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Durante siglos las bacterias ácido lácticas se hanusado empíricamente como forma de preservar ymejorar la calidad de los alimentos fermentados.Desde hace unos pocos años se acumulan muchasevidencias científicas que indican que el consumosistemático de algunas de ellas afecta a la composi-ción de la microflora del tracto gastrointestinal delindividuo que las ingiere. Como consecuencia seproduce un efecto beneficioso en su salud. Durantemás tiempo del deseable muchas de estas afirmacio-nes se basaban en evidencias in vitro o estudios pre-clínicos con animales de experimentación, pero enlos últimos años se han acumulado evidencias cientí-ficas en experimentación clínica con voluntarios hu-manos (Tabla I) que nos permiten afirmar que algu-nas de estas bacterias tienen un efecto positivosobre algunas patologías clínicas en humanos (1). En

muchos países desarrollados se ha disparado el con-sumo de alimentos adicionados con estos microor-ganismos como una forma de prevenir la apariciónde determinadas enfermedades o mejorar el estadogeneral de salud del consumidor. A este tipo de mi-croorganismos los denominamos probióticos.

Existen muchas definiciones de probiótico. En ge-neral, considerando lo propuesto en su día por ILSI,FAO y OMS podemos entender por probiótico “unsuplemento alimentario compuesto por microorga-nismos viables que tienen una influencia beneficiosasobre la salud del consumidor”. En esta definición sehace preciso considerar que dicha influencia es es-pecífica de cepa, debe producirse con la ingesta encantidad usual del alimento y debe ser demostradapor medio de una experimentación científica riguro-sa. Aunque ateniéndose a este concepto de probióti-co hay muchos microorganismos que pueden serlo,los que se comercializan son fundamentalmente bac-terias ácido lácticas (Tabla II). De hecho, casi todos

1136-4815/06/48-52ALIMENTACION, NUTRICION Y SALUD ALIM. NUTRI. SALUDCopyright © 2006 INSTITUTO DANONE Vol. 13, N.º 2, pp. 48-52, 2006

Probióticos: aspectos microbiológicos y tecnológicos

D. Ramón Vidal

DEPARTAMENTO DE MEDICINA PREVENTIVA Y SALUD PÚBLICA, CIENCIA DE LOS ALIMENTOS,TOXICOLOGÍA Y MEDICINA LEGAL. FACULTAD DE FARMACIA. UNIVERSITAT DE VALENCIABURJASSOT, VALENCIA. DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA. INSTITUTO DE AGROQUÍMICA YTECNOLOGÍA DE ALIMENTO-CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS.DEPARTAMENTO DE I+D, BIÓPOLIS S.L. VALENCIA

Durante los últimos años las ventas de probióticoshan aumentado notoriamente en muchos países. Su pro-ducción industrial exige la búsqueda del microorganismo ysu validación científica, la optimización de su producciónindustrial, la formulación del alimento adicionado del pro-biótico y su validación clínica. El futuro de la investigacióncon probióticos vendrá marcado por el empleo de las nue-vas tecnologías “ómicas”.

Palabras clave: Probiótico. Validación. Producción.

During the last few years, sales of probiotics havebeen increased in many countries. The industrial produc-tion of these microorganisms includes the search for theprobiotic and its scientific validation, the optimization ofits industrial production, the formulation of the probioticfood or beverage and finally its clinical validation. Futuretrends in probiotic research will be based on the use of thenew “omic” technologies.

Key words: Probiotic. Validation. Production.

RESUMEN ABSTRACT

¿QUÉ ES UN PROBIÓTICO?

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los probióticos comerciales están compuestos porcélulas viables de bacterias ácido lácticas pertene-cientes a los géneros Bifidobacterium y Lactobaci-llus. Las bacterias utilizadas con mayor frecuenciacomo probióticos son distintas cepas de las especiesBifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infan-tis, Bifidobacterium longum, Lactobacillus aci-dophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus gasse-ri, Lactobacillus johnsonii y Lactobacillusrhamnosus. Aunque existe mucha confusión sobrela taxonomía de algunas de estas cepas, como suce-de en otros procesos industriales, dicha confusiónobedece en más ocasiones a intereses comercialesque a cuestiones científicas.

Hay muchos productos alimentarios que contie-nen probióticos y están autorizados para la comer-cialización. Para tener una idea del potencial demercado de estos productos, baste recordar que enel año 1998 se manejaban datos de ventas elevadosen Alemania (60 millones de dólares), Holanda (30millones de dólares), Francia (28 millones de dóla-res), España (24 millones de dólares) y Reino Unido(14 millones de dólares) y que sólo en el último deestos países, en el año 2002 esta cifra había aumen-tado hasta 676 millones de dólares (2,3). En alimen-tación convencional los derivados lácteos como elyogur, el queso, los helados o la mantequilla son elvehículo más utilizado para comercializar probióticosaunque existen otros como las leches de soja, mayo-nesa, zumos e incluso carnes, cacahuetes o sopas.Aun así se hace necesario recordar que buena partede la producción mundial de probióticos se vende enforma de suplementos nutricionales, particularmenteen Estados Unidos.

Aunque a todos nos parece familiar el consumode este tipo de productos, con frecuencia descono-cemos todos los pasos de investigación y desarrolloque hay que llevar a cabo para poder formular el ali-mento adicionado del probiótico. Estos pasos inclu-yen la búsqueda del microorganismo y su validacióncientífica, la optimización de su producción indus-trial, la formulación del alimento adicionado del pro-biótico y su validación clínica. Dado el elevado costede los ensayos clínicos en humanos, ninguna empre-sa del sector asume este tipo de investigación hastaestar seguros de ser capaces de disponer de un mi-croorganismo que tenga unas determinadas propie-dades funcionales in vitro se pueda producir de for-ma estable y sea viable en la matriz alimentaria a laque se va a añadir.

En cuanto a la búsqueda del probiótico, se reco-mienda partir de muestras biológicas humanas (funda-mentalmente heces) provenientes de individuos sa-

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TABLA I

ALGUNAS PATOLOGÍAS EN LAS QUE SE DISPONE DEALGÚN ENSAYO CLÍNICO CON PROBIÓTICOS CON

EFECTO POSITIVO

Patología

Colitis ulcerosaDermatitis atópicaDiarrea asociada a Clostridium difficileDiarrea asociada al consumo de antibióticosDiarrea infantilDiarrea de los viajerosEnfermedad de CrohnPouchitisSíndrome de colon irritableVaginitis

Confeccionada con los datos descritos en 1.

TABLA II

ALGUNOS MICROORGANISMOS IDENTIFICADOSCOMO PROBIÓTICOS

Grupo microbiano Especie

Bifidobacterias Bifidobacterium adolescentis Bifidobacterium animalis subsp. lactisBifidobacterium bifidumBifidobacterium brevisBifidobacterium infantisBifidobacterium longum

Enterococos Enterococcus faecalisEnterococcus faecium

Lactobacilos Lactobacillus acidophilusLactobacillus amylovorusLactobacillus caseiLactobacillus crispatusLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusLactobacillus delbrueckii subsp. lactisLactobacillus fermentumLactobacillus gallinarumLactobacillus gasseriLactobacillus helveticusLactobacillus johnsoniiLactobacillus paracaseiLactobacillus plantarumLactobacillus reuteriLactobacillus rhamnosusLactobacillus salivarius

Lactococos Lactococcus lactis subsp. lactisLevaduras Saccharomyces boulardii

¿CÓMO PRODUCIR UN ALIMENTO CONUN PROBIÓTICO?

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nos. Se suelen seguir estrategias de enriquecimientohaciendo cultivos en medios a pH ácido adicionadosde sales biliares. De esta forma se seleccionan cepasque posteriormente sean capaces de resistir las condi-ciones extremas del tracto digestivo y puedan por lotanto ejercer una acción positiva sobre la salud delconsumidor. Las cepas seleccionadas se someten auna caracterización taxonómica exhaustiva, combi-nando propiedades fenotípicas con características ge-néticas. Es importante definir una huella genética dela cepa que permita posteriormente identificarla a ob-jeto de protección jurídica. Además se evalúa la resis-tencia al pH ácido y a las sales biliares y también seestudia su capacidad de adherencia a mucus intesti-nal, se analiza su perfil de resistencia a antibióticos yla posible producción de determinados metabolitos in-deseados. A todo ello se suman estudios bioquímicosy fisiológicos in vitro e in vivo con animales de expe-rimentación que permitan definir las bases molecula-res de la actuación del probiótico en la patología ofunción fisiológica objeto de estudio. Este hecho esuno de los requisitos de la nueva reglamentación so-bre alegaciones funcionales.

Optimizar la producción industrial de un probióti-co no es tarea fácil. Cada cepa tiene un compor-tamiento diferencial, lo que obliga a definir losparámetros de crecimiento (medio de cultivo, tem-peratura, agitación, oxigenación, fase de crecimien-to) y conservación (fase de cultivo para la recogida,tipo de secado, crioprotector, temperatura de alma-cenamiento) para cada nuevo probiótico. A pesarde su precio, se suelen utilizar medios complejoscomo los denominados BFM, MRS o TPY (4). En elcaso de las bifidobacterias y Lb. acidophilus, dadasu baja actividad proteolítica se suelen añadir al me-dio aminoácidos, extracto de levadura o hidroliza-dos de caseína (5,6). Se optimiza el inóculo inicial,la temperatura y, si se trabaja en feed-batch, el ré-gimen de alimentación del nutriente limitante. Sueleser crítica la aireación y en consecuencia el poten-cial redox, por lo que se suele crecer el microorga-nismo en un ambiente anaerobio. En ocasiones esadecuado añadir algunos compuestos con actividadantioxidante como el ácido ascórbico o la L-cisteína(7,8). En cualquier caso, esta fase de producción delprobiótico debe ir ligada a la siguiente que se refierea su conservación. En este sentido, la liofilizaciónsuele ser el método más conveniente. Para optimi-zar esta fase se analiza la fase de cultivo en la querecoger la biomasa (fase logarítmica versus fase es-tacionaria), se ensayan diferentes crioprotectores ysu efecto sobre la viabilidad del microorganismo, latextura del probiótico desecado y su influencia orga-noléptica en el alimento final. Con todo ello se estu-dian distintas temperaturas de almacenamiento y sedefine la vida útil del probiótico como ingredientealimentario en las condiciones subóptimas de alma-cenamiento.

Finalmente hay que escoger la matriz alimentaria ala que añadir el probiótico. Una vez seleccionada hay

que asegurar la dispersión homogénea del mismo en elseno del alimento. Este trabajo es más sencillo al traba-jar con bebidas que con alimentos sólidos donde se ha-ce necesario afinar las operaciones unitarias de mez-cla. Sin duda, en esta fase lo más importante es definirla concentración del probiótico en el alimento o bebidafinal. Dicha concentración debe ser un compromisoentre la dosis efectiva diaria de probiótico y la ingestausual diaria del alimento. A título orientativo, la Fede-ración Internacional de Lechería o la Asociación Japo-nesa para los Derivados Lácteos recomiendan 107

ufc/ml en matrices líquidas. En el caso de alimentossólidos los expertos sugieren cifras en torno a las 109

ufc/g. El problema es que las distintas matrices alimen-tarias pueden afectar diferencialmente a la viabilidadde un mismo probiótico. Para conocer este efecto seanaliza la supervivencia del probiótico almacenando elalimento en las condiciones de venta. En estos trabajoshay que considerar entre otros la influencia del pH, eloxígeno o el tipo de envase. Se han descrito casos degrandes pérdidas de viabilidad (menos de 103 ufc/ml o106 ufc/g en el alimento final) que invalidarían el efec-to funcional (9). Es un problema especialmente graveen el caso de alimentos con larga vida útil (papillas in-fantiles) y también con determinados probióticos (bifi-dobacterias). Una de las formas de evitarlo es acudir ala microencapsulación del probiótico. En este sentidose ha descrito la microencapsulación en lípidos comouna estrategia de mejora de la vida útil tras tratamien-tos térmicos y también el empleo de gelatina, gomasvegetales o geles de alginato como materiales de en-capsulación que podrían incluso proteger al probióticode las condiciones extremas de acidez del tracto diges-tivo tras la ingesta (10,11).

Como antes se indicó, el nuevo reglamento eu-ropeo sobre alegaciones funcionales exigirá cono-cer las bases moleculares de la alegación funcionalasociada al probiótico, pero también obligará a de-mostrar su efecto en al menos dos ensayos clínicosen hospitales diferentes. Para llevar a cabo este ti-po de experimentación clínica se recomienda se-guir las directrices del grupo de expertosFAO/OMS que en el año 2001 se reunieron en laciudad argentina de Córdoba (12). En esencia, es-tas recomendaciones sugieren una dinámica deevaluación comparable a la que se lleva a cabo confármacos aunque con una exigencia menor. Es im-portante destacar que las evaluaciones clínicassiempre se deben llevar a cabo con el alimento fi-nal adicionado con el probiótico y no con el pro-biótico aislado. Como en el caso de las evaluacio-nes de fármacos se habla de distintas fases.

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ÚLTIMOS PASOS: EVALUACIÓN CLÍNICAY REQUISITOS LEGALES

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La llamada fase I, o fase de evaluación de la seguri-dad, implica un trabajo previo de determinación delperfil de resistencia a antibióticos del probiótico, la au-sencia de producción de compuestos indeseados y, aser posible, su estatus GRAS. Si el desarrollo del pro-ducto se ha llevado a cabo de forma racional, buenaparte de este trabajo ya habrá sido abordado durantela selección del probiótico (vide supra). La fase II, o fa-se de evaluación de la eficacia, conlleva los ensayos envoluntarios humanos informados. Deben ser ensayosal azar a doble ciego y con un control de placebo. Co-mo antes indicamos, se recomienda llevar a cabo almenos dos ensayos en centros clínicos independien-tes. La fase III o fase de evaluación de la efectividad esopcional. Consiste en comparar la efectividad del pro-biótico con la ejercida por un producto comparable(otro probiótico previamente comercializado o un fár-maco). En la medida de lo posible conviene llevar a ca-bo estas evaluaciones en poblaciones sanas. Como an-tes se indicó, el coste de este tipo de evaluacionesimplica que las empresas del sector no abordan su eje-cución hasta tener una completa seguridad de la vali-dez tecnológica del probiótico.

Superadas todas estas evaluaciones se llega a la co-mercialización del alimento adicionado con el probióti-co. En la actualidad en la Unión Europea (UE) se co-mercializan muchos productos con probióticos. Conmás frecuencia de la deseada en su publicidad existeun marketing demasiado agresivo y se hace uso dealegaciones funcionales que no se corresponden con laexperimentación preclínica y clínica abordada para esacepa concreta. En la UE no existe una definición legalni una legislación sobre probióticos pero existe una se-rie de legislaciones horizontales que las empresas pro-ductoras deben tomar en consideración (13). La pri-mera de ellas es el reglamento de nuevos alimentos. Ellistado de categorías de nuevos alimentos incluidos enesta reglamentación incluye un apartado para ingre-dientes alimentarios que sean o consistan en microor-ganismos. Una interpretación razonada de este requi-sito implicaría reconocer como nuevo alimentocualquier nuevo probiótico. Sin embargo, a pesar dehaberse presentado desde el año 1997 un total de 53aplicaciones de nuevo alimento, ninguna ha hecho re-ferencia a un nuevo probiótico. La segunda es la regu-lación sobre producción orgánica que limita el empleodel término “bio” o “eco” para los productos de laagricultura ecológica. La falta de base científica paratal decisión sólo puede ser explicada por los intereseseconómicos y las presiones políticas que la promovie-ron. Lo bien cierto es que un producto que contengaun probiótico no podrá usar esta terminología a me-nos que se haya elaborado siguiendo las directrices dela agricultura ecológica. El resto de normativas hori-zontales que afectarán a la comercialización de probió-ticos en la UE aún no están en vigor. Son el anterior-mente mencionado reglamento sobre alegacionesfuncionales y la propuesta de la Comisión para la regu-lación del yogur y los productos similares al yogur. Sinduda, su aprobación marcará pautas de comercializa-

ción y etiquetado de los alimentos con probióticos, so-bre todo el primero de ellos que pretende que: a) laevaluación científica sea el único motor del desarrollode alimentos funcionales; b) las alegaciones funciona-les se basen en pruebas fundadas, objetivas y apropia-das; c) las pruebas se sustenten en exigencias científi-cas en vigor; y d) las alegaciones sean verdaderas y noinduzcan al error al consumidor.

El futuro de la investigación en probióticos vendráde la mano de las nuevas tecnologías “ómicas”. Debe-mos incrementar nuestro conocimiento sobre la ecolo-gía microbiana del tracto gastrointestinal para, de esaforma, desarrollar probióticos más eficaces. En estesentido es interesante destacar el comienzo de algunosproyectos de metagenómica de bacterias de la cavidadbucal y el tracto gastrointestinal (14). A ello habrá quesumar los estudios de secuenciación de genomas deprobióticos. En la fecha de redacción de este artículohay secuencia pública del genoma de tres cepas pro-bióticas (B. longum NCC2705, Lb. johnsoniiNCC533 y Lb. plantarum WCFS1) aunque existenproyectos en marcha de otras muchas más (15). La in-formación que de ellas obtengamos, unida a estudiosde transcriptómica y proteómica, será la base de losprobióticos de la próxima década.

Llegados a este punto conviene recordar que ya sehan desarrollado los primeros probióticos transgéni-cos. Se han diseñado cepas transgénicas de Lactococ-cus lactis que expresan el gen de la subunidad B de latoxina tetánica (16) o genes de interleuquinas (17) ytambién cepas transgénicas de Lactobacillus que pro-ducen antígenos capsulares de rotavirus (18). La pocareceptividad de los consumidores europeos a este tipode productos dificulta su desarrollo aunque nadie dudade su valor en algunos países en vías de desarrollo.Desde la UE, con la barriga llena, es fácil decir no a es-tos desarrollos que solventan problemas sanitarios queno afectan a nuestra sociedad. La pregunta clave es:¿aceptaría un consumidor europeo un probióticotransgénico eficaz contra la enfermedad celiaca? Qui-zás en este caso la respuesta fuera otra. Lo que es pro-bable es que ese desarrollo marcaría un antes y un des-pués de la investigación con probióticos

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EL FUTURO

CORRESPONDENCIA:Daniel Ramón VidalDepartamento de Medicina Preventiva y Salud Pública,Ciencia de los Alimentos, Toxicología y Medicina LegalFacultad de FarmaciaUniversitat de ValenciaAvda. Vicent Andrés Estellés, s/n46100 Burjassot, Valenciae-mail: daniel.ramon@uv.es

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