practica nº1 camara de neuvauer

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CAMARA DE NEUBAUER I. OBJETIVOS: Aprender a utilizar la cámara Neubauer, y similares para el recuento de levaduras. II. FUNDAMENTO: CAMARA DE NEUBAUER La Cámara de Neubauer es un instrumento utilizado en medicina y biología para realizar el recuento de células en un medio líquido, que puede ser un cultivo celular, sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, liquido sinovial, etc. Esta cámara de contaje está adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente deprimidas y que en el fondo de las cuales se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula de dimensiones conocidas. Se cubre la cámara con un cubrecámaras que se adhiere por simple tensión superficial.

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Page 1: Practica Nº1 Camara de Neuvauer

CAMARA DE NEUBAUER

I. OBJETIVOS:

Aprender a utilizar la cámara Neubauer, y similares para el recuento de levaduras.

II. FUNDAMENTO:

CAMARA DE NEUBAUER

La Cámara de Neubauer es un instrumento utilizado en

medicina y biología para realizar el recuento de células en un

medio líquido, que puede ser un cultivo celular, sangre, orina,

líquido cefalorraquídeo, liquido sinovial, etc.

Esta cámara de contaje está adaptada al microscopio de campo

claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos que

tiene dos zonas ligeramente deprimidas y que en el fondo de las

cuales se ha marcado con la ayuda de un diamante una

cuadrícula de dimensiones conocidas. Se cubre la cámara con un

cubrecámaras que se adhiere por simple tensión superficial.

Luego se introduce el líquido a contar, al que generalmente se ha

sometido a una dilución previa con un diluyente, por capilaridad

entre la cámara y el cubrecámara; puesto que tiene dos zonas

esto permite hacer dos recuentos simultáneamente. Para contar

Page 2: Practica Nº1 Camara de Neuvauer

las células se observa el retículo al microscopio con el aumento

adecuado y se cuentan las células.

Con base en la cantidad de células contadas, conociendo el

volumen de líquido que admite el campo del retículo, se calcula

la concentración de células por unidad de volumen de la muestra

líquida inicial.

La fórmula de valoración del número de células (válida

universalmente) es la siguiente: Partículas por μl= (partículas

contadas)/(superficie contada (mm²)∙profundidad de la

cámara(mm)∙ dilución)

Recuento de eritrocitos: ejemplo

Observe que en la grilla de la cámara de Neubauer las áreas de

recuento de eritrocitos y linfocitos son diferentes. Los glóbulos

rojos se cuentan en las áreas coloreadas de rojo, mientras que

los glóbulos blancos se cuentan en las áreas coloreadas de azul.

Ten en cuenta que la grilla central tiene 25 cuadrados de 1mm x

1mm de área y 0.10 mm de profundidad. El factor de dilución es

por tanto de 1:200. Convierte el número de glóbulos rojos

contados en 5 cuadrados a nº glóbulos rojos/µl. (1 µl (micro litro)

= 1 mm3)

La imagen de abajo simula el campo que está viendo al

microscopio con un objetivo de 45x. Solo es visible el centro de

la grilla. Intenta verificar esto al ir moviendo el campo de

Page 3: Practica Nº1 Camara de Neuvauer

derecha-izquierda y de arriba-abajo, como si de una pletina de

microscopio se tratase. Cuenta los glóbulos rojos en los cinco

cuadrados mencionados anteriormente y determina el recuento

de eritrocitos como se ha descrito anteriormente.

Muy importante: Cuando un eritrocito se sitúa en mitad de las

líneas superior y/o de la izquierda, entonces es contabilizado.

Pero no se contabiliza cuando se sitúa en mitad de las líneas

inferior y/o de la derecha.

El rango normal de recuento de glóbulos rojos es el siguiente;

Mujeres:3.9-5.6millones/µl

Hombres: 4.5-6.5 millones/µl

TÉCNICAS DE CONTAJE CELULAR

Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número

de partículas microscópicas dispersas en un fluido.

Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de

las células en la suspensión como el porcentaje de éstas que son

viables.

Page 4: Practica Nº1 Camara de Neuvauer

Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes

técnicas, desde la relativamente simple cámara de contaje

celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que

empleamos (cámara de Neubauer), hasta equipos automáticos

de

Contaje celular como el "CellCoulter" de la empresa.

El principio del contador celular se basa en la medida de los

cambios en la resistencia eléctrica que se producen cuando una

partícula no conductora en suspensión en un electrolito atraviesa

un pequeño orificio. Como se puede ver en el esquema, una

pequeña abertura entre los electrodos es la zona sensible a

través de la que pasan las partículas que se encuentran en

suspensión. Cuando una partícula atraviesa el orificio desplaza

su propio volumen de electrolito. El volumen desplazado es

medido como un pulso de voltaje. La altura de cada pulso es

proporcional al volumen de la partícula. Controlando la cantidad

de la suspensión que circula a través del orificio es posible contar

y medir el tamaño de las partículas. Es posible contar y medir

varios miles de partículas por segundo, independientemente de

su forma, color y densidad.

En la unidad de citometria de flujo y microscopia con focal de los

servicios científicos- técnicos de la universidad de Barcelona se

dispone de contadores celulares.Sin embargo, es posible

determinar la densidad celular empleando métodos más

Page 5: Practica Nº1 Camara de Neuvauer

sencillos. Nos basta con una cámara de contaje celular, por ej. La

cámara de Neubauer, y un microscopio. Una cámara de contaje

celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la

suspensión a medir. El dispositivo presenta unas señales que

determinan un volumen conocido (x micro litros). Al contar bajo

el microscopio el número de partículas presentes en ese volumen

se puede determinar la densidad de partículas en la suspensión

de origen.

La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al

microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata

de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo

de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una

cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3

x 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de

0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a

1 milímetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está

hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se

cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada

0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y

el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 micro

litro.

Si contamos las cuatro áreas sombreadas (L) observando un total

de x células entre las cuatro áreas, la concentración en la

suspensión celular será:

Concentración en la suspensión (células / mL) = 10000 (x/4)

Page 6: Practica Nº1 Camara de Neuvauer

En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones

marcadas como L y que en el microscopio se ven como una

cuadrícula de 16 pequeños cuadrados de 0.25 milímetros de

lado. Esta imagen ha sido tomada empleando un microscopio

invertido de contraste de fases.

Existen numerosos modelos de cámaras de contaje celular

adaptadas a su uso en microscopía. En la imagen puedes

observar una cámara de Neubauer doble, como las que usas en

el laboratorio de prácticas.

Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes

métodos. El más común es el de tinción con azul tripán. El azul

tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células

que presentan roturas en la membrana. Así pues las células que

aparecen en la imagen, claramente de color azul, son

consideradas no viables. Asimilar células blancas, por exclusión,

a células viables es un error pues por este método se

sobrevalora la viabilidad de las células en la suspensión,

determinando como inviables sólo aquellas con la membrana

rota. Existen otros métodos de determinación de la viabilidad

celular como el más preciso de la tinción con ioduro de propidio.

1. se aseptiza el dedo con alcohol y luego se seca al aire o con

algodón. Se coge entre el pulgar y el índice y se hace una

punción rápida y penetrante a través de la piel de la punta

del dedo con una lanceta estéril.

Page 7: Practica Nº1 Camara de Neuvauer

2. Se desecha la primera gota de sangre y se aspira la

siguiente con la pipeta de dilución perfectamente limpia y

seca hasta la señal 1 o 0.5 (también puede utilizarse la

pipeta de hemoglobina, de 20 microlitros). Hay que evitar la

entrada de burbujas de aire, pudiendo ayudarnos de un

papel de filtro para conseguir el enrasado.

3. A continuación se toma con la pipeta líquido de Hayem,

isotónico con la sangre, hasta la señal 1; así, la sangre

queda diluida al 1/10, si tomamos sangre hasta la señal 1, o

al 1/20 si tomamos hasta 0.5. Esto es así porque el volumen

de la bola de la pipeta es 100 veces superior al del capilar

de la misma. (Si hemos utilizado la pipeta de hemoglobina

podemos diluir su contenido en 2 o 4 ml de líquido de

Hayem para obtener diluciones 1/100 o 1/200).

Page 8: Practica Nº1 Camara de Neuvauer

4. Se adapta un cubreobjetos sobre una cámara cuenta

glóbulos limpia y seca y se coloca una gota en uno de los

lados del cubre; esta gota penetra por capilaridad y rellena

el retículo de la misma.

5. Una vez preparada la cámara se coloca sobre la platina del

microscopio dejándose unos minutos en reposo para que

sedimenten los glóbulos. Disponemos el condensador bajo y

luz débil; enfocamos primero con el objetivo débil seco y

luego se cambia al fuerte seco para proceder al recuento,

que se lleva a cabo en los cuadrados pequeños del retículo

marcado en color rojo. Finalizado el recuento se procede a la

limpieza de la pipeta con acético 1:3, agua destilada y

alcohol-éter sucesivamente.

7. El volumen de sangre en el cual se han contado las células

resulta de multiplicar la profundidad de la cámara por el

factor de dilución, la superficie de los cuadrados y el número

de cuadrados contadosCon cámara de NEUBAUER:

Superficie de 1 cuadrado grande (1/20 mm de lado):

Volumen de un cuadrado grande (1/10 mm de profundidad):

Page 9: Practica Nº1 Camara de Neuvauer

Si contamos "a" glóbulos rojos en "n" cuadrados pequeños, el

número de glóbulos por cuadrado será a/n.

Si en un volumen 1/4000 mm3 hay a/n glóbulos rojos, en 1 mm3

habrá X. Luego:

Siendo X el número de glóbulos rojos existentes por cada mm3

de sangre diluida.

Si la sangre se diluyó a 1/100 o 1/200, habrá que multiplicar el

valor X por 100 o 200 respectivamente, con lo cual obtendremos

un nuevo valor, Y, que representa el número de glóbulos rojos

existentes por cada mm3 de sangre (sin diluir).

Se utilizan para calcular, mediante el uso del microscopio, el

número de partículas (leucocitos, hematíes, bacterias…) por

unidad de voluimen de un líquido.

La cámara está constituida por una placa base de vidrio especial

pareciso a un porta, su parte central se encuentra separada de

los extremos por unas ranuras. en ella se encuentran las

cuadrículas de recuento. La fórmula de contaje es:

partículas/mm3= partículas contadas.

Clases de cámaras:

Neubauerimproved: Es el más utilizado (9 cuadros grandes,

cada 1 de 1 mm2.)

Page 10: Practica Nº1 Camara de Neuvauer

Neubauer: La diferencia es el cuadro grande central.

Thoma: Se utiliza solo para el recuento de eritrocitos.

Fuchs-Rosenthal: Se utiliza habitualmente para recuento de

células en líquidos orgánicos (LCR, Líquido sinovial…)

III. EQUIPOS Y MATERIALES:

cámara de Neubauer.

Micropipeta.

Tubos de ensayo.

Alcohol de 96º.

Vaso precipitado 50 ml.

Cubreobjetos.

IV. PROCEDIMIENTO:

Conteo en cámara de Neubauer: Esta cámara se utiliza para

conteo celular.

1. Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con

alcohol.

2. Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordado

quebrada.

Page 11: Practica Nº1 Camara de Neuvauer

3. Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma

vertical, esta debe quedarcentrada.

4. Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y

definitivo en la distribución de las células .Es recomendable

llenar la con micropipeta pequeña.

5. Con la pipeta se coloca ya que la cámara se llena con una

gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento.

6. La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en

las esquinas del recuadro de llenado se ven porciones

secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la

cámara es de líquido abundante en las terminaciones del

recuadro.

7. Conteo: Llévela cámara a el microscopio y enfoque el cuadro

de conteo con el ocular de 4X.Observará lo siguiente.

Page 12: Practica Nº1 Camara de Neuvauer

8. Si las células que va a contar son pequeñas como son las

levaduras, bacterias, etc., ubicarse en la cuadricula central y

pasar al ocular de 10X. Se visualizará de la siguiente manera:

9. En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales

se cuentan las células presentes en 5 campos,

generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el

central, lo que garantiza un conteo aleatorio.

10. Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se

visualiza cada uno

11. De los campos y con ayuda de el carro del microscopio se

desplaza la cuadricula hasta contar en todos los cuadros. El

conteo en estos campos de la cámara se conoce como AP

(altopoder). Con el lente de 40X cada cuadro se ve de la

siguiente manera:

12. Las células se cuentan cuadro por cuadro y se hace un

Page 13: Practica Nº1 Camara de Neuvauer

total. Se recomienda realizar el conteo siguiendo las flechas

para evitar que se cuenten las células dos veces o que no

se cuenten .Alrededor de cada cuadricula se observa que

hay tres líneas que delimitan el cuadro, que son

fundamentales en el momento del conteo ya que definen

cuales células son contables o cuales están fuera del

campo de conteo .Las células que no tocan la segunda línea

son contables, si la toca no están encima de ella no se

incluyen .Gráficamente se puede apreciar la forma correcta

de conteo. Las células que tiene una X son las que no se

deben contar.

13. Después de contar las células se procede a calcular al número

de células por unidad de volumen. Para esto se utiliza el área

de cada cuadro, el espacio ocupado por el líquido en el que

están las células que es el mismo espacio que hay entre la

cuadricula de la cámara y la laminilla de cuarzo.

14. Se promedia el número de esporas de la cámara de arriba

con la de abajo, se multiplica por el factor de dilución y por

un factor Figua la 106si se contó el cuadro central o 104 si

se contaron los cuadros de los extremos, obteniendo el valor

X.

Si 1 ml del preinoculo X esporas

Interrogante Esporas a inocular

Page 14: Practica Nº1 Camara de Neuvauer

(Ej.:1*108esporas)

Luego, este valor se multiplica por la cantidad de mililitros de

medio en el que va a Desarrollarse el microorganismo.

V. CONCLUSIONES:

Pudimos repasar y conocer mejor esta técnica y sobre todo la

importancia de conocer bien los procedimientos y de

estudiarlos y comprenderlos correctamente, no solo a la hora

de calificar la materia, sino para poder ponerlos en práctica y

tener un conocimiento general acerca de la sangre, lo cual es

la finalidad de la capacitación de laboratorista clínico-

hematología, formar íntegramente alumnos capaces de

realizar este tipo de análisis.

VI. BIBLIOGRAFÍA:

http://members.tripod.com/~Biorreactores/Definicion.htm

http://2l2m-laboratoristaclinico.blogspot.com/2009/04/camara-

de-neubauer.html

2l2m-laboratoristaclinico.blogspot.com/.../camara-de-neuba

Page 15: Practica Nº1 Camara de Neuvauer

III PRACTICA DE BIOTECNOLOGIA DE ALIMENTOS

TEMA: USOS DE LA CAMARA NEUBAUER

OBJETIVO

Aprender a utilizar la cámara Neubauer , y similares para el recuento

de levaduras.

FUNDAMENTO TEORICO

Page 16: Practica Nº1 Camara de Neuvauer

Además del recuento de levaduras en placa el método de recuento

con la cámara Neubauer es bastante útil. Para realizar un buen

recuento, es necesario teñir la muestra para distinguir las células

viables vivas de las muertas . Las muertas son las que se tiñen. Los

colorantes que se pueden utilizar son : azul de tripán, azul de

metileno o rodamina.

La cámara consta de un campo central o fondo de la cámara donde

están grabadas dos cuadrículas de recuento, que están separadas

una de otra por una ranura. El fondo de la cámara del campo central

es de 0,1 mm más bajo esto es la profundidad de la cámara.

PROCEDIMIENTO

Preparación de la muestra:

Lavar la cámara y el cubre con agua destilada y alcohol de 96%.

Secar bien con papel suave.

Poner el cubreobjetos encima de la cámara.

Homogenizar removiendo bien el cultivo en donde residen las

levaduras.

Tomar con pipeta una muestra.

Poner la punta de la pipeta en una de las dos ranuras de la cámara y

por capilaridad, las levaduras se distribuirán en la cámara.

Si se crea una cámara de aire repetir la operación desde el principio.

Fijar la cámara de recuento en la platina del microscopio para realizar

la observación microscópica.

Esperar unos minutos antes de contar para que las levaduras se

depositen en la cámara.

Preparativos del microscopio:

Page 17: Practica Nº1 Camara de Neuvauer

El enfoque del microscopio se empieza con el objetivo de menor

aumento que posteriormente pasaremos a uno de más. Se centra el

objetivo del microscopio a ojo en el centro teórico de la cruz de la

cámara, luego se coloca el objetivo lo más cerca posible del

cubreobjetos pero sin tocarlo y posteriormente se irá alejándolo hasta

que la imagen sea la más clara y nítida posible. Se aconseja trabajar

a 400 aumentos.

Para contabilizar las levaduras totales se aconseja siempre hacer la

media de levaduras contenidas en varios grupos de cuadros.

Las cámaras tienen 400 cuadrados útiles.

RESULTADOS

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFIA

Page 18: Practica Nº1 Camara de Neuvauer
Page 19: Practica Nº1 Camara de Neuvauer

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

Escuela de Ing. De Industrias Alimentarias

Alumno

Arenaza Mamani, Fredy

(2006-29251)

Chuctaya navarro, David

(1993- )

Docente

MGR. Amelia Castro Gamero

Materia

BIOTECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

(Practica)

Tipo de trabajo

Informe 01 :CAMARA DE NEUBAUER

Año académico

Quinto año