PREDICTORES GÉNETICOS DE LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO DE LA INFECCIÓN POR EL VIRUS DE LA HEPATITIS C (HCV) EN ARGENTINA

Trinks J.1, Frías A.2, Avecilla A.2, Sotelo C.2, Torres O.2, Gadano A.3, Flichman D.4, Argibay P.1

1Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental (ICBME), Hospital Italiano de Buenos Aires; 2Servicio de Hemoterapia, Hospital Materno Infantil “Ramón Sardá” ; 3Servicio de Hepatología, Hospital Italiano de Buenos Aires;

4Cátedra de Virología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina.

RESUMEN

El HCV causa hepatitis crónica y puede evolucionar a cirrosis y hepatocarcinoma. La tasa de respuesta al tratamiento en las infecciones con el genotipo 1, el más prevalente en Argentina, es del 46-52%.Recientemente en los genes IL28B e ITPA se han descripto SNPs (polimorfismos de nucleótido único) predictores de la respuesta terapéutica. El objetivo de este trabajo fue caracterizar la frecuencia de estos SNPs en población sana residente en Argentina. Para ello, se reclutaron voluntarios anti-HCV negativos no relacionados entre sí: i) argentinos (n=228; 50,4% hombres; edad 43,2±17,7 años) de Buenos Aires provenientes del Banco de ADN del Hospital Italiano de Buenos Aires; y ii) inmigrantes (n=187; 15,5%;28,5±6,6) latinoamericanos (74% Bolivia; 14% Paraguay; 12% Perú). Los SNPs rs7270101A>C, rs1127354C>A (ITPA) y rs12979860C>T (IL28B) fueron genotipificados por secuenciación bidireccional. Con respecto a IL28B, se observó la homocigosis CC -vinculada a la respuesta terapéutica favorable- en 52,4% de los argentinos (vs. 40,6% de los inmigrantes; p<0,01), 35% CT (vs. 34,4%) y 12,6% TT (vs. 25%; p<0,001); mientras que respecto a ITPA, se detectó la homocigosis CC y AA para ambas variantes -asociada al riesgo de anemia hemolítica- en el 73,4% de los argentinos (vs. 94,7% de los inmigrantes; p<0,001). Los resultados de los argentinos fueron similares (p>0,05) a los ya reportados para la etnia europea. En conclusión, estos resultados preliminares reflejan la importancia de caracterizar previamente estas variantes a fin de evaluar el costo-beneficio del tratamiento según el origen del paciente.

INTRODUCCIÓN

Se estima que alrededor del 3% de la población mundial ha sido infectada por el virus de la Hepatitis C (HCV) y que más de 170 millones de personas son portadores crónicos [1] de este virus. El HCV es uno de los principales agentes asociados a la hepatopatía crónica. La mayoría de los individuos infectados (80-85%) desarrolla –en ausencia de un tratamiento eficaz– una infección crónica, definida por la persistencia del ARN del HCV en suero por más de 6 meses [2]. La naturaleza y el grado de la respuesta inmune frente al HCV dependen de varios factores virales y propios del hospedador, determinando así el curso evolutivo de la infección. Si el sistema inmune es incapaz de resolver la infección inicial, ésta progresa a una infección persistente, que puede evolucionar a la cirrosis al cabo de 10 años en el 5-10% de los pacientes. A su vez, algunos de estos pacientes cirróticos (17-30%) pueden progresar al carcinoma hepatocelular (HCC) al cabo de otros 5 años de evolución [3]. Junto con el virus de la hepatitis B (HBV), el HCV es el causante del 85-90% de los HCC, que representa el quinto tumor más prevalente, la tercera causa de muerte asociada a cáncer y la indicación más frecuente de trasplante hepático. El objetivo primario del tratamiento es erradicar la infección por HCV, lo cual redundará en una mejoría de la lesión histológica, evitando la progresión de la enfermedad (de hepatitis crónica a cirrosis, de cirrosis compensada a descompensada o a HCC). Para el mismo, se recomienda en la actualidad la terapia combinada de interferón alfa pegilado (PEG-IFN-α) y ribavirina (RBV) [4]. Un parámetro importante a evaluar durante el tratamiento es el nivel de respuesta virológica, la cual se halla asociada al éxito de la terapia antiviral. Se define como respuesta virológica sostenida (RVS) a la presencia de niveles no detectables de ARN del HCV 24 semanas después de finalizada la terapia antiviral, lo cual se correlaciona –en la mayoría de los casos– con la erradicación del virus. Los pacientes con niveles de ARN del HCV no detectables luego de 4 semanas de tratamiento poseen una respuesta virológica rápida, mientras que aquellos cuyos tests para ARN del HCV son negativos luego de 12 semanas de iniciado el tratamiento tienen una respuesta virológica temprana.En los últimos años se han desarrollado más de 50 drogas denominadas en conjunto antivirales de acción directa (ADD). Al día de la fecha, solo dos de ellas (Boceprevir y Telaprevir), que actúan como inhibidores de la proteína no estructural serino proteasa 3/4A del HCV, han sido aprobados por la Food and Drug Administration (FDA) de los Estados Unidos y por la European Medicines Agency (EMA) de la Comunidad Europea. En nuestro país, estas drogas están próximas a ser aprobadas por la Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica (ANMAT) para el tratamiento de la hepatitis crónica por HCV-1 [5]. Si bien la adición de los AAD a la terapia combinada ha incrementado significativamente la tasa de RVS y ha permitido acortar el tiempo de tratamiento en pacientes crónicamente infectados con HCV-1 [6-12], el PEG-IFN-α y RBV continuarán siendo componentes vitales del tratamiento, ya que la monoterapia con AAD induce la selección de variantes resistentes que estimulan escapes virológicos [6].En base a su secuencia nucleotídica se han identificado -hasta el momento- 6 genotipos del HCV. Su determinación es importante para establecer la dosis y duración en el que deberá administrarse el tratamiento. El HCV-1, el más prevalente en el mundo y en Argentina, requiere 48 semanas de tratamiento combinado alcanzándose la RVS en sólo el 46-52% de los pacientes naïve monoinfectados; mientras que en HCV-2/3 la tasa de respuesta es del 76-83% de los casos luego de 24 semanas de tratamiento [13].La terapéutica en sí misma es costosa y se asocia a numerosos efectos adversos potencialmente severos (anemia hemolítica en el caso de la RBV), lo cual requiere en ciertas ocasiones la reducción de las dosis (hasta 15% de los casos) y/o la interrupción prematura del tratamiento; incrementando así el riesgo de falla terapéutica [14]. Por lo tanto, contar con la posibilidad de predecir la respuesta al tratamiento y el riesgo de padecer efectos adversos permitiría a los médicos y pacientes tomar decisiones individualizadas con respecto al riesgo-beneficio de la terapéutica y la posibilidad de éxito en cada caso en particular.Si bien diferentes factores virales han sido asociados a la ausencia de respuesta al tratamiento antiviral (HCV-1, mutaciones en los genes codificantes del core y de la proteína no estructural 5A -NS5A-, elevada carga viral pre-tratamiento) [15-16], la observación de curación solamente en el 50% de los pacientes con HCV-1 y las diferencias étnicas en las tasas de respuesta al tratamiento sugieren también una base genética [17-18]. En consecuencia, varios estudios fueron llevados a cabo -en los últimos años- con el objetivo de identificar factores genéticos vinculados a la infección por HCV, contribuyendo así a comprender los factores

subyacentes de la disparidad individual y de grupos étnicos en la presentación clínica y en la respuesta al tratamiento antiviral [14, 19].En el año 2009, 3 genome-wide association studies, que incluyeron en su totalidad a 1137 pacientes de distintas etnias, han identificado tres polimorfismos de nucleótido único (SNPs) -rs12980275, rs12979860, rs8099917- fuertemente asociados a la respuesta favorable a la terapéutica en infectados con el HCV-1 [20-22]. Todos los estudios ubicaron a estos SNPs en el cromosoma 19, específicamente alrededor del gen codificante de la interleuquina 28B (IL28B o IFN-λ-3). Asimismo, algunos reportes han también vinculado a estos SNPs con la eliminación viral espontánea, con la recurrencia histológica y la respuesta al tratamiento en pacientes trasplantados infectados con HCV [23-24].Por otra parte, recientemente se demostró que variantes genéticas asociadas a la deficiencia de la enzima inosina trifosfatasa (ITPA) -condición carente de relevancia clínica- reducen el riesgo de desarrollar anemia hemolítica en individuos infectados por HCV que reciben RBV [25]. Estudios realizados en pacientes de origen japonés, caucásico y afro-americano identificaron 3 SNPs del gen codificante de ITPA -rs1127354, rs6051702 y rs7270101- capaces de predecir el riesgo de anemia severa, resultando en un incremento de las tasas de RVS como consecuencia de la reducción en la necesidad de ajustar la dosis de RBV administrada [26-28].En Argentina, la información disponible sobre este tema es limitada: los SNPs rs12979860 y rs8099917 han sido significativamente asociados a la RVS en 102 pacientes de la etnia caucásica europea infectados con HCV-1 [29] y se ha reportado la prevalencia de las variantes del polimorfismo rs12979860 en una muestra de 102 argentinos no infectados de la provincia de Córdoba [30].Cabe destacar que el grado de asociación de estos SNPs, así como su frecuencia alélica difiere según el grupo étnico estudiado [31-32].Argentina es un país multi-étnico, en el cual el 70% de la población del Norte presenta una significativa contribución de la etnia indo-americana, mientras que en la región central ésta solo representa el 41% [33]. Más aún, en la población argentina actual, el grado de mestizaje -detectado por el estudio de marcadores de ADN determinantes de ancestralidad localizados en cromosomas autosómicos, mitocondrial e Y- es elevado [34]. Asimismo, en la actualidad el mayor número de inmigrantes provienen de países limítrofes como Bolivia y Perú [35] donde la población es principalmente indoamericana. Sin embargo, se desconoce reporte alguno que determine el grado de asociación de los polimorfismos de la IL28B e ITPA en la etnia indo-americana, así como sus frecuencias alélicas en la población general de Argentina.

OBJETIVO

El presente estudio -cuyos resultados preliminares se describen a continuación- presenta como objetivo la caracterización de la epidemiología molecular de polimorfismos genéticos predictores del tratamiento del HCV, mediante el establecimiento de la frecuencia alélica de los polimorfismos de los genes codificantes de la interleuquina 28B (IL28B) e inosina trifosfatasa (ITPA) en una muestra representativa de la población sana de Argentina y la comparación de la frecuencia alélica de dichos polimorfismos entre individuos pertenecientes a distintas etnias y provenientes de diferentes regiones geográficas del país.

MATERIALES Y MÉTODOS

El presente estudio cuenta con la aprobación del Comité de Ética de Protocolos de Investigación (CEPI) del Hospital Italiano de Buenos Aires (N° 1701). Se invitó a participar del mismo a 415 individuos sanos residentes de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires y sus alrededores, tomando en consideración los siguientes criterios de inclusión: i) ser hombre o mujer mayor de 18 años, ii) ser residente del territorio argentino independientemente de su nacionalidad, iii) no presentar una relación de consanguinidad con alguno de los otros participantes, iv) no referir infección por HCV, y v) comprender la finalidad del estudio y haber firmado el consentimiento informado. Luego de la firma del mismo, cada voluntario debió responder una encuesta estructurada, pre-codificada y suministrada, con preguntas cerradas de corta duración; y para la toma de la muestra, todos los voluntarios fueronsometidos a la extracción de una muestra de 3 ml de sangre.

El ADN genómico fue extraído empleando un equipo comercial (Flexi Gene DNA Kit, QIAGEN, EE.UU.). Se procedió a diseñar los cebadores y se optimizaron los protocolos de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificación en cada muestra de los polimorfismos: i) rs12979860 del gen de la IL28B [22, 36]; y ii) rs1127354 y rs7270101 del gen de la enzima ITPA [26, 28] que han sido significativamente asociados con la RVS y la anemia hemolítica inducida por la RBV respectivamente. Los productos de amplificación fueron secuenciados bidireccionalmente empleando el sistema Big-Dye Termination chemistry (Applied Biosystem, EE.UU.). Luego, para determinar la variante presente en cada polimorfismo, se procedió a analizar la secuencia nucleotídica con el programa BioEdit Sequence Alignment Editor versión 7.0.5 y Seqman (DNAstar®).Para el análisis estadístico, se emplearán los programas Epidat versión 3.1 (Xunta de Galicia/OPS) y Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, IBMTM). En las muestras analizadas, se determinará en forma descriptiva el porcentaje de cada variante de acuerdo al polimorfismo que se trate y estas frecuencias se compararán con un test no paramétrico de comparación de proporciones. En la comparación de más de dos proporciones independientes se aplicará la prueba de Chi-cuadrado. Esto establecerá el desequilibrio o no de determinado polimorfismo con respecto al resto.

RESULTADOS

Se reclutaron 415 individuos sanos residentes de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires y sus alrededores que fueron agrupados de la siguiente manera:i) argentinos (n=228; 50,4% sexo masculino y edad -promedio ± desvío estándar- 43,2 ± 17,7 años) oriundos de la ciudad de Buenos Aires y sus alrededores provenientes del Banco de ADN del Hospital Italiano de Buenos Aires; y ii) inmigrantes (n=187; 15,5% sexo masculino y edad -promedio ± desvío estándar- 28,5 ± 6,6 años) latinoamericanos (74% Bolivia; 14% Paraguay y 12% Perú) provenientes del Servicio de Hemoterapia del Hospital Materno Infantil “Ramón Sardá”.Con respecto al polimorfismo del gen codificante de la IL28B, se observó la homocigosis CC -vinculada a la respuesta terapéutica favorable- en 52,4% de los argentinos vs. 40,6% de los inmigrantes (p<0,01) y la homocigosis TT –asociada a la ausencia de respuesta al tratamiento antiviral- estuvo presente en 12,6% de los argentinos vs. 25% de los inmigrantes (p<0,001). En cambio, no se observaron diferencias estadísticamente significativas en la prevalencia de la heterocigosis CT (35% de los argentinos vs. 34,4% de los inmigrantes) [Figura 1].Con respecto a los polimorfismos de la enzima ITPA, se detectó la homocigosis CC y AA para ambas variantes - asociada al riesgo de anemia hemolítica inducida por la Ribavirina- en el 73,4% de los argentinos vs. 94,7% de los inmigrantes (p<0,001) [Figura 2 y Tabla 1].

CONCLUSIONES

A nivel mundial, el número de casos del HCV continuaría incrementándose como consecuencia de la ausencia de una vacuna efectiva y la falta de medidas de concientización y prevención [37-38]. En nuestro país no se dispone de un sistema de relevamiento poblacional, por lo tanto, se desconoce el verdadero impacto de la infección por HCV.La identificación de marcadores genéticos asociados a la infección por HCV nos acercaría a una medicina más personalizada, a través de la predicción del pronóstico clínico y la respuesta al tratamiento antiviral. También permitiría establecer -mediante el estudio de su prevalencia en la población sana- políticas de salud pública a futuro para: i) el diseño de nuevas guías para el manejo y tratamiento de los pacientes infectados que reducirían los costos de la salud pública nacional gracias a una selección correcta del tipo y dosis de las drogas desde el inicio del tratamiento; y ii) el previo planeamiento de la adquisición o desarrollo de drogas -para las cuales la población argentina presente una alta tasa de respuesta y no demuestre resistencia- con el objetivo de abastecer adecuadamente a los centros de salud.En este estudio preliminar se describe por primera vez las frecuencias alélicas de los polimorfismos genéticos predictores de la respuesta al tratamiento de la infección crónica por HCV en la población general

de Argentina, reportándose dicha prevalencia no solo en argentinos sino también en individuos provenientes de países latinoamericanos con un elevado predominio de la etnia indo-americana.Los resultados obtenidos para el grupo de los argentinos fueron similares (p>0,05) a los ya reportados para la etnia europea [20, 21, 25], pero demostraron diferencias estadísticamente significativas con respecto a los encontrados en el grupo de inmigrantes latinoamericanos. Estos resultados preliminares sugerirían que la etnia indoamericana se encontraría asociada a una menor respuesta terapéutica en la infección crónica por HCV. Más aún, este estudio refleja la importancia de caracterizar previamente estas variantes a fin de evaluar el costo-beneficio del tratamiento según el origen del paciente.

Figura 1. Prevalencia de los polimorfismos del gen de la IL28B.

Figura 1. Prevalencia de los polimorfismos del gen de la enzima ITPA.

p < 0,01

p < 0,001

p < 0,001

p < 0,001p < 0,001

Tabla 1. Significancia clínica de la prevalencia de los polimorfismos de la enzima ITPA.

rs1127354C>A

rs7270101A>C

Actividad de ITPasa

Deficiencia de ITPasa

Riesgo de anemia

hemolíticainducida por

RBV

ARGENTINOS (n=228)

INMIGRANTES (n=187)

Salvaje (CC) Salvaje (AA) 100% - +++ 73,4% 94,7%

Salvaje (CC) Heterocigota (AC) 60% + ++ 16,2% 3,7%

Heterocigota (CA) Salvaje (AA) 30% ++ + 8,3% 1,6%

Salvaje (CC) Homocigota (CC) 30% ++ + 1,7% 0%

Heterocigota (CA) Heterocigota (CA) 10% +++ - 0,40% 0%

Homocigota (AA) Salvaje (AA) <5% +++ - 0% 0%

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