plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · mengharapkan saran dan kritik guna...

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN

KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI AIREKSTRAK METANOLIK BUAH LABU SIAM

(Sechium edule Jacq. Swartz.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Angela Natalia Meta Karvitasari

NIM : 088114070

FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA2012

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN

KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI AIREKSTRAK METANOLIK BUAH LABU SIAM

(Sechium edule Jacq. Swartz.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:Angela Natalia Meta Karvitasari

NIM : 088114070

FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA2012


ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Tidak ada rahasia kesuksesan. Ini adalah hasil dari persiapan, kerja keras,

dan belajar dari kegagalan.”

(Colin Powell)

Skripsi ini aku persembahkan kepada :

Ibu, Bapak, keluarga besarku,

sebagai ungkapan rasa hormat dan baktiku,

Laki-laki yang selalu menyebut namaku di setiap doanya,

semua sahabat, teman, dan almamaterku.

“Tuhan takkan terlambat

Juga tak akan lebih cepat

Ajarlah kami setia s’lalu menanti waktuMu Tuhan.”

(1 Korintus 10 : 13 & Pengkotbah 3 : 11a)

“Jenius adalah 1% inspirasi

dan 99% keringat. Tidak ada

yang dapat menggantikan

kerja keras. Keberuntungan

adalah sesuatu yang terjadi

ketika kesempatan bertemu

dengan kesiapan.”

(Thomas Alfa Edison)

“Kebahagiaan terbesar dalam

kehidupan adalah keyakinan

bahwa kita dicintai apa

adanya, atau lebih tepatnya

dicintai tanpa mempedulikan

diri kita yang apa adanya.”

(Victor Hugo)


v


vi


vii

PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan karena berkat rahmat dan karunia-Nya penulis

dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan

Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan

Kandungan Fenolik Total Fraksi Air Ekstrak Metanolik Buah Labu Siam

(Sechium edule Jacq. Swartz.)” sebagai salah satu syarat guna memperoleh gelar

Sarjana Farnasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Dalam proses penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari

bantuan dan dukungan dari semua pihak sehingga skripsi ini dapat terselesaikan

dengan baik. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan

terimakasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Prof. Dr. CJ. Soegihardjo, Apt. Sebagai Dosen Pembimbing yang telah

memberikan bimbingan, pengarahan serta ilmu dalam penelitian dan

penyusunan skripsi ini.

2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. sebagai Dosen Penguji atas pengarahan dan

kesediaannya menguji skripsi ini.

3. Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si. sebagai Dosen Penguji atas pengarahan dan

kesediaannya menguji skripsi ini.

4. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. sebagai Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma.

5. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.


viii

6. Bapak dan Ibu atas doa dan restu serta dukungan baik moril dan materiil

sehingga skripsi ini bisa selesai serta kasih sayang yang tiada tara.

7. Fransiskus Endi Bawono Utomo dan keluarga yang selalu mendoakan dan

mendukung agar skripsi ini cepat untuk diselesaikan.

8. Sahabat-sahabatku, Fransisca Dian Permanasari, Margaretha Ratih

Vitaningrum, Intan Chintya Dewi, Wilfrida Maria Du’a, Anastasia Fillipa

Veritas, dan Margareta Efa Putri atas doa dan dukungannya selama ini.

9. DPPH team (Valentinus Widyawan, Rollando, Aldo Sahala, dan Anthonius

Pandu) terimakasih atas kerjasama yang telah dilewati bersama dalam

penelitian ini.

10.Teman-teman Farmasi kelas B angkatan 2008, dan FST 2008.

11. Teman-teman KKN kelompok 20 (Gondang Pusung) atas doa dan

dukungannya selama ini.

12.Semua pihak yang telah memberi dukungan dan bantuan yang tidak dapat

desebutkan satu persatu.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini banyak kekurangan dan

jauh dari sempurna, untuk itu dengan segala kerendahan hati penulis

mengharapkan saran dan kritik guna perbaikan dan penyempurnaan skripsi ini.

Harapan penulis semoga penelitian dan penyusunan skripsi ini bermanfaat bagi

perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang Farmasi.

Yogyakarta, Januari 2012

Penulis


ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL............................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING..................................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN............................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN............................................................................ iv

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI................................................... v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA................................................................ vi

PRAKATA............................................................................................................ vii

DAFTAR ISI.......................................................................................................... ix

DAFTAR TABEL................................................................................................ xiii

DAFTAR GAMBAR........................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN........................................................................................ xvi

INTISARI........................................................................................................... xvii

ABSTRACT......................................................................................................... xviii

BAB I PENGANTAR............................................................................................. 1

A. Latar Belakang.................................................................................................. 1

1. Permasalahan................................................................................................ 3

2. Keaslian penelitian....................................................................................... 4

3. Manfaat yang diharapkan............................................................................. 4

B. Tujuan............................................................................................................... 5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA...................................................................... 6


x

A. Labu Siam......................................................................................................... 6

1. Klasifikasi tanaman...................................................................................... 6

2. Nama lain...................................................................................................... 6

3. Morfologi tanaman....................................................................................... 7

4. Deskripsi tanaman.........................................................................................7

5. Kandungan kimia.......................................................................................... 8

6. Kegunaan labu siam..................................................................................... 9

7. Penelitian antioksidan................................................................................. 10

B. Senyawa Fenolik............................................................................................. 10

C. Radikal Bebas.................................................................................................. 13

D. Antioksidan..................................................................................................... 17

E. Pengukuran Aktivitas Antioksidan................................................................. 21

F. Metode DPPH................................................................................................. 23

G. Ekstraksi.......................................................................................................... 24

H. Spektrofotometer Visibel................................................................................ 27

I. Validasi Metode Analisis................................................................................ 29

J. Landasan Teori................................................................................................ 31

K. Hipotesis.......................................................................................................... 32

BAB III METODE PENELITIAN........................................................................ 33

A. Jenis dan Rancangan Penelitian...................................................................... 33

B. Variabel dan Definisi Operasional.................................................................. 33

C. Bahan Penelitian.............................................................................................. 34

D. Alat Penelitian................................................................................................. 35


xi

E. Tata Cara Penelitian........................................................................................ 35

1. Determinasi tanaman.................................................................................. 35

2. Pembuatan ekstrak metanol dan fraksi air buah labu siam......................... 35

3. Uji pendahuluan.......................................................................................... 36

4. Penentuan aktivitas antioksidan................................................................. 37

5. Penentuan kandungan fenolik total............................................................ 39

6. Analisis Hasil............................................................................................. 41

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN.............................................................. 42

A. Hasil Determinasi Tanaman............................................................................ 42

B. Hasil Pengumpulan Bahan.............................................................................. 42

C. Hasil Preparasi Sampel................................................................................... 43

D. Hasil Uji Pendahuluan..................................................................................... 48

1. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan........................................................ 48

2. Uji pendahuluan fenolik............................................................................. 49

E. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan......................................... 50

1. Penentuan operating time (OT).................................................................. 51

2. Penentuan panjang gelombang maksimum................................................ 53

F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan.......................................... 54

1. Akurasi....................................................................................................... 56

2. Presisi......................................................................................................... 59

3. Linearitas.................................................................................................... 59

4. Spesifitas.................................................................................................... 60

G. Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH........................ 62


xii

H. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total........................ 68

1. Penentuan operating time (OT).................................................................. 69

2. Penentuan panjang gelombang maksimum................................................ 70

I. Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total......................... 71

1. Akurasi....................................................................................................... 72

2. Presisi......................................................................................................... 72

3. Liniearitas................................................................................................... 74

4. Spesifitas.................................................................................................... 74

J. Hasil Estimasi Kandungan Fenolik Total....................................................... 76

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN................................................................ 81

A. Kesimpulan..................................................................................................... 81

B. Saran................................................................................................................ 81

DAFTAR PUSTAKA........................................................................................... 82

LAMPIRAN.......................................................................................................... 86

BIOGRAFI PENULIS........................................................................................ 111


xiii

DAFTAR TABEL

Tabel I. Contoh beberapa radikal bebas (Haliwell dan Guitteridge, 2000)...14

Tabel.II. Kekuatan antioksidan dengan metode DPPH (Ariyanto cit.

Sambada, 2011)................................................................................ 24

Tabel III. Rentang akurasi yang dapat diterima (Harmita, 2004).................... 30

Tabel IV. Rentang CV yang masih dapat diterima (Harmita, 2004)................ 30

Tabel V. Hasil % recovery dan %CV uji aktivitas antioksidan rutin...............57

Tabel. VI. Hasil % recovery dan %CV uji aktivitas antioksidan fraksi air....... 58

Tabel VII. Hasil %IC rutin menggunakan radikal DPPH.................................. 65

Tabel VIII. Hasil %IC fraksi air menggunakan radikal DPPH............................ 66

Tabel IX. Hasil IC50 fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam dan rutin..... 67

Tabel X. Hasil % recovery dan %CV penetapan kadar fenolat...................... 73

Tabel XI. Hasil absorbansi berbagai seri konsentrasi asam galat..................... 78

Tabel XII. Hasil absorbansi fraksi air................................................................ 79

Tabel XIII. Hasil kandungan fenolik total fraksi air............................................ 79


xiv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Reaksi antara senyawa fenol dengan pereaksi Follin-Ciocalteu

(Sambada, 2011) .........................................................................12

Gambar 2. Struktur kimia asam galat (Mongkolsilp et al., 2004)................ 13

Gambar 3. Struktur kimia beberapa antioksidan sintetik (Pokorny et al.,

2001)........................................................................................... 19

Gambar 4. Mekanisme pembentukan radikal antioksidan (Sihombing,

2011)........................................................................................... 20

Gambar 5. Reaksi reduksi DPPH (Prakash, Rigelhof, Miller, 2001)............ 23

Gambar 6. Diagram Spektrofotometer UV-Vis (Sastrohamidjodjo, 2001).. 28

Gambar 7. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol

negatif [blanko], B = larutan uji [fraksi air ekstrak

metanolik nuah labu siam], C = kontrol positif

[rutin])......................................................................................... 49

Gambar 8. Hasil uji pendahuluan fenolik (A = kontrol positif [asam galat],

B = larutan uji [fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam],

C = kotrol negatif [blanko])........................................................ 50

Gambar 9. Hasil grafik penentuan OT rutin.................................................. 52

Gambar 10. Hasil grafik penentuan OT fraksi air........................................... 52

Gambar 11. Hasil scanning λ maksimum DPPH pada berbagai konsentrasi..54

Gambar 12. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan rutin......... 55


xv

Gambar 13. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan fraksi air

ekstrak metanolik buah labu siam............................................... 55

Gambar 14. Hasil scanning rutin pada λ 400-600 nm.................................... 60

Gambar 15. Hasil scanning fraksi air pada λ 400-600 nm.............................. 61

Gambar 16. Hasil scanning metanol pada λ 400-600 nm............................... 61

Gambar 17. Perubahan warna DPPH disertai dengan penurunan absorbansi

(Molyneux, 2004)....................................................................... 63

Gambar 18. Gugus kromofor dan auksokrom DPPH (Prakash et al., 2001).. 63

Gambar 19. Struktur rutin (Santos, Mazo, Cavalheiro, 2008)........................ 64

Gambar 20. Grafik penentuan OT penetapan kandungan fenolat................... 69

Gambar 21. Hasil scanning λ maksimum senyawa berwarna biru

(molybdenum blue) pada berbagai konsentrasi asam galat......... 70

Gambar 22. Kurva persamaan regresi linier penetapan kadar fenolat total.... 71

Gambar 23. Hasil scanning larutan asam galat pada λ 600-800 nm............... 75

Gambar 24. Hasil scanning fraksi air pada λ 600-800 nm............................. 75

Gambar 25. Hasil scanning metanol-air pada λ 600-800 nm.......................... 76

Gambar 26. Struktur asam galat (Mongkolsilp et al., 2004)........................... 77


xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman labu siam.........................86

Lampiran 2. Gambar tanaman labu siam dari daerah Sawangan (Magelang)... 87

Lampiran 3. Perhitungan rendemen....................................................................87

Lampiran 4. Data penimbangan bahan.............................................................. 88

Lampiran 5. Data perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding

dan larutan uji................................................................................ 89

Lampiran 6. Scanning pengkoreksi................................................................... 91

Lampiran 7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan.................................... 97

Lampiran 8. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH............... 101

Lampiran 9. Perhitungan nilai IC50 fraksi air ekstrak metanol buah labu

siam dan rutin.............................................................................. 102

Lampiran 10. Uji statistik aktivitas antioksidan dengan SPSS 17.0.................. 103

Lampiran 11. Penimbangan untuk uji kandungan fenolik total......................... 104

Lampiran 12. Optimasi penentuan kandungan fenolik total.............................. 104

Lampiran 13. Penentuan kandungan fenolik total............................................. 108

Lampiran 14. Skema jalannya penelitian........................................................... 109

Lampiran 15. Uji kualitatif fraksi etil asetat....................................................... 110


xvii

INTISARI

Antioksidan adalah senyawa yang dapat menyumbangkan satu atau lebihelektron kepada radikal bebas, sehingga radikal bebas tersebut dapat diredam.Akibatnya, kerusakan sel oleh radikal bebas dapat dihambat. Labu siam (Sechiumedule Jacq. Swartz.) merupakan sayuran yang banyak disukai dan diketahuimemiliki senyawa fenolik. Senyawa fenolik merupakan senyawa di dalamtanaman yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan.

Penelitian ini dilakukan untuk menentukan aktivitas antioksidan dankandungan fenolik total fraksi air ekstrak metanol buah labu siam. Ekstrakmetanol diperoleh dari proses maserasi buah labu siam dengan penyari metanol.Ekstrak metanol buah labu siam kemudian dilarutkan dengan air kemudiandipartisi dengan wash bensin dan etil asetat. Fraksi air yang diperoleh diujiaktivitas antioksidannya dengan menggunakan metode 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil(DPPH). Hasil dari pengukuran aktivitas antioksidan dinyatakan melalui nilai IC50yang merupakan konsentrasi yang menyebabkan penurunan 50% dari konsentrasiDPPH awal. Adanya senyawa antioksidan akan mengubah warna larutan DPPHdari ungu menjadi kuning dan disertai penurunan absorbansi DPPH. AbsorbansiDPPH dibaca dengan menggunakan spektrofotometer pada λ maksimum 515,8nm. Penentuan kandungan fenolik total menggunakan metode Folin-Ciocalteaudan dinyatakan dengan nilai masa ekivalen asam galat per g fraksi air ekstrakmetanol buah labu siam. Senyawa fenolik akan dioksidasi oleh pereaksi fenolFolin-Ciocalteau dalam suasana basa sehingga terbentuk larutan berwarna biru.Larutan tersebut memiliki λ maksimum 750 nm. Hasil uji aktivitas antioksidanpada fraksi air mempunyai nilai IC50 sebesar (51,89 + 0,48) μg/ml dan tergolongdalam aktivitas antioksidan kuat. Kandungan fenolik total sebesar (6,56 + 0,05)mg ekivalen asam galat per g fraksi air.

Kata kunci : fraksi etil asetat ekstrak metanol buah labu siam (Sechiumedule Jacq. Swartz.), aktivitas antioksidan, DPPH, kandungan fenolik total.


xviii

ABSTRACT

Antioxidants are compounds that can donate one or more electrons to freeradicals, so that free radicals can be muted. Consequently, cell damage by freeradicals can be inhibited. Chayote (Sechium edule Jacq. Swartz.) is a vegetablemuch to preferred and know to have phenolic compounds. Phenolic compoundsare compounds in plants that have antioxidant activity.

This research was conducted to determine the activity and content ofphenolic antioxidants and total the water fraction from methanolic extract ofchayote. This research was conducted to determine the antioxidants activity andtotal phenolic contents of water fraction methanolic extract of chayote. Themethanolic extract obtained by maceration using the methanol solvents and thenwas reconstituted with water and partitioned with wash-bensin and ethyl acetate.The fraction of water obtained were tested using using the radical DPPH,expressed as IC50 is the concentration that causes a decrease of 50% of earlyDPPH concentration.The presence of antioxidant compounds, wil change colourof DPPH from purple to yellow and the absorbance decreases. Absorbancereading was conducted with spectrophotometry at the wave length at 515,8 nm.Total Phenolics contentdetermined by the Folin-Ciocalteau method, expressed asmg equivalent gallic acid per g of water fraction. Phenolics compound willoxidated by Follin-Ciocalteu reagent in alkaline conditions, formed blue solution.The solution has maximum λ at 750 nm. The result of antioxidant activity test ofwater fraction is IC50 (51.89 + 0.48) μg/ml and belonging to the strong antioxidantactivity. Total phenolic content is (6.56 + 0.05) mg equivalent gallic acid per g ofwater fraction

Keywords : water fraction from methanolic extract of chayote (Sechiumedule Jacq. Swartz.), antioxidant, DPPH, total phenolic content


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Penggunaan senyawa antioksidan saat ini semakin meluas seiring dengan

semakin besarnya pemahaman masyarakat tentang peranannya dalam

menghambat penyakit degeneratif seperti penyakit jantung, arteriosclerosis,

kanker, serta gejala penuaan dini. Masalah-masalah ini berkaitan dengan

kemampuan antioksidan untuk bekerja sebagai inhibitor reaksi oksidasi oleh

radikal bebas reaktif yang menjadi salah satu pencetus penyakit-penyakit di atas

(Tahir, Wijaya, Widianingsih, 2003).

Radikal bebas bersifat reaktif karena mempunyai elektron yang tidak

berpasangan pada orbit terluarnya. Reaksi radikal ini berlangsung secara berantai

sehingga akan menghasilkan radikal bebas baru yang jumlahnya terus bertambah.

Radikal bebas yang berlebihan akan menyerang bagian tubuh yang sehat maupun

yang sakit sehingga dalam jangka waktu yang lama akan menyebabkan timbulnya

berbagai macam penyakit (Sauriasari, 2006).

Antioksidan merupakan suatu senyawa kimia yang dapat

menyumbangkan satu atau lebih elektron kepada radikal bebas, sehingga radikal

bebas tersebut dapat diredam (Suhartono, 2002). Antioksidan dapat berasal dari

bahan alam maupun sintetis. Adanya kekhawatiran akan efek samping yang belum

diketahui dari antioksidan sintetik menyebabkan antioksidan alami menjadi


2

alternatif yang dibutuhkan (Sunarni, 2005). Hal ini yang menyebabkan adanya

penelitian eksplorasi sumber antioksidan alam yang berasal dari tumbuhan.

Labu siam memiliki efek diuretik yang dapat melancarkan buang air

kecil sehingga kelebihan asam urat bisa dikeluarkan. Selain itu juga bisa

menurunkan lemak darah (kolesterol atau trigliserida), mengobati tekanan darah

tinggi, diabetes, dan memperlancar proses pencernaan. Labu siam juga dapat

menyembuhkan gangguan sariawan, panas dalam, serta menurunkan demam pada

anak-anak karena mengandung banyak air (Ekowahyuni, 2002).

Flavonoid, tanin, dan polifenol merupakan golongan senyawa yang

berpotensi sebagai antioksidan. Senyawa-senyawa tersebut banyak terdapat pada

teh, buah-buahan, dan sayuran (Sofia, 2006). Dalam penelitiannya Marliana,

Suryanti dan Suyono (2005) mengemukakan bahwa labu siam mengandung

flavonoid. Selain itu, Melo, Lima dan Maciel (2006) melaporkan bahwa ekstrak

metanol labu siam mengandung fenolat, flavonoid, tanin terkondensasi, dan asam

askorbat.

Labu siam mengandung senyawa-senyawa yang berpotensi sebagai

antioksidan karena itu penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas

antioksidan buah labu siam dan kandungan fenolik total dari buah labu siam.

Diharapkan dengan diketahuinya potensi buah labu siam sebagai antioksidan,

dapat meningkatkan kegunaan buah labu siam sebagai bahan pangan fungsional.

Senyawa fenolik merupakan sekelompok metabolit sekunder yang

mempunyai cincin aromatik yang terikat dengan satu atau lebih substituen gugus

hidroksi (OH). Oleh karena itu pada umumnya senyawa tersebut larut dalam


3

pelarut polar (Markham,1988). Metanol dipilih sebagai penyari karena metanol

merupakan pelarut universal dan penetrasinya ke dalam sel-sel tanaman lebih kuat

dibanding etanol maupun cairan penyari yang lain (Depkes RI b, 2000). Pemilihan

fraksi air didasarkan pada kandungan senyawa fenolik yang terdapat pada buah

labu siam yang mempunyai kelarutan yang baik pada pelarut polar seperti air

sehingga diharapkan aktivitas antioksidan pada fraksi air ini cukup baik.

Salah satu uji untuk menentukan aktivitas antioksidan adalah metode

DPPH (1,1Diphenyl-2-picrylhidrazyl). Pada metode ini penangkap radikal bebas

menyebabkan elektron menjadi berpasangan yang kemudian menyebabkan

penghilangan warna. Nilai aktivitas antioksidan diketahui melalui nilai IC50 yang

merupakan konsentrasi yang menyebabkan penurunan 50% dari konsentrasi

DPPH awal (Sunarni, 2005). Salah satu keuntungan uji aktivitas antioksidan

dengan metode DPPH adalah dapat dikerjakan dengan cepat dan sederhana

dibanding metode lain. Karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengetahui

aktivitas antioksidan buah labu siam dengan metode DPPH. Dalam penelitian ini

juga dilakukan penetapan kandungan fenolik total dengan metode Folin-

Ciocalteau .

1. Permasalahan

a. Berapa nilai aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak metanol buah labu siam

yang dinyatakan sebagai IC50 dengan metode DPPH?


4

b. Berapakah kandungan fenolik total fraksi air ekstrak metanol buah labu siam

yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat?

2. Keaslian penelitian

Uji aktivitas antioksidan buah labu siam (Sechium edule Jacq. Swartz.)

merupakan hasil modifikasi penelitian Tri Wahyuni (2009). Pada penelitian Tri

Wahyuni dilakukan uji aktivitas antioksidan buah labu siam dengan metode

emulsi-skaroten-asam-linoleat. Sedangkan Ratih Indah Syari Pratiwi (2011) telah

melakukan penelitian karakterisasi simplisia dan uji aktivitas antioksidan ekstrak

n-heksan, etil asetat dan etanol herba labu siam (Sechium edule Sw) dengan

metode DPPH.

Pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak

metanol buah labu siam dengan metode DPPH. Sejauh penulusuran dan

pengamatan peneliti modifikasi yang dilakukan belum pernah dikerjakan.

3. Manfaat yang diharapkan

a. Manfaat praktis, penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi

bagi penelitian lebih lanjut maupun masyarakat mengenai potensi buah labu siam

sebagai antioksidan alami.

b.Manfaat teoritis, penelitian ini diharapkan dapat memberikan

sumbangan terhadap perkembangan ilmu pengetahuan dalam bidang farmasi,

khususnya tentang penggunaan metode DPPH dalam menguji aktivitas

antioksidan bahan alam.


5

B. Tujuan

1. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak metanol buah labu

siam yang dinyatakan sebagai IC50 dengan metode DPPH.

2. Mengetahui kandungan fenolik total fraksi air ekstrak metanol buah labu siam

yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat.


6

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Labu Siam

1. Klasifikasi tanaman

Klasifikasi tanaman buah labu siam dalam sistematika tumbuhan adalah

sebaga berikut.

Devisi : Spermatophyta

Subdivisi : Angiospermae

Kelas : Dicotiledonea

Sub kelas : Dilleniidae

Ordo : Violales

Bangsa : Cucurbitales

Keluarga : Cucurbitaceae

Marga : Sechium

Varietas : Sechium edule (Jacq.) Swartz (Backer and van Den Brink, 1968).

Labu siam termasuk salah satu spesies famili Cucurbitaceae dan

merupakan satu-satunya spesies dalam genus Sechium (Heyne, 1987).

2. Nama lain

Sumatera (Melayu) : Labu Siem

Jawa Barat (Sunda) : Gambas, Waluh Siam

Jawa Tengah : Labu Jipang, Waluh Jipang


7

Jawa Timur : Manisah

Nama internasional : chayote atau chajota (Depkes RI a, 2000).

3. Morfologi tanaman

Habistus labu siam berupa perdu dan merambat. Batangnya lunak,

beralur, banyak cabang, terdapat pembelit berbentuk spiral, kasap, dan berwarna

hijau. Daunnya tunggal, tepi bertoreh, ujung meruncing, kasap, panjang 4-25 cm,

lebar 3-20 cm, tangkai panjang, pertulangan menjari, dan berwarna hijau. Bunga

merupakan bunga majemuk, berada di ketiak daun, kelopak bertaju lima, mahkota

beralur, benang sari lima, kepala sari berwarna jingga, putik satu. Buah berbentuk

lonjong, menggantung, permukaan berlekuk, dan berwarna hijau keputihan. Biji

berbentuk pipih, berkeping dua, dan berwarna putih. Akar berupa akar tunggang,

dan putih kecoklatan (Backer and van den Brink, 1968).

4. Deskripsi tanaman

Tanaman labu siam bersifat merambat dengan alat yang berbentuk pilin.

Tanaman ini berbatang panjang, lebih kuat dari mentimun dan bersifat tahunan.

Batang tanamannya kecil tetapi sangat panjang. Buahnya berbentuk bola lampu

dan beraluralur sebanyak 5-20 buah. Buahnya lunak (berdaging) dan banyak

mengandung air (Sunarjono, 2006). Kulit buah tipis dengan daging yang tebal.

Bila dikupas kandungan getahnya keluar. Oleh karena itu, perlu direndam

sebentar dalam air sebelum dimasak. Ada juga yang merebus labu siam muda

langsung beserta kulitnya untuk dijadikan lalap (Nazaruddin, 1998). Pada


8

permukaan buahnya tumbuh bulu-bulu yang tajam dan jarang seperti duri

(Sunarjono, 2006).

Labu siam dapat ditanam di dataran rendah maupun dataran tinggi.

Tempat yang berhawa sejuk, pegunungan paling disukai oleh tanaman tersebut. Di

dataran rendah labu siam sebaiknya ditanam di pinggir-pinggir kolam. Tanaman

tersebutdirambatkan pada para-para di atas kolam karena tempat tersebut lembap

(Sunarjono, 2006).

Labu siam berasal dari Amerika Tengah dan telah beradaptasi pada

daerah tropika serta daerah subtropika yang bebas embun beku. Tanaman ini

paling luas diusahakan di Amerika Tengah, Hindia Barat dan telah dimasukan ke

Malawi, Thailand, Filipina, dan menjadi sayuran penting di beberapa bagian dari

Hindia dan Asia. Akar buah labu siam yang berdaging juga dapat dimakan

(Ronoprawiro, 1993).

5. Kandungan kimia

Buah labu siam mengandung saponin, alkaloid, tanin, polifenol, antiosin,

dan flavonoid (Andrade-Cetto dan Heinrich (cit., Khikmawati, 2009).

Penelitian Marliana, Suryanti, Suyono (2005) yang melakukan penapisan

fitokimia pada ekstrak etanol labu siam dan menghasilkan bahwa ekstrak etanol

labu siam mengandung alkaloid, saponin, kardenolin/bufadienol, dan flavonoid.

Dari penelitian Melo, et al. (2006), menghasilkan bahwa daging buah labu siam

mengandung fenolat sebesar 5,93 ± 0,31 mg katekin/100 g labu siam basah, tanin


9

terkondensasi 75,73 ± 3,25 mg proantosianidin/100 g labu siam basah, dan

flavonoid 1,92 ± 0,09 mg kuersetin /100 g labu siam basah.

6. Kegunaan labu siam

Labu siam memiliki efek diuretik yang dapat melancarkan buang air

kecil sehingga kelebihan asam urat bisa dikeluarkan. Selain itu juga bisa

menurunkan lemak darah (kolesterol atau trigliserida), mengobati tekanan darah

tinggi, diabetes, dan memperlancar proses pencernaan. Diduga kandungan serat

dalam labu siam dapat memperlancar proses pencernaan. Labu siam juga dapat

menyembuhkan gangguan sariawan, panas dalam, serta menurunkan demam pada

anak-anak karena mengandung banyak air (Ekowahyuni, 2002).

Sifat diuretik dari labu siam dapat menurunkan tekanan darah tinggi

karena melalui urine yang banyak terbuang kandungan garam di dalam darah pun

ikut berkurang. Berkurangnya kadar garam yang bersifat menyerap atau menahan

air ini akan meringankan kerja jantung dalam memompa darah sehingga tekanan

darah akan menurun. Kandungan alkaloidnya berfungsi sebagai vasodilator.

Penderita diabetes melitus juga cocok mengonsumsi labu siam yang telah

dikukus. Kandungan patinya mengenyangkan sehingga penderita diabetes melitus

tak lagi mengonsumsi makanan pokok secara berlebihan (Ekowahyuni, 2002).

Labu siam juga memiliki efek antioksidan dan antimikrobial (Priantono (cit.,

Khikmawati, 2009).


10

7. Penelitian antioksidan

Tri Wahyuni (2009) telah melakukan penelitian terhadap ekstrak metanol

buah labu siam dengan metode metode emulsi-karoten-asam-linoleat yang

dimodifikasi dan diperoleh hasil ekstrak metanol buah labu siam memiliki

aktivitas antioksidan lebih besar dibanding BHT (Butil Hidroksi Toluen) dan tidak

beda nyata dengan aktivitas antioksidan PG (Propil Galat). Golongan senyawa

kimia yang terdapat dalam ekstrak metanol buah labu siam adalah fenolat,

flavonoid, tanin terkondensasi, dan karotenoid.

Ratih Indah Syari Pratiwi (2011) telah melakukan penelitian karakterisasi

simplisia dan uji aktivitas antioksidan ekstrak n-heksana, etil asetat dan etanol

herba labu siam (Sechium Edule Sw) dengan metode DPPH. Dari hasil penelitian

diperoleh bahwa pada ekstrak n-heksana mempunyai nilai IC50 sebesar 156,14

μg/mL, ekstrak etil asetat mempunyai nilai IC50 sebesar 135,15 μg/mL dan ekstrak

etanol mempunyai nilai IC50 sebesar 147,24 μg/mL. Semua ekstrak memiliki

aktivitas antioksidan.

B. Senyawa Fenolik

Senyawa fenolik merupakan sumber antioksidan alami yang aman

digunakan dan merupakan golongan mayoritas senyawa yang bertindak sebagai

antioksidan. Aktivitas antioksidan dari fenolik didapatkan dengan cara mereduksi

radikal bebas sehingga radikal menjadi stabil (Marxen, Vanselow, Lippemeier,

Hitze, Ruser, dan Hansen, 2007). Ketertarikan lain terhadap senyawa fenolik

adalah sifat antioksidannya yang kuat serta toksisitasnya yang rendah dibanding


11

dengan senyawa antioksidan sintesis seperti BHA dan BHT (Caillet, Salmieri,

Lacroix, 2006).

Senyawa fenolik merupakan sekelompok metabolit sekunder yang

mempunyai cincin aromatik yang terikat dengan satu atau lebih substituen gugus

hidroksi (OH) yang terbentuk melalui jalur metabolisme asam sikimat-fenil

propanoid dan jalur aseat-polimalonat. Termasuk dalam kelompok senyawa ini

adalah fenol sederhana, asam fenolat, kumarin, tanin dan flavonoid. Dalam

tananaman, senyawa-senyawa ini biasanya berada dalam bentuk glikosida atau

esternya (Proestos, Sereli, Komaitis, 2006). Golongan yang terbanyak dari

senyawa fenolik adalah flavonoid. Pada umumnya flavonoid larut dalam pelarut

polar (Markham,1988).

Senyawa fenolik dalam suatu sampel secara kualitatif dan kuantitatif

dapat ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah

dengan adanya senyawa yang dapat mereduksi reagen fenol Folin-Ciocalteu, akan

menyebabkan terbentuk senyawa berwarna biru yang proporsional dengan jumlah

senyawa yang dapat mereduksi dan dinyatakan dalam nilai ekuivalen asam galat

(Abdul-Fadl, 1949).

Metode Folin-Ciocalteu pertama kali dikembangkan pada tahun 1927

untuk menganalisis asam amino tirosin. Adanya senyawa fenolik akan dioksidasi

oleh reagen asam fosfomolibdat-tungstat menghasilkan produk senyawa berwarna


12

yang dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum 745-750

nm :

Na2WO4/Na2MoO4 (fenol-MoW11O40)-4

Mo(IV) (kuning) + e- Mo(V) (Biru)

Metode ini sederhana, sensitif, dan teliti. Metode ini terjadi dalam suasana basa

sehingga dalam penentuan kadar fenolik dengan pereaksi Folin-Ciocalteu

digunakan natrium karbonat yang bertujuan untuk membentuk suasana basa

(Prior, Wu, Schaich, 2005).

Gambar 1. Reaksi antara senyawa fenol dengan pereaksi Follin-Ciocalteu(Sambada, 2011)

Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai ekivalen asam galat. Asam

galat (Gambar 2) merupakan asam dengan 3 gugus hidroksi fenolik sehingga


13

dapat digunakan sebagai senyawa baku untuk menetapkan kadar senyawa fenolik

total. Alasan lain penggunaan asam galat sebagai pembanding adalah tersedianya

asam galat dalam kemurnian yang tinggi dan stabil serta harganya yang relatif

lebih murah dibandingkan dengan senyawa standar yang lain (Mongkolsilp,

Pongbupakit, Sae-Lee, Sitthithaworn, 2004).

Gambar 2. Struktur kimia asam galat (Mongkolsilp et al., 2004)

C. Radikal Bebas

Radikal bebas secara sederhana didefinisikan sebagai suatu spesies yang

mampu berada dalam keadaan tersendiri yang memiliki satu atau lebih elektron

tidak berpasangan pada orbit terluarnya. Kehadiran satu atau lebih elektron tidak

berpasangan biasanya menyebabkan radikal bebas sangat mudah tertarik oleh

medan magnet, dan terkadang menyebabkan radikal bebas sangat reaktif,

meskipun reaktivitas kimia radikal bervariasi pada spektrum yang luas (Haliwell

dan Guitteridge, 2000).

Elektron yang tidak berpasangan cenderung untuk membentuk pasangan

dengan menarik elektron dari senyawa lain sehingga terbentuk radikal baru.

Radikal bebas memiliki dua sifat sebagai berikut.

1) Reaktivitas tinggi karena cenderung menarik elektron, dan


14

2) dapat mengubah suatu molekul menjadi suatu radikal lain (Sjabana dan

Bahalwan, 2002).

Tabel I. Contoh beberapa radikal bebas (Haliwell dan Guitteridge,2000)

Nama FormulaAtom hidrogen H∙Triklorometil CCl∙

3

Superoksid O.2

Hidroksil OH∙Tiol/pertiol RS∙Peroksil,alkoksil RO∙Oksida nitrogen NO∙Radikal nitrogen C6H5N=N∙

Elektron dari radikal bebas yang tidak berpasangan ini sangat mudah

menarik elektron dari molekul lainnya sehingga radikal bebas tersebut menjadi

lebih reaktif. Oleh karena sangat reaktif, radikal bebas sangat mudah menyerang

sel-sel yang sehat di dalam tubuh. Bila tidak ada pertahanan yang cukup optimal

maka sel-sel sehat tersebut menjadi tidak sehat atau sakit (Hernani dan Rahardjo,

2005).

Teori modern dari ROS (Reactive Oxygen Species) menyatakan bahwa

ROS memainkan peran ganda. ROS tidak hanya berhubungan dengan peroksidasi

lipid yang menyebabkan kerusakan pada makanan, tetapi juga menyebabkan

berbagai macam penyakit seperti proses penuaan sel, mutagenesis, karsinogenis,

penyakit jantung, diabetes, dan neurodegenerasi (Zou, Lu, Wei, 2004).


15

Secara umum, pembentukan radikal peroksi yang akan menyerang asam

lemak adalah sebagai berikut.

1. Tahap inisiasi

Tahap inisiasi merupakan awal pembentukan radikal asam lemak, reaksinya

sebagai berikut :

RH R* + H*

2. Tahap propagasi

Tahap propagasi merupakan pemanjangan rantai radikal, radikal asam lemak akan

bereaksi dengan oksigen membentuk radikal peroksi.

R* + O2 ROO*

ROO* + RH ROOH +R*

3. Tahap terminasi

Tahap terminasi merupakan bereaksinya radikal dengan radikal lain membentuk

molekul yang stabil. Reaksinya sebagai berikut :

ROO* +ROO* non radikal

R* + ROO* non radikal

R* + R* non radikal

(Winarsi, 2007).


16

Radikal bebas, khususnya radikal hidroksil dapat merusak tiga senyawa

yang merupakan penyusun makhluk hidup, yaitu :

1. Asam lemak, khususnya asam lemak tak jenuh yang merupakan komponen

penting fosfolipid yang menyusun membran sel.

2. DNA, yang merupakan perangkat gengetik sel.

3. Protein yang memegang peranan penting seperti enzim, reseptor, antibodi, dan

sitoskeleton (Sjabana dan Bahalwan, 2002).

Target utama radikal bebas adalah protein, asam lemak tak jenuh dan

lipoprotein, serta unsur DNA termasuk karbohidrat. Senyawa radikal bebas bebas

di dalam tubuh dapat merusak asam lemak tak jenuh ganda pada membran sel

sehingga dinding sel menjadi rapuh, merusak basa DNA sehingga mengacaukan

sistem genetika selanjutnya terjadi pembentukan sel kanker (Winarsi, 2007).

Oksidan dan radikal bebas memiliki sifat-sifat yang mirip dan

menghasilkan akibat yang sama meskipun melalui proses yang berbeda. Inilah

yang menyebabkan pengertian keduanya menjadi sering rancu. Oksidan adalah

senyawa yang dapat menarik atau menerima elektron. Sifat radikal bebas yang

mirip dengan oksidan terletak pada kecenderungannya untuk menarik elektron.

Sama halnya dengan oksidan, radikal bebas adalah juga penerima elektron,

sehingga radikal bebas digolongkan dalam oksidan, tetapi tidak semua oksidan

adalah radikal bebas (Sjabana dan Bahalwan, 2002).


17

D. Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang dapat mengikat radikal bebas,

akibatnya kerusakan sel dapat dihambat (Winarsi, 2007). Antioksidan dapat

menghambat ROS (Reactive Oxygen Species) dan radikal bebas lainnya sehingga

antioksidan dapat mencegah penyakit-penyakit yang dihubungkan dengan radikal

bebas seperti karsinogenesis, kardiovaskuler, dan penuaan (Halliwell dan

Gutteridge, 2000).

Tubuh memiliki sistem pertahanan internal terhadap radikal bebas. Sistem

pertahanan tersebut dapat dikelompokkan menjadi tiga golongan sebagai berikut.

1) Antioksidan primer, yaitu antioksidan yang dapat menghalangi pembentukan

radikal bebas baru. Yang termasuk dalam golongan ini adalah superoksida

dismutase (SOD) dan katalase. SOD akan mengkatalisis dismutasi radikal

anion superoksida menjadi oksigen dan hidrogen peroksida, sedangkan

katalase akan mengubah hidrogen peroksida menjadi oksigen dan air ( Niki et

al., 1995 cit Hertiani, 2000).

2) Antioksidan sekunder atau penangkap radikal (radical scavenger), yaitu

antioksidan yang dapat menekan terjadinya reaksi rantai baik pada awal

pembentukan rantai maupun pada fase elongasi ( Niki et al., 1995 cit Hertiani,

2000).

3) Antioksidan tersier, yaitu antioksidan yang memperbaiki kerusakan-kerusakan

yang telah terjadi, yang termasuk golongan ini adalah enzim yang memperbaiki

DNA dan metionin sulfoksida reduktase ( Niki et al., 1995 cit Hertiani, 2000).


18

Sumber antioksidan dalam sistem biologi, yaitu :

a) Enzim (superoksid dismutase, glutation peroksidase dan katalase),

b) molekul besar (albumin, seruloplasmin, ferritrin dan protein lain),

c) molekul kecil (asam askorbat, glutation, asam urat, tokoferol, karetenoid, dan

polifenol), dan

d) hormon (estrogen, angiotensin, melatonin) (Prior et al., 2005).

Menurut sumbernya, antioksidan dapat digolongkan menjadi dua macam,

yaitu antioksidan sintetik dan alami. Antioksidan sintetik merupakan antioksidan

yang dibuat melalui sintesis secara kimia sedangkan antioksidan alami merupakan

antioksidan yang diproduksi langsung oleh tumbuhan maupun tubuh (Gulcin,

Uguz, Oktay, Beydemir, dan Kufrevioglu, 2004).

Beberapa senyawa antioksidan sintetik yang sering digunakan untuk

memperlambat oksidasi lipid dalam makanan adalah senyawa-senyawa fenolik

seperti ter-butil hidroksi anisol (BHA), ter-butil hidroksi toluen (BHT), propil

galat (PG) dan ter-butil hidrokuinon (TBHQ) (Pokorny, Yanishlieva, Gordon,

2001). Menurut penelitian, penggunaan antioksidan sintetik dalam jumlah tinggi

dapat mengakibatkan timbulnya kanker di sekitar lambung pada tikus dan tupai.

Sejumlah penelitian yang lain mengatakan bahwa pemberian BHA akan

mengakibatkan alergi pada sejumlah orang karena terganggunya kesetimbangan

metabolisme lemak yang terdapat dalam tubuh (Yuliarti, 2007).

Antioksidan sintetis mempunyai efektifitas yang tinggi, namun kurang

aman bagi kesehatan sehingga penggunaannya diawasi dengan ketat di berbagai


19

negara. Oleh karena itu, perlu dicari sumber antioksidan alami yang lebih aman

daripada antioksidan sintetis untuk dikembangkan. Antioksidan alami bisa berasal

dari rempah-rempah, buah atau tanaman (Pujimulyani, 2003).

Gambar 3. Struktur kimia beberapa antioksidan sintetik (Pokornyet al., 2001)

Sekarang ini, banyak perhatian terarah pada antioksidan alami terutama

senyawa fenolik yang mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi (Zin, Hamid,

Osman, Saari, 2004).

Efek antioksidan mengacu pada seyawa fenolik, seperti flavonoid, asam

fenolat dan diterpen fenolik. Senyawa-senyawa polifenol mampu menghambat

autooksidasi melalui mekanisme penangkapan radikal dengan cara

menyumbangkan satu elektron yang tidak berpasangan dalam radikal bebas

sehingga banyaknya radikal bebas menjadi berkurang (Pokorny et al.,2001).

Setelah bereaksi dengan radikal bebas dan menyumbangkan satu

elektronnya antioksidan akan membentuk radikal antioksidan namun radikal

antioksidan ini bersifat tidak reaktif karena distabilkan oleh cincin fenolik

(Pokorny et al.,2001).


20

Gambar 4. Mekanisme pembentukan radikal antioksidan (Sihombing, 2011)

Aktivitas senyawa polifenol sebagai antioksidan meliputi tiga

mekanisme, yaitu :

a. Aktivitas penangkapan radikal bebas dengan proses transfer elektron,

b. mencegah spesies senyawa reaktif memproduksi katalisis melalui reaksi

pengkelatan logam, dan

c. interaksi dengan antioksidan lain untuk meningkatkan aktivitasnya (Winarsi,

2007).

Mekanisme lain yang sering terjadi adalah menghambat peruraian

hidroperoksidase menjadi radikal bebas. Hidroperoksidase yang berasal dari lipid

dapat terurai menjadi membentuk radikal bebas peroksil dan hidroksil dengan

katalis logam berat. Karena itu, senyawa-senyawa yang dapat mengkelat logam

juga termasuk dalam antioksidan. Beberapa senyawa disebut sebagai sinergis

karena senyawa tersebut dengan sendirinya tidak mempunyai aktivitas antioksidan

akan tetapi senyawa tersebut dapat meningkatkan aktivitas antioksidan senyawa

lain (Pokorny et al., 2001).


21

Suatu epidemologi menunjukkan bahwa dengan mengkonsumsi sayuran

dan buah-buahan dapat melindungi tubuh melawan kerusakan oksidatif dengan

menghambat atau meredam radikal bebas. Hal ini disebabkan karena kandungan

senyawa-senyawa yang mampu menangkap radikal bebas seperti polifenol (Zin et

al., 2004).

E. Pengukuran Aktivitas Antioksidan

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan baik secara kualitatif

maupun kuantitatif. Uji kualitatif dilakukan untuk mengetahui apakah suatu

senyawa memiliki aktivitas antioksidan atau tidak, yang dapat dilakukan dengan

kromatografi kertas atau kromatografi lapis tipis. Uji kuantitatif dilakukan untuk

mengetahui seberapa besar kemampuan suatu senyawa tersebut sebagai

antioksidan (Pokorny et al., 2001). Secara kuantitatif, terdapat beberapa metode

untuk mengetahui aktivitas suatu senyawa sebagai antioksidan yang diantaranya :

1. Pengujian penangkapan radikal

Pengujian dengan cara ini dilakukan dengan mengukur penangkapan radikal

sintetik dalam pelarut polar seperti metanol atau etanol pada suhu kamar. Radikal

sintetik yang biasa digunakan adalah DPPH (2,2-difenil-1-pikril hidrazil) dan 2

(2,2’-azinobis(3-etil benztiazolin-asam sulfonat)). Dengan uji ini, penangkapan

radikal DPPH oleh suatu senyawa diikuti dengan penurunan absorbansi pada

517nm yang terjadi karena reduksi radikal tersebut oleh antioksidan menurut

reaksi :


22

DPPH∙+ AH DPPH-H + A

∙

DPPH∙+ R

∙DPPH-R

(Pokorny et al., 2001).

2. Pengujian aktivitas antioksidan dengan sistem linoleat-tiosianat

Asam linoleat merupakan asam lemak tak jenuh dengan dua buah ikatan rangkap

yang mudah mengalami oksidasi membentuk peroksida. Peroksida ini selanjutnya

mengoksidasi ion fero menjadi ion feri. Ion feri bereaksi dengan amonium

tiosianat membentuk kompleks feri-tiosianat (Fe(CNS)3) yang berwarna merah.

Intensitas warna merah ini diukur absorbansinya pada panjang gelombang 490

nm. Semakin intens warna merahnya menunjukkan bahwa semakin banyak

peroksida yang terbentuk (Pokorny et al., 2001).

3. Pengujian dengan asam tiobarbiturat atau TBA (Thio Barbituric Acid)

Pengujian ini berdasarkan adanya malonaldehid yang terbentuk dari asam lemak

bebas tidak jenuh dengan paling sedikit mempunyai tiga ikatan rangkap dua.

Malonaldehid selanjutnya bereaksi dengan asam tiobarbiturat membentuk produk

kromogen yang berwarna merah yang dapat diukur absorbansinya pada panjang

gelombang 532 nm (Pokorny et al., 2001).

4. Pengujian dengan sistem β-karoten-linoleat

Pengujian ini dilakukan dengan mengamati kecepatan terjadinya pemucatan

warna β-karoten (Pokorny et al., 2001).

Selain dengan keempat metode diaatas, antioksidan dapat ditentukan

dengan bilangan peroksidase, bilangan para-anisidin, dan dengan bilangan

oktanoat (Pokorny et al., 2001).


23

F. Metode DPPH

Salah satu uji untuk menentukan aktivitas antioksidan penangkap radikal

adalah metode 1,1 Diphenyl-2-picrylhidrazyl (DPPH). Metode DPPH

memberikan informasi reaktivitas senyawa yang diuji dengan suatu radikal stabil.

DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna

violet gelap. Penangkap radikal bebas menyebabkan elektron menjadi

berpasangan yang kemudian menyebabkan penghilangan warna yang sebanding

dengan jumlah elektron yang diambil (Sunarni, 2005).

Reaksi reduksi DPPH dapat dilihat sebagai berikut.

Gambar 5. Reaksi reduksi DPPH (Prakash, Rigelhof, Miller, 2001)

Aktivitas antioksidan merupakan kemampuan suatu senyawa atau ekstrak

untuk menghambat reaksi oksidasi yang dapat dinyatakan dengan persen

penghambatan. Parameter yang dipakai untuk menunjukan aktivitas antioksidan

adalah harga konsentrasi efisien atau efficient concentration (EC50) atau Inhibition

Concentration (IC50), yaitu konsentrasi suatu zat antioksidan yang dapat

menyebabkan 50% DPPH kehilangan karakter radikal atau konsentrasi suatu zat

antioksidan yang memberikan % penghambatan 50% ( Molyneux, 2004 ).


24

Metode DPPH memiliki kelebihan antara lain yaitu mudah digunakan,

mempunyai tingkat sensitifitas yang tinggi, dan dapat menganalisis sejumlah

besar sampel dalam jangka waktu yang singkat (Kim, Lee.K, Lee.H, Lee.C,

2002).

Tabel.II. Kekuatan antioksidan dengan metode DPPH (Ariyanto cit.Sambada, 2011)

Intensitas Nilai IC50Sangat kuat < 50 µg/mlKuat 50-100 µg/mlSedang 101-150 µg/mlLemah >150 µg/ml

G. Ekstraksi

Ekstrak merupakan sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi

senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut

yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau

serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah

ditetapkan (Depkes RI b, 2000).

Ekstraksi merupakan kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat

larut dalam pelarut cair sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut.

Senyawa aktif yang terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkan ke

dalam minyak atsiri, alkaloid, flavonoid dan lain-lain. Struktur kimia yang

berbeda-beda akan mempengaruhi kelarutan serta stabilitas senyawa-senyawa

tersebut terhadap pemanasan, udara, cahaya, logam berat, dan derajat keasaman

(Depkes RI b, 2000).


25

Ada beberapa metode ekstraksi yang sering digunakan, antara lain :

maserasi, perkolasi, sokletasi dan infundasi. Maserasi adalah proses ekstraksi

simplisia menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau

pengadukan pada temperatur kamar. Secara teknologi, maserasi termasuk

ekstraksi dengan prinsip pencapaian konsentrasi pada keseimbangan (Depkes RI

b, 2000).

Maserasi merupakan proses yang paling tepat yang mana obat yang

sudah halus memungkinkan untuk direndam dengan pelarut sampai meresap dan

melunakkan susunan sel, sehingga zat-zat yang mudah larut akan melarut. Dalam

proses maserasi, bahan biasanya ditempatkan dalam wadah/bejana bermulut lebar.

Bersama pelarut yang sudah ditetapkan, bejana ditutup rapat, dan isinya dikocok

berulang-ulang selama 2-14 hari. Pengocokan memungkinkan pelarut mengalir

nerulang-ulang ke seluruh permukaan dari bahan yang sudah halus (Ansel, 1989).

Beberapa modifikasi dapat dilakukan pada metode maserasi, yakni:

1. Digesti, merupakan maserasi dengan pemanasan lemah pada suhu 400-500C.

Maserasi seperti ini hanya digunakan untuk zat aktif yang tahan terhadap

pemanasan.

2. Maserasi dengan mesin pengaduk. Adanya penggunaan mesin pengaduk yang

berputar terus-menerus dapat mempersingkat waktu maserasi terjadi 6-24 jam.

3. Remaserasi, merupakan maserasi dengan cairan penyari yang ada dua. Serbuk

simplisia dimaserasi dengan cairan pertama, dienapkan tuangkan dan diperas,

kemudia dimaserasi kembali dengan cairan yang kedua.


26

4. Maserasi melingkar, merupakan proses maserasi dengan cairan penyari yang

selalu bergerak dan menyebar, dengan demikian proses maserasi akan menjadi

lebih baik. Cairan penyari dipompa dari bawah bejana penyari, melalui pipa

penghubung dan kemudian masuk kembali ke bejana penyari dengan cara

diemburkan oleh alat penyembur ke permukaan serbuk simplisia. Proses tersebut

dilakukan secara berulang hingga cairan penyari menjadi jenuh oleh zat aktif

(Ansel, 1989).

Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai

sempurna (exhausted etraction) yang umumnya dilakukan pada temperatur

ruangan. Proses ini terdiri atas tiga tahap yaitu pengembangan bahan, tahap

maserasi antara dan tahap perkolasi sebenarnya yang berupa penetesan dan

penampunga ekstrak (Depkes RI b, 2000).

Soxhletasi adalah ekstraksi dengan menggunakan alat khusus yang mana

pelarut yang digunakan untuk menyari selalu baru sehingga ekstraksi yang

kontinyu dapat terjadi. Pelarut yang selalu baru tersebut didapat dengan

menguapkan pelarut yang ada dan diembunkan kembali oleh pendingin balik

(Depkes RI b, 2000).

Infusa adalah sediaan cair yang dibuat dengan mengekstraksi simplisia

nabati dengan air pada suhu 900C selama 15 menit. Prinsip kerja infundasi adalah

simplisia dengan derajat halus yang sesuai dalam panci secukupnya, dipanaskan di

atas tangas air selama 15 menit, terhitung mulai suhu mencapai 900C sambil

sekali-kali diaduk, diserkai selagi panas melalui kain flanel, ditambah air panas


27

secukupnya melalui ampas sehingga diperoleh volume infus yang dikehendaki

(jika tidak dinyatakan lain, dibuat infusa 10%) (Depkes RI b, 2000).

Flavonoid merupakan senyawa fenolik terbanyak yang terdapat di dalam

tumbuhan. Untuk menganalisis flavonoid lebih ideal menggunakan tumbuhan

yang segar meskipun pada simplisia kering yang disimpan dengan hati-hati

selama bertahun-tahun masih mungkin memberikan hasil yang bagus. Namun,

dalam bahan yang sudah dikeringkan dan disimpan dalam waktu yang lama,

terdapat kecenderungan glikosida diubah menjadi bentuk aglikonnya oleh fungi,

dan aglikon ini mudah teroksidasi oleh adanya cahaya maupun udara (Markham,

1988).

H. Spektrofotometer Visibel

Apabila cahaya mengenai suatu senyawa, maka sebagian dari cahaya

tersebut akan diserap oleh molekul-molekul sesuai dengan struktur molekul.

Apabila besarnya perbedaan energi antara keadaan tingkat dasar dengan keadaan

tereksitasi suatu senyawa dengan besarnya energi cahaya yang mengenainya

sama, maka elektron-elektron pada keadaan dasar akan tereksitasi ke tingka energi

eksitasi dan sebagian energi cahaya yang sesuai dengan panjang gelombang ini

diserap. Perbedaan energi antara tingkat dasar dan tingkat tereksitasi untuk setiap

senyawa besarnya berbeda-beda sehingga frekuensi yang diserap juga akan

spesifik untuk tiap-tiap senyawa (Sastrohamidjodjo, 1991).


28

Instrumen yang digunakan untuk mempelajari serapan atau emisi radiasi

elektromagnetik sebagai fungsi dari panjang gelombang disebut spektrometer atau

spektrofotometer. Cara kerja spektrofotometer UV-Vis sebagai berikut.

a. Sinar dari sumber radiasi diteruskan menuju monokromator,

b. monokromator sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah cahaya

yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monokromatis,

c. cahaya monokromatis kemudian dilewatkan pada sampel. Digunakan kuvet

untuk meletakkan sampel, kuvet biasa terbuat dari gelas atau kuarsa transparan,

d. detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan

mengubahnya menjadi arus listrik, dan

e. meter/pencatat akan menangkap besarnya isyarat listrik yang berasal dari

detektor (Sastrohamidjodjo, 2001).

Gambar 6. Diagram Spektrofotometer UV-Vis (Sastrohamidjodjo, 2001)

Senyawa yang mempunyai gugus kromofor apabila mengalami interaksi

denga radiasi elektromagnetik pada daerah UV-Vis (200-800 nm) maka akan

menghasilkan transisi elektromagnetik dan spektra absorbansi elektromagnetik.

Spektra absorbansi tersebut dapat digunakan untuk analisis kuantitatif

dikarenakan jumlah radiasi elektromagnetik yang diserap sebanding dengan

jumlah molekul penyerapnya. Spektrum UV mempunyai absorbansi antara 100-

400 nm, sedangkan spektrum visibel atau tampak mempunyai absorbansi antara

400-800 nm (Fessenden dan Fesenden, 1995).

Sumberradiasi

Monokromator

Meter/pencatat

DetektorSelpenyerap


29

Panjang gelombang cahaya UV atau tampak yang diserap oleh suatu

senyawa tergantung pada kemudahan promosi elektron. Molekul-molekul akan

menyerap pada panjang gelombang yang lebih pendek apabila molekul tersebut

membutuhkan lebih banyak energi untuk promosi elektron (Fessenden dan

Fesenden, 1995).

Atom gugus fungsional seperti OH, NH2, Cl yang memiliki elektron

tidak berpasangan (non bonding) tidak menunjukkan absorbsi sendiri, tetapi dapat

mempengaruhi intensitas suatu pita absorbsi atau panjang gelombang dari suatu

kromofor. Gugus-gugus ini disebut sebagai auksokrom. Apabila intensitas

absorbsi meningkat maka dinamakan efek hiperkromik, sedangkan bila intensitas

absorbsi menurun dinamakan efek hipokromik. Apabila yang berubah panjang

gelombangnya maka dapat terjadi pergeseran hipsokromik yaitu pergeseran ke

arah panjang gelombang yang lebih pendek atau pergeseran batokromik, yaitu

pergeseran ke arah pajang gelombang yang lebih panjang (Sastrohamidjojo,

1991).

I. Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis merupakan ukuran untuk membuktikan bahwa

metode yang digunakan memberikan hasil seperti yang diharapkan dengan

kecermatan dan ketelitian yang memadai (Mulja dan Hanwar, 2003).

Parameter validasi metode analisis antara lain adalah akurasi, presisi dan

linearitas. Akurasi suatu metode merupakan keterdekatan nilai pengukuran dengan

nilai sebenarnya dari analit dalam sampel (Mulja dan Hanwar, 2003).


30

Tabel III. Rentang akurasi yang dapat diterima (Harmita, 2004)

Analit pada matriksampel

Rata-rata yangdiperoleh (%)

100 98-102>10 98-102>1 97-103

>0,1 95-1050,01 90-1070,001 90-107

0,000.1(1 ppm) 80-1100,000.01(100 ppb) 80-1100,000.001(10 ppb) 60-1150,000.000.1(1ppb) 40-120

Presisi suatu metode analisis merupakan sejumlah pancaran hasil yang

diperoleh dari analisis berulangkali pada suatu sampel homogen. Presisi

dinyatakan dalam standar deviasi atau koefisien variasi (Mulja dan Hanwar,

2003).

Tabel IV. Rentang CV yang masih dapat diterima (Harmita, 2004)

Analit pada matriksampel (%)

KV (%)

>1 2,50,001 5

0,000.1 (1ppm) 160,0000.000.1 (1ppb) 32

Linieritas pada suatu metode analisis dari suatu prosedur analisis

merupakan kemampuannya untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung

proporsional dengan konsentrasi (jumlah) analit di dalam sampel. Persyaratan data

linieritas yang bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien korelasi ( r ) > 0,999

(Mulja dan Hanwar, 2003).


31

Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode untuk mengukur dengan

akurat respon analit diantara seluruh komponen sampel potensial yang mungkin

ada dalam matriks sampel (Mulja dan Hanwar, 2003).

J. Landasan Teori

Radikal bebas merupakan senyawa yang tidak stabil karena memiliki

elektron yang tidak berpasangan pada kulit terluarnya. Radikal bebas akan

menstabilkan diri dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul di

sekitarnya sehingga dapat menyebabkan kerusakan sel dan selanjutnya akan

menimbulkan berbagai macam penyakit. Oleh karena itu, diperlukan senyawa

antioksidan yang dapat menghambat reaksi oksidasi radikal bebas. Senyawa

fenolik merupakan antioksidan alami yang terdapat pada tumbuhan dan aman

untuk digunakan.

Buah labu siam merupakan sayuran yang telah banyak dikonsumsi oleh

masyarakat Indonesia sebagai makanan sehari-hari. Senyawa fenolik yang

terdapat pada buah labu siam adalah flavonoid.

Senyawa fenol seperti vitamin E dan flavonoid yang terdapat pada

tanaman mampu berfungsi sebagai antioksidan. Flavonoid dapat mendonorkan

atom hidrogen ke radikal bebas sehingga radikal bebas menjadi stabil.

Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan metode DPPH.

DPPH merupakan suatu radikal bebas ketika elektronnya menjadi berpasangan

oleh karena adanya senyawa antioksidan maka akan terjadi peluruhan warna


32

larutan DPPH dari ungu menjadi kuning dan menyebabkan penurunan absorbansi

secara stokiometri yang sesuai dengan jumlah elektron yang diambil .

Kandungan total fenolik ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu.

Dengan adanya senyawa fenolik dalam sampel akan mereduksi reagen fenol

Folin-Ciocalteu sehingga terbentuk larutan berwarna biru dimana intensitas warna

biru yang dihasilkan sebanding dengan kandungan fenolik dalam sampel.

K. Hipotesis

Fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam memiliki aktivitas

antioksidan dinyatakan sebagai IC50 dan memiliki kandungan fenolik yang

dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat.


33

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental karena adanya

perlakuan terhadap senyawa uji.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel

a. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam.

b. Variabel tergantung berupa kemampuan fraksi air ekstrak metanolik daun sirih

untuk menangkap radikal DPPH (%IC).

c. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu

pemanenan, umur buah yang dipanen dan jumLah buah segar yang digunakan.

d. Variabel pengacau tak terkendali berupa cahaya matahari, curah hujan, cuaca,

kelembapan ruangan, dan komposisi senyawa penyusun ekstrak.

2. Definisi operasional

a. Buah labu siam merupakan buah dari tanaman labu siam yang dipetik dari

daerah Sawangan, Kecamatan Muntilan, Kabupaten Magelang

b. Ekstrak buah labu siam adalah ekstrak kental yang diperoleh dari hasil

maserasi dengan metanol.


34

c. DPPH adalah salah satu metode yang digunakan untuk menguji aktivitas

antioksidan. DPPH merupakan suatu radikal bebas yang akan bereaksi dengan

senyawa antioksidan dan menyebabkan terjadinya peluruhan warna DPPH dari

ungu menjadi kuning sehingga absorbansi DPPH akan menurun.

d. Persen inhibition concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan

kemampuan fraksi air ekstrak metanolik daun sirih untuk menangkap radikal

DPPH.

e. IC50 adalah nilai konsentrasi fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam yang

menghasilkan penangkapan 50% radikal DPPH.

C. Bahan Penelitian

Bahan tanaman yang digunakan adalah buah labu siam yang diperoleh

dari daerah Sawangan, Kecamatan Muntilan, Kabupaten Magelang. Bahan kimia

farmasetis (CV. General Labora) berupa metanol dan akuades. Bahan kimia pro

analitik (E.Merck) berupa metanol, silika G254, n-butanol, asam asetat glasial.

Bahan kualitas pro analitik (Sigma) berupa rutin, DPPH, asam galat, Folin-

Ciocalteu, DMSO. Bahan kualitas teknis Brataco Chemica berupa wash bensin

aluminium foil dan etilasetat.


35

D. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa vortex (Junke &

Kunkel), spektrofotometer UV-VIS (Perkin Elmer Lamda 20), blender, corong,

Buchner, oven, mikropipet 10-1000 µL; 1-10 mL (Acura 825, Socorex), neraca

analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P), vacuum rotary evaporator (Junke &

Kunkel), waterbath (Labo-tech, Heraceus), tabung reaksi bertutup, dan alat-alat

gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki).

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Determinasi sampel buah labu siam yang digunakan berdasarkan

pengamatan ciri morfologinya dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2.Pembuatan ekstrak metanol dan fraksi air buah labu siam

Buah labu siam diperoleh dari daerah Sawangan, Kecamatan Muntilan,

Kabupaten Magelang. Buah labu siam dicuci dan dibersihkan kemudian dikupas

kulitnya, dibuang bijinya kemudian diblender dan dimaserasi dengan pelarut

metanol. Maserasi diulangi sebanyak 3 kali. Maserasi yang pertama dilakukan

selama 2 x 24 jam, kemudian disaring dengan penyaring Buchner sehingga

diperoleh filtrat dan ampas. Ampas dimaserasi lagi selama 1 x 24 jam. Ampas

yang didapat dimaserasi kembali selama 1 x 24 jam. Kemudian filtrat digabung


36

dan diuapkan pelarutnya dengan rotary evaporator sampai tidak ada pelarut yang

menetes lagi.

Ekstrak kental metanol yag diperoleh ditambahkam dengan air hangat

sebanyak 300 mL dan dipartisi dengan wash bensin dengan perbandingan pelarut

1:1 v/v, kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna. Fase air akan berada

pada paling bawah, sedangkan fase wasbensin berada pada bagian atas.

Selanjutnya, fase air dipisahkan dan dipartisi lagi dengan etilasetat dengan

perbandingan pelarut 1:1 v/v. Setelah dipisahkan fraksi air diuapkan dengan

vacum rotary evaporator. Lalu hasil fraksi tersebut digunakan analisis lebih

lanjut.

3.Uji Pendahuluan

a. Uji fenolik, sejumlah 0,5 mL larutan uji 750,0 µg/mL dan larutan

pembanding asam galat 150,0 µg/mL ditambahkan 2,5 mL pereaksi fenol Folin-

Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v) kedalam tabung

reaksi. Diamkan selama 10 menit. Tambahkan 7,5 mL larutan natrium karbonat 1

M. Kemudian amati warna larutan tersebut.

b.Uji pendahuluan aktivitas antioksidan, sebanyak 1 mL larutan DPPH

dimasukan ke dalam masing-masing tiga tabung reaksi. Ditambahkan masing-

masing dengan 1 mL metanol p.a, larutan pembanding rutin 37,5 μg/mL , dan

larutan uji 200,0 μg/mL. Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan 3 mL

metanol p.a. Larutan tersebut kemudian divortex selamam 30 detik. Setelah 30

menit, amati warna pada larutan tersebut.


37

4.Penentuan aktivitas antioksidan fraksi etil asetat dengan metode DPPH

a. Pembuatan larutan DPPH, sebanyak 15,7 mg DPPH dilarutkan ke

dalam metanol p.a sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM.

Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.

b.Pembuatan larutan stok rutin, sebanyak 2,5 mg rutin dilarutkan dengan

metanol p.a sampai 10,0 mL.

c. Pembuatan larutan standar rutin, diambil sebanyak 0,5; 1,0; 1,5; 2,5;

3,0 mL larutan stok rutin, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL,

sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar rutin sebesar 12,5; 25,0; 37,5; 50,0;

dan 62,5 μg/mL.

d. Pembuatan larutan uji, sejumlah 25,0 mg fraksi air ditimbang dan di ad

metanol p.a sampai 25,0 mL. Diambil sebanyak 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 mL larutan

tersebut, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh

konsentrasi larutan uji sebesar 100; 150; 200; 250; 300 μg/mL.

e. Penentuan operating time, sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukan

kedalam masing-masing tiga labu ukur 10 mL, ditambahkan masing-masing

dengan 2 mL larutan pembanding rutin 12,5; 37,5 dan 62,5 μg/mL. Selanjutnya,

larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan

tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya

denga spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 517 nm selama 1 jam.

Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 100; 200; 300 μg/mL.


38

f. Penentuan panjang gelombang maksimum, pada 3 labu ukur 10 mL,

dimasukan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mL larutan DPPH. Ditambahkan larutan

tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH

menjadi 0,020; 0,040; dan 0,080 mM. Larutan tersebut kemudian divortex selama

30 detik. Diamkan selama OT. Lalu dilakukan scanning panjang gelombang

serapan maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang

400-600 nm.

g. Penentuan aktivitas antioksidan

(i). Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol) , pada labu ukur 10

mL, dimasukan sebanyak 2 mL larutan DPPH. Ditambahan larutan tersebut

dengan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca

absorbansinya pada saat OT dan panjang gelomabang maksimum. Pengerjaan

dilakukan sebanyak 5 kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji

larutan pembanding dan uji.

(ii). Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji, sebanyak 2 mL

larutan DPPH dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup kemudian ditambah

dengan 2 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai seri konsentrasi telah

dibuat. Selanjutnya, larutan tersebut ditambah dengan metanol p.a hingga tanda

batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan diamkan selama

OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang

gelombang maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakukan dengan lima kali

replikasi.


39

h. Validasi metode uji aktivitas antioksidan, hasil dari proedur 4g (i)

dan (ii) divalidasi akurasi (% recovery), presisi (%CV) spesifisitas (spektra

kontrol), dan linearitas (nilai r).

% Recovery =

% CV = x 100%

i. Estimasi aktivitas antioksidan, hasil dari prosedur 4g (i) dan (ii)

dihitung nilai % IC dan IC50 untuk rutin dan fraksi air ekstrak metanolik buah

labu siam.

5. Penentuan kandungan fenolat total

Kandungan fenolik total ditentukan dengan menggunakan metode

spektrofotometri sesuai dengan penelitian Nusarini ( 2007). Langkah kerjanya

meliputi dua tahap, yakni:

a. Pembuatan kurva baku asam galat, dibuat larutan asam galat dengan

konsetrasi 500 µg/mL dalam akuades : methanol p.a (1:1). Diambil sebanyak 0,5 ;

1; 1,5; 2; dan 2,5 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan akuades : methanol

p.a (1:1) sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat

sebesar 25; 50; 75 ; 100 ; dan 125 µg/mL.

b. Pembuatan larutan uji, sejumlah 10,0 mg fraksi air ditimbang dan di

ad metanol p.a sampai 10,0 mL.

c. Penentuan Operating time, sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 25; 75;

dan 125 μg/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah

diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0


40

mL natrium karbonat 1 M. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan

spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit.

d. Penentuan panjang gelombang maksimum, sebanyak 0,5 mL larutan

asam galat 25; 75; dan 125 μg/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-

Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:1 v/v). Larutan selanjutnya

ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Diamkan selama OT,

absorbansinya dibaca pada λ maksimum dengan spektrofotometer visibel pada

panjang gelombang 600-800 nm.

e. Pengukuran absorbansi larutan asam galat, sebanyak 0,5 mL larutan

asam galat 25; 50; 75; 100 dan 125 μg/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen

Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya

ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Diamkan selama OT,

absorbansinya dibaca pada λ maksimum dengan spektrofotometer visibel.

Dilakukan 5 kali replikasi.

f. Validasi metode penetapan kandungan fenolat total, hasil prosedur

5e divalidasi akurasi (% recovery), presisi (%CV) spesipisitas (spektra kontrol),

dan linearitas (nilai r).

% Recovery =

% CV = x 100%

g. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji, diambil 0,5 mL larutan

uji ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan

dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium

karbonat 1 M. Diamkan selama OT, absorbansinya dibaca pada λ maksimum


41

dengan spektrofotometer visibel. Dilakukan lima kali replikasi. Kandungan

fenolik total dinyatakan sebagai mg ekivalen asam galat dalam setiap per g fraksi.

6.Analisis Hasil

Aktivitas penangkapan radikal DPPH (%) dihitung dengan rumus :

Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 menggunakan

persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun

pembanding sedangkan sumbu y adalah %IC. Lalu dianalisis secara statistik

Mann-Whitney untuk menentukan ada atau tidak adanya perbedaan bermakna

antara IC50 larutan pembanding dan larutan uji.

Uji kandungan fenolisk total menghasilkan nilai mg ekivalen asam galat

dalam setiap per g fraksi. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linier

dengan data kurva baku.


42

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman labu siam dilakukan di Laboratorium Kebun

Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Determinasi ini dilakukan untuk mengetahui kebenaran identitas tanaman yang

akan diuji sehingga kesalahan pengambilan sampel dalam suatu penelitian dapat

dihindari.

Dari hasil determinasi tersebut dapat dinyatakan bahwa sampel buah labu

siam yang digunakan dalam penelitian ini memang benar-benar diambil dari

tanaman labu siam (Sechium edule Squartz) (lampiran 1).

B. Hasil Pengumpulan Bahan

Buah labu siam diperoleh dari daerah Sawangan, Kecamatan Muntilan,

Kabupaten Magelang pada bulan September 2011. Pengambilan bahan dari satu

tempat, hal ini untuk menghindari variasi kandungan senyawa aktif tanaman.

Buah labu siam yang digunakan adalah buah yang masih muda berwarna hijau

dan bagian ujung buah belum mengeluarkan tunas dan terbelah. Buah yang

diperoleh adalah sebesar 1 kg dan masing-masing memiliki ukuran yang

bervariasi. Panjang buah labu siam yang diperoleh antara 10-13 cm.


43

Buah labu siam dipetik pada pagi hari agar senyawa fenolik yang terdapat

pada tanaman belum termetabolisme menjadi bentuk metabolit sekunder lain.

Gambar tanaman dan buah labu siam disajikan pada lampiran 2.

C. Hasil Preparasi Sampel

Preparasi sampel ini dilakukan untuk mendapatkan fraksi air ekstrak

metanol buah labu siam yang diduga dalam fraksi tersebut mengandung senyawa

antioksidan. Sampel yang digunakan merupakan buah labu siam segar. Digunakan

sampel segar karena bertujuan untuk menjaga kestabilan senyawa fenolik di

dalam tanaman karena senyawa fenolik cenderung mengalami perubahan susunan

dengan adanya pengeringan atau pemanasan. Perubahan yang terjadi dapat

menurunkan aktivitas antioksidan dari senyawa fenolik (Markam, 1988)

Alasan lain digunakan sampel segar adalah untuk menjaga stabilitas

senyawa fenolik pada tanaman. Menurut Handayani (2011) proses pengeringan

dapat memicu terjadinya peristiwa browning dan blackening. Peristiwa tersebut

terjadi dipicu oleh reaksi oksidasi akibat adanya pemanasan yang dikatalis oleh

enzim fenol oksidase atau polifenol oksidase sehingga menyebabkan senyawa

fenolik berubah menjadi quinon dan kemudian dipolimerasi menjadi pigmen

melaniadin. Senyawa fenolik dalam bentuk polimer tersebut yang tidak memiliki

aktivitas antioksidan.


44

Buah labu siam segar dihilangkan kulitnya terlebih dahulu kemudian

dicuci untuk menghilangkan getah-getah yang terdapat pada permukaan buah.

Buah labu siam yang telah dikupas harus segera diolah karena untuk menghindari

peristiwa browning pada buah. Ketika buah dikupas atau dipotong, enzim yang

tersimpan di dalam jaringan buah akan terbebas. Apabila enzim tersebut

mengalami kontak dengan oksigen di udara, fenolase akan mengkatalisis konversi

biokimia dari senyawa fenolik yang terdapat pada buah sehingga senyawa fenolik

akan berubah menjadi bentuk polimer yang tidak memiliki aktivitas antioksidan.

Buah labu siam yang telah bersih dipotong kecil-kecil supaya lebih mudah

diblender. Buah labu siam diblender terlebih dahulu untuk memperkecil ukuran

pemukaan agar penyari dapat kontak lebih luas dengan simplisia. Lalu dilakukan

proses maserasi dengan metanol. Dipilih metode ekstraksi dengan maserasi karena

ekstraksi ini tidak melibatkan pemanasan sehingga perubahan-perubahan senyawa

dapat dihindari. Selain itu, proses maserasi sangat menguntungkan untuk isolasi

senyawa bahan alam karena dengan perendaman ekstrak tumbuhan dapat

menyebabkan pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan

antara di dalam dan di luar sel sehingga metabolit sekunder yang ada di dalam

sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan

sempurna.

Metanol dipilih sebagai penyari karena metanol merupakan pelarut

universal dan penetrasinya ke dalam sel-sel tanaman lebih kuat dibanding etanol

maupun cairan penyari yang lain (Depkes RI b, 2000). Hal tersebut dikarenakan

metanol memiliki viskositas yang lebih rendah dibandingkan etanol walaupun


45

keduanya memiliki polaritas yang hampir sama. Metanol memiliki konsistensi

yang lebih encer menyebabkan metanol lebih mudah berdifusi menembus sel-sel

tanaman (Pedricilli, 2001). Selain itu, metanol memiliki presentase OH yang lebih

besar dibandingkan dengan etanol sehingga proses pembasahan bahan dan

ekstraksinya lebih efektif.

Maserasi dilakukan dalam tabung erlenmeyer tertutup agar metanol tidak

menguap karena sifat metanol mudah menguap pada suhu kamar. Selain itu, juga

untuk mencegah masuknya kontaminan dari luar. Tabung erlenmeyer dibungkus

dengan alumunium foil agar tidak terkena cahaya matahari atau sinar matahari

langsung. Hal ini dikarenakan ada beberapa senyawa dapat bereaksi oleh adanya

cahaya dan juga dapat mengalami kerusakan oleh sinar ultraviolet matahari.

Maserasi dilakukan selama 2x24 jam dan dibantu dengan shaker agar

proses maserasi lebih efektif karena penyari lebih banyak kontak langsung dengan

sel-sel dalam buah labu siam dibandingkan jika hanya didiamkan saja.

Penyaringan dilakukan dengan bantuan pompa vakum karena jumlah bahan

banyak sehingga membutuhkan waktu yang lama jika disaring secara biasa.

Ampas yang diperoleh dari hasil penyaringan diremaserasi dengan metanol

selama 1x24 jam kemudian dilakukan penyaringan dengan pompa vakum, filtrat

disimpan dan ampas kembali diremaserasi selama 1x24 jam dengan penyari

metanol. Remaserasi ini bertujuan untuk memaksimalkan proses penyarian agar

diperoleh lebih banyak senyawa fenolik.

Filtrat yang diperoleh dari hasil penyaringan tersebut diupkan pelarutnya

menggunakan vaccum rotary evaporator (rotavapor) pada suhu 400C-500C.


46

Tujuan digunakannya rotavapor agar filtrat metanol yang akan diuapkan

pelarutnya tidak mengalami kontak dengan panas yang berlebihan dengan

demikian, kerusakan senyawa-senyawa kimia yang terkadung dalam filtrat

metanol dapat dihindari.

Rotavapor menggunakan prinsip penguapan dengan pengurangan tekanan.

Suatu cairan akan mendidih jika tekanan uap cairan sama dengan tekanan

atmosfir di sekelilignya. Oleh karena itu, adanya pengurangan tekanan pada alat di

bawah tekanan atmosfir dapat menyebabkan metanol mendidih dibawah titik

didih normalnya (Depkes RI, 1986). Pada penguapan tersebut hampir semua

metanol teruapkan. Sisa metanol dan air yang tertinggal dalam ekstrak kemudian

diuapkan dengan waterbath dan dibantu dengan kipas angin untuk mempercepat

penguapan. Hasil penguapan ini selanjutya disebut ekstrak metanolik buah labu

siam. Hasil ektsrak metanolik buah labu siam yang diperoleh dari proses maserasi

adalah sebesar 64,6 g sehingga diperoleh rendemen ekstrak metanolik sebesar

6,5%.

Setelah didapatkan ekstrak kental metanolik buah labu siam, kemudian

ekstrak dilarutkan dengan air hangat sebanyak 300 mL. Digunakan air hangat agar

lebih mudah melarutkan ekstrak. Ekstrak dipartisi dengan wash bensin di dalam

corong pisah dengan perbandingan air dan wash bensin 1 : 1. Fraksi air berada

dibagin bawah sedangkan fraksi wash bensin berada pada bagian atas. Hal ini

dikarenakan berat jenis wash bensin lebih kecil dibandingkan berat jenis air. Berat

jenis wash bensin adalah 0,730 sedangkan berat jenis air adalah 0,996.


47

Partisi dengan wash bensin ini bertujuan untuk menghilangkan zat-zat

kimia yang bersifat nonpolar seperti lipid dan klorofil yang dapat mengganggu

proses analisis, sedangkan dalam fraksi air terlarut senyawa-senyawa fenolik akan

dianalisis selanjutnya.

Proses eksrtaksi dilakukan berulang sebanyak 3 kali agar ekstraksi lebih

efektif dan senyawa fenolik terlarut seluruhnya dalam fraksi air. Penggojogan

lemah pada proses ekstraksi dimaksudkan agar tidak terbentuk emulsi yang dapat

menyebabkan proses pemisahan menjadi lebih lama (Matsuda,2001).

Setelah didapatkan fraksi air pertama kemudian fraksi tersebut diekstraksi

cai-cair dengan etil asetat. Hal ini bertujuan untuk memurnikan senyawa fenolik

yang didapatkan. Fraksi etil asetat akan berada di atas sedangkan fraksi air berada

di bawah. Hal ini dikarenakan berat jenis etil asetat (0,898) lebih kecil

dibandingkan berat jenis air (0,996). Fraksi etil esetat dibuang sedangkan fraksi

air akan dianalisis.

Senyawa fenolik dapat berbentuk glikosida maupun aglikonnya. Dalam

bentuk glikosida senyawa fenolik bersifat polar, sedangkan dalam bentuk

aglikonnya senyawa fenolik bersifat lebih nonpolar. Karena itu, tidak menutup

kemungkinan adanya senyawa fenolik yang terlarut dalam air maupun etil asetat

yang bersifat semi polar. Peneliti tertarik untuk menguji aktivitas antioksidan

fraksi air dibandingkan fraksi etil asetat karena kandungan senyawa fenolik yang

terdapat pada buah labu siam yang mempunyai kelarutan yang baik pada pelarut

polar seperti air, sehingga diharapkan aktivitas antioksidan pada fraksi air ini

cukup baik. Lima dan Maciel (2006) melaporkan bahwa ekstrak metanol labu


48

siam mengandung fenolat, flavonoid, tanin terkondensasi, dan asam askorbat.

Selain itu peneliti telah melakukan uji pendahuluan terhadap fraksi etil asetat dan

memberikan hasil bahwa fraksi etil asetat tidak menunjukkan adanya senyawa

fenolik dan aktivitas antioksidan (lampiran 15). Fraksi air yang didapatkan

diuapkan pelarutnya dengan pemanasan menggunakan waterbath dengan bantuan

kipas angin sehingga diperoleh ekstrak kental air buah labu siam.

Berat fraksi air yang didapatkan sebesar 26,1 g dengan rendemen. 2,6 %

Fraksi tersebut disimpan dalam cawan poselin ditutup dengan plastik dan

alumunium foil lalu disimpan dalam eksikator. Hal ini dilakukan untuk

menghindari adanya kerusakan senyawa fenolik dalam fraksi air tersebut dari

pengaruh cahaya, udara maupun kelembaban.

D. Hasil Uji Pendahuluan

1. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Tujuan uji ini adalah untuk mengetahui secara kualitatif aktivitas

antioksidan dari fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam. Uji ini

menggunakan reaksi antara senyawa uji dan DPPH. Molekul radikal DPPH akan

bereaksi dengan atom hidrogen yang dilepaskan oleh senyawa uji sehingga

senyawa DPPH mengalami pengurangan intensitas warna ungu atau berubah

menjadi kuning sampai jernih (Prior et al., 2005). Pengujian menunjukan hasil

positif dengan berubahnya warna larutan uji menjadi kuning. Hal ini

menunjukkan potensi fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam dalam

menangkap radikal DPPH.


49

Gambar 7. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol negatif[blanko], B = larutan uji [fraksi air ekstrak metanolik nuah labu siam], C =

kontrol positif [rutin])

2. Uji pendahuluan fenolik

Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui secara kualitatif kandungan

senyawa fenolik dalam fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam. Prinsip uji ini

adalah reaksi oksidasi reduksi dari ion fenolat senyawa uji dengan pereaksi fenol

Folin-Ciocalteu. Dengan adanya natrium karbonat yang bersifat basa akan

mengubah senyawa fenolik dari senyawa uji menjadi ion fenolat. Ion fenolat dapat

mereduksi reagen fenol Folin-Ciocalteu sehingga menyebabkan terbentuknya

senyawa berwarna biru (Abdul-Fadl,1949). Pengujian menunjukan hasil positif

dengan terbentunya warna biru pada larutan uji (gambar 8). Hal ini menunjukkan

bahwa fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam mengandung senyawa fenolik.


50

Gambar 8. Hasil uji pendahuluan fenolik (A = kontrol positif [asamgalat], B = larutan uji [fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam], C =

kotrol negatif [blanko])

E. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan

Pengujian aktivitas penangkapan radikal bebas dari fraksi air ektrak

metanolik buah labu siam menggunakan metode DPPH dengan pertimbangan

dalam sampel terdapat senyawa yang mempunyai kemampuan menangkap radikal

DPPH. Pertimbangan yang lain adalah karena metode ini mudah digunakan,

mempunyai tingkat sensitifitas yang tinggi, dan dapat menganalisis sejumLah

besar sampel dalam jangka waktu yang singkat (Kim et al, 2002).

Mekanisme reaksi antara senyawa uji dan DPPH yaitu molekul radikal

bebas DPPH akan bereaksi dengan atom hidrogen yang dilepaskan oleh senyawa

uji sehingga senyawa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil mengalami pengurangan

intensitas warna ungu atau menjadi warna kuning sampai jernih (Gulcin et al.,


51

2004). Berkurangnya intensitas warna ungu dari larutan DPPH menunjukkan

potensi aktivitas antioksidan dari senyawa uji. Secara kuantitatif dapat dihitung

dengan berkurangnya absorbansi larutan tersebut.

Pengukuran aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH menggunakan

spektrofotometri. DPPH mempunyai λ maksimum pada 517 nm. (Sunarni, 2005).

Karena itu untuk memastikan bahwa tidak ada gangguan pengukuran pada daerah

λ maksimum DPPH tersebut dilakukan scanning λ maksimum pada pelarut, fraksi

air dan rutin pada daerah 400-600 nm. Adanya gangguanpengukuran pada daerah

λ maksimum DPPH dapat menyebabkan pengukuran absorbansi DPPH menjadi

tidak akurat. Dari hasil scanning λ maksimum terhadap pelarut metanol, fraksi air,

dan rutin tidak menunjukkan adanya gangguan pada daerah λ maksimum DPPH.

Hasil scanning λ maksimum pada daerah 400-600 nm dapat dilihat pada lampiran

6.

Sebelum melakukan pengujian aktivitas antioksidan senyawa uji perlu

dilakukan proses optimasi metode DPPH terlebih dahulu. Proses optimasi

meliputi penentuan operating time (OT) dan scanning λ maksimum DPPH.

1. Penentuan operating time (OT)

Penentuan OT ini perlu dilakukan untuk memperoleh rentang waktu

dimana larutan uji dan rutin sudah mereduksi radikal DPPH dengan sempurna

sehingga diperoleh nilai absorbansi yang stabil dengan demikian kesalahan

analisis dapat diminimalkan. Operating time dihitung mulai dari larutan sampel

maupun rutin direaksikan dengan DPPH. Penentuan OT dilakukan terhadap tiga


52

konsentrai larutan sampel dan rutin seagai larutan pembanding yang direaksikan

dengan DPPH dan diukur absorbasinya pada λ maksimum DPPH yaitu 517nm.

Pengukuran absorbansi dilakukan setiap 5 menit selama 60 menit.

Gambar 9. Hasil grafik penentuan OT rutin

Gambar 10. Hasil grafik penentuan OT fraksi air

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

0

Abso

rban

si

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

0

52






30 60

Waktu (menit)

Penentuan OT rutin

2.5 µg/mL

7.5 µg/mL

12.5 µg/mL

20 40 60 80

52






2.5 µg/mL

7.5 µg/mL

12.5 µg/mL

20 ug/ml

40ug/ml

60 ug/ml


53

Berdasarkan hasil yang diperoleh pada gambar 9 dan 10, dari menit ke-5

sanpai ke-60 absorbansi larutan uji fraksi air dan larutan pembanding rutin

semakin stabil, hal ini menunjukkan bahwa reaksi antara DPPH dengan senyawa

antioksidan semakin sempurna. Dari hasil tersebut ditetapkan OT larutan

pembanding rutin pada menit ke-30 sedangkan larutan uji pada menit ke-25.

2. Penentuan panjang gelombang maksimum

Tahap selanjutnya adalah penentuan λ maksimum DPPH. Pengukuran

absorbansi larutan uji dilakukan pada λ maksimum karena pada λ maksimum

sedikit perubahan konsentrasi akan memberikan perubahan absorbansi yang besar

sehingga akan didapatkan kepekaan analisis yang maksimum. Penentuan λ

maksimum dilakukan terhadap larutan DPPH pada λ visibel 400-600 nm. Secara

teoritis λ maksimum larutan DPPH adalah 517 nm (Sunarni, 2005). DPPH

memiliki gugus kromofor dan auksokrom sehingga dapat terukur pada daerah

visibel selain itu adanya elektron yang tidak berpasangan pada struktur DPPH

menyebabkan larutan DPPH berwarna unggu dan mempunyai serapan yang kuat

pada 517 nm. Dari hasil pengukuran diperoleh λ maksimum DPPH, yaitu 515,8

nm.


54

Gamba 11. Hasil scanning λ maksimum DPPH pada berbagai konsentrasi

F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan




Parameter validasi metode analisis yang dilakukan untuk menguji

validitas metode uji aktivitas antioksidan antaralain analisis akurasi, presisi,

linearitas dan spesifitas. Dalam pengujian digunakan lima replikasi larutan

pembanding rutin dan larutan uji fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam

sehingga didapatkan lima persamaan regresi linier antara konsentrasi rutin dan

larutan uji dengan % IC. Dari kelima persamaan tersebut dipilih persamaan

dengan nilai liniaritas ( r ) yang paling baik untuk menghitung konsentrasi terukur

rutin dan juga larutan uji sehingga % recovery dan % CV dapat dihitung. Gambar

54














54















55

berikut menunjukkan kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan larutan

pembanding rutin dan larutan uji fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam.

Gambar 12. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan rutin

Gambar 13. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan fraksi airekstrak metanolik buah labu siam

y = 5.834x + 16.303r = 0.9973

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12 14

%IC

(%)

Konsentrasi (µg/mL)

Kurva persamaan regresi linearaktivitas antioksidan rutin

y = 1,1594x-10,1462r = 0.9908

0

10

20

30

40

50

60

70

0 10 20 30 40 50 60 70

%IC

(%)

Konsentrasi (µg/mL)

Kurva persamaan regresi linier aktivitasantioksidan fraksi air labu siam


56

Gambar 12 dan 13 menunjukkan korelasi yang baik antara konsentrasi

rutin dan larutan uji dengan %IC. Hal ini ditunjukkan dengan nilai koefisien

korelasi (r) mendekati satu yang mengandung arti semakin besar konsentrasi rutin

maupun larutan uji maka semakin bear pula % IC yang dihasilkan.

1. Akurasi

Akurasi suatu metode merupakan keterdekatan nilai pengukuran dengan

nilai sebenarnya dari analit dalam sampel. Akurasi dinyatakan dengan nilai

perolehan kembali (%recovery). Nilai %recovery diperoleh dari data hubungan

antara seri konsentrasi rutin dan fraksi air dengan aktivitas antioksidan yang

dihasilkan. Tabel berikut menunjukkan % recovery rutin dan larutan uji fraksi air.

Dari data yang terdapat pada tabel V dan VI menunjukkan rentang

%recovery rutin adalah 90,42%-107,94%, sedangkan % recovery larutan uji

berada dalam rentang 90,07%- 114,95% Persyaratan rentang % recovery yang

baik untuk bahan p.a seperti rutin pada kadar sekitar 10 ppm adalah 90%-107%

(Harmita, 2004). Sedangkan rentang % recovery yang baik untuk bahan alam

adalah 80%-120%. Rentang % recovery rutin maupun larutan uji masuk dalam

persyaratan sehingga dapat dapat dikatakan metode ini memiliki akurasi yang baik

karena memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan.


57

Tabel V. Hasil % recovery dan %CV uji aktivitas antioksidan rutin

Rutin

Konsentrasiteoritis(µg/mL)

%IC(%)

Konsentrasiterukur(µg/mL)

%Recovery(%) SD

% CV(%)

seri 1 2,5 30,45 2,42 95,45 1,80 1,942,5 29,92 2,33 92,622,5 29,55 2,27 90,422,6 30,06 2,36 92,442,5 29,99 2,35 92,35

seri 2 5,1 44,83 4,89 96,25 0,50 0,525,0 44,66 4,86 96,425,0 44,20 4,78 95,265,1 44,75 4,87 95,585,1 44,76 4,88 96,00

seri 3 7,6 63,60 8,11 106,37 0,80 0,757,6 63,78 8,14 107,637,5 63,73 8,13 107,947,7 63,73 8,13 106,257,6 63,59 8,10 106,35

seri 4 10,2 75,96 10,22 100,63 0,50 0,5010,1 75,03 10,06 99,8510,0 75,11 10,08 100,3910,2 75,59 10,16 99,6210,2 75,99 10,23 100,68

seri 5 12,7 88,99 12,46 98,09 1,20 1,2212,6 89,09 12,47 99,0112,6 89,77 12,59 100,3312,8 88,59 12,39 97,1712,7 88,73 12,41 97,74


58

Tabel. VI. Hasil % recovery dan %CV uji aktivitas antioksidan fraksi air

Fraksi Air

Konsentrasiteoritis(µg/mL)

%IC(%)

Konsentrasiterukur(µg/mL)

%Recovery(%) SD

% CV(%)

seri 1 20,16 12,56 19,58 97,13 2,90 3,1420,32 11,07 18,30 90,0720,24 11,24 18,44 91,1220,32 11,11 18,33 90,2320,16 11,59 18,74 92,98

seri 2 30,24 30,16 34,76 114,95 1,30 1,1530,48 30,09 34,70 113,8630,36 29,89 34,53 113,7330,48 29,74 34,40 112,8730,24 28,91 33,69 111,39

seri 3 40,32 35,20 39,11 97,01 0,60 0,6240,64 34,90 38,85 95,6040,48 34,83 38,79 95,8340,64 35,24 39,15 96,3340,32 34,53 38,54 95,58

seri 4 50,40 48,32 50,43 100,05 0,80 0,8150,80 47,87 50,04 98,5150,60 47,64 49,84 98,5050,80 48,04 50,18 98,7950,40 47,02 49,31 97,83

seri 5 60,48 60,87 61,26 101,28 1,70 1,6960,96 59,96 60,46 99,1960,72 61,80 62,05 102,1960,96 59,15 59,77 98,0460,48 60,97 61,34 101,42


59

2. Presisi

Presisi dinyatakan dengan nilai % CV. Persyaratan nilai % CV yang baik

untuk bahan p.a pada konsentrasi sekitar 10 ppm adalah < 5% sedangkan nilai %

CV yang baik untuk bahan alam < 15 % (Harmita, 2004). Berdasarkan nilai %

CV dari data hubungan antara konsentrasi rutin dan larutan uji dengan %IC

diperoleh nilai %CV rutin berada dalam rentang 0,5%-1,94% sedangkan %CV

larutan uji berada dalam rentang 0,62%-3,14%. Dengan demikian baik rutin

maupun larutan uji memiliki % CV yang baik karena memenuhi persyaratan yang

ditetapkan sehingga dapat dikatakan metode ini memiliki presisi yang baik.

3. Linearitas



proporsional dengan konsentrasi (jumlah) analit di dalam sampel. Linearitas

biasanya dinyatakan dalam istilah variansi sekitar arah garis regresi yang dihitung

berdasarkan persamaan matematik data yang diperoleh dari hasil uji analit dalam

sampel dengan berbagai konsentrasi analit. Hasil nilai koefisien korelasi (r)

persamaan regresi linier utuk rutin yang paling bagus adalah pada replikasi I,

yaitu 0,9973 sedangkan untuk fraksi air nilai koefisien korelasi yang paling bagus

adalah pada replikasi V, yaitu 0,9908. Menurut APVMA (Australian Pesticides &

Veterinary Medicines Authory) persyaratan liniearitas yang baik untuk bahan p.a

konsentrasi 10 ppm adalah > 0,99, sedangkan untuk fraksi air nilai r >0,8000


60

menunjukkan kekuatan korelasi yang sangat kuat (Dahlan, 2011). Nila r rutin dan

fraksi air memenuhi persyaratan maka metode ini memiliki liniearitas yang baik.

4. Spesifitas

Spesifitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur

zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang

mungkin ada dalam matriks sampel (Harmita, 2004). Uji dilakukan dengan

mengukur absorbsi fraksi air, rutin, dan pelarut pada λ maksimum DPPH apakah

memberi serapan yang dapat mengganggu pengukuran absorbansi DPPH.

Gambar 14. Hasil scanning rutin pada λ 400-600 nm


61

GambaR 15. Hasil scanning fraksi air pada λ 400-600 nm

Gambar 16. Hasil scanning metanol pada λ 400-600 nm


62

Dari hasil spektra terlihat bahwa larutan rutin, larutan uji fraksi air

ekstrak metanolik buah labu siam dan pelarut metanol tidak menunjukkan adanya

gangguan berarti terhadap absorbansi DPPH. Dengan demikian dapat dikatakan

metode ini memilki spesifitas yang baik.

G. Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH

Metode DPPH merupakan salah satu uji kuantitatif untuk mengetahui

seberapa besar aktivitas fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam sebagai

antioksidan. Ketika radikal DPPH ditangkap oleh senyawa antioksidan yang

mampu mendonorkan atom hidrogen maka DPPH akan tereduksi membentuk

DPPH-H tereduksi. Perubahan bentuk DPPH menjadi bentuk tereduksi ini

menyebabkan perubahan warna larutan DPPH dari unggu menjadi kuning.

Perubahan warna ini diikuti penurunan absorbansi DPPH sehingga aktivitas

antioksidan penangkapan radikal dapat diketahui dengan menghitung rasio

penurunan absorbansi DPPH (Molyneux, 2004).


63

Gambar 17. Perubahan warna DPPH disertai dengan penurunanabsorbansi (Molyneux, 2004).

Gambar 18. Gugus krsomofor dan auksokrom DPPH (Prakash et al.,2001)

Untuk menunjukkan besar kemampuan suatu senyawa sebagai

antioksidan maka digunakan parameter IC50. IC50 merupakan konsentrasi senyawa

antioksidan yang dibutuhkan untuk megurangi raikal DPPH sebesar 50% (Zou et

al.,2004). Nilai IC50 diperoleh dari suatu persamaan regresi linier yang


64

menyatakan hubungan antara konsentrasi senyawa uji dengan persen penangkapan

radikal (%IC). Semakin kecil nilai IC50, semakin kuat senyawa uji tersebut

sebagai antioksidan.

Nilai IC50 dari fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam akan

dibandingkan dengan nilai IC50 dari rutin. Digunakan rutin sebagai pembanding

karena diketahui rutin memiliki potensi aktivitas antioksidan penangkap radikal

bebas yang kuat. Rutin merupakan salah satu senyawa fenolik yang tergolong

flavonoid. Aktivitas antioksidan rutin berasal dari gugus O-dihidroksi yang

terdapat pada cincin B rutin.

Gambar 19. Struktur rutin (Santos, Mazo, Cavalheiro, 2008)

Hasil penentuan aktivitas antioksidan pada rutin dan fraksi air ekstrak

metanolik buah labu siam dapat dilihat pada tabel berikut.

64













64














65

Tabel VII. Hasil %IC rutin menggunakan radikal DPPH

ReplikasiKonsentrasi(μg/mL)

Absorbansilarutanpembanding

%IC(%) Persamaan regresi linear

1

2,5 0,619 30,45 y = Bx + A5,1 0,491 44,83 y = 5,8347 x + 16, 3037,6 0,324 63,6 r = 0,9973

10,2 0,214 75,9612,7 0,098 88,99

2

2,5 0,623 29,92 y = Bx + A5,0 0,492 44,66 y = 5,9010 x + 15,88257,6 0,322 63,78 r = 0,9968

10,1 0,222 75,0312,6 0,097 89,09

3

2,5 0,620 29,55 y = Bx + A5,0 0,491 44,2 y = 6,0304 x + 15, 0457,5 0,320 63,64 r = 0,9971

10,0 0,219 75,1112,6 0,090 89,77

4

2,6 0,619 30,06 y = Bx + A5,1 0,489 44,75 y = 5,8004 x + 16,16947,7 0,321 63,73 r = 0,9967

10,2 0,216 75,5912,8 0,101 88,59

5

2,5 0,621 29,99 y = Bx + A5,1 0,490 44,76 y = 5,8545 x + 15,99777,6 0,323 63,59 r = 0,9969

10,2 0,213 75,9912,7 0,100 88,73


66

Tabel VIII. Hasil %IC fraksi air menggunakan radikal DPPH

ReplikasiKonsentrasi(μg/mL)

Absorbansilarutan fraksiair

%IC(%) Persamaan regresi linear

1

20,16 0,780 12,56 y = Bx + A30,24 0,623 30,16 y = 1,1588 x - 8,497740,32 0,578 35,2 r = 0,9899

50,4 0,461 48,3260,48 0,349 60,87

2

20,32 0,795 11,07 y = Bx + A30,48 0,625 30,09 y = 1,1379 x - 9,4407140,64 0,582 34,9 r = 0,9874

50,8 0,466 47,8760,96 0,358 59,96

3

20,24 0,790 11,24 y = Bx + A30,36 0,624 29,89 y = 1,1747 x - 10, 471940,48 0,580 34,83 r = 0,98817

50,6 0,466 47,6460,72 0,340 61,8

4

20,32 0,792 11,11 y = Bx + A30,48 0,626 29,74 y = 1,1261 x - 9,104740,64 0,577 35,24 r = 0,9878

50,8 0,463 48,0460,94 0,364 59,15

5

20,16 0,786 11,59 y = Bx + A30,24 0,632 28,91 y = 1,1594 x - 10,146240,32 0,582 34,53 r = 0,9908

50,4 0,471 47,0260,48 0,347 60,97

Dari tabel VII dan VIII dapat terlihat bahwa pada berbagai seri konsentrasi

rutin maupun larutan uji fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam semakin

besar konsentrasi larutan maka semakin kecil absorbansi yang dihasilkan. Hal ini

disebabkan semakin besar konsentrasi larutan maka semakin banyak senyawa


67

antioksidan yang mendonorkan atom hidrogen kepada radikal DPPH sehingga

terjadi peluruhan warna larutan DPPH.

Tabel IX. Hasil IC50 fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam dan rutin

Bahan

Uji

IC50

rata-rata

(μg/mL) SD

% CV

(%)

Rep. 1

(μg/mL)

Rep. 2

(μg/mL)

Rep. 3

(μg/mL)

Rep. 4

(μg/mL)

Rep. 5

(μg/mL)

Rutin 5,77 5,78 5,80 5,83 5,81 5,80 0,02 0,34

Fraksi air 51,36 52,24 51,48 52,49 51,88 51,89 0,48 0,93

Pada tabel IX, rata-rata nilai IC50 rutin sebesar 5, 80 (μg/mL) , sedangkan

larutan uji sebesar 51,89 (μg/mL). Untuk melihat signifikansi antara nilai IC50

rutin denga larutan uji maka data nilai aktivitas antioksidan diuji secara statistik.

Pengujian dilakukan dengan menggunakan software SPSS Statistics 17.0.

Langkah pertama dilakukan uji Shapiro-Wilk karena sampel yang digunakan < 50

(Dahlan, 2011). Uji ini bertujuan untuk mengetahui apakah data mengikuti

distribusi normal atau tidak. Hipotesis null (Ho) adalah data %IC berdistribusi

normal sedangkan Hipotesis alternatif adalah data %IC berdistribusi tidak normal.

Dari hasil perhitungan Shapiro-Wilk diperoleh nilai signifikansi (p) rutin sebesar

0,012 dan larutan uji sebesar 0,030. Nilai signifikansi tersebut lebih kecil dari

nilai signifikansi yang ditentukan yaitu 0,05 (taraf kepercayaan 95%) sehingga Ho

ditolak. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa data %IC rutin dan larutan uji

berdistribusi tidak normal. Karena distribusi data tidak normal selanjutnya

dilakukan uji non parametrik.


68

Uji non parametrik yang digunakan adalah uji Mann-Whitney karena

nilai IC50 antara rutin dan larutan uji ini tidak saling berhubungan. Uji Mann-

Whitney ini bertujuan sebagai parameter induktif untuk melihat signifikansi nilai

IC50 antara rutin dan larutan uji. Hipotesis null (Ho) adalah nilai IC50 rutin tidak

lebih kecil dari larutan uji sedangkan Hipotesis alternatif adalah nilai IC50 rutin

lebih kecil daripada larutan uji. Hasil pengujian memperoleh nilai signifikansi

sebesar 0,009 antara rutin dan larutan uji. Nilai signifikansi tersebut lebih kecil

dari nilai signifikansi yang ditentukan yaitu 0,05 (taraf kepercayaan 95%)

sehingga Ho ditolak. Dari nilai tersebut dapat disimpulkan bahwa nilai IC50 rutin

lebih kecil dari larutan uji yaitu fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam.

Berdasarkan penggolongan tingkat kekuatan antioksidan, rutin memiliki

tingkat aktivitas antioksidan sangat kuat sedangkan fraksi air ekstrak metanolik

buah labu siam memiliki tingkat aktivitas antioksidan kuat yang berarti bahwa

larutan uji fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam mempunyai aktivitas

antioksidan yang lebih lemah daripada rutin.

H. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total

Adanya aktivitas antioksidan dari larutan uji fraksi air ekstrak metanolik

buah labu siam kemungkinan disebabkan karena kandungan fenoliknya. Banyak

penelitian melaporkan bahwa senyawa fenolik dianggap sebagai komponen

antioksidan terpenting pada tanaman dan memberikan korelasi yang bagus antara

konsentrasi fenolik dengan aktivitas antioksidannya (Zin et al,2004).


69

Kandungan fenolik total diekspresikan dengan ekivalen asam galat dan

ditentukan dengan metode spektrofotometri menggunakan pereaksi Follin

Ciocalteu (Abdul-Fadl, 1949). Sebelum dilakukan penetapan kandungan fenolik

total terlebih dahulu dilakukan proses optimasi. Proses optimasi meliputi

penentuan operating time (OT) dan penentuan λ maksimum.

1. Penentuan operating time (OT)

Penentuan OT ini bertujuan untuk mendapatkan rentang waktu dimana

reaksi anatra asam galat dan pereaksi Follin Ciocalteu telah berlangsung secara

sempurna sehingga menghasilkan absorbansi yang stabil. Hal ini dapat

mengurangi tingkat kesalahan dalam analisis.

Gambar 20. Grafik penentuan OT penetapan kandungan fenolat

Dari gambar diatas dapat terlihat absorbansi mulai stabil pada menit ke

15. Hal ini menunjukkan bahwa reaksi antara asam galat dan Follin Ciocalteu

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 5 10 15 20 25 30 35

25 ug/ml

75 ug/ml

Penentuan OT kandungan fenolik

Abso

rban

si

waktu (menit)


70

telah berlangsung sempurna sejak menit ke-15 karena itu ditentukan OT adalah

15 menit.

2. Penentuan panjang gelombang maksimum

Penentuan λ maksimum ini perlu dilakukan karena pengukuran

absorbansi larutan uji pada λ maksimum akan memberikan sensitifitas yang

tinggi. Pada λ maksimum sedikit perubahan konsentrasi akan memberikan

perubahan absorbansi yang besar. Penentuan λ maksimum ini dilakukan dengan

mereaksikan pereaksi Folin Ciocalteu dengan asam galat pada konsentrasi 50

µg/mL;100 µg/mL dan 150 µg/mL sehingga dihasilkan senyawa berwarna biru.

Berdasarkan hasil spektra (Gambar 21) terlihat bahwa senyawa molybdenum blue

yang dihasilkan dari reaksi antara senyawa fenolik dan Follin Ciocalteu memiliki

λ maksimum pada 750 nm. Hal ini sesuai dengan λ maksimum teoritis metode

Follin Ciocalteu berada pada rentang λ 745-750 nm (Prior et al., 2005).

Gambar 21. Scanning λ maksimum senyawa berwarna biru (molybdenumblue) pada berbagai konsentrasi asam galat


71

I. Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total

Untuk menguji validitas metode penetapan kandungan fenolik total ini

digunakan beberapa parameter, antara lain analisis akurasi, presisi, linearitas dan

spesifitas. Dalam pengujian digunakan lima replikasi sehingga didapatkan lima

persamaan regresi linier antara konsentrasi asam galat dengan absorbansi yang

didapat. Dari kelima persamaan tersebut dipilih persamaan dengan nilai liniaritas (

r ) yang paling baik untuk menghitung konsentrasi terukur rutin dan juga larutan

uji sehingga % recovery dan % CV dapat dihitung. Persamaan regresi liner yang

paling baik yaitu 0,9999 didapatkan dari replikasi II dengan y = 0,004 x + 0,1392

Gambar 22 menunjukkan kurva persamaan regresi linier asam galat.

Gambar 22. Kurva persamaan regresi linier penetapan kadar fenolat total

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 50 100 150

Kurva persamaan regresi linier asam galat

Kurva persamaan regresilinier asam galat

Linear (Kurva persamaanregresi linier asam galat)

konsentrasi (µg/ml)

abso

rban

si

y = 0,004 x + 0,1392r = 0,9999


72

1. Akurasi

Akurasi suatu metode dinyatakan dengan nilai perolehan kembali

(%recovery) yang menyatakan keterdekatan nilai pengukuran dengan nilai

sebenarnya dari analit dalam sampel.

Dari data yang terdapat pada tabel.X menunjukkan rentang % recovery

konsentrasi asam galat adalah 94,18% - 104,17%. Persyaratan rentang %recovery

yang baik untuk bahan p.a seperti asam galat pada kadar sekitar 150 ppm adalah

90%-107% (Harmita, 2004). Rentang %recovery asam galat masuk dalam

persyaratan sehingga dapat dapat dikatakan metode ini memiliki akurasi yang baik

karena memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan.

2. Presisi

Presisi dinyatakan dengan nilai % CV. Persyaratan nilai % CV yang baik

untuk bahan p.a pada konsentrasi sekitar 150 ppm adalah < 5%. Berdasarkan nilai

% CV dari data hubungan antara konsentrasi asam galat dengan absorbansi

diperoleh nilai %CV asam galat berada dalam rentang 1,1% - 3,43%. Dengan

demikian asam galat memiliki % CV yang baik karena memenuhi persyaratan

yang ditetapkan sehingga dapat dikatakan metode ini memiliki presisi yang baik.


73

Tabel X. Hasil % recovery dan %CV penetapan kadar fenolat

Replikasi

konsentrasiteoritis(µg/mL)

Absorbansiasam galat

Konsentrasiterukur

%Recovery(%) SD

%CV(%)

seri 1 25,30 0,24 24,45 96,64 3,40 3,4225,10 0,24 25,20 100,4025,15 0,24 26,20 104,1725,30 0,24 25,20 99,6025,20 0,24 24,20 96,03

seri 2 50,60 0,34 49,45 97,73 1,40 1,4350,20 0,34 50,20 100,0050,30 0,34 48,95 97,3250,60 0,33 48,70 96,2550,40 0,34 49,70 98,61

seri 3 75,90 0,44 73,95 97,43 2,40 2,4575,30 0,44 74,95 99,5475,45 0,43 73,70 97,6875,90 0,44 76,20 100,4075,60 0,42 71,20 94,18

seri 4 101,40 0,54 99,95 98,57 1,20 1,20100,40 0,54 100,70 100,30100,60 0,55 102,70 102,09101,20 0,54 101,20 100,00100,80 0,54 100,70 99,90

seri 5 126,50 0,64 124,95 98,77 1,10 1,11125,50 0,64 125,45 99,96125,75 0,64 125,95 100,16126,50 0,63 123,20 97,39126,00 0,64 124,20 98,57


74

3. Linearitas



proporsional dengan konsentrasi (jumLah) analit di dalam sampel. Persyaratan

data linieritas yang bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien korelasi ( r ) >

0,999 (Mulja dan Hanwar, 2003). Metode ini memiliki linearitas yang baik karena

pada replikasi ke II diperoleh nilai r = 0,9999.

4. Spesifitas

Spesifitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur

zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang

mungkin ada dalam matriks sampel (Harmita, 2004). Dari hasil spektra terlihat

bahwa larutan asam galat, larutan uji fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam,

dan pelarut metanol-air tidak menunjukkan adanya gangguan berarti terhadap

absorbansi senyawa biru yang dihasilkan. Dengan demikian dapat dikatakan

metode ini memilki spesifitas yang baik.


75

Gambar 23. Hasil scanning larutan asam galat pada λ 600-800 nm

Gambar 24. Hasil scanning fraksi air pada λ 600-800 nm


76

Gambar 25. Hasil scanning metanol-air pada λ 600-800 nm

J. Hasil Estimasi Kandungan Fenolik Total

Senyawa fenolik yang banyak terkandung di dalam tanaman memiliki

peran penting dalam mengurangi resiko penyakit jantung koroner, kanker dan

beberapa penyakit lain yang disebabkan oleh radikal bebas (Makris, 2003). Oleh

karena itu, pada penelitian ini juga dilakukan penetapan kandungan fenolik total

untuk mengetahui hubungan antara aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak

metanolik buah labu siam dengan kandungan fenolik totalnya.

Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai ekivalen asam galat. Asam

galat (Gambar 26) merupakan asam dengan 3 gugus hidroksi fenolik sehingga

dapat digunakan sebagai senyawa baku untuk menetapkan kadar senyawa fenolik

total. Alasan lain penggunaan asam galat sebagai pembanding adalah tersedianya

asam galat dalam kemurnian yang tinggi dan stabil serta harganya yang relatif


77

lebih murah dibandingkan dengan senyawa standar yang lain (Mongkolsilp et al.,

2004).

Gambar 26. Struktur asam galat (Mongkolsilp et al., 2004).

Senyawa fenolik dalam suatu sampel secara kualitatif dan kuantitatif dapat

ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah dengan

adanya senyawa yang dapat mereduksi reagen fenol Folin-Ciocalteu, akan

menyebabkan terbentuk senyawa berwarna biru yang proporsional dengan

jumLah senyawa yang dapat mereduksi dan dinyatakan dalam nilai ekuivalen

asam galat (Abdul-Fadl,1949).

Senyawa fenolik akan menjadi ion fenolat dalam suasana basa karena itu

dalam penelitian ditambahkan natrium karbonat untuk mempermudah reaksi

antara senyawa fenolik dengan pereaksi Folin-Ciocalteu yang berisi reagen asam

fosfomolibdat-fosfotungstat. Senyawa fenolik akan dioksidasi oleh asam dari

pereaksi Folin-Ciocalteu, sedangkan pereaksi Folin-Ciocalteu akan mendapatkan

proton dari senyawa fenolik dan air (tereduksi) sehingga mengahasilkan senyawa

berwarna biru (molybenum-blue).

Hasil pengukuran absorbansi berbagai konsentrasi asam galat setelah

direaksikan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu dapat dilihat pada tabel XI.

77


2004).

















77


2004).


















78

Tabel XI. Hasil absorbansi berbagai seri konsentrasi asam galat

ReplikasiKonsentrasi

(µg/mL) AbsorbansiPersamaan regresi

linear

1

25,3 0,237y = Bx + A

y = 0,0039 x + 0,1356r = 0,9999

50,6 0,33775,9 0,435101,2 0,539126,5 0,639

2

25,1 0,24y = Bx + A

y = 0,004 x + 0,1392r = 0,9999

50,2 0,3475,3 0,439100,4 0,542125,5 0,641

3

25,1 0,244y = Bx + A

y = 0,0040 x + 0,1373r = 0,9992

50,3 0,33575,45 0,434100,6 0,55125,75 0,643

4

25,3 0,24y = Bx + A

y = 0,0039 x + 0,1406r = 0,9993

50,6 0,33475,9 0,444101,2 0,544126,5 0,632

5

25,2 0,236

y = Bx + Ay = 0,00398 x + 0,134

r = 0,9991

50,4 0,33875,6 0,424100,8 0,542126 0,636


79

Tabel XII. Hasil absorbansi fraksi air

Replikasi

Konsentrasifraksi air(µg/mL) Absorbansi

1 10200,676

2 10100,662

3 10300,681

4 10400,689

5 10200,677

Tabel XIII. Hasil kandungan fenolik total fraksi air

Kandunganfenolik

(µg/mL)

Kandungan fenolik(mg ekivalen asamgalat per g fraksi)

Rata-rata (mgekivalen asam

galat per g fraksi) SD

134,20 6,58 6,560,05

130,70 6,47135,45 6,58137,45 6,61134,45 6,59

Dalam pembuatan kurva baku dilakukan lima replikasi sehingga

didapatkan lima persamaan regresi linier antara konsentrasi asam galat dengan

absorbansi yang didapat. Dari ketiga persamaan tersebut dipilih persamaan

dengan nilai liniaritas ( r ) yang paling baik. Persamaan regresi linier yang paling

baik diperoleh dari replikasi II dengan y = 0,004 x + 0,1392 dan r = 0,9999.

Dengan menggunakan persamaan tersebut diperoleh kandungan fenolik total

fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam sebesar 6,56 mg ekivalen asam galat


80

per g fraksi. Namun nilai tersebut kurang valid karena absorbansi dari fraksi air

berada di luar dari rentang absorbansi kurva baku asam galat.

Di dalam labu siam juga mengandung asam askorbat karena itu, aktivitas

antioksidan dari labu siam tidak hanya dipengaruhi oleh kandungan senyawa

fenolik namun juga bisa karena kandungan asam askorbat di dalamnya.

Kandungan fenolik total diekspresikan dengan %b/b ekivalen asam galat

karena belum diketahuinya struktur kimia senyawa fenolik yang terdapat pada

total fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam.


81

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Nilai aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak metanol buah labu siam dengan

menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50 sebesar (51,89 +

0,48) µg/ml.

2. Kandungan fenolik total fraksi air ekstrak metanol buah labu siam yang

dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat sebesar (6,56 + 0,05) mg ekivalen

asam galat per g fraksi air.

B. Saran

1. Perlu dilakukan pengenceran pada fraksi air ekstrak metanol buah labu siam agar

diperoleh nilai absorbansi yang masuk dalam rentang absorbansi kurva baku asam

galat dalam penentuan kandungan fenolik total.

2. Perlu dilakukan uji korelasi antara kandungan fenolik pada fraksi air ekstrak

metanolik buah labu siam dengan aktivitasnya sebagai antioksidan.

3. Perlu dilakukan isolasi lebih lanjut dan elusidasi struktur untuk mengetahui

senyawa fenolik yang memiliki aktivitas antioksidan dalam fraksi air ekstrak

metanol buah labu siam.s

4. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut yang mendukung aktivitas antioksidan

buah labu siam sebagai antikanker.


82

DAFTAR PUSTAKA

Abdult-Fadl, M.A.M., 1949, Colorimetric Determination of Potassium by Folin-Ciocalteu Phenol Reagent, Postgraduate Medical School, London, 44,282.

Ansel, C. H., 1989, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi, edisi IV, 607-609, UIPress, Jakarta.

APVMA, 2004, Guidelines For The Validation Of Analytical Methods For ActiveConstituent, Agricultural And Veterinary Chemical Products, Australia

Backer, C., A., and van den Brink Jr, R., C., B., 1968, Flora of Java, volume I, 1-306,N.V.P Noordhooff Groningen, Netherland

Caillet, S., Salmieri, S., and Lacroix, M., 2006, Evaluatio of free radical-scavenging properties of commericial grape phenol extracts by a fastcolorimetric method, J. Food Chem., 95: 1-6

Dahlan, M. S., 2011, Statistik Untuk Kedokteran dan Kesehatan, 24-25, 169,Salemba Medika, Jakarta

Depkes RI, 1986, Sediaan Galenik, 10-13, Departemen Kesehatan RepublikIndonesia, Jakarta.

Depkes RI a, 2000, Inventaris Tanaman Obat Indonesia (I), Jilid 1, 213-214,Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Jakarta.

Depkes RI b, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, cetakanpertama, 6, 13-38, Departemen Kesehatan RI, Jakarta.

Ekowahyuni, P., 2002, Makalah falsafah Sains :Fenomena vivipary Labu Siam(Sechium edule Jacq Swartz) Varietas Lokal Desa Barukupa BawahCipanas, Program Pasca Sarjana IPB, Bandung.

Fessenden, R.J., dan Fessenden J.S., 1995, Kimia Organik, Jilid II, 119-220,diterjemahkan oleh Pujaatmaka, A.H., edisi ketiga, Penerbit Erlangga,Jakarta.

Gulcin, I., Uguz, M.T., Oktay, M., Beydemir, S., Kufrevioglu, O.I., 2004,Evaluation of the Antioxidant and Antimicrobial Activities of Clary Sage(Salvia sclarea L.), Turk. J., Agric. For., 28: 25-33.

Halliwell, B., and Gutteridge J. M. C., 2000, Free Radical in Biology andMedicine, 1-231, 353-435, Oxford University Press, New York.


83

Handayani, 2011, Proses Pencoklatan pada Buah Apel,http://teknologi.kompasiana.com/terapan/2011/05/13/prosespencokelatan-pada-buah-apel/, diakses pada tanggal 3 Desember 2011

Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi dan Cara Perhitungan,Departemen FMIPA UI, Depok, pp. 5-13.

Hernani dan Rahardjo M., 2005, Tanaman Berkhasiat Antioksidan, PenebarSwadaya, Bogor.

Hertiani, T., 2000, Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid Antioksidan dariDaun Plantago Mayor L., Tesis, Program Pasca Sarjana UGM,Yogyakarta.

Heyne, K., 1987, Tumbuhan Berguna Indonesia, Jilid III, diterjemahkan olehBadan Litbang Kehutanan, hal. 1819, Yayasan Sarana Wana Jaya,Jakarta.

Khikmawati, W., H., 2009, Pengaruh Pemberian Perasan Buah Labu SiamTerhadap Penurunan Kadar Glukosa Daraah Pada Kelinci Jantan NewZealand yang Dibebani Glukosa, Skripsi, Universitas MuhammadiyahSurakarta, Surakarta.

Kim, D.K., Lee, K.W., Lee, H.J., and Lee C.Y., 2002, Vitamin C equivalentantioxidant capacity (VCEAC) of phenolic phytochemicals, J. AgricFood Chem., 50, 3713-3717.

Markham, K.R., 1988, Tecniques of Flavonoid Identification, diterjemahkan olehPadmawinata, K., hal. 15, ITB, Bandung.

Marliana, SD., Suryanti V., Suyono, 2005, Skrining Fitokimia dan AnalisisKromatografi Lapis Tipis Komponen Kimia Buah Labu Siam (Sechiumedule Jacq. Swartz.) dalam Ekstrak Etanol, Biofarmasi., 3 (1): 26-3.

Marxen, K., Vanselow, K.H., Lippemeier, S., Hitsze, R., Ruser, A., dan Hansen,U., 2007, Determination of DPPH Radical Oxidation Caused byMethanolic Extract of Some Mircroalgal Species by Linear RegressionAnalysis of Spectrofotometric Measurements, Sensors, 7(2007), 2080-2095, Jerman.

Matsuda, H., Morikawa, T., Ueda, H., Yoshikawa M., 2001, Medical Foodstuffs.XXVII, Chem. Pharm. Bull., Tokyo, 49 (10), 1368-1371.

Melo, E., Lima, V., Maciel, M, 2006, Polyphenol, Ascorbic acid and TotalCarotenoid Contents in Common Fruits and Vegetables Brazil, BrazilianJournal of Food Technology, Vol. 9 : 89-94.


84

Molyneux, P., 2004, The Use of The Stable ree Radical DPPH for EstimatingAntioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci. Technol., 26 (2), 211-219

Mongkolsilp, S., Pongbupakit, I., Sae-Lee, N., Sitthithaworn, W., 2004, Radicalscavenging activity and total phenolic content of medical plants ofmedicinal plants used in primary healt care, SWU J. Pharm Sci, 9: 2-35.

Mulja, M., Hanwar, D., 2003, Prinsip-prinsip dan Cara Berlaboratorium yang baik(Good Laboratory Practice), Majalah Farmasi Airlangga, Volume III,No.2, 71 – 76.

Nazaruddin, 1998, Sayuran Dataran Rendah, 104-105, Penebar Swadaya, Jakarta.

Nusarini, N.M.R., 2007, Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat EkstrakMetanolik Herba Ketul (Bidens pilosa L.), Skripsi, 15-20, FakultasFarmasi Universitas Gajah Mada, Yogyakarta.

Pedricilli, P., 2001, Antioxidant Mechanism of Flavonoid, Solvent Effect on RateConstant for Chain Breaking Reaction of Quersetin and EpicathecininAutoxidation of Metyl Linoleat, J. Agric. Food Chem, 49.

Pokorny J., Yanishlieva, N., Gordon., 2001, Antioxidant in Food : PracticalApplications, CRC Press, New York.

Prakash, A., Rigelhof, F., Miller, E., 2001, Antioxidant Activity, MedalliaonLaboratories.

Pratiwi, R. I. S., 2011, Karakterisasi Simplisia dan Uji Aktivitas AntioksidanEkstrak n-Heksan, Etil Asetat, dan Etanol Herba Labu Siam, Skripsi,Universitas Sumatra Utara, Medan.

Prior, R.L., Wu, X., and Schaich, K., 2005, Standarized methods for thrdetermination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietarysupplements, J. Agric. Food Chem., 55: 2698A-J.

Proestos, C., Sereli, D., and Komaitis, M., 2006, Determination of phenoliccompounds in aromatic plant by RP-HPLC and GC-MS, J.Food Sci., 95:44-52.

Pujimulyani D., 2003, Pengaruh bleanching terhadap sifat antioksidan sirup kunirputih (Curcuma mangga val.), Agritech, 23(3): 137-141.

Ronoprawiro, S. ,1993, Produksi Sayuran di Daerah Tropika, Terjemahan :Vegetable Production in The Tropics. C.N.Williams, 203, UGM Press,Yogyakarta.

Sambada, D. L. E., 2011, Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal DPPHdan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Air Ekstrak EtanolikDaun Selasih, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.


85

Sambada, edhi, 2011, Metode penetapakn kandungan fenolik total dengan folin-ciocalteu, http://edhisambada.wordpress.com/2011/02/18/metode-folin-ciocalteu/, diakses tanggal 23 Desember 2011

Sastrohamidjojo, H., 1991, Spektroskopi, 1-114, Liberty, Yogyakarta

Sastrohamidjojo, H., 1991, Spektroskopi, edisi II, Liberty, Yogyakarta

Saurisari, R., 2006, Mengenal dan Menangkal Radikal Bebas,http://www.beritaiptek.com, diakes tanggal 11 Maret 2011.

Sidney X., dos Santos, Luiz H., Mazo, Eder T., G., Cavalheiro, 2008, The use of agraphite-silicone rubber composite electrode in the determination of rutinin pharmaceutical formulation, J. Braz. Chem. Soc, vol.19 no.8, SaoPaulo, Brazil

Sihombing, Ninda, 2011, Mekanisme antioksidan menetralkan radikal bebas,http://nindasihombing.blogspot.com/2011/03/catatan-kuliahnutraseutikal-sebelum.html, diakses tanggal 23 Desember 2011

Sjabana, M.G., dan Jovanovic, J.V., 2002, Seri Referensi Herbal : PesonaTradisional dan Ilmiah Buah Mengkudu (Morinda citrifolia L.), 5-20,Salemba Medika, Jakarta.

Sofia, D., Antioksidan dan Radikal Bebas, http://www.chemistry.org, diaksestanggal 1 Mei 2011.

Sunarjono, H., 2004, Bertanam 30 Jenis Sayuran, 115-117. Penebar Swadaya,Jakarta.

Sunarni, T., 2005, Aktivitas Antioksidan Penangkap Radikal Bebas Beberapakecambah Dari Biji Tanaman Familia Papilionaceae, 53-61, JurnalFarmasi Indonesia 2 (2), Jakarta.

Tahir, I., Wijaya, K., Widianingsih, D., 2003, Terapan Analisis Hansch UntukAktivitas Antioksidan senyawa Turunan Flavon/Flavonol, Seminar onChemometrics-Chemistry Dept Gadjah Mada University, Yogyakarta.

Wahyuni, Tri, 2009, Aktivitas Antioksidan Buah Labu Siam (Sechium eduleSwartz), Skripsi, Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

Winarsi, W., 2007, Antioksidan Alami dan Radikal Bebas, Kanisius, Yogyakarta,pp. 13, 77.

Yuliarti, N., 2007, Awas! Bahaya di Balik Lezatnya Makanan, 120, Andi,Yogyakarta.

Zin, Z. M., Hamid, A. A., Osman, A., Saari, N., 2006, Antioxidative Activities ofChromatographic Fractions Obtained from Root, Fruit, and Leaf ofMengkudu (Morinda citrifolia L.), Food Chemistry, Vol. 94 : 169-178.

Zou, Y., Lu, Y., dan Wei, D., 2004, Antioxidant Activity of Flavonoid-RichExtract of Hypericum Perforatum L in vitro, J. Agric Food Chem., 52:5032-5039.


86

LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman labu siam


87

Lampiran 2. Gambar tanaman labu siam dari daerah Sawangan (Magelang)

Lampiran 3. Perhitungan rendemen

Bobot buah labu siam = 1000 g

Fraksi air

Penimbangan Cawan I Cawan IICawan porselen 52,7561 g 53, 8417 gCawan porselen + fraksi air 65, 1848 g 67, 4953 gBobot fraksi 12, 4287 g 13,6536 gTotal bobot fraksi 26,0823 g

Rendemen fraksi air = x 100 %

= , x 100 %

= 2,6 %


88

Lampiran 4. Data penimbangan bahan

1. DPPH

Penimbangan Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5Bobot kertas 0,2122 g 0,2352 g 0,2256 g 0,2117 g 0,2327 gBobot kertas +DPPH

0,2279 g 0,2509 g 0,2415 g 0,2346 g 0,2485 g

Bobot sisa 0,2124 g 0,2353 g 0,2258 g 0,2118 g 0,2329 gBobot DPPH 0,0155 g 0,0156 g 0,0157 g 0,0158 g 0,0156 g

2. Rutin

Penimbangan Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5Bobot kertas 0,2358 g 0,2234 g 0,2561 g 0,2342 g 0,2376 gBobot kertas +rutin

0,2384 g 0,2267 g 0,2587 g 0,2368 g 0,2403 g

Bobot sisa 0,2359 g 0,2236 g 0,2562 g 0,2343 g 0,2378 gBobot rutin 0,0025 g 0,0025 g 0,0025 g 0,0025 g 0,0025g

3. Fraksi air

Penimbangan Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5Bobot cawan 21,6747 g 23,2374 g 25,1211 g 22,2743 g 23,1197 gBobot cawan +rutin

21,7000 g 23,2630 g 25,1466 g 22,2998 g 23,1450 g

Bobot sisa 21,6748 g 23,2376 g 25,1213 g 22,2744 g 23,1198 gBobot rutin 0,0252 g 0,0254 g 0,0253 g 0,0254 g 0,0252 g


89

Lampiran 5. Data perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding dan

larutan uji

1. DPPH

Contoh perhitungan molar DPPH

Replikasi 1

BM = 394,33

Mol = = , , = 00393M = = , , = 0,393

2. Rutin (larutan pembanding)

Konsentrasi Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5Seri 1 2,5 µg/ml 2,5 µg/ml 2,5 µg/ml 2,5 µg/ml 2,5 µg/mlSeri 2 5,1 µg/ml 5,0 µg/ml 5,0 µg/ml 5,1 µg/ml 5,1 µg/mlSeri 3 7,6 µg/ml 7,6 µg/ml 7,5 µg/ml 7,6 µg/ml 7,6 µg/mlSeri 4 10,2 µg/ml 10,1 µg/ml 10,0 µg/ml 10,2 µg/ml 10,1 µg/mlSeri 5 12,7 µg/ml 12,6 µg/ml 12,5 µg/ml 12,7 µg/ml 12,7 µg/ml

Contoh perhitungan konsentrasi larutan pembanding :

Replikasi 1

Konsentrasi larutan stok rutin = , = 250 μ /Konsentrasi larutan intemediet pembanding (seri 1)

V1 x C1 = V2 x C2

0,5 ml x 250 µg/ml = 10 x C2

C2 = 12,5 µg/ml


90

Konsentrasi larutan pembanding (seri 1) :

V1 x C1 = V2 x C2

2 ml x 12,5 µg/ml = 10 x C2

C2 = 2,5 µg/ml

3. Fraksi air (larutan uji)

Konsentrasi Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5Seri 1 20,2 µg/ml 20,3 µg/ml 20,2 µg/ml 20,3 µg/ml 20,2 µg/mlSeri 2 30,2 µg/ml 30,5 µg/ml 30,4 µg/ml 30,5 µg/ml 30,2 µg/mlSeri 3 40,3 µg/ml 40,6 µg/ml 40,5 µg/ml 40,6 µg/ml 40,3 µg/mlSeri 4 50,4 µg/ml 50,8 µg/ml 50,6 µg/ml 50,8 µg/ml 50,4 µg/mlSeri 5 60,5 µg/ml 61,0 µg/ml 60,7 µg/ml 60,9 µg/ml 60,5 µg/ml

Contoh perhitungan konsentrasi larutan uji:

Replikasi 1

Ditimbang 25,2 mg ditambahkan metanol p.a sampai 25 ml, sehingga

komsemtrasinya 1008 µg/ml.

Intermediet (seri 1)

V1 x C1 = V2 x C2

1 ml x 1008 µg/ml = 10 x C2

C2 = 100,8 µg/ml

Konsentrasi larutan uji (seri 1)

V1 x C1 = V2 x C2

2 ml x 100,8 µg/ml = 10 x C2

C2 = 20,16 µg/ml


91

Lampiran 6. Scanning pengkoreksi

1. Scanning metanol


92

2. Scanning metanol : air (1:1 v/v)


93

3. Scanning rutin


94

4. Scanning asam galat


95

5. Scanning fraksi air (400-600 nm)


96

6. Scanning fraksi air (600-800 nm)


97

Lampiran 7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan

1. Penentuan OT

Waktu(menit)

Konsentrasi rutin (µg/ml) Konsentrasi fraksi air (µg/ml)2,5 7,5 12,5 20 40 60

5 0,534 0,435 0,092 0,821 0,624 0,41910 0,503 0,334 0,087 0,819 0,62 0,39515 0,483 0,311 0,086 0,811 0,613 0,38220 0,480 0,285 0,083 0,795 0,596 0,36625 0,476 0,270 0,081 0,78 0,583 0,35230 0,475 0,260 0,080 0,78 0,583 0,35235 0,475 0,260 0,080 0,78 0,583 0,35240 0,475 0,260 0,080 0,78 0,583 0,35245 0,475 0,260 0,080 0,78 0,583 0,35250 0,475 0,260 0,080 0,78 0,583 0,35255 0,475 0,260 0,080 0,78 0,583 0,35260 0,475 0,260 0,080 0,78 0,583 0,352


98

2. Penentuan λ maksimum

a. Scanning DPPH 0,020 Mm


99

b. Scanning DPPH 0,040 mM


100

c. Scanning DPPH 0,080 mM


101

Lampiran 8. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH

% IC= ( / 100 %Rutin

Replikasi Konsentrasi(μg/ml)

Absorbansikontrol

Absorbansilarutan

pembanding

%IC(%)

Persamaan regresilinear

1

2,5

0,890

0,619 30,45 y = Bx + A5,1 0,491 44,83 y = 5,8347 x + 16, 3037,6 0,324 63,6 r = 0,997310,2 0,214 75,9612,7 0,098 88,99

Fraksi air

Replikasi Konsentrasi(μg/ml)

Absorbansikontrol

Absorbansilarutan

fraksi air%IC (%) Persamaan regresi

linear

1

20,16

0,892

0,780 12,56 y = Bx + A30,24 0,623 30,16 y = 1,1588 x - 8,497740,32 0,578 35,2 r = 0,989950,4 0,461 48,3260,48 0,349 60,87

Contoh perhitungan nilai %IC

Rutin (replikasi 1, konsentrasi 2,5 µg/ml)

% IC = , ,, x 100 % = 30,45 %

Fraksi air (replikasi 1, konsentrasi 20,16 µg/ml)

% IC = , ,, x 100 % = 12,56 %


102

Lampiran 9. Perhitungan nilai IC50 fraksi air ekstrak metanol buah labu

siam dan rutin

Bahan

Uji

IC50

rata-rata

(μg/ml) SD

%

CV

(%)

Rep. 1

(μg/ml)

Rep. 2

(μg/ml)

Rep. 3

(μg/ml)

Rep. 4

(μg/ml)

Rep. 5

(μg/ml)

Rutin 5,77 5,78 5,80 5,83 5,81 5,80 0,02 0,34

Fraksi

air 51,36 52,24 51,48 52,49 51,88 51,89 0,48 0,93

Keterangan : Rep = Replikasi ; SD = Simpangan Deviasi ; dan CV =Coefficient of Variant

Persamaan regresi linier dari konsentrasi dengan %IC adalah Bx + A

y = aktivitas antioksidan (%IC)

x = konsentrasi (µg/ml)

IC50 adalah nilai x pada saat y sebesar 50%

Contoh perhitungan nilai IC50 (Rutin replikasi 1)

y = 5,8347 x + 16, 303

50 = 5,8347 x + 16, 303

x = 5,77 µg/ml


103

Lampiran 10. Uji statistik aktivitas antioksidan dengan SPSS 17.0

1. Uji normalitas

Tests of Normality

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

Rutin .167 25 .069 .891 25 .012

F.Air .139 25 .200* .910 25 .030

a. Lilliefors Significance Correction

*. This is a lower bound of the true significance.

2. Uji Mann-Whitney

Test Statisticsb

Kadar

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611

Asymp. Sig. (2-tailed) .009

Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008a

a. Not corrected for ties.

b. Grouping Variable: Faktor


104

Lampiran 11. Penimbangan untuk uji kandungan fenolik total

Penimbangan asam galat

Penimbangan Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5Bobot kertas 0,2341 g 0,2386 g 0,2256 g 0,2178 g 0,2357 gBobot kertas +asam galat

0,2393 g 0,2438 g 0,2307 g 0,2230 g 0,2410 g

Bobot sisa 0,2342 g 0,2388 g 0,2257 g 0,2179 g 0,2359 gBobot asamgalat

0,0051 g 0,0050 g 0,0050 g 0,0051 g 0,0051 g

Penimbangan fraksi air

Bobot Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5Cawan 21,1287 g 21,1342 g 25,6591 g 23,6087 g 24,2625gCawan + fraksi air 21,1389 g 21,143 g 25,6694 g 23,6191 g 24,2729 gIsi 0,0102 g 0,0101 g 0,0103 g 0,0104 g 0,0104 g

Lampiran 12. Optimasi penentuan kandungan fenolik total

1. Penentuan OT

Waktu(menit)

Konsentrasi asam galat (µg/ml)

25 50 1255 0,252 0,563 0,69410 0,274 0,59 0,71615 0,274 0,59 0,76920 0,274 0,59 0,76925 0,274 0,59 0,76930 0,274 0,59 0,769


105

2. Scanning λ maksimum

a. Scanning penentuan kandungan fenolik total asam galat 25 µg/ml


106

b. Scanning penentuan kandungan fenolik total asam galat 75 µg/ml


107

c. Scanning penentuan kandungan fenolik total asam galat 125 µg/ml


108

Lampiran 13. Penentuan kandungan fenolik total

Contoh perhitungan kandungan fenolik total

Replikasi 1

y = 0,004 x + 0,1392

0,676 = 0,004 x + 0,1392

x = 134,2 µg/ml

Kandungan fenolik total

x. = 0,1342 . ,, = 6,58


109

Lampiran 14. Skema jalannya penelitian

Determinasi tanaman

Pengumpulan bahan

Pembuatan ekstrak etanolik buah labu siam

Fraksi washbensin Fraksi air I

Ekstraksi cair-cair dengan etilasetat

Fraksi air II Fraksi etil asetat

Uji pendahuluan

Optimasi metode penetapankandungan fenolik total

Optimasi uji aktivitasantioksidan

Validasi metode penetapankandungan fenolik total

Estimasi penetapankandungan fenolik total

Validasi metode ujiaktivitas antioksidan

Estimasi aktivitasantioksidan

Ekstraksi cair-cair dengan washbensin dan air

Analisis statistik denganSPSS 17.0


110

Lampiran 15. Uji kualitatif fraksi etil asetat

a. Uj kualitati aktivitas antioksidan

(A= rutin ; B = fraksi etil asetat)

b. Uji kualitatif kandungan fenolik total

(A = fraksi etil asetat ; B = asam galat ; C = pelarut)


111

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Uji AktivitasAntioksidan Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan KandunganFenolik Total Fraksi Air Ekstrak Metanolik BuahLabu Siam (Sechium edule Jacq. Swartz.)”memiliki nama lengkap Angela Natalia MetaKarvitasari. Penulis lahir di Purwokerto, JawaTengah pada tanggal 23 Desember 1989,merupakan anak tunggal dari pasangan RichardusEko Nugroho dan Cornelia Widiastuti. Pendidikanformal yang telah ditempuh oleh penulis: TK Santa

Maria Purwokerto (1994-1996), SD Bruderan Purwokerto (1996-2002), SMPNegeri 1 Purwokerto (2002-2005), SMA Negeri 1 Purwokerto (2005-2008). Padatahun 2008, penulis melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Universitas SanataDharma (USD) Yogyakarta. Selama kuliah penulis aktif dalam kegiatan mudikadi Keuskupan Purwokerto. Selain itu, penulis juga aktif dalam beberapakepanitiaan baik di dalam universitas maupun diluar universitas antara lain PanitiaPharmacy Performance (2009), Panitia Bakti Sosial Aksi Puasa PembangunanPengabdian Masyarakat (2009), Panitia Wisata Rohani Mudika KeuskupanPurwokerto (2009), Panitia Wisata Rohani Wanita Katolik KeuskupanPurwokerto (2010) serta menjadi beberapa peserta seminar seperti seminar HerbaMedicines (2008), seminar Kanker Serviks dan Kanker Paru-Paru (2011), seminarHIV-AIDS (2011)


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · mengharapkan saran dan kritik guna...

Documents