potencia antibiotica 2011
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ENSAYOS MICROBIOLOGICOS EN PERSPECTIVA
Q.F. MIRTHA ROQUE ALCARRAZQ.F. MIRTHA ROQUE ALCARRAZMG EN MICROBIOLOGIAMG EN MICROBIOLOGIA
ENSAYOS BIOLOGICOS
Es definido como un procedimiento experimental donde la potencia de una sustancia desconocida es estimada por comparacion de su efecto en un sistema biologico con un estandar de potencia conocida.
Bioensayo: ensayo en el cual el poder o potencia de una sustancia es medido a través de la respuesta de organismos vivos o sistemas vivientes.
Ensayo Microbiologico
El sistema biologico es un cultivo de microorganismos.
Ensayo Macrobiologico
El sistema biologico es un numero de organismos superiores tales como:
Aves Mamiferos (ratas ,ratones etc) Organos aislados de animales
Variabilidad
El que se tenga que utilizar seres vivos Caracteristicas especiales Que sin excluir la Bioetica Variabilidad de los efectos que se
obtienen es mayor que en los ensayos de la fisica o quimica
Obliga el uso de metodos estadisticos Los resultados se acompañan de Limites
de confianza.
Tipos de Bioensayos
Directo Determina la dosis o
concentracion capaz de producir el efecto deseado
Dosaje de digitalicos
Indirecto
basado en respuestas cualitativas
Determina la respuesta deseada en grupos de animales
DL50 dosis letal Dosis efectiva 50
Ensayo Indirecto
Basado en respuestas cuantitativas.
Se compara los efectos de una sustancia conocida usado como patron o estandar con los de una muestra.
Establece una relacion dosis/respuesta y la ecuacion de regresion correspondiente.
Ensayos microbiologicos: Inhibicion de crecimiento
bacteriano por sustancias antibioticas
Promocion de crecimiento por sustancias como aminoacidos y vitaminas
HISTORIA La Penicilina se descubrio en 1929. En 1939 empieza la investigacion para la produccion
de penicilina y otras sustancias antibioticas. Norman Heatley un bioquimico fue asignado para
establecer las condiciones de produccion de penicilina.
En 1940 Heatley ideo el ensayo de difusion en agar para penicilina.
Heatley la describió en 1944
El método en placa cilíndrica descrito por Edwar Penley Abraham en 1941 para la prueba de penicilinas fue el primero.
Más tarde lo modificaron Foster y Woodruft asi como Schmidt y Moyer.
A partir de 1971 la USP estandarizó el método
ENSAYO DE ENSAYO DE POTENCIA POTENCIA ANTIBIÓTICAANTIBIÓTICA
POTENCIA ANTIBIOTICA
La ACTIVIDAD (POTENCIA)POTENCIA) de un antibiótico es estimada comparando la inhibición de crecimiento de micro-organismos sensibles producida por concentraciones conocidas del antibiótico que esta examinándose y una sustancia de referencia.( ESTANDAR DE REFERENCIA)
Bajo las condiciones adecuadas, la actividad POTENCIA de los antibioticos puede demostrarse por su efecto inhibidor sobre los microorganismos.
La reduccion de la actividad antimicrobiana tambien revela cambios sutiles no comprobales mediante metodos quimicos
Valoraciones microbiologicas siguen siendo la metodologia que permite disipar dudas en cuanto a la posible perdida de actividad de un antibiotico
JUSTIFICACION
CONDICIONES
AMBIENTE ASEPTICO que permita que los
procedimientos se realicen en condiciones de higiene que aseguren la no contaminacion
No es necesario realizar el ensayo en una cabina de Bioseguridad.
Cumplir con las BPL Control microbiológico del área
de trabajo Asignar un area especifica para
los ensayos de valoracion microbiologica
AREA ASEPTICA
EQUIPOS
Todos los equipos deben limpiarse bien antes y despues de cada uso.
Los equipos que lo requieran deben ser calibrados.
Los procesos de esterilizacion en horno y autoclave deben ser validados.
EQUIPOS
Balanza analítica Espectrofotómetr
o Incubadora Baño
termostático Halómetro Vernier digital Vortex Refrigeradora
Espectrofotometria
Se requiere un espectrofotometro adecuado
Fuente luminosa que permita longitudes de onda 530 a 580 nm.
la espectrofotometría visible solamente usa el rango del campo electromagnético de la luz visible , de 400 a 800 nm.
Medir T o AMet. TurbidimetricoConc. Inoculos
Materiales de vidrio
Los materiales de vidrio utilizados para conservar y transferir los organismos de prueba deben
Ser esterilizados por calor seco (Horno de esterilizacion) o calor humedo( autoclave)
El material de vidrio graduado debe ser calibrado
Placas Petri
Denominadas placas de valoracion (USP 32)
Pueden ser de vidrio o plastico
Dimensiones 20 x 100 mm
Deben ser nuevas sin defectos ni rayaduras
Tener un procedimiento de lavado adecuado
Se utilizan esteriles
PLACAS PETRIPLACAS PETRIDeberán utilizarse placas de vidrio o desacartables con dimensiones de :
20 x 100 mm20 x 100 mm100 mm diametro
Otros materiales
Micropipetas
Volumenes ; 10 a 50 ul 100 a 1000 ul Deben ser calibradas
CALIBRACION DE BALANZA
Se requiere que el procedimiento de pesada sea exacto.
Al pesar sales para las soluciones tampon
Pesar sustancias antibioticas problema
Sustancias estandar de referencia.
CONTROL DE TEMPERATURASe requiere control
termostatico en varias etapas de una valoracion:
Cultivo de microorganismos
Preparacion del inoculo Incubacion de placas del
ensayo de valoracion Es imperativo un control
estricto diario de la Tº Valoracion ± 0.5 º C
Estufas con circulacion de aguaMayor capacidad termica y Tº mas estable
Cilindros para valoracion
Cilindros de acero inoxidable o porcelana
Diametro externo de 8 mm.
Diametro interno de 6 mm
Longitud 10 mm
Tubos de prueba para turbidimetria Tubos de prueba de
vidrio o plastico 16 x 125 mm 18 x 150 mm No deben tener
rayaduras ni defectos Procedimiento de lavado
que elimine residuos de antibiotico
Se deben esterilizar antes de usar y luego de usados antes de la limpieza.
MEDIOS DE CULTIVO
Se encuentran en el mercado en forma deshidratada y se preparan de acuerdo a lo indicado por el fabricante.
La USP indica los medios para cada antibiótico.
Deben pasar por la prueba de promoción de crecimiento, y la prueba de esterilidad.
USP 32
Medios de cultivo
Los medios de cultivo deben tener certificados del proveedor.
En lo posible se debe trabajar con medios de un mismo laboratorio .
Medios de cultivo certificados
Laboratorios certificados Formulas para
reconstituir Preparan por
ingredientes
SOLUCIONES AMORTIGUADORAS
Son soluciones de sales de fosfato de potasio.
Otorgan el pH optimo para la actividad del antibiótico durante la realización de los ensayos.
La USP indica la solución amortiguadora para cada antibiótico.
Preparación de las soluciones amortiguadoras
Utilizar sales químicamente puras y conservarse en el desecador.
Las pesadas deberán ser exactas.
Debera utilizarse material estéril (fiolas, pipetas, agua destilada y otros)
Las operaciones de la disolución se harán asépticamente.
Las soluciones tampon se esterilizan por filtracion o se preparan con agua esteril.
IMPORTANTE RECORDAR
La medicion del pH De las soluciones
tampon es un rquisito indispensable para la disolucion y difusion de las sustancias antibioticas
ESTANDARES DE REFERENCIA USP
denominados Estandares de Referencia Oficiales
Son sustancias de elevada pureza Con caracteristicas esenciales son sustancias cuya actividad ha sido
precisamente determinada con: referencia a la Norma Internacional
correspondiente o la Preparación de la Referencia Internacional
USP, BP.
USO
Ayudan a garantizar el cumplimiento de los requisitos de calidad oficiales de USP-FDA
Se utilizan en las valoraciones y pruebas farmacopeicas contenidas en las publicaciones de Nornas oficiales.
Distribucion
La USP ofrece mas de 2200 estandares de referencia
La USP colabora con la OMS que tiene como objetivo proporcionar estandares biologicos internacionales y materiales quimicos de referencia para antibioticos,productos biologicos y quimioterapeuticos
Productos
Uso correcto de los Estandares Los Estandares de
Referencia no estan diseñadas para ser utilizadas como farmacos.
Los usuarios deben asegurarse de la aptitud para el uso
Almacenamiento
Deben almacenarse en sus envases originales y cerrados
Las condiciones de Tº y Humedad se indican en el certificado de cada Estandar.
La exposicion a la luz es importante cuando la exigencia lo requiere.
Desecadores
Pesada
Asegurarse que los Estandares de Referencia sean pesados con exactitud
Secado
Cuando sea necesario secar un Estandar antes de usarlo.
Secar en un recipiente limpio y seco y No en el envase original.
Seguir indicaciones especificadas en el certificado
MICROORGANISMOS DE PRUEBA
Las cepas a utilizar deben ser:Sensibles al antibiótico de experimentaciónResistentes a los demás antibióticos
Deben ser adquiridas:
American Type culture collection
(ATCC) Deben ser
conservadas en el medio indicado según la USP.
American Type Culture Collection (ATCC) es una entidad privada, mundialmente
reconocida como centro de recursos biológicos, cuya misión se centra en la producción, conservación, y distribución de patrones de referencia de microorganismos.
Mercado dirigido para la investigación y laboratorios de control de calidad.
La colección de microorganismos ATCC, incluye más de 1800 cepas de bacterias de 900 géneros, así como 2000 diferentes tipos de virus vegetales y animales.
Organismos de prueba para cada antibiotico
PREPARACION DEL INOCULO
PREPARACION DEL INOCULO
Seleccionar el medio de cultivo.
Sembrar el m.o en agar inclinado x 24 h a 30-35ºC
Cosechar el crecimiento con 3 ml de S.S.F.
Propagar en Frasco Roux incubando a 30-35 ºC x 24h.
Cosechar con 50 ml de SSF.
Estandarizar concentración del inoculo
SUSPENSION 10 8 A 10 9 CELULAS /ml
100g 100g
Sembrar m.o
Cosechar m.o
3 ml ssf
Propagarm.o
EstandarizarConcentracio
ninoculo
Incubacion35 ºC x 24 h
Incubacion35 ºC x 24 h
Recordar :
El crecimiento y la preparacion del microorganismo determinan el estado fisiologico de las celulas
Influencia directa en el resultado de los ensayos
.
TUBOCl2Ba 1% SO4H2 1% u.f.c/ml
1 0,1 9,9 3,0x108
2 0,2 9,8 6,0x108
3 0,3 9,7 9,0x108
4 0,4 9,6 1,2x109
5 0,5 9,5 1,5x109
6 0,6 9,4 1,8x109
7 0,7 9,3 2,1x109
8 0,8 9,2 2,4x109
9 0,9 9,1 2.7x109
10 1,0 9,0 3,0x109
ESCALA DE MAC FARLAND
METODOLOGIASegún:Farmacopea Americana USP 32 Farmacopea Británica 2009Farmacopea Europea 2009Técnicas de Laboratorio de origen
METODOS
DIFUSION
TURBIDIMETRICOTURBIDIMETRICO
METODO DIFUSION
Difusión del antibiótico contenido en un cilindro o disco de papel de filtro a través de los medios de cultivo.
adecuados en una extensión tal que el microorganismo agregado se inhiba de crecer en la zona que rodea al cilindro o disco de papel. (ZONAS DE INHIBICION)
MATERIALES Y EQUIPOSMETODO DIFUSION
CILINDROSCILINDROS,acero inoxidable.
Diámetro externo de 8 mm ( +- 0.1 mm)
Diámetro interno 6 mm (+- 0.1mm).
Longitud 10 mm ( +- 0.1 mm)
10 mm
Principio de la formacion de zonas de inhibicion
Leyes que influencian la difusion
Ley de la difusion
Ley del crecimiento microorganismos
Ley absorcion,permeabilidad y particion
Ley accion especifica del antibiotico
METODO CILINDRO PLACA
• Se basa en la difusión del antibiótico desde un cilindro vertical a través de una capa de agar.
•De modo que el crecimiento del microorganismo forma una Zona de inhibición alrededor del cilindro conteniendo la solución del antibiótico.
METODO DE EXCAVACION PLACA CULTIVO
Se basa en la difusión del antibiótico contenido en una excavación, a través de una capa de agar.
Formacion de una zona de inhibicion.
METODO TURBIDIMETRICO
Inhibición del crecimiento de un cultivo microbiano en una solución uniforme del antibiótico, en un medio fluido que favorece su desarrollo en ausencia del antibiótico.
MATERIALES Y EQUIPOS
METODO TURBIDIMETRICO
TUBOSTUBOS De longitud y
diámetros uniforme Si son vueltos a
utilizar el lavado de los mismos debe ser eficiente
ESPECTROFOTOMETROESPECTROFOTOMETRO530 nm . 530 nm . Hacer un blanco
con el medio de cultivo no inoculado