión de Formación Continuadadel Ministerio de Sanidad y Consumo (en tramitación).

Entidades colaboradoras

DIRECCIÓN DEL CURSODr. José Luis Motellón y Dr. Juan Bueren

3 al 5 de Noviembre de 2010CIEMAT - AVDA. COMPLUTENSE, 22 – MADRID

PROGRAMA PRELIMINAR

DIRECCIÓN DEL CURSODr. José Luis Motellón y Dr. Juan Bueren

3 al 5 de Noviembre de 2010CIEMAT - AVDA. COMPLUTENSE, 22 – MADRID

PROGRAMA PRELIMINAR

© 2011 Faltan!!!!!

Edita: Edikamed, S.L. Josep Tarradellas, 52 - 08029 Barcelona www.edikamed.com

ISBN: 978-84-7877-658-0

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Índice III

Gene therapy for inmunodeficiency 1

Adrian J TrasherCentre for Immunodeficiency, Molecular Immunology Unit, Londres COMPROBAR!!!!

1. Inmunoterapia humoral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

Manuel Hidalgo

The Johns Hopkins University. Baltimore (MD). Estados Unidos Centro Integral Oncológico Clara Campal. Hospital de Madrid Norte Sanchinarro. Madrid

2. Genómica, proteómica y medicina 15

Fernando Vivanco

Fundación Jiménez Díaz Universidad Complutense. Madrid

3. Impact of pharmacogenetics on drug use in individually optimised pharmacotherapy 30

Arnold G. Vulto PharmD PhD and Monique J. Bijl PharmD PhD

Department of Hospital Pharmacy Erasmus University Medical Centre, P.O. Box 2030, 3000 CA Rotterdam, The Netherlands

4. Biología de las células madre 39

Antonio Bernard

Departamento de Cardiología Regenerativa Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC)

5. Clinical applications of cell therapy 56

José López-Barneo

Instituto de Biomedicina de Sevilla-Ibis Hospital Universitario Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla. Sevilla

6. Avances de la terapia génica en el tratamiento de enfermedades monogénicas 84

Juan A. Bueren

División de Hematopoyesis y Terapia Génica CIEMAT y CIBER de Enfermedades Raras

Índice

9a edición del curso de Biotecnología Aplicada a la Salud HumanaIV

7. Nanomedicina: apliación de la nanotecnología en la salud 98

Laura M. Lechuga

Grupo de Nanobiosensores y Aplicaciones Bioanalíticas Centro de Investigación en Nanociencia y Nanotecnología (CIN2) Consejo Superior de Investigaciones Científicas

8. Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por biotecnología 113

Alfonso Domínguez-Gil Hurlé

Servicio de Farmacia Hospital Universitario de Salamanca

9. Aplicaciones de la biotecnología recombinante vegetal a la terapéutica humana 122

Fernando Ponz

Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (UPM-INIA) Campus de Montegancedo. Pozuelo de Alarcón. Madrid

10. Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la Agencia Europea de Medicamentos (EMA), BWP (Grupo de Biológicos) y CHMP (Comité de Medicamentos de Uso Humano) 129

Sol Ruiz

Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios (AEMPS)

11. Las empresas biotecnológicas y su importancia en la terapia humana 136

José Luis Motellón

AMGEN


At the start of the 1990s, the first clinical trials of gene therapy were attempted for an inheri-ted severe combined immunodeficiency (SCID) caused by deficiency of the intracellular enzyme adenosine deaminase. In the absence of defini-tive treatment, SCID of any molecular type is usually fatal within the first year of life, although patients with ADA deficiency can be supported by administration of exogenous bovine enzyme. Even so, this is often only partially effective, and is extremely expensive. The rationale for the development of gene therapy for SCID the-refore derives from the severity of the illness, the inadequacy of conventional therapy, and the considerable morbidity and mortality associated with stem-cell transplantation, particularly from a mismatched donor. Efficacy in these early stu-dies was limited, but a decade further on, gene transfer technology and cell handling proto-cols had been refined sufficiently to produce real clinical benefit. Four recent studies have demonstrated highly effective gene therapy for the X-linked form of SCID (SCID-X1) and ADA deficiency, using retroviruses to deliver the therapeutic genes into haemopoietic stem cells ex vivo,. Bearing in mind the outcome and ad-verse effects of conventional therapy, these are remarkable results and the first clear indication that gene therapy can offer a cure for some hu-man diseases. In a few patients the treatment has failed, indicating that there is more to learn about the effective dose of corrected cells and

the potential for host factors to influence im-mune cell development.

Many different types of vector have been tested in laboratory experiments to deliver therapeutic genes, and their effectiveness is largely determi-ned by the host and tissue type. For stable gene transfer to dividing cells, such as haemopoietic cells, the new genetic material has to be retained through cell division and passed on to daughter cells. Although retroviruses are highly effective for this, their dependence on chromosomal integra-tion brings with it the risk of inadvertent gene activation or inactivation. Having initially achieved successful immunological reconstitution, five pa-tients with SCID-X1 (out of a total of 19 SCID-X1 and seven ADA-deficient patients treated to date) developed T cell lymphoproliferative disease up to after the gene therapy procedure. In four of these patients, the enhancer sequences in the retroviral vector, which are responsible for effective transgene expression, had activated the LMO-2 proto-oncogene. There are likely to be other factors that contributed to cell transfor-mation, but they have not yet been defined. It is therefore unclear whether all patients are at significant risk, or whether this is restricted to a few with SCID-X1.

Fortunately, it is likely that much can be done to improve efficiency and safety of current pro-tocols, and these developments are expected to enter clinical trial quite soon. The design of vectors used for gene delivery is clearly impor-

Gene therapy for inmunodeficiencyAdrian J TrasherCentre for ImmunodefICIenCy, moleCular Immunology unIt, londres COMPROBAR!!!

9a edición del curso de Biotecnología Aplicada a la Salud Humana2

tant, and modifications are possible that limit the risks of mutagenesis, such as incorporation of DNA and RNA insulator sequences in inte-grating vectors; use of self-inactivating vectors in which the powerful viral enhancer sequences are deleted; or targeting of safe regions in the genome. Ultimately, the development of homo-logous recombination or gene repair to accu-rately correct genetic mutations, or the cons-truction of mitotically stable extrachromosomal vectors, would obviate many of these problems, but current technologies are inefficient.

9.000

7.000

5.000

3.000

1.000

10 20 30 40 50 60 70 80months after gene therapy

T Ly

mph

ocyt

es

MoLV R U5 IL2RGQ

SD SA

YMoLV R U5

***

*

*

Lymphocyte recovery CD3 (UK/France, 19 patients).

SCID/CID

γc, IL7Ra, JAK3, ZAP-70RAG1/2, artemis, ligase IV, CernunnosADA, PNPMHC I/II, CD3δ/ε/ζ, CD45, ORAI1, STIM1, Coronin 1a

HSC-multi

Chromosome 11p13

100

10

1

0,1

Fold

diff

eren

ce

C11orf41 CD59 FBXO3 LMO2 CAPRIN1 NAT10 ABTB2

33,65 Mb

Forward Strand

33,85 Mb 34,05 Mb

Virusintegration

LTR-LTR

LTR-LTR

1 2 3 4 5 6

Relative to:

Leukaemia panel

DP1 T cells

DP2 T cells


HincII (2.635)

SalI (2.633)

WPRE

HincII (3.275)SalI (3.273)

3’ LTR SFFV

KpnI (3.838)

ORI

AP

KpnI (523)

5’ LTR PCMV

EcoRI (1.522)

Ncol (1.533)

Banhll (159)

Indication

No MSD/MUD

Failure of PEG-ADA

Protocol

D-60 BM harvest (save)

D-30 Stop PEG-ADA

D-4 BM harvest

D-2 MElphalan 140 mg/m2

D0 Infuse cells

Phase 1/2 Study: CD34+ cell gene therapy for ADA-deficient SCID incorporating melphalan conditio-ning (D-2).

Accumulation of genetic lesions...

100

10

1

0,1Fold

diff

eren

ce in

exp

ress

ion Relative to:

Leukaemia panel

DP1

DP2

IL2RG LMO2 CDKN2A NOTCH1 HES1 MYC RBPJ/CSL

TCRb to STIL-TAL-1 translocation

CDKN2A (p16INK4A/p21ARF1)

Leukemia

AB

AA/BB

AB

AA/BB

HMM

HMM

Constitutive DNA

0 50 9 Mb 100CDKN2A

Pre-treatment d0 d539 d717 Control

Amino acid changeR1599P in the HD-N domain

G to CCGC to CCC

T C G G GC C C C T T GCA


Lymphocyte recovery...

Centre N.o patients F/U Off enzyme Survival DFS

Milan 10+ 1,8-8,0 8/10 100% 80%

London 6 0,5-5,5 3/6 100% 50%

CHLA 5 0,75-4 3/5 100% 60%

Total 21 0,5-8,0 14/21 100% 67%

Summary of patients –Milan/London/CHLA/NIH...

Thoughts...

Haematopoietic gene therapy represents a highly effective treatment for SCID-X1 and ADA-deficient SCID, and is promising for other haematological, immunological and metabolic disorders (CGD,WAS, ALD)

Insertional mutagenesis is a finite risk but relatively simple modifications to design may have significant impact on safety

Are vectors as good as we think at expressing transgene ?

2.500

2.000

1.500

1.000

500

0-20 0 20 40 60 80 100 120

CD16/56

CD19CD8

CD4

CD3

ALC

Lym

phoc

ytes

per

ul

GRANs 13%, MONOs 6%, B 34%, T 48%, NK 34%RBC ada 52 (40-100 nmol/mgHb/h)dATP low

Weeks

CD3

ALC

Max on PEG-ADA


R U5 IL2RGSD

EF1s R U5PRE

No HLA identical donor

GTAC 146EUDRACT Number: 2007-004308-11

MHRA approved 2009

p = 0,01

p = 0,03

MO

CK

RRLP

PT.W

ASP.W

AS.pr

e

RRL.P

PT-e

GFP

RRL.P

PT.VA

V.cG

REEN

RRL.P

PT.SF

.eGFP

RRL.P

PT.SF

.eGFP

.pre

SRS.S

F.eG

FP.pr

e

SF91

.eGFP

.pre

0,1

0,01

0,001

0,00001

neg.

repl

atin

g fre

quen

cy/c

opy

num

ber

0,0001

Reduced mutagenesis with SIN configuration and non-LTR promoters...

Limiting dilution assay

Day 1

Lin. neg.BM cells

Expansion

2 days

Days 4 & 5

Expansion

2 weeks

Expansion

DNA

RNA

Phenotype

Step 1 Step 2

R U5 IL2RGSD

EF1s R U5PRE

Retroviral vector insertion site

RU5IL2RGSD

EF1sRU5 PRE

E 1

E 1

E 2

pA LTRGFP

pA LTRGFP

4,8 kb

3,1 kb

DD

B

E 1

Phase I/II clinical trial of haematopoietic stem celll gene therapy for SCID-X1.


Lentiviral IL2RG SIN vectors...

R U5 IL2RGSD

R U5PRERSVSA

VAV

?Te

R U5 IL2RGSD

R U5PRERSVSA

UCOE

TepA

R U5 IL2RGSD

R U5PRERSVSA

EFs.RRE

GC prom

IL2RG genomic

Ubiquitous chromatin opening element (A2UCOE)...

R U5 eGFPSD

R U5PRERSVSA

UCOE

CpG island

CBX3 HNRPA2B1

2.2 A2UCOE

B T

1 kb

10 kb

NFE2L3HNRPA2B1CBX3


Next generation vectors...

R U5 IL2RGSD

R U5PREUCOE

Restricted enhancer activity

R U5 IL2RGSD

R U5PRESA

UCOE

pA TeIns

RSV

R U5 IL2RGSD

R U5PRESA

UCOERSV

?Te

GlycosylationRespiratory

burst VacuoleActive

NADPHoxidase

2O22O2-

p21phox

gp91phox

P2e–

PP

CitoplasmInactiveNAPDHoxidase

SH3domains

Flavocytochrome b

NADPH p47phox

p67phox

p40phox

GDI

GDP

GTP

GDP

GDP

GDP-GTPexchange GTP

hidrolysis

DeactivatedNADPH oxidase

NADPH+ + H+

p21rac andGDI dissociate

p21rac andGDI reassociate


Enhanced homologous recombination...

Zinc-finger domainsNuclease domains

Mutant sequence

Double-stranted break

Homologus recombinatio

Wild-type template

Corrected sequence

A

B

C

D

Urnov et al, 2005.Lombardo et al., 2007.Redondo et al., 2008.

Grizot et al., 2009

Next generation vectors...?

R U5 IL2RGSD

R U5PREUCOE

R U5 IL2RGSD

R U5PRESA

UCOE

pA Te Ins

R U5 IL2RGSD

R U5PRESA

UCOE

Restricted expression or endogenous promoter/enhacer activity in myeloid cells

Ins

MSP

Chim

MiRNA targets

Inmunoterapia humoral 9

ResumenEl uso de anticuerpos monoclonales es ac-

tualmente una modalidad terapéutica de enor-me importancia en el tratamiento de pacientes con enfermedades neoplásicas. Los anticuerpos se han utilizado como agentes únicos o conju-gados con agentes radioactivos o como vehícu-los de fármacos y toxinas. Actualmente existen anticuerpos frente a receptores de factores de crecimiento, factores de crecimiento per se y otras dianas celulares, como antígenos de mem-brana. Estos fármacos han demostrado actividad clínica en pacientes con tumores de mama, co-lon, pulmón, linfomas y leucemias. Las áreas de investigación y desarrollo incluyen la generación de agentes con mejores propiedades farmaco-lógicas y menos tóxicos.

IntroducciónEl desarrollo de anticuerpos con fines te-

rapéuticos ha crecido de forma importante en la última década. Inicialmente se utilizaron anticuerpos de origen murino, aunque estas moléculas tienen el inconveniente de que ge-neran una respuesta inmunitaria a ellos. Los anticuerpos murinos se pueden transformar en moléculas «humanizadas», de forma que no son reconocidos por el sistema inmunitario. Los

anticuerpos humanos (o «humanizados») se caracterizan también por una vida media más prolongada. Recientemente se han desarrolla-do estructuras con capacidad para reconocer múltiples antígenos, con distintos tamaños y propiedades. Junto a la creciente identificación de dianas terapéuticas, el empleo de anticuer-pos, tanto «desnudos» como conjugados con toxinas, fármacos y compuestos radioactivos, ha aumentado notablemente. Los anticuerpos uti-lizados con mayor frecuencia en el tratamiento contra el cáncer son las inmunoglobulinas G (IgG). Los avances en genética humana y mo-lecular han permitido la síntesis de fragmentos de IgG. Estos anticuerpos modificados se ca-racterizan por tener distinta afinidad antigénica, un número variable de sitios de unión al an-tígeno y distintas propiedades farmacológicas. Las más utilizadas son los fragmentos variables de cadena única (scFV), que están compuestos por cadenas variables pesadas y ligeras unidas por un péptido. Estas moléculas tienen un peso molecular de ≈ 25 kDa y son eficaces como vehículos de radionucleótidos. También se han desa-rrollado estructuras de mayor enverga-dura, como los llamados diabodis y minibodis; el menor peso molecular de estas estructuras facilita su eliminación renal y su especificidad en la localización tumoral, a la vez que mues-tran menor toxicidad que la asociada a las IgG completas.

1 Inmunoterapia humoralManuel Hidalgothe Johns hopkIns unIversIty. BaltImore (md). estados unIdos

Centro Integral Oncológico Clara Campal. Hospital de Madrid Norte Sanchinarro. Madrid


Mecanismos de acción de los anticuerpos monoclonales como agentes terapéuticos

Los anticuerpos monoclonales ejercen sus actividades de forma muy diversa y variada en función de las dianas afectadas. Los anticuerpos dirigidos contra receptores de factores de cre-cimiento, como el del factor de crecimiento epi-dérmico (EGFR), impiden la unión de ligandos con sus receptores y, en consecuencia, impiden sus funciones, dando como resultado inhibición de la proliferación celular y apoptosis. Los anti-cuerpos también generan actividad antitumoral por medio de mecanismos inmunológicos, in-duciendo anticuerpos antiidiotipo, citotoxicidad dependiente de células (ADCC) y citotoxicidad mediada por complemento. Como ya se ha mencionado, los anticuerpos también se utilizan como vehículos de otros agentes terapéuticos como fármacos, toxinas y sustancias radioacti-vas. En estos casos, los mecanismos de acción están en función de las moléculas asociadas.

Limitaciones del empleo de anticuerpos terapéuticos

Inicialmente, los anticuerpos terapéuticos ad-ministrados en oncología eran anticuerpos mu-rinos. Una de las limitaciones más importantes de estos fármacos es la generación de HAMA (human antimouse antibodies), problema que re-duce el número de tratamientos que pueden recibir los pacientes. Técnicas más modernas han permitido la generación de anticuerpos qui-méricos, que comparten estructuras humanas y murinas y que presentan menor inmunoge-nicidad. Actualmente es posible la producción

de anticuerpos totalmente humanizados que no generan HAMA. Un segundo problema es la unión del anticuerpo a antígenos circulantes, con la consiguiente reducción en la disponibili-dad del anticuerpo para llegar al tumor. Otras limitaciones a la distribución de los anticuerpos en el tejido tumoral son las alteraciones en la vasculatura de los tejidos, la elevada presión hidrostática y la distribución heterogénea de los antígenos dentro de los tumores. Además, la inmunoterapia humoral está limitada por las dificultades de acceso de las células efectoras a los tejidos tumorales. Finalmente, es bien cono-cido que los tumores secretan sustancias que disminuyen la respuesta inmunitaria.

Anticuerpos terapéuticos

Neoplasia hematológica

CAMPATH-1

Es un anticuerpo monoclonal específico fren-te al antígeno CD52, un glucopéptido que se expresa en linfocitos B y T. Se ha empleado en enfermos con leucemia mieloide crónica (LMC), leucemia promielocitica y linfomas no Hodgkin (LNH), así como para deplecionar la médula de células T en trasplantes alogénicos. El fármaco tiene aproximadamente un 50% de respuesta en pacientes con LMC resistente a fludarabina. También ha demostrado actividad en pacientes con enfermedad no tratada, si bien es menor en los que presentan afectación esplénica y de los ganglios linfáticos. En pacientes con LNH se ha estudiado una versión humanizada del an-ticuerpo: el 20% respondió, aunque de forma transitoria. Los principales efectos secundarios observados fueron anemia, trombocitopenia e infecciones oportunistas.

Rituximab

El rituximab es un anticuerpo monoclonal hu-manizado frente al antígeno CD20. En estudios


fase II, el fármaco mostró un 40-50% de res-puestas positivas en pacientes con recidivas de LNH de bajo grado, con muy buena tolerancia. En algunas ocasiones, el tratamiento con rituxi-mab comportó reacciones a la perfusión carac-terizadas por fiebre, escalofríos, lisis tumoral, pla-quetopenia, broncoespasmo e hipoxemia. Estos síntomas se suelen resolver con tratamiento de soporte y los pacientes pueden continuar el tra-tamiento sin secuelas. En raras ocasiones se han descrito reacciones cutáneas de gran intensidad, algunas incluso fatales. En pacientes con linfo-mas de grado alto e intermedio, las respuestas positivas fueron del 30%, independientemente de la dosis empleada. En combinación con qui-mioterapia CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, prednisona), el índice de respuestas fue superior al 90%, con un 55% de respuestas completas de larga duración; es importante re-saltar que pacientes con translocación del gen blc2 negativizaron dicho marcador en sangre medido por PCR. En ancianos, el tratamiento combinado de quimioterapia con rituximab ha demostrado superioridad frente al tratamien-to con quimioterapia sola. En linfomas de bajo grado, el tratamiento combinado de rituximab y fludarabina dio como resultado un 93% de res-puestas globales, con una duración de más de 14 meses. En el desarrollo clínico del rituximab, una observación importante es que la presencia de células CD20 positivas circulantes puede afectar a la actividad del fármaco, actuando como un santuario en el que se deposita el anticuerpo, por lo que puede necesitar dosis más altas de éste. De hecho, en otros estudios se ha obser-vado una relación entre valores séricos del anti-cuerpo y actividad clínica, de forma que pacien-tes con enfermedad avanzada pueden precisar dosis de anticuerpo más altas. Ocasionalmente, los pacientes desarrollan resistencia a rituximab debido a la proliferación de poblaciones linfoci-tarias sin expresión del antígeno. En estas situa-ciones puede considerarse la combinación de este agente con otros fármacos dirigidos contra las poblaciones linfocitarias emergentes.

Tumores sólidos

Trastuzumab

El Her2/Neu, también llamado ErbB2, es uno de los miembros de la familia del EGFR. Este receptor de membrana se encuentra sobreex-presado, debido a una amplificación genética, en aproximadamente el 30% de pacientes con cán-cer de mama. El trastuzumab (Herceptin®) es una versión humanizada del anticuerpo murino 4D5. El anticuerpo va dirigido frente a epítopos en el dominio extracelular del Her2. En estu-dios de fase II en pacientes con carcinoma de mama avanzado, el tratamiento con este fárma-co mostró un 10-15% de respuestas objetivas y, aproximadamente, 9 y 13 meses de tiempo a la progresión y supervivencia, respectivamente. El fármaco es activo en los tumores que sobre-expresan el Her2, determinado mediante inmu-histoquímica o mediante amplificación genética por FISH. En combinación con quimioterapia, el tratamiento con trastuzumab ha mostrado superioridad frente al tratamiento con quimio-terapia exclusivamente en pacientes con cán-cer de mama avanzado. En un estudio fase III, el tratamiento combinado de trastuzumab con paclitaxel o ciclofosfamida-adriamicina también se demostró superior en respuestas objeti-vas, así como en supervivencia. El tratamiento combinado con antraciclinas produjo casos de disfunción miocárdica, y no se recomienda su utilización. Recientemente se han publicado es-tudios con trastuzumab en combinación con quimioterapia en pacientes con carcinoma de mama operado, demostrando una mejor su-pervivencia libre de enfermedad en pacientes tratadas con este fármaco, por lo que ha me-recido su aprobación para uso clínico. La mejor supervivencia de las pacientes tratadas indica que posiblemente se logre un mayor número de curaciones de la enfermedad.

Cetuximab

El EGFR, o sus ligandos, está sobreexpresa-do en la gran mayoría de tumores sólidos epi-


teliales y es una diana muy interesante para el desarrollo de fármacos antitumorales. Farma-cológicamente, se han desarrollado dos estra-tegias contra esta diana, basadas en el empleo de anticuerpos monoclonales contra el domi-nio extracelular del receptor o de moléculas pequeñas dirigidas frente al dominio intracelu-lar de éste. Ambas estrategias han demostrado ser efectivas y actualmente están aprobados fármacos inhibidores de este receptor en las dos categorías. Los anticuerpos monoclonales bloquean la interacción del ligando receptor e inhiben su función. Además, los anticuerpos mo-noclonales inducen la degradación del receptor, y éste es otro mecanismo de atenuación de la señal. En las células, estos episodios provocan una inhibición de la proliferación celular. Estu-dios preclínicos han demostrado además que estos fármacos reducen la expresión del factor de crecimiento del endotelio vascular, con lo que se produce una disminución del potencial angiogénico. En estudios preclínicos se ha vis-to también que los anticuerpos monoclonales ejercen efectos sinérgicos con quimioterapia y radioterapia frente al EGFR.

Existen varios anticuerpos de esta clase en desarrollo y entre los más avanzados están el cetuximab (Erbitux®) y el panitumumab. El pri-mero ha sido aprobado para el tratamiento de pacientes con carcinoma de colon refractario a irinotecán en combinación con este agente o con radioterapia en pacientes con carcinoma epidermoide de cabeza y cuello con enferme-dad localmente avanzada; también, como agente único, en pacientes con enfermedad avanzada. En diferentes estudios clínicos se ha observado que este anticuerpo tiene actividad, como agen-te único y también en combinación con irinote-cán, en pacientes con cáncer de colon avanzado. En un reciente estudio fase III, la combinación de cetuximab con irinotecán resultó ser superior a cetuximab solo en pacientes con cáncer de colon avanzado que habían progresado al trata-miento con irinotecán. El fármaco tiene también actividad en otros tumores, tanto como agente único como en combinación con quimioterapia

y radioterapia. En particular, varios estudios re-cientes han demostrado que este fármaco tiene actividad como agente único en pacientes con tumores de cabeza y cuello. Asimismo, la adición de cetuximab al tratamiento con quimioterapia basada en platino, en pacientes con carcinoma de cabeza y cuello, mostró un aumento de las respuestas positivas. Finalmente, en un estudio fase III, la combinación de cetuximab con radio-terapia resultó superior a la radioterapia sola en pacientes con carcinoma de cabeza y cuello lo-calmente avanzado. La toxicidad principal obser-vada con este fármaco es cutánea y se manifiesta como acné. Curiosamente, en estudios clínicos se ha observado que los pacientes que desarrollan toxicidad cutánea tienden a evolucionar mejor. Los datos más recientes demuestran aumento de supervivencia en pacientes con carcinoma de pulmón tratados con cetuximab en combinación con quimioterapia. Así mismo, se ha demostrado que los pacientes con carcinoma de colon que se benefician del tratamiento con estos agentes presentan gen Kras normal.

El otro anticuerpo monoclonal aprobado para uso clínico es panitumumab. Este anticuerpo, a diferencia de cetuximab, es totalmente humano, lo cual disminuye la incidencia de reacciones de hipersensiblidad. En un reciente estudio fase III en pacientes con carcinoma de colon resisten-te a tratamiento con quimioterapia, el panitu-mumab mostró un aumento significativo en el tiempo a la progresión frente a placebo. Estos resultados han llevado a la aprobación clínica para pacientes con carcinoma de colon refrac-tario a quimioterapia.

Edrecolomab

El anticuerpo 17-1A (Panorex®) reconoce el antígeno Ep-CAM. El anticuerpo desarrolla-do clínicamente es un anticuerpo humanizado que tiene una larga vida media, induce ADCC y no produce HAMA. Debido a observaciones preclínicas que indican una mayor actividad del anticuerpo cuando se combina con citoquinas como interferón, interleucinas y factores de crecimiento hemopoyéticos, este anticuerpo se


ha desarrollado en combinación con los otros agentes. Los estudios clínicos realizados con esta molécula han dado resultados conflictivos. La combinación con citoquinas ha mostrado mejores respuestas inmunitarias, pero no me-jores respuestas clínicas. Los estudios iniciales en pacientes con estadio III de cáncer de colon demostraron aumento en la supervivencia del grupo tratado con anticuerpo frente al control. Estudios posteriores en pacientes en estadio II de cáncer de colon y en combinación con qui-mioterapia en pacientes con estadio III no han confirmado dicha actividad.

Bevacizumab

El VEGF es uno de los mediadores más im-portantes de la angiogénesis. Bevacizumab es un anticuerpo monoclonal dirigido contra este factor de crecimiento que ha sido reciente-mente aprobado para el tratamiento de pa-cientes afectados de carcinoma de colon en combinación con quimioterapia. El fármaco ha demostrado, en estudios fase III en pacientes con carcinoma de colon avanzado, mama y pul-món, un mayor índice de respuestas objetivas y de supervivencia. El fármaco también tiene actividad en pacientes con carcinoma de pul-món y se está estudiando con intensidad en estas otras enfermedades. Los principales efec-tos secundarios son hipertensión, hemorragias (tumorales, epistaxis, hemoptisis) y cuadros de perforación intestinal.

Otros anticuerpos en tumores sólidos

Actualmente se está desarrollando un gran número de anticuerpos monoclonales frente a otros múltiples antígenos, entre los que desta-can IGF1R, VEGFR, HGF y mesotelina.

Radioinmunoterapia

Radioinmunoconjugados

En esta modalidad terapéutica, los anticuer-pos se utilizan como vehículos de sustancias

radioactivas. Los anticuerpos utilizados pueden ser sin actividad terapéutica per se o con ella, como por ejemplo rituximab. La gran disponibi-lidad actual de anticuerpos y radioisótopos, con propiedades físicas y biológicas muy diversas, permite mucha flexibilidad en su combinación, de manera que es posible generar reactivos de muy diversa índole. Hasta hace poco, el único radioisótopo disponible era el 131I. Recientemen-te, está disponible también el 90Y, cuyo uso está aumentando de forma progresiva. Estos agentes de clasifican en dos grandes categorías depen-diendo del tipo de energía que emiten, alfa o beta. Estas sustancias se han utilizado mayor-mente en el tratamiento de neoplasias hemato-lógicas. Tositumomab (Bexxar®) está compuesto por 131I-anti CD20. Dosis mieloablativas de este agente han sido eficaces en el tratamiento de pacientes con linfoma refractario al tratamiento convencional y también ha demostrado activi-dad a dosis más bajas en pacientes con linfomas refractarios. Ibritumomab (Zevalin®) combina un anticuerpo frente al CD20 con 90Y. El más relevante estudio con este fármaco es de asig-nación aleatoria, fase III, en pacientes con linfo-ma de bajo grado. Se distribuyeron de modo aleatorio 143 enfermos para recibir tratamien-to con ibritumomab o rituximab, resultando en un mayor índice de respuestas positivas (tanto completas como parciales) en el grupo tratado con ibritumomab. Otros fármacos RAIT inclu-yen Lym-1 y M195. Esta modalidad terapéutica se ha ensayado también en tumores sólidos, con menor éxito hasta el momento.

ConclusionesLos anticuerpos monoclonales se han esta-

blecido como una importante modalidad tera-péutica y actualmente existen varios aprobados para el tratamiento de pacientes con diversos tipos de tumores. Los anticuerpos ofrecen una gran versatilidad en cuanto a su posible utiliza-ción como agentes únicos o combinados con radioinmunoconjugados, fármacos y toxinas.


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Genómica, proteómica y medicina 15

Resumen

La secuenciación del genoma humano, junto con el desarrollo y la implementación de las nuevas tecnologías «ómicas» de alto rendimien-to (genómica, proteómica, metabolómica), están incrementando de manera esencial el conoci-miento de la enfermedad humana y establecien-do unas bases sólidas para el desarrollo de la medicina personalizada (MP). El paradigma de la MP, y que plantea unos objetivos más ambi-ciosos, es la denominada «medicina 4P»: pre-ventiva, predictiva, personalizada y participativa. Aplicando la biología de sistemas (que utiliza los datos y las técnicas genómicas, proteómicas y metabolómicas), la emergencia de nuevas tec-nologías (nanochips, microfluídica, técnicas de visualización) y las nuevas herramientas compu-tacionales, pretenden establecer nuevos están-dares en salud humana. Uno de sus objetivos es incorporar el genoma de cada individuo a su historial clínico. En septiembre de 2010 se ha anunciado el lanzamiento del Proyecto del Pro-teoma Humano que, de forma similar al del Ge-noma Humano, pretende identificar y caracteri-zar todas las proteínas humanas. Su consecución es una pieza esencial en el establecimiento de la MP para facilitar la obtención de los perfiles proteicos (de tejidos, células y líquidos fisiológi-cos) que definan cada enfermedad.

De la medicina personalizada a la medicina 4P

La MP es una forma o modalidad de la me-dicina que utiliza la información de los genes, proteínas y metabolitos de cada paciente para prevenir, diagnosticar y tratar la enfermedad. Emplea la información del genoma de un indi-viduo (y los datos que se derivan, expresión de proteínas, presencia de metabolitos) en pruebas de diagnóstico útiles y tratamientos específicos para cada enfermedad y para cada paciente. La medicina genómica hace uso de la información genómica y las tecnologías complementarias (bioinformáticas) para determinar el riesgo y la predisposición a la enfermedad, diagnóstico y pronóstico y la selección y priorización de las opciones terapéuticas. Mientras que la farma-cogenética se centra en el estudio de cómo un gen (o un pequeño número de genes) afecta al metabolismo de un fármaco, la farmacogenómi-ca lo hace en el estudio de cómo la variación genética del genoma afecta al metabolismo y respuesta frente a los fármacos. La MP utiliza los test moleculares farmacogenéticos y farmacoge-nómicos para estratificar a los pacientes según su respuesta predicha a un tratamiento parti-cular y mejora la eficacia del tratamiento selec-

2 Genómica, proteómica y medicinaFernando VivancofundaCIón JIménez díaz

Universidad Complutense. Madrid


cionando los individuos que responden bien o excluyendo a los que van a tener un efecto ad-verso (fig. 1). En los últimos años los genetistas han conseguido identificar los genes responsa-bles de enfermedades que dependen de 1 solo gen (unos 2.000), como la enfermedad de Hun-tington, la fibrosis quística o la anemia falcifor-me. Sin embargo, otras enfermedades mucho más comunes, como la diabetes, la enfermedad coronaria o diversos tipos de cánceres, tienen una base genética compleja (están implicados muchos genes) y su estudio no puede realizarse por las técnicas genéticas habituales. No obs-tante, las nuevas técnicas de secuenciación de ADN y los microarrays de ADN han permitido la identificación de un gran número de genes de

susceptibilidad para estas enfermedades com-plejas, abriendo la posibilidad de una detección temprana y una posible prevención en algunos casos. Los microarrays permiten evaluar miles de fragmentos de ADN o ARN y medir el ni-vel de expresión de cada gen, obteniéndose las firmas de expresión génica o perfiles de expre-sión; son, por tanto, una herramienta muy pode-rosa para investigar el papel de uno o múltiples genes y los polimorfismos (SNP, variaciones de secuencias en el ADN) en los procesos patoló-gicos de individuos o de poblaciones. Asimismo, los estudios de asociación genómica (Genomic-Wide Association Study, GWAS) han permitido, a partir de 2006, la identificación de cientos de genes de susceptibilidad para las enfermedades prevalentes (muy recientemente para el asma). Con esta aproximación se comparan los geno-mas de un número de pacientes que tienen una enfermedad con un grupo control que no la tiene, para identificar las diferencias entre am-bas poblaciones. Si se encuentra alguna variante genética de algún gen que aparece con mayor frecuencia en la población de pacientes que en el grupo control, esas variantes se consideran que están asociadas con la enfermedad.

En cierto sentido los médicos siempre han practicado la MP, ajustando las dosis de los me-dicamentos a cada paciente, cambiando el tipo de fármaco, etc., pero para probar en función del resultado, lo que con frecuencia dilataba el tiempo para aplicar el tratamiento óptimo y se padecían los efectos adversos o la ineficacia de los fármacos. Actualmente, la MP incorpora la información derivada de los análisis moleculares, con nuevos perfiles proteicos en sangre que in-dican un riesgo elevado de enfermedad cardio-vascular o la presencia de cáncer de páncreas o de próstata o de inflamación, que orientan al clínico de forma decisiva en la toma de de-cisiones. Cada vez más, un mayor número de enfermedades se caracteriza por su perfil mo-lecular (genómico, proteómico), cuyo máximo exponente es el cáncer –hasta ahora el órgano, tejido, localización y caracterización histológica

Figura 1A. Eficacia de distintos fármacos sobre la población general.

Patients can respond differently to the same medicine

Anti-depressants

(SSRIS) 38%

40%

43%

50%

70%

75%

Asthma drugs

Diabetes drugs

Arthritis drugs

Alzheimer’s

drugs

Cancer drugs

Percentage of the patient population for witch particular drug

in a class is ineffective, on average


eran los criterios decisivos–. Hoy día, además, se caracterizan por los genes que expresa cada tumor o por las proteínas presentes en su su-perficie. Los test moleculares ofrecen una gran información sobre la situación de cada paciente, incluyendo la susceptibilidad a una enfermedad, su progresión y la respuesta a distintos fárma-cos: el fármaco adecuado, en la dosis adecuada, para el paciente adecuado, que es la esencia de la MP (farmacogenómica). Además, tienen en

gran medida naturaleza predictiva, lo que favo-rece intervenciones preventivas (tabla 1). Los dos enfoques son complementarios, siendo los protagonistas del primero (clásico) las células, los tejidos y los fármacos de tipo general, su-puestamente útiles para todos los pacientes de una misma enfermedad («talla única para to-dos»). En el enfoque de la MP, los protagonistas son los genes, las proteínas y los metabolitos; y las rutas, redes e interconexiones entre ellos, de

Figura 1B. Comparación de la estrategia utilizada en la MP, utilizando test genéticos (panel inferir), frente a la medicina clásica, que utiliza el mismo fármaco para todos los pacientes de una misma enfermedad.

Pacientes con el mismo diagnóstico

Beneficio y toxicidad

No beneficio y no toxicidad

Beneficio y no toxicidad

No beneficio y toxicidad

Pacientes con el mismo diagnóstico

Tratamiento óptimo

para cada paciente

Genotipado

Medicina personalizada


Tabla 1. Selected Personalized Medicine Drugs, Treatments, and Diagnostics as of March 2009*

Therapy Biomarker/test Indication

Herceptin® (trastuzumab)Tykerb® (lapatinib)

HER-2/neu receptor Breast cancer: «…for the treatment of patients with metastatic breast cancer whose tumors overexpress the HER2 protein and who have received one or more chemotherapy regimens for their metastatic disease»

Pharmaceutical and sur-gical prevention options and surveillance

BRCA 1,2 Breast cancer: Guides surveillance and preventive treatment based on susceptibility risk for breast and ovarian cancer

Tamoxifen Aviara Breast CancerIndexSM (HOXB13, IL17BR)

Breast cancer: Calculates a combined risk analysis for recurrence after tamoxifen treatment for ER-positive, node-negative breast cancer

Chemotherapy Mammostrat® Breast cancer: Prognostic immunohistochemistry (IHC) test used for postmenopausal, node negative, estrogen receptor expressing breast cancer patients who will receive hormonal therapy and are considering adjuvant chemotherapy

Chemotherapy MammaPrint® Breast cancer: Assesses risk of distant metastasis in a 70 gene ex-pression profile

Coumadin® (warfarin) CYP2C9 Cardiovascular disease: «an increased bleeding risk for patients ca-rrying either the CYP2C9*2 or CYP2C9*3 alleles»

Coumadin® (warfarin) VKORC1 Cardiovascular disease: «Certain single nucleotide polymorphisms in the VKORC1 gene (especially the -1639G > A allele) have been associated with lower dose requirements for warfarin»

Coumadin® (warfarin) PGx PredictTM:Warfarin

Cardiovascular disease: Determines CYP2C9 and VKORC1 genoty-pes to predict likelihood of adverse events with warfarin therapy.

Coumadin® (warfarin) Protein C deficiencies Cardiovascular disease: Hereditary or acquired deficiencies of pro-tein C or its cofactor, protein S, has been associated with tissue necrosis following warfarin administration

Pharmaceutical and lifes-tyle prevention options

Familion® 5-gene profile

Cardiovascular disease: Guides prevention and drug selection for patients with inherited cardiac channelopathies such as Long QT Syndrome (LQTS ), which can lead to cardiac rhythm ab-normalities

Statins PhyzioType SINM Cardiovascular disease: Predicts risk of statin-induced neuro-myopa-thy, based on a patient’s combinatorial genotype for 50 genes

Atorvastatin LDLR Cardiovascular disease: «Doses should be individualized ac-cording to the recommended goal of therapy. Homozygous Familial Hypercholestremia (10-80mg/day)and heterozygous (10-20mg/day)»

Camptosar® (irinotecan) UGTIA1 Colon cancer: «Variations in the UGT1A1 gene can influence a patient’s ability to break down irinotecan, which can lead to increa-sed blood levels of the drug and a higher risk of side effects»



Erbitux® (cetuximab)

Gefitinib

Vectibix® (panitumab)

EGFR expression Colon cancer: «Patients enrolled in the clinical studies were re-quired to have…evidence of positive EGFR expression using the DakoCytomation EGFR pharmDx™ test kit». EGFR positive indi-viduals are more likely to respond to the drug than those with reduced EGFR expression.

Erbitux® (cetuximab)

Gefitinib


KRAS Colon cancer: Certain KRAS mutations lead to unresponsiveness

to the drug

Erbitux® (cetuximab) and


Fluorouracil

Camptosar® (irinotecan)

Target GI™ Colon cancer: Provides information of the expression of key mole-

cular targets–KRAS, TS, and TOPO1–to guide therapy

Tagretol (carbamazepine)

HLA-B*1502 Epilepsy and bipolar disorder: Serious dermatologic reactions are

associated with the HLAB*1502 allele in patients treated with

carbamazepine. «Prior to initiating Tegretol therapy, testing for

HLA-B*1502 should be performed in patients with ancestry in

populations in which HLAB*1502 may be present»

Immunosuppressive drugs

AlloMap® gene profile

Heart transplantation: Monitors patient’s immune response to heart transplant to guide immunosuppressive therapy.

Ziagen® (abacavir) HLA-B*5701 HIV: «Patients who carry the HLA-B*5701 allele are at high risk for expe-

riencing a hypersensitivity reaction to abacavir. Prior to initiating therapy

with abacavir, screening for the HLA-B*5701 allele is recommended»

Selzentry® (maraviroc)

CCR5 receptor (1) HIV: «Selzentry, in combination with other antiretroviral agents, is indicated for treatment experienced adult patients infected with only CCR5-tropic HIV-1 detectable...»

Budesonide IBD Serology 7 Inflammatory bowel disease: Identifies subset of patients who will

benefit from budesonide.

Gleevec®

(imatinib mesylate)

BCR-ABL Leukemia: «Gleevec® (imatinib mesylate) is indicated for the

treatment of newly diagnosed adult and pediatric patients with Phi-

ladelphia chromosome positive [indicated by presence of BCRABL]

chronic myeloid leukemia (CML) in chronic phase»

Dasatinib Philadelphia

Chromosome

Leukemia: «Dasatinib is indicated for the treatment of adults with

Philadelphia chromosomepositive acute lymphoblastic leukemia

(Ph+ AL) with resistance or intolerance to prior therapy»

Busulfan PhiladelphiaChromosome

Leukemia: «Busulfan is clearly less effective in patients with chronic mye-logenous leukemia who lack the Philadelphia (Ph1) chromosome»

Purinethol® (mercaptopurine)

ThiaguanineAzathioprine

TPMT Leukemia: Guides adjustment of dose in treatment of acute lym-

phoblastic leukemia: «Patients with inherited little or no thiopurine

S-methyltransferase (TPMT) activity are at increased risk for severe

Purinethol toxicity from conventional doses…»



Tarceva® (erlotinib) EGFR expression Lung cancer: The test determines patients most likely to respond.

Capecitabine DPD Multiple cancers: «Rarely, unexpected severe toxicity (e.g., sto-matitis, diarrhea, neutropenia and neurotoxicity) associated with 5-fluorouracil has been attributed to a deficiency of dihydropyri-midine dehydrogenase (DPD) activity»

Pharmaceutical and sur-gical treatment options and surveillance

MLH1, MSH2, MSH6 Multiple cancers: Guides surveillance and preventive treatment ba-sed on susceptibility risk for colon and other cancers.

Chemotherapy CupPrintTM Multiple cancers: Determines cancer classification for tumors of unknown primary origin.

Chemotherapy Aviara Cancer TYPEID®

Multiple cancers: Classifies 39 tumor types from tumors of unk-nown primary origin, using a gene expression profile.

Elitek® (rasburicase) G6PD deficiency Multiple cancers: «Rasburicase administered to patients with glucose- phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency can cause severe he-molysis. … It is recommended that patients at higher risk for G6PD deficiency … be screened prior to starting ELITEK therapy»

Drugs metabolized by CYP P450

2C19: Celecoxib, Codeine, Dia-zepam, Esomeprazole, Nelfinavir, Omeprazole, Pantoprazole, Ra-beprazole, Voriconazole

2D6: Acetaminophen, Aripiprazo-le, Atomoxetine, Carvedilol, Ce-vimeline hydrochloride, Clozapi-ne, Fluoxetine HCl, Fluoxetine HCL and Olanzapine, Metopro-lol, Propranolol, Propafenone, Protriptyline HCl, Risperidone, Tamoxifen, Terbinafine, Thiorida-zine, Timolol maleate, Tiotropium bromide inhalation, Tolterodine, Tramadol, Venlafaxine

Amplichip®

CYP2D6/CYP2C19Multiple diseases: FDA classification 21 CFR 862.3360: «This device is used as an aid in determining treatment choice and individualizing treatment dose for therapeutics that are metabolized primarily by the specific enzyme about which the system provides genotypic information»

RifampinIsoniazidPyrazinamide

NAT Multiple diseases: N-acetyltransferase slow and fast acetylators and toxicity- «slow acetylation may lead to higher blood levels of the drug, and thus, an increase in toxic reactions»

Rituximab PGx PredictTM: Rituximab

Non-Hodgkin’s lymphoma: Detects CD-20 variant (polymorphism in the IgG Fc receptor gene FcgRIIIa) to predict response to cancer drug rituximab.

Celebrex® (celecoxib) CYP2C9 Pain: «Patients who are known or suspected to be P450 2C9 poor metabolizers based on a previous history should be administered celecoxib with caution as they may have abnormally high plasma levels due to reduced metabolic clearance»

Risperdal® (resperidone)Zyprexa® (olanzapine)

PhyzioType PIMS Psychiatric disorders: Predicts risk of psychotropic-induced metabolic syndrome, based on a patient’s combinatorial genotype for 50 genes.


forma que los fármacos (a veces en forma de cóctel) interfieren con las redes o con los nudos (intersecciones) que bloquean toda la red. Algu-nos test para el cáncer de mama, que evalúan 70 genes, orientan no sólo sobre el fármaco a administrar sino que predicen la probabilidad de desarrollar metástasis e incluso el grado de malignidad. La MP, por tanto, se basa en análisis moleculares, con frecuencia altamente comple-jos (perfiles genómicos de miles de genes, perfi-les proteómicos de cientos de proteínas) y que requiere un amplio apoyo de todo el sistema de salud de los países que quieran implantar-lo: nuevas regulaciones, revisión profunda de la educación en biomedicina, sistemas integrados de información sobre la salud, nueva legislación que proteja frente a la discriminación (por ra-zones genéticas), cobertura de los test por los seguros públicos y privados, etc.

A pesar de los numerosos obstáculos, lenta-mente, pero con paso firme, la MP se va incor-porando a los sistemas de salud de los países desarrollados. La tecnología y las nuevas estra-tegias científicas han sido siempre los motores de las revoluciones científicas y todo indica que lo mismo va a ocurrir con la medicina. Países como Estados Unidos o el Reino Unido han aprobado recientemente en sus parlamentos las directrices para el establecimiento de la MP

como el camino óptimo para la salud de la po-blación y, a la vez, el de menor costo a largo plazo. El paradigma de la MP, y que plantea unos objetivos más ambiciosos, es la denominada me-dicina 4P: preventiva, predictiva, personalizada y participativa. Sus promotores (cuyo máximo re-presentante es L. Hood, presidente del Institute for Systems Biology, Seattle, Estados Unidos) consideran que la aplicación de la biología de sistemas (que hace uso de los datos y técnicas genómicas, proteómicas y metabolómicas) (fig. 2), la emergencia de nuevas tecnologías (nano-chips, microfluídica, técnicas de visualización), y las nuevas herramientas computacionales, van a modificar significativamente la medicina y el tra-tamiento de la enfermedad. El carácter predicti-vo proviene de la estimación de la probabilidad de padecer o no una cierta enfermedad en función del genoma individual. Es personalizada porque las variaciones genéticas únicas de cada individuo orientan y/o dirigen los tratamientos: cada paciente se convierte en su propio con-trol; a partir del genoma individual se poseen billones de datos de cada individuo y cientos de millones de individuos con esa cantidad de información. Es preventiva porque pueden di-señarse fármacos terapéuticos/preventivos a partir de la información generada mediante la biología de sistemas. Y, finalmente, es participa-


Gleevec® (imatinib mesylate)

c-KIT Stomach cancer: «Gleevec® is also indicated for the treatment of patients with Kit (CD117) positive unresectable and/or metastatic malignant gastrointestinal stromal tumors (GIST)»

*This list is not intended to be comprehensive but reflects commonly used or available products as of March 2009. Some products, for which the FDA recommends or requires pharmacogenomic testing or which have pharmacogenomic information in their label, are listed at the FDA’s Web site (http://www.fda.gov/cder/genomics/genomic_biomarkers_table.htm). Other listed products that are novel, and/or that address large popula-tions, have been identified via websites and public announcements.

Indications in quotes are taken from the therapeutic product label.

BCR-ABL = breakpoint cluster region – Abelson DPD = dihydropyrimidine dehydrogenase TOPO1 = topoisomerase 1BRCA 1,2 = breast cancer susceptibility gene 1 or 2 G6PD = glucose 6 phosphate dehydrogenase TPMT = thiopurine S-methyltransferasec-KIT = tyrosine kinase receptor HER2 = human epidermal growth factor receptor 2 TS = thymidylate synthaseCYP = cytochrome P450 enzyme NAT = N-acetyltransferase UGT1A1 = UDP-glucuronosyltransferase 1A1

Therapeutic product label contains pharmacogenomic information as: Information only Recommended Required


tiva porque los pacientes entienden y partici-pan en las opciones que toman los médicos, los cuales deben actuar como integradores de la información total.

Utilizando los análisis moleculares de la bio-logía de sistemas para el tratamiento de la en-fermedad o su predisposición, la medicina 4P promete introducir nuevos estándares en la salud humana. El resultado es que en los próxi-mos 5-20 años la medicina puede cambiar de ser prioritariamente reactiva (responde cuando aparecen los síntomas de la enfermedad) a ser proactiva, caracterizada por las 4P. Si se adop-tan los test moleculares en la práctica clínica se puede realmente transformar la salud de la población. Gracias a la secuenciación ultrarrápi-da se puede obtener el perfil genómico de un individuo (o de un tumor) en cuestión de días e incluso horas, lo cual introduce unos niveles de complejidad difícilmente controlables en la actualidad. Sin embargo, el número de causas o modificaciones (mutaciones) que hacen que una célula sana se convierta en tumoral no pa-

rece ser muy elevado y son comunes a muchos tumores, lo que facilita el diagnóstico y sobre todo el tratamiento. Ya no es arriesgado decir que en un futuro inmediato la determinación del genoma completo de cada individuo es algo no sólo factible, sino de un precio asequible (unos 1.000 dólares, 800 euros): el primer geno-ma costó 3 billones de dólares, el segundo 100 millones y el tercero, el de James Watson, 1,5 millones (fig. 3). En el futuro cada recién nacido tendrá determinado su genoma completo antes de abandonar el hospital, lo que ya es un obje-tivo en Estados Unidos, donde el número de nacimientos anuales ronda los 4 millones. Los genomas individuales serán un estándar dentro de las historias clínicas en los próximos años.

Sin embargo, algunas de las tecnologías de hoy día necesitan ser mejoradas de forma im-portante si se quieren conseguir los objetivos de la medicina 4P. Por ejemplo, los métodos na-notecnológicos para la medición de proteínas –como medir 2.500 proteínas a partir de una gota de sangre– no son posibles actualmente.

Figura 2. Representación esquemática de los elementos que constituyen la biología de sistemas y su aplicación en medicina.

• Parallel analyses of proteins, metabolites and mRNA from complex samples

• Determination of molecular function and elucidation of disease mechanisms

• Informatics tools to link gene response, protein activity and metabolite dynamics

• BioSystematics™ to translate covariant sets of genes, proteins, metabolites into biochemical interaction and target information

prot

ein

inde

x

metabolite index

gene

inde

x BioS

yste

mat

icsT

M

Target andSystem information

Genes

Proteins

Metabolites

Clinical data


Existen pequeños dispositivos que son capaces de cuantificar 40-60 proteínas en líquidos fisio-lógicos (se han testado en saliva) que pueden ser prototipos de desarrollos posteriores (fig. 4). La propuesta de que deben desarrollarse test que evalúen 50-100 proteínas específicas de los distintos órganos, como forma de pre-guntarnos acerca del estado de salud en vez del estado de la enfermedad, está sin embar-go mucho más cerca. Las técnicas proteómicas más recientes, como el método MRM, ya son capaces de cuantificar 50-100 proteínas/ensayo en un breve tiempo y con gran sensibilidad y exactitud. Igualmente, la capacidad de obtener análisis detallados a partir de una única célula o un pequeño grupo de ellas (actualmente se está haciendo con 1.000 células) podrá ser real en un futuro próximo. El desarrollo de herra-mientas computacionales y matemáticas con capacidad de gestionar la dimensionalidad de los datos es una tecnología con un alto poder transformador. En los próximos 10 años vamos a disponer de millones de datos procedentes del genoma y proteomas de cada paciente. ¿Cómo reducir esa enorme cantidad de datos a hipótesis simples de salud y enfermedad? El

modo de correlacionar los datos genómicos y proteómicos con el fenotipo normal y asociado a cada enfermedad es un gran reto. Dónde y cómo se van a manejar informáticamente todos esos datos es actualmente un desafío y un tema para la reflexión. Hood considera que esta im-plementación abocará en una digitalización de la medicina, de forma similar a lo que ha ocurrido recientemente en el paso de la información ana-lógica a la digital. Es posible que la medicina se convierta así en una ciencia de la información.

Proteómica y medicina: el proyecto proteoma humano

En septiembre de 2010, dos centros indepen-dientes (The Institute for Systems Biology, en Seattle, Washington y el Swiss Federal Institute of Technology, ETH, en Zúrich) han anunciado oficialmente que han completado la primera fase para la generación de un mapa comple-to del proteoma humano, utilizando la espec-trometría de masas (MS) para la identificación

Figura 3. Descenso progresivo en el costo (en $) estimado para la determinación del genoma completo de un individuo.

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0

$3B$20M

2006 2006 2006 2006 2006

$2M$5K $1K

20

15

10

5

0

$ M

illons

$ Bi

llons

1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008


de las proteínas –estos datos están libremen-te accesibles a toda la comunidad científica en (www.srmatlas.org; www.peptideatlas.org–. Los investigadores han generado espectros de ma-sas (análisis que permite identificar cada proteí-na) de referencia para cada una de las proteínas correspondientes a los 20.300 genes humanos presentes en el genoma. Este mapa de refe-rencia permitirá a los investigadores de todo el mundo detectar y cuantificar cualquier proteína humana de cualquier muestra biológica (tejidos, células, líquidos fisiológicos). Se utilizan para ello técnicas específicas de MS, fundamentalmente SRM (Selected Reaction Monitoring), que per-miten detectar y cuantificar cada proteína indi-

vidual a partir de alguno de sus péptidos. Mo-ritz, Hood y Aebersold han generado más de 150.000 SRM que incluyen al menos 5 péptidos proteotípicos (específicos de cada proteína) para la identificación de las proteínas. Además, han dsarrollado ensayos de SRM específicos para todas las proteínas de membrana y todas las glucoproteínas con sitios de N-glucosilación. Este ingente trabajo supone un avance compa-rable al primer borrador del genoma humano, de forma que ahora las bases de datos con las proteínas son de libre acceso; el costo estimado ha sido de 5 millones de euros. El mapeo del genoma humano requirió 10 años y un costo de casi 3 billones de dólares; fue el origen de lo

Figura 4. A) La presencia de proteínas órgano-específicas en el plasma permite la obtención de perfiles proteicos asociados a la enfermedad. B) Representación esquemática de un nanochip para el análisis de proteínas plasmáticas.

Determinación de perfiles proteicos órgano-específicos (cerebro, hígado) en el plasma

Distinción salud/enfermedad

Eliminar células 300 nl de plasmaCuantificación de proteínas

Nanochips (microfluídica) para el análisis del plasma sanguíneo (proteínas)

B

A


que ahora comienza como Proyecto del Pro-teoma Humano (HPP), que se estima pueda es-tar completado en el año 2020. Con los datos, ahora públicos, se da un paso de gigante para reforzar el desarrollo de la MP porque facilita hacer el tipo de análisis de alto rendimiento (mi-les de proteínas de un individuo) que se requie-re en la MP o 4P. Pero el objetivo final del HPP no es tener un mero listado de proteínas, sino todas las posibles variantes de cada proteína (isoformas), su función, abundancia, localización subcelular y sus interacciones (redes y rutas de señalización). Casi un tercio de los 21.000 ge-nes del genoma humano no tiene una proteína conocida asociada y de los otros dos tercios no hay una información detallada. El HPP se propo-ne obtener esta información detallada y tener al menos una proteína correspondiente a cada gen humano. Es un objetivo complicado, por-que el proteoma es dinámico, está cambiando constantemente y las proteínas son modificadas de múltiples formas (fosforilación, glucosilación, acetilación, etc.) y en distintos tiempos. Además, se pretende tener una colección de anticuerpos específicos para cada una de las proteínas.

De cara al futuro inmediato, uno de los ma-yores desafíos es almacenar, manejar y controlar todos los datos que genera el HPP, especial-mente de forma integrada entre sí y con los datos genómicos. Es fundamental que presente utilidad práctica y, en especial, que proporcio-ne información útil para la medicina que pueda trasladarse rápidamente a la práctica clínica. No debe olvidarse que en último término son las proteínas (y no sólo los genes) las moléculas clave para el entendimiento de las enfermeda-des (y de la salud). Las proteínas son los con-tribuyentes fundamentales del fenotipo, y las enfermedades se refieren fundamentalmente al fenotipo y no al genotipo. Cualquier mejora e implementación en la medicina y en la MP de-pende de un mayor conocimiento de las proteí-nas y del proteoma humano que ahora empieza a desvelarse. Es importante recordar, además, que más del 90% de las dianas terapéuticas son proteínas, sobre las que actúan los fármacos.

Proteómica clínicaLa proteómica ofrece una información al-

tamente complementaria de la genómica; como la mayoría de las funciones biológicas las realizan las proteínas, la proteómica ofrece una nueva visión de la enfermedad. A pesar de su complejidad, el rápido y notable desa-rrollo en los últimos años ha conducido a su aplicación a los procesos patológicos o pro-teómica clínica, la cual se ocupa de la identifi-cación sistemática y exhaustiva, a gran escala, de patrones proteicos de enfermedad y de la aplicación de esos datos a los pacientes (estu-dio de la enfermedad, susceptibilidad, preven-ción, selección de terapias, seguimiento de los tratamientos, etc.). Entender, por ejemplo, las alteraciones tempranas en diversas enferme-dades (típicamente en cáncer o en el síndro-me coronario agudo), produciría una notable mejora en la prevención e identificación de pacientes con riesgo y/o en estado preclínico. La proteómica clínica pretende definir patro-nes de proteínas que puedan generar infor-mación de valor clínico acerca de la suscep-tibilidad, diagnóstico, pronóstico y terapia de la enfermedad; para que impacte de manera real en la mejora de la salud debe identificar y seleccionar patrones proteicos, validarlos en estudios poblacionales muy amplios y trasla-darlo a la práctica clínica. Entre sus objetivos, se encuentran los que siguen.

Identificación de biomarcado-res individuales

La búsqueda e identificación de biomarca-dores individuales se lleva a cabo siguiendo la metodología proteómica clásica de separa-ción de proteínas (2-DE, DIGE, cromatografía multidimensional y electroforesis capilar) y su identificación por espectrometría de ma-sas (MS, MALDI-TOF, ESI-Q-TOF o ESI-Trap, MALDI-TOF/TOF). Su estrategia fundamental es el análisis de la expresión diferencial de proteínas entre controles y muestras pato-


lógicas (fig. 5), de proteomas completos (li-sados celulares) o subproteomas específicos (mitocondrias, membranas, etc.). Un aspecto fundamental es la determinación de las mo-dificaciones postraduccionales y su potencial implicación en patología. En muchos casos los biomarcadores se convierten simultáneamen-te en nuevas dianas terapéuticas.

Obtención de perfiles proteicos

Consiste en el estudio sistemático, a gran esca-la, de las proteínas de una muestra para la identi-ficación de patrones o perfiles proteicos (huellas dactilares proteicas), con carácter diagnóstico (discriminatorio) y/o pronóstico. Los escasos biomarcadores identificados y aprobados por la FDA en los últimos años son un reflejo de la es-

trategia habitual de testar una proteína individual, o llevar a cabo análisis en pequeña escala, etc. Aunque existen excepciones (paraproteínas de los mielomas, déficit de α-1-antitripsina) es muy posible que no existan marcadores únicos de las enfermedades complejas, por lo que la estrategia proteómica de estudiar paneles proteicos, supo-ne un paso cualitativo de gran trascendencia. Este estudio se puede realizar mediante, al menos, las tres estrategias que siguen.

Perfiles proteicos de plasma o suero

Se analiza el suero/plasma de los pacientes con la patología objeto de estudio (cardiovas-cular, neurodegenerativa, infecciosas, cáncer, etc.) y alternativamente en otros líquidos fisiológicos (lavado broncoalveolar, líquido cefalorraquídeo, orina). Se utiliza la técnica denominada SELDI-

Figura 5. Ejemplo de análisis proteómico de expresión diferencial mediante electroforesis bidimensional. La comparación entre las proteínas (manchas en la figura) del tejido sano (Normal) y patológico (RCC), permite detectar alteraciones en los niveles de expresión de varias proteínas (flechas en los paneles de la derecha)

Normal

RCC

Normal

RCC


TOF (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization-Time of Flight) para la generación de los perfiles proteicos, que combina la retención de las proteínas del suero en biochips con la de-terminación de sus masas moleculares mediante MS, permitiendo generar gráficos donde se re-presenta la abundancia frente a la masa molecu-lar de las proteínas, a modo de código de barras proteicos constituidos por miles de líneas que caracterizan el suero de cada individuo (fig. 6). Su poder discriminatorio es muy superior al de mar-cadores únicos con los que se han comparado (p. ej., PSA en cáncer de próstata, proteína C reac-tiva en infección e inflamación). Como el análisis mediante SELDI-TOF utiliza muy poca muestra (1 μl) y, además, es muy rápido (se pueden anali-zar cientos de muestras al día) y automatizado, su potencial en clínica analítica es enorme y puede ir sustituyendo muchas de las técnicas habituales de los laboratorios de bioquímica clínica (enzimo-inmunoanálisis), que son más lentos, más caros (utilizan anticuerpos marcados con sondas fluo-rescentes), precisan mayor cantidad de muestra y sólo informan de un único marcador, frente a los miles que proporciona el SELDI-TOF.

Perfiles proteicos de tejidos: MS-Imaging

En tejidos, pueden obtenerse perfiles o imáge-nes (mapas) bidimensionales de proteínas (MS-Imaging) aplicando directamente la MS sobre cortes histológicos del tejido (cortes habituales sobre portaobjetos para microscopia óptica, de 5-20 μm de grosor), utilizando el MALDI-TOF o el MALDI-TOF/TOF. El mapa bidimensional se consigue haciendo incidir el láser (que «barre» la superficie de la muestra) del espectróme-tro sobre los cortes histológicos y analizando las proteínas que son vaporizadas. Típicamente aparecen 500-1.000 señales de proteínas indivi-duales en cada punto del tejido, con masas en-tre 2-70 kDa. De esta forma se obtiene la masa (m/z) de las moléculas (péptidos, proteínas) presentes en cada zona del tejido. Seleccionan-do una masa dada (m/z) en los distintos espec-tros de las diferentes zonas, se genera un mapa

bidimensional de la distribución de esa proteína (esa m/z) a lo largo del corte de tejido (a modo de cartografía proteica). Se pueden conseguir dos tipos de datos: perfiles proteicos (mediante una adquisición puntual) e imágenes (barriendo todo el tejido con el láser) (fig. 7).

Las imágenes son generadas mediante un software específico que clasifica y agrupa las proteínas y compara diversas muestras, permi-tiendo obtener imágenes tridimensionales de la distribución de las proteínas del tejido. Esta tecnología implica un tipo de información to-talmente nuevo para la descripción, clasificación y caracterización de muestras histológicas que está permitiendo la identificación de biomarca-dores, la localización de proteínas específicas y, en el campo de la oncología, la reclasificación de tumores, por ejemplo.

Una técnica muy similar (SIMS-TOF, Secon-dary Ion Mass Spectrometry) permite el análisis (identificación y caracterización) de moléculas de bajo peso molecular presentes en la super-ficie de una muestra (determinación del meta-boloma) hasta los 1.500 Da. Esta limitación en el reducido rango de masas analizado es com-pensada en parte por la alta resolución obte-nida (subcelular ; hasta 200 nm/pixel) y por no necesitar la utilización de ningún tipo de matriz (evitando interferencia y deslocalización de las muestras: se usa el tejido directamente), lo que

Figura 6. Representación de perfiles proteicos obtenidos por SELDI-TOF.

Rela

tive

inte

nsity

3325.1 4303.1

5392.1

6593.8

3,000 4,000 5,000 7,0006,000

3325.44303.1

5392.1

6593.8


la convierte en una herramienta muy valiosa en patología. Además, como ésta técnica se aplica para localizar y mapear en el tejido moléculas pequeñas, particularmente fármacos (y su co-localización con proteínas), es de gran interés para la industria farmacéutica.

Chips (arrays) de proteínas

La obtención de perfiles proteicos, tanto de suero (u otros líquidos fisiológicos) como de cé-lulas o tejidos, también puede obtenerse a partir de la utilización de chips (o micromatrices) de proteínas. Éstos pueden clasificarse según mu-

chos parámetros (modo de fabricación, quími-ca de la superficie, especificidad, densidad, etc.), aunque es mejor sistematizarlos en dos grandes grupos, según lo que capturan o analizan.

Chips analíticos

Se utilizan para determinar las proteínas pre-sentes en una muestra (perfil de expresión) y su cuantificación. La disolución de la mezcla de proteínas a analizar se aplica sobre el chip, que contiene agentes de captura que actúan como sondas. Los agentes de captura más conocidos son los anticuerpos (Ab) en sus distintas moda-

Figura 7. Flujo de trabajo en el análisis de tejidos mediante MS-Imaging.

MS/MS spectrum

Mass spectra for each xy coordinate

Single m/z values Biocomputational analysis

Class A Class B0% 100%

Peptide fragments

Database search

Protein identification Protein images Classification images

Tandem MS

Tissue slide

Matrix application

Laser ablation

MS

Laser


lidades: monoclonales completos, Fab, scFv, afi-bodies (Ab sintéticos), dominios de Ab, etc. La utilización de Ab no está exenta de problemas: inespecificidad, reacciones cruzadas, orientación, afinidad, etc. Otra alternativa son los chips de antígeno para analizar el perfil sérico de Ab (y autoAb en enfermedades autoinmunes), como los chips de alérgenos para la detección de IgEs en respuestas alérgicas.

Recientemente se está generando una plétora de agentes de captura distintos a los Ab, como péptidos, moléculas orgánicas, polímeros sin-téticos, oligonucleótidos, aptámeros, ribozimas, trinectinas (derivados de la fibronectina), MIP (molecular imprinted polymers: compuestos que se polimerizan sobre las proteínas creando mol-des para su uso posterior), etc. A pesar de ésta diversidad, la captura de las proteínas (y los mé-todos de detección) constituye el gran problema de los chips proteicos: no existen todavía agentes de captura de alta calidad que puedan inmovili-zarse en la superficie de un chip y que permitan unir, detectar y cuantificar una mezcla compleja de proteínas. Este problema está retrasando no sólo el desarrollo de los chips proteicos sino de la industria proteómica en general.

Los chips de fase reversa son de especial re-levancia en medicina porque permiten determi-nar las proteínas implicadas en las rutas de seña-lización celular en las biopsias de los pacientes. En ellos, las biopsias (típicamente de tumores o cardiacas) se lisan y se depositan en dilucio-nes sucesivas como microgotas (utilizando los mismos robots que para la fabricación de los chips de ADN); posteriormente, son revelados con Ab validados (que reconocen proteínas fos-foriladas y cinasas, a fin de determinar el grado de activación de las diferentes rutas de señali-zación), obteniéndose información cualitativa y cuantitativa para cada paciente, lo que permite un tratamiento personalizado; actualmente exis-ten más de 1.000 Ab validados. Mediante estos arrays puede determinarse simultáneamente el estado de fosforilación de las proteínas impli-

cadas en las principales rutas de señalización intracelular. La utilización de los arrays de fase reversa permite así, obtener un tipo de infor-mación molecular único e individualizado de cada muestra y, por tanto, de cada paciente. Este nuevo tipo de array proporciona perfiles de señalización intracelular, incluyendo las modi-ficaciones postraduccionales, datos que no son accesibles mediante técnicas genómicas.

Chips funcionales

Se utilizan para determinar actividades bio-químicas e interacciones moleculares. Las pro-teínas de interés se inmovilizan en el chip y se analizan sus funciones biológicas e interacciones incubándolas con distintas moléculas (otras proteínas, metabolitos, sustratos de enzimas, ADN, etc.). Los dos problemas principales de estos chips son la producción de colecciones extensas de proteínas y su mantenimiento en forma activa en el chip. Sin embargo, para gru-pos de proteínas con características funcionales similares (factores de trascripción, receptores, cinasas) hay un gran campo por desarrollar en clínica humana.

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AbstractTraditional pharmacotherapy is rather in-

efficient; on average only 40% of patients will benefit from a particular drug as com-pared with placebo. Interindividual variability in drug disposition and effect can be partly explained by genetic variants. In the science of pharmacogenetics the influences of gene-tic differences on patients’ drug response are studied. The major causes of inefficient drug treatment (like lack of effectiveness or the occurrence of side effects or toxicity) are he-terogeneity of the disease, variations in drug disposition (pharmacokinetics) and drug res-ponse (pharmacodynamics).

Genetic variants can be detected by ampli-fication of DNA using the Polymerase Chain Reaction (PCR) followed by sequence analysis. Other techniques, like micro-arrays, enable us to screen the whole genome.

The influence of pharmacogenetics becomes more and more important in clinical practice and on drug development. In this review we will discuss the principles of pharmacogenetics and the practical implications, illustrated with exam-ples taken from clinical practice. Pharmacogene-tics is a new cornerstone in medicine!

IntroductionPatients differ in their response to drugs. On

average only 40% of patients will benefit from a particular drug as compared with placebo. When treating risk factors (e.g. hypertension) medically, we are grossly over treating the ge-neral population. A good measure to evaluate treatment effect is the ‘Number Needed to Treat’ (NNT): the total number of people that are exposed to treatment to prevent one in-cident. For example >1000 patients younger than 60 years with hypertension should be treated to prevent one death. On the other hand about 10% of the patients will experien-ce adverse drug reactions (ADRs). From this perspective, traditional drug treatment is ra-ther inefficient.

The reason for this inefficiency is that we can-not point out beforehand which patients will benefit from the treatment and which patients will experience ADRs. Interindividual variability in drug disposition and effect can be partly ex-plained by genetic variants. Patients do not only show a considerable variation in disease-develo-pment but also in drug disposition (pharmaco-kinetics) and drug effects (pharmacodynamics) (Evans et al; 2003). In the science of pharmaco-

3 Impact of pharmacogenetics on drug use in individually optimised pharmacotherapyArnold G. Vulto PharmD PhD and Monique J. Bijl PharmD PhDdepartment of hospItal pharmaCy

Erasmus University Medical Centre , P.O. Box 2030, 3000 CA Rotterdam, The Netherlands

Impact of pharmacogenetics on drug use in individually optimised pharmacotherapy 31

genetics the influences of genetic differences on patients’ drug response are studied.

The mapping of the human genome is slowly changing the scene. Based on genetic analysis drugs can be produced tailor-made for specific patients, based on their genetic constitution. Many applications can be envisaged. Genetic predispo-sition can be spelled out: which patients carry a serious disease risk and should be treated with priority? Which patients will benefit most from certain types of drugs? It may become possible to repair genetically determined risk factors, or to repair genetic defects (gene therapy). Gene therapy can also be employed to change the bio-chemical repertoire of a cell in such a way that the body is producing its own drugs. But also in the use of traditional drugs, the scene will change. Factors like absorption and metabolism are ge-netically determined by the structure of so-called P-glycoprotein pumps in the cell membrane and polymorphism of the drug metabolising cyto-chrome P450 (CYP) enzymes in the liver. In addi-tion, it may become feasible to assess the sensiti-vity of target-tissues or even become possible to change it in a desirable fashion.

Genetic variationThe whole DNA sequence is called the hu-

man genome. The arsenal of proteins is the proteome. 99.9% of the genome of two unrela-ted persons is identical, but still there is genetic variability in 0,1% of 3.3 billion base pairs (on average one variant per 1000 bases).

The most common type of variant is a single nucleotide polymorphism (SNP), a single-base difference in the DNA sequence that can be observed between individuals in the population. A polymorphism has been defined as the minor allele occurring in more than 1% of the popu-lation, whereas mutations are rare. Many muta-tions have been discovered in coding sequences of genes causing rare inherited diseases.

The specific set of alleles observed on a sin-gle chromosome is called a haplotype. Haplo-

types are formed by recombination when the paternal and maternal chromosomes exchange corresponding segments of DNA. The co-inhe-ritance of SNPs on these haplotypes leads to associations between these alleles (linkage dise-quilibrium). Not a single SNP but the haplotype is associated with the disease. This advantage leads to optimal genotyping: carefully chosen SNPs in a specific region will provide enough information to predict much of the information about the remaining SNPs in that region. The-se SNPs are called ‘tagSNPs’ and are used to screen the whole genome (Burton et al; 2005).

The human genome is diploid (one paternal and one maternal allele). A SNP can be pre-sent on 0, 1 or 2 alleles. If an individual has no polymorphism on both alleles, this individual is called homozygous wildtype. One speaks of homozygous mutant if both alleles are affected. An individual with one wildtype and one variant allele is heterozygous. A SNP could lead to no functional enzyme activity, decreased enzyme activity or increased activity. To simplify different combinations the term semi quantitative gene dose (SGD) is introduced. Functional alleles have a SGD of 1, completely dysfunctional alleles 0 (e.g. CYP2D6*4) and 0,5 for variant alleles with decreased enzyme activity (Steimer et al; 2004).

Sources of VariationThe major causes of inefficient drug treatment

are heterogeneity in disease, variations in drug disposition (pharmacokinetics) and drug res-ponse (pharmacodynamics). Figure 1 shows the relationships in relation with the drugs response / therapy outcome and the targets we can use to optimise pharmacotherapy. In the following sections we will present some illustrative exam-ples of genetic variability with practical conse-quences for the quality of pharmacotherapy.

Heterogeneity in diseaseOne of the interesting examples of diseases

showing the importance of genetic heteroge-


neity is Alzheimer-disease. Currently, we know that at least 3 gene-mutations are involved. In addition, there are polymorphisms in susceptibi-lity genes. Such genes may not cause the disease themselves but may make an individual more sensitive to acquire the disease if conditions make this permissive.

The E4 variant of APOE (apolipoprotein E) is associated with an increased risk of Alzheimer disease. Homozygosity of the E4 allele increases the risk of Alzheimer by a factor 33 in Japane-se, 15 in Caucasians and 6 in African Americans. Although this increased risk is known for 12 years, its identification did not help to develop effective medicines or prevention strategies.

Alzheimer is also an illustrative example to show heterogeneity in drug response. When the cholinesterase-inhibiting drug tacrine was investigated in clinical trials, the overall efficacy

was disappointing: only about 1/3 of the patients benefited from the drug, in 1/3 there was no apparent effect and the drug had to be discon-tinued in another 1/3 due to side effects. Only later (when the drug was already dead) it was found that patients with a ApoE 2/3 genotype showed a 80% response while the ApoE 4 ge-notype predisposed for no effect / worsening of the disease and suffering from side effects. This example shows the potential promise of genome technology.

Some drugs are very efficacious in some pa-tients, but not in others. But how can we learn this beforehand? That means that we have to study the origins of variability in drug response in more detail, and these may have to do with disease state, pharmacokinetics and pharmaco-dynamics.

On the other hand success stories are also

Figura 1. Variability in drug response scheme.

Individually optimised pharmacotherapyWith the aid of pharmacogenetic profiling

Heterogeneity in disease e.g.• Genetic variability in patients• Genetic diversity in infective agents

Heterogeneity in pharmacodynamics e.g. • Drug targets (e.g. receptors)• Dose-response relationship• Interactions• Side effects

Heterogeneity in pharmacokinetics e.g.• Absorption: active (PgP), passive• Distribution: active, passive, compartments• Metabolism: e.g. cytochrome P450• Elimination: renal, hepatic

DiagnosisIncl. genetic profiling

Drug selection

Dosage adjustment and monitoring

Response/Outcome


known. The monoclonal antibody trastuzumab has a high affinity for the HER2 transmembrane protein. HER2 (human epidermal growth factor) is a member of the epidermal growth factor re-ceptor (EGFR) family of tyrosine kinases and is in-volved in regulation of cell proliferation. In patients with overexpression of HER2 or an amplification of the gene, breast cancer is more aggressive: enhanced growth and proliferation, increased in-vasive and metastatic capability and stimulation of angiogenesis. In these patients treatment with the selective HER2-antibody trastuzumab leads to a response rate of 34%. In combination with catatonic agents the response rate is further in-creased (Hortobagyi et al; 2005).

Heterogeneity in Pharmacokinetics

Absorption/P-glycoprotein and Multi ATP-binding cassette, sub-family B member 1 (ABCB1) Genes

The P-glycoprotein efflux pump, which is en-coded for by the ABCB1 gene, plays an impor-tant role in the export of substances from the inside of cells and from membranes to the out-side. P-gp (P-glycoprotein) protects cells from toxic substances and many drugs by permitting or inhibiting transportation through the intesti-ne and other epithelial barriers. To date > 100 variants of the ABCB1 gene have been disco-vered. Not all these SNPs lead to an effect on PGP; most of them are intronic or non-coding. Of the 15 most common variants the C3435T mutation at exon 26 is well known. This silent mutation leads to an alteration in the effect of PGP. The TT genotype (homozygous variant alle-le) is associated with a twofold lower ABCB1 expression level in the duodenum compared with the CC genotype (wildtype) and resulted for instance in a higher digoxine plasma concen-tration (Kerb; 2006).

HIV-protease inhibitors are known substrates of PGP resulting in a low bioavailability and a limi-ted penetration in targets. The presence of one T

allele at the C3435T polymorphism predicts lower plasma concentrations of nelfinavir, efavirenz (Fe-llay et al; 2002) and atazanavir (Rodriguez-Novoa et al; 2007). These findings are contradictory, sin-ce the C >T change is associated with a decrea-sed PGP activity. A possible explanation is that CYP3A4 activity could be increased in patients with ABCB1 polymorphisms, leading to lower plasma concentrations of atazanavir, which is me-tabolized by CYP3A4 (Ma et al;2007).

The frequency of the TT genotype is very low in Africans as compared to Caucasians (25%), which partly explains the difference in response between Caucasians and black Africans to these drugs.

Metabolism/polymorphism in drug metabolising enzymes

Many drugs are metabolised by the oxidati-ve cytochrome P450-enzyme complex. One member of this family, CYP2D6, is extremely polymorphic, with more than 75 allelic variants. CYP2D6*4 is the most common variant (21% allele frequency in Caucasians), which leads to a non-functional allele. Subjects homozygous for a non-functional variant allele lack enzyme activity and are defined as ‘poor metabolisers’ (PMs). The CYP2D6 PM phenotype results in an increased plasma concentration of drugs predominantly metabolised by CYP2D6 e.g. tricyclic antidepres-sants, codeine and tramadol. In case of a narrow therapeutic window this will lead to toxicity.

CYP2D6 gene duplication/multiplication oc-curs relatively infrequent among Northern Europeans (1-2% of the Swedish population), but increases in Southern direction: 7-10% of Spaniards and Southern Italians, and as high as 29% of Ethiopians. Such subjects can have an inadequate response to standard doses of drugs metabolised by CYP2D6 and are called ‘ultra ra-pid metabolisers’ (UMs) (Dahl et al; 2002).

These polymorphisms are illustrated in figure 2. The following case is a nice example showing

the influence of CYP2D6 polymorphisms in daily practice (Gasch et al; 2004).


A 62-year-old man with a history of chronic lymphocytic leukaemia had complaints of fever, fatigue, dyspnoea and a cough. Therapy with ce-ftriaxone, clarithromycine and voriconazol was initiated for pneumonia infected by yeast. The patient received a modest dose of codeine (25 mg 3 times daily) to relieve the cough. After 4 days, the patient’s level of consciousness dete-riorated. His neurological status (a score of 6 on the Glasgow Coma Scale) was poor. After the administration of naloxone, the patient re-covered rapidly. Extremely high plasma levels of codeine and morphine were found despite of the modest dose of codeine. After analysis of the patients CYP2D6 genotype, the patient seemed to be an ultrarapid metaboliser. Along with the CYP2D6 gene duplication, a drug inte-raction may have contributed to the observed toxic effects. Voriconazole and clarithromycine both inhibit CYP3A4, thereby decreasing the amount of the metabolite norcodeine (and in-

creasing codeine concentration). At last due to renal failure the excretion of the morphine me-tabolites was reduced, leading to the observed respiratory problems.

A similar example demonstrating the impact of the CYP2D6 genotype on codeine toxicity was published in the Lancet (Koren et al; 2006). A full term baby boy died due to an increased morphine concentration (70 mg/ml in stead of 0-2,2 ng/ml). The mother, who was breast-feeding her child, was prescribed codeine in a standard dose. After genotyping for CYP2D6, the mother seemed to be an ultrarapid meta-boliser (gene duplication). This genotype leads to increased formation of morphine from co-deine, which she passed on to her boy.

Tamoxifen is one of the most widely used drugs for treatment of post-menopausal wo-men with oestrogen receptor-positive breast cancer. CYP2D6 plays an important role in the formation of endoxifen, the most active meta-

Figura 2. Schematic presentation of the relationship between the debrisoquine metabolic ratio and CYP2D6 genotype in Caucasians (Dahl et al; 2002).

UM

EM homozygous

xx

xx

EM heterozygous

MR = 12,6PM

0,01 0,1 1 10 100 1000

( )13

UM

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

N.o

of in

divi

dual

s


bolite of tamoxifen. Goetz et al. were the first to describe that tamoxifen users with decreased CYP2D6 enzyme activity, due to homozygous carriership of CYP2D6 variant alleles or the in-take of potent CYP2D6 inhibitors, had a higher risk of breast cancer recurrence and disease free survival (Goetz et al; 2007.).

In the Rotterdam study we found similar re-sults. Breast cancer mortality was significantly higher in tamoxifen users with the CYP2D6*4/*4 genotype (HR=4.1, CI 95% 1.1-15.9, p = 0.041) compared to extensive metabolizers. A trend test revealed a significant increased breast can-cer mortality risk with a hazard ratio of 2.0 per additional CYP2D6*4 variant allele (p = 0.015) (M. Bijl, PhD-Thesis Erasmus University Rotter-dam, 2009). Genotyping before the start of en-docrine treatment in breast cancer could iden-tify PMs who will better respond to aromatase inhibitors than to tamoxifen therapy. CYP2D6 EMs could be prescribed tamoxifen, since aro-matase inhibitors are more expensive.

Polymorphisms in another member of the cytochrome P450 family, CYP2C9, are asso-ciated with overanticoagulation. Anticoagu-lants like acenocoumarol, phenprocoumon and warfarin are metabolized by CYP2C9. Com-pared to CYP2C9 wild type patients, carriers of CYP2C9*2 or *3 have an increased risk of overanticoagulation with coumarins (Visser et al; 2004, Schalekamp et al; 2007). Together with polymorphisms in the VKORC1 gene (vitamin K reductase complex subunit 1) a large part (up to 40%) in the interindividual variability can be explained.

Notwithstanding proven evidence that geno-typing contributes to better drug response, ge-notyping is hardly performed in clinical practice to predict drug response. It is mostly carried out retrospectively to explain clinical symptoms as seen in the cases mentioned above.

Thiopurine S-methyltransferase (TPMT) geno-typing is a notable exception: it is clinically used to prevent life-threatening myelosuppression in patients with acute lymphoblastic leukaemia,

treated with mercaptopurine (Puri-Nethol®) or azathioprine (Imuran®).

The immunosuppressant thiopurine drugs mercaptopurine and azathioprine are metabo-lised by thiopurine S-methyltransferase (TMPT) and xanthine oxidase (XO). Variation in TPMT is of much greater impact than XO. Three im-portant SNPs are found in the TPMT gene: TPMT*3A, *3B and *3C. The presence of one of these mutations leads to reduced enzyme activity. Subjects homozygous for the variant allele TPMT*3A (0,3% of the Caucasians) are of increased risk of myelosuppression, a known side effect of thiopurine drugs. *3C is the most common variant allele in Asian subjects, while *3B is very rare (Wang et al; 2006).

Phenotypic assays for TPMT, performed on red blood cells, have also been developed. However, the phenotypic assay is labour-intensi-ve, requires qualified knowledge and expensive instruments.

Some authors have doubts about the benefit of genotyping, since TPMT polymorphism fails to explain all cases of myelosuppression. However, certainty is rare in clinical medicine. TPMT geno-typing predicts myelosuppression and is proven to be cost-effective (van den Akker et al; 2006).

Heterogeneity in Pharmacodynamics

Pharmacodynamics of a drug is regulated by the whole genome. We know for example that drug response depends on the presence of sufficient numbers and sensitivity of receptors. Receptors are proteins that are encoded for by genes. This means that the gene expression level determines the amount of receptors and is thus closely associated with drug response. Gene ex-pression itself however, is determined by several transcriptional, translational and post-translational regulatory effects of other genes. In this way the whole genome is involved in drug response.

Small genetic variations, such as variability in receptors, can have a large impact on the


pharmacodynamics of a drug. It is no surprise that the list of drugs that are subject to such an effect is increasing almost daily.

In some cases a SNP or a point mutation can modify drug response. Genetic variability in receptors is either inherited or acquired. Re-sistence to the tyrosine-kinase inhibitor imati-nib is for example associated with mutations in the kinase domain of BCR-ABL that interfere with drug binding. The acquired mutation in a threonine residue of the ABL kinase is the cause of resistance to imatinib in about 67% of the cases (Gorre et al;2001). Increased expression of BCR-ABL from genomic amplification could also be a mechanism for resistance.

One of the first well documented examples of genetically determined pharmacodynamics relates to the efficacy of cholesterol synthesis-inhibitors of the statin-type. Carriers of so called B1-alleles on the receptor benefit more from statin-therapy than individuals that have just one allele (Kuivenhoven et al;1998).

Another example relates to the tachyphylaxis of beta-2-agonists, a well known effect from drugs like salbutamol. The ß2-receptor has three main polymorphisms and two of them (Arg16Gly and Gln27Glu) are found in the general population. The two SNPs are in strong linkage disequilibrium and can be considered together in haplotypes. It is demonstrated that homozygous carriers of Gly16/Gly16 desensitise faster than Arg16/Arg16 carriers. Arg16Gly and Gln27Glu are associated with a decreased effect of ß2-agonists.

Patients with variant alleles of the promo-ter gene of ALOX5 (5-lipoxygenase) have a diminished gene transcription, and therefore a decreased receptor activity, which leads to a decreased response to treatment with leuko-triene antagonists (like montelukast) (Drazen et al;1999).

Another interesting example relates to the efficacy of antibodies towards the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) in the treatment of colon-cancer. On average such drugs show only low response rates, and this appears to be

related to the genotype of a downstream sig-nal peptide K-RAS, which acts like a switch. The wild type protein activity can be reduced with VEGF antibodies like cetuximab or panitumumab. However, if the K-RAS gene is mutated [which is the case in ca. 40 of patients], the switch is no longer functional, which renders the antibo-dy ineffective and treatment with this expensive drug useless. In many countries in Europe colon-cancer patients are tested for K-RAS genotype status before start of treatment with an VEGF-antibody, and reimbursement of the drug is made dependent on the test outcome.

Detecting genetic variation One of the most frequently used techniques

in identifying genetic variability is the Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR is a simple method by which a part of DNA or a transcript (RT-PCR) is amplified. Subsequent sequence analysis on the PCR product will reveal the presence of muta-tions or polymorphism. PCR is not only used to detect sequential variability but also variability in gene expression. By applying real-time PCR, we are able to measure gene expression precisely. In this way single nucleotide polymorphism can be detected in genes encoding drug metabolising enzymes, transporters and receptors.

Micro-arrays have been developed to detect many SNPs in a short time period. The Ampli-chip CYP450 GeneChip® is an oligonucleotide microarray hybridization method for genotyping CYP2D6 and CYP2C19. This test distinguishes 29 polymorphisms in the CYP2D6 gene inclu-ding gene deletion (*5) and gene duplication. In this way the phenotype of a patient (PM, IM, EM or UM) can be predicted. For CYP2C19 the test discriminates between PM and EM by determining 2 common polymorphisms in CYP2C19 (*2 and *3). The main disadvantage of the test is its price (± 500 euro per patient). It is expected that these costs will decrease due to a higher demand and mass production.


For detecting disease related genes ‘whole ge-nome screening’ can be used. Commercially avai-lable kits based on hybridisation technology (Illu-mina®, Affymetrix®) contain more than 550 000 tagSNP’s evenly distributed across the genome (1 tagSNP every 5.5 Kb). None of these arrays covers all variation in the human genome, but come close by using haplotype tagging SNP’s.

Influence on drug discovery Pharmacogenomics can enhance drug disco-

very in two ways:

• Identification of new drug targets• Subpopulation-specific drug development

Pharmaceutical companies are interested in ca-rrying out smaller, less expensive trials using phar-macogenetics. Identification of a genetic variant associated with drug response can lead to smaller phase III studies involving only those individuals who are more likely to respond that lead to improved efficacy, decreased toxicity and less side effects. Although pharmacogenomics could lead to smaller treatment groups, the increased effectiveness of the targeted drug could provide the pharmaceutical industry more sales. The uncertainty about adver-se drug reactions is reduced, encouraging many more physicians to prescribe and patients to use the drug.

Many genetic variants vary in frequency among ethnic populations. If a marker for drug response has a low prevalence in a certain po-pulation, that population might be excluded from research or treatment.

An example is the drug BiDil, a combination of isosorbide dinitrate and hydralazine. This drug was not sufficiently effective in treating heart fa-ilure in two large ethnically mixed clinical trials. But in a subpopulation of African Americans BiDil decreased the risk of death by 43%. The FDA approved this drug for a single racial group (Service; 2005).

ConclusionPharmacogenetics constitutes a rapidly evol-

ving research field. Thousands of studies are pu-blished annually with great promise. However, incorporation of these discoveries in medical practice has been slower than expected.

The implementation of these promising pros-pects are complicated by several factors. Diagnos-tics have to be changed in such a way that genoty-ping of relevant PK/PD systems is included. Who will translate this kind of sophisticated information to a prescribing physician? By now, proper dosing and avoiding drug interactions is already a for-midable task. The number of disease-targets will become almost incomprehensible for the average physician. That means that an incredible informa-tion dissemination barrier has to be solved. As a result, we foresee that a new specialty will deve-lop: genetic information specialist. Not aimed at diagnosing inherited diseases but at inherited risk factors and drug-treatment success-factors. And last but not least: the costs of these developments – both for diagnosis and for more individualised drug preparations – will be impressive. There will be no way to deny patients the results of the-se new developments because they may prove highly efficacious and possibly also cost-effective (although very costly on an individual basis).

Hospital pharmacists and other healthcare professionals should be aware of the upcoming developments and should prepare both for a proper information structure and sufficient ex-pertise to advise doctors in the rapidly appro-aching era of genetically based medicine (phar-macogenetics). And of course of the formidable resources needed to pay for this.

Pharmacogenetics is a new cornerstone in medicine!

AcknowledgementWe wish to thank M.L. Becker PhD and phar-

macist, for critically reading the manuscript.


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Biología de las células madre 39

ResumenDos características son definitorias de una

células madre (CM), permitiendo además di-ferenciarlas de la gran mayoría de las células constitutivas de un organismo adulto: a) poseer una capacidad muy importante de proliferación, pero manteniendo su estadio indiferenciado (au-tomantenimiento), y b) ser capaces de generar progenie, perteneciente a varios linajes celulares del organismo (pluripotencia). El control de su capacidad de proliferación versus diferenciación se produce en localizaciones especializadas, de-nominadas nichos, y alteraciones de este meca-nismo básico pueden estar implicadas en muchas patologías humanas. El potencial terapéutico que encierra el concepto de célula madre –en su conjunto– es enorme, pero debemos de ser capaces de explotarlo adecuadamente.

Introducción¿Qué es una célula madre? ¿Dónde podemos

encontrar las células madre? ¿Para qué sirven las células madre en el individuo adulto? ¿Cuantas tenemos? ¿Qué podemos esperar de la revolu-ción tecnológico-terapéutica que se nos aveci-na? Buenas preguntas que tienen una respuesta cambiante cada semana que transcurre.

El misterio de la vida se concreta, desde una perspectiva meramente biológica, en cómo la complejidad de un organismo se encuentra pre-

programada en un minúsculo embrión (zigoto). Cuanto más ampliamos nuestro conocimiento molecular y celular, más lejos nos parece estar del maravilloso modelo de regulación (a cor-to, medio y largo plazo) que se encierra en esa célula.

El zigoto, tras su implantación, y con la ayu-da del ambiente propicio aportado por las es-tructuras maternas, desarrolla todo su potencial biológico, generando una constelación estruc-turada de tipos celulares cuyo resultado final es un nuevo organismo.

Durante los estadios tempranos del desarro-llo embrionario se pueden identificar y aislar células con capacidad «totipotencial», término que se emplea para indicar que a partir de ellas se pueden generar todos los tipos celulares del organismo adulto. Estas células totipotencia-les embrionarias se denominan células madre (también conocidas como células stem –del inglés–, o células troncales). En ratón, hace más de 20 años (Martín, 1981; Evans et al., 1981; Bradley et al., 1984) aislaron y caracterizaron líneas celulares (fig. 1) con estas características (embryonic stem cells, ES), obtenidas de la masa interna de embriones en estadios tempranos de desarrollo, denominado blastocisto (Bongso et al., 1994).

La caracterización inicial de estas células ma-dre permitió el establecimiento indefinido in vi-tro de líneas celulares capaces de dar origen a un ratón indistinguible de sus congéneres, siendo además capaces de trasmitir su información en

4 Biología de las células madreAntonio Bernarddepartamento de CardIología regeneratIva

Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC)


la línea germinal. Posteriormente se demostró la posibilidad de su manipulación génica convir-tiéndose en células clave para la generación de modelos animales capaces de desarrollar enfer-medades análogas a las presentes en humanos para el estudio de enfermedades humanas y en una herramienta insustituible para desvelar la función de los genes in vivo. La trascendencia de este cuerpo de trabajo para el desarrollo de la

biomedicina moderna ha sido reconocida me-diante la concesión del premio Nobel de Fisio-logía o Medicina (2007) a los doctores Mario R. Capecchi, sir Martin J. Evans y Oliver Smithies.

Sin embargo, el concepto de CM se origina mucho antes (Ferrebee et al., 1958), y deriva de los trabajos pioneros que permitieron de-sarrollar el trasplante de médula ósea y salvar muchas vidas. La médula ósea es el órgano don-

Figura 1. Esquema de la obtención de animales manipulados genéticamente mediante la utilización de células stem embrionarias (mES).

Hembra seudopreñada receptora CD I–blanco–

Ovocito fertilizado (129Svj)

Blastocistos (CD I)ES (129Svj)

Blastocistos

Masa interna del blastocisto

Línea de células ES (129Svj) –pardo–

Manipulación genética/

caracterización

Microinyección o agregación

Implantación

Transmisión a línea

germinal?

Línea de ratón manipulada genéticamente:

• Estudios básicos• Modelos de enfermedad


de se producen las células sanguíneas a partir de distintos «progenitores» mediante una orga-nización piramidal (fig. 2) que, tras ejecutar un complejo programa de desarrollo, originan los cientos de millones de células funcionales que necesita el organismo diariamente en su sangre y órganos linfoides secundarios (donde madura la respuesta inmunitaria).

El «truco» es que el funcionamiento de por vida de este dinámico sistema (linfohemato-poyético) está garantizado si se consigue man-tener un pequeño número de células madre (0,01-0,1% de la celularidad de la médula ósea) alojadas en lo más íntimo de los huesos del in-dividuo. Si conseguimos extraer y trasplantar un número suficiente de estas células madre hematopoyéticas, conseguiremos que el orga-nismo receptor pueda reconstituir y mantener su sistema linfohematopoyético totalmente fun-cional durante el resto de la vida. Estos trabajos pioneros merecieron la concesión del premio Nobel de Fisiología o Medicina (1990) a E. Don-nall Thomas.

En este sentido amplio, y desde la década de 1960, el estudio del sistema linfohematopoyé-tico y el transplante de medula ósea ha sido la escuela donde se han creado y desarrollado la gran mayoría de los conceptos que hoy día se manejan sobre la biología y fisiología de las cé-lulas madre. En términos generales, el trasplante de médula ósea, la reparación de cartílago ar-ticular y el trasplante de piel artificial a grandes quemados (fig. 3) se pueden considerar los ver-daderos antecedentes de la actual revolución en medicina megenerativa.

Definición de célula madre

Las características más importantes que permiten definir a las CM y diferenciarlas de la gran mayoría de las células constitutivas de un organismo adulto son dos. La primera es que en condiciones de cultivo adecuadas,

Figura 2. Esquema de la organización piramidal del sistema linfohematopoyético.


tienen una capacidad ilimitada de dividirse; así una CM es capaz de generar un número inmenso de células, manteniendo sus mis-mas características –por el contrario, todas las demás células de las que todos estamos constituidos, las denominadas células somá-ticas, poseen un número limitado de divi-siones (se calcula que sólo pueden dividirse alrededor de cincuenta veces, al cabo de las cuales mueren)–. La segunda es que las CM son capaces de generar varios de los linajes celulares de los que está constituido un indi-viduo: células de corazón, de hígado, de riñón, neuronas, músculo, etc.

Hasta el momento se han identificado cé-lulas con características de CM de 4 orígenes distintos: de origen embrionario, células madre germinales, células madre procedentes de car-cinomas embrionarios (terato-carcinomas) y células madre procedentes de tejidos somá-

ticos, y aisladas de individuos adultos, las que denominaremos CMA (células madre adultas). En la actualidad, aunque todavía se encuentran en fase de estudio y evaluación, estas fronteras estrictas han desaparecido debido al desarrollo de la tecnología de reprogramación genética. Esto permite obtener células con propiedades muy similares a las embrionarias (iPS; induced Pluripotent Stem Cells) a partir de numerosos tipos celulares adultos (p. ej., Park et al; 2008) que incluyen fibroblastos, queratinocitos, MSC, etc. Aunque las posibilidades abiertas son enormes, quedan por resolver varios temas técnicos y garantizar su bioseguridad. Pero aun más interesante es el hecho de que con esta misma técnica de reprogramación genética se han conseguido obtener de forma directa cardiomiocitos a partir de fibroblastos (Ieda et al., 2010) Claramente, el sinfín de posibilidades que se abren está aún por desarrollarse.

Figura 3. Antecedentes de la medicina regenerativa.

Transplante de médula óseaReparación cartílagoPiel. Quemados

Medicina regenerativa: de la realidad clínica actual a un futuro prometedor

Sistema linfohematopoyético


Hasta hace una década, las únicas CMA de mamíferos cuya existencia había sido demostra-da de forma concluyente eran las células ma-dre hematopoyéticas (CMH, o HSC, del inglés Hematopoietic Stem Cells), responsables de la producción de todos los linajes sanguíneos. Se postulaba la existencia de CMA en otros tejidos altamente proliferativos, como la piel y el híga-do, pero el concepto genérico de «célula madre adulta» como tipo celular existente en todos los tejidos es un paradigma bastante reciente. En la actualidad, sabemos que la diversidad de CMA equivale prácticamente a la variedad de tejidos del organismo adulto. De hecho, probablemente es mayor, pues algunos tejidos, cómo la médula ósea, contienen más de un tipo de CMA.

En la división celular típica, las dos células hijas generadas son equivalente entre sí y a la célula progenitora de la que derivan (división simétri-ca). Posteriormente, las células descendientes (progenie) pueden evolucionar por distintas vías, bien siguiendo unos programas determinados de diferenciación o bien pueden mantener su potencial inicial. El mantenimiento de una rela-ción adecuada entre la tasa de proliferación y di-ferenciación permite en la mayoría de los tejidos establecer un control homeostático de su forma

y tamaño, evitando un crecimiento descontrola-do que se asocia, p. ej., con los procesos tumo-rales. Por el contrario, las CM parece que están reguladas por un mecanismo de división conser-vador (asimétrico), de forma que en su división se genera una célula equivalente a la original y otra que da cuenta del resto del programa de diferenciación. Este mecanismo de «automante-nimiento» (en inglés, self-renewal) permite con-trolar de forma estricta el número de CM que existe en un determinado órgano (fig. 4).

Se ha asumido que las CM presentes en el organismo adulto (CMA) deben de poseer, en términos generales, un menor potencial que las presentes durante el desarrollo embrionario y fetal. Sin embargo, aunque en lógica es fácil asu-mir este principio, demostrarlo es mucho más complicado. Además, al menos en el organismo adulto, no todas las células madre de un órgano participan activamente en el proceso de rege-neración y mantenimiento de la funcionalidad. Sólo unas pocas están contribuyendo de forma simultánea a la creación de un tejido, en un mo-mento dado. La mayoría se encuentra en un es-tado de reposo (conocido como quiescencia), lo que las protege tanto de agresiones externas, físicas o químicas, como del proceso de enve-

Figura 4. Esquema comparativo de la división simétrica en comparación con la división asimétrica.

d d p p dd

División simétrica División asimétrica

GI/S G0


jecimiento celular. Cuando las CMA responsa-bles en un momento dado de la regeneración tisular agotan sus posibilidades, son sustituidas paulatinamente por la progenie de otras nuevas. Las nuevas células así generadas representan di-ferentes clones y el fenómeno responsable del proceso se denomina «sucesión clonal».

En definitiva, una CM se define, funcional-mente, como una célula capaz de «automan-tenerse» (mediante el mecanismo de división asimétrica) y con potencial de generar (median-te diferenciación de sus células descendientes) varios linajes celulares (pluripotencia) o todo un organismo (totipotencia). Por lo tanto, no todas las CM son equivalentes y aunque la mayoría de las veces se definen por su origen (embrio-narias, adultas, etc.) no siempre estos términos equivalen necesariamente a un mayor potencial de desarrollo o, incluso, de potenciales aplica-ciones biomédicas. Los mecanismos por medio de los cuales ocurre esta diferenciación, los ge-nes implicados y la posibilidad de incrementar la eficiencia en su aislamiento y/o caracterización constituyen una de las áreas más relevantes en la actualidad de la biología y de la biomedicina.

Células madre adultas. Tipos y origen

El origen embrionario de todos los tipos de CMA es, en última instancia, el mismo que el de los restantes tipos de células somáticas presen-tes en el organismo adulto, es decir, las células pluripotentes de la masa interna del blastocisto. Sin embargo, es muy poco lo que se conoce de los precursores específicos de cada tipo de CMA, más allá de la hoja embrionaria a la que pertenecen (ectodermo, mesodermo o endo-dermo).

En el organismo adulto la inmensa mayoría de sus células se encuentran en un estado, que denominamos «postmitótico», en el que rara-mente se dividen y multiplican. Están ejerciendo las funciones para las que han sido programa-

das y sólo en casos excepcionales (daños de diversa índole) salen de su letargo y, en la me-dida que les permita su entorno y su propio potencial, repararán el daño producido. A esta regla general sólo escapan cuatro órganos que se encuentran en una situación de alta actividad fisiológica: a) la médula ósea, por la exigente de-manda de células sanguíneas y mediadoras de la respuesta inmune; b) las gónadas, que generan constantemente células germinales; c) el hígado, que tiene una gran capacidad de regeneración, y d) los epitelios, sobre todos el intestinal y el epidérmico, que están en una continua renova-ción. En los cuatro órganos existen poblaciones con características de CM, específicas de tejido, que dan justificación a dicho potencial. En los últimos años el panorama respecto al cerebro ha cambiado dramáticamente. Se creía que el número de neuronas y la estructura cerebral quedaba determinado en los primeros años de vida, y que posteriormente sólo se producían re-estructuraciones y perdida de conexiones (plasticidad neuronal). Sin embargo, actualmente sabemos que el cerebro es también un órgano muy activo que puede generar nuevas neuro-nas (se ha estimado que puede llegar a producir 105 al día). Estas células tienen que producirse a partir a células madre alojadas en el cerebro.

De manera transitoria, en el momento del par-to una gran proporción de células hematopoyé-ticas se encuentran en la sangre contenida en el cordón umbilical y en la placenta. Si se recoge entonces adecuadamente la sangre placentaria se puede obtener una población muy sustancial de células madre hematopoyéticas, con la que se han establecido los denominados Bancos de Sangre de Cordón. Esta fuente es ideal para el trasplante en niños o adultos de bajo peso con enfermedades hematológicas severas.

Células madre linfohematopo-yéticas (CMH)

Como ocurre con muchos otros aspectos de su biología, el origen embrionario de las CMH es el mejor estudiado de todos los tipos de


CMA. Desde principios del siglo XX se cree que las CMH derivan de un precursor más pri-mitivo, común con el linaje endotelial, al que se denomina hemangioblasto, cuya existencia ha sido confirmada por diversos estudios expe-rimentales en distintos estadios de desarrollo (Pelosi et al., 2002). La hematopoyesis se inicia en el embrión de mamífero en el saco vitelino (semana 5 de gestación en humanos; d7-7,5 en ratón). Sin embargo, los precursores hematopo-yéticos del saco vitelino sólo son los responsa-bles de la hematopoyesis embrionaria, y no dan origen posteriormente a las CMH presentes en el adulto. De hecho, la capacidad de los progeni-tores primitivos (CD34+/CD117+) aislados del saco vitelino para contribuir a la hematopoyesis en adultos es limitada. Las CMH responsables de la hematopoyesis definitiva en adultos se ori-ginan en la región del mesodermo denominada aorta-gónada-mesonefros (AGM), derivada de la esplacnopleura para-aórtica. Tras el saco vi-telino, la hematopoyesis tiene lugar en el bazo, hígado y nódulos linfáticos, hasta el momento en que se desarrolla la médula ósea, que even-tualmente asume la tarea de producir células sanguíneas para todo el organismo adulto.

Las CMH de la médula ósea se hallan en una concentración aproximada de 1 por cada 10.000 células mononucleares; también pueden obtenerse de la sangre periférica, ya que son capaces de abandonar la médula ósea y pasar a la circulación sanguínea, en un proceso de-nominado movilización. Las CMH se caracteri-zan por su pequeño tamaño, una gran relación núcleo:citoplasma, la ausencia de marcadores de linaje (Lin-), un bajo marcaje con tintes vi-tales como Hoechst 33342 y la presencia de varios marcadores de superficie, entre los que se encuentran (humano): CD34, CD90, CD117 (c-kit) y CD133. Una población celular altamen-te enriquecida con CMH puede obtenerse me-diante selección por citometría de flujo de célu-las que expresan alguno de dichos marcadores (tradicionalmente CD34). Sin embargo, ninguno de ellos por sí solo, ni en combinaciones simples, permite identificar específicamente una CMH.

CMA no-linfohematopoyéticas

El mayor problema actual al que se enfrenta el biotecnólogo, el ingeniero genético o celular, o el clínico, que pretenden utilizar CM con fines terapéuticos, es que, en la mayoría de los ca-sos (hay notables excepciones), estas CM una vez extraídas de su entorno natural tienen una gran tendencia a «diferenciar» perdiendo, total o parcialmente, su «toti- o pluripotencia». Este problema parece estar relacionado con el bajo nivel de conocimiento de su regulación. En el momento que obtengamos la información ade-cuada, se podrán mantener ex vivo en mejores condiciones que permitan preservar su poten-cial, aspirando incluso a expandir su número para llegar a situaciones óptimas para su aplica-ción clínica. Esto debería de ser posible para to-dos los tipos de CMA que se conocen (fig. 5).

Células madre mesenquimales (CMM)

Además de CMH, la médula ósea contiene al menos otro tipo de CMA, denominadas cé-lulas madre mesenquimales (CMM, o MSC, del inglés Mesenchymal Stem Cells), las cuales son células fibroblastoides precursoras de todos los tipos de tejidos conectivos no hematopo-yéticos (hueso, grasa, cartílago, etc.) (Pittenger et al., 1999). Las CMM no se encuentran sólo en la médula ósea, sino también en el estroma de virtualmente todos los órganos, por ejem-plo en el tejido adiposo subcutáneo (Zuk et al., 2002) o el cartílago articular (De la Fuente et al., 2004). Las CMM se obtienen generalmente mediante selección por adherencia a plástico de cultivo celular, pues son capaces de adherirse y crecer en condiciones en las que otros tipos ce-lulares habitualmente no proliferan. No poseen ningún marcador específico, pero presentan un perfil homogéneo y reproducible de antíge-nos de superficie, que habitualmente se define como: CD9+/CD13+/CD29+/CD14–/CD34–/CD44+/CD45–/CD90+/CD105+.

Debido a su relativamente sencilla obten-ción, su elevada capacidad de proliferación ex vivo (a diferencia de las CMH) y a su amplio


potencial de diferenciación, las CMM son uno de los tipos de CMA más empleados en te-rapia celular. Además, en determinadas condi-ciones experimentales, las CMM han mostrado la capacidad de diferenciarse en linajes celula-res no conectivos, tales como el endotelial y el neuronal. Por último, una propiedad espe-cialmente interesante de las CMM, es que son capaces, tanto in vitro como in vivo, de inhibir la respuesta inmunitaria (Rasmusson et al., 2006). Esta capacidad de inmunorregulación incluye la inhibición de la activación de células T, B, NK y de la maduración de células dendríticas, así como la protección frente a patologías infla-matorias y/o autoinmunes, incluido el rechazo a trasplantes.

Células madre epidérmicas (CME)

Fuera de la médula ósea, uno de los teji-dos donde se suponía desde hacía décadas la existencia de CM, dado su carácter altamente proliferante, era la epidermis. En la actualidad sabemos que existen células madre epidérmicas (CME o EpSC, del inglés Epidermal Stem Cells) al menos en dos localizaciones distintas. En pri-mer lugar, en la membrana basal interfolicular se estima que entre el 1 y el 2% de las células son CME, con fenotipo p63+, las cuales son capaces de generar queratinocitos que, al migrar hacia la superficie, dan lugar a la formación de la epider-mis (Pellegrini et al., 2001). En segundo lugar, en el interior de los folículos pilosos, en concreto

Figura 5. Células madre. Origen, ontogenia y tipos.

CM tumorales

Tejid

os e

mbr

iona

rios

o a

dulto

sTe

jidos

ext

raem

brio

nari

os

Nacimiento

CM embrionarias

CM fetales

CM adultas

CM Membrana amniótica

CM Líquido amniótico

CM Cordón umbilical

CM Sangre de cordón umbilical

CM linfohematopoyéticasCM mesequimalesCM epitelialesCM neuroepitelialesCM germinalesCM intestinalesCM neuralesCM de músculo esquelético

(satélite)CM hepáticas (ovales)CM endotelialesCM cardiacasCM pancreáticasCM renalesCM de neumocitos

MAPC??


en la región denominada bulge, se ha descrito la existencia de una población de células madre más primitivas, con fenotipo CD34+/queratina 15+/integrina α6+, capaces de dar lugar no sólo a la epidermis propiamente dicha, sino también a los folículos y a las glándulas sebáceas. En el hombre, sin embargo, la identificación de las CME interfoliculares resulta más difícil, y se han propuesto varios fenotipos diferentes para las CME del bulge, siendo uno de ellos CD200+/CD34–/CD24–/CD71–/CD146– (Ohyama et al., 2006). Al igual que ocurre con otros tipos de CMA, existen estudios que indican que las CME muestran plasticidad en determinadas condicio-nes experimentales (Toma et al., 2001).

Células madre neurales (CMN)

Al contrario que la médula ósea o la epi-dermis, ambos tejidos con una elevada tasa de recambio (turnover) celular, el descubrimiento de CM en el SNC constituyó sin duda una de las mayores sorpresas de la biología en los ini-cios del presente siglo (Doetsch et al., 1999). Las células madre neurales (CMN o NSC, del inglés Neural Stem Cells) presentes en el cere-bro adulto de mamíferos tienen su origen en células de la cresta neural, y se localizan prin-cipalmente en la región subventricular y en la región subgranular del giro dentado del hipo-campo. El principal marcador de estas células es la nestina, y su aislamiento se realiza me-diante el cultivo celular en presencia de los fac-tores de crecimiento EGF y bFGF, condiciones en las que crecen en forma de agregados es-féricos en suspensión, denominados neuroes-feras. Los cultivos de neuroesferas permiten obtener grandes cantidades de CMN, capaces de diferenciarse tanto a neuronas como a glía (astrocitos y oligodendrocitos).

Otras CMA

Las CM hematopoyéticas, mesenquimales, neurales y epidérmicas son las más estudiadas y mejor conocidas hasta el momento, pero no son los únicos tipos de CM demostrados en los tejidos somáticos del adulto. Otros tipos de

CMA que han despertado un especial interés en medicina regenerativa son los siguientes:

• Células madre endoteliales. Se ha descrito la existencia de precursores endoteliales (que algunos autores consideran células madre) tanto en médula ósea como circulantes (Asa-hara et al., 1997). Estas células están relacio-nadas con las CME y han despertado un gran interés por sus posibles usos en el tratamien-to de la patología isquémica.

• Células madre de músculo esquelético. Tra-dicionalmente se han denominado células satélite, y se definen por la expresión del factor de transcripción Pax3. En ratón se ha demostrado que esta población posee el fe-notipo CD34+/CD45–/Sca1– (Montarras et al., 2005).

• Células madre pancreáticas. La evidencia ex-perimental sugiere la existencia de uno o va-rios tipos de células madre en el páncreas. Las CM capaces de diferenciarse a células beta parecen ser células presentes en los islotes y en los ductos pancreáticos positivas en neu-rogenina-3 (Seaberg et al., 2005).

• Células madre cardiacas. Diversos grupos han comunicado en los últimos años el aislamien-to a partir de miocardio de células capaces de diferenciarse a cardiomiocitos, endotelio y músculo liso, aunque aún existe controver-sia sobre su relevancia, origen y fenotipo. La mayor parte de los trabajos identifican como células madre cardiacas a las CD117+/Sca-1+ (Barile et al., 2007).

Por último, diversos trabajos han descrito la existencia de CMA «pluripotentes» (o, al me-nos, con una extensa multipotencia) en diversos tejidos de mamíferos. Destacan en este campo los trabajos de la doctora Catherine Verfaillie, en los que se describe el aislamiento a partir de la médula ósea y otros tejidos de diversas especies de mamíferos de células capaces de diferenciarse tanto in vitro como in vivo a prácti-camente todos los linajes celulares somáticos, a las cuales denominan MAPC (Multipotent Adult


Progenitor Cells), y que son similares a las CMM pero negativas para los marcadores CD44 y HLA-I (Jiang et al; 2002). Dichos trabajos, sin embargo, no han podido ser adecuadamente reproducidos por muchos grupos y, en la ac-tualidad, las MAPC se consideran en general más como el resultado de algún tipo de modi-ficación inducida por las condiciones de cultivo ex vivo que como un tipo celular presente en condiciones fisiológicas in vivo.

El concepto de nicho y el control de la autorrenovación

Las CM son, junto con las células tumorales, las únicas células de mamíferos capaces de pro-liferar y mantener su potencial de diferenciación indefinidamente. Esta capacidad de dividirse de forma ilimitada para dar lugar a otras CM equi-valentes a ellas es lo que se denomina automan-tenimiento o autorrenovación (self-renewal).

La autorrenovación es un proceso biológico de enorme relevancia, pues encierra las claves tanto de la regeneración y homeostasis tisular como del desarrollo, el envejecimiento y el cán-cer. A pesar de ello, nuestra comprensión de di-cho proceso es aún muy limitada. La mayoría de lo que conocemos acerca de los mecanismos de autorrenovación se ha averiguado en el modelo de células madre embrionarias (ESC, del inglés Embryonic Stem Cells). En dicho modelo se han identificado una serie de señales extracelulares (LIF, BMP, FGF, etc.) que contribuyen a mantener la expresión de varios factores de transcripción (Oct4, Nanog, Sox2 y otros), los cuales a su vez actúan como genes maestros que mantienen el estado pluripotente de las células (Rao et al., 2004). No se comprende muy bien el posible papel de los mencionados genes de pluripo-tencia en la autorrenovación de las CMA, pero todas las evidencias indican que son bastante específicos de ESC y que la autorrenovación en CMA es regulada principalmente por otros fac-

tores. Sin embargo, algo que tienen en común los mecanismos de autorrenovación de todas las CM, es que todos ellos dependen de un con-junto específico de señales extracelulares, que es distinto para cada tipo de CM y que incluye: señales solubles, tanto paracrinas como autocri-nas, interacciones con la matriz extracelular, e interacciones célula-célula. Según su efecto so-bre las células, dichas señales mantenedoras de la autorrenovación pueden clasificarse en:

• Señales de proliferación: inducen la división celular.

• Señales de quiescencia: inducen la ralentiza-ción del ciclo celular en G0, estado en el cual la célula puede mantenerse durante periodos prolongados sin diferenciarse ni sufrir daños genéticos.

• Señales inhibidoras de la diferenciación: contri-buyen a mantener la expresión de genes que inhiben los procesos de diferenciación celular.

• Señales de supervivencia: proporcionan una señal sin la cual la CM entraría en senescen-cia/apoptosis, o bien protegen de la acción de otras señales capaces de inducir dicha apop-tosis.

El conjunto de todas estas señales que cons-tituyen el microambiente especializado de una determinada CM es lo que se denomina nicho. El concepto de nicho, derivado de nuevo del estudio del sistema hematopoyético (fig. 6) es fundamental para la comprensión de la biología de las CM.

En el nicho adecuado, las CM son capaces de autorrenovarse; fuera de él, las CM se diferen-cian o mueren. Por tanto, las características del nicho fisiológico son dominantes y controlan el equilibrio proliferación/quiescencia/diferen-ciación, así como determinantes de la «expre-sión» de potencial que se le permite a esa CM en dicha localización anatómica. Cada tipo de CMA reside por tanto sólo en localizaciones anatómicas muy precisas dentro del organismo, donde se dan las señales que constituyen su co-rrespondiente nicho. Este estricto control de la


autorrenovación es una de las diferencias esen-ciales entre una CM y una célula tumoral, la cual no parecen presentar dichas restricciones.

Los nichos de algunos tipos de CMA han sido localizados de forma precisa, y ya han sido men-cionados anteriormente, como por ejemplo los de las CME (capa basal de la epidermis y bulge de los folículos), las CMN (región subventricular y giro dentado) y las CM intestinales (fondo de las criptas). En otros tipos de CMA, sin embargo, la localización del nicho es aún poco precisa. En el caso de las CMH, se ha descrito que se lo-calizan mayoritariamente cerca de la superficie ósea, pero también asociadas con el endotelio sinusoidal (Wilson et al., 2006). Aún no se com-prende bien la relación entre ambos tipos de nicho, ni su probable función diferencial en la biología de las CMH.

Las principales rutas de señalización regulado-ras de la autorrenovación conocidas en CMA son Wnt, Notch y Hedgehog (Blank et al., 2008). Una característica común de todas estas señales es que pueden regular la autorrenovación en dis-tintos sentidos (induciéndola o inhibiéndola) de-pendiendo del contexto, y probablemente como resultado de equilibrios cuantitativos. Así, por ejemplo, la activación de Notch es esencial para la autorrenovación de las CMH, pero en CMN pue-de promover tanto la autorrenovación en algunos casos como la diferenciación a glía en otros.

La señalización por Wnt a través de la ruta canónica (ß-catenina) promueve la autorreno-vación en CMH, CMM, CMN, CME y en las CM intestinales. Sin embargo, en las CMH la dele-ción de ß-catenina no afecta a la capacidad de autorrenovación, por lo que, o bien la señaliza-

Figura 6. Definición y estructura funcional del «nicho» hematopoyético.

Stromal cell

Self-renewal

Commitment differentiation

Autorrenovación frente a diferenciación («el nicho»)

CAM

MSC

sGF

mb-GF

CSF’sSCFIL-3IL-6IL-IIetc. IL-6

+

+

+

–

–

–

IL-ITNFIL-6

IL-ITNFetc.

TGF-ßpEEDCK

ECM-b GF

LIFTGF-ß

etc.

Mφ


ción por Wnt no es necesaria, o bien señaliza por medio de la vía no canónica en estas células. De forma contraria, la acumulación de Wnt-3a en el suero plasmático del ratón se ha asociado recientemente al fenómeno de envejecimiento fisiológico, al menos de las células satélite mus-culares (Brack et al., 2008)

Por su parte, Sonic Hedgehog también pro-mueve el mantenimiento de las CMH, CMN y CME. Al menos en las CMH, dicha actividad tie-ne lugar a través de un mecanismo dependiente de BMP-4. La ruta de señalización de TGF-ß/BMP (mediada por Smads) se ha estudiado extensamente en CMH, y se sabe que TGF-ß es uno de los más potentes inhibidores de la autorrenovación de CMH. Debido al alto nivel de redundancia de las proteínas Smad, su papel en el automantenimiento de las CMA aún no se comprende de forma completa.

Los programas genéticos específicos responsa-bles del control de la autorrenovación de CMA son considerablemente menos conocidos que las señales extracelulares que los regulan. Hasta

el momento, los genes de autorrenovación mejor estudiados en CMA pertenecen a la familia de las proteínas Polycomb. Las proteínas del grupo Polycomb (PcG) se asocian en grandes comple-jos que reprimen la trascripción de otros genes mediante modificaciones de la estructura de la cromatina. Entre los genes PcG se han identifi-cado varios que participan en la regulación de la autorrenovación de CMA. Entre ellos, el mejor conocido es Bmi1 (Park et al., 2003), cuya expre-sión es necesaria para el mantenimiento de las CME y CMN. Bmi1 promueve la proliferación de las CMA principalmente reprimiendo la ruta de senescencia celular inducida por p16Ink4a y p19Arf.

Plasticidad de las CMAEn los últimos 7-8 años ha existido una amplia

polémica, que todavía persiste en algunos extre-mos, sobre el novedoso concepto de la «plasti-cidad» celular, principalmente establecido sobre experimentación realizada con CMH (fig. 7). Por

Figura 7. Plasticidad de células madre hematopoyéticas (CMH).

Músculo Folículo piloso

Criptas intestinales

Queratinocitos-epidermis

Célula satélite

Hígado

Célula oval

Tumor in situ

PEC (médula ósea)Sistema nervioso

SNC

SCE


plasticidad celular entendemos el fenómeno por el cual una CMA, extraída de su nicho natural, manipulada o no ex vivo, y trasplantada en otro entorno fisiológico, es capaz de dar lugar a otros linajes celulares no previstos según su programa de desarrollo estándar.

En este proceso se han implicado diferentes mecanismos, no totalmente clarificados, y que incluyen dediferenciación, transdiferenciación y reprogramación. Hoy en día algunos de los postulados iniciales no se han confirmado, pero otros sí (Rovó y Gratwohl, 2008). En la actua-lidad se está investigando la terapia celular con CMH como posible procedimiento terapéutico para el tratamiento de muy diversas patologías no relacionadas con el sistema linfohematopo-yético. Las principales aplicaciones en este senti-do son la reparación/regeneración hepática y el tratamiento de la isquemia.

La capacidad de las CMH para generar nue-vas células hepáticas se ha demostrado en va-rios modelos animales de insuficiencia hepática (Lagasse et al., 2000), y su posible aplicación en clínica ofrece una importante promesa terapéu-tica en este tipo de patologías. Sin embargo, la formación de nuevos hepatocitos no se debe a la diferenciación de las CMH, sino a un proceso de fusión de dichas células (u otros tipos deri-vadas de ellas, como los macrófagos) con los hepatocitos preexistentes (Wang et al., 2003). Este descubrimiento, no obstante, no invalida la posibilidad de tratar eficazmente enfermedades metabólicas o infecciosas hepáticas mediante el trasplante de CMH, y se están investigando activamente las propiedades biológicas de las células resultantes de la fusión.

La isquemia cardiaca es otra de las patologías que se está abordando mediante el trasplan-te de CMH. Los trabajos iniciales en roedores (Orlic et al., 2001) promovieron el desarrollo de numerosos estudios preclínicos y clínicos de terapia celular motivados por la hipótesis de que las CMH poseen una plasticidad suficien-temente elevada cómo para transdiferenciarse a células del linaje cardiomiocítico. Sin embargo, estudios posteriores parecen descartar que di-

cha transdiferenciación tenga lugar en una pro-porción significativa en las condiciones experi-mentales habituales (Murry et al; 2004) aunque la transdiferenciación in vivo se ha sustanciado en diferentes estudios realizados sobre varones que recibieron un trasplante de corazón cuyo donante era una mujer, sin la aparente media-ción de mecanismos de fusión (Angelini et al., 2007). Por tanto, sigue la polémica. Por otra parte, la posible capacidad proangiogénica está siendo investigada en el tratamiento de la isque-mia periférica (Pearce et al., 2008).

De forma análoga, el potencial de las CMH para la transdiferenciación in vivo en células del sistema nervioso central también se ha sustan-ciado en diferentes estudios realizados sobre mujeres que recibieron un trasplante de mé-dula ósea cuyo donante era un varón (Cogle et al., 2007).

En definitiva, la plasticidad celular de diferen-tes CMA es una nueva opción terapéutica que necesitará mucho más tiempo para ser evaluada con solidez, lo cual no la descarta cómo plausi-ble –aunque complicada en términos de efica-cia– en algunas indicaciones.

Células madre embrionarias humanas

Recientemente (Thomson et al., 1998; Reubi-noff et al., 2000) se han conseguido las primeras líneas de células madre embrionarias humanas (hES), aunque por el momento las condiciones de cultivo y expansión in vitro no están defi-nidas al nivel de sus homólogas de ratón. No obstante, dada la amplia experiencia que se ha adquirido con las células ES de ratón (mES), el mero hecho de su existencia ha abierto un gran debate social y científico-ético sobre lo que puede y/o debe ser investigado al amparo de la financiación pública, y sobre reformas en las leyes correspondientes que regulen la actividad general y económica en torno a este nuevo po-tencial terapéutico.


Como hemos comentado anteriormente, la gran ventaja teórica de partir de hES es que éstas células deben de poseer el potencial (por definición) de generar cualquier tipo celular hu-mano. Esta premisa, sin embargo, es difícil de con-firmar experimentalmente. De hecho, no existe una prueba formal de que las células hES que se manejan sean totalmente equivalentes a las mES; en este sentido, ambas células tienen diferentes requerimientos de crecimiento y parecen ser bastante más inestables genéticamente (Baker et al., 2007). Sin duda es necesario acumular mu-cha más experiencia sobre el comportamiento de éstas células en cultivo, antes de plantearse su empleo en procedimientos clínicos.

En todo caso, la utilización de hES obliga a con-trolar, de forma reproducible, su capacidad de di-ferenciación a células o progenitores del linaje ce-lular de interés. Así, se han realizado avances muy significativos (p. ej., Narazaki et al., 2008), aunque también se ha evidenciado que la identificación y caracterización de las células derivadas ha de ser exhaustiva, ya que los marcadores simples que sirven en células primarias somáticas, pueden no ser equivalentes sobre estas células obtenidas ar-tificialmente (Martin et al., 2008).

Finalmente, la utilización generalizada de técni-cas basadas en hES obligaría a disponer bien de un panel amplio de líneas celulares que pudiesen cubrir los haplotipos más comunes en una deter-minada población humana, o bien a desarrollar una tecnología eficaz para conseguir el clonado terapéutico. Ninguna de las dos situaciones son posibles en la actualidad, aunque pueden conver-tirse en una realidad (Cibelli et al., 2007). En todo caso, el traslado de esta tecnología a ensayos clí-nicos requerirá muy probablemente el disponer las líneas equivalentes en algún modelo animal grande, cómo recientemente se ha conseguido en el perro (Schneider et al., 2008).

La tercera víaSe han identificado recientemente, tanto en

ratón como en el hombre, varias combinacio-

nes de genes cuya expresión exógena en una célula diferenciada puede, por sí sola, promover su reprogramación y desdiferenciación a célula pluripotente (Takahashi et al., 2007). Este resul-tado ha sido ya validado por numerosos grupos y abre definitivamente una nueva vía (la tercera vía) para obtener células pluripotenciales huma-nas. Evidentemente, este nuevo tipo celular, iPS, debe poseer muchas de las propiedades/cuali-dades de las hES, pero con la ventaja de poder obtener «fácilmente» una línea autóloga de un ser humano concreto. Los resultados relaciona-dos con la inducción selectiva de diferentes lina-jes todavía es muy reducida, pero prometedora (p. ej., Park et al., 2008), y habrá que acumular más experiencia sobre estas células para evaluar su interés final como dianas de procedimientos de ingeniería tisular. En todo caso, la mayoría de las reflexiones realizadas en el apartado ante-rior (hES) se aplicarían también a ésta nueva opción terapéutica.

Una realidad incipiente. Una nueva visión de algunas patologías humanas

Hay que seguir alimentando el entusiasmo y el soporte social que las nuevas posibilidades terapéuticas basadas en la utilización de CM han resucitado, pero manteniendo paralelamente un gran rigor y una extremada cautela. Es necesa-rio transmitir a la población la información de forma equilibrada, y explicando que cualquier avance significativo en el laboratorio tardará más de 10 años en convertirse en una realidad clínica establecida.

Las expectativas que generó en su día la posibilidad de introducir en el organismo vivo nuevas versiones «correctas» de los genes que contenían mutaciones asociadas a enfermeda-des genéticas humanas (terapia génica) fueron extraordinarias. La realidad sin embargo se mostró mucho más exigente que la voluntad, y


han sido necesarios más de 25 años para que los primeros beneficios clínicos (y no exentos de problemas) hayan sido una realidad. Las con-secuencias las hemos sufrido todos, incluyendo investigadores, clínicos y pacientes. Sinceramen-te, esperamos que no ocurra lo mismo con las infinitas posibilidades que la combinación de terapia celular/génica pueden abrir al arsenal terapéutico de la humanidad.

Debemos reconocer que aunque los avances en el conocimiento de la biología de las CM han sido enormes en la última década, todavía estamos lejos de controlar completamente los sistemas. Sin ir más lejos, en los últimos años han surgido del genoma humano «nuevos ju-gadores» que eran completamente desconoci-dos en mamíferos hace unos años; nos estamos refiriendo a los RNA de corto tamaño y no codificantes (microRNA; miRNA) que parecen jugar un papel importante en el control fino de las transcripción/traducción (Garzon y Croce, 2008). Su papel en cáncer humano es induda-ble, pero su potencial papel sobre la biología de CMA es todavía muy mal conocido. Por tanto, debemos de ser humildes, y avanzar al ritmo que el conocimiento básico nos permita, sabien-do aprovechar, al máximo, las opciones realistas que existan en cada momento.

Por último, no todo son bondades en el nue-vo universo de la célula madre, y su estudio nos ha abierto los ojos a nuevos conceptos que hace unos años eran pura especulación. Se ha demostrado que ciertas poblaciones celulares, originarias de la médula ósea, pero que pueden pasar a la circulación en determinadas circuns-tancias, tienen un papel importante en el desa-rrollo de lesiones arterioscleróticas, así como en el establecimiento de la vasculatura tumoral en varios modelos. Los mecanismos moleculares que activan esta movilización patológica de cé-lulas madre no se conocen en detalle, pero esta realidad fisiológica se está intentando explotar para generar nuevas posibilidades terapéuticas; precursores angioblásticos, aislados de sangre periférica o de médula ósea, se intentan utilizar como «vehículos celulares» para conseguir pro-

ducir biomoléculas de interés terapéutico en zonas localizadas del cuerpo (tumores secunda-rios, pre-lesiones malignas o arterioescleróticas, etc.). Estas estrategias de terapias combinadas (celular-génica) están dando sus primeros frutos en un nivel básico.

Más aún, una vieja teoría se va convirtiendo en una realidad clínica día a día. Los tumores sólidos son aglomeraciones de células muy he-terogéneas genética y funcionalmente. En varios modelos de tumores sólidos humanos se ha po-dido constatar que dentro de los tumores existe una población muy minoritaria de células que es la responsable de garantizar la propiedades del tumor y su agresividad (su trasplante en mode-los animales es capaz de reestablecer el tumor). Esto ha reabierto la discusión sobre la existen-cia de las «células madre tumorales» (CMT o CSC, del inglés Cancer Stem Cells), inicialmente propuesto desde la hematoncología, y las impli-caciones que esto tiene sobre la efectividad de las terapias (Glinsky, 2008). La realidad es que las células tumorales y ciertas poblaciones de células madre poseen ciertas propiedades muy asimilables y pueden estar relacionadas (fig. 8); los próximos años nos depararán con seguridad nuevas sorpresas y, probablemente, una nueva visión de muchas de las patologías humanas.

Figura 8. Equilibrios funcionales en células ma-dre adultas.

Cáncer (stem cells)

Nuevas posibilidades terapéuticas

Nuevas implicaciones

fisiopatológicas

Positivos Negativos

Homeostasis de los tejidos y los órganosFisiología normal

Células madre adultas


Un futuro prometedorEl potencial terapéutico de las células madre

es enorme. Basta pensar en la cantidad de per-sonas que todavía mueren a la espera de un trasplante de órgano vital, a sabiendas que de conseguir un donante adecuado, esto les ofre-cería unos cuantos años con calidad de vida. En otros casos, algunos órganos del paciente sufren daños debidos a procesos traumáticos, patológicos o causados por hábitos insanos, que solamente pueden ser aliviados mediante complejos procedimientos clínico-quirúrgicos. La tecnología asociada a la manipulación de células madre empieza a ofrecer un futuro en todos estos campos. Poniendo por delante que estamos hablando casi siempre de resulta-dos obtenidos en modelos animales de expe-rimentación (rata, ratón y, en el mejor de los casos, cerdo) y que su traslado al ser huma-no es abismal, el futuro es muy prometedor. Prácticamente a diario se hacen públicos en las revistas científicas más prestigiosas resultados espectaculares. Como ejemplo citemos sola-mente los primeros resultados de seguridad/factibilidad (fase I) de empleo de células de medula ósea (movilizadas a sangre periférica) en el tratamiento del fallo hepático crónico (Levicar et al., 2008).

Sin embargo, cualquier revolución técnica, y no digamos médica, requiere su tiempo de acu-mulación de experiencia, reflexión y evaluación en una muestra significativa de la población. En todas las diferentes etapas implicadas en el de-sarrollo de cualquier aplicación clínica de CM (fig. 9) se esperan avances significativos y, muy probablemente, el formato de la producción celular asociada a los ensayos clínicos en los próximos años se parecerá poco a los actuales. Démosle tiempo al tiempo y dejemos que este valor absoluto ponga a cada uno en su lugar.

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Figura 9. Estructura de un ensayo de terapia celular típico.

Diferenciación controlada ¿ex vivo?

¿Biomateriales?

¿Modificación genética?

Reimplantación autóloga

Implantación alogénica

Expansión ex vivo

Cultivo ex vivo

Aislamiento celular/caracterización


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Cell therapy: a challenge of translational medicine

Replacement of damaged organs, tissues, and cells is one of the fundamental objectives of modern medicine, and the last decades have witnessed spectacular advances in organ/tis-sue transplantation and related disciplines (or-gan preservation, immunosuppression, patient clitical care, etc). Within this field, cell therapy still remains in its initial stages of translation to medicine, although it is the area that should profit more of the numerous developments in cell biology occurred in recent years. It is over forty years that cell therapy is applied routinely in hematology to replace bone marrow cells damaged by accidental irradiation, mutations, or cancer. There have been also clinical advan-ces in cell therapy related with other areas of medicine such as skin or bone/cartilage repla-cement and regeneration. However, it is in the neurological diseases where the promises of cell therapy have probably created the highest ex-pectations, as the ability of regeneration of the mammalian central nervous system is null, or very low. In addition, neurological disorders, and particularly neurodegenerative diseases, have high individual, social, and economic costs, thus representing one of the major challenges of de-veloped societies.

Cell therapy in diseases of the central nervous system; introductory remarks

Many diseases of the central nervous sys-tem (CNS) are a consequence of the acute or chronic loss of neurons and/or glial cells owing, among other causes, to degenerative, toxic, traumatic, ischemic or inflammatory aggressions. Therefore, the replacement of damaged cells by new ones has been considered as a potential therapeutic strategy in these CNS disorders. Neurologic cell-based therapy implies not only the transplantation of exogenous tissues to re-pair or restore function (cell replacement), but also the use of cells for the delivery of trophic factors with a protective action on the neurons affected by the ongoing pathological processes (neuroprotection) (1-3). Routes of cell or tis-sue administration include direct intracerebral grafting by open surgery or through stereotaxic needles, as well as intrathecal or intraventricu-lar delivery. Systemic intravascular (arterial or venous) injections are used in some cases and migration of the putative therapeutic cells to the site of lesion has been reported. Another plausible form of cell therapy is the activation of pre-existing neuronal precursors located in

5 Clinical applications of cell therapyJosé López-BarneoInstItuto de BIomedICIna de sevIlla-IBIs

Hospital Universitario Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla. Sevilla

Clinical applications of cell therapy 57

neurogenic centers (i.e. the subventricular zone of the lateral ventricles or the dentate gyrus of the hippocampus) that could migrate and di-fferentiate to replace destroyed cells in some parts of the brain. This possibility is speculative at present and based solely on preliminary ex-perimental observations (4, 5).

In theory, the ultimate goal of neurologic cell therapy is the histological and functional integra-tion of grafts within the neighboring brain pa-renchyma. In this regard, synaptic connections between grafted neurons and the host tissue have been described in experimental studies. However, it has become evident that physiolo-gical restoration of the intricate synaptic circuits of the brain cannot be achieved through the cell replacement protocols currently used to treat CNS disorders. In contrast, the beneficial effects of transplants are, in most cases, a consequence of gross anatomical or neurochemical modifi-cations in the recipient organ. For instance, the amelioration of parkinsonism after intrastriatal grafting of dopaminergic tissue is due to the tonic release of dopamine and/or trophic factors from grafted cells which, respectively, activate dopami-ne receptors in neighboring neurons and induce sprouting of the dopaminergic nigrostriatal fi-bers in the host brain. Therefore, the best results of cell therapy are obtained in CNS disorders, such as Parkinson’s disease (PD), with relatively focalized lesions and affecting diffuse synaptic circuits in which pre-post synaptic specification is not an absolute requisite for the restoration of function. At present, it is difficult to envisage how therapies based on cell replacement or the activation of preexisting neurons could restore the delicate cortical and hippocampal synaptic circuits underlying memory storage and retrie-val extensively damaged in Alzheimer’s disease patients. Other limitations of cell therapy derive from the scarcity of cells/tissues that are appro-priate for transplantation. Although autogra-fts can be performed in some cases, the most frequently used clinical protocols are based on allo- or even xenografts, thus requiring immuno-suppression treatment. Allotransplants are also

rendered difficult because the use of tissue from human donors (i.e. human fetuses or embryos) raises numerous legal and ethical issues.

Despite the limitations described above, cell therapies have been successfully applied to the treatment of neurological diseases for over two decades. The pioneer studies, designed to treat advanced PD patients with excellent results in some cases, stimulated the development of the field and were followed by a great deal of ex-perimental and clinical work. These studies have boosted the development of animal models of numerous CNS diseases and the appearance of well-defined clinical protocols to evaluate disease progression. Nevertheless, the initial enthusiasm derived from the results of open trials has been tempered by the less spectacular clinical outcomes of double-blind and placebo-controlled studies performed with large patient cohorts. Recently there has been, however, re-newed interest in the cell therapy field due to the appearance of new cell sources, particularly stem cells, with potential clinical applicability. Cu-rrently, there are numerous ongoing experimen-tal and clinical transplantation studies designed to test the therapeutic efficacy of several cell types in a variety of neurological diseases, such as PD, Huntington’s disease (HD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), stroke, and spinal cord in-jury (SCI), among others.

This chapter aims to provide a general over-view of the current status of cell therapies applied to CNS disorders. After a concise up-date of the preclinical knowledge available, the studies and techniques that have already resul-ted in clinical application are discussed in more detail. In this respect, the chapter’s main focus is PD, a prototypical neurodegenerative disease in which the most solid and promising conceptual and technological advances in neurologic cell therapy have been tested. In addition, recent developments related with cell therapy applied to other CNS disorders (i.e. HD, ALS, stroke, or SCI) are briefly addressed. The chapter ends with a concluding summary and look at future perspectives in the field.


Cell therapy in Parkinson’s disease

Pathophysiology and novel therapeutic strategies in Parkinson’s disease

Parkinson’s disease (PD) is a progressive neu-rodegenerative disorder of unknown etiology. Although several genetic forms have been des-cribed (6) the majority of cases are sporadic and unrelated to familial traits. PD is a major health problem in developed countries, as it affects to 100-300 subjects per 100,000 inhabitants and up to 3% of people older than 65 (7, 8). The motor symptoms of PD (tremor, bradykinesia/hypokine-sia, rigidity, and alterations of gait and posture) are due to the progressive loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra (SN) and their projections to the striatum (Figure 1). The dege-nerative process also affects other areas of the CNS and the peripheral autonomic nervous system, thus causing several non-motor symp-toms, such as depression, cognitive impairment, and autonomic dysregulation (9). Although the progressive neuronal loss is a common feature of all neurodegenerative diseases, a typical pa-

thological hallmark of PD is the appearance of cytoplasmic inclusions, called Lewy bodies, con-taining synuclein and ubiquitin among other pro-teins. The mechanism of neuronal death in PD is likely multi-factorial, involving a cascade of events among which cellular oxidative damage appears to have a prominent role (Figure 1). Selective de-crease of reduced glutathatione, mitochondrial complex I activity, and reactive oxygen species (ROS)-destroying enzymes, or elevated con-centrations of iron, which can act as a catalyst for detrimental oxidative reactions, have been reported within the parkinsonian SN. Similarly, there is evidence of oxidative damage to lipids, proteins and DNA in the brains and leukocytes of PD patients. Inflammatory-related events, such as nitric oxide-derived reactive species produced by glial inducible nitric oxide synthase, appear also to participate in SN dopaminergic degeneration (10). Besides mitochondrial dysfunction and the oxidative or inflammatory stresses, alteration of protein-degrading mechanisms at the proteaso-me is an additional factor that participates in PD initiation and/or progression. For example, mutations in α-synuclein (a presynaptic protein of unknown function that is deposited in Lewy bodies) or in parkin (a ubiquitin ligase necessary for protein identification by the proteasome) are responsible for some forms of genetic PD (6).

Figura 1. Dopaminergic nigrostriatal pathway. A) Mouse dopaminergic nigrostriatal neurons and fibers stained using antibodies anti tyroxine hydroxylase. SN, substantia nigra; St, Striatum. B) Schematic repre-sentation of a dopaminergic presynaptic terminal. Uptake of dopamine (DA) and its metabolization to dihydroxyphenyl acetic acid (DOPAC) and hydrogen peroxide (H2O2) are illustrated. DAT, dopamine transporter ; MAO, monoamine oxidase.

Nigrostriatal pathway in mouse Striatal dopaminergic terminal

DOPAC + H2O2

DAMAO

DAT

DA

A B

St

SN


PD treatment relies mainly on L-dopa, a drug that is converted to dopamine in neuronal so-mata and presynaptic terminals. L-dopa is nor-mally complemented with the administration of dopamine receptor agonists or inhibitors of dopamine-degrading enzymes (monoamine oxidase and catechol-o-methyl transferase). Patients who develop disabling motor com-plications (motor fluctuations and dyskinesias) or drug-resistant tremor can be candidates for surgical implantation of electrodes for electrical stimulation, these normally being placed at the subthalamic nuclei. This methodology, consisting of the application of high frequency (> 100 Hz) electrical pulses to inhibit neuronal activi-ty, can correct the alterations of basal ganglia circuits in the parkinsonian brain. Although the current pharmacological and surgical therapies are symptomatically effective, their long-term utility is limited because they do not halt the disease progression (11). Therefore, there is a need for neuroprotective and/or neurorestora-tive therapies capable of arresting or reversing the neurodegenerative process. Dopamine cell replacement and the intracerebral administra-tion of trophic factors are cell-based promising therapeutic approaches currently subjected to intense basic research and clinical evaluation.

Transplantation of dopamine-secreting cells. Preclinical studies

Mammalian models of Parkinson’s disease

Development of research on CNS cell thera-py depends on the existence of animal models of the neurological diseases, where the effecti-veness, advantages, and limitations of the various therapeutic approaches can be tested experi-mentally. A brief description of the mammalian models of PD available is given below.

A commonly used PD animal model is the hemiparkinsonian rat, generated by unilateral stereotaxic injections of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) either into the SN, the neighboring

medial forebrain bundle, or the striatum. In all cases the drug is metabolically converted to do-pamine and generates H2O2, which subsequently kills the dopaminergic nigrostriatal neurons due to oxidative stress (Figure 2). Unilateral destruc-tion of the dopaminergic nigrostriatal neurons produces a spontaneous rotational behavior towards the side of the lesion (greatly exacer-bated by administration of D-amphetamine) that is easily monitored with a rotameter. As the number of rotations is proportional to the degree of SN lesion (and to the extension of striatal dopaminergic denervation) this model permits the experimenter to test the recovery of the syndrome after striatal transplantation of dopamine (and/or trophic factor)-releasing cells (Figure 2) (12). The 6-OHDA model has, howe-ver, numerous limitations since it is generated by acute oxidative damage to SN dopaminergic neurons, a phenomenon quite different from the chronic and progressive death of this neu-ronal population characteristic of PD. Moreover, the direct mesencephalic injection of 6-OHDA makes it difficult to obtain animals with partial lesions, which are required to test neuroprotec-tive therapies based on the trophic action of the transplanted cells on nigrostriatal neurons spared by the lesions or still unaffected by the ongoing neurodegenerative process. In the last few years there have been several attempts to generate chronic rat PD models, although their feasibility and reproducibility are still under scrutiny. Chronic intravenous or subcutaneous administration of rotenone (a membrane-per-meable inhibitor of mitochondrial complex I) seems to produce bilateral destruction of do-paminergic SN neurons with Lewy body-like cytoplasmic inclusions. Similar results have also been reported after chronic administration of proteasome inhibitors. Unfortunately, the validi-ty and reproducibility of this model (that initia-lly raised great expectations) is being seriously questioned (10, 13).

The monkey model of PD is also broadly used owing, among other reasons, to the need for testing in non-human primates most of the


cell therapy procedures destined for clinical use. Monkeys are chronically treated by subcuta-neous injections of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), a drug converted in the primate brain to 1-methyl-4-phenylpyri-dinium ion (MPP+) which, in turn, is taken up selectively by dopaminergic neurons via the dopamine transporter (Figure 1). As MPP+ is a potent mitochondrial complex I inhibitor, its chronic application leads to progressive dopa-minergic cell death. MPTP has similar actions in mice (see below) but is ineffective in rats since they do not express the enzymes required to convert MPTP into MPP+. In primates (monkey and human) MPTP produces a bilateral parkin-sonian syndrome with motor features similar to those present in sporadic PD (10, 14). The objectives of experimental cell therapy in par-

kinsonian monkeys are similar to those descri-bed above for the rat. Dopamine- or trophic factor-releasing cells are normally deposited ste-reotaxically in the striatum (normally at several locations in the putamen) and clinical recovery is monitored with ad hoc behavioral tests. The MPTP monkey is particularly useful to perform unilateral striatal transplants since the contrala-teral striatum (injected with saline solution) can be used as control. In these cases, the success of the procedure results in unilateral histological and clinical recovery, with the animals behaving in a hemiparkinsonian manner hence showing a typical rotational behavior towards the side contralateral to the transplant (15).

Systemic administration of MPTP in mice produces bilateral destruction of dopaminergic nigrostriatal neurons (10, 16, 17). The parkin-

Nigrostriatal denervation in the hemiparkinsonian rat Striatal reinervation after CB grafting

Figura 2. Hemiparkinsonian rat model and intrastriatal grafting of dopaminergic cells. A) Coronal sec-tions at the level of the striatum (St) and the mesencephalon (SN, substantia nigra; VTA, ventral tegmen-tal area) showing the normal (left) and denervated (right) nigrostriatal pathway. B) Striatal dopaminergic reinnervation after transplantation of carotid body glomus cells (g, graft).


sonian syndrome in mice is less amenable for behavioral analysis than the syndrome in the rat; however mice are sometimes chosen because MPTP administration requires no surgery and, as in the case of primates, if unilateral transplan-tation is performed the contralateral side can be used as an internal control. In addition, sus-ceptibility to MPTP-derived toxicity can be stu-died in the numerous genetically modified mice strains available. An acute MPTP mice model is normally generated by subcutaneous injections (single or distributed over 12-24 h) of the drug. Chronic models, based on the continuous de-livery of MPTP using subcutaneous pumps or repeated injections, are being assayed in several laboratories but results differ among the various groups and animals strains.

There are several mouse genetic models in which some of the genes altered in familial PD (i.e. α-synuclein or parkin) have been transgeni-cally overexpressed in an attempt to reproduce the disease. So far, none of these genetically mo-dified animals exhibit clear histological, neuroche-mical or behavioral signs of parkinsonism. Ano-ther PD mouse model is the one obtained after genetic disruption of the glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) signaling pathway. GDNF is the most representative member of a family of trophic factors (called dopamino-trophic factors) that promote the in vivo and in vitro survival of dopaminergic neurons (see below). GDNF null animals die at early neonatal stages due to kidney agenesia and alterations of the enteric nervous system, although in these animals both the SN and the striatum are nor-mal. In adult life, the overall GDNF expression in the central nervous system decreases drastically, although high levels of GDNF are maintained in some striatal neurons and glial cells, possibly as a mechanism to aid trophic maintenance of the nigrostriatal pathway. Heterozygous GDNF+/- animals develop normally, although it has been reported that they show a mild reduction of the dopaminergic neuronal pool at advanced age. Thus, it seems that abolition of GDNF expres-

sion (or function) in the adult mouse could ser-ve as a good PD mouse model. Conflicting re-sults have recently been reported regarding the effect of c-ret (a transmembrane component of the GDNF receptor) knock-out in adult life (18, 19). The conditional GDNF null mouse recently generated in our laboratory has demonstrated that striatal GDNF production is absolutely ne-cessary for the survival of adult mesencephalic dopaminergic neurons. These animals show an extensive loss of cells in SN and VTA as well as in the Locus coeruleus. They also have a clear akinetic syndrome that ameliorates after L-dopa administration (19b).

Preclinical transplantation studies

The first cell therapy studies in animal models of PD were performed in the late 1970s in rats using fetal rat dopamine-containing neurons as donors with the aim of restoring striatal dopa-mine levels. In these investigations, improvement of the functional deficits in parkinsonian animals was paralleled by the survival of intrastriatal gra-fts and axonal outgrowth (20, 21). After this pio-neer work, numerous studies have been perfor-med in the last 25 years in an effort to address the following main objectives:

I. To establish the effectiveness of different ty-pes of donor tissue on recovery from the parkinsonian syndrome.

II. To test the survival of the transplanted tissue and its histological integration within the host striatal parenchyma.

III. To evaluate electrophysiological and neuro-chemical activity in grafts and the establish-ment of functional connections (synapses) between the graft and the host brain.

IV. To determine whether immunosuppression facilitates long-lasting cross-species trans-plantation of neural and non-neural tissues.

After the initial transplantation of mesen-cephalic tissue from rat embryo to rats, a step further was the transplantation of mesencepha-


lic dopaminergic neurons, taken from mouse embryos or human fetuses, to the dopaminer-gically denervated neostriatum of recipient rats, and the use of primates with MPTP-induced Parkinson-like syndrome as graft receptors (22). At the same time, adrenal chromaffin cells were used as an alternative dopamine source in PD animal models, from rats to primates, although with poorer results than those obtained using embryonic or fetal dopamine neurons (23). In parallel with these studies there have been several reports from groups using porcine me-sencephalic neurons with good results (24). Si-milarly, tissues in the peripheral nervous system, other than the adrenal medulla, have been used. In those studies, transplants of sympathetic neu-rons from the superior cervical ganglion were performed in experimental animal models as well as in humans (25).

Among the most promising new experimen-tal approaches developed within the last few years are the transplantation of retinal pigment epithelial cells and of carotid body tissue. In the first case, stereotaxic intrastriatal implan-tation of human retinal pigment epithelial cells attached to gelatin microcarriers in rodent and non-human primate models of PD produced long-term amelioration of motor and behavio-ral deficits, with histological and PET evidence of cell survival without immunosuppression (26). In the second case, the autotransplantation of dopaminergic carotid body (CB) cell aggrega-tes was able to effect notable histological and functional recovery in parkinsonian rats (27, 28) and MPTP-treated monkeys (15). The CB is a tissue particularly attractive for antiparkinsonian cell therapy because it combines the properties necessary for dopamine cell replacement and for neuroprotection. The CB contains neural crest-derived dopaminergic glomus cells, which function as arterial oxygen sensors and relea-se large amounts of dopamine in response to hypoxia. Long-term recovery of parkinsonian animals after intrastriatal CB grafting is induced not only by the release of dopamine, but also

through a trophic effect on nigrostriatal neu-rons. In fact, adult rodent CB cells express much higher GDNF levels than any other paraneural cells studied (adrenal medulla, superior cervical ganglion, Zuckerland’s organ and PC12). Mo-reover, GDNF expression by CB glomus cells is maintained after intrastriatal grafting and in CBs of aged or MPTP-treated animals (29) (Figure 3). Thus, glomus cells appear to be miniaturized biological pumps useful for the local delivery of GDNF and possibly other trophic factors.

Besides the transplantation of dopamine-producing cells, other experimental strategies have been designed to directly increase the striatal concentration of trophic factors that could eventually induce regeneration of the dopaminergic nigrostriatal pathway. Among these studies Sertoli cells from the testis, am-niotic epithelial cells or genetically modified cells overexpressing trophic factors have been used. Some of these trophic factor-producing cell types have been assayed in conjunction with dopamine releasing cells (i.e. cotransplan-tation of peripheral nerve plus adrenal medu-lla, and Sertoli or CB cells plus ventral mesen-cephalic neurons) (30).

After more than 20 years of preclinical re-search in antiparkinsonian cell therapy, the stu-dies performed can be retrospectively classified into three major groups:

I. Intrastriatal transplantation of heterologous dopaminergic neurons to compensate for the loss of intrinsic dopaminergic fibers. For these studies, fetal mesencephalic neurons were normally used and the establishment of synaptic connections between the graft and host neurons was considered a good indication of graft survival and integration in the recipient brain. More recently, fetal me-sencephalic neurons are being substituted by stem cell-derived dopaminergic neurons (see Section 3.2).

II. Intrastriatal transplantation of dopamine-releasing cells (adrenal chromaffin, retinal or


carotid body cells) with the sole objective of increasing the average level of dopamine in the striatal parenchyma. Functional connec-tions between the graft and host tissues were not expected.

III. Intrastriatal delivery of cells releasing trophic factors (carotid body, retinal cells, Sertoli or amniotic epithelial cells or genetically modi-fied cells), to encourage striatal reinnervation through sprouting of the intrinsic nigrostriatal neurons.

Over the years, interest has shifted from pro-cedures that could be included in categories i/ii to those included in category iii. In the initial sta-ges, the limiting factors in cell therapy research were graft survival and accessibility to an abun-dant dopaminergic neuronal source. Currently, it is considered more important to determine the mechanisms of action of the transplants to

help better define the type of patient that could eventually benefit from cell therapy.

Current developments using stem cells

Embryonic stem (ES) cells are generally thought to offer a promising source of dopaminergic neu-rons suitable for PD cell therapy. They are charac-terized by a high proliferation rate and the po-tential to give rise in vitro to any cell type of the adult organism (2). In recent years, the differentia-tion of mouse embryonic stem cells into dopa-minergic neurons has been repeatedly obtained in different laboratories following two different approaches. One involves the co-culture of ES cells with stromal feeder cells (PA6, MS5) that fa-cilitates the induction of the neural fate. Another approach implies a five-stage method based on the formation of a three-germ layer structure, the embryoid body, from which neural cells can be selected. In both protocols, neural progenitor cells

Intrastriatally grafted carotid body cells Carotid body cells in situ

Figura 3. Maintenance of carotid body glomus cell phenotype in situ (right) and several weeks after intrastriatal transplantation (left). Immunocytochemical staining using anti tyroxine hydroxylase antibo-dies (brown-yellow) and X-galactosidase (green). The X-gal signal indicates that the GDNF promoter is active in these dopaminergic cells. See reference (29) for further details.


can be expanded and induction to the midbrain dopamine fate can be favoured by exposing the cells to appropriate morphogenetic factors (31, 32). Neuronal differentiation is normally triggered by mitogen withdrawal, and the dopaminergic phenotype is normally demonstrated by identifi-cation of the cells with markers such as tyrosine hydroxylase and the dopamine transporter (Figu-re 4). Embryonic stem cell-derived dopaminergic neurons are normally obtained from established ES cell lines, however, dopaminergic neurons have also been derived from embryos obtained by nu-clear transfer or from induced pluripotent stem cells (iPSC).

Striatal transplantation of previously specified midbrain ES cell-derived neural progenitors cells has been reported to provide surviving dopa-minergic neurons in the host brain and render histological, neurochemical and behavioral re-covery of hemiparkinsonian rats (33, 34) (Figu-re 4). If ES cells are genetically manipulated to overexpress the nurr-1 gene, dopaminergic neu-ronal differentiation is markedly increased and, subsequently, a higher yield of surviving dopa-minergic neurons is achieved upon grafting (33). One major drawback of ES cell-based therapy is tumor generation, however this possibility is greatly diminished with appropriate differentia-tion procedures that eliminate all proliferative ES cells from the transplanted preparation. Several recent studies performed in non-human primate and human ES cells have demonstrated the abili-ty of these cells to differentiate into dopaminer-gic neurons. However, survival of transplanted dopaminergic neurons, an absence of prolifera-tive cells in the grafts, and consistent behavioral recovery are issues that seriously compromise the clinical applicability of human ES cell-derived neurons. Identification of key factors determi-ning the survival of human ES cell-derived do-paminergic neurons is an active field of research for regenerative medicine (35).

Neural stem cells derived from fetal or adult brain have been shown to differentiate into dopaminergic neurons, although the yield is re-

latively poor due to their limited capacity for proliferation and because of their preferential glial differentiation. Different factors have been used to increase the dopaminergic differentia-tion of neural stem cells with relatively modest success, although good results are beginning to be reported by some laboratories (35b). Bone marrow stromal cells and umbilical stem cells are also attractive sources of multipotent stem/progenitor cells, currently subjected to intense research, that could eventually be used for au-tologous transplants. However, the ability for do-paminergic differentiation of these cells is quite limited. Neural crest-derived progenitors have also been recently described in the carotid body, which permit the adaptive growth of this organ in chronic hypoxia. In vitro, these progenitors can differentiate to dopamine and GDNF producing cells, hence they could be used for transplan-tation studies in PD (35c). In summary, several critical challenges need to be overcome befo-re fetal, adult or autologous stem cells can be brought into the clinical field to treat PD (35).

Transplantation of dopamine-secreting cells. Clinical studies

General overview

Transplantation of dopamine-secreting cells in advanced PD patients was initiated in the mid 1980s. A summary of the transplantation pro-cedures, with indication of the donor tissue and current status of the technique, is given in Table 1. Despite the highly variable clinical outcomes of these studies, with excellent results reported in selected patients but only modest effects in most cases, the overall benefit experienced by the patients stimulated further research and cli-nical tests. Clinical trials resulting in a higher im-pact have been those employing adrenal medu-lla or mesencephalic neurons as donor tissues.

The first stereotaxic intrastriatal implantation of autologous adrenal medulla on four patients was performed, with modest results, by the Lund


group in 1985 (36). In 1987, a Mexican group re-ported excellent clinical results (not confirmed by others) after transplantation by open surgery of adrenal tissue into a cavity made in the cauda-te nucleus (37). These pioneer trials were soon followed by numerous studies in several hospi-tals all over the world. These studies differed in the surgical approach (open versus stereotaxic)

as well as in the procedures followed for adre-nalectomy and the treatment given to the cells prior to transplantation. All studies performed were open, with few patients (3 to 20) and wi-thout blind evaluation. In most cases the clinical efficacy of adrenal medulla autografts was very modest with a lack of neurochemical improve-ment based on positron emission tomography

Embryonic stem cells Neural precursor cells Dopaminergic neurons

Figura 4. In vitro differentiation of dopaminergic neurons from embryonic stem (ES) cells. A) Left, Colonies of mouse ES cells. Undifferentiated state is proved by Oct-4 staining. Calibration bars: 100 μm and 50 μm, in phase contrast and immunostaining, respectively. Center, Monolayer of ES cells-derived neural precur-sors. Neural identity is proved by nestin staining on cells adopting typical rosette disposition. Calibration bars: 100 μm and 50 μm, in phase contrast and immunostaining, respectively. Right, ES cells-derived dopa-minergic neurons (tyroxine hydroxylase,TH +). Calibration bar: 100 μm. 4´-6-diamidino-2-phenylindole (Dapi) shows nuclear counterstaining. B) Left. Photograph of the transplanted rat brain illustrating the localization of the graft in the striatum. The inset shows the dopaminergic identity (TH+) of the ES cells-derived grafted neurons. Calibration bars: 500 μm and 200 μm (inset). Right. Schematic representation of the rotational behavior of hemiparkinsonian rats non-transplanted (red) and transplanted (green) with ES cells-derived dopaminergic neurons. See further details in the text and reference (33).

A

B

Oct-4

Dapi

-2 0 2 4 6 8 10

1.000

500

0

-500

Rota

tions

Weeks

Grafting

TH


(PET). Postmortem analyses have demonstrated an almost complete absence of chromaffin cells at the transplanted sites. Several groups have reported that the viability of adrenal medulla grafts and their clinical efficacy increased if the cells were treated with trophic factors or co-transplanted with other tissues (i.e. peripheral nerve) (38). The transplantation of adrenal tis-sue to treat PD has, however, been abandoned due among other factors to the relatively high morbidity/mortality associated with the dual (abdominal and cranial) surgery and the deve-lopment of other therapeutic approaches. The most compelling alternative to adrenal autogra-fts is the transplantation of fetal mesencephalic neurons (see below), a technology that has do-minated the clinical trials on cell therapy applied to PD patients for the last 15-20 years.

Transplantation of fetal mesencephalic neurons

The first intrastriatal transplants of human fetal mesencephalic tissue in PD patients were carried out by the Lund group between 1989 and 1991, stimulated by the good results obtai-ned with the same methodology in preclinical studies . Since some patients treated with fetal cells showed long lasting clinical improvement, this methodology was extended to other labo-ratories. In most cases the technique used was the bilateral stereotaxic implantation of disper-sed cells or tissue fragments in the caudate/putamen. It is believed that this technique has been applied in open trials to several hundred patients although only about 50 have been ca-refully evaluated in the scientific literature (see

Tabla 1. Transplantation procedures in patients with Parkinson’s disease

Tissue Type of transplantation1

First report2

Spread of the technique

Level of development & current status

Adrenal medulla Autologous (36) Worldwide Abandoned

Homologous (human fetal)

(37) Single or few centers Abandoned

Adrenal medulla & peripheral nerve

Autologous (38) Single or few centers Abandoned

Mesencephalic tissue Homologous (human fetal)

(39) Worldwide Phase III studies3 in progress

Heterologous (porcine embryonic)

(40) Single or few centers Phase III study3 in progress

Retinal pigment epithelial cells

Homologous (post-mortem eye donors)

(41) Single or few centers Phase III study3 in progress

Carotid body cells Autologous (42) Single or few centers Phase II clinical and PET study completed

Sympathetic ganglion cells

Autologous (43) Single or few centers Open-label series

1 Type of transplantation. Autologous: transplantation of tissue obtained from the same patient. Homologous: donor tissue obtained from other individuals of the same species. Heterologous: donor tissue obtained from individuals of different species. 2 First report. Refers to the first full publications of outcomes in patients. 3 Phase III studies refer to double-blind placebo-controlled trials.


summary in Table 2). Although the transplanta-tion methodology differs in the age and number of donor fetuses, the preparation, storage and dissociation of the tissue, and the protocol of immunosuppression used, the clinical evaluation of these patients has been more homogeneous than in the case of adrenal transplants. Patient evaluation was generally done with the Unified

Parkinson’s Disease Rating Scale (UPDRS) and most assays followed the Core Assessment Pro-gram for Intracerebral Transplantations (CAPIT) protocols (60). In the following sections we summarize the clinical results and other rele-vant features of the main open studies and of the two double-blind, placebo-controlled, trials completed in recent years.

Tabla 2. Methodology of the main open-label trials on human fetal mesencephalic transplants (see clinical outcomes in the text)

Country (city)

Ref. n Donors Graft type/ technique

Location of implants

IMS Clinic al follow-

up

PET1 Necropsy2

N.o per hemisphere

Age

Sweden (Lund)

(39, 44) 2 3-4 7-9 w Cells Stereotaxic

C + P Unilateral 6 m 18 m Yes (–) No

(45-47) 2 3-4 6-7 w Cells Stereotaxic

P Unilateral 6 m 3 y Yes (++) No

(48) 23 3-4 6-8 w Cells Stereotaxic

C + P Bilateral 12 m 2 y Yes (++) No

USA (Denver)

(49, 50) 7 1 7-8 w Cells or strands of

tissue/ Stereotaxic

C + P P

Unilateral (2)Bilateral (5)

6 m (4)No (3)

4 y Yes (+) (1)(–) (6)

No

USA (New Haven)

(51) 4 1 7-11 w Tissue/ Stereotaxic

C Unilateral 6 m 18 m Yes (+) (1) Yes (+/–) (1)

USA (Tampa/ New York/Chicago)

(52-54) 6 3-4 6-9 w Tissue/ Stereotaxic

P Bilateral (6-8 tracks/side)

6 m 2 y Yes (++) Yes (+++) (2)

France (Créteil)

(55-57) 5 2-3 6-9 w Cells Stereotaxic

C + P P

Unilateral (4)Unilateral (1)

6 m 1-3 y Yes (++) No

Spain (Madrid)

(58) 10 1 6-15 w Tissue/ Open

surgery

C Unilateral Chronic 5 y No No

USA (Los Angeles)

(59) 13 1 (6) ≥ 2 (7)

6-9 w Tissue/ Stereotaxic

P Bilateral 18 m 6 m Yes No

Ref. (references): Publications where the results appeared. n: number of patients operated in the different trials. In other columns the number of patients is given between parentheses. Location of implants: C: caudate. P: putamen. IMS: immunosuppression. Other notations: w: weeks. m: months. y: years.1 18F-dopa PET. Yes: at least some patients were studied. (−): no significant changes; lesser (+) or greater (++) increase in 18F-dopa uptake. 2 Necropsy. Yes: at least some patients were studied. Uncertain (+/-), minor (+), moderate (++), or major (+++) graft survival and integration. 3 Two patients with MPTP-induced parkinsonism.


Clinical outcome. Open studies

The main methodological features of the open clinical studies performed with heterolo-gous implantation of mesencephalic neurons in PD patients are summarized in Table 2. In most trials the patients (between 2 and 13) suffered advanced PD with motor complications, and one study included two cases of MPTP-induced

parkinsonism. The surgical procedures are varia-ble, with uni- or bilateral caudate and /or puta-minal implantations. The clinical follow-up of the patients varied between 6 months and 5 years and in most cases included neurochemical eva-luation with [18F]-dopa PET analyses. Despite the methodological differences, all studies reported some degree of motor improvement in most

Tabla 3. Methodology of the two double-blind placebo-controlled studies on human fetal mesencephalic transplants (see clinical outcomes in the text)

Double-blind placebo-controlled trials

Denver/New York Group (61) New York/Chicago/Tampa Group (62)

Patients Transplant group: 20 (≤ 60 yrs: 10; > 60: 10)

Placebo group: 20 (≤ 60 yrs.: 11; > 60: 9 )

Transplant group: 23 (1 donor: 11; 4 donors: 12)Placebo group: 11

Follow-up 1 year 2 years

Loss of follow-up 1 (transplant group) 3 (group not specified)

Primary outcome Subjective global self-rating of change(scale from -3 to +3)

Change in UPDRS III

Donors:• N.o/hemisphere• Age

27-8 weeks

1 (11 patients); 4 (12 patients)6-9 weeks

Graft type Strands of tissue(cultured up to 4 weeks)

Fragments of tissue(stored in cool hibernation medium up to 2 days)

Surgical technique Stereotaxic (bilateral in one stage)2 twist-drill holes per side

Stereotaxic (bilateral in two stages)1 burr hole per side

Location of implants Putamen bilateral (4 tracks per side; tissue deposited continuously)

Posterior putamen bilateral (8 tracks per side; 4 deposits per track)

Immunosuppression No Cyclosporine during 6 months

18F-dopa PET One year after surgery:• mean increase in uptake (− in 3

patients)• difference to placebo group• no difference in ≤ 60 / > 60 years

groups

One and two years after surgery:• mean increase in uptake• difference to placebo group• trend to a greater increase in the 4 donors

group

Necropsy1 2 patients (> 60 years): ++

2 patients (1 donor/side): ++2 patients (4 donors/side): +++

III: motor sub-scale of the Unified Parkinson’s Disease Rating Scale. 1 Necropsy. See footnote of Table 2.


patients. In general, patients experienced an in-crease in the «on» period and improvement of symptoms, particularly rigidity and bradykinesia, in the «off» period. «On» dyskinesias were re-duced in some patients but increased in others (see «Complications» below). The clinical bene-fits of the transplants, perceived either imme-diately or around 3-6 months after the surgery, reached a peak at approximately 1-2 years af-ter surgery and then progressively disappeared. There are, however, reports of persistent clinical improvements 5 to 10 years after transplanta-tion. In the few open studies that included con-trols the results reported are also quite distinct. In the Los Angeles group study (Table 2) the blinded evaluation of motor benefits was higher in patients randomly assigned to receive more tissue than a control group. However, the New Haven group (Table 2) failed to see differences between transplanted patients and a control group of similar characteristics that received only pharmacological treatment. In conclusion, the open studies summarized in this section represent hallmarks in the development of cell therapy strategies to fight PD, although their scientific value is limited because of the lack of uniform analytical methodologies.

Clinical outcome. Double-blind studies

To progress in the evaluation of the clinical applicability of fetal mesencephalic cell trans-plantation in PD, two double-blind, placebo-controlled studies have been performed in re-cent years. These are the first controlled phase III clinical trials ever done to test a cell therapy strategy applied to a CNS disease. The major methodological features of these studies are summarized in Table 3. Patients were subjected to stereotaxic bilateral implantation of fetal tis-sue in the putamen. In the two trials a randomly selected placebo group was subjected to sham surgery consisting of craniectomy without du-ramater perforation. Both the patients and the clinical evaluators were unaware of the type of treatment (either «placebo» or «transplant») applied to each case. All patients were evalua-

ted pre- and post-surgically with [18F]-dopa PET scans. The major objective of the studies was the precise evaluation of «actual» symptoma-tic improvement of advanced PD patients after transplantation. The trial of the Denver/New York group (61) placed special emphasis on the effect of patient age on the clinical outcome, whereas the New York/Chicago/Tampa group (62) focused on the clinical effects of transplan-tation of different amounts of tissue.

In the Denver/New York trial transplanted pa-tients showed a statistically significant improve-ment of 18% in the UPDRS III scale in «off» with respect to the placebo group one year after sur-gery. This improvement, affecting mainly rigidity and bradykinesia, was due to the marked effect of the transplants on patients below 60 years of age (34% average improvement). The clini-cal benefit appeared during the first 4 months and was maintained in open evaluations for up 3 years. More recent analysis of this patient co-hort has suggested that the best prognostic fac-tor was responsiveness to levodopa rather than patient’s age. Fetal cell transplantation did not induce significant changes in the diary of fluc-tuations, levodopa dose or cognitive function. In the New York/Chicago/Tampa trial no statistica-lly significant clinical differences in the UPDRS III scale in «off» were observed between patients of the transplanted and placebo groups two years after surgery. There was, however, a trend towards a clinical amelioration proportional to the amount of tissue transplanted. Patients with UPDRS III < 49 who received a larger amount of tissue showed a statistically significant clinical recovery with respect to the placebo controls. In this last subgroup, the clinical effects were perceived around three months after the sur-gery and reached a peak around 6-12 months. There were no significant changes in the diary of fluctuations or the levodopa dose.

Complications

In most of the transplantation trials done with fetal mesencephalic tissue, the procedure was, in general, well tolerated although some complica-


tions associated with the cranial surgery were reported. Intracerebral hemorrhages, epileptic seizures, or postsurgical confusional syndromes were the most frequent complications, normally resolved after a few days of treatment. In one case, patient death by hydrocephaly was repor-ted due to migration of the transplanted tissue to the fourth ventricle. In some patients trans-planted with homologous fetal tissue, the ad-ministration of immunosuppressants has been associated with renal dysfunction or nosoco-mial infections. Besides these complications, the placebo-controlled studies have reported the appearance in some transplanted patients of severe and persistent dyskinesias (characterized by stereotyped abnormal movements of the limbs) during the «off» periods. In the Denver/New York study this complication affected 15% of the patients (younger than 65 years) that had experienced clinical improvement. In the New York/Chicago/Tampa trial, dyskinesias appeared in more than 50% of the patients and were par-ticularly severe in three cases. The «off» dyski-nesias have been suggested to originate from an excess of dopamine released from the trans-plant. However, no correlation between the severity of the dyskinesias and the amount of tissue transplanted or [18F]-dopa uptake in PET studies (see below) has been reported. It has been suggested that the dyskinesias reflect the anomalous innervation of striatal cells by the transplanted neurons, however it cannot be dis-counted that they are generated by other varia-bles (i.e. tissue preparation) different from those in previous open studies.

Neurochemical and histological data

The open trials testing the effect of fetal neuronal transplants have generally included the monitoring of striatal dopamine content using [18F]-dopa PET scans (see Tables 2 and 3). Dopa (a dopamine precursor) is taken up by the dopamine transporter in the nigrostria-tal presynaptic terminals (Figure 1), as well as in the soma and neurites of the transplanted dopaminergic neurons. Therefore accumula-

tion of the marker (which results in a higher amount of emitted radiation) provides an in-dication of striatal dopaminergic innervation. Practically all the studies performed have re-ported an increase of [18F]-dopa uptake in the transplanted area at one-year follow-up. In one study synaptic release of dopamine in the transplant was demonstrated by neuroimaging using [11]C-raclopride, a drug that competes with dopamine for binding to postsynaptic D2 receptors (63). In the two double blind-studies [18F]-dopa uptake one year after the surgery was significantly higher in the transplanted pa-tients in comparison with the placebo group. Thus, the neuroimaging data suggest that fetal mesencephalic grafts survive for several years after transplantation and remain neurochemi-cally and functionally active.

In patients that died during the studies (gene-rally for causes not related to the transplantation procedure) and were subjected to necropsy, the direct histological examination of the striatum normally confirmed the in vivo PET data. The-se postmortem histological analyses have also demonstrated that the surviving dopaminergic neurons account for less than 5% of the several hundreds or millions initially transplanted, which suggests a marked mortality of donor cells du-ring the transplantation procedure.

Current status of the methodology and future developments

After almost 20 years of intense research, the applicability of fetal mesencephalic tissue for treatment of advanced PD is being se-riously questioned. Besides the limitations of this methodology already recognized in the open studies (scarcity of donor tissue and poor cell viability), the double-blind studies have sug-gested that the successful implantation of do-paminergic cells in the striatum is not sufficient to induce significant clinical amelioration of symptoms. The scarcity of donor tissue (seve-ral fetuses per patient) is heightened by ethical and legal concerns regarding the use of human embryonic material. Additionally, the dissection


and manipulation of fetal mesencephalic tissue is technically difficult and results in a mixture of different neural populations with a high in-cidence of cell death. The numerous attempts to minimize these limitations have included the treatment of cells with neurotrophic factors or antioxidants as well as the use of porcine mesencephalic tissue. Although both appro-aches have been tested in experimental animal models as well as in open clinical studies with some positive results, they have not provided clear improvement with respect to the trials utilizing human tissue. Porcine xenographs (40) have been virtually abandoned because of the danger of interspecies infections, although a phase III clinical trial is in progress.

A major limitation of fetal mesencephalic tis-sue transplantation is the relatively poor clinical effect of this procedure despite the fact that the grafted dopaminergic cells remain neurochemi-cally active. Therefore, it seems that the de novo formation of an ectopic SN in the striatum (the result of intrastriatal dopaminergic neuronal grafts) is not sufficient to ameliorate PD patient symptoms. In contrast, it seems that an excess of dopamine or the establishment of aberrant synaptic connections between the transplanted cells and striatal neurons, might lead to severe motor complications that, in terms of patient’s life quality can be even worse than the manifes-tation of the disease.

The limitations and complications derived from the use of fetal mesencephalic tissue have led to the conclusion that, in its current state, this procedure, although conceptually pionee-ring in the field, is not an advisable therapeutic option for PD. Moreover, the double-blind pla-cebo-controlled studies on fetal mesencepha-lic transplantation suggest that dopamine cell replacement in the striatum is not the ideal approach to compensate for the progressive nigrostriatal neuronal loss. Given this scenario, the clinical applicability of other transplantation procedures based on a similar rationale (e.g., intrastriatal grafting of porcine mesencepha-lic neurons or stem cell-derived dopaminer-

gic neurons) is, for the moment, uncertain. It is generally believed that other cell types and methodologies, capable of delivering locally the proper cocktail of trophic factors, might be more effective in protecting the dopaminergic nigrostriatal neurons from whatever insults cause PD and to arrest or even reverse the neurodegenerative process.

Recent pilot studies with other tissues

In recent years there have been numerous attempts to evaluate the potential applicability of dopamine-producing cells other than fetal mesencephalic neurons for transplantation in PD. In the context of this chapter the studies done with carotid body (CB) and retinal cells are particularly relevant since they have been transferred from animal models to PD patients.

Transplantation of carotid body tissue

As described above, the CB is an organ com-posed of highly dopaminergic glomus cells who-se efficacy for antiparkinsonian cell therapy has been tested in animal models of PD (15, 27). A priori, a major advantage of the CB with respect to fetal mesencephalic neurons is that the for-mer can be used for autotransplantation since its unilateral surgical resection has no significant side effects (42), thus circumventing most of the limitations of fetal transplants. Intrastriatal CB grafts can induce notable behavioral ameliora-tion in parkinsonian rats and monkeys due not only to increase of the intrastriatal dopamine level but also to a trophic effect of the trans-plant on the dopaminergic nigrostriatal neurons (28). In fact, CB glomus cells are among those with the highest GDNF content in adult rodents (29). The favorable results in preclinical studies stimulated the execution of two pilot phase I/II open trials to test the feasibility, safety and clini-cal efficacy of CB autotrasplantation in PD. The experimental protocol in these studies con-sisted of the unilateral removal of the CB and the preparation of cell aggregates, which were bilaterally deposited at the putamen through a stereotaxic needle (42) (Figure 5). Typically,


about 150-200 aggregates, with approximately 200 cells each, were obtained from a human CB and, therefore the total number of cells trans-planted was around 15,000-20,000 on each side of the brain.

In the first CB trial, 5 of 6 PD patients showed amelioration of the UPDRS III scale in «off» pe-riods when blindly evaluated by an independent neurologist using masked video recordings (42). Clinical improvement was between 26-74% and 13-52% at 6 and 12 months of follow-up, res-pectively. The patient that did not receive any benefit from the implantation had a fibrous ca-rotid body with major absence of dopaminergic

glomus cells. In the long term a trend towards the presurgical clinical status was observed, although 3 patients still maintained a measura-ble motor improvement (15-48%) 36 months after transplantation. A patient of this sub-study who, for technical reasons, only received cells in one side of the brain (although the needle tracts were done bilaterally), showed clinical im-provement only in the side contralateral to the transplant. The clinical evolution of the patients in the second sub-study performed by the same group was essentially similar to that described above (64). Patients of the second sub-study were subjected to [18F]-dopa PET scans before

Figura 5. Intraputaminal stereotaxic transplantation of dopaminergic cells in Parkinson disease patients. A) Carotid body resected from a parkinsonian patient after it was cleaned of surrounding connective tissue. B) Carotid body cells aggregates transplanted through a stereotaxic needle as illustrated in C. Pt, putamen, Cd, caudate nucleus; Th, thalamus; SNc, substantia nigra pars compacta; SNr, substantia nigra pars reticulata. See reference (42) for further details.

A C

B

1 mm

250 µm

CgS

CS

LS

STS

Th

DG

SNc

SNc

Cd

Pt

Cd


and 1 year after transplantation. This neuroche-mical analysis showed a non-significant 5% in-crease in mean putaminal [18F]-dopa uptake but there was a significant inverse relationship bet-ween clinical amelioration and annual decline in putaminal [18F]-dopa uptake. Complications of CB grafting are similar to those reported for other intracerebral transplantation procedures. However, carotid body grafted patients, unlike those subjected to fetal transplantation, do not seem to develop off-period dyskinesias, which might be related to the fact that they received a much lower number of dopaminergic cells and that the main effect of CB transplants is to sti-mulate intrinsic dopaminergic striatal reinnerva-tion (42, 64).

The pilot studies performed have indicated that CB autotransplantation is a feasible and safe procedure with potential clinical applicabi-lity to treat PD patients. In addition, CB grafting has demonstrated similar symptomatic efficacy as the placebo-controlled mesencephalic grafts. The beneficial effect of CB grafts is higher in young patients with a well-preserved CB and in individuals with a less severe disease. Altoge-ther, these studies suggest that the clinical im-provement observed after CB transplantation, although modest, derive from a true neuropro-tective effect of the transplanted glomus cells on the nigrostriatal pathway. Nevertheless, at pre-sent, CB autotransplantation is not a methodo-logy ready to be evaluated in large controlled phase III trials until the characteristics of suitable candidates and the objectives of the therapy are clearly defined, and the origin and quanti-ty of donor tissue are determined. Although autotransplantation is conceptually attractive, the amount of tissue obtained from a single CB appears to be smaller than that needed to ob-tain significant clinical benefit consistently. The in vitro expansion of CB tissue using either con-ditionally immortalized glomus cells or their di-fferentiation from multipotent precursors (35c), provides possible therapeutic strategies that will surely be explored in future work.

Transplantation of retinal cells

The retinal pigment epithelium contains do-paminergic cells whose suitability for transplan-tation studies has recently been tested in animal models of PD (26, 41). Good results in precli-nical experiments led to the execution of an open pilot study in six patients with advanced PD. About 300,000 human pigment cells atta-ched to gelatine microcarriers were grafted, wi-thout immunosuppression, into the most affec-ted putamen of each patient. All subjects were reported to have a clear improvement in the UPDRS III motor scale in «off» periods that was initiated during the first month of the surgery and improved subsequently. Average reduction of the UPDRS III score with respect to the basal value was 48% at 12 months. No major compli-cations or dyskinesias have been reported (65). Therefore, allografts of retinal pigment epithe-lial cells seem to be well tolerated and clinically effective in PD patients. The mechanism of ac-tion of these transplants is unknown, although a recent study has proposed that, as for CB cells, retinal cells could also release trophic factors to support nigrostriatal neurons (66). This me-thodology is being evaluated in a double blind, placebo-controlled study currently in progress (Table 1).

Administration of trophic fac-tors (GDNF delivery)

Neurotrophic factors are substances (gene-rally proteins or peptides) that, among other functions, regulate the differentiation and main-tenance of neuronal phenotype. These factors also protect neurons against cell death by apop-tosis and/or exogenous pathological insults. Numerous studies both in vivo and in vitro have shown that mesencephalic dopaminergic neu-rons are sensitive to a variety of trophic factors including the glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), brain-derived neurotrophic fac-tor, neurotrophin 4, insulin-like growth factor, fibroblast growth factor and platelet-derived


growth factor, among others. GDNF has con-sistently shown to exert the strongest and most selective in vitro and in vivo trophic actions on nigrostriatal dopaminergic cells (67). In animal models of PD, GDNF can prevent neuronal de-generation and restore the striatal dopaminer-gic function (19b, 68-70). Depletion of GDNF has been found in the SN of human PD brains, which may constitute an additional pathogenic mechanism of the disease.

Although all the precedents summarized in the previous paragraph suggest that GDNF ad-ministration might be a valuable neuroprotec-tive and neurorestorative therapy for PD, the method of GDNF delivery into the striatum has become a critical issue, since GDNF does not cross the blood-brain barrier, diffuses poorly in the extracellular environment and is easily des-troyed by proteases. Different methods of direct administration have been experimentally tested, including intermittent injections, continuous infusion, and implantation of GDNF-releasing biodegradable microspheres (71). Intraventri-cular or intraputaminal GDNF administration has been reported to promote structural and functional recovery in advanced parkinsonian monkeys (70). However, in a controlled clinical trial, monthly intraventricular administration of GDNF failed to provide clinical benefit in ad-vanced PD patients but resulted in frequent ad-verse events (72). A post-mortem examination in one patient suggested that GDNF did not reach the target cells via this route. The safety and clinical effects of a continuous intraputami-nal GDNF infusion have been evaluated in two open-label trials. An initial trial of a British group on five PD patients reported encouraging clini-cal outcomes at one year, while [18F]-dopa PET studies showed an increase in putaminal uptake around the tip of each catheter (73). A second American study on 10 patients using a different delivery protocol also reported positive results at six months (74). However, a randomized pla-cebo-controlled trial involving 34 PD patients showed no significant clinical differences bet-

ween groups at six months, despite increased [18F]-dopa uptake in the recombinant GDNF-treated group (75). The open-label extension of this study was halted due to safety concerns: three patients developed neutralizing antibo-dies, which could potentially cross-react with endogenous GDNF, while in a parallel toxico-logy study some monkeys developed cerebellar damage.

In this context, research interest has focused on other indirect methods of GDNF delivery, such as cell therapy, i.e. the intrastriatal grafting of GDNF-producing cells (CB or genetically modified cells), and in vivo gene therapy using GDNF-encoding viral vectors (71). CB cells have already been tested in PD patients with good results in less-affected and younger pa-tients, this finding being compatible with the tro-phic action of the grafted tissue. Besides GDNF, CB glomus cells also produce BDNF and other factors, so they could supply damaged neurons with the appropriate cocktail of trophic factors to encourage nigrostriatal regeneration. Despi-te these stimulating results, the use of CB or other cell types to deliver trophic factors in PD patients is still under debate and experimental evaluation.

Cell therapy in other CNS disorders

Huntington’s disease

Huntington’s disease (HD) is a dominantly inherited neurodegenerative disorder caused by a polyglutamine expansion in the gene en-coding the huntingtin protein. Its pathological hallmark is the preferential loss of medium size spiny GABAergic neurons in the striatum, although degeneration progressively extends to the cortex and other brain regions. The function of huntingtin is unknown and the pathogenesis of HD remains obscure. The disease is clinically


characterized by movement disorders (mainly chorea), dementia and behavioral disturbances, leading to progressive disability and death. The relatively selective striatal damage at early sta-ges of HD made this disease a potential target for cell therapy shortly after the initial experi-mental work on PD. Animal (normally rodents) models of HD are obtained by striatal neural death-induction either with excitotoxic drugs or after metabolic poisoning. There also transgenic mouse models of HD expressing poliglutamine repeat expansions. Numerous preclinical stu-dies have demonstrated that transplants of fe-tal striatal cells survive in the host striatum and induce reversion of the motor and behavioral abnormalities. More recently, other donor tis-sues, such as neural progenitor cells, pre-diffe-rentiated GABAergic neurons obtained from a neural stem cell line, or several types of trophic factor-producing cells, have also been assayed in rodent HD models (76).

Transplantation of human fetal striatal tissue has been undertaken in a few open clinical trials each involving each 4-7 mild to moderate HD patients. A Core Assessment Program for In-tracerebral Transplantation in HD (CAPIT-HD) has been developed in order to standardize the study protocols. Some bilaterally transplan-ted patients had small improvements in clinical measures at one-year, which correlated with an increase in the striatal and cortical metabolic activity measured by PET. One autopsy study performed 18 months after transplantation de-monstrated surviving grafted cells innervated by host-derived dopaminergic fibers (77). However, in the long-term follow-up, a progressive clinical and PET decline has been consistently observed (78). Porcine xenografts have also been tried in 12 HD patients, with no change in functional capacity one year after unilateral transplantation (79). Although improvements in transplantation procedures and patient selection could lead to better outcomes, striatal cell replacement alone seems unlikely to induce a long-lasting benefit taking into account the progressive and exten-

sive nature of neurodegeneration in HD. In this context, other strategies aiming to exert a neu-roprotective effect on damaged neurons should be further developed.

Amyotrophic lateral sclerosis

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a de-vastating disease characterized by progressive upper (cortical) and lower (spinal) motor neu-ron degeneration. The absence of disease-modi-fying therapies has prompted experimental and clinical research on cell therapy. Although the etiopathogeny of ALS is unknown it seems that alteration of redox regulation both in neurons and astrocytes is a major cause of the disease. In a minority of cases the disease is familial due to a mutation (G93A) in the Cu-Zn superoxide dismutase (SOD1), and overexpression of the mutant human SOD1 in transgenic mice results in a syndrome that resembles human ALS. Using this animal model, several cell-replacement and/or neuroprotective strategies have been tested (80). Potential benefits have been advocated after transplantation into the spinal cord of hNT cells (derived from a human teratocarci-noma cell line), bone marrow cells, Sertoli cells, neural precursor cells, astrocytes derived from embryonic stem cells, or different genetically modified cells to produce trophic factors. Intra-venous administration of human umbilical cord blood mononuclear cells has also been tried in rodents with promising results.

Some cell therapy strategies have been assa-yed on ALS patients in small phase I-II clinical trials: twelve subjects were subjected to intra-thecal implantation of encapsulated genetically engineered baby hamster kidney cells releasing human ciliary neurotrophic factor (81), and se-ven patients participated in a study on intraspinal cord implantation of autologous mesenchymal stem cells (82). Although preliminary results of the later study might be encouraging, the wides-pread nature of cell death in ALS (involving the spinal cord, brainstem and cortex) is a daunting


challenge for focal cell replacement strategies. On the other hand, diffuse trophic factor deli-very from glial cells or combined approaches (cell replacement plus growth factor delivery) may show promise in modifying the course of the disease.

Currently, numerous cell-based therapies for ALS are being performed in institutions outsi-de the academic environment without sufficient scientific knowledge or medical control. The cli-nical outcome of these operations is not well documented and therefore there is urgent need of phase III (double-blind and placebo-contro-lled) studies to clarify the actual efficacy of cell therapy in ALS.

Spinal cord injury

In recent years cell-based therapies have been intensely studied to ascertain whether they exert favorable effects on traumatic spinal cord injury (SCI). Several groups have repor-ted excellent results in animal models and some pilot clinical studies are being performed. The experimental strategies designed for cell thera-py in SCI vary depending on the nature of the lesion (complete or incomplete), and whether the treatment is applied few hours/days (acute) or weeks/months (chronic) after the lesion. In the case of complete spinal cord lesions the ul-timate goal is to induce neuronal regeneration, a challenging but as yet unreachable scenario that is worth pursuing since it is expected that a significant functional recovery could be obtai-ned even if only 1% of the severed axons are replaced or regenerated. In incomplete spinal cord lesions the functional failure is derived in part from axons partially damaged by contu-sion, edema, or ischemia. In these cases neuro-protective measures can help to obtain axonal re-myelinization and sprouting.

A variety of cell types tested in animal models of SCI have shown considerable therapeutic potential after intraspinal transplantation or fo-llowing administration by other routes, such as

intravascular, intraventricular or intrathecal (83). Schwann cells have been transplanted into spi-nal cord animal models based on the regene-rative capacity of this cell type observed in the peripheral nervous system. Similarly, olfactory ensheathing glia, a specialized form of glial cell able to promote regeneration of axons in the olfactory nerve, have been tested, with some success, for regeneration in spinal cord injuries (84). Neural progenitor cells have been implan-ted in spinal cord animal models yielding beha-vioral recovery presumably due to neurogenesis and synaptogenesis from the transplanted cell preparation or from donor-host humoral inte-ractions that may support regeneration of host axons. Most of the effects exerted by either neural or stem cell-derived progenitors appear to be due to their preferential differentiation to oligodendrocytes or astrocytes. In fact oligo-dendrocytes derived from human embryonic stem cells have also been reported to myelinate axon in foci of contused spinal cords. An enti-rely different approach relies on the capacity of endogenous mesenchymal or immune cells to provide axonal regeneration. With this objective appropriately activated macrophages have been shown to provide functional recovery.

Regarding the clinical application of cell the-rapy in SCI, several small phase I-II pilot studies using various cells types have shown promising but inconclusive results. Twenty patients with acute (n = 7) or chronic (n = 13) SCI recei-ved autologous bone marrow transplantation by intra-arterial (via catheterization of a. ver-tebralis) or intravenous route, with promising results in the acute phase (up to 1 month after injury) (85). Eight patients were subjected to intraspinal injection of incubated autologous macrophages within 14 days of injury, three of whom achieved neurological improvement (86). For the purpose of clinical applicability a number of groups have demonstrated the production of olfactory ensheathing glial cells (OECs) by tissue culture of the olfactory epi-thelium obtained from biopsy samples of the


upper nasal lining. Others have used OECs obtained from fetuses or cadavers. An initial published clinical trial has shown no adverse effects one year after transplanting autologous cultured mucosal OECs into spinal injuries (87). Two other neurosurgical teams (one in Beijing and another in Lisbon), have adopted transplantation of olfactory tissue as a clinical procedure for treating patients with SCI. The results from these groups are uncertain, not well documented, and criticized by part of the scientific community (84, 88). Apart from press commentaries, no real breakthroughs in clini-cal achievements have been proved. Therefore, validation of these and other procedures must await the outcomes of independent randomi-zed double-blind controlled trials that will su-rely be performed in the near future.

Stroke

Among neurological disorders, stroke re-presents a leading cause of death and disabi-lity in developed countries and despite inten-se research only a few options exist for the treatment of stroke-related infarction of brain tissue. Numerous preclinical experimental stu-dies on cell therapy have been performed in rodent models of stroke (endothelin-induced transient middle cerebral artery occlusion or collagenase-induced intracerebral hemorrha-ge), which include direct grafting of cells in the infarcted area or surroundings as well as intra-ventricular, subarachnoidal, intra-arterial or in-travenous cell administration. Among the cells tested are adult stem cells from bone marrow, umbilical cord and neural or adipose tissue, as well as embryonic stem cell-derived neu-ral (neurons and glial) cells. Some studies have used engineered neural stem cells to produce angiogenic factors (VEGF and others) as well as the GDNF-secreting CB cells. In experimen-tal stroke, cell therapy can partly reverse some behavioral deficits. However, the underlying mechanisms remain unknown as most studies

reveal little, if any, evidence for neuronal repla-cement and the observed behavioral improve-ments appeared to be related more to a graft-derived induction of a positive response in the remaining host tissue than to cell replacement by the graft itself (89-91).

From a clinical standpoint the information available pertains only to a few pilot studies performed on a small patient cohort. The group of Pittsburgh pioneered the clinical application of cell therapy for stroke by performing stereo-taxic implantation of human neuronal cell lines with promising results. However, a controlled randomized trial by the same group in patients with ischemic or hemorrhagic subcortical mo-tor strokes (treatment n = 14; control n = 4) failed to show significant benefit in the primary outcome measure (92). A study based on trans-plantation of fetal porcine cells was terminated by the USA Food and Drug Administration after the inclusion of five patients. Autologous mesenchymal stem cell transplantation by intra-venous infusion, which appear to migrate to the site of the lesion, has also been tested in some clinical trials. One of the most representative studies is that performed by Bang et al. (93) on five stroke patients and 25 controls. In this trial the treated group achieved a better functional outcome at six months compared with controls. As indicated above, both the mechanisms of ac-tion of transplanted cells and their actual clinical efficacy are still undetermined. Cell therapy in stroke is a promising experimental approach but for the moment not a realistic therapeutic option.

Other diseases

Besides the preclinical and clinical studies already discussed, cell-based neuroregenerati-ve or protective therapies have been assayed in several other neurological disorders. Neural precursor cell transplantation has been shown to attenuate the severity of experimental au-toimmune encephalomyelitis, an animal model


of multiple sclerosis. Intraventricular transplan-ted cells migrated along white matter tracts and seemed to down-regulate the acute inflamma-tory process and reduce axonal injury (94). A different procedure, autologous hematopoie-tic stem cell transplantation, has been used to treat patients with severe multiple sclerosis. In a series of 178 patients, 63% were reported to have neurological improvement or stabilization at a median of 41.7 months after transplanta-tion (95). However, a recent autopsy study on five patients who received this transplant found evidence for ongoing demyelination and neuro-degeneration.

Hematopoietic stem cell transplantation, in-cluding umbilical cord blood transplantation, is being currently under consideration as a pos-sible therapy in young patients with storage diseases such as mucopolysaccharidosis, muco-lipidosis, leukodystrophies, Krabbe disease, Tay-Sachs disease or neuronal ceroid lipofuscinosis. Intracranial transplantation of neural stem cells has recently shown striking beneficial effects in a mouse model of Sandhoff disease, a lethal gan-gliosidosis (96). However, further basic research in these areas is needed before the experimen-tal data warrant the translation to patients of safe procedures with reasonable and well-de-monstrated clinical efficacy.

Conclusions and perspectives

Although neuroregeneration and neurorepair are concepts and goals intimately associated with the development of modern neuroscience, it is only in the last 25 years that experimental and clinical studies have systematically addressed the possibility of neural reparation by means of cell therapy. Diseases of the brain and spinal cord represent especially daunting challenges for cell-based strategies of repair, given the multiplicity of cell types within the adult central nervous

system, and the precision with which they must interact in both space and time. Nonetheless, a number of diseases are, in principle, especially appropriate for cell-based therapy, in particular those in which single phenotypes are lost, and in which the re-establishment of vectorially speci-fic connections is not entirely requisite for the-rapeutic benefit. In recent years, the preclinical and clinical studies on Parkinson’s disease initia-ted in the 1980s have been extended to other neurological diseases, such as Huntington’s di-sease, amyotrophic lateral sclerosis, stroke, and spinal cord injury, among others.

Originally, the goal of cell therapy was the restoration of function by replacement of dead cells with healthy ones. However, in most recent studies the primary interest has shifted from cell replacement to neuroprotection, in the hope that application of the proper cocktail of trophic factors released from cells grafted at the injured sites or administered systemically would either prevent neuronal damage or activate intrinsic regenerative mechanisms leading to restoration of the destroyed neurons or synaptic connec-tions. The discovery of neurogenic centers in the adult brain (in the subventricular zone of the lateral ventricles and the dentate gyrus of the hippocampus) has stimulated research on the potential therapeutic applicability of pre-existing neuronal precursors, which under appropriate conditions could migrate and differentiate to replace destroyed cells in other parts of the brain. This possibility is, however, speculative and only based on preliminary experimental ob-servations. Recently, much attention has been focused on the relevance of hippocampal neu-rogenesis to the pathophysiology and treatment of mood disorders. Indeed all major pharmaco-logical and non-pharmacological treatments for depression enhance hippocampal neurogenesis and suppressing hippocampal neurogenesis in mice blocks behavioral responses in some anti-depressant-sensitive tests.

Neurologic cell-based therapies have been also much influenced by the development of


embryonic stem (ES) cell research, as these cells have the potential to give rise in vitro to any cell type of the adult organism. ES or iPS cells are generally thought to offer a promising source of neurons suitable for cell replacement therapy in Parkinson’s disease and other disorders. Most investigators in the field are, however, aware that translation of ES/iPS cells to the clinical setting is confronted with numerous limitations and unsolved problems. Differentiation of ES/iPS cells to mature neurons is still not well con-trolled and therefore the possibility of tumor generation is high. In addition, the short lasting viability of neurons derived from human ES(iPS cells compromises their use in cell therapy. ES/iPS cell-derived neuronal types may not possess the complete set of phenotypic features of their in vivo counterparts, which may contribute to the limited success of these cells in repairing injured or diseased brain and spinal cord in ani-mal models. Hence, efficient generation of neu-ral subtypes with correct phenotype remains a challenge. Consequently, major hurdles still lie ahead in applying human ES/iPS cell-derived neural cells clinically.

Although cell therapy constitutes an actively progressing research field, it is also the subject of numerous criticisms and concerns. The scien-tific and technical advances being made are qui-te heterogeneous and erratic, as in many cases transplantation studies are performed without a precise knowledge of the putative therapeutic products released by the cells, their mechanisms of action, or even the type of cell transplanted. Moreover, together with well-controlled pilot clinical trials being performed in academic re-search environments, there are institutions offe-ring cell-based therapies to heavily deteriorated patients without having performed the neces-sary scientific preclinical studies and methodo-logical (safety and feasibility) tests. In conclusion, neurologic cell-based therapies still remain a promise rather that a reality, and effective clinical translation in this area will necessarily require a period of sustained and solid basic research.

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IntroducciónLos avances en el campo de la genética

molecular están teniendo una importante repercusión en nuestra capacidad para com-prender, diagnosticar y tratar variedad de enfermedades congénitas y adquiridas. Así, la posibilidad de introducir genes en células eu-cariotas ha permitido comenzar nuevos pro-tocolos de marcado y de terapia génica (TG) humana que no resultaban abordables hace unos pocos años.

Tal como se muestra en la figura 1, la TG pue-de realizarse por medio de dos aproximaciones diferentes. La primera, denominada «terapia gé-nica de adición», se basa en la inserción del gen

terapéutico bajo el control de secuencias pro-motoras y potenciadoras de la expresión génica; todos los protocolos de TG que actualmente se realizan en la clínica utilizan esta aproximación. La segunda, conocida cómo «terapia de susti-tución», tiene por objeto la sustitución del gen afectado por la versión correcta del mismo gen. En ella, el gen introducido se encontraría en su entorno natural y, por tanto, bajo el control de los sistemas fisiológicos que regulan su expre-sión. Debido la baja eficacia de recombinación homóloga actualmente conseguida en células eucariotas, esta aproximación todavía no se en-cuentra en fase de aplicación clínica.

Desde el punto de vista práctico, la TG puede realizarse tanto in vivo (inoculando el vector de

6 Avances de la terapia génica en el tratamiento de enfermedades monogénicasJuan A. BuerendIvIsIón de hematopoyesIs y terapIa génICa

CIEMAT y CIBER de Enfermedades Raras

Figura 1. Modalidades básicas de terapia génica.

Terapia de adicciónInserción génica• Alta eficacia de inserción • Inserción génica homo o heteróloga• Limitaciones de regulación

Terapia de sustituciónRecombinación homóloga• Baja eficacia de recombinación • Precisa reparación génica• Óptima regulación de expresión

Aplicable en terapia humana No implantado en terapia humana

Avances de la terapia génica en el tratamiento de enfermedades monogénicas 85

transferencia en el paciente) como in vitro. En este caso, la transferencia génica se realiza sobre células extraídas del paciente, las cuales, una vez modifica-das genéticamente, son reinfundidas en él.

En general, los vectores de transferencia gé-nica presentan una eficacia de transducción notablemente superior cuando se utilizan in vitro sobre las células diana a transducir frente a cuando se inoculan in vivo. En una serie de ensayos clínicos, no obstante, se utilizan proto-colos de TG in vivo, en los cuales los vectores de transferencia génica se introducen por vía sisté-mica o en los tejidos del paciente afectados por la enfermedad (fig. 2).

La revista Journal of Gene Medicine (http://www.abedia.com/wiley/index.html) ha reportado que hasta junio de 2010 se habían puesto en marcha un total de 1.644 ensayos clínicos de TG. Aunque la mayor parte de estos protocolos han tenido

como objeto el tratamiento del cáncer (64,5%), los resultados más significativos han estado re-lacionados con el tratamiento de enfermedades monogénicas. Tal como puede observarse en la figura 3, de todos los vectores utilizados, los re-trovirales (gammarretrovirales) y los adenovirales son los de uso más frecuente en estos ensayos. No obstante, ya se observa la puesta en marcha de un total de 27 ensayos (1,7% del total) con vectores lentivirales, propuestos como una nueva familia de vectores de mayor seguridad y eficacia respecto a los retrovirales.

El fundamento para la utilización de vecto-res virales es el de aprovechar su gran capa-cidad infectiva y, en algunos casos, de integrar su genoma en la célula huésped, eliminando su potencial replicativo en la célula infectada (transducida). El virus modificado (vector) sólo será capaz de llevar a cabo un único ciclo de

Figura 2. Modalidades básicas de terapia génica.

Terapia génica ex vivo Terapia génica in vivo

Medidas modificadas genéticamente Vectores de transferencia génica

Tipos de medicamentos génicos


infección, lo que le permitirá actuar como ve-hículo seguro del gen terapéutico. Todos los elementos necesarios para que el vector tera-péutico pueda empaquetarse e infectar las cé-lulas diana son aportados con las denominadas líneas celulares empaquetadoras. En la figura 4 se muestra un ejemplo de cómo modificar un gammarretrovirus para producir un vector gammarretroviral.

Criterios para definir el vector de transferencia a utilizar

El éxito terapéutico de la TG depende funda-mentalmente de 3 cuestiones. En primer lugar, resulta necesario insertar eficazmente el trans-

Figura 3. Distribución de los ensayos clínicos de Terapia Génica por indicaciones y vectores.

Cancer diseases 64,5% (n = 1.060)Cardiovascular diseases 8,7% (n = 143)Monogenic diseases 8,2% (n = 134)Infectious diseases 8% (n = 131)Neurological diseases 1,8% (n = 30)Ocular diseases 1,1% (n = 18)Other diseases 2,4% (n = 40)Gene marking 3% (n = 50)Healthy volunteers 2,3% (n = 38)

Adenovirus 23,8% (n = 400)Retrovirus 20,5% (n = 344)Naked/Plasmid DNA 17,7% (n = 304)Vaccinia virus 7,9% (n = 133)Lipofection 6,5% (n = 109)Poxvirus 5,5% (n = 93)Adeno-associated virus 4,5% (n = 75)Herpes simplex virus 3,3% (n = 56)Lentivirus 1,7% (n = 29)Other categories 4,9% (n = 82)Unknown 3,3% (n = 55)

Indications addressed by Gene Therapy Clinical Trials Vectors used in Gene Therapy Clinical Trials

Gen terapéutico

Figura 4. La Manipulación Genética de los Retrovirus: De virus patogénico a medicamento génico..

Ciclo de infección del retrovirus MoMuLV Generación de células empaquetadoras de vectores terapéuticos

Citoplasma

EnsamblajeFusión de membranas

ARN

ADNbc

ARN ADN Integración Núcleo

PROT mRNA

Célula productora de vectores retrovirales

Integración

ARN

ARNmARNmARNm

Núcleo

Vector retroviral terapéutico

env (SU)

env (TM)

gag (matriz)

gag (cápsida)

RNApol LTR LTR

LTR Gag Pol Env LTR


gén terapéutico en las células diana deseadas; por otra parte, también es necesario que el gen se exprese en cantidad suficiente y durante el tiempo suficiente para que se obtenga benefi-cio clínico, y, por último, como en todo medi-camento, la eficacia terapéutica de la TG viene limitada por la relación entre el beneficio clínico que produce y los riesgos que conlleva.

En el caso de enfermedades asociadas a de-fectos monogénicos resulta evidente que la cura-ción de la enfermedad sólo se obtendrá cuando las células de los tejidos afectados tengan acceso permanente a niveles umbrales de la proteína deficitaria. Una de las aproximaciones más direc-tas para lograr este objetivo se fundamenta en la transducción de la población celular afectada, o de sus células progenitoras, con vectores que permitan la integración estable del transgén en el genoma celular. En los protocolos clínicos diseña-dos al efecto se han utilizado fundamentalmente vectores gammarretrovirales, en particular los derivados del virus de la leucemia murina de Mo-loney (MoMLV). Como ya se ha indicado, los vec-tores lentivirales constituyen una herramienta de reciente aplicación en el campo de la TG, ya que permiten la integración del transgén en células quiescentes y ofrecen una mayor seguridad en comparación a los vectores gammarretrovirales.

Estudios y ensayos clínicos representativos sobre los beneficios y limitaciones de la terapia génica actual

Hasta que los laboratorios de genética mole-cular ofrezcan alternativas eficaces para el trata-miento de mutaciones dominantes, el tratamien-to genético de las enfermedades monogénicas se está centrando en las que están asociadas a mutaciones monogénicas recesivas, en las cuales la expresión de una copia funcional del corres-

pondiente transgén pueda ser suficiente para la curación de la enfermedad.

En las patologías en las que no es posible o no es del todo eficaz la administración exóge-na de la proteína deficitaria, se han planteado alternativas de terapia celular o génica sobre estos pacientes. En la actualidad existen unas 30 enfermedades monogénicas que habitualmente se tratan mediante trasplante de progenitores hematopoyéticos procedentes de donantes his-tocompatibles sanos. Puesto que en promedio sólo 1 de cada 3 pacientes posee un donan-te familiar HLA idéntico, y debido a los riesgos asociados al trasplante alogénico a partir de do-nantes alternativos, se considera una larga serie de enfermedades monogénicas candidatas a ser tratadas mediante TG.

A continuación se muestra el fundamento de algunos de los protocolos de TG de enferme-dades monogénicas que han sido más relevan-tes, bien por su eficacia terapéutica, bien por las dudas levantadas respecto a los riesgos que entraña esta nueva alternativa terapéutica.

Inmunodeficiencia ADA

Entre las enfermedades que primero se con-sideraron para su tratamiento génico destacan las inmunodeficiencias severas combinadas asociadas a mutaciones en los genes adenosina deaminasa (ADA-SCID) y gamma-c, asociado a la inmunodeficiencia X1-SCID. La ausencia de ADA implica una acumulación celular del sustra-to desoxiadenosina trifosfato, lo cual resulta par-ticularmente tóxico en los linfocitos T (fig. 5).

Figura 5. Esquema del fundamento bioquímico de la inmunodeficiencia severa combinada ADA.

Adenosina

Deoxidante

↑ dATP

Iosina

DeoxiinosaADA


Ésta fue una de las primeras patologías en ser tratadas mediante TG con vectores retrovira-les, primero en el National Institutes of Health (NIH) de Estados Unidos [1, 2], y luego en el Hospital S. Raffaelle de Milán [3-5]. Las alterna-tivas que se consideraron para el tratamiento genético de esta enfermedad tenían por objeto la transferencia del gen ADA en los linfocitos T de los pacientes o en las células madre hemato-poyéticas (CMHs). En todos los casos se com-probó la presencia de células corregidas gené-ticamente en la sangre de los pacientes, aunque tan sólo se obtuvieron modestas evidencias de beneficio clínico. Los mejores resultados se han obtenido recientemente por los grupos de Milán (A. Aiuti) y de Londres (B. Gaspar y A. Thrasher): utilizando un protocolo en donde se retiró la administración de la proteína ADA, los

pacientes se acondicionaron con un tratamien-to submieloablativo previo a la perfusión de las células CD34+ transducidas con vectores ga-mmarretrovirales portadores del gen ADA [5, 6]. El esquema básico seguido en estos ensa-yos clínicos es el que se muestra en la figura 6: se extrajeron células de la médula ósea de los pacientes, se purificaron las células CD34+ y se transdujeron con los vectores terapéuticos; finalmente, la población conteniendo las célu-las corregidas genéticamente fueron perfundi-das en los pacientes tras su acondicionamiento con dosis submieloablativas de busulfán (fig. 6). La gran mayoría de estos pacientes mostraron beneficios clínicos incuestionables, sin que en ninguno de ellos se produjeran efectos adver-sos graves. Este protocolo constituye uno de los ejemplos más significativos de la eficacia y la

Figura 6. Esquema básico del protocolo utilizado para la terapia génica de la inmunodeficiencia ADA-SCID.

Infusióndel inóculo corregido genéticamente

Acondicionamiento submieloablativo

Transducción con vectores terapéuticos

Recolección de células de médula ósea

Selección de células CD34+


seguridad que la TG puede ofrecer a pacientes con enfermedades monogénicas.

Inmunodeficiencia X1-SCID

Ésta inmunodeficiencia representa aproxi-madamente la mitad de todas las inmunodefi-ciencias graves combinadas y está asociada a un defecto en la cadena γc, una proteína que forma parte de numerosos receptores de interleuci-nas (fig. 7).

La TG de estos pacientes también se ha rea-lizado mediante la transferencia del vector te-rapéutico a células CD34+, en este caso sobre pacientes que no recibieron acondicionamiento alguno. En el 90% de los pacientes se obser-vó reconstitución del sistema inmunitario con células que contenían el gen terapéutico y una evidente mejoría clínica, que, como en el caso anterior, permitió que los pacientes abando-naran las unidades de aislamiento a las pocas semanas del tratamiento [7]. Se considera que

este protocolo, desarrollado en Francia por A. Fischer y M. Cavazzana-Calvo, es el primer pro-tocolo de TG de una enfermedad monogénica que ha demostrado eficacia terapéutica incues-tionable (fig. 8). El equipo de Adrian Thrasher, en Londres, ha obtenido resultados similares en cuanto a la eficacia terapéutica del proceso [8]

Figura 7. Señalización defectiva por receptores de citoquinas en inmunodeficiencia X1-SCID.

Activación génica

JACK3

NÚCLEO

py-stat

J3 J3 J3

γc γc γc a

IL-7R IL-4R IL-2R

a a b

Figura 8. Rescate de la inmunodeficiencia por terapia génica en inmunodeficiencia SCID-X1.

9.000

8.000

7.000

6.000

5.000

4.000

3.000

2.000

1.000

0

Linf

ocito

s T/m

cl

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

P5

P7P8

P4

P2P9 P1

P6

P10

Meses después de la terapia génica


¿¿??, pues todos los pacientes pediátricos trata-dos han mostrado clara mejoría clínica.

Como veremos más adelante, 5 de los 15 pacientes X1-SCID tratados por TG desarrolla-ron leucemia linfocítica como consecuencia de esta intervención terapéutica, si bien 4 de ellos respondieron satisfactoriamente al tratamiento antitumoral. Las causas y consecuencias de este proceso maligno producido como consecuen-cia del tratamiento con vectores retrovirales se discuten, así mismo, más adelante.

Granulomatosis crónica

Constituye otra inmunodeficiencia que ha re-cibido atención particular para su tratamiento genético. Esta enfermedad se caracteriza por una deficiente respuesta de las células fagocí-ticas para generar anión superóxido, lo que se manifiesta mediante un síndrome recurrente de infecciones y formación de granulomas (fig. 9).

Estudios experimentales sugieren que la co-rrección genética de, aproximadamente, un 5% de los granulocitos circulantes, será suficiente para reportar un beneficio terapéutico [9]. Los estudios clínicos basados en el trasplante de células CD34+ transducidas con vectores re-trovirales y trasplantadas en pacientes no acon-dicionados, no mostraron beneficio terapéutico. No obstante, un ensayo clínico realizado por Manuel Grez, en Frankfurt, en pacientes que recibieron acondicionamiento mieloablativo, ha mostrado evidente mejora clínica en los 2 pacientes tratados [10]; sin embargo, en este ensayo clínico también se han descrito efectos adversos graves similares a los descritos en pa-cientes X1-SCID [11].

Hemofilia

La hemofilia es una enfermedad ligada al cro-mosoma X originada por mutaciones en el gen que codifica el factor VIII (hemofilia A) o el fac-tor IX (hemofília B) de la coagulación. A pesar de los avances producidos en la administración intravenosa de estos factores, su corta vida media

y elevado coste han incentivado la investigación en el campo de la TG de esta enfermedad. En el tratamiento de la hemofilia A y B se han seguido múltiples enfoques, que incluyen la transducción de fibroblastos con plásmidos portadores del gen del factor VIII truncado, perfusión intravenosa de vectores retro o adenovirales con el gen del fac-tor VIII, o la transducción de músculo esquelético o hígado con vectores AAV portadores del gen del factor VIII y el minigen del factor IX, respec-tivamente. Ninguno de los protocolos puestos en marcha hasta el momento ha conseguido expresar a largo plazo el factor de coagulación correspondiente a niveles terapéuticos. Trabajos más recientes han conseguido alcanzar niveles del factor de coagulación del orden del 5-25% en perros hemofílicos o primates no humanos, me-diante 3 aproximaciones diferentes. En un caso se administró por vía sistémica vectores retrovirales en perros neonatales, en donde los hepatocitos se encontraban con alta tasa proliferativa, y se han utilizado también vectores AAV para trans-ducir músculo esquelético por vía intravascular, o el hígado por vía de la arteria hepática o portal. La administración de vectores AAV al hígado se contempla actualmente como uno de los proce-dimientos más prometedores para el tratamiento de la hemofília, pues ya se han alcanzado valores de alrededor del 10-12% de los valores normales, aunque la expresión se mantuvo durante sema-nas, en lugar de años, como fue el caso de perros hemofílicos [12]. La presencia de células CD8+ de memoria contra antígenos de la cápsida viral parece ser la causante de la corta duración en la que se expresó el factor. La inmunosupresión del paciente hasta que la cápsida viral se aclare de sus tejidos, o la utilización de serotipos diferentes de AAV (AAV-8 en lugar de AAV-2), se contemplan como alternativas de interés para mejorar la efi-cacia clínica del procedimiento.

Hemoglobinopatías

De entre ellas, destacan las talasemias y la anemia de células falciformes. Algunos genes de hemoglobinopatías (alpha-thal, beta-thal y HbS)


causan enfermedad (talasemia alfa, talasemia beta y anemia drepanocítica, respectivamente), pero otros (HbE y HbC) sólo causan manifestaciones clínicas graves cuando se combinan con alguno de los genes del primer grupo. Los niños con ta-lasemia suelen nacer sin manifestaciones clínicas, pero la anemia surge entre los 6 meses y los 2

años de vida. La sustitución de la globina-ß defec-tiva o ausente en pacientes con talasemia ß, pue-de ser curativa. Resultados preclínicos recientes del grupo de G. Ferrari muestran la corrección de células humanas de pacientes con talasemia major. La caracterización de células derivadas de la médula ósea de estos pacientes antes después

Figura 9. Fundamentos moleculares de la granulomatosis crónica.


de la transferencia del gen terapéutico mostró una elevada eficacia de transducción, restaura-ción de la síntesis de la hemoglobina, rescate de la apoptosis y la corrección de los defectos en eritropoyesis. En general, estos resultados pro-porcionan un fundamento sólido para una futura traducción clínica de este protocolo de TG [13].

Anemia de Fanconi

La anemia de Fanconi (AF) es una enferme-dad autosómica recesiva, poco frecuente entre la población pero de muy mal pronóstico. Los pacientes suelen desarrollar anomalías congé-nitas múltiples (en el 65% de los casos), fallo de médula ósea y predisposición a cáncer. En promedio, la manifestación de la aplasia se ob-serva alrededor de los 8 años de edad, si bien prácticamente todos los pacientes que alcanzan los 40 años muestran fallo de médula ósea. Una de las características de esta enfermedad, que la hace particularmente apropiada para su trata-miento por TG, radica en la ventaja selectiva de las células corregidas genéticamente respecto a las células defectivas en los genes de Fanconi [14]. La AF es consecuencia de mutaciones o deleciones en cualquiera de los 13 genes de AF relacionados con la estabilidad genómica de estas células. Los resultados publicados sobre los ensayos realizados en fase I no manifesta-ron beneficios terapéuticos evidentes (Liu et al., 1999) [15]. Nuestro equipo de investigación ha publicado recientemente resultados preclínicos que abren nuevas expectativas al tratamiento por TG de esta enfermedad mediante nuevos procedimientos de manipulación celular y nue-vos vectores lentivirales, más eficaces y seguros respecto a los utilizados anteriormente [16].

Fibrosis quística

El gen de la fibrosis quística (FQ) está locali-zado en el cromosoma 7 y posee un tamaño de 6,7 kB. En el 75% de los pacientes enfermos de FQ, la enfermedad se produce por un defecto en la posición 508. Como consecuencia de las

deficiencias de este gen se produce una altera-ción física y química de las secreciones de las vías respiratorias y de las enzimas pancreáticas. Debido al defecto en el transporte del cloro entre las células, las mucosidades se hacen muy densas, dificultando la expulsión del moco bron-quial y facilitando su infección con patógenos difíciles de eliminar. La TG prioritaria de esta en-fermedad radica en la inserción del gen de la FQ en las células respiratorias. Se han desarrollado diversos ensayos clínicos en fase I utilizando fundamentalmente vectores adenovirales y, más recientemente, vectores no virales. Los proto-colos con vectores adenovirales han mostrado ventajas respecto a su eficacia de transducción de las células diana; sin embargo, también han puesto de manifiesto su inmunogenicidad, al ha-berse generado anticuerpos que neutralizaron la eficacia de los vectores. Las formulaciones no virales facilitarán la administración repetida de fármaco genético. En todo caso, estos ensayos clínicos están mostrando mayores complicacio-nes de la inicialmente previstas.

La seguridad en terapia génica

Problemas en el tratamiento de la deficiencia de la ornitín transcarbamilasa

Esta es una enfermedad en la que los pacien-tes carecen de una enzima clave del metabo-lismo de aminoácidos, la ornitín transcarbami-lasa (OTC), lo que da lugar a una acumulación potencialmente fatal de amoniaco en la sangre. Puesto que la actividad OTC está normalmen-te presente en el hígado, se considera que éste es el tejido diana de vectores que expresen la versión correcta del gen OTC. En virtud de la eficacia de los adenovirus para infectar células hepáticas, se propuso utilizar tales vectores para transducir las células hepáticas de estos pacien-tes con el gen OTC. Estudios in vitro, y también


en animales de experimentación, mostraron la eficacia del protocolo propuesto. El tratamien-to de 17 pacientes con dosis progresivamente crecientes del vector no manifestó efectos tóxi-cos graves. No obstante, en 1 de los pacientes tratados con la dosis más alta se manifestó un proceso febril seguido de inflamación hepáti-ca y aumento descontrolado de los niveles de amonio, dando lugar a la entrada en coma del paciente. Lamentablemente, el paciente falleció poco después, y está todavía en investigación la causa primaria de su muerte. Este hecho, como consecuencia de la inoculación del vector viral, disparó las alarmas de los organismos regula-dores, principalmente en lo que se refiere a la inoculación in vivo de vectores de la familia de los adenovirus. En la actualidad se han generado nuevos vectores adenovirales desprovistos de la mayor parte del esqueleto viral implicado en su inmunogenicidad, por lo que se confía que su empleo prevenga de la generación de respues-tas inmunogénicas no previstas.

Incidencia de leucemias en pacientes X1-SCID tratados mediante terapia génica

De los 20 pacientes X1-SCID que fueron tratados en París y Londres mediante TG, 5 de-sarrollaron leucemia linfocítica asociada a la in-serción del gen terapéutico en la proximidad de diferentes oncogenes [17]. De manera paralela a la observación de las primeras leucemias en los pacientes SCID-X1, C. Baum observó por pri-mera vez en animales de experimentación un fe-nómeno similar. En sus experimentos trasplantó células madre hematopopyéticas que habían sido transducidas con vectores gamarretrovirales a animales receptores [18] ¿¿??. Al cabo del tiempo observó en algunos animales la aparición de una leucemia clonal, que investigó en su nivel molecu-lar. En su estudio, Baum observó que el vector re-troviral se había insertado junto al oncogén evi1, al cual había activado mediante las secuencias promotoras presentes en el vector. De manera análoga, en los ensayos clínicos con pacientes

X1-SCID se observó que una gran proporción de las inserciones del vector terapéutico tuvo lu-gar en regiones próximas a (o dentro de) genes de las células diana. De hecho, se observó que la inserción del vector terapéutico ocurría con frecuencia junto al oncogén LMO2, implicado en leucemias linfocíticas [19] (fig. 10). ¿¿??

Estudios posteriores han evidenciado que los vectores gamarretrovirales se insertan preferen-temente en la proximidad o dentro de genes que se están transcribiendo activamente en el mo-mento de la transducción [20]. En estudios com-plementarios se observó que estos vectores se insertan preferentemente en regiones próximas al inicio de la transcripción, facilitando con ello la transactivación de los genes próximos. Con obje-to de minimizar el riesgo de transactivar oncoge-nes por la inserción de vectores terapéuticos, se han desarrollado vectores de mayor seguridad. Así, a diferencia de lo que ocurre con los vecto-res gamarretrovirales, los vectores lentivirales no muestran una preferencia por integrarse junto al inicio de la transcripción del gen [21]. Por otra parte, la introducción de promotores menos po-tentes que los promotores virales anteriormente utilizados constituye una alternativa complemen-taria que está mejorando significativamente la seguridad de la TG [22].

En todo caso, los riesgos asociados a la TG han de ser correctamente ponderados, por una parte para minimizar en lo posible el ries-go asociado a su utilización, pero también para no impedir su aplicación a pacientes que no tienen alternativas terapéuticas de beneficio comparable.

Puesta en marcha de nuevos ensayos clínicos con vectores terapéuticos de nueva generación

Como consecuencia de los estudios de se-guridad realizados desde que se pusieron de


manifiesto los primeros efectos adversos aso-ciados a la terapia con vectores retrovirales, comenzó el desarrollo de vectores lentivirales para su aplicación clínica. El primer ensayo de tratamiento de una enfermedad monogénica con vectores lentivirales se realizó reciente-mente en París en pacientes con X-adreno-leucodistrofia (ALD) [23]. Esta enfermedad cursa con una desmielinización severa en cerebro, por deficiencia en la proteína ALD. La progresión de la enfermedad puede ser detenida mediante trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos. En el ensayo clínico realizado por N. Cartier et al., se trans-dujeron células CD34+ de la médula ósea de los pacientes con vectores lentivirales porta-dores del gen de la ALD y se reinfundieron tras un acondicionamiento mieloablativo de los pacientes (fig. 11). Los resultados reporta-dos en este trabajo demuestran por primera vez la detención del proceso de desmieliniza-ción en pacientes tratados por TG, abriendo una nueva expectativa para la terapia de esta grave patología.

La reprogramación celular, una nueva estrategia para la terapia génica de enfermedades monogénicas

Ante el limitado número de células madre he-matopoyéticas presentes en la médula ósea de los pacientes con aplasias congénitas, como la anemia de Fanconi (AF), por ejemplo, surgió la necesidad de investigar la posibilidad de generar progenitores hematopoyéticos a partir de fuen-tes alternativas a la médula ósea. Para ello resul-tó esencial el descubrimiento del investigador japonés Yamanaka en el año 2006, que demos-traba por primera vez que la transferencia de tan sólo 4 genes podía reprogramar fibroblastos de piel [24] y así generar células pluripotentes inducidas (iPS) similares a las células madre em-brionarias. Nuestro equipo, en colaboración con el de Raya e Izpisúa-Belmonte, en el Centro

Figura 10. Oncogénesis insercional en dos pacientes X1-SCID tratados por terapia génica.

3’LTR

198 pbs

10 ngWT

50 c. IS10 ngWT

500 c. IS

6 13 17 24 31 34 -C 37 M

IS

CD3 T PBL PBLγδ

41.253 44.218 46.229 54.614

MFG γc 1 MFG γc 2

P5

8

7

6

5

4

3

2

1

0

% d

e in

mig

raci

ón

-10

a -9

-9 a

-8

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-7

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-6

-6 a

-6

-5 a

-1

-4 a

-3

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-2

-2 a

-1

-1 a

00

a 1

1 a

22

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3 a

44

a 6

6 a

66

a 7

7 a

88

a 9

9 a

10

Distancia al origen de transcripción TSS (kb)

600 integraciones independientes: 63% a < 10 kb de genes

P4

Hacein-Bey et al., Science 302, 416;2003.


de Medicina Regenerativa de Barcelona, y el de Surrallés, de la Universidad Autónoma de Bar-celona/Ciber de Enfermedades Raras, demos-tramos recientemente la posibilidad de corregir

el defecto genético de fibroblastos de piel de pacientes AF y, también, de reprogramar estas células para generar progenitores hematopo-yéticos con fenotipo sano [25] (fig. 12). Desde

Figura 11. Terapia génica con vectores lentivirales en pacientes con X-adrenoleucodistrofia (tomado de L Naldini. Science 326, 805-6, 2009).

20 months

ALD patient (lipid storage disorder)

Lipid storage relief

Progeny of gene-corrected HSCs distribute

throughout the body

HIV-based vector with therapeutic ABCD1 gene

HSCs

Gene-corrected HSCs


esta primera demostración, la reprogramación celular se contempla como un nuevo campo de gran expectación en el cual la TG de adición y también por recombinación homóloga tendrá una oportunidad de traslación clínica.

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Figura 12. Esquema seguido para la generación de progenitores hematopoyéticos a partir de fibroblastos de piel de pacientes con anemia de Fanconi (Raya et al. Nature 460: 53-9, 2009).

Células de la piel + FANCA

Célula iPS

CMH CMH

+ Oct 3/4

+ Sox2

+ c-Myc

+ Klf4


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ResumenLa nanomedicina, aplicación de la nanotecno-

logía en las ciencias de la salud, es la rama de la nanotecnología que se perfila como la de mayor proyección en un futuro próximo debido a sus importantes aplicaciones, especialmente diag-nósticas y terapéuticas. La detección temprana de enfermedades, su tratamiento precoz per-sonalizado y un preciso seguimiento posterior de su evolución serán posibles en los próximos años gracias a la aplicación de las herramientas nanotecnológicas que se están desarrollando actualmente. Los importantes avances en este campo podrían dar lugar a sistemas de diagnosis y tratamientos terapéuticos de mayor eficacia que los existentes, lo que redundaría en una mayor calidad de vida para el hombre. Una au-téntica revolución se vislumbra en el horizonte del cuidado de la salud y la tecnología médica.

Introducción: ¿qué es la nanomedicina?

Desde hace unos años la nanotecnología se está perfilando como un área emergente en

ciencia y tecnología que nos está conduciendo a una nueva revolución industrial. La nanotecno-logía se define como el «desarrollo de ciencia y tecnología a niveles atómicos y moleculares, en la escala de aproximadamente 1-100 nm, para obte-ner una comprensión fundamental de fenómenos y materiales en dicha escala nanométrica y para crear y usar estructuras, dispositivos y sistemas que tengan nuevas propiedades y funciones debido a su tamaño». Nanométro (del latín nanus, enano) significa la milmillonésima parte de 1 metro. Lo más interesante de la nanotecnología no es la posibilidad de trabajar con materiales de reduci-das dimensiones, sino el cambio a menudo radi-cal que sufren las propiedades físicas y químicas de la materia cuando se trabaja a esta escala: la conductividad eléctrica, el color, la resistencia o la elasticidad, entre otras propiedades, se com-portan de manera diferente a como lo hace el material volumétrico (fig. 1). Por ello, la nano-tecnología tiene gran aplicación en diferentes campos, entre los que destacan los materiales, la electrónica, la medicina y la energía. Se han alcanzado ya avances significativos en la fabri-cación de materiales de mayor dureza y resis-tencia, ordenadores más veloces y con mayor capacidad de procesamiento gracias a los mi-croprocesadores con componentes nanotecno-

7 Nanomedicina: apliación de la nanotecnología en la saludLaura M. Lechugagrupo de nanoBIosensores y aplICaCIones BIoanalítICas

Centro de Investigación en Nanociencia y Nanotecnología (CIN2)Consejo Superior de Investigaciones Científicas

Nanomedicina: ampliación de la nanotecnología en la salud 99

lógicos, diagnósticos médicos más eficaces o la obtención de energía a bajo coste y respetuosa con el medio ambiente. Ya existen multitud de productos «nanotecnológicos» en el mercado, como cosméticos más eficaces y protectores, raquetas de tenis más flexibles y resistentes, ga-fas que no se rayan, ropa que no se arruga ni se mancha, por citar algunos ejemplos.

La irrupción de la nanotecnología en las cien-cias de la salud ha dado lugar a una nueva disci-plina denominada nanomedicina, cuyo objetivo principal es el desarrollo de herramientas para diagnosticar, prevenir y tratar enfermedades cuando están todavía en estados poco avanza-dos o en el inicio de su desarrollo. La nanomedi-cina estudia interacciones a la nanoescala y para

ello utiliza dispositivos, sistemas y tecnologías que incluyen nanoestructuras capaces de interactuar a escala molecular y que se interconectan a nivel micro para interaccionar en el nivel celular. Uno de los grandes retos en este proceso reside en el desarrollo de «nanoterapias», dirigidas espe-cíficamente a los tejidos y órganos enfermos, evitando dañar a las células sanas circundantes y, por tanto, evitando los temidos efectos secunda-rios de los tratamientos actuales.

En los orígenes de la nanotecnología se llegó a predecir la fabricación de «nanorobots», que se inyectarían directamente y atacarían selecti-vamente los tejidos dañados, incluso protegien-do de ataques externos y reparando posibles desperfectos. A pesar de que esto sigue siendo

Figura 1. Las medidas de la nanotecnología.

Balón de fútbol 220.000.000 nm

Microchip ordenador 70 nm

Nanotubos de carbón anchura 1,4 nm

Molécula de C60 0,7 nm

Átomo de hidrógeno 0,1 nm

Nanoprisma de oro lado 50 nm

Virus polio 10 nm

Molécula de ADN anchura 2 nm

Hormiga 10.000.000 nm

Cabello humano 80.000 nm

Glóbulos rojos 7.000 nm


ciencia ficción, sí se puede afirmar que se ha avanzado notablemente en el diseño de nanoes-tructuras que incorporan distintas funcionalida-des y pueden desempeñar un papel muy similar.

El progresivo aumento que se observa de gra-ves dolencias como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares, la diabetes, o las enfermedades neurodegenerativas (Alzheimer y Parkinson), para las que no existen tratamientos definitivos, hacen necesarios nuevos métodos diagnósticos y terapéuticos más rápidos, eficaces y específi-cos que los actuales y que además reduzcan al máximo los costes implicados. La nanomedicina promete resolver algunos de estos grandes re-tos mediante la capacidad de detectar de forma precoz la presencia de enfermedades (como el cáncer) o la capacidad de regenerar los órganos y tejidos que estén dañados dentro del orga-nismo proporcionado un diagnóstico precoz, una terapia adecuada y un seguimiento poste-rior efectivo de la evolución del paciente. En un futuro próximo se podrá incluso disponer de tratamientos individualizados a distancia en el propio hogar o lugar de trabajo del paciente.

La nanomedicina agrupa tres áreas princi-pales: el nanodiagnóstico, la liberación contro-lada de fármacos (nanoterapia) y la medicina regenerativa. El nanodiagnóstico consiste en el desarrollo de sistemas de análisis y de imagen para detectar una enfermedad o un mal funcio-namiento celular en los estadios más tempranos posibles tanto in vivo como in vitro. La nanote-rapia pretende dirigir nanosistemas activos que contengan elementos de reconocimiento para actuar o transportar y liberar medicamentos exclusivamente en las células o zonas afectadas, a fin de conseguir un tratamiento más efectivo, minimizando los efectos secundarios. La medici-na regenerativa tiene como objetivo reparar o reemplazar tejidos y órganos dañados aplicando herramientas nanotecnológicas.

Dado que es imposible abarcar con profun-didad todas las tecnologías que pueden surgir de conceptos basados en nanomateriales y nanodispostivos, se han seleccionado para este

capítulo algunos ejemplos clave de avances conseguidos en las tres líneas principales de la nanomedicina, haciendo especial hincapié en el área del nanodiagnóstico.

NanodiagnósticoEl objetivo del nanodiagnóstico es la identifi-

cación de enfermedades en sus estadios inicia-les en el nivel celular o molecular e, idealmente, al nivel de una sola célula, mediante la utilización de nanodispositivos y sistemas de contraste. Una identificación temprana permitiría una rá-pida capacidad de respuesta y la inmediata apli-cación del tratamiento adecuado, ofreciendo así mayores posibilidades de curación.

Los nanosistemas de diagnóstico se pueden utilizar in vitro o in vivo. El diagnóstico in vivo nor-malmente requiere que los dispositivos puedan penetrar en el cuerpo humano para identificar y (idealmente) cuantificar la presencia de un de-terminado patógeno o de células cancerígenas, por ejemplo. Esto conlleva una serie de proble-mas asociados con la biocompatibilidad del ma-terial del dispositivo, pero además requiere de un sofisticado diseño para asegurar su eficacia y minimizar los posibles efectos secundarios. Por su parte, el diagnóstico in vitro ofrece una mayor flexibilidad de diseño, ya que se puede aplicar a muestras muy reducidas de fluidos corporales o de tejidos, a partir de los cuales se puede llevar a cabo una detección específica (de patógenos o defectos genéticos, p. ej.) en tiempos muy cortos, con gran precisión y sensibilidad. Debido a estas diferencias fundamentales, se prevé que la detección in vitro usando nanodispositivos lle-gue al mercado de una forma mucho más rápi-da y se pueda consolidar más fácilmente que los métodos in vivo.

Dentro del nanodiagnóstico, dos son las principales áreas de trabajo: los nanosistemas de imagen y los nanobiosensores, dispositivos capaces de detectar en tiempo real y con una alta sensibilidad y selectividad agentes químicos


y biológicos. Los principales sistemas de nano-diagnóstico dentro de estas dos grandes áreas se recogen en la tabla 1.

Nanosistemas de imagen

Estos sistemas se basan en el uso de nano-partículas, generalmente, semiconductoras, me-tálicas o magnéticas, como agentes de contras-te para marcaje in vivo. Estos nuevos sistemas permiten aumentar la sensibilidad y dan mayor contraste en las técnicas de imagen.

Uno de los primeros sistemas de nanopartí-culas que se han propuesto para marcaje celu-lar e identificación de zonas dañadas o tumo-res son las nanopartículas de semiconductores, también conocidas como «puntos cuánticos» (quantum dots).

Cuando el tamaño de estos semiconducto-res se reduce a unos pocos nanómetros (tí-picamente entre 1 y 10 nm), se produce una modificación de su estructura electrónica, de tal manera que se pierde la característica es-tructura de bandas y surgen niveles electrónicos discretos. Esta nueva estructura electrónica les

confiere una respuesta óptica (fluorescencia, en particular) que varía con el tamaño. Por lo tanto, se pueden fabricar puntos cuánticos del mismo material que emiten luz en diferentes longitudes de onda (con distintos colores) dependiendo de su tamaño, por lo que son extremadamente útiles como marcadores biológicos (fig. 2).

De entre la gran variedad de materiales que se han estudiado, los semiconductores más uti-lizados son los de CdSe y CdTe, ya que se pue-den producir en grandes cantidades mediante procesos químicos, con un excelente control del tamaño, lo que permite obtener bandas de emisión estrechas e intensas en una amplia va-riedad de colores y con un tiempo de vida muy prolongado. Todas estas características, a las que se puede añadir que la excitación de puntos cuánticos de distintos tamaños se puede realizar con una única lámpara (permitiendo así realizar marcajes múltiples de forma simultánea), han promovido su desarrollo como competencia a los marcadores moleculares habituales. Existen ya múltiples demostraciones de la utilidad de los puntos cuánticos para la localización de pe-queños tumores, lo cual significa que se podría proceder a su extirpación inmediata. En la figura 2 se muestran algunos ejemplos.

Sin embargo, el diseño de los puntos cuánticos (al igual que otros sistemas de nanopartículas) es bastante más complicado. No es suficiente con obtener un material de alta luminiscencia y estabilidad, la nanopartícula también debe llegar a su destino de forma selectiva e, idealmente, debe eliminarse del organismo una vez realiza-da su función para evitar efectos secundarios. Uno de los problemas a resolver es la captación de las nanopartículas por los macrófagos antes de alcanzar la zona afectada. Para ello es nece-sario recubrir las nanopartículas con materiales que actúen como una capa de invisibilidad, p. ej., con polímeros como el polietilenglicol. Una vez resuelto este problema, es preciso indicar-les cómo localizar el tumor, y para ello hay que recubrir su superficie con biomoléculas (biorre-ceptores, como anticuerpos monoclonales) con

Tabla 1. Resumen de los sistemas de nano-diagnóstico más desarrollados

Principales sistemas de nanodiagnóstico

Dispositivos de nanodiagnóstico

• Nanobiosensores

• Biochips genómicos y proteómicos

• Lab-on-a-chip

Diagnóstico por imagen

• Resonancia magnética muclear

• Espectroscopia y fluorescencia

• Microscopios de campo próximo (AFM, STM)

• Microscopia y tomografía electrónica

• Marcadores y agentes de contraste

– Puntos cuánticos– Nanopartículas magnéticas – Nanopartículas metálicas


afinidad selectiva hacia un compuesto específi-co de la zona a reconocer (p. ej., la célula can-cerosa). Así, hay ciertas proteínas o moléculas que se encuentran en mayor proporción en la membrana de las células cancerosas (como los receptores de ácido fólico o la hormona lutei-nizante) y son características de cada tipo de cáncer. Cuando los puntos cuánticos en función con el biorreceptor específico se acercan a una muestra que contiene dicha proteína, se produ-ce una reacción de reconocimiento biomolecu-lar (fig. 2), de forma que se acumularán allí, per-mitiendo la detección mediante iluminación con luz ultravioleta y observación de la emisión de fluorescencia característica del punto cuántico empleado. La eliminación de las nanopartículas a través del hígado o los riñones parece ser bas-tante eficiente para los tamaños de los puntos cuánticos, pero pueden existir problemas liga-dos a procesos de agregación, que es necesario resolver en algunos casos.

Hasta ahora, los experimentos in vivo con puntos cuánticos se han realizado con anima-les, pero se prevé que una vez superados los controles de las agencias de salud, se puedan realizar estos ensayos en seres humanos.

Otra posibilidad para los agentes de contraste es emplear nanopartículas metálicas, ya que su frecuencia de resonancia (el color) es muy sen-sible a su tamaño y a su forma, lo cual permite diseñarlas para que absorban o dispersen luz en la región espectral que interese. Por ejemplo, se pueden fabricar nanopartículas de oro que sean muy eficientes absorbiendo o reflejando luz en el infrarrojo cercano (700-900 nm), donde los tejidos son más transparentes, de forma que es posible diseñar métodos de marcaje celular, en una forma similar a lo que se ha descrito para los puntos cuánticos. Uno de los métodos uti-lizados se denomina tomografía de coherencia óptica (optical coherence tomography, OCT), y permite obtener mapas tridimensionales de los

Figura 2. A) Disoluciones de puntos cuánticos de distintos tamaños, con color de fluorescencia ca-racterístico para cada tamaño. B) Esquema de funcionamiento de un punto cuántico. C) Imágenes de experimentos en los que se han inyectado puntos cuánticos y cómo se acumulan en células u órganos dañados..

C

A B


tejidos y detectar las zonas en las que se han acumulado las nanopartículas.

Otra posibilidad es utilizar nanopartículas magnéticas (típicamente óxidos de hierro como la magnetita) para aumentar el contraste en me-didas de resonancia magnética. Estas nanopartí-culas podrían sustituir a los marcadores actuales de metales pesados, reduciendo su toxicidad. Además, el carácter magnético de estos mate-riales podría facilitar su transporte a través del organismo mediante la utilización de un campo magnético externo (como un imán).

Nanobiosensores

Dentro del nanodiagnóstico, los principales dispositivos de análisis que se están desarrollan-do son los nanobiosensores, dispositivos capa-ces de detectar en tiempo real, sin necesidad de

marcadores fluorescentes o radioactivos y con una alta sensibilidad y selectividad, todo tipo de sustancias químicas y biológicas.

Un biosensor es un dispositivo integrado por un receptor biológico (enzimas, ADN, anticuer-pos, etc.) preparado para detectar específica-mente una sustancia y un transductor o sensor, capaz de medir la reacción de reconocimiento biomolecular y traducirla en una señal cuantifi-cable (fig. 3). Los dos constituyentes del biosen-sor están integrados conjuntamente y es preci-samente esta íntima unión la que le confiere a los dispositivos biosensores sus especiales ca-racterísticas de sensibilidad y selectividad. Otra de las características fundamentales que hace atractivos a los biosensores es la posibilidad de realizar el análisis de la sustancia a determinar en tiempo real y de forma directa (sin necesi-dad de marcador) a diferencia de cualquier aná-

Figura 3. A) Esquema del funcionamiento de un biosensor. B) Fabricación de nanobiosensores con tec-nología microelectrónica. El biosensor está formado por un transductor similar a los circuitos integrados de silicio y una capa bioreceptora para el análisis específico.

A B

Proceso datos

Muestras

Receptor Biológico

analíticoSuperficie del nanosensor

Señal

Transductor

–S–(

CH

2)6-N

=C

H–(

CH

2)3-C

H

= O–S

–(C

H2)

6-N

=C

H–(

CH

2)3-C

H

= O–S

–(C

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6-N

=C

H–(

CH

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H

= O–S

–(C

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6-N

=C

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CH

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6-N

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CH

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H

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=C

H–(

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H

= O–S

–(C

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6-N

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H–(

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H

= O–S

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6-N

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= O–S

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6-N

=C

H–(

CH

2)3-C

H

= O–S

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H2)

6-N

=C

H–(

CH

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H

= O–S

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6-N

=C

H–(

CH

2)3-C

H

= O–S

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H2)

6-N

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CH

2)3-C

H

= O–S

–(C

H2)

6-N

=C

H–(

CH

2)3-C

H

= O–S

–(C

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H–(

CH

2)3-C

H

= O–S

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H2)

6-N

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H–(

CH

2)3-C

H

= O–S

–(C

H2)

6-N

=C

H–(

CH

2)3-C

H= O

–S–(

CH

2)6-N

=C

H–(

CH

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H

= O–S

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6-N

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H–(

CH

2)3-C

H

= O–S

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H2)

6-N

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H–(

CH

2)3-C

H

= O–S

–(C

H2)

6-N

=C

H–(

CH

2)3-C

H

= O


lisis biológico o clínico que siempre requiere un marcador (ya sea fluorescente o radioactivo).

Todo ello confiere a los biosensores la posi-bilidad de realizar no sólo un análisis cualitativo (sí/no) y cuantitativo, sino también la posibilidad de evaluar la cinética de la interacción (constan-te de afinidad, asociación, disociación, etc.) y, por tanto, elucidar los mecanismos fundamentales de dicha interacción. Las técnicas de análisis de laboratorio más habituales, ya sea de sustancias químicas o biológicas, suelen ser laboriosas, con-sumen mucho tiempo y en la mayoría de la oca-siones requieren personal especializado para su empleo. Frente a ellas, los biosensores ofrecen la posibilidad de hacer medidas directas, conti-nuas, de forma rápida y con alta sensibilidad.

El término «nanobiosensor» designa a los biosensores cuyas propiedades vienen modu-ladas por la escala nanotecnológica con la que están fabricados. Los nanobiosensores pueden mostrar una sensibilidad mucho mayor que la de los dispositivos convencionales y además ofrecen las ventajas del pequeño tamaño y la portabilidad, lo que posibilita su utilización en cualquier lugar, como el hogar o la consulta del médico. Con estos nanodispositivos la cantidad de muestra para hacer el análisis es relativamen-te baja (de micro a nanolitros), lo que significa que los métodos de extracción de muestras de pacientes pueden ser menos invasivos y menos traumáticos. Además podrían ser fácilmente in-troducidos en el interior del cuerpo humano, proporcionando datos mucho más fiables del estado de salud real de un paciente.

Dentro de los desarrollos de nanobiosensores son de destacar los nanobiosensores fotónicos, nanoplasmónicos, basados en nanoestructuras (nanopartículas, nanotubos de carbono, nanoa-lambres, etc.) y los biosensores nanomecánicos.

Biosensores nanofotónicos

Los biosensores nanofotónicos han demos-trado un nivel de sensibilidad extremo para la detección directa de proteínas y ADN. En estos sensores (también llamados de onda evanescen-

te) se hace uso de la forma particular en que se transmite la luz en el interior de los circuitos ópticos; esta transmisión tiene lugar a lo largo de la guía óptica mediante múltiples reflexiones internas. A cada reflexión, una componente de la luz, denominada onda evanescente, se propa-ga en el medio que envuelve a la guía. La longi-tud de penetración de la onda evanescente es de unos cientos de nanómetros y ofrece una oportunidad única e ideal para medir cualquier interacción biomolecular que tenga lugar en su interior. Con estos sensores es posible evaluar concentraciones de proteínas en el nivel pico-molar o variaciones de una única base en el ADN en tan sólo unos minutos, necesitando volúmenes de muestra del orden de microlitros y, en ocasiones, las muestras a analizar (orina, suero) no necesitan un pretratamiento previo.

Los nanosensores fotónicos también permiten la medida en el interior de una única célula de su estado metabólico. Para este fin existen nano-sensores que consisten en una fibra óptica muy afilada (su extremo final tiene sólo 30-50 nm) lo que le permite penetrar a través de la mem-brana celular sin causar ningún daño y sin alterar el funcionamiento normal de la célula. La fibra óptica se biofuncionaliza con receptores especí-ficos antes de su introducción. Una vez dentro, la nanosonda puede detectar especies químicas y señalizar procesos moleculares en localizaciones específicas del interior de la célula. La detección se realiza a través de la interacción del campo evanescente de la luz que circula por la fibra óp-tica con la interacción biomolecular, debida al bio-rreceptor específico anclado en la superficie del extremo final de la fibra. Con esta técnica se abre la posibilidad de identificar cambios patológicos dentro de una célula individual e incrementar el conocimiento sobre las funciones celulares in vivo, como la división celular, la apoptosis, el funciona-miento de las nanomáquinas biológicas, etc.

Biosensores nanoplasmónicos

El biosensor de Resonancia de Plasmón Su-perficial (SPR) está basado en la variación de


reflectividad de una capa metálica en contacto con un medio biológico. El biosensor SPR ha sido ampliamente desarrollado, cientos de pu-blicaciones aparecen cada año en la literatura especializada y numerosas compañías lo comer-cializan en diferentes versiones. Este sensor per-mite detectar de forma directa concentraciones en el rango nanomolar de forma directa y sin necesidad de marcadores fluorescentes.

En este sensor se deposita una capa metálica delgada (generalmente una capa de oro de 50 nm de espesor) sobre un material dieléctrico (p. ej., un cristal). Excitando la interfase del metal y el dieléctrico en condiciones de reflexión inter-na total, se obtiene una resonancia plasmónica para un cierto ángulo de incidencia de la luz, resonancia que se manifiesta en una absorción de la luz y, por tanto, un mínimo agudo en la intensidad de la luz reflejada. La característica más interesante de este efecto es que el án-gulo de resonancia al que se genera la onda plasmónica (de carácter evanescente) es muy sensible a cualquier variación que tenga lugar en la superficie metálica, como puede ser una inmunorreación o cualquier otro tipo de inte-racción biomolecular. La interacción se detecta entonces como una variación del ángulo de re-sonancia. En la figura 4 se muestra el esquema de un sensor de SPR y su mecanismo de fun-cionamiento.

Como alternativa, se están desarrollando ac-tualmente biosensores basados en el fenómeno de resonancia de plasmón en nanopartículas. En el caso de éstas, y debido a su pequeño tamaño, la oscilación de los electrones está muy locali-zada en ciertas zonas de las nanopartículas (v. mapas de intensidad en la fig. 4), por lo que el fenómeno se denomina resonancia de plasmón superficial localizada (LSPR). Tal como se indica en la figura 4, la adsorción de (bio)moléculas sobre las nanopartículas provoca cambios de color, que se pueden emplear para la detección. A pesar de que los límites de detección podrían ser similares que los obtenidos con los biosen-sores SPR, el sistema experimental es mucho

más sencillo en LSPR, ya que se mide transmi-sión en lugar de reflexión y además se puede facilitar la miniaturización.

En ambos casos, los dispositivos permiten portabilidad y requieren una cantidad de mues-tra relativamente baja (de micro a nanolitros) para hacer el análisis y ya se ha demostrado su utilidad en la detección de proteínas en el ni-vel nanomolar en muestras de pacientes (orina, suero) sin necesidad de pretratarlas o de mu-taciones puntuales en las cadenas de ADN sin necesidad de marcadores fluorescentes.

Existen otros métodos de detección que ha-cen uso del fenómeno de LSPR de una forma diferente. Por ejemplo, se han desarrollado de-tectores de ADN basados en los cambios de color que se producen debido a la agregación de nanopartículas de oro marcadas con cade-nas de ADN complementarias a la que se in-tenta reconocer.

Biosensores nanomecánicos

Otro tipo de nanobiosensor con grandes perspectivas en nanodiagnóstico son los bio-sensores nanomecánicos, que emplean como sistema de transducción la deflexión nanomé-trica de una micropalanca o el desplazamiento de su frecuencia de resonancia al interaccionar con el sistema biológico. El cambio en la posi-ción y movimiento de la micropalanca induci-do por el reconocimiento molecular ocurre a escala de unos pocos nanómetros, y de aquí deriva el nombre de biosensores «nanome-cánicos». La figura 5 muestra las imágenes de algunos de estos sensores. Las micropalancas tienen un área sensora muy pequeña (del or-den de 1.000 μm2), lo que permite el análisis de cantidades de sustancia inferiores al fe-mtomol. Además se fabrican con tecnología microelectrónica estándar, lo que proporciona producción en masa a bajo coste y permite la fabricación de miles de micropalancas en un mismo proceso, que podrían ser empleadas para la detección simultánea de miles de anali-tos de la misma muestra.


Desarrollos como los nanosensores fotónicos o los nanomecánicos, fabricados a miles gracias a la tecnología microelectrónica, abren un ca-mino para la fabricación de nanobiochips genó-micos y proteómicos, que a diferencia de los actuales biochips, llevan incorporado un sistema de transducción de la interacción (no se nece-sitarían marcadores fluorescentes), con los que sería posible conseguir en muy poco tiempo una inmensa cantidad de información genética y proteómica que permitirá elaborar vacunas, identificar mutaciones indicativas de enferme-

dades, identificar nuevos fármacos, identificar patógenos, etc. de forma mucho más rápida que utilizando las tecnologías convencionales.

Sistemas “laboratorio-en-un-chip”

La integración en sistemas «lab-on-a-chip» será otra de las áreas fundamentales de trabajo, que permitirá la descentralización de las medi-das. El término «lab-on-a-chip» (o «laboratorio en un chip») describe el desarrollo de platafor-

Figura 4. A) Funcionamiento de un biosensor SPR. La interacción biomolecular que tiene lugar sobre el oro se detecta mediante el desplazamiento de la curva plasmónica. B) Fotografías de microscopia electrónica de nanopartículas de oro (esferas y cilindros) y la localización de la resonancia plasmónica. La resonancia varía cuando se colocan los analitos en la superficie.

A

B

1.200

800

400

0450 500 550 600

Wavelength (nm)

1 2

Scat

terin

g In

tens

ity

LASER

priam

Flow of anlytea

Au layer

Photodetectora array

III

I II


mas integradas y miniaturizadas donde tienen lugar complejas reacciones químicas y bioquí-micas. Estas plataformas se están constituyendo como una tecnología revolucionaria en el sec-tor clínico. Las micro y las nanotecnologías han proporcionado las herramientas necesarias para llevar a cabo esta innovación en el diagnóstico molecular, al permitir la fabricación e integración de micro/nanobiosensores, microcanales, micro-actuadores, etc. en un mismo chip. El empleo de estos dispositivos aporta las ventajas de rapidez en el análisis, reducido volúmenes de muestra, alto grado de automatización y su carácter por-tátil y desechable.

Un simple microsistema con nanosensores in-corporados podría ofrecer un diagnóstico com-pleto a partir de una gota de sangre mediante la identificación (de otra manera imperceptible) de cambios moleculares; esto implica que los análisis podrían hacerse a domicilio. Cuando se empiecen a reemplazar los caros y lentos análisis de laboratorio por estos análisis de microchips más baratos, rápidos y cómodos, el impacto en organizaciones sanitarias y sus pacientes será muy importante.

Pero, a pesar de estos incipientes desarrollos, todavía queda mucho camino por recorrer y para al futuro, sería deseable contar con nanodisposi-

tivos que cumplieran la mayoría de los siguientes requisitos: robusto, barato, posibilidad de multia-nalito, detección a niveles de pico/femtomolar o incluso en el nivel de una sola molécula, rápidos y directos, portátiles, de fácil manejo por parte de personal no especializado, de multiuso o suficien-temente barato para ser de un único uso.

El trabajo futuro se encamina tanto al desarrollo de nuevas estrategias de inmovilización y de pro-tección, para permitir nanobiosensores comple-tamente reversibles y regenerables y que puedan funcionar in situ en muestras complejas (como es la sangre) y que sean biocompatibles para ser implantados in vivo. La inclusión de los nanodis-positivos en el interior del cuerpo preservando su funcionalidad será un logro paradigmático en nanodiagnóstico. Los nanobiosensores implanta-dos podrían funcionar como «centinelas» dentro del cuerpo humano y emitir una señal de alarma ante la aparición de las primeras células enfermas. Ya se han obtenido pequeños avances (a nivel micro), como píldoras con cámaras de imagen que pueden tragarse, sensores que pueden reali-zar medidas in vivo durante operaciones, etc. Está será sin duda una de las grandes áreas de trabajo de la nanomedicina en los años venideros. La fi-gura 6 recoge una visión del empleo futuro de los dispositivos nanobiosensores.

Figura 5. Biosensores nanome-cánicos empleados en nanodiag-nóstico. Las micropalancas se do- blan unos nanómetros cuando tiene lugar una reacción de re-conocimiento molecular en su superficie. El nanobiosensor de matrices de micropalancas pue-de emplearse como biochip de ADN o proteómico según la biofuncionalizacións.


Liberación controlada de fármacos

La nanomedicina se ha propuesto como una posible solución para el desarrollo de nuevos sistemas de liberación controlada de fármacos. La idea consiste en utilizar nanoestructuras que transporten el fármaco hasta la zona dañada y, solamente cuando han reconocido esa zona, lo liberen como respuesta a un cierto estímulo. Para ello es necesaria la previa encapsulación o desactivación de los fármacos para que no ac-túen durante su tránsito por el cuerpo hasta lle-gar al lugar afectado, de forma que mantengan

intactas sus propiedades físico-químicas y que se minimicen posibles efectos secundarios en otras zonas del cuerpo. Una vez que el fármaco ha llegado a su destino, debe liberarse a una velocidad apropiada para que sea efectivo, lo cual se puede hacer mediante una variación de ciertas condiciones (pH o temperatura, p. ej.) en la zona dañada, o mediante un control preci-so de la velocidad de degradación del material encapsulante, permitiendo que la liberación del fármaco sea controlada.

Para la administración de fármacos se ha pro-puesto una gran variedad de nanoestructuras, como nanopartículas, nanocápsulas, dendríme-

Figura 6. Futuro de la utilización de nanobiosensores como sistemas de nanodiagnóstico. Adaptado de General Electric.

Nanobiosensores en urgencias

Nanobiosensores en la consulta

Nanobiosensores en casa

TecnologíasNanofotónicaNanotubos, nanopartículasNanomecánica, NEMS

BeneficiosDatos en tiempo real e in-situImagen a nivel celularHerramientas quirúrgicas de precisión guiadas por sensores

BeneficiosAnálisis completo en minutosDiagnósticos rápidos y precisosTratamientos específicos y personalizados

TecnologíasBiochipsNanoarrays de alta densidad

TecnologíasWirelessDispositivos portátiles con bateríaDisplays de alta resolución

BeneficiosAuto pruebas diagnósticas simplesTransmisión automática de datos a historial clínico


ros, liposomas, micelas, nanotubos, conjugados poliméricos, microgeles, etc. (fig. 7). La nanotec-nología permite que la liberación del fármaco sea mínimamente invasiva, ya que estos nano-sistemas pueden atravesar poros y membranas celulares. Otra gran ventaja es que la efectividad del medicamento se ve incrementada mediante el control preciso de la dosis requerida y del tamaño, la morfología y las propiedades superfi-ciales del compuesto.

En la actualidad ya se encuentran disponibles en el mercado numerosos fármacos desarrolla-dos basados en principios de la nanotecnología;

algunos de ellos se recogen en la tabla 2, así como la fase de desarrollo en la que se encuen-tran actualmente.

Terapia basada en nanopartículas

Además de elementos de reconocimiento y diagnóstico, las nanopartículas pueden utilizar-se también como agentes terapéuticos. Una vez que las nanopartículas se unen a tejidos

Figura 7. Diferentes tipos de nanosistemas que pueden emplearse en la dosificación de fármacos.

Nanopartículas Dendrímeros LiposomasNanocápsulas poliméricas

Tabla 2. Ejemplos de fármacos nanoestructurados

Nano estructura Fase de desarrollo Ejemplos

Liposoma Aprobado por la FDA DaunoXone, Docil

Albuminoso Aprobado por la FDA Abraxane

Micela polimérica Ensayos clínicos Genesol-FM, SP1049C, NK911, NCQ12, NC105, NC-6004

Conjugado polímero/fármaco Ensayos clínicos XYQTAX, Pegamotrecan, APS346, etc.

Liposoma dirigido Ensayos clínicos MCC-465,MBP-426, SGT-53

Nanopartícula de polímero Ensayos clínicos FCE28069 (PK2), CALAA-01

Partícula inorgánica o metálica Ensayos clínicos (oro) y preclínicos

Nanotubos de carbono, partículas de sílice, nanopartículas de oro

Dendrímero Ensayos preclínicos Poliamidoamina (PAMAM)


dañados o a células cancerosas, se puede indu-cir su calentamiento mediante aplicación de un campo magnético de baja intensidad (para na-nopartículas magnéticas) o por irradiación con luz infrarroja (para nanopartículas metálicas). A pesar de que los mecanismos son diferentes, en ambos casos el calentamiento provoca la des-trucción de las células tumorales por hiperter-mia, sin afectar a las células o tejidos sanos que las rodean. La utilización de esta tecnología para el tratamiento del cáncer evitaría los graves pro-blemas de efectos secundarios de los actuales tratamientos de quimioterapia o radioterapia.

Estos experimentos ya han demostrado su utilidad en pacientes humanos. Una de las principales nanoterapias es la desarrollada por la empresa alemana MagForce Nanotechnolo-gies AG, que ha recibido recientemente (julio de 2010) la aprobación de la Agencia Europa. El sistema de nanoterapia de MagForce se basa en el uso de nanopartículas de óxido de hierro recubiertas de aminosilano. La aplicación con-creta, recientemente aprobada para su uso en la clínica para tratamiento de tumores cerebrales, consiste en inyectar estas nanopartículas mag-néticas en la zona del tumor y posteriormente aplicar un campo magnético alternante de alta frecuencia, que produce un calentamiento local de la zona tumoral debido la vibración de las nanopartículas y, por consiguiente, la destruc-ción de las células cancerosas. La terapia podría aplicarse a diferentes tipos de tumores sólidos. La aprobación de este nuevo método terapéu-tico abre las puertas a los métodos terapéuticos basados en la nanotecnología.

Nanomedicina regenerativaLa nanomedicina regenerativa se ocupa de la

reparación o sustitución de tejidos y órganos enfermos o dañados mediante la aplicación de métodos procedentes de la terapia génica, la terapia celular, la dosificación de sustancias bio-rregenerativas y la ingeniería de tejidos, estimu-

lando los propios mecanismos reparadores del cuerpo humano. Las principales aportaciones de la nanotecnología a la medicina regenerativa están relacionadas con la producción de nuevos materiales y sistemas de soporte, la utilización de células madre embrionarias y adultas y la producción de moléculas bioactivas que sirvan como señales de diferenciación celular.

En la ingeniera de tejidos, la nanotecnología puede jugar un papel predominante, al facilitar nuevos materiales y técnicas que permiten una integración de los tejidos de forma más eficien-te por la posibilidad de generar microambien-tes más propicios para la regeneración tisular. La principal dificultad radica en encontrar ma-teriales adecuados que permitan la fabricación de estructuras que mantengan activo el órgano afectado mientras se regenera la zona dañada. Entre los materiales que se están utilizando cabe destacar los nanotubos de carbono, las nanopartículas como hidroxiapatita o zirconia, las nanofibras de polímeros biodegradables, los nanocomposites, etc.

Uno de los mayores logros es el desarrollo de biomateriales con capacidad de imitar a la matriz extracelular, constituyendo un auténtico soporte, idéntico al que aparece de forma natu-ral en las células, sobre el que pueden crecer las células progenitoras para posteriormente im-plantarlo en el paciente y así reparar o sustituir el órgano dañado.

También se pueden utilizar superficies na-noestructuradas que pueden actuar como in-cubadoras de líneas celulares, favoreciendo el proceso de diferenciación celular. Un ejemplo se muestra en la figura 8, donde una superficie nanoestructurada con nanotubos de carbono ha permitido el crecimiento y proliferación de redes neuronales; también puede observarse una estructura tridimensional con huecos or-denados, fabricada mediante replicación inversa de un cristal opalino, en cuyo interior se han crecido hepatocitos. Esta estructura podría pro-porcionar la rigidez necesaria para mantener el hígado mientras se desarrolla el crecimiento de


las células encargadas de regenerarlo.Otra posibilidad es el diseño de biomateriales

inteligentes que incorporen en su seno molé-culas de señalización que, una vez insertadas en el paciente, sean liberadas de forma gradual y activen la regeneración tisular in vivo.

Gracias a la nanomedicina, las células madre pluripotenciales y los factores de señalización se-rán componentes esenciales de implantes inteli-gentes y multifuncionales que podrán reaccionar en función del microambiente que le rodee y fa-cilitar entonces la regeneración del tejido dañado de forma específica y en el mismo lugar.

Es de prever también que se puedan desa-rrollar nanoestructuras artificiales que puedan detectar y reparar daños en el organismo, de la

misma forma que las nanoestructuras naturales lo hacen (p. ej., los linfocitos de la sangre). Así, se ha propuesto de forma teórica la fabricación de unas nanoestructuras para sustituir la hemo-globina, denominadas «respirocitos». Los respi-rocitos son células rojas nanofabricadas con una enorme capacidad para transportar oxígeno y que puede permitir pasar varias horas bajo el agua sin respirar. Según los cálculos de su crea-dor, con una inyección de respirocitos podríamos vivir con el corazón parado durante 4 horas o bucear durante 2,5 horas. Otros interesantes desarrollos incluyen motores biomoleculares, interruptores moleculares o nanoagujas que pe-netren en el núcleo de células vivas con un alto grado de precisión para realizar cirugía celular.

Figura 8. A) Red bidimensional nanoestructurada con nanotubos de carbono y utilizada como soporte para la proliferación de redes neuronales. B) Imágenes de microscopia electrónica del crecimiento de osteoblastos. C) Crecimiento de vasos sanguíneos artificiales. D) Crecimiento de células de fibroblasto sobre un sustrato nanoestructurado.

A

C

B

D


ConclusionesEl enorme avance de la nanotecnología du-

rante las últimas décadas ha permitido grandes desarrollos en muchos campos, incluidas las ciencias de la salud. Los conceptos de la nano-tecnología se están aplicando en métodos de diagnóstico más sensibles, sistemas de terapia y de administración controlada de fármacos, así como en herramientas que permiten la regene-ración de tejidos y órganos dañados. Los siste-mas y métodos descritos en este capítulo son solamente ejemplos seleccionados de la ingente actividad que se está desarrollando en miles de laboratorios de todo el mundo para mejorar las condiciones de salud y la calidad de vida de toda la sociedad.

En el futuro, estos sistemas se integrarán en microchips implantables que permitirán la admi-nistración programada de fármacos con un tra-tamiento personalizado y que, al mismo tiempo, podrán medir los parámetros vitales del pacien-te y trasmitir esta información directamente a una estación central de datos, para tener con-trolado al paciente mientras éste hace su vida normal. Ya existen chips subcutáneos para medir de forma continua parámetros cruciales como el pulso o la temperatura, nanopartículas que pueden reconocer, detectar y atacar selectiva-mente células cancerosas, así como nanosenso-res que permiten detectar en fluidos biológicos cantidades extremadamente bajas de moléculas que revelan la existencia de cáncer u otras en-fermedades. Se están fabricando actualmente dispositivos «laboratorio-en-un-chip» y se ha pasado a la etapa de ensayo clínico para nano-partículas que realizan una liberación controla-da de fármacos. Sin embargo, los largos proce-sos de aprobación en los sectores médicos y farmacéuticos pueden significar que los benefi-cios para la salud sólo podrán apreciarse a largo plazo. Aunque todavía es necesario llevar a cabo una gran cantidad de investigación y desarrollo,

no cabe duda de que la nanotecnología seguirá sorprendiéndonos con avances que redundarán en una mejora de la calidad de vida de nuestra envejecida sociedad y que ayudará a resolver los problemas causados por las principales en-fermedades (cáncer, desórdenes neurodegene-rativos y enfermedades cardiovasculares).

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Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por biotecnología 113

IntroducciónLos medicamentos obtenidos por biotecnolo-

gía constituyen una clase terapéutica emergente en la clínica que presenta unas características diferenciales no sólo por su origen, sino también por su estructura química y algunas propieda-des farmacológicas.

Los medicamentos biotecnológicos incluyen proteínas obtenidas por ingeniería genética, anticuerpos monoclonales producidos me-diante la tecnología del hibridoma, vectores para el transporte de material genético, frag-mentos de anticuerpos, oligonucleótidos anti-sentido, vacunas, etc. Estos productos presen-tan algunas características que los diferencia de los medica-mentos tradicionales. Su estruc-tura química, por ejemplo, es más compleja, ya que se trata con frecuencia de proteínas que contienen un número elevado de aminoáci-dos (filgastrim 174, somatropina 191, alteplasa 527, etc.) con una determinada secuencia, con especificidad en el número y localización de los puen-tes disulfuro e incorporación de una o varias moléculas de carbohidratos que son necesarias para la actividad biológica. La cade-na proteica puede presentar además hélices en distinto número, tamaño y configuración. Asimismo, algunas proteínas activas requieren

la asociación de varias subunidades proteicas para formar un gran agregado activo, estructu-ra cuaternaria, como ocurre, por ejemplo con el interferón-α-1b formado por dos proteínas idénticas de 165 kDa unidas por uniones no covalentes [1].

Toda sustancia con actividad farmacológica queda definida no solamente por su configura-ción estructural, sino también por sus propieda-des fisicoquímicas y biológicas, entre las que se incluye el perfil farmacocinético que cuantifica, mediante diversos parámetros, los procesos de absorción, distribución, metabolismo y excre-ción [2].

La farmacocinética se ha consolidado du-rante los últimos años como una disciplina de gran interés sanitario. Su aplicación se dirige, principalmente, hacia el desarrollo de nuevos medicamentos y a la optimización de los trata-mientos farmacológicos [3]. Otras aplicaciones menos conocidas son la detección diagnóstica de respuestas anómalas, el análisis retrospectivo de errores terapéuticos o tratamientos inade-cuados y las actividades educativas encaminadas a asegurar el uso seguro y eficaz de los medica-mentos. Dentro de la investigación farmacoló-gica, la farmacocinética puede dirigirse también a la resolución de aspectos clínicos concretos, como la detección de interacciones, problemas

8 Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por biotecnologíaAlfonso Domínguez-Gil HurléservICIo de farmaCIa

Hospital Universitario de Salamanca


de biodisponibilidad, o a la definición de pará-metros útiles para el diseño de regímenes de dosificación individualizados. La farmacocinética es hoy de gran utilidad para todos los profe-sionales implicados en el desarrollo, evaluación y uso de los medicamentos. Para la profesión farmacéutica tiene un especial interés, aunque para su dominio se requiere, además, una sólida formación en terapéutica farmacológica y en el seguimiento clínico de los pacientes.

La actividad intrínseca que presenta un fár-maco es condición necesaria, pero no suficiente para asegurar la eficacia terapéutica. El fármaco precisa, necesariamente, alcanzar su lugar de ac-ción, no siempre bien definido, en ocasiones difí-cilmente accesible o cuya accesibilidad se modi-fica con la gravedad de la enfermedad. Para ello se puede requerir, por ejemplo, una biodisponi-bilidad elevada, una amplia distribución tisular o un lento aclaramiento plasmático. Unas propie-dades farmacocinéticas desfavorables pueden llegar a condicionar el potencial terapéutico de un nuevo fármaco y aconsejar la interrupción de los ensayos clínicos programados en su de-sarrollo. La figura 1 muestra esquemáticamente la contribución de la farmacocinética y la far-macodinamia en la respuesta a un tratamiento farmacológico [4].

Los resultados obtenidos en los estudios far-macocinéticos, junto a los procedentes de los ensayos de eficacia y seguridad, configuran el perfil farmacológico de un nuevo medicamen-to, permitiendo establecer los principios básicos para su correcta utilización en la práctica clínica.

La investigación de nuevos fármacos se orienta, con frecuencia, a mejorar algunas ca-racterísticas farmacocinéticas, especialmente la absorción gastrointestinal, la distribución tisular y la velocidad de eliminación. Ello se consigue mediante cambios en la estructura química o en la formulación farmacéutica, que puede mo-dificar la cinética de liberación, el acceso a los tejidos e incluso los procesos de metabolismo y excreción [5]. Estos cambios permiten mejorar la efectividad de los tratamientos, bien por cam-bios en el perfil de la respuesta o facilitando la administración y mejorando el cumplimiento de la prescripción.

La estructura química que presentan la mayo-ría de los productos biotecnológicos condiciona algunas propiedades que pueden dificultar su utilización terapéutica y que se reflejan en su perfil farmacocinético. Entre ellas destacan la baja biodisponibilidad por vía oral, ciertas exi-gencias en la distribución tisular y celular y un aclaramiento plasmático elevado.

Figura 1. Relación de la farmacocinética y de la farmacodinamia con la respuesta terapéutica.

Efecto terapéutico

Parémetros farmacocinéticos

Relacionados con el régimen de dosificación

Cmáx, AUC

Otros:

F, Vd, CI

Parámetros farmacodinámicos

CE50

Fármaco en el lugar de acción

Fijación a receptores

Procesos posreceptor

Efectos bioquímicos

Respuesta farmacológica


Biodisponibilidad oral, pulmonar y nasal

Los péptidos y las proteínas presentan una baja biodisponibilidad por vía oral, general-mente inferior al 1%, por lo que en principio no son candidatos idóneos para utilizar esta vía de administración. Ello es debido a su ines-tabilidad en el medio fuertemente ácido del estómago, al efecto producido por las pepti-dasas intestinales y, especialmente, a su escasa permeabilidad como consecuencia del tamaño molecular, la carga eléctrica y la elevada polari-dad. La mayoría de las proteínas recombinan-tes se incluyen dentro de la clase III del sistema de clasificación biofarmacéutica, solamente al-gunas pertenecen a la clase IV y es excepcio-nal que algunas biomoléculas se incluyan en la clase I. Es decir, los productos obtenidos por biotecnología suelen presentar una solubilidad en agua alta o moderada y una permeabilidad intrínseca baja o muy baja [6]. Actualmente se están desarrollando diferentes estrategias para mejorar la biodisponibilidad oral de péptidos y proteínas.

La vía pulmonar constituye una alternativa a la vía oral para la administración de péptidos y proteínas destinadas tanto a conseguir una ac-ción local en el sistema respiratorio como para producir efectos sistémicos. El empleo de bio-moléculas se inició hace más de 70 años, cuando se comprobó la absorción parcial de la insulina administrada en forma de aerosol.

Para ejercer un efecto localizado, el fármaco debe alcanzar de forma eficiente la superficie a través del flujo aéreo, penetrando o incluso atravesando la barrera mucosa para alcanzar su lugar de acción. La tecnología de los aerosoles ha alcanzado en los últimos años un desarrollo que permite el control de las variables que pue-den reducir el rendimiento del proceso.

Los agentes mucolíticos (dornasa-α) y las anti-proteasas (inhibidores leucoproteasa, proteinasa-α1, etc.) son más efectivos cuando se dispersan

en las secreciones del flujo aéreo en las zonas en las que se produce una mayor obstrucción. Los antioxidantes y los factores de crecimiento pre-cisan, sin embargo, alcanzar las células epiteliales, mientras que la terapia de transferencia génica precisa no sólo alcanzar el epitelio pulmonar, sino también las glándulas submucosas o las cé-lulas progenitoras de epitelio.

La mucosa pulmonar constituye una barrera importante para el paso de los fármacos que están destinados a alcanzar el epitelio, acentua-da en presencia de procesos inflamatorios o infecciosos.

Diversos factores dependientes del fármaco, como carga de las partículas, solubilidad y ta-maño, así como las propiedades biofísicas del mucus, afectan a la capacidad para atravesar esta barrera [7]. Así, se ha demostrado la existencia de una relación inversa entre el peso molecular del fármaco y la difusión a través del mucus, que es especialmente manifiesta a partir de 30 kDa. La difusión a través del mucus se ve dificultada por la fijación a algunos componentes, como la mucina, ADN, etc. y al efecto de diversas enzi-mas. Entre los factores que aumentan la capa-cidad de difusión figuran la superficie efectiva de tensoactivo y el incremento en el tiempo de retención de las partículas.

La vía inhalatoria presenta algunas caracterís-ticas ideales para la consecución de efectos sis-témicos; así, destaca especialmente la superficie de absorción, aproximadamente de 100 m2 con pequeño espesor, de 100-200 nm.

Las moléculas pequeñas se absorben por di-fusión pasiva o transporte mediado por recep-tores. En el caso de macromoléculas, los pépti-dos pequeños, con un peso molecular inferior a 40 kDa, pueden absorberse por transporte paracelular, mientras que para valores superio-res participa la transcitosis, mediada, en algunos casos, por receptores de membrana. El proceso puede ser relativamente rápido, con valores de Cmáx de 10-30 minutos para pequeños péptidos solubles, hasta varias horas cuando se trata de grandes proteínas.


La vía nasal ha recibido en los últimos años considerable atención debido a algunas carac-terísticas diferenciales respecto al tracto gas-trointestinal y otras mucosas, como la escasa actividad proteolítica, la reducida cobertura mucosa, el pH, que se mantiene próximo a la neutralidad, y la ausencia de alimentos o pro-ductos de la digestión que pueden reducir la biodisponibilidad.

La vía nasal también puede utilizarse para la administración de péptidos y proteínas destina-das a ejercer efectos sistémicos. Para moléculas pequeñas, constituidas por 10 aminoácidos, la biodisponibilidad es elevada, alcanzando en al-gunos casos el 100%. Sin embargo, para molé-culas mayores de 25 aminoácidos se produce un descenso muy acusado de la biodisponibili-dad, hasta el 1% o incluso valores inferiores.

Las posibilidades de la vía nasal para la ad-ministración de biomoléculas pueden verse aumentadas con la incorporación de agentes viscosizantes, que aumentan su tiempo de con-tacto con la mucosa, y moléculas bioadhesivas, que incrementan la permeabilidad.

La vía nasal ha sido utilizada por sus ventajas para la administración de hormonas peptídicas (desmopresina, oxitocina, calcitonina, etc.), aun-que debe asegurarse el cumplimiento terapéu-tico por parte de los pacientes. Se encuentran formulaciones en avanzado estado de desarro-llo para administración endonasal de glucagón, insulina, hormona de crecimiento, hormona liberadora de hormona de crecimiento, soma-tostatina, etc. La formulación de insulina ha teni-do mayores dificultades, debido a su tendencia a la agregación de hexámeros en disolución acuo-sa y a su naturaleza hidrofílica. Por ello, para su introducción en clínica ha precisado de la incor-poración de promotores de absorción.

La vía nasal parece ofrecer buenas expectati-vas para la administración de vacunas. Los antí-genos administrados por vía intranasal pueden absorberse a través de los nódulos linfáticos cervicales, pasar directamente a la circulación sistémica debido a la alta densidad en la vas-

cularización de la mucosa o ser captados por el tejido linfoide nasal (NALT) rico en células M con capacidad para el transporte vesicular transcelular de partículas y macromoléculas.

Administración parenteralDebido a las limitaciones de la vía oral, los

péptidos y las proteínas se administran habi-tualmente por vía parenteral, preferentemente intravenosa. La mayoría de estas moléculas pre-sentan un rápido aclaración, lo que conduce a valores bajos en la semivida de eliminación.

Los problemas que surgen con la administra-ción parenteral de macromoléculas que presen-tan un rápido aclaramiento ha estimulado el de-sarrollo de diferentes actuaciones dirigidas, en principio, a modificar el perfil farmacocinético y, en consecuencia, facilitar su administración. Esto se ha conseguido mediante cambios estructu-rales, por conjugación con diversos polímeros, por hiperglicosilación de las proteínas y con el desarrollo de formulaciones parenterales de li-beración controlada [8-10].

La conjugación de péptidos y proteínas con diversos polímeros constituye actualmente un área de gran interés, especialmente en la tera-péutica oncológica, a la que se han incorporado proteínas antitumorales, enzimas, citocinas, etc. La conjugación con polímeros produce cambios significativos en el perfil farmacocinético de las macromoléculas, permitiendo superar algunas de las limitaciones que presentaban para su utilización clínica. El principal cambio es un in-cremento en la semivida de eliminación con un aumento de la captación celular por endocitosis. Una vez en sangre, se produce la liberación del conjugado a los compartimentos endosómicos y lisosómicos de la célula, con descenso del pH (5,5-6,0). Una vez alcanzado el lisosoma se pro-duce la degradación metabólica por acción de las hidrolasas intracelulares.

La pegilación de proteínas con una o varias cadenas de polietilenglicoles (PEG) es, posible-


mente, el mecanismo de conjugación más de-sarrollado. Los PEG son polímeros lineales o ramificados constituidos por unidades de óxido de etileno (-CH2-O-CH2-) que presentan dos grupos hidroxilo terminales, los cuales pueden ser activados químicamente [11]. La reacción de pegilación más frecuente implica al grupo ε-amino de la lisina o grupos amino terminales de las proteínas. Las biomoléculas conjugadas presentan propiedades fisicoquímicas diferentes de las proteínas originales, como cambios en la conformación, impedimento estérico, capacidad de unión electrostática, valores de pK locales de la lisina, hidrofobia, punto isoeléctrico, etc. Estos cambios pueden quedar reflejados, en principio, por variaciones en la actividad, detectada me-diante ensayos in vitro, y en la eficacia, estableci-da con ensayos in vivo. La fijación a receptores se reduce progresivamente al aumentar la masa molecular del polímero, lo que produce un des-censo de la actividad in vitro con tiempos de incubación cortos. Sin embargo, la eficacia de la proteína se incrementa como consecuencia de los siguientes mecanismos:

• Retraso en el aclaramiento renal de la pro-teína, que produce un incremento en la se-mivida de eliminación y en el valor del área bajo la curva de niveles séricos. Este último parámetro refleja el «periodo de exposición» y se relaciona, en ocasiones, con la eficacia en modelos pK-pD.

• Mayor estabilidad frente a las enzimas respon-sables de la degradación de péptidos y proteí-nas, frecuentemente como consecuencia del impedimento estérico.

• Menores efectos adversos debido a que el PEG reduce significativamente la inmunoge-nicidad y antigenicidad de las proteínas.

La pegilación produce importantes cambios en el perfil pK-pD de los péptidos y proteínas utilizados en clínica. Actualmente se dispone de varias proteínas pegiladas y son numerosas las que se encuentran en diferentes fases de de-

sarrollo. La PEG-ADA (adenosina desaminasa) está aprobada para el tratamiento de la defi-ciencia de ADA en pacientes con inmunodefi-ciencia combinada grave. Se trata de un conju-gado de ADA con múltiples cadenas de PEG de un peso molecular de 5 kDa. La consecuencia más inmediata es un cambio en la semivida de eliminación de la enzima de unos pocos minu-tos a aproximadamente 24 horas.

La pegilación de interferones también produ-ce cambios significativos en el perfil farmaco-cinético-farmacodinámico que pueden suponer un progreso en el tratamiento de la hepatitis C y otras indicaciones. La figura 2 muestra el efec-to provocado en las concentraciones séricas del interferón-α-2a como consecuencia de su conjugación con el PEG. El efecto depende del tamaño del polímero y se ha considerado que dos cadenas ramificadas de 20 kDa proporcio-naban un perfil farmacológico idóneo para el desarrollo clínico [12].

Durante los pasados 20 años se han estu-diado numerosos conjugados de proteínas con PEG (citotóxicos, antioxidantes, enzimas, trombolíticos, citocinas y factores de creci-miento hematopoyético, etc.), aunque sólo algunos se encuentran en fase de desarrollo clínico. La conjugación con PEG también se ha aplicado a oligonucleótidos y lípidos para au-mentar su solubilidad, estabilizar las molécu-las, incrementar la permeabilidad o disminuir el aclaramiento [13].

Los glucoconjugados son los compuestos re-sultantes de la unión covalente de una fracción glucídica con otro compuesto, que puede ser protídico o lipídico. La eritropoyetina recombi-nante es una glucoproteína utilizada desde hace más de 10 años en el tratamiento de la anemia renal. Su excreción renal es mínima, y es amplia-mente metabolizada en el hígado vía recepto-res de la galactosa. Los residuos de ácido siálico eliminados en el proceso de biotransformación aseguran la estabilidad de la hormona y su ac-tividad biológica. El metabolito desprovisto de ácido siálico es rápidamente eliminado, siendo


la semivida de eliminación de la eritropoyetina de 4-8 horas.

Diversos estudios experimentales han demos-trado que hay una relación directa entre el conte-nido de ácido siálico y la semivida de eliminación de las glucoproteínas, lo que ha sido un estímulo para la búsqueda de nuevas moléculas.

Darbepoetina es un análogo hiperglicosilado de eritropoyetina que presenta distintas pro-piedades fisicoquímicas y biológicas. La figura 3 recoge la estructura de ambas moléculas esti-mulantes de la eritropoyesis, así como la evo-lución de los valores séricos obtenidos tras su administración por vía intravenosa. La principal consecuencia del cambio producido en el perfil farmacocinético es la modificación del intervalo de la posología, que pasará de 3 a 4 días con eri-tropoyetina a 7-14 días con darbepoetina [14].

En los últimos años se han desarrollado nu-merosas matrices poliméricas biodegradables y biocompatibles que se han incorporado a mi-

crocápsulas, microesferas, nanoesferas e implan-tes para conseguir una liberación prolongada de pequeñas moléculas. Actualmente algunos de estos polímeros se utilizan en el diseño de for-mulaciones parenterales de medicamentos ob-tenidos por biotecnología [15]. Entre ellos des-tacan los poli (±-hidroxiácidos) –como el ácido poliláctico y el polihidroxibutírico– y los copolí-meros, especialmente el ácido láctico-ácido gli-cólico. Estos productos no son inmunogénicos y permiten, por sus propiedades fisicoquímicas, controlar la velocidad de liberación de péptidos y de proteínas.

Distribución tisular y celular

La incorporación de los fármacos a órganos y tejidos corporales es un proceso cinético com-

12

8

4

00 25 50 75 100 125 150

1,6

1,2

0,8

0,4

00 25 50 75 100 125 150

25

20

15

10

5

00 25 50 75 100 125 150

Tiempo (h)

Tiempo (h) Tiempo (h)

PEG-Interferón-α-2a (40 kDa)

Interferón-α-2a PEG-Interferón-α-2a (5 kDa)

Con

cent

raci

ón

Con

cent

raci

ón

Con

cent

raci

ón

Figura 2. Farmacocinética de interferón y dos derivados pegilados.


plejo con una gran repercusión en la respuesta terapéutica. La velocidad de distribución puede estar limitada por la perfusión sanguínea o por la permeabilidad lo que condiciona el acceso y permanencia en su lugar de acción. La fracción de la dosis de un fármaco que alcanza finalmen-te los tejidos o incluso los espacios intracelula-res obedece a numerosos factores, muchos de ellos dependientes de sus propiedades fisico-químicas. Por ello, las pequeñas moléculas con un óptimo coeficiente de reparto acceden con facilidad a los compartimentos periféricos y pre-sentan valores elevados del volumen aparente de distribución, a diferencia de los péptidos y proteínas que muestran valores relativamente pequeños. El elevado peso molecular de algunas biomoléculas constituye un factor limitante de la distribución tisular. Sin embargo, en algunos casos es posible alcanzar el lugar de acción en concentración suficiente para producir una res-puesta terapéutica adecuada.

La especificidad en la localización del lugar de acción de muchos fármacos obtenidos por biotecnología obliga a mayores exigencias en su perfil de distribución. El desarrollo de los facto-res de crecimiento y genes recombinantes para promover la angiogénesis en el infarto de mio-cardio es un buen ejemplo de la importancia de esta característica farmacocinética [16]. La administración intravenosa del factor de creci-

miento de fibroblastos (FCF) no produce res-puesta angiogénica en modelos experimentales de isquemia miocárdica. Por esto ha sido nece-sario recurrir a la administración directa en el miocardio, en el saco pericárdico o en el espa-cio perivascular para alcanzar la respuesta tera-péutica deseada. La eficacia de estas alternativas fue confirmada y evaluada por la medida del flu-jo y función miocárdica, aunque se hace preciso aún aplicar nuevas técnicas, como la tomografía de emisión de positrones o la resonancia mag-nética para establecer, de forma más precisa, la extensión de la respuesta angiogénica.

Una situación más problemática se plantea cuando se precisa el acceso intracelular de ge-nes y oligonucleótidos antisentido cuya diana está localizada en el compartimento citosol/núcleo [17]. Se han propuesto diferentes meca-nismos para explicar la interiorización de estas moléculas, como la endocitosis en fase fluida y la endocitosis mediada por receptores, ya que no hay evidencia de paso por difusión pasiva, ni siquiera recurriendo a biomoléculas neutras. En el momento actual, la escasa capacidad de interiorización y la inadecuada compartimenta-ción intracelular constituyen un problema bási-co en el progreso de la terapéutica antisentido. Recientemente se han desarrollado diferentes métodos físicos (microinyección, permeabili-zación, electroporización, etc.), que mejoran

Figura 3. Estructura y farmacocinética de eritropoyetina y darbepoetina.

Tiempo posinyección i.v. (horas)

0 12 24 36 48 60 72 84 96

Con

cent

raci

ón s

éric

a (n

g/m

l) 10

1

0,1

0,01

Eritropoyetina Darbepoetina

• 3 enlaces-NH-glicosídicos• ≤ 14 residuos ácido sialico• 30.400 Da• 40% carbohidratos

• 5 enlaces-NH-glicosídicos• ≤ 22 residuos ácido sialico• 38.500 Da• 52% carbohidratos

Darbepoetina

Eritropoyetina


la captación celular de los oligonucleótidos en relación con los métodos convencionales de conjugación o los que recurren a transporta-dores (liposomas, lipoplexes, policationes, etc.). También puede recurrirse a la administración de estos medicamentos en el tejido diana, como el fomivirsen, administrado por inyección intra-vítrea directa en el tratamiento de la retinitis por citomegalovirus.

La selectividad en la distribución permite me-jorar la relación beneficio-riesgo de numerosos medicamentos, lo que puede incrementar su potencial terapéutico. Esta última consideración ha vuelto a poner de actualidad el concepto de «bala mágica», idealización introducida por Paul Erlich hace casi un siglo y que, gracias a la biotec-nología, puede convertirse en una realidad [18].

Los sistemas de transporte coloidal, como liposomas, nanopartículas, microsferas, etc., se han utilizado para prolongar el tiempo de circu-lación de numerosas moléculas, protegerlas de la degradación y dirigirlas a tejidos diana. Estos sistemas tienen dificultades para acceder a los tejidos sanos, debido, entre otros factores, a su tamaño, especialmente si supera 20 nm, consi-derado el tamaño crítico para la mayoría de los tejidos.

El desarrollo de los anticuerpos monoclona-les representa una de las técnicas más pode-rosas para dirigir fármacos, tóxicos, isótopos y enzimas a su lugar de acción. El gemtuzumab es un anticuerpo recombinante humanizado dirigido frente al antígeno CD33 y unido a la calicheamicina, un potente antibiótico tumoral. Se trata del primer fármaco vectorizado intro-ducido en quimioterapia y fue aprobado por la FDA a finales del año 2000 en el tratamiento de la leucemia mieloide aguda en casos de re-cidivas. Gemtuzumab se une al antígeno CD33, expresado en el 80-90% de los pacientes con leucemia mieloide aguda, penetrando en la célu-la y liberando el agente citotóxico que provoca la muerte celular.

El potencial terapéutico de estos agentes se ha incrementado desde la introducción de la

tecnología del hibridoma en la década de 1970, y actualmente se dispone de fármacos inhibido-res de la reactividad aloninmune y autoinmune, antitumorales, antiplaquetarios antivirales, etc. En España, se han introducido recientemente tras-tuzumab, infliximab y rituzimab, aunque otros muchos se encuentran en diferentes fases de desarrollo, alcanzando casi el 25% de todos los productos obtenidos por biotecnología [19].

A pesar de las ventajas potenciales que pre-sentan al fijarse selectivamente a las células diana, su incorporación a la terapéutica mostró mayores dificultades de las inicialmente previs-tas. Entre ellas, la capacidad limitada de penetra-ción tisular que depende, entre otros factores, de las dimensiones del anticuerpo. Los anticuer-pos convencionales son proteínas de elevado peso molecular que presentan una baja capa-cidad de acceso a los tejidos –especialmente los que tienen una escasa vascularización–. En terapéutica oncológica con anticuerpos mono-clonales, la relación de concentraciones entre el tumor y la circulación sistémica se incrementa lentamente durante varios días debido, a la eli-minación del anticuerpo y, en menor grado, a la captación tumoral [20].

ConclusiónLa efectividad clínica de los medicamentos

obtenidos por biotecnología está condicionada por su perfil farmacocinético. Algunas relaciones pK-pD confirman que los parámetros farmaco-cinéticos son buenos factores de predicción de la respuesta terapéutica.

Por su estructura química, estas biomoléculas presentan algunas limitaciones para su utiliza-ción clínica, especialmente una biodisponibilidad oral baja y un rápido aclaramiento plasmático. Por ello, se han realizado importantes esfuerzos para mejorar sus características farmacocinéti-cas, entre las que debe destacarse la importan-te contribución de la tecnología farmacéutica mediante el diseño de diferentes formulaciones


que mejoran sensiblemente el perfil farmaco-cinético. El profesor Robert S. Langer, del Mas-sachusetts Institute of Technology, uno de los investigadores de mayor prestigio en el diseño de formas de liberación de medicamentos seña-laba recientemente: «I am very excited by the fact that the first protein delivery systems are coming on the market and that a lot of a protein delivery systems are moving into the clinic...».

De forma progresiva se van incorporando nuevas biomoléculas al arsenal terapéutico, in-dicadas especialmente en el diagnóstico y tra-tamiento de patologías graves. Una progresión similar experimenta la formulación farmacéutica, que ha culminado recientemente con la presen-tación de un microchip aplicado a la liberación controlada de medicamentos, incluidos pépti-dos y proteínas.

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Desarrollo de la biotecnología vegetal

Durante las dos últimas décadas se han pro-ducido en el conjunto de las actividades liga-das a la investigación genética en plantas una serie de innovaciones y cambios tecnológicos que se han englobado bajo la denominación de biotecnología vegetal y que constituyen una verdadera revolución, no sólo de la investiga-ción y el desarrollo agrario, sino de toda una concepción de la agricultura tradicional y de la utilización económica de las plantas. Sin duda la capacidad de generar plantas transgénicas constituye una de estas nuevas tecnologías so-bre las que pivota el cambio global que se está produciendo. Hoy día, prácticamente ya no hay ninguna especie vegetal cultivada importante para la que no se disponga de la capacidad de transgénesis.

Transgénesis vegetal mediante Agrobacterium tumefaciens

La transgénesis vegetal no se realiza en la actualidad de un modo único. Los primeros

desarrollos, todavía ampliamente utilizados, se basaron en la capacidad natural de la bacteria A. tumefaciens y relacionadas para in¬tegrar de forma estable par te de su ma-terial genético en el genoma de sus plantas huésped. La manipulación subsiguiente del genoma de Agrobacterium permitió dispo-ner en breve plazo de vectores desarmados (exentos de la capacidad de inducir enfer-medad que poseen los aislados naturales de la bacteria) para llevar a cabo integraciones estables de genes foráneos. La clonación de estos genes en los vectores de Agrobacte-rium permite que la bacteria los integre en el genoma de las futuras plantas transgénicas. En general, el proceso de transformación se complementa con un conjunto de tecnolo-gías de cultivo in vitro de tejidos vegetales, que permiten regenerar plantas enteras fér-tiles a par tir de determinados tejidos trans-formados cultivados. Como se ha dicho, esta tecnología de generación de plantas trans-génicas se utiliza todavía ampliamente, aun-que más recientemente se han desarrollado otras formas de transformación de plantas, lo cual a su vez ha permitido ampliar el aba-nico de especies transformables.

9 Aplicaciones de la biotecnología recombinante vegetal a la terapéutica humanaFernando PonzCentro de BIoteCnología y genómICa de plantas (upm-InIa)Campus de Montegancedo. Pozuelo de Alarcón. Madrid

Aplicaciones de la biotecnología recombinante vegetal a la terapéutica humana 123

Otros métodos de transformación de plantas

De entre todos los desarrollos habidos des-de las primeras transformaciones de discos de hojas de tabaco con Agrobacterium, merecen destacarse 2 por la simplicidad que han añadi-do al proceso. En primer lugar la biolística, que implica el disparo de microproyectiles de oro, wolframio, etc., recubiertos del ADN que se desea integrar en el genoma de la planta. Esta técnica evita la utilización de la bacteria en el proceso de transformación y es especialmente interesante en los casos de especies vegetales que no son huéspedes naturales de la bacteria, como es el caso de los cereales (en general, de las plantas monocotiledóneas). El otro desarro-llo reciente es el que permite en algunas espe-cies, sobre todo experimentales, llevar a cabo la transformación con la bacteria directamente sobre las flores, lo que posibilita la obtención directa de semillas de plantas transgénicas sin necesidad de recurrir al cultivo in vitro.

Genómica y proteómica vegetales

Disponer de plantas transgénicas constituye un hito importante en el desarrollo de la bio-tecnología vegetal, pero no es el único. En efecto, la capacidad para el análisis pormenorizado de los genomas vegetales, tanto en su vertiente es-tructural como funcional, se ha desarrollado en paralelo con la transgénesis y empieza a permi-tir la racionalización de muchos de los procesos clásicos de la mejora genética y, también, de la propia transgénesis. Las nuevas disciplinas de la genómica y la proteómica, cuyas aplicaciones al estudio del genoma humano están provocando toda una nueva forma de buscar y diseñar fár-macos, están también teniendo un fuerte impac-to en la biotecnología vegetal. La conjunción de ambas tecnologías supone un potencial enorme de incidencia en procesos de desarrollo contro-lado de las plantas, así como de su utilización para otras áreas biotecnológicas, como por ejemplo

la farmacia. Como en tantas otras ocasiones an-teriores, el desarrollo tecnológico ha permitido poner de manifiesto conceptos de índole más fundamental, en un proceso de alimentación mu-tua muy característico de todas las actividades de I + D. Así, por ejemplo, fenómenos como la cosupresión y el silenciamiento génico mediado por ARN se han descubierto y estudiado por primera vez en plantas, gracias al propio desarro-llo tecnológico de la biotecnología vegetal. Tras su descubrimiento en el campo vegetal, se ha demostrado en los últimos 2-3 años la existen-cia de fenómenos similares en animales, incluido el hombre, abarcando todo un nuevo sistema de regulación de la expresión génica basado en micro-ARN. Las implicaciones de este descubri-miento en las aproximaciones terapéuticas a en-fermedades, tanto genéticas como infecciosas, se están revelando en la actualidad de una enorme importancia.

Generaciones de productos vegetales biotecnológicos

Primera generación de plan-tas y productos vegetales transgénicos

Las primeras variedades transgénicas de al-gunas plantas de cultivo mundial muy extenso como, por ejemplo, el maíz, la soja, la colza o el algodón, ya han llegado al mercado y tanto ellas como sus productos derivados están en estos momentos en el centro de una fuerte po-lémica social que se está desarrollando en va-rios frentes y a diferentes niveles. Los ejemplos citados forman parte de lo que se ha dado en llamar la primera generación de plantas y pro-ductos transgénicos. Su principal característica es que las modificaciones genéticas que se les han introducido van a dirigidas a mejorar ca-racterísticas de las plantas que son de interés fundamentalmente para sus productores, o sea, para los agricultores. Así, plantas que expresan


constitutivamente un gen de una toxina para insectos procedente de una bacteria, que so-brexpresan una enzima que inactiva la acción de un herbicida o que son resistentes a una virosis gracias a la resistencia conferida por la producción en planta de fragmentos del propio virus, son plantas de un interés obvio e inmedia-to para el productor primario. La Organización para la Cooperación y Desarrollo Económico (OCDE), que ha estudiado intensamente en los últimos años el fenómeno de la biotecnología desde muchos ángulos, ha definido esta primera generación de cultivos transgénicos «centrada en características agronómicas para conferir mayores rendimientos en las cosechas median-te la reducción de pérdidas y espaciamientos menores entre hileras, y para reducir costes de insumos mediante la disminución del uso de plaguicidas y herbicidas». Otras dos característi-cas de los productos de la primera generación son su irrelevancia para el consumidor final, así como que no suponen un cambio de mercado. Se trata, en definitiva, de plantas cuyos produc-tos van dirigidos a los mismos mercados que sus parientes no transgénicas y que no suponen cambios sustanciales para el consumidor, excep-to quizá su menor precio, consecuencia de unos menores costes de producción.

Segunda generación de plantas y productos vegetales transgénicos

Existen ya una segunda y una tercera genera-ción de plantas transgénicas, cuya llegada al mer-cado se está produciendo aún con timidez, pero de las que se espera un gran impacto comercial en los próximos años. De nuevo según la OCDE, la segunda generación de plantas transgénicas «se centra en una serie de caracteres relaciona-dos con la calidad, que mejorarán su aplicación en los sistemas de producción de alimentos así como sus características de uso finales. Cose-chas con modificaciones en las grasas, aceites y almidones para mejorar el procesamiento y

la digestibilidad, como sojas de alto contenido en ácido oleico, colzas de alto estearato o ácido láurico (cultivándose ya en los Estados Unidos), maíz de bajo fitato o ácido fítico. Desde un punto de vista industrial se pueden esperar, p. ej., plantas de algodón coloreado que eviten o disminuyan la necesidad de tintes químicos (al-gunas ya disponibles)». Se aprecian en esta se-gunda generación algunos cambios sustanciales en relación con la primera. En primer lugar hay un cambio de mercado final. Las modificaciones genéticas ya no se hacen pensando fundamen-talmente en el productor, sino en el consumidor del producto final, al cual se le proporciona un producto de mayor calidad. Por supuesto es posible combinar características típicas de esta segunda generación con otras de la primera, si se desea o el mercado lo demanda. Así, es po-sible producir patatas con unas características de almidón más adecuadas para su congelación y fritura directa en freidora, que además sean resistentes al escarabajo de la patata median-te la expresión de la toxina bacteriana. La otra característica de algunos de los productos de la segunda generación es que presentan un aspecto de interfase con cuestiones más clási-camente relacionadas con problemas de salud humana que con consideraciones meramente agroalimentarias. Por ejemplo, la producción de aceite de soja con un mayor contenido en ácido oleico se hará teniendo muy en cuenta factores de salud relacionados con enfermedades car-diovasculares, además de otros factores de pro-ducción agraria,o algunas de las modificaciones en los metabolismos de hidratos de carbono de plantas como la patata o algunos cereales con-siderarán el tamaño creciente de mercado que suponen los consumidores diabéticos.

Tercera generación de plantas y productos vegetales transgénicos

Si la segunda generación de productos bio-tecnológicos vegetales supone un grado de so-


fisticación considerable en relación con los de la primera, aun lo será más con los productos de la tercera generación. La OCDE predice que es-tas plantas «producirán más factores de calidad de cara a un producto final, como productos de nutricéutica o alimentos funcionales, que son cosechas modificadas para producir medicinas o suplementos alimentarios en la planta. Estas plantas podrían inducir inmunidad a enferme-dades o mejorar características sanitarias de los alimentos tradicionales, como, p. ej., colza con ß-carotenos o arroz suplementado con vitamina A. También se prevén plantas que fijen nitróge-no con mayor eficacia, disminuyendo por tanto la necesidad de abonos, o plantas resistentes a la sequía, las inundaciones y las temperaturas extremas, así como plantas que se puedan utili-zar en procesos de biorremediación de suelos y aguas. También se ha sugerido la posibilidad de producir plantas de algodón incombustible o que no se arrugue, o plantas de colza que pro-duzcan plásticos biodegradables (esto ya se ha conseguido)». Es en estos productos de tercera generación donde se producirá el verdadero cambio que aporta la biotecnología a la produc-ción vegetal. Los mercados a los que se dirigen estos productos pueden ser tradicionales del producto agrario, pero serán básicamente mer-cados nuevos. La interfase entre la producción vegetal e industrias que son en estos momentos ajenas a la agricultura o utilizan productos agra-rios de manera muy minoritaria, se verá fuer-temente incrementada cuando estos productos alcancen masivamente el mercado. De entre todas estas industrias es quizá la farmacéutica la que se prevé que se afecte antes en sus estruc-turas de producción de determinados produc-tos por el impacto de la biotecnología vegetal. Hay dos niveles de impacto entre productos biotecnológicos vegetales y la producción de medicamentos. El primero es el de utilizar las plantas como biofactorías de producción de fármacos o productos de interés farmacéutico. Esta actividad constituye el factor más impor-tante de lo que se denomina «agricultura mo-

lecular» (molecular pharming) y que se describe con algo más de detalle en el siguiente apar-tado. La otra constituye una verdadera síntesis entre la agricultura, la alimentación y la farmacia, y es la base de una nueva disciplina científica emergente, la «nutricéutica», como parte de un concepto más general que es el del «alimento funcional». Conferir una funcionalidad sanitaria al hecho de alimentarse supone profundizar en una tendencia creciente en las sociedades avan-zadas, como es la de la «comida sana», confi-riendo al hecho de alimentarse una vertiente curativa, o más bien, y en mayor medida, pre-ventiva. Quedan mencionadas anteriormente las posibilidades de plantas con suplementos vitamínicos, pero quizá el paradigma de lo que puede ser esta nueva actividad farmacéutica lo constituyan las llamadas «vacunas comestibles». Esta idea intenta explotar la inmunidad mucosal de las personas y los animales (también aplica-ciones veterinarias) mediante la presentación de antígenos con potencial vacunal por medio de alimentos procedentes de plantas transgéni-cas que expresen dichos antígenos. Algunas de las primeras pruebas realizadas en animales de experimentación han resultado muy promete-doras y las pruebas clínicas ya han empezado en algún caso. Además de la posible implanta-ción de este tipo de vacuna alimenticia en las poblaciones infantiles de países desarrollados, lo cual resulta algo cuestionable desde el punto de vista de la rentabilidad y ventajas económi-cas y de gestión, esta aproximación presenta una vertiente social de indudable valor, como es poder alcanzar segmentos de población que en estos momentos no está sometida a pro-gramas de vacunación, fundamentalmente por motivos económicos –especialmente en países no desarrollados–. Ello podría incluir enferme-dades infecciosas tropicales de baja incidencia en países desarrollados, como el cólera, la ma-laria o la fiebre amarilla, para las que se podrían plantear vacunaciones fundamentadas en vacu-nas comestibles basadas en productos de alto consumo (yucas, bananas, etc.).


Producción de fármacos en plantas

Producción en plantas transgénicas

La agricultura molecular ha comenzado su andadura orientada básicamente a la produc-ción de fármacos en plantas y, de entre ellas, los primeros productos que han despertado el mayor interés entre los biotecnólogos ve-getales han sido las proteínas terapéuticas. Existen ya en la literatura científica numerosos ejemplos de plantas transgénicas productoras de proteínas humanas con valor terapéutico. Los resultados obtenidos hasta el momento permiten ser muy optimista con respecto a la evolución creciente de esta tecnología, pero al tiempo ilustran con claridad la complejidad de situaciones que se pueden producir al generar las plantas productoras. Algunos de los puntos que se están revelando claves para el éxito o el fracaso de esta aproximación global son varia-dos como, p. ej., las enormes diferencias de ex-presión del transgén que se encuentran en los distintos casos, la problemática de extracción de las proteínas producidas, el grado de simi-litud en el procesamiento post-traduccional de las proteínas, etc. Cada uno de estos pun-tos requerirá un esfuerzo de afinamiento de las condiciones de producción que necesita-rá soluciones parcialmente distintas para cada caso, por lo que es difícil en estos momentos ir mucho más allá en las generalizaciones. En la actualidad no hay todavía ninguna proteína terapéutica humana producida en plantas que se encuentre en el mercado, pero ya hay al-gunas en las fases de pruebas clínicas. Quizá la más avanzada sea un anticuerpo producido en la planta del tabaco que se pretende utili-zar, por medio de colutorios, en el tratamien-to y prevención de las caries y enfermedades infecciosas de las encías. Los costes menores de producción de grandes volúmenes de un anticuerpo de estas características en plantas

de tabaco posiblemente permitan lanzar al mercado ese tipo de producto sin disparar el precio para el consumidor final. Al margen de los problemas nuevos que se vayan poniendo de manifiesto en la producción de fármacos en plantas según se vayan desarrollando los procesos, esta estrategia de producción pre-senta algunas ventajas inherentes respecto de los métodos tradicionales de extracción de tejidos humanos y animales o de procesos de fermentación. Queda ya mencionado el proba-ble menor coste, pero hay más: p. ej., el de la seguridad sanitaria del fármaco. La reciente cri-sis de las encefalopatías espongiformes bovinas y su probable relación con algunas enferme-dades humanas del tejido nervioso ha puesto claramente de manifiesto el riesgo de arrastrar desde tejidos animales en los procesos de ex-tracción, patógenos de difícil detección o eli-minación. Este riesgo se elimina totalmente en las plantas, ya que éstas no permiten la mul-tiplicación de estos patógenos (priones, virus del SIDA, virus de las diferentes hepatitis, etc.). Además, las plantas pueden constituir el único sistema capaz de producir eficientemente cier-tas proteínas humanas, como reguladores del crecimiento e inhibidores del ciclo celular, que tendrían un impacto negativo en los animales transgénicos o en las células animales cultivadas en las que se expresaran. Otra consideración es la de capacidad de producción del fármaco, la cual puede llegar a ser limitante en algunos casos. Un caso citado con frecuencia de esta última situación es el del potencial tratamiento del cáncer mediante inmunoterapia. Cálculos efectuados en Estados Unidos predicen que cada paciente puede llegar a necesitar entre 10 y 200 mg de anticuerpo recombinante an-titumoral, lo cual, dado el ritmo de diagnóstico de nuevos casos (al año, 650,000 de cánceres de mama, pulmón y colon sólo en los Estados Unidos), puede llegar a crear una demanda de unos 130 kg por año en aquel país. Práctica-mente, sólo la producción en plantas puede asegurar ese nivel de producción a un precio razonable.


Producción mediada por virus vegetales

El punto de la producción de grandes can-tidades del fármaco que se desea obtener ha puesto de manifiesto un problema al que se enfrentan las plantas transgénicas como vía de producción. Como se ha mencionado previa-mente, con la tecnología disponible en la actua-lidad es prácticamente imposible predecir los niveles de expresión del gen foráneo que se alcanzarán en una línea transgénica determina-da y, de todas formas, parece razonable pensar que la expresión a partir de un promotor tiene que presentar límites cuantitativos difíciles de sobrepasar. Por otra parte, establecer una línea transgénica productiva y genéticamente estable puede llevar muchos meses, incluso años. Situa-ciones como la de los anticuerpos antitumora-les, mencionada anteriormente, son claramente incompatibles con estas limitaciones pues se trata de fármacos personalizados de los que se necesitan grandes cantidades en períodos bre-ves de tiempo (semanas a unos pocos meses). Este tipo de consideraciones, junto con algunas otras de carácter más cercano a la estrategia comercial, han hecho que bastantes investiga-dores y empresas de biotecnología se hayan fijado en los virus vegetales como vehículos de expresión de los genes foráneos. Los virus vege-tales suelen ser agentes infecciosos muy simples genéticamente, por lo que su manipulación ge-nética no resulta excesivamente compleja. Ge-neralmente se multiplican hasta alcanzar niveles de acumulación de viriones bastante elevados, lo cual se encuentra también para algunos de sus productos génicos individuales y, por extra-polación, para proteínas producidas a partir de genes foráneos introducidos en ellos. Además, desde el punto de vista de la rapidez de pro-ducción, resulta mucho más rápido generar un virus transgénico que una planta transgénica. Es-tas características hacen de los virus vehículos de expresión muy interesantes y que se están desarrollando rápidamente en la actualidad. Una consideración adicional para algunas aplicacio-

nes es que es factible combinar ambas estrate-gias (plantas transgénicas y vectores virales), lo cual permitiría elegir lo mejor de ambas.

La interfase virus vegetales/nanobiotecnología biomédica

En los últimos 5 o 6 años varios grupos pio-neros en algunos centros de investigación es-tán explorando intensamente la posibilidad de aprovechar los viriones vegetales como nano-partículas con aplicaciones biomédicas. El desa-rrollo de la nanotecnología en biomedicina está acelerándose notablemente y el hecho de que los viriones sean en sí mismos nanopartículas biológicas naturales, no ha pasado desapercibi-do. Viriones vegetales pertenecientes a distintos virus han sido convertidos en plataformas por-tadoras de péptidos, anticuerpos, antígenos de todo tipo, moléculas contraste para utilización en diagnóstico por imagen, o nanovasijas por-tadoras de drogas antitumorales, por citar sólo unas cuantas aplicaciones. Aunque todavía lejos de la utilización clínica, los resultados obtenidos hasta la fecha permiten ser muy optimista en este campo, que sin duda va ser uno de los de mayor expansión en el futuro próximo.

La estructura de la empresa biotecnológica farmacéutica vegetal

El rápido desarrollo de la biotecnología vege-tal está contribuyendo también, junto con otros desarrollos biotecnológicos, a la profunda trans-formación que se está experimentando en la ac-tualidad en la estructura empresarial de varios sectores industriales ligados a las ciencias de la vida. Hay características muy llamativas de la nue-va situación. Por un lado, surgen constantemente (sobre todo en Estados Unidos) nuevas peque-ñas empresas con un alto contenido tecnológico que contribuyen de manera muy significativa al rápido desarrollo de la biotecnología; muchas de estas empresas fracasan en su proyecto em-presarial o son finalmente absorbidas por otras


empresas mayores. Por otro, este proceso de ab-sorción empresarial se da también entre grandes empresas multinacionales, lo cual está generando una situación de concentración empresarial sin precedentes. Otra característica es la de la crea-ción de un sector industrial completamente nue-vo, que se denomina «de empresas de ciencias de la vida». Este tipo de empresas se diferencian de las clásicas farmacéuticas –o de productos agrarios o alimentarios– en que integran en su seno ambos mundos, reflejo de la interfase cre-ciente entre ambas actividades, que se ha co-mentado varias veces a lo largo de este capítulo. Con referencia al futuro, es razonable pensar que ambas tendencias (nuevas pequeñas empresas tecnológicas y grandes grupos empresariales) se-guirán desarrollándose, creando una estructura de producción farmacéutica nueva. Sin embargo, el fenómeno es todavía muy reciente y habrá que estar atento a su evolución.

ReferenciasEl número de trabajos que abordan de mane-

ra pública los temas referidos a la producción de fármacos en plantas mediante biotecnología es aún limitado, dada su relativa novedad. Además, bastantes de estos trabajos se publican en revis-tas especializadas de investigación en plantas de menor difusión en los ambientes médicos o far-macéuticos. Sin embargo, en los últimos años se han publicado un número importante de bue-nos artículos de revisión sobre este tema que proporcionan una visión general y un buen nivel de información al lector interesado. Se presenta a continuación, como orientación, una lista de algunas de estas revisiones.

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Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la Agencia Europea de Medicamentos (EMA)... 129

IntroducciónDurante la década de 1980, los avances en

ingeniería genética y en el establecimiento y cultivo de líneas celulares han permitido la ob-tención de multitud de proteínas terapéuticas (p. ej., eritropoyetina, hormona de crecimiento, interferón) que nunca hubiese sido posible ob-tener en cantidad suficiente de sus fuentes na-turales. Además, el desarrollo de las técnicas de ingeniería de proteínas ha permitido disponer de proteínas modificadas respecto a sus equi-valentes naturales que presentan una mejor efi-cacia clínica, un mejor perfil de seguridad o una nueva aplicación terapéutica. Así, se encuentran disponibles análogos de insulina o eritropoyeti-na (p. ej., insulina lispro, darbepoetin alfa), pro-teínas de fusión que combinan características de dos proteínas diferentes (p. ej., etanercept), proteínas conjugadas a polietilénglicol (p. ej., pe-ginterferon, pegfilgrastim) o anticuerpos mono-clonales «humanizados» (p. ej., alemtuzumab).

Desde la creación de la EMEA, actualmen-te EMA, en 1995, la evaluación de estos me-dicamentos obtenidos mediante tecnología del ADN recombinante se realiza, por reque-rimiento legal, mediante un procedimiento de tipo centralizado, es decir, efectuado en todos los países de la Unión Europea a la vez y coor-dinado por la EMA. Hasta la fecha se han auto-rizado más de 70 productos biotecnológicos y se espera que este número siga aumentando durante los próximos años. Además, la investi-gación en nuevos sistemas de expresión per-mitirá obtener medicamentos biotecnológicos de fuentes «menos convencionales» como, p. ej., animales transgénicos o plantas. La EMEA autorizó en junio de 2006 el primer medica-mento biotecnológico (antitrombina III humana recombinante) producido en la leche de cabras transgénicas. Otros productos obtenidos en conejos transgénicos, como C1 inhibidor, lac-toferrina y fibrinógeno humano, se encuentran en fase de desarrollo clínico o preclínico. Otros

10 Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la Agencia Europea de Medicamentos (EMA), BWP (Grupo de Biológicos) y CHMP (Comité de Medicamentos de Uso Humano)Sol RuizagenCIa española de medICamentos y produCtos sanItarIos (aemps)


medicamentos considerados de alta tecnología incluyen las denominadas «terapias avanzadas», que incluyen terapia génica, terapia celular so-mática e ingeniería de tejidos. Las solicitudes de comercialización para estos productos se eva-lúan también mediante el procedimiento cen-tralizado (solamente la autorización de ensayos clínicos es responsabilidad nacional).

La legislación comunitaria actual permite la autorización de medicamentos biosimilares, es decir, medicamentos biotecnológicos equivalen-tes a otros ya autorizados y cuya patente ha expirado. Su autorización es también mediante el procedimiento centralizado coordinado por la EMA. Hasta ahora, siguiendo esta nueva vía de autorización, se han aprobado 14 medicamen-tos biotecnológicos que incluyen la hormona de crecimiento humana, la eritropoyetina humana y los factores estimuladores de colonias de granu-locitos.

Marco legal y bases para la creación de una agencia europea de evaluación de medicamentos

Los fundamentos de la UE se recogen en el Tratado de Roma, ratificado inicialmente en 1957 por 6 países. Aunque el tratado compro-metía a sus signatarios a establecer un amplio rango de medidas de armonización, dejaba la organización de la sanidad y los sistemas de se-guridad social a la decisión de cada país. Cada EM, por tanto, desarrolló su propia regulación farmacéutica.

Desde 1965, fecha de adopción de la prime-ra directiva de la UE, la legislación farmacéutica comunitaria ha buscado dos objetivos funda-mentales: la protección de la salud pública y la creación de un mercado común que permita la libre circulación de medicamentos.

La Comisión Europea (en adelante referida como Comisión) comenzó en 1965 a promulgar Directivas (del inglés, Directives), es decir, leyes o disposiciones comunitarias de carácter obligato-rio, relacionadas con la regulación farmacéutica.

La Directiva 65/65/EEC del Consejo de 26 de enero de 1965 estableció el principio de conce-sión de autorizaciones de comercialización de especialidades farmacéuticas en todos los EM sobre criterios científicos de calidad, seguridad y eficacia, sin tener en cuenta consideraciones de tipo socioeconómico. Diez años más tarde, los EM consolidaron la experiencia adquirida y se pusieron de acuerdo sobre principios co-munes para la autorización y control de medi-camentos de uso humano (Directivas 75/318/CEE y 75/319/CEE del Consejo de 20 de mayo de 1975). No obstante, cada EM mantenía la responsabilidad de conceder o denegar la auto-rización para comercializar cada medicamento en particular. Actualmente, tanto las directivas citadas anteriormente como otras relacionadas con medicamentos humanos han sido deroga-das y sustituidas por la Directiva 2001/83/EC del 6 de noviembre, posteriormente modifi-cada y ampliada por la Directiva 2003/63/EC del 25 de junio. Estas dos directivas constituyen actualmente la legislación básica que regula los medicamentos para uso humano. Otra directiva posterior, 2004/27/EC, y la Regulación (EC) No. 726/2004 modifican y delimitan también el ám-bito de aplicación de la directiva 2001/83/EC.

En 1977 se constituyó el denominado Co-mité de Especialidades Farmacéuticas o CPMP (Committee for Proprietary Medicinal Products), formado por representantes de todos los EM y de la Comisión. A solicitud de un EM o de la Comisión, el CPMP podía emitir un dictamen consultivo sobre temas relacionados con la au-torización de medicamentos y sobre el control de reacciones adversas de los mismos (farma-covigilancia).

En 1981 se adoptaron provisiones similares para medicamentos de uso veterinario (Directi-vas 81/51/CEE y 81/52/CEE del Consejo de 28 de septiembre de 1981), incluyendo la creación del Comité de Medicamentos Veterinarios o CVMP (Committee for Veterinary Medicinal Pro-ducts). Al igual que para medicamentos huma-nos, estas directivas han sido sustituidas por otra más reciente, la Directiva 2001/82/EC.


La creación de estos comités supuso tam-bién el inicio de un procedimiento coordinado de evaluación, con dictamen no vinculante, que marcó un paso importante en la cooperación entre EM. Aparte de los procedimientos de re-gistro nacionales, las compañías farmacéuticas podían utilizar dos tipos de procedimiento de registro comunitario: el «procedimiento multi-estado» (ampliación de la autorización existen-te en 1 EM a 2 o más de los restantes EM) o el «procedimiento de concertación» (evalua-ción coordinada de la solicitud de autorización en todos los EM; ningún EM podía tomar una decisión individual sobre una autorización de comercialización antes de su discusión previa y dictamen por el CPMP). Este último procedi-miento estaba reservado a los medicamentos obtenidos por procesos biotecnológicos y para otros medicamentos de alta tecnología.

Con el objeto de colaborar con el CPMP en determinados aspectos de la evaluación de me-dicamentos, se crearon grupos de trabajo so-bre calidad, seguridad y eficacia con objeto de aproximar la forma en que cada EM ponía en práctica las obligaciones derivadas de las direc-tivas comunitarias. Estos grupos de trabajo han tenido su continuación en grupos equivalentes en el seno de la EMA.

Primeros pasos en la creación del grupo de biotecnología

En 1985 se creó el denominado Ad Hoc Wor-king Group on Biotechnology/Pharmacy (prece-dente del grupo de biotecnología de la EMA) con dos objetivos fundamentales: asesorar al CPMP sobre solicitudes de autorización de pro-ductos biotecnológicos y establecer recomen-daciones específicas sobre la producción y con-trol de calidad y seguridad de estos productos.

Esta segunda finalidad se llevó a cabo median-te la elaboración de directrices (guidelines) (dis-posiciones de carácter no obligatorio basadas en los conocimientos científicos del momento sobre un aspecto concreto). Se ha preferido la utilización de directrices, que no obligan jurídi-

camente, en vez de un instrumento jurídico for-mal, como una directiva, con el fin de mantener la flexibilidad y no poner obstáculos legales al progreso científico. Se admite que en algunos casos, como resultado de los avances científicos, pueda ser adecuado otro enfoque. Sin embar-go, cuando un solicitante decida no seguir una determinada directriz debe explicar y justificar dicha decisión en los informes que presente la compañía en apoyo de su solicitud.

El Ad Hoc Working Group on Biotechnology/Pharmacy estaba formado por expertos (alre-dedor de 20) procedentes de diferentes áreas relacionadas con la biomedicina, desde auto-ridades reguladoras, laboratorios nacionales de control o investigadores a un representan-te (observador) de la Farmacopea Europea (PhEur). En esta etapa inicial se completaron y/o iniciaron varias directrices sobre citocinas, anticuerpos monoclonales y reducción del ries-go de transmisión de encefalopatías espongifor-mes por medio de medicamentos. Este grupo ha tenido continuación como el Biotechnology Working Party (BWP) dentro de la estructura de la EMA, y recientemente ha pasado a denomi-narse Biologics Working Party (BWP) sin que sus funciones hayan variado.

Agencia Europea de Medicamentos. Procedimientos de autorización

A finales de 1990 se publicaron varias pro-puestas relacionadas con la creación de la Agen-cia y el nuevo sistema comunitario para autori-zación de medicamentos. En 1993 se decidió fijar la sede de la EMEA en Londres y comenzó a funcionar como tal en febrero de 1995. La función principal de la EMEA (hoy EMA) es coordinar y organizar el sistema de autoriza-ción de medicamentos en Europa. Este sistema evalúa cualquier solicitud de comercialización


bien mediante el denominado «procedimiento centralizado» (autorización de comercialización en todos los países de la UE a la vez; decisión unánime o por mayoría) o «descentralizado» (también conocido como «reconocimiento mutuo», equivalente al anterior procedimiento «multi-estado» (extensión de la autorización existente en un EM a otros). El procedimiento centralizado de autorización está reglamentado por la Regulación (EC) No. 726/2004. Este pro-cedimiento es obligatorio para los medicamen-tos que se describen a continuación:

• Obtenidos a partir de tecnología del ADN recombinante, o de la expresión controlada de genes que codifican proteínas biológica-mente activas en procariotas o eucariotas, in-cluyendo las células de mamífero transforma-das, u obtenidos a partir de hibridomas o que emplean anticuerpos monoclonales durante su producción

• Veterinarios empleados como potenciadores para aumentar el crecimiento o rendimiento de los animales tratados

• Humanos para el tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida, cáncer, dia-betes y enfermedades neurodegenerativas. A partir de 2008 también será aplicable a en-fermedades autoinmunes u otras alteraciones inmunitarias y para enfermedades virales.

• Medicamentos huérfanos (según la Regula-ción (EC) No 141/2000).

Existen actualmente 6 comités científicos principales dentro de la EMA: CHMP (Comi-té de Medicamentos Humanos, previamente CPMP), CVMP (Comité de Medicamentos Ve-terinarios), COMP (Committee for Orphan Me-dicinal Products; encargado de la concesión este tipo de clasificación a un medicamento), HMPC (Committee for Herbal Medicinal Products; encargado de plantas medicinales), PDCO (Paediatric Committee; revisión de planes de in-vestigación pediátricos) y CAT (Committee for Advanced Therapies; propuesta de opinión sobre

medicamentos basados en terapias avanzadas al CHMP) . Cada uno de estos comités está formado por un representante de cada uno de los EM. La EMA actúa como el eje central del sistema europeo, organizando y coordinando el trabajo de evaluación que es llevado a cabo por expertos nacionales de cada una de las agencias reguladoras.

Los comités PDCO y CAT son los de más re-ciente creación. La función del PDCO (comité pediátrico) es evaluar los planes de investiga-ción pediátricos y emitir opiniones de acuerdo a la Regulación (EC) 1901/2006 (y sus modifi-caciones posteriores). Este comité, sin embargo, no es responsable de las autorizaciones de co-mercialización de medicamentos para uso pe-diátrico, ya que esto sigue siendo competencia del CHMP. El otro comité, CAT (Comité de Te-rapias Avanzadas), comenzó a trabajar en enero de 2009. Su función principal es la evaluación de medicamentos de terapia avanzada (es decir, de terapia génica, terapia celular somática e in-geniería de tejidos) aunque su autorización final corresponderá también al CHMP. Se puede en-contrar información adicional sobre este comité en la Regulación (EC) 1394/2007.

Evaluación de medicamentos de uso humano y veterinario: CHMP y CVMP

Desde la creación de la EMEA ambos comi-tés de medicamentos humanos y veterinarios, CHMP y CVMP, respectivamente, continúan su labor mediante reuniones mensuales de varios días de duración. Una gran parte de la agenda consiste en la discusión y emisión de dictámenes respecto a nuevas solicitudes de comercialización, bien por el procedimiento centralizado o por el descentralizado. En el procedimiento centraliza-do, 2 miembros del comité (representantes de


países distintos) son designados como ponen-tes (rapporteur y co-rapporteur) para coordinar la evaluación de cada solicitud. Tras la evaluación en el ámbito nacional, los informes de cada uno de los ponentes son discutidos en las reuniones del comité científico correspondiente (CHMP o CVMP), y se emite un informe final vinculante sobre dicho producto. La decisión final se trans-mite a la Comisión que convertirá dicha opinión en una única autorización de comercialización para toda la UE. Solamente quedan a decisión nacional los aspectos relacionados con el precio del medicamento y su posible financiación por el sistema nacional de salud.

El procedimiento descentralizado está basado en el principio de reconocimiento mutuo de au-torizaciones nacionales. Permite la extensión de una autorización de comercialización dada por un EM (denominado EM de referencia o RMS) a otro(s) EM identificados por el solicitante. Cuan-do no sea posible llegar a un acuerdo porque algún EM no acepte la autorización nacional ori-ginal concedida por el RMS, los puntos de des-acuerdo serán discutidos en el recientemente creado Grupo de Coordinación. Si el desacuer-do permanece, la decisión del comité correspon-diente (CHMP o CVMP) es siempre vinculante.

Independientemente del procedimiento seguido, la decisión final la toma la Comisión Europea o, en caso de desacuerdo importante entre EM, el Consejo de la UE.

Los productos que vayan a comercializarse únicamente en 1 EM pueden continuar utili-zando la vía de autorización nacional. Como se ha descrito anteriormente, los productos bio-tecnológicos nunca podrían utilizar esta vía de autorización.

Grupos de trabajo del CHMP

Con objeto de emitir una opinión sobre cual-quier cuestión planteada a la EMA relacionada con medicamentos, el CHMP cuenta con el apoyo de grupos de trabajo que le asesoran en aspectos específicos relacionados con la calidad,

eficacia y seguridad de medicamentos y que participan en las actividades de armonización internacionales (ICH).

Actualmente existen diferentes grupos de trabajo del CHMP y uno conjunto del CHMP/CVMP (QWP). Algunos de ellos se mencionan a continuación:

• Grupo de biológicos (Biologics Working Party, BWP; previamente Biotechnology Working Party): asesora al CHMP, CAT y COMP sobre aspectos relacionados con la producción y control de productos biológicos y biotecno-lógicos, incluyendo terapias avanzadas.

• Grupo de eficacia (Efficacy Working Party, EWP), responsable de elaborar recomendaciones metodológicas en áreas terapéuticas estable-cidas y documentos de opinión sobre aspec-tos de eficacia de medicamentos en áreas en desarrollo clínico.

• Grupo de seguridad (Safety Working Party, SWP), discusión y recomendaciones sobre aspectos de seguridad preclínicos.

• Grupo de farmacovigilancia (Pharmacovigilan-ce Working Party, PhWP), grupo de discusión y evaluación de aspectos relacionados con la seguridad o cambios en la relación riesgo/be-neficio de medicamentos autorizados.

• Grupo de hemoderivados (Blood Products Wor-king Group, BPWG), encargado de aspectos de seguridad y evaluación clínica de productos derivados de sangre o plasma humanos.

• Grupo de vacunas (Vaccine Working Party, VWP), evaluación y discusión de aspectos relacio-nados con la calidad, eficacia y seguridad de vacunas.

• Grupo de biosimilares (Similar Biological Me-dicinal Products, BMWP), grupo encargado de aspectos de seguridad y evaluación clínica de medicamentos biológicos o biotecnológicos que se presentan como equivalentes a otro ya autorizado.

• Grupo de farmacogenética (Pharmacogenetics Working Party, PgWP), grupo asesor del CHMP en materias relacionadas con farmacogenética.


• Grupo de calidad (Quality Working Party, QWP), grupo conjunto del CHMP y CVMP para ar-monizar y asesorar sobre aspectos de calidad de medicamentos humanos y veterinarios.

Grupo de biológicos (BWP)

Desde 1995 hasta ahora, el BWP viene cele-brando unas 10-12 reuniones anuales, de varios días de duración, en la sede de la EMA. Este gru-po está formado por un representante de cada uno de los EM de la UE, un representante de la Comisión, un representante de la Farmacopea Europea, personal técnico de la EMA y, desde febrero de 2000, un representante de Norue-ga y otro de Islandia se han incorporado como miembros de pleno derecho (presentes desde 1999 en calidad de observadores).

El BWP es responsable de proporcionar asis-tencia técnica al CHMP y CAT sobre aspectos relacionados con la fabricación y control de medicamentos biotecnológicos y de origen bio-lógico, incluyendo aquellos derivados de sangre o plasma y productos inmunológicos y medica-mentos de terapias avanzadas. El BWP es tam-bién el grupo asesor del COMP para productos de origen biológico o biotecnológico y de la OMS en los casos en que este organismo lo solicite.

Las actividades principales del BWP se descri-ben a continuación:

• Elaboración de informes sobre los procesos de producción y control de las solicitudes de co-mercialización de medicamentos humanos de origen biológico y biotecnológico. Los aspectos relacionados con la calidad este grupo de me-dicamentos se discuten en la reunión corres-pondiente del BWP y se emite un informe para su consideración por el CHMP que, tras la discusión de los aspectos toxicológicos y clínicos del medicamento en cuestión, emitirá un dictamen final sobre la aprobación o re-chazo de la solicitud correspondiente.

• Elaboración de directrices o recomendaciones europeas e internacionales sobre temas espe-cíficos relacionados con productos biológicos y

biotecnológicos. Al igual que el resto de grupos de trabajo, una de las tareas fundamentales del BWP es la elaboración de directrices o recomendaciones, que serán después apro-badas por el CHMP, sobre temas específicos relacionados con productos biológicos y bio-tecnológicos. Con este fin, se suelen crear subgrupos dentro del BWP que elaboran un documento inicial sobre un tema especifico que es discutido posteriormente en las se-siones plenarias del BWP. En general, las di-rectrices elaboradas por el BWP son objeto de evaluación continua a medida que se pro-ducen avances científicos en temas específi-cos. Expertos del BWP participan también en grupos de trabajo internacionales para armo-nizar criterios y recomendaciones entre la UE, Estados Unidos y Japón (actividades ICH) so-bre este grupo particular de medicamentos.

El BWP también proporciona asesoramiento al CHMP en forma de documentos de opi-nión o recomendaciones puntuales (Points to Consider) sobre aspectos concretos relaciona-dos con un grupo particular de medicamentos (p. ej., aspectos relacionados con la evaluación de posibles vacunas de gripe atenuadas), intro-ducción de nuevos requerimientos de control (p. ej., test de PCR para la detección del virus de la hepatitis C en volúmenes de plasma para la obtención de hemoderivados), etc.

• Asesoramiento científico. Las compañías farma-céuticas tienen la posibilidad de solicitar ase-soramiento científico en cualquier momento durante el desarrollo de un medicamento previo a la presentación de una solicitud de autorización de comercialización o antes de introducir determinados cambios en la fabri-cación de un medicamento ya autorizado. El asesoramiento en aspectos de producción y control de medicamentos biotecnológicos lo realiza el BWP.

• Organización de «workshops» y reuniones sobre temas relacionados con medicamentos biológi-cos y biotecnológicos. El BWP organiza reunio-nes con expertos europeos e internacionales con objeto de discutir los últimos avances


científicos en determinadas áreas que per-mitan la elaboración de recomendaciones especificas, p. ej. productos de terapia géni-ca, ensayos para la detección de marcadores de encefalopatías espongiformes y su posible aplicación a medicamentos, etc. El BWP tam-bién efectúa reuniones con representantes de la industria farmacéutica implicados en temas concretos con objeto de evaluar las implica-ciones o consecuencias de la introducción de determinadas medidas de control o de discutir la aplicación de las mismas de forma coordinada, p. ej. con representantes de fa-bricantes de gelatinas y derivados de grasas animales empleados en la fabricación de me-dicamentos.

• Reuniones con otros grupos de trabajo de la EMEA y de la PhEur. Miembros del BWP participan tam- bién en reuniones conjuntas con miembros de otros grupos de trabajo con objeto de coor-

dinar y facilitar la adopción de recomenda-ciones concretas, p. ej. la discusión sobre as-pectos de seguridad del tiomersal (empleado en la fabricación de determinadas vacunas) se llevó a cabo junto con los Grupos de Seguri-dad (SWP) y el de Farmacovigilancia (PhWP). Miembros del BWP también forman parte de grupos de trabajo de la PhEur para coordinar actividades y recomendaciones en temas rela-cionados con el control de calidad de produc-tos biológicos y biotecnológicos en general.

Bibliografiawww.ema.europa.eu Información adicional sobre el BWP

y actividades de la EMA en general (incluyendo los do-cumentos elaborados por los grupos de trabajo).

http://ec.europa.eu/health/index_en.htmSalud Pública y legislación sobre medicamentos en la

Unión Europea.

AbreviaturasBWP Biologics Working Party (previamente Biotechnology Working Party)

CAT Committee for Advanced Therapies

CHMP Committee for Human Medicinal products (previamente CPMP)

COMP Committee for Orphan Medicinal Products

CPMP Committee for Proprietary Medicinal Products (actualmente CHMP)

CVMP Committee for Veterinary Medicinal Products

EM Estado(s) Miembro(s)

EMA/EMEA European Medicines Agency (actualmente EMA)

HMCP Committee for Herbal Medicinal Products

ICH International Conference for Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use

OMS Organización Mundial de la Salud

PDCO Paediatric Committee

PhEur Farmacopea Europea

RMS Reference Member State

UE Unión Europea


ResumenAnte la creciente demanda de nuevos fárma-

cos que mejoren la salud humana, la biotecnolo-gía proporciona una nueva solución a las nece-sidades médicas no cubiertas por el desarrollo tradicional de fármacos químicos. Hace 30 años se formaron las primeras compañías de biotec-nología, y su crecimiento ha sido exponencial en los últimos 5 años, tanto en Estados Unidos, cuyas empresas lideran el sector, como en la Unión Europea. Las nuevas técnicas diagnósticas que aplican la inmunología y la biología molecu-lar han ayudado a este crecimiento, junto con las previsiones de un adecuado retorno de la inversión. Las grandes empresas farmacéuticas tienden cada vez más a fusionarse o comprar biotecnológicas para incrementar su pipeline de productos. En España se ha cuadriplicado el número de empresas biotecnológicas en los úl-timos 5 años, contabilizándose 305 en el 2008. Cataluña y la Comunidad de Madrid concentran la mayor actividad. La colaboración en el futu-ro entre empresas, universidades, laboratorios públicos e instituciones reguladoras será im-prescindible para impulsar la biotecnología en España.

Introducción: retos para la terapia humana en el futuro

La evolución demográfica de la población mundial, marcada por un número creciente de habitantes y un envejecimiento progresivo, comportará un aumento exponencial en la ne-cesidad de nuevos medicamentos. Para el año 2020 se estima una población de 7.600 millones de personas, frente a los 6.500 millones actua-les, de los cuales casi el 10% serán mayores de 65 años, con un aumento esperado del 3% en esta franja de población con respecto al año 2005 [PDDESAUNS, 2004] La población de edad avanzada requiere un mayor número de tratamientos. Se calcula que 3 de cada 4 perso-nas con más de 75 años consume al menos 1 fármaco de prescripción, mientras que el 36% consume 4 o más [UKDH, 2001].

Por otro lado, la mejora en las condiciones económicas de los países emergentes, como Brasil, China, India, Indonesia, México, Rusia y Tur-quía (países E7), repercutirá en un aumento de la esperanza de vida y un cambio en el patrón

11 Las empresas biotecnológicas y su importancia en la terapia humanaJosé Luis MotellónAMGEN

Las empresas biotecnológicas y su importancia en la terapia humana 137

de alimentación y costumbres. Se estima que el producto interior bruto de estos países se tripli-cará en los próximos 13 años, y que los cambios asociados convertirán la diabetes y la obesidad, por ejemplo, en un problema público. El número de pacientes con diabetes en países en desarro-llo podría pasar de 84 millones en 1995 a 228 millones en 2025. Por todo ello, se calcula que en el año 2020 los países emergentes represen-tarán el 20% de la demanda de medicamentos.

Además de estos cambios demográficos, los avances en la medicina están permitiendo que enfermedades que antes presentaban una ele-vada mortalidad a corto plazo se conviertan en enfermedades crónicas. Las enfermedades cardiovasculares, el SIDA y el cáncer consti-tuyen los principales ejemplos. El número de muertes por ataques al corazón ha descendi-do un 50% en la mayoría de los países indus-trializados [TCU, 2004] y la expectativa de vida a los 5 años de pacientes con cáncer entre 1999-2005 ha aumentado el 68% entre 1975 y 1977 [ACS, 2010]. Este aumento en la espe-ranza de vida se asociará al repunte de otras enfermedades distintas que antes presentaban una incidencia muy baja, por lo que será ne-cesario desarrollar nuevos fármacos dirigidos contra estas patologías.

Otro factor que puede generar la necesidad de nuevos medicamentos es la aparición de resistencias a fármacos clásicos o de mutacio-nes de organismos patógenos en el caso de las enfermedades infecciosas. El CDC (Centers for Disease Control and Prevention) de Estados Unidos calcula que más del 70% de las infeccio-nes en hospitales americanos son resistentes al menos a 1 de los antibióticos que más frecuen-temente se emplean para tratarlas [USNIAID, 2006]. Al mismo tiempo, están apareciendo mu-taciones en enfermedades existentes, como es el caso del SARS (síndrome respiratorio agudo severo), y el virus H5N1 de la gripe aviar. Por todo ello deberá continuar la búsqueda de nue-vos antiinfecciosos.

El cambio climático aumentará la temperatu-ra del planeta, con una media aproximada de 0,2 ºC por década. Aunque se desconoce el im-pacto que ello puede tener en la salud mundial, se teme que enfermedades como la malaria, el cólera, la difteria y el dengue se trasladen a paí-ses industrializados de latitudes más elevadas. En estos países se ha observado ya un aumento de la incidencia de asma y bronquitis, atribuido al calentamiento del clima por una mayor pre-sencia de polen en la atmósfera.

Todos estos cambios repercutirán de modo significativo en la industria farmacéutica, que de-berá invertir en I + D (investigación y desarro-llo) para desarrollar nuevos medicamentos para una mayor población de edad avanzada y con numerosas comorbilidades. En el marco de esta investigación, las compañías biofarmacéuticas serán imprescindibles para afrontar los nuevos retos de la salud global, dadas las características diferenciales de sus productos y procesos, que representan un avance en el desarrollo de nue-vos fármacos frente a los métodos tradicionales.

La crisis en la generación de nuevos medicamentos

La productividad de la I + D en la industria farmacéutica debe aumentar en el futuro, en paralelo con el incremento y envejecimiento de población mundial. Pero en la actualidad, el desarrollo de nuevos fármacos representa un enorme esfuerzo y se lleva a cabo con gran di-ficultad. Como reflejo de ello, la industria farma-céutica gasta mucho más en I + D y produce menos medicamentos que hace 20 años.

Diversos factores intervienen en esta cre-ciente complejidad. La preocupación por la se-guridad de los fármacos hace que las agencias reguladoras cada vez sean más conservadoras y tengan requerimientos más estrictos. Los ensa-yos clínicos son más difíciles de iniciar, requieren


mayor número de pacientes y tiempo de segui-miento, y son mucho más caros de realizar que hace 20 años. Esto se debe a los crecientes re-quisitos de control y rigurosidad que se aplican para proteger la seguridad en los pacientes, la primera prioridad de las empresas farmacéuti-cas y los profesionales sanitarios. Por otra par-te, estas exigencias acarrean unos costes que disparan la inversión en I + D de las empresas; muchas pequeñas compañías, o las entidades fi-nancieras que las respaldan, no pueden asumir dicho riesgo. A la vez, la presión en los precios y, en algunos casos, una inadecuada política de la protección de la propiedad intelectual por al-gunas autoridades, hace más difícil un retorno de la inversión y tiene un efecto negativo en el desarrollo de ciertos fármacos, sobre todo en determinadas áreas terapéuticas.

El coste de la investigación en la industria farmacéutica

Los costes del desarrollo de un nuevo fár-maco en Estados Unidos casi se han triplica-do entre la década de 1980 y la de 1990 (de

318 a 802 millones de dólares), principalmente porque se han multiplicado por 4 los costes en la fase de desarrollo clínico. El coste total de la I + D de un nuevo fármaco ha pasado del equivalente a 100 millones de euros (MÜ) (( ¿¿?? )) en 1975 a 1.000 MÜ en la actualidad [PhRMA, 2005].

Aunque existen importantes diferencias en-tre países industrializados, la investigación que genera la industria farmacéutica representa alre-dedor del 2% del producto interior bruto (PIB) de cada país (fig. 1). España se encuentra en un nivel relativamente bajo de gasto en I + D por parte de la industria farmacéutica, con un 1,3% del PIB en el año 2007. Este gasto ha aumento progresivamente en los últimos años. En 2006, las principales empresas biofarmacéuticas invir-tieron 55.200 millones de dólares en I + D, el doble de lo invertido en 1996 [USFDA, 2006] y esto representa tan sólo las tres terceras partes de todo el gasto mundial en investigación bio-tecnológica [PhRMA, 2007]. Entre 1995 y 2005, el porcentaje que representa la I + D en la in-versión total de la industria farmacéutica pasó del 15,0% al 17,1% [Barrie; 2006].

En paralelo con el aumento en la inversión en I + D por parte de la industria farmacéutica, se

Figura 1. Esfuerzo en I + D en los países industrializados. Gasto total en I + D en porcentaje del produc-to interior bruto (PIB) a precios de mercado (PIBpm) en 2000, 2005, 2006 y 2007. Fuente: Main Science & Technology Indicators. Vol. 2009/2 [OECD, 2009]. Tabla 1.8, 2.ª parte [Fundación COTEC, 2010].

3,04

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0Japón Coreaa EE.UU. Alemania OCDE Francia Australia Canadá Reino

UnidoUE-27 España Italia Polonia

3,32 3,40 3,44

2,30

2,79

3,10 3,

21

2,71

2,57 2,61 2,66

2,45 2,49 2,53

2,53

2,19 2,21 2,24 2,28

2,15

2,10

2,10

2,04

1,51

1,78

b 2,06

2,06

c

1,91 2,

051,

971,

90

1,81

1,73 1,76 1,82

1,74

1,74 1,76 1,77

0,91 1,

12 1,20 1,27

1,05 1,09 1,13 1,18

0,64

0,57

0,56

0,57

Gas

to to

tal e

n I +

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taje

del

PIB

pm

a No incluye la I + D en ciencias sociales y humanidades. b Dato de 2004. c Dato de 2006.

2000 2005 2006 2007


ha observado un progresivo declive en el nú-mero y, especialmente, la proporción relativa de fármacos aprobados anualmente con respecto a todos los que inician el proceso de desarrollo clínico [DiMasi, 2001]. En el año 2006, la Food and Drug Administration (FDA) autorizó única-mente 22 moléculas, frente a las 53 de 1996. Aproximadamente el 5% de nuevas moléculas con potencial terapéutico llegan a iniciar la fase de ensayos preclínicos y, de ellas, se comercializa tan sólo el 11% de los productos que inician la fase I, el 16% de los que alcanzan la fase II, el 44% de la fase III y el 79% de los se presentan a registro [Galduf et al., 2006].

La creciente complejidad del proceso debido al aumento de requisitos de las agencias regula-doras, como se ha comentado anteriormente, es la principal causa del incremento en el coste de la investigación. Desde la fase de cribado hasta la comercialización pasan unos 10-15 años. Ade-más, debido a la carestía de fármacos en inves-tigación potencialmente atractivos, las empresas de biotecnología que venden sus productos a las grandes farmacéuticas han exigido un mayor pre-cio por sus compuestos en etapas iniciales [Chan, 2006]. Como resultado, los nuevos fármacos de-ben financiar su propio desarrollo y el de mu-chas otras moléculas que no fueron aprobadas. Esta realidad confronta con la enorme presión pública para la contención del gasto sanitario. La investigación farmacéutica en el futuro, pues, de-berá realizar un gran esfuerzo para equilibrar la contención del gasto farmacéutico y la creciente inversión necesaria para el descubrimiento y de-sarrollo de medicamentos. Para ello, será nece-saria la participación tanto de entidades públicas como privadas, y la racionalización y renovación de recursos y conocimientos.

Posibles solucionesFrente a esta situación, la industria farmacéu-

tica tendrá que apoyarse cada vez más en el desarrollo de nuevas tecnologías que permitan desarrollar medicamentos más eficaces y se-

guros de una manera más eficiente; entre ellas, la genómica y la biología computacional en la identificación y validación de las dianas bioló-gicas, el diseño y cribado virtual de potenciales candidatos moleculares y la biomodelización/biosimulación de los ensayos clínicos. Los dos grandes métodos de producción de fármacos, la síntesis y la biotecnología, deberán sufrir una revolución y una mejora en los procesos que les permita afrontar un necesario aumento de la productividad en la I + D de la industria.

Énfasis en la fisiopatología de la enfermedad

La industria está en un punto de inflexión en la manera en que investiga nuevos fármacos. Un análisis reciente ha demostrado que aproxima-damente el 50% de las moléculas que fallaron en fase III se debió a la falta de eficacia [Gordian et al., 2006]. En medicamentos con un mecanis-mo de acción novedoso (primeros en clase), el fallo fue el doble de los que tienen un mecanis-mo de acción probado. Esto quiere decir que la industria está invirtiendo ingentes cantidades de dinero en desarrollar moléculas cuyo impacto farmacológico no es bien comprendido debido a la falta de conocimiento de la fisiopatología de la enfermedad.

Hasta ahora, el típico proceso ha sido conocer las vías, las dianas potenciales y la epidemiología de la enfermedad a través de la información cien-tífica pública. Posteriormente, se generan datos internamente in vitro o in vivo en modelos celula-res y animales, y cuando se ha establecido cierta confianza en el racional, se realiza un cribado ma-sivo de moléculas y de optimización de las selec-cionadas, que pasan a ser testadas en humanos. Estos primeros estudios en muchos casos no se centran en probar el racional para esa diana y esa molécula, sino en caracterizar su farmacodinamia o farmacocinética –aunque esta aproximación está ya cambiando–. No es hasta la fase II en la que realmente se testa la prueba o racional del concepto, y esto es normalmente entre 5 y 7 años después del cribado masivo inicial.


Con el incremento de los costes y la presión para desarrollar nuevas moléculas, este modelo será insostenible en los próximos años. La investi-gación de la industria en el futuro se deberá foca-lizar en probar el concepto o racional de la diana y la molécula en el hombre de una forma segura, tan pronto sea posible, e invertir mucho más en entender la fisiopatología antes de embarcar-se en costosos ensayos clínicos fase III. De esta manera, al igual que ahora las grandes empresas farmacéuticas utilizan las pequeñas biotecnológi-cas como fuente de moléculas prometedoras, es probable que en los años venideros se formen compañías especializadas en el estudio de vías biológicas y la validación de conceptos que ven-dan sus datos a las compañías farmacéuticas.

La medicina personalizada

El proceso de desarrollo de medicamentos está en la actualidad basado en el método es-tadístico, que proporciona una probabilidad de que poblaciones semejantes a las que han sido estudiadas respondan a un determinado trata-miento. Sin embargo, los médicos no tratan a poblaciones, sino a pacientes individualmente. El futuro está en la «medicina estratificada» o medicina personalizada.

El primer paso en esta personalización del tratamiento es entender el mecanismo fisiopa-tológico de la enfermedad y las vías alteradas que crean dicha patología. Una vez identifica-das, se analiza cual es la diana más adecuada para activar o inhibir dicha vía. Posteriormente, se desarrolla la molécula que mejor interactúa con dicha diana. Estas «terapias dirigidas» han supuesto un gran paso en el tratamiento de muchas enfermedades. Sin embargo, no todos los pacientes responden de la misma manera, o presentan los mismos efectos secundarios. La medicina estratificada depende de la posibilidad de identificar a los pacientes más susceptibles de responder a una determinada terapia.

La medicina estratificada o individualizada ha impulsado el estudio de factores predictivos

de respuesta, que permiten diferenciar ciertos tipos de pacientes según unos determinados «biomarcadores». Por medio de esta diferen-ciación, el paciente recibirá el tratamiento que más beneficios le aporte. Se individualiza así el tratamiento, paciente a paciente.

Estamos dando los primeros pasos para uti-lizar este tipo de biomarcadores, pero existen ya ejemplos interesantes en oncología, como el gen K-ras en cáncer de colon. Panitumumab, un anticuerpo monoclonal totalmente humano frente al receptor del factor de crecimiento epi-dérmico (EGFr), ha demostrado un aumento de la supervivencia libre de progresión en pacien-tes con cáncer colorrectal metastático previa-mente tratados con quimioterapia [Van Cutsem et al., 2007]. Sin embargo, los pacientes con un gen K-ras no mutado («wild type») presentan una respuesta mucho mayor que los que pre-sentan mutaciones en este gen [Amado et al., 2008]. Esto tiene unos claros beneficios, dado que se identifica a la población susceptible de ser tratada con éxito. De esta manera, la efica-cia del fármaco aumenta, no se administra a los pacientes en los que no será beneficioso y no se expone a estos pacientes a los efectos secunda-rios innecesarios que todo tiene fármaco.

Los tratamientos dirigidos unidos a la utiliza-ción de biomarcadores presentan un modelo económico muy diferente al de las medicinas convencionales. La población a tratar es mucho más reducida. Por ejemplo, antes de conocer el gen K-ras como factor de predicción, la inhibi-ción del EGFr con panitumumab se utilizaba en los pacientes con cáncer colorrectal metastático en general. Sin embargo, aproximadamente el 50% de los pacientes presentan K-ras mutado y no son susceptibles de ser tratados: el gasto po-tencial en este fármaco se reduce teóricamente a la mitad. Además, debido a su especificidad, la utilización de biomarcadores mejora la identifi-cación de los pacientes susceptibles de lograr un beneficio, por lo que la relación coste-beneficio del tratamiento es más positiva. Tiene también un impacto en el proceso de desarrollo farma-


céutico, dado que al estudiar subpoblaciones más limitadas se reduce el número y tamaño de los ensayos clínicos requeridos en el proceso de investigación.

Por lo tanto, la introducción de biomarcado-res permitirá a la industria desarrollar terapias más seguras, efectivas, y de una manera más económica, que permitirán a la larga una mejora de la eficiencia en el sistema de salud.

Mejora de la síntesis química

La síntesis química ha sido la tecnología tra-dicional para la producción de potenciales candidatos de fármacos (llamados también pe-queñas moléculas, a diferencia de las grandes moléculas producidas mediante procesos bio-tecnológicos) en los que se ha basado la I + D en la industria. El futuro de esta tecnología dependerá, sin duda, en mejoras en la química combinatoria, que permitirá obtener compues-tos con una rapidez y variedad muy superior a la de la química convencional. La identificación de estos compuestos mediante uHTS (ultra-High Throughput Screening methods) permite ya hoy en día producir hasta 50-60.000 molé-culas por semana [Sánchez, 2002] que pueden, a través de la bioinformática, ser integradas en bibliotecas masivas de compuestos con poten-cial interés terapéutico.

Impulso a la biotecnología

Sin embargo, la aparición de la biotecnología ha supuesto la verdadera gran revolución en la industria. El futuro de la I + D industrial depen-derá en gran medida de su expansión. Hoy en día, los pacientes tienen acceso a 160 fármacos biotecnológicos, y se estima que 325 millones de pacientes se han beneficiado ya de estas te-rapias. En la actualidad representan el 20% de todos los fármacos que están en el mercado y el 50% de todos los nuevos fármacos que es-tán en desarrollo. Hace 30 años se formaron las primeras compañías de biotecnología, y ya en

2006 existían sólo en Europa 2.330 empresas, con 98.800 trabajadores y un gasto en I + D de 7.600 MÛ. En Estados Unidos estas cifras son mucho mayores [European Association for Bio-industries, 2008]. Con este crecimiento expo-nencial, dentro de 20-30 años gran parte de la I + D la realizarán compañías biofarmacéuticas o divisiones biotecnológicas de las tradicionales empresas farmacéuticas.

El cáncer es con gran diferencia el área en la que la biotecnología se está concentrando con más intensidad (fig. 2). Según la encuesta de Phar-maceutical Research and Manufacturers of Ame-rica [PhRMA], en el año 2002 se estaban desa-rrollando 178 compuestos oncológicos, frente a los 47 para tratar enfermedades infecciosas y 26 en las enfermedades autoinmunes, los cuales ocupaban el segundo y el tercer lugar respecti-vamente. Se espera que este predominio de la I + D de medicamentos oncológicos dentro de la industria aumente en los próximos años.

En general, puede admitirse que la cifra de fracaso en la etapa de I + D clínico para los productos biotecnológicos está en torno al 75%, mientras que se aproxima al 94% para los fármacos de síntesis química [Farmaindustria, 2005]. Dada la mayor probabilidad de éxito y las aportaciones en su especificidad, el número de estos fármacos en I + D en el año 2030 habrá aumentado sin duda dramáticamente.

Sin embargo, el predominio de los medica-mentos biotecnológicos incrementará la com-plejidad de la I + D, ya que estas terapias presen-tan características muy peculiares y diferentes de los fármacos obtenidos mediante síntesis química [Farmaindustria, 2005]. Su característi-ca diferencial es que estas terapias están pro-ducidas mediante células de organismos vivos, las cuales por su naturaleza son únicas y, por lo tanto, el fármaco que elaboran es también úni-co. Cada línea celular (que es propiedad intelec-tual de cada compañía farmacéutica) produce una molécula con atributos específicos y dife-rentes a otra producida por otra línea celular. Además, son moléculas mucho más complejas.


Por ejemplo, la darbepoetina es 200 veces más grande que la molécula de la aspirina. Es la mis-ma escala que si comparamos un Airbus con una bicicleta. Por estas razones, es necesaria una

alta dotación tecnológica para su investigación, desarrollo, producción y purificación, requirién-dose una monitorización y unos controles de calidad más estrictos. Son necesarios alrededor

Figura 2. Fármacos biotecnológicos en desarrollo y aplicaciones terapéuticas. Fuente: «2004 Survey Medicines in Development» [PhRMA, 2004]. En: Biotecnología en la medicina del futuro [Fundación COTEC, 2006].

Factores estimuladores de coloniaReceptores solubles combinables

SeñalizaciónInhibidores de angiogénesis

Terapia de sustitución enzimáticaFactores de crecimiento

InterleuquinasInmunoterapia

InterferonesTerapia celular

Oligonucleótidos antisentidoTerapia celular

Proteínas recombinantesOtros

Anticuerpos monoclonalesVacunas

0 20 40 60 80 100

2234578101011

142323

34

7690

Número de fármacos

Fármacos biotecnológicos en desarrollo

Aplicaciones terapéuticas de fármacos biotecnológicos

Trastornos sanguíneos

Trastornos del crecimiento

Enfermedades oculares

Patologías dermatológicas

Trastornos genéticos

Diabetes

Patologías digestivas

Enfermedades respiratorias

Enfermedades neurológicas

SIDA/VIH patologías relacionadas

Enfermedades cardiovasculares

Enfermedades autoinmunes

Enfermedades infecciosas

Cáncer/patologías relacionadas

0 20 40 60 80

2

3

5

7

9

10

11

14

16

19

43

26

154

Número de fármacos

100 120 140 160

17


de 250 controles en la producción de cada mo-lécula, comparados con los 50 requeridos para los fármacos químicos tradicionales. Esto origina que pequeñas variaciones en la línea celular, en el proceso de fabricación, en el almacenamiento o transporte, creen cambios sustanciales en su estructura, con repercusiones importantes en su perfil de eficacia y, sobre todo, de seguridad, fundamentalmente en relación con la respuesta inmunogénica.

Como consecuencia de este incremento en la biotecnología, las relaciones de la I + D indus-trial con las agencias reguladoras necesitarán en el futuro un proceso de adaptación. Las caracte-rísticas especiales de las terapias biológicas han hecho que las exigencias de registro y aproba-ción para estos productos sean diferentes a las de los fármacos de síntesis química. Por ejemplo, el proceso de aprobación centralizado por la EMA es obligatorio. Como consecuencia, el me-canismo de reconocimiento mutuo por estados miembros irá descendiendo sin duda.

Empresas biotecnológicas

A nivel mundial

La industria biotecnológica global ha venido disfrutando de un incremento anual superior al 15% durante los últimos 5 años, con inversiones en I + D que han aumentado anualmente un 34% [European Commission, EC, 2003]. En 2006 estaban identificadas 1.991 compañías biotecno-lógicas en Estados Unidos frente a 2.330 en la UE-15 [European Association for Bioindustries, EUROPABIO, 2008]. A pesar de las cifras muy pa-recidas de compañías en ambas áreas geográficas, el número de empleados (190.500 trabajadores frente a 98.500), la inversión en I + D (21.000 MÛ frente a 7.600 MÛ) y los ingresos (41.500 MÛ frente a 21.500 MÛ) son significativamente mayores en Estados Unidos. Según la Asociación Europea de Bioindustrias [EUROPABIO, 2008], la principal causa de la menor competitividad eu-

ropea es la falta de una infraestructura adecuada de financiación, que hace que muchas compañías desaparezcan en un periodo de 3 a 5 años. En la figura 3 se presentan las principales empresas biotecnológicas ordenadas por el volumen de sus ventas en 2007; es significativo el predominio absoluto de empresas americanas dentro de las de mayor tamaño.

Hay que destacar el crecimiento llamativo de nuevas empresas pequeñas en la Unión Euro-pea, promovidas por la acción estatal y la volun-tad de los gobiernos de impulsar el sector. Las universidades, sobre todo las del Reino Unido y Alemania, son el origen de un buen número de nuevas empresas spin-off creadas a partir de los laboratorios de investigación básica. Las oficinas de transferencia de tecnología en estos países han actuado de puente entre los investigadores, las fuentes de financiación y los emprendedores. Otra herramienta ampliamente utilizada en la UE es la generación de biopolos o la potencia-ción de desarrollos tecnológicos regionales im-pulsados por los gobiernos locales. En España, los proyectos más ambiciosos en este sentido se están llevando a cabo en el País Vasco, dentro del plan Biogune y su Centro de Investigación Cooperativo, y en Cataluña, desde los parques científicos, ligados a las universidades y a la in-vestigación clínica. Según datos del informe de la Asociación Española de Bioempresas [ASEBIO, 2009], la inversión en I + D de las empresas biotecnológicas españolas dedicadas a salud hu-mana fue de 460 MÛ en 2008, el doble de la dedicada a I + D en 2005. A efectos comparati-vos, la inversión en I + D por las empresas bio-tecnológicas de Estados Unidos, en 2006, fue de 21.000 MÛ, según datos de BIO, la Asociación de Industrias Biotecnológicas de aquel país.

El diagnóstico in vitro ha sido uno de los ámbitos de la medicina que ha crecido de un modo más espectacular gracias a los productos biotecnológicos, especialmente debido a la ma-yor diversificación de inmunoensayos y técnicas moleculares. Estas nuevas técnicas han permiti-do la ampliación de nuevas áreas de negocio en


compañías ya existentes, como Roche o Abbott, o la creación de nuevas empresas, como Dige-ne o Innogenetics, empresas norteamericana y belga, respectivamente. En España, cabe citar Genómica, Progenika, BioKit y Biotools.

La investigación biotecnológica ha generado además un amplio mercado de clientes públi-cos y privados de I + D que consumen reacti-vos, aparatos y material fungible de laboratorio en cantidades cada vez mayores. Por ello han surgido numerosas compañías de nueva crea-ción, como Qiagen o Promega, o por fusiones de compañías previas, como puede ser Apple-ra (empresa resultante de la unión de Applied Biosystems y Celera) y Perkin-Elmer, ambas de Estados Unidos, que constituyen una industria auxiliar de la investigación biotecnológica.

Las empresas biotecnológicas en España

La investigación de la industria farmacéutica en España

En la actualidad hay afincadas en España al-rededor de 270 compañías farmacéuticas con actividad de fabricación y 375 laboratorios. Es-

tas compañías dan empleo a unos 40.000 pro-fesionales, lo que representa aproximadamente el 7% de la mano de obra de la industria farma-céutica europea [European Federation of Phar-maceutical Industry Associations, EFPIA, 2002].

Según datos del año 2006 del Instituto Nacio-nal de Estadística (INE) sobre la I + D en España, el sector farmacéutico se mantiene el segundo en la clasificación, por encima de sectores con fuerte imagen en I + D como son la aeronáutica, las comunicaciones o incluso la automoción. En 2006, la industria farmacéutica invirtió en I + D 792 MÛ, dedicando a estas labores 4.615 perso-nas [INE; 2006]. Estas cifras representan el 17% y 5,57% respectivamente del total de la I + D de la industria en España. El porcentaje de la inversión respecto a facturación es mucho más alto que en otros sectores. Además, mientras que en el periodo 1995-2005 la cifra de negocio del sector farmacéutico creció a una tasa anual del 6,1%, el gasto en investigación aumentó en este mismo periodo un 12,2%, una tendencia que no se ob-servó en otros sectores [INE, 2006].

Durante las últimas 2 décadas, España se ha transformado en un referente para muchos la-boratorios en las fases de investigación clínica, con una expansión muy notable del número

Figura 3. Principales empresas biotecnológicas, según volumen de ventas, en 2007. Fuente: «Scrip Exe-cutive Briefing» [Informa UK Ltd]. Vol. 2008/1 n.º 8; 2008. * Genentech se fusionó con Roche en marzo de 2009.

16.000,00

12.000,00

8.000,00

4.000,00

0,00Volu

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al

9.443,00

2.883,28 2.661,612.136,82522,98 338,70 315,22 243,40 190,73 179,47 169,80 116,14 100,69 86,80

de ensayos, centros sanitarios, colaboradores y personal de los departamentos de I + D. Esto se ha debido sin duda a su desarrollo como po-tencia científica, y aporta unos claros beneficios a la sociedad, en su conjunto, en cuanto a inver-sión, creación de puestos de trabajo y prestigio en el mundo. Sin embargo, nos enfrentamos a la posibilidad de perder una parte importante de las inversiones del sector debido especialmen-te a la creciente competitividad de otros países, básicamente de Asia y Sudamérica, que ofrecen unos costes más bajos, un potencial inmenso para el reclutamiento de pacientes y unos tiem-pos de aprobación razonables.

La investigación en empresas biotecnológicas españolas

En los últimos 5 años, los informes anuales de la Asociación Española de Bioempresas (ASE-BIO) han puesto de manifiesto un crecimiento exponencial del sector biotecnológico español. Según datos del informe ASEBIO 2009, en el año 2008 había 305 empresas en España com-pletamente dedicadas a la biotecnología, más de cuatro veces las existentes en 2003 (71), y otras 637 que realizaban actividades relacionadas con la biotecnología (127 en 2003) (fig. 4). La tasa de crecimiento de las empresas biotecnológicas entre 2007 y 2008 fue del 23,3%. Cataluña y la Comunidad de Madrid lideran a nivel autonó-mico los principales indicadores, seguidos por Andalucía y País Vasco (fig. 4).

El empleo total proporcionado por estas em-presas fue de 108.374 trabajadores en 2008, el 4,3% más que el año precedente, y el gas-to interno privado en I + D en biotecnología ascendió a 460 millones de euros en 2008, el 22,5% más que en 2007. Esta cifra es el doble de la dedicada a I + D en 2005, que llegaba a los 201 millones de euros, lo que representa el gran esfuerzo en I + D que están haciendo las empresas que utilizan la biotecnología en su ne-gocio. Dicho esfuerzo se vio recompensado por un aumento paralelo en la cifra de negocio del sector, que alcanzó los 31.101 millones de euros

en 2008, el 18,9% más respecto al año anterior. La mayoría de estas empresas desarrollan sus actividades en el campo de la salud humana, se-guidas a distancia de las que trabajan en el área de la biotecnología agroalimentaria.

El Parque Científico de Madrid, en colaboración con ASEBIO, identificó 430 invenciones biotec-nológicas durante el año 2009. De las mismas, el 84% correspondió a solicitudes y el 16% restante a concesiones. En cuanto a las publicaciones cien-tíficas de empresas españolas en distintas revistas o medios especializados, se computaron un total de 177 impactos, cuya titularidad correspondió a 24 entidades. Comparándolo con el año anterior (140 impactos de 22 empresas), se refleja el au-mento de actividad de estas compañías.

En 2009 se crearon 58 nuevas empresas bio-tecnológicas. Las regiones en las que más empre-

Figura 4. Número de empresas del sector bio-tecnológico en España en 2006, 2007 y 2008 (izquierda). Distribución del gasto interno en I + D biotecnológica del sector privado por co-munidad autónoma en 2007 (derecha). Fuente: «Encuesta sobre Innovación tecnológica en las empresas. Estadística sobre el uso de biotecno-logía». INE (2006 y 2007) [Fundación COTEC, 2010; ASEBIO, 2009].

Inferior al 1% del total

Entre el 1% y el 5% del total

Entre el 5% y el 30% del total

Superior al 30% del total


sas se crearon fueron Andalucía, el 26% del total, y Cataluña, el 24%, seguidas de Valencia (9%) y Ma-drid (7%). En el mismo año se contabilizaron 101 alianzas, de las cuales el 42% fueron entre empre-sas biotec y entidades públicas, el 38% con otra empresa biotec y el 28% con empresas usuarias.

Entre las operaciones realizadas por las en-tidades privadas en el área de la biotecnología centrada en salud, destaca en el último año la de Cellerix (grupo Genetrix) que encabeza el ranking por un importe de 27,2 millones de euros. Se trata de la segunda ronda de finan-ciación internacional de la compañía española que trabaja en el desarrollo de medicamentos con células madre, y en la que participaron Ysios Capital Partners, Life Science Partners, Ventech, Bankinter, Capital Riesgo Madrid, JV Risk Tech-nologies; en ella destacaba la contribución clave del grupo Genetrix.

La segunda operación más grande del año, si bien se cerraba al comienzo de 2010, era rea-lizada por la división biofarmacéutica del grupo Lipotec, GP-Pharm, por medio de un préstamo sindicado. En esta operación, que supuso un total de 20 millones de euros, participaron las siguientes entidades: Caixa Catalunya, Banco de Sabadell, Bancaja, Institut Català de Finances y el Instituto de Crédito Oficial (ICO). Por su parte, Noscira, compañía del Grupo Zeltia, conseguía su tercera ronda de financiación alcanzando 11,1 millones de euros. Esta operación, realizada en 2009, fue suscrita por inversores privados.

Cabe destacar también en el año 2009 la au-torización de la Comisión Europea a comerciali-zar Yondelis, de Pharmamar, para cáncer de ova-rio. En el área de diagnóstico, Araclon Biotech comenzó el estudio de su kit Abtest, único kit en el mercado para el diagnóstico del Alzhei-mer en sus estadios iniciales.

Entre los factores que pueden explicar el cre-cimiento del sector se encuentran el esfuerzo inversor realizado por el gobierno en los últi-mos años, tal y como reflejan los 958 millones de euros que se han destinado a proyectos de I + D en el ámbito biotecnológico desde 2005

hasta 2008. Aún así, sería necesario en los próxi-mos años poner en marcha incentivos fiscales para dotar de liquidez a las empresas como, por ejemplo, aumentar los porcentajes de la deduc-ción por actividades de I + D biotecnológica del impuesto de sociedades, el límite a la aplica-ción de la deducción por actividades de I + D e innovación biotecnológica, e incentivar a los inversores para conseguir un mayor dinamismo del sector biotecnológico.

Otro de los objetivos para las empresas bio-tecnológicas españolas en los próximos años es la internacionalización. La maduración de los proyectos empresariales y la necesidad de acce-der a nuevos mercados ante la difícil coyuntura económica actual, son en parte responsables de que el negocio exterior se haya convertido en una prioridad en la estrategia de crecimiento del sector biotecnológico español. En la actua-lidad, la contribución de las actividades interna-cionales en la facturación de las empresas ha representado de media, en el año 2009, el 26%.

Como menciona Genoma España en su «Avance del Estudio Estratégico de la Biotec-nología en España: descripción e indicadores» [Genoma España, 2004], el principal retorno de la inversión pública son las publicaciones científicas, que paradójicamente y en muchas ocasiones, son utilizadas por empresas norte-americanas para patentar. Los indicadores de producción científica biotecnológica son exce-lentes respecto a la investigación básica (España es la cuarta potencia europea en producción científica) y no se corresponden con la produc-ción de patentes, que es muy escasa. Dado el valor estratégico del sector biotecnológico, así como las peculiaridades propias de estas em-presas, es importante trabajar en identificar los criterios que den una idea real de su estado actual y de su potencial evolución. El objetivo es completar la información actualmente disponi-ble con una serie de indicadores que muestren su grado de competitividad, a la vez que permi-tan definir y evaluar la efectividad de las políticas aplicadas. Los indicadores clave deberían cubrir,


aparte de la capacidad científica donde se va-lore la formación del personal o el número de patentes, otras áreas fundamentales para el éxi-to de estas empresas, como son su capacidad financiera y de gestión junto a resultados en tér-minos de alianzas estratégicas. Según esto, sería importante considerar la perspectiva temporal en función de la caja disponible antes de una ronda siguiente de financiación (el valor medio es 2 años de vida), el origen de sus fuentes de financiación (el capital privado es un indicador de profesionalización frente a las meras ayudas públicas), el nivel de ingresos (su modelo de ne-gocio es la referencia), la composición de los equipos directivos (la existencia de directivos independientes de los fundadores es una garan-tía en la gestión), los acuerdos estratégicos o de licencia realizados (los acuerdos internacionales son un indicador) y la existencia de comités científicos y asesores.

El futuro de la I + D en biotecnología

El movimiento hacia Asia

Como en otros aspectos que ya se han co-mentado, el movimiento de la investigación bási-ca fuera de Estados Unidos y Europa aumentará sin duda principalmente hacia Asia. El número de doctorados en el mundo occidental ha ido decreciendo desde la década de 1990 [USNSF, 2006]. El porcentaje de literatura científica pro-ducida en Estados Unidos ha disminuido desde 1988 al 2003 del 38 al 30, y aunque en Europa creció del 28,9 al 31, 5, en China lo hizo de un 530, y en los 8 países más importantes de Asia, en un 235%. Asia ha pasado de contribuir con menos del 4% de las publicaciones a más del 10% en el año 2003. Además, los costes de la in-vestigación científica se han vuelto tan enormes en el mundo occidental que no pueden compe-tir con los de Asia, mucho más reducidos.

Colaboraciones externas

La carestía de nuevos fármacos que se está viviendo en la actualidad llevará cada vez más a la industria a intentar aumentar las fuentes de potenciales entidades moleculares atractivas, creando más colaboraciones con investigado-res externos, entidades académicas y pequeñas compañías especializadas. El mundo académico ha entendido que su integración en el mundo industrial es crítica; desde el año 2000 al 2004, el número de patentes de instituciones académi-cas americanas se ha incrementado en un 70%, y en el futuro este número deberá aumentar aun más.

ConclusionesEl descubrimiento y desarrollo de nuevas te-

rapias es un proceso cada vez más complejo. El número de nuevos fármacos aprobados ha disminuido en la última década, mientras que los gastos de investigación y desarrollo han aumen-tado. La síntesis química está siendo sustituida por la biotecnología, que abre la posibilidad de desarrollar tratamientos con mecanismos de acción distintos. Para mejorar la salud humana con la biotecnología, será necesario en el futu-ro garantizar el reembolso de nuevas terapias, como las herramientas de diagnóstico, que pue-den mejorar considerablemente la atención al paciente (p. ej., evitar biopsias o cirugías inne-cesarias en pacientes con cáncer). El desarrollo de nuevos marcadores biológicos será vital para personalizar la medicina, así como la estratifi-cación de pacientes candidatos a cada terapia en función de su perfil molecular. Traducir la emergente ciencia genómica a la medicina per-sonalizada es una tarea compleja, y se deberían recompensar las intervenciones en función de su eficacia, eficiencia y seguridad. Será necesario fomentar una nueva generación de estudios de colaboración público-privados para conocer el valor real de la medicina personalizada, inclu-


yendo pacientes en el mundo real, sin basarse necesariamente en los tradicionales ensayos clínicos controlados aleatorios. Se deberán aunar esfuerzos y mejorar los incentivos para que todas las partes interesadas –incluyendo las compañías farmacéuticas y de diagnóstico, los agentes reguladores, los responsables políticos y las instituciones de investigación públicas– par-ticipen del objetivo común de mejorar la salud de los pacientes desarrollando fármacos más seguros y eficaces.

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