Potogénesis y neutralización de losefectos locoles inducidos por uenenode la serpiente Hterciopelo"(BothroPSASPerJ

,. M. Gutiérrez*L. Cerdas*O. Arroyo*E. Rojas*B. Lomonte*J. A. Gené*

SUMARIOSe presenta la revisión de una serie de investi­

gaciones sobre la patogénesis y neutralización de losefectos locales inducidos por el veneno de laserpiente "terciopelo". El cuadro local está consti­tuÍdo por mionecrosis, hemorragia y un procesoinflamatorio caracterizado por abundante infIltradoleucocitario y pronunciado edema. Además, hayotras 'alteraciones vasculares como angionecrosis ytrombosis.

La necrosis de fibras musculares se desarrollarápidamente después de inocular el veneno. Enratón, los análisis histológico y ultraestructuralmuestran una alta proporción de fibras necróticastres horas después del envenenamiento, momentoen el cual los niveles séricos de CPK alcanzan sumáximo valor. El efecto hemorrágico también esde aparición inmediata, aunque alcanza su máximaintensidad entre seis y nueve horas posteriores a lainoculación. El desarrollo del cuadro inflamatoriolocal es rápido y drástico, lo mismo que el de lasotras alteraciones vasculares mencionadas.

Los sueros antiofídicos polivalentes producidosen Costa Rica contienen anticuerpos capaces deneutralizar los efectos loCll1es, siempre y cuando elsuero y el veneno se incuben previo a la inoculación.Sin embargo, cuando el veneno se administraantes que el suerO, los efectos locales sólo sonneutralizados parcialmente. Esto sugiere que el

* Instituto Clodomiro Picado, Facultad de Micro­biología, Universidad de Costa Rica.

rápido desencadenamiento de dichos efectos alentrar el veneno a los tejidos dificulta su neutrali­zación por los sueros antiofídicos.

El suero sanguíneo de la serpiente "zopilota"es capaz de neutralizar los efectos locales de laserpiente "terciopelo", cuando se incuba con elveneno antes de la inoculación. No obstante, estesuero es tóxico para el ratón, por 10 que supotencial uso en el tratamiento de las mordedurasde serpiente no es posible en este momento.

INTRODUCCION

En Costa Rica, así como en el resto de lospaíses centroamericanos, las especies deserpiente más importantes desde el punto devista médico, se ubican taxonómicamente enel género Bothrops (27,31,17). Entre ellas,la que produce una mayor cantidad deaccidentes es Bothrops asper, anteriormentedenominada Bothrops atrox, la cual recibediversos nombres comunes, tales como"terciopelo", "barba amarilla" y "raboamarillo". En nuestro país, algunas investi­gaciones señalan que esta especie es respon­sable de alrededor del 85 % de las mordedurasen las que se ha identificado la serpienteagresora (31,17).

El cuadro clínico que provoca el envene-

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namiento a consecuencia de la mordedura de"terciopelo" es muy complejo y su patogeniase conoce sólo parcialmente. No obstante,se puede afirmar que se caracteriza por unmucado y casi inmediato efecto local y poruna serie de fenómenos sistémicos entre losque se destacan las hemorragias, el choquecardiovascular, la insuficiencia renal, la hemó­lisis intravascular y las alteraciones en losmecanismos de la coagulación sanguínea(27,20,27,16).

Lo que se ha denominado efecto local es.una compleja gama de fenómenos íntima­mente relacionados, los cuales se desenca­denan en los tejidos ubicados en la vecindadde la zona de la mordedura. Dicho efecto secaracteriza por la necrosis de los tejidosmusculares, la hemorragia y un procesoinflamatorio intenso que incluye un pronun­ciado edema y un abundante infiltradoleucocitario (14,10). La consecuencia másseria de estos efectos locales es la necrosistisular, con subsecuente pérdida de tejido,la cual puede alcanzar proporciones impor­tantes en casos de mordeduras severas (17,28). Dada la rápida aparición de estos efectos,y dado que el suero antiofídico usualmentese administra varias horas después de lamordedura, esta destrucción tisular es unasecuela bastante común de los accidentes por"te"rciopelo".

El objetivo del presente trabajo esexponer y discutir los resultados de una seriede investigaciones desarrolladas para estudiarla patogenia y la neutralización de los efectoslocales (mionecrosis, hemorragia y edema)inducidos por el veneno de Bothrops asper.

El efecto mionecrótico:Uno de los componentes más conspicuos

del efecto local es el desencadenamiento denecrosis de las fibras musculares. Estefenómeno mionecrótico se inicia menos deuna hora después del envenenamientoexperimental en ratón e histológicamente secaracteriza por la presencia de fibrasmusculares necróticas de aspecto principal­mente miolítico, es decir, con una clara lisisdel material intracelular. Asimismo, son evi­dentes fibras necróticas de aspecto coagula­tivo, que contienen un material intracelularhialino y homogéneo, con pérdida de laestriación normal (8).

Pese a que la mionecrosis es evidente una

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hora después de inoculado el veneno enratones, la necrosis más intensa, a nivel histo­lógico, se observa a partir de las tres horas(7,8). Las muestras histológicas tomadasuna semana después de la inoculaciónmuestran un cuadro regenerativo claro, conpresencia de fibras en regeneración y célulasinflamatorias mononucleares (8).

Para conocer en mayor detalle la patogeniade este efecto mionecrótico, se ha efectuadoun estudio ultraestructural con el micros­copio electrónico. de transmisión (2). Setomaron muestras de tejido muscular deratón 1 y 3 horas después de la inoculaciónde 50 J.lg de veneno de "terciopelo" y seobservaron tres tipos de fibras musculares:(a) células con una morfología ultraestruc­tural normal, (b) fibras que mostraron unaalteración no muy severa a nivel de retículosarcoplásmico, el cual presentó dilatación yvacuolización moderadas, y (c) fibras con unaalteración severa en las diferentes organelas;las miofibrillas perdieron su arreglo normal ylos miofllamentos precipitaron en una masaamorfa de proteínas; el retículo sarco­plásmico sufrió vacuolización y fragmenta­ción evidentes; la membrana plasmática seapreció destruida y discontinua en algunospuntos y algunas mitocondrias se observaronhinchadas, en tanto que otras perdieron suintegridad estructural. Este estudio corroboróel hecho de que la mionecrosis inducida porel veneno de "terciopelo" es un fenómenorápido y drástico, que en término de treshoras alcanza una gran intensidad.

Uno de los problemas que ha dificultadoel estudio de la mionecrosis inducida porvenenos es la ausencia de un método quepermita cuantificar la magnitud de la necrosis(23). En nuestro laboratorio se efectuó unproyecto tendiente a estudiar la posibilidadde utilizar la determinación de los nivelesséricos de la enzima creatina fosfoquinasa(CPK) como índice cuantitativo de dichamionecrosis (8). En este estudio se observóq ue, en 1as condiciones experimentalesempleadas, las muestras de corazón y cerebrono presentaron alteraciones severas a nivelhistológico, en tanto que las fibras delmúsculo esquelético alrededor del sitio de lainoculación se apreciaron notablementeafectadas, tal y como se describió anterior­mente. Con base en lo anterior, se concluyóque la rápida y pronunciada elevación de la

CPK en suero es un reflejo de la necrosis demúsculo esquelético y, por lo tanto, puedeutilizarse como índice cuantitativo de dichoproceso patológico. El uso potencial de ladeterminación de CPK en el campo de losvenenos tiene dos implicaciones importantes:(a) a nivel de patología experimental, es uninstrumento cuantitativo en la evaluación dela magnitud de la necrosis y en el estudiode la capacidad neutralizante de los suerosantiofídicos; y, (b) podría eventualmente uti­lizarse en la práctica hospitalaria comotécnica de laboratorio para evaluar la inten­sidad de la necrosis e, indirectamente, paráestimar la severidad del envenenamiento engeneral, colaborando de esta forma en eldiseño de un adecuado tratamiento. Resultainteresante destacar que \m grupo de investicgadores japoneses ha propuesto reciente­mente el uso de la determinación de la CPKcomo índice cuantitativo del volumen deveneno inoculado a las víctimas de accidentesofídicos (22).

El modo exacto de acción de las toxinasmionecróticas del veneno de "terciopelo" sedesconoce. Estudios preliminares no publi-cados indican que en este veneno existenal menos tres diferentes componentes queprovocan mionecrosis. Pese a la ausencia deinvestigaciones con toxinas purificadas,parece razonable proponer que algunastoxinas mionecróticas podrían actuar direc­tamente en la membrana plasmática de lascélulas musculares, alterando severamenteel control que dicha membrana posee sobrela permeabilidad de diferentes sustancias. Loanterior traería como consecuencia undesequilibrio en el ambiente intracelular queculminaría con la muerte de la fibramuscular. Una de las implicaciones másimportantes de esta alteración en la permea­bilidad de la membrana celular sería elaumento de la concentración del ion Calcioen el interior de las células. Varias hipótesishan sido propuestas en las cuales se leconfiere al ion Calcio un rol fundamental enlos procesos de muerte celular en músculoesquelético y cardíaco (6,32,5). Aparente­mente, el aumento en la concentraciónintracelular de Calcio activa una serie depr6teasas y fosfolipasas que pueden desen­cadenar la muerte celular. La temprana libe­ración de CPK al torrente circulatorio,observada en nuestros estudios experimen-

tales en ratones, es una evidencia de estaposible alteración en la permeabilidad de lamembrana plasmática. Sin embargo, las ideasanteriores permanecen en el plano hipotéticohasta que no se tengan datos experimentalesmás concluyentes al respecto.

En algunas oportunidades se ha propuestoque la necrosis muscular local es consecuenciade la intensa compresión tisular originada apartir de los procesos inflamatorio y edema­tizante que provoca el veneno de "terciopelo".Sin embargo, el hecho de que es posibleaislar de los venenos toxinas puras capacesde inducir mionecrosis por sí mismas, sinprovocar edema, es una clara demostración deque la compresión tisular puede constituirun factor que contribuye al cuadro mione­erótico local, pero no es su causa principal.

El efecto hemorrágico:La hemorragia local y sistémica es uno de

los efectos más consistentes y evidentes en elenvenenamiento por "terciopelo". Dichocuadro ha sido ampliamente descrito entrabajos de tipo clínico, así como depatología experimental (27,20,17,30,8).

En estudios efectuados en ratones, elfenómeno hemorrágico local aparece pocosminutos después de la inoculación de venenode "terciopelo"; no obstante, el mismoadquiere su mayor intensidad 6 horasdespués (8).

Aunque la patogenia del efecto hemo­rrágico inducido por el veneno de"terciopelo" no ha sido investigada a profun­didad, algunos estudios efectuados con otrosvenenos pueden sugerir posibles modos deacción de las toxinas hemorrágicas. Merecenla atención principalmente los estudiosdesarrollados con los venenos de las especiesTrimeresurns flavoviridis (29) y Crotalusatrox (25,24), ya que estas serpientes tienenuna posición filogenética cerCana con la"terciopelo". En el caso del veneno deT. flavoviridis, las toxinas hemorrágicasafectan directamente la sustancia intercelularque separa las células endoteliales en el lechocapilar; este mecanismo se ha denominadohemorragia por diapedesis, ya que los eritro­citos abandonan el torrente circulatorioatravesando los orificios que quedan entrelas células endoteliales. En cambio, los com­ponentes hemorrágicos del veneno dee atrox atacan y lesionan directamente las

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células endoteliales de los vasos capilares, sinque se haya descrito una acción sobre lasustancia intercelular. Este segundo venenoorigina una hemorragia por reris, en la cuallos eritrocitos se extravasan atravesando losorificios que quedan al ser destruidas lascélulas del endotelio. Es posible que ambosmecanismos jueguen un rol en la patogeniadel efecto hemorrágico y que la importanciarelativa de uno u otro varíe de acuerdo alveneno.

Cabe mencionar, además, el hecho de queel veneno de "terciopelo" provoca otrasalteraciones vasculares en ratón,· siendo lasmás evidentes la angionecrosis y la trombosis(14,7). Dado que dichos fenómenos seaprecian con claridad cerca del sitioanatómico de la mordedura, ellos son compo­nentes de lo que hemos denominado efectoslocales.

El edema y el fenómeno inflamatorio:El desarrollo de un proceso inflamatorio

agudo en el sitio de la mordedura es otra delas características típicas del envenenamientopor "terciopelo". Pese a que la patogenia delmismo no se conoce en sus detalles, en dichocuadro se dan dos fenómenos principales:(a) Histológicamente, se observa un abun­dante infIltrado leucocitario compuesto enlas primeras 24 horas por polimorfonuclearesneutrófIlos (7). La composición celular delinfIltrado inflamatorio varía una semanadespués del envenenamiento en ratones,cuando está formado principalmente pormacrófagos y otras células mononucleares.En los estudios experimentales efectuados, elinfIltrado inflamatorio alcanza su máximaintensidad entre las 9 y las 24 horasposteriores a la inoculación de veneno de"terciopelo" (8). (b) Aparece, muy rápida­mente, un intenso edema que en el ratónalcanza valores significativos desde la primerahora y se mantiene por varios días, llegandoa su máximo valor a las 24 horas (8). En lapatogénesis de dicho edema pueden parti­cipar directamente componentes del venenoque afecten la permeabilidad capilar y queinduzcan una exudación de material plas­mático. Además, el edema puede ser provo­cado de manera indirecta por el veneno, en elsentido de que es parte de la respuesta infla­matoria de los tejidos al envenenamiento. Eneste caso, podría estar mediado por meca-

nismos autofarmacológicos relacionados conla liberación de histamina y bradikinina.

Variaciones geográficas y de acuerdo a laedad del ejemplar:Jiménez-Porras (1964) demostró clara­

mente que los venenos obtenidos de ejem­plares individuales de "terciopelo", proce­dentes de diferentes regiones del territoriocostarricense, varían en su composiciónbioquímica. Por otra parte, Aragón yGubensek (1979) también demostraron unadiferenciación de tipo bioquímico entre losvenenos de ejemplares de "terciopelo" de laregión Atlántica en relación con los delPacífico. Más recientemente, Gutiérrez et al.(1980) observaron que los venenos de ejem­plares adultos y recién nacidos de estaespecie presentan propiedades inmunológicasy toxinológicas distintas. En lo relativo a losefectos locales en ratón, los venenos de ejem­plares recién nacidos son más hemorrágicos ymás edematizantes, en tanto que los venenosde ejemplares adultos producen una mione·crosis de mayor intensidad, con una máspronunciada elevación de los niveles séricosde CPK. Es de destacar que, pese a las dife­re ncias, el suero antiofídico polivalenteneutraliza el efecto letal de ambos tipos deveneno con título similar.

De estos estudios se concluye que elcuadro local resultante de una mordedura de"terciopelo" varía de un caso a otro, siendoimposible predecir la magnitud del daño.Dicha variación se origina por la diferentecantidad de veneno inoculado (que nosiempre guarda una relación directamenteproporcional al tamaño del ofidio), por -elsitio anatómico de la mordedura, por laprocedencia geográfica del espécimen y porla edad de la serpiente.

La neutralización de los efectos locales delveneno de "terciopelo":

a) Neutralización por los sueros hiperinmunespolivalentes: Durante muchos años se hadesarrollado una polémica a nivel interna­cional con· respecto a si los sueros antiofí·dicos o antivenenos neutralizan o no losefectos locales inducidos por mordedura deserpiente. En general, estudios efectuados enotros países han llegado a la conclusión deque los antivenenos no son capaces deneutralizar en su totalidad la hemorragia y

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la mionecrosis (21,13,19,26).En el Instituto Clodomiro Picado hemos

efectuado varios estudios tendientes a anali­zar la capacidad neutralizante que posee elsuero polivalente producido en nuestroslaboratorios sobre los efectos locales indu­cidos por el veneno de "terciopelo" enratón (11,12). Para ello se han llevado a cabodos tipos de experimentos: (l) experimentosen los cuales se incuba el veneno junto conel suero en un tubo de ensayo poí: un período·de 30 minutos, inoculándose luego la mezclaen los animales de laboratorio y (2) experi­mentos en los cuales se ha tratado de repro­ducir la secuencia natural de una morde­dura de serpiente, es decir, con inoculacióninicial del veneno y administración posteriordel suero antiofídico. Las conclusiones deestos estudios se pueden resumir de lasiguiente manera: Primero, cuando el sueropolivalente, ya sea éste producido encaballos o en ovejas, se incuba previamentecon el veneno de "terciopelo", los efectoslocales (mionecrosis, hemorragia y edema)son neutralizados. No obstante, el volumende suero necesario para neutralizar cada unode lqs efectos es diferente, siendo másefectiva la neutralización de la actividadhemorrágica; en cambio, para neutralizar eledema y la mionecrosis se requiere una mayorproporción de suero. La conclusión principales que, en este tipo de experimentos, nuestrossueros polivalentes son capaces de neutralizarlos efectos locales que produce el venenode "terciopelo". En segundo lugar, cuando elveneno de "terciopelo" se inocula enratones y el suero polivalente se administradespués, los resultados son diferentes. Enestas circunstancias, los efectos edemati­zante y mionecrótico sólo son neutralizadosparcialmente, aún en el caso de que elantiveneno se administre inmediatamentedespués del veneno. El fenómeno hemorrá­gico es mucho mejor neutralizado, siemprey cuando el suero sea inyectado inmediata­mente después del envenenamiento. Sinembargo, si el suero se administra al ratón30 minutos después del veneno, la neutrali­zación de los tres efectos es mínima. Final­ment~, se observó que, en ratón, el efectoneutralizante del suero varía de acuerdo a lavía de administración del mismo. Los mejoresresultados se obtuvieron empleando la víaendovenosa; en lo referente a la vía intra-

muscular, se observó una mayor neutrali­zación si el antiveneno se administra en lavecindad del sitio de la mordedura.

El suero antiofídico polivalente produ­cido en el Instituto Clodomiro Picadoneutraliza el efecto letal de los venenos deserpientes costarricenses ubicadas en lafamilia Viperidae (3,4). Sin embargo, losresultados anteriormente expuestos nospermiten concluir que dichos sueros neutra­lizan sólo parcialmente los efectos localesinducidos por el veneno de "terciopelo". Lacausa de ello no es la ausencia de antitoxinasen dichos sueros, sino que el origen de esadébil neutralización se encuentra principal­mente en la forma rápida y drástica en que sedesencadenan los citados efectos una vez queel veneno ha sido inoculado. Como fuemencionado, los fenómenos mionecrótico,edematizante y hemorrágico son muypronunciados una hora después del envene­namiento experimental en ratones, lo queindica que los mismos se desencadenan pocosminutos después de la mordedura. Ello nospermite proponer que, cuando las antitoxinaspresentes en el suero polivalente llegan a lostejidos afectados, ya se han iniciado losefectos locales y la neutralización de losmismos se dificulta considerablemente.

b) Neutralización por el suero de la serpiente"zopilota" (Clelia cleliaJ: La serpienteClelia clelia, conocida corno "zopilota",presenta hábitos ofiófagos, esto es, sealimenta de serpientes. Debido a ello, esfrecuentemente mordida por las serpientesvenenosas de las que se alimenta; sinembargo, .presenta una resistencia naturalcontra dichos. venenos. En nuestros labora­torios se han efectuado inoculaciones deveneno de las principales serpientes deCosta Rica en la "zopilota", y ésta ha sidoresistente a todos ellos (Cerdas y Lomonte,resultados no publicados). Lo anterior sirvióde base para una investigación en la que seestudió la capacidad neutralizante que elsuero de dicha serpiente tiene sobre losefectos locales del veneno de "terciopelo"(18). Los resultados de la misma señalan queefectivamente el suero sanguíneo de Cleliaclelia es capaz de neutralizar los tres efectoslocales mencionados, cuando se incuba conel veneno antes de la inoculación en ratones.No obstante, también se observó que el

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suero de la "zopilota" es tóxico para el ratón,produciendo a nivel local pronunciada necro­sis tisular y edema. Lo anterior pareceexcluir la posibilidad del empleo de dichosuero sin detoxificar para tratamiento. Apesar de esto, el estudio del mecanismo deacción del suero sanguíneo de "zopilota"puede ser de mucha utilidad en el desarrollode una más adecuada comprensión de lapatogenia y neutralización de los efectos1ocales inducidos por el veneno de laserpiente "terciopelo".

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecemos a todo el personaldel Instituto Clodomiro Picado de la Univer­sidad de Costa Rica por su valiosa colabo­ración en los diferentes proyectos efectuados.Estas investigaciones han sido financiadaspor la Universidad de Costa Rica y por elConsejo Nacional de Investigaciones Cientí­ficas y Tecnológicas (CONICIT) de CostaRica.

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