prenatal tanıda yeni ufuklar non İnvaziv prenatal...

Prenatal Tanıda Yeni Ufuklar

Non İnvaziv Prenatal Test

Dr İsrael Aruh,

Kent hastanesi IVF Ünitesi

Direktörü

PRENATAL TEST: NIPT TEKNOLOJİSİNE

BAKIŞ

Data adapted from Wellesley, D, et al., Rare chromosome abnormalities, prevalence and prenatal diagnosis rates from

population-based congenital anomaly registers in Europe. Eur J of Hum Gen, 11 January 2012.

53

13

5

8

5

16

Percent of Reported Chromosome Abnormalities

T21

T18

T13

45,X

Sex trisomy

Other rare

Kromozom Anomalilerinin Prenatal Görülme Sıklığı

Major fetal

aneuploidies

PRENATAL TARAMA SEÇENEKLERİ – RISK SCORE

ACOG Practice Bulletin No. 77, January 2007

Integrated

Screen

1st Trimester

1st Trimester

2nd Trimester

2nd Trimester

Serum

Integrated

64-70

82-87

69

81

94-96

85-88

Detection Rate

(%) Down Syndrome Testing with 5% Screen Positive Rate

.

GÜNÜMÜZDEKİ TANI SEÇENEKLERİ

KARYOTYPE

Kesin cevap, ancak girişimsel olup anne ve fetus için risk taşır.

Tarama testlerindeki yüksek yanlış pozitif oranlarından dolayı, çoğu

zaman gereksiz yere uygulanır.

1. Hahnemann JM, Vejerslev LO. Accuracy of cytogenetic findings on chorionic villus sampling (CVS)--diagnostic consequences of CVS mosaicism and

non-mosaic discrepancy in centres contributing to EUCROMIC 1986-1992. Prenat Diagn. 1997 Sep;17(9):801-20.

2. Mid-trimester amniocentesis for prenatal diagnosis. Safety and accuracy. JAMA. 1976 Sep 27; 236(13): 1471-6.

Trimester - Test Sensitivity Specificity

1st – CVS 99.25%1 98.65%1

2nd - Amniocentesis 99.4%2 99.5%2

.

PRENATAL TEST SPEKTRUMU

Serum

Screening

Amnio NIPT Combined Serum

Screens, NT, Ultra-

sound

SCREENING DIAGNOSTIC

TARAMA

Risk skorları biyokimyasal analiz

ve populasyon istatistikleri

kullanılarak elde edilir.

TANI

Sonuçlar tamamen genetik

faktörlere bağlıdır.

CVS

NIPT’NİN HEDEFLERİ NELERDİR?

Fetal,

maternal

riski

azaltmak

Yalancı

pozitifleri

azaltmak

Tüm

gebelere

kolay

uygulanır

olması

Yüksek

tespit

oranı

sağlama

MATERNAL KANDA FETAL DNA’NIN

İKİ KAYNAĞI:

• Fetal hücreler

• Tüm hücre popülasyonunun

milyarda biri

• İzolasyonu için mekanik ve

biyokimyasal yöntemler gerekir

• Cell-free DNA (cfDNA)

• Anne kanında maternal ve fetal

cfDNA birarada mevcuttur

• Total cfDNA’nın %2–20’si fetus’a

aittir

.

MATERNAL KANDA FETAL cfDNA

• Apoptosis sonucu salınır

• Fetal cfDNA plasentanın cytotrophoblastic

hücrelerinden salınır

• Kan dolaşımına küçük DNA

fragmentleri(150-200bp) olarak karışır

• 7+ gebelik haftasında güvenle tespit edilir

• Postpartum saatler içinde dolaşımdan

kaybolur

Gebelikte güvenli analiz edilebilen bir komponenttir

.

NIPT Metodları

MPSS

Targeted Sequencing

Massively Parallel

Shotgun Sequencing

Digital Analysis of Selected Regions+

Fetal Fraction Optimized Risk of Trisomy Evaluation

COUNTING SNPs

DANS+FORTE

NIPT Metodları

Massively Parallel Shotgun

Sequencing

Targeted Sequencing

Sequenom MaterniT21

Verinata Verifi

Ariosa Harmony

Targeted Sequencing

Natera Panorama

COUNTING SNPs

Chrom 3 Chrom 21 Sayarak

Chrom 3 Chrom 21

Expected Amount: 20% 80%

Sayarak

Observed Amount: 25% 75%

Confidential and Privileged

Sayma Metodu

Collect (MPSS, Targeted)

Sequence

Assign/Map with Reference

Calculate ratio

Observed:Expected

Create result

Cell free DNA ve Fetal Fraksiyon

cfDNA comes from

apoptytic cells derived

from:

•Maternal

• Adipocytes

• Hematopoetic

system

•Fetal

• Placenta

(trophoblasts)

Fetal Fraction = Fetal DNA

Fetal DNA + Maternal DNA

Cell free DNA (cfDNA)

At 10% fetal DNA:

[1.5% x (90% maternal)]

+

[1.5 + 0.75 =2.25%] x (10%

fetal)]

= 1.575%

Chromosome 21 is 1.5%

of genome equivalents

(0.75 per chromo)

At 5% fetal DNA:

[1.5% x (95% maternal)]

+

[1.5 + 0.75 =2.25%] x (5%

fetal)]

= 1.530%

Difference of 0.03%

Kromozoma bağlı amplifikasyon değişimleri

Adapted from: Fan, Quake et al. 2008 PNAS

Average Counting

Sensitivity1,2,3,4

SNP Sensitivity5

Trisomy 21 99.67% >99%

Trisomy 18 98.5% >99%

Trisomy 13 86.4% >99%

1 Palomaki 2011

2 Bianchi 2012

3 Ashoor 2212

-“Özellikle G ve C’nin çok düşük veya fazla olduğu kromozomlarda,

amplifikasyon aşaması daha geniş varyasyonlara yol açar.”6

Sayma metodu DNA’daki bilgilerden ziyade DNA miktarına dayanır ve bu

nedenle bu varyasyonlardan daha çok etkilenir.

- SNP metodu ile kromozomdan kromozoma amplifikasyon değişimi elimine

edilerek, trizomi 13 ve seks kromozomlarındaki azalmış sensitivite ve

spesifisite sorunu önlenir.”6

4 Ashoor 2012

5 Nicolaides, 2013

6 Boon & Faas 2013

SNP’ler:

Genomdaki herhangi bir nükleotidin A,T,G ve C’nin DNA

sekanslarındaki dizilimindeki varyasyonlarından dolayı

değişimine SNP adı verilir. SNP’ler toplumlardaki doğal

genetik varyasyonların bir parçasıdır.

SNP-Bazlı Yaklaşım

Maternal

blood

Buffy coat =

Maternal

DNA

Plasma =

Maternal + Fetal

DNA

SNP

Sequencing

SNP

Sequencing Maternal

Genotype

Maternal +

Fetal Genotype

Fetal

Genotype

19,488 SNP simultane hedeflenir

SNP (NATUS) Algoritması kullanılarak Next-generation Anöploidi Testi

Genotypic Data

from Mom +/-

Dad

Sub-hypotheses with

different crossover

points

Data from Human

Genome Project

(HapMap)

+

Multiple hypotheses for

each chromosome

Maksimum Olasılık Tahmini Doğru Hipotezi Belirler

Sequencing

Measurements

from Maternal plasma

Compare

Maksimum Olasılık Tahmini Doğru Hipotezi Belirler

Sequencing

Measurements

from Maternal plasma Compare

Her koşul için

kişiselleştirilmiş risk

skoru

SNP profilinin çözülümü

Mother AA, Fetus AA

Mother AA, Fetus AB

Mother AB, Fetus AA

Mother AB, Fetus AB

Mother AB, Fetus BB

Mother BB, Fetus AB

Mother BB, Fetus BB

Mother AA, Fetus AAA

Mother AA, Fetus AAB

Mother AB, Fetus AAB

Mother AB, Fetus ABB

Mother BB, Fetus ABB

Mother BB, Fetus BBB

Disomy Trisomy

Mother AB, Fetus BBB

Mother AB, Fetus AAA

NATUS Algoritma Özeti

• Anne ve babadan fetüse geçen, ilgili kromozomlardaki (21,18,13,X,Y) tüm cross-over’lar dahil milyonlarca olası sonuç hipotezleri bilgisayar tarafından oluşturulur.

• Olası tüm sonuçlar fetüsün fragmente SNP profilleri ile karşılaştırılır

• Sonucu verebilmek için tüm eşleşmeler toplanıp maksimum olasılık bayesian analizi kullanılır

• Özelleştirilmiş risk skoru elde etmek için, SNP sayıları,, fetal fraksiyon,maternal yaş ve diğer örneğe bağlı faktörler kullanılır.

SNP-bazlı Yaklaşımın Avantajları

• Tüm otozomlarda daha tutarlı tespit oranı – Düşük veya yüksek GC içeriğinden

kaynaklanan kromozom amplifikasyonu önyargısından bağımsız

• Referans kromozoma ihtiyaç yok

• Düşük hata oranı

• Triploidiyi tespit edebilme

• Düşük fetal fraksiyonlarda daha hassas performans

Taken from http://wdic.net/word/snp

Neden Sayma Metodu Triploidiyi Tespit Edemez?

No difference

Triploidi Tespiti

• Sayma metodu triploidiyi tespit edememektedir – Sayma metodu uygulanan 8 olgu ‘’etkilenmemiş olarak”

raporlanmıştır (Bianchi 2012, Futch 2013)

– 2 kör çalışmada, 5 paternal triploidi olgusunun tamamı SNP metoduyla tespit edilmiştir.

Triploidi Tipleri

DIGYNIC DIANDRIC

Extra haplotypes

Maternal Paternal

Placenta Small, normal Large, cystic

Fetus Growth-restricted, often abnormal

Less affected

Biochemistry Very low free β-hCG and PAPP-A

free β-hCG 10X higher than normal

Other findings Partial Molar - Maternal complications

Vanishing Twin/Triploidi Sonucunu Alındığında Takip

• Vanishing twin/ Triploidi

– Eğer ikinci sak yok ve/veya anormal plasenta bulgusu mevcut ise, girişimsel tanı testi önerilir

Düşük Fetal cfDNA Fraksiyonu Tespit Oranını Düşürür

0

5

10

15

20

25

30

35

40

8 10 12 14 16 18 20 22 24

Feta

l Fra

ctio

n (

%)

Gestational Age (weeks)

9-14. gebelik haftasında anne

adaylarının %25’inde fetal fraksiyon oranı

%4-8 arasında saptanmıştır. (2,3)

% Fetal DNA

Fraction

Counting Down

Syndrome Sensitivity1

Panorama Down

Syndrome Sensitivity2

>8% >99% >99%

4-8% 75% >99%

1.Palomaki GE et al DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an interntional clinical validation

study. Genet Med 2011 Nov; 13(11):913-2

2. Natera Internal Data

3. Norton ME et al. Non-Invasive Chromosomal Evaluation(NICE) Study: results of a multicenter prospectgive cohort

study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18. AJOB 2012;1.e1-1.e8

Fetal Fraksiyonun Önemi

“Son 1.5 yıl içerisinde, anöploidi tespiti için Dünya’da 100,000’den fazla DNA testi uygulanmış olup, test performansını etkileyen faktörler daha belirginleşmiştir. cffDNA’nın relatif oranı yani fetal fraksiyonun önemi kriktir.”

-- Lyn Chitty and Diana Bianchi Prenatal Diagnosis 2013, 33, 511–513

Fetal Fraksiyon Aralıkları

Fetal Fraction too

low to report

Intermediate fetal

fraction – decreased

sensitivity with

counting methodology

Fetal fraction adequate to

achieve best performance

Confidential and Privileged 63

What is this a picture of?Edges are minimum ff – so no call is made by anyone

<4% fetal fraction

Fetal fraksiyonun %4’ten düşük olduğu durumda puzzle’daki resim

aşağıdaki gibi gözükür. Sonuç alınamaz.


Missing moderate amount of pieces, but still making callPhoto of car and highway

4-8% fetal fraction, single rejection test

4-8% fetal fraksiyonda sayma metoduyla, puzzle’da halen eksik parçalar

bulunmasına rağmen, resim daha belirginleşti.


4-8% fetal fraction with metrics

Still have same amount of pieces, but now they are the right pieces -BUFFALO walking in the street

SNP metoduyla 4-8% fetal fraksiyonda puzzle parçaları daha

doğru yerleşerek resim daha nettir.


Reporting

SequenomMaterniT21

Plus

VerinataVerifi

AriosaHarmony

NateraPanorama

Reporting Method

PositiveNegative

DetectedNot Detected

Suspected

Risk score(mat age, fetal

fraction,1 metric)

Risk Score(mat age, fetal

fraction, multiple metrics)

Low Risk Report


High Risk Report for Trisomy 21

53

FETAL FRACTION: 9.2%

Unable to Report – Low Fetal Fraction

FETAL FRACTION: 3.2%

Unable to Report – Redraw Recommended

• Spesifik bir örnekteki DNA fragmentlerine bağlı bir durum olduğu düşünülüp, yeni bir örneğin daha hassas bir sonuç verebileceği ihtimalinde tekrar bir kan örneği alınması istenebilir.

• Böyle bir sonucun gelmesi, gebelikte herhangi bir sorun olduğunu göstermez.

• Redraw önerilmesinin amacı daha hassas ve güvenilir bir sonuç alınabilmesini hedefler.

• Redraw önerildiğinde, 2. bir örneğin alınmasıyla %90 ihtimalle sonuç alınır.

• DÜŞÜK FETAL FRAKSİYON – <3.5% fetal fraksiyon

– Algoritmayla yüksek güvenirlikte sonuç alınamaz.

– Not:Diğer NIPT metodlarında fetal fraksiyon cutoff değeri %4’tür.

• DOES NOT PASS QUALITY METRICS -- – DNA daha az bilgi verici ise

("noisy" data)

– Algoritmanın yüksek güvenirlikte sonuç vermesinde güçlük olduğunda.

– Bunlar, total DNA miktarı (kombine maternal ve fetal DNA), okuma sayısı ve de hassas ve tutarlı sonuçlar elde etmek için iyi kalitede veri sağlıyan diğer kontrol ölçümlerini içerir.

Unable to report – Redraw NOT recommended

• Uninformative DNA Pattern

– Vakaların <1%

– DNA yorumlanamıyorsa

– Bu hasta için klinik öykü tekrar dikkate alınıp takip ve/veya daha ileri tetkik seçenekleri önerilebilinir

• Fetal mozaisizm

• Maternal kromozom anomalileri veya mozaisizm

• Beklenenden fazla seviyedeki homozigosite (Haploblock)

• Egg donor or surrogate

NIPT IS A

INVASIVE PROCEDURE UPDATE BY MONTH (7/2010 THROUGH 3/2013)

NIPT’yi öneren kurumlar

Nisan 2013, TJOD İstanbul Şubesi

• Maternal Kanda Hücre Dışı Fetal DNA (cffDNA) ile Non-Invasive Prenatal Test (NIPT)

• Uzman Görüşü

• Raporu onaylayanlar (soyadı sırasına göre); BAKSU Başak, BAŞARAN Seher,

BAŞGÜL Alin, BATUKAN Cem, ERMİŞ Hayri, GEDİKBAŞI Ali, GÜL Ahmet, HAS

Recep, KALELİOĞLU İbrahim, PEKİN Oya, POLAT İbrahim, ŞAHİNOĞLU Zeki,

ULUDOĞAN Mehmet, TUĞRUL Semih, YAZICIOĞLU Fehmi, YILDIRIM Gökhan,

YÜKSEL Atıl)

• cffDNA ile NIPT'nin olası kullanım alanları:

* Maternal yaşın 35 ve üstünde olması.

* Trizomi tarama testlerinin pozitif olması durumunda.

* Trizomi 21 ve 18 için spesifik ultrason belirteçlerinin varlığında.

* Trizomi 21 ve 18’li fetus / bebek öyküsünde.

* Parental dengeli robertsonian Trizomi 21 ve Trizomi 13 translokasyonu.

Am J Obstet Gynecol 2012;207:374.e1-6.

The performance of screening for trisomy 21 and trisomy 18 by NIPT using

chromosome-selective sequencing in a routine population is as effective as

previously reported in high-risk groups with DR 99% and FPR 1%.

Daha önce bildirilen yüksek risk gruplarındaki %99 tespit oranı ile %1’lik

yalancı pozitif oranı, trizomi 21 ve trizomi 18’in taramasında kromozom-selektif

sekanslama kullanılarak uygulanan NIPT performansı, rutin popülasyonlarda

da eşit derecededir.

Am J Obstet Gynecol 2012;207:374.e1-6.

On the basis of existing data, NIPT can potentially be used in universal

screening for trisomies 21 and 18 in all singleton pregnancies and the main

limiting factor for such widespread application of the test at present is the

associated cost.

Mevcut verilere göre, NIPT potansiyel olarak , tüm tekil gebeliklerin

trizomi 21 ve trizomi 18 açısından taramasında üniversal

kullanılabilinir. Günümüzde, yaygın uygulamayı sınırlayıcı esas

faktör testin maliyetidir.

Validation of targeted sequencing of single-nucleotide

polymorphisms for non-invasive prenatal detection of

chromosomes 13, 18, 21, X, and Y K.H. Nicolaides, A. Syngelaki, M. Gil, V. Atanasova and D. Markova

This blinded validation study has demonstrated that cfDNA testing

in maternal blood using targeted sequencing of SNPs at

chromosomes 13, 18, 21, X and Y and use of the NATUS algorithm

holds promise as an accurate method for detecting fetal

autosomal aneuplodies, sex chromosome aneuploidies and

triploidy in the first trimester of pregnancy.

Bu kör doğrulama çalışması, gebeliğin birinci trimestrinde

maternal kanda cfDNA testiyle, 13,18,21,X ve Y kromozomlarındaki

SNP’lere yönelik hedeflenmiş sekanslama ve NATUS algoritması

kullanımının fetal otozomal anöploidileri, seks kromozom

anöploidileri ve triplodiyi tespitte, gelecek vaad eden kesin bir

metod olduğunu göstermiştir.

Prenatal Diagnosis 2013 June, 33(6): 575-579

NIPT

DAHA GÜVENLİ PRENATAL TANI

1. NIPT kadınlar için mevcut prenatal test opsiyonları

spektrumunu genişletmiştir

2. Tarama sonucunun pozitif olduğu durumda, invaziv tanı

testi yerine, NIPT, kadınlar için bir alternatiftir.

• T18 and T21 için yüksek sensitivite ve spesifisite. (T13

performansı nispeten daha düşük)

NIPT

DAHA GÜVENLİ PRENATAL TANI

3. İnvaziv tanı testlerini kabule yanaşmayan kadınlar için, NIPT

güven verici ve rahatlatıcı bir seçenektir.

4. NIPT, girişime bağlı riski ortadan kaldırarak kadınların bu tip

testleri reddetme ihtimalini düşürür.

GELECEK UFUKLAR

• Düşük risk popülasyonlarda geniş kapsamlı çalışmalar

• Çoğul gebeliklerde çalışmalar

• Sub-kromozomal anomalilerin tespiti

• cfDNA ve gebelik komplikasyonları

• Tek örnekte NIPT + Maternal taşıyıcılık taraması

• Genetik sendromların tedavisi (Down v.s)

Teşekkürler!

Dr İsrael Aruh,

Kent hastanesi IVF Ünitesi Direktörü

prenatal tanıda yeni ufuklar non İnvaziv prenatal...

Documents