Metode za selektivno izdvajanje i ispitivanje

funkcija ćelija prirodnog i adaptivnog imuniteta

U istraživačkom i kliničkom radu najčešće se koriste prečišćene populacije odgovarajućih

ćelija

Selektivno izdvajanje ćelijskih populacija:

1.Na osnovu različitih fizičkih osobina

2.Na osnovu ekspresije različitih površinskih molekula

Izdvajanje ćelija

1. Na osnovu fizičkih osobina (gustina,

adhezivnost)a) Izdvajanje ćelija na gustinskom gradijentu

b) Izdvajanje ćelija na osnovu adhezivnosti

a) Izdvanaje ćelija na gustinskom gradijentu

Različita gustina i težina ćelija

Uzorak: periferna krv, tkivni homogenat...

Grdaijenti: Ficol, Perkol, Opti prep, Nyco prep...

Uslovi razdvajanja: temperatura, rpm, odnos zapremine gradijenta i uzorka

(prema preporuci

proizvodjača)

Izolacija mononuklearnih ćelija na gustinskom

gradijentu

https://www.youtube.com/watch?v=6lsldFFMEhE

Dobijanje i kultivacija dendritskih ćelija poreklom od monocita

(kultivacija, 6 dana)

(10%FCS/RPMI + GM-CSF i IL-4)

stimulacijarazličitim

Imunomodulatorima, kultivacija

Ispitivanje fenotpiskih i funkcionalnih

karakteristika MoDC

-Ekspresija površinskih markera (protočna citometrija)-Procena alostimulatorne sposobnosti MoDC-Produkcija citokina od strane MoDC-Produkcija citokina od strane T-limfocita u ko-kulturi

b) Izdvajanje ćelija na osnovu adhezivnosti

Adherencija za plastiku ili staklo

Adherentne ćelije – makrofagi, DĆ

Neadherentne ćelije – T limfociti

2. Na osnovu ekspresije različitih

površinskih molekula Ćelijski markeri: CD3, CD21, CD11c, CD11b...

Antitela specifična za ćelijske markere

Izvor ćelija: periferna krv, ćelije kosne srži, limfnih čvorova,slezine

2. Na osnovu ekspresije različitih

površinskih molekula

a) Metod paninga

b) Imunomagnetno sortiranje

a) Metod paninga Adherencija za plastične površine obložene

antitelima Direktan paning Indirektan paning

b) Imunomagnetno sortiranje

Magnetne kuglice obložene antitelima

Direktno imunomagnetno sortiranje

Indirektno imunomagnetno sortiranje

antigen

antitetlo

magnetnačestica

Magnet

ćelija koja ne iskazuje antigen

ćelija koja iskazuje antigen

suspenzija ćelija izlaganje magnetu razdvojene populacije ćelija

https://www.youtube.com/watch?v=vEaYuZIx2sg

Testovi za ispitivanje funkcija imunskih ćelija

Određivanje broja i vijabilnosti ćelija

Testovi za ispitivanje funkcija ćelija prirodnog imuniteta

Testovi za ispitivanje funkcija ćelija adaptivnog imuniteta

ODREĐIVANJE BROJA I VIJABILNOSTI ĆELIJA

Brojanje ćelija na hemocitometru/

elektronski brojačTripan plavoMetilensko plavoKristal-violet testPropidijum jodidMTT test

MTT TEST Vijabilnost ćelija odgovara

aktivnosti mitohondrija Kolorimetrijski test: MTT žute

boje se u živim ćelijama redukuje u crveno mrki nesolubilni formazan; rastvaranje kristala formazana→ oslobađanje boje, merenje apsorbance

TESTOVI ZA ISPITIVANJE FUNKCIJE ĆELIJA PRIRODNOG IMUNITETA

FAGOCITI (MAKROFAGI i NEUTROFILI)

NK ĆELIJE

FAGOCITIMAKROFAGI - Produkcija citokina (IL-12, TNFα...)- Fagocitoza- Produkcija NO i ROS

NEUTROFILI- Produkti granula (MPO, elastaza, katepsin G...)- Fagocitoza- Produkcija NO, ROS- Produkcija citokina (IL-1, IL-6...)

1. Određivanje sposobnosti adhezije

Ispitivanje adhezije granulocita periferne krvi sa i bez prisustva ConA

Kratak opsi procedure:- kultivisati ćelije u mikrotitarskoj ploči (5x106 ćelija/bunariću) u četveroplikatima- dodati PMA (samo u polovinu bunarića)-ostaviti da se inkubira 60 minuta pa potom ispranjem toplim PBSom ukloniti neadherentne ćelije- fiksirati adherentne ćelije metil-alkoholom (5-7 min)- obojiti ćelije rastvorom metilenskog plavog (10 min)- isprati boju 3x česmenskom vodom- dodati HCl (200μl, 0,1N HCl)- očitati apsorbancu na 650nm

2.TEST FAGOCITOZE

čestice obeležene fluorohromom,fagocitoza se detektuje fluorescentnim mikroskopom/FACS

3.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE CITOKINA

Vanjćelijska/unutarćelijska detekcija citokina;

ELISA testovi, ELISPOT...

4.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE ROS-NBT test

FORMAZAN (redukovana forma,

plav→ sivo-crn)

NADPH oksidaza NBT

(oksidovana forma žuta)

Kolorimetrijski test

Intenzitet redukcije NBT-a srazmeran produkciji ROS

5. ODREĐIVANJE PRODUKCIJE NO

Griess-ova reakcija(merenje neorganskog nitratakoji je krajnji produkt oksidacije

kratkoživećeg NO)

6. ODREĐIVANJE PRODUKCIJE MIJELOPEROKSIDAZE

• 7. ODREĐIVANJE MIGRACIJE NEUTROFILA (Transwell sistem)

7. ODREĐIVANJE MIGRACIJE NEUTROFILA (Transwell sistem)

NK ĆELIJETestovi za funkcionalno ispitivanje NK ćelija:1. Citotoksičnost

( korišćenje tumorskih ćelijskih linija npr. K562 i radioaktivnog 51Cr)2. Produkcija citokina (INF-γ)

ELISA, ELISPOT

T limfociti• test proliferacije T limfocita in vitro• detekcija produkcije citokina• test citotoksičnosti

TESTOVI ZA ISPITIVANJE FUNKCIJE ĆELIJA ADAPTIVNOG IMUNITETA

B limfociti• test proliferacije B limfocita in vitro• detekcija produkcije antitela

T LIMFOCITITest proliferacije

• Proliferacija stimulisana različitim poliklonskim aktivatorima ili mitogenima limfocita (con A, fitohemaglutimin-PHA,anti-CD3, PMA...) ili specifinim antigenom

• Proliferativni odgovor se može meriti MTT testom, na osnovu inkorporacije 3H timidina u DNK...

-Izolacija mononuklearnih ćelija-Kultivacija ćelija sa stimulatorom/antigenom 3-5 dana-Pred kraj kultivacije dodavanje radioaktivnog 3H timidina-Merenje radioaktivnosti na sintilacionom brojaču β zračenja

MEŠANA LEUKOCITNA

REAKCIJA (MLR)

Transplantaciona reakcija

Limfociti donora i recipijenta

Dvosmerna i jednosmerna MLR

Produkcija citokina (ELISA, RIA, PCR...)

ELISPOT

Određivanje citotoksične aktivnosti T limfocita• Kokultivacija citotoksičnih T ly sa ciljnim

ćelijama (tumorske ćelije,ćelije inficirane virusom itd) koje su obeležene radioizotopom (npr. 51Cr)

• Nivo oslobođenog radioizotopa je srazmeran citotoksičnom potencijalu ćelija

B LIMFOCITITest proliferacije

• Isti kao i kod T limfocita (kao mitogen se može koristiti stafilokokni protein A)

Produkcija antitela• ELISA, RIA, ELISPOT