plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · mengharapkan saran dan kritik guna...
TRANSCRIPT
UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN
KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI AIREKSTRAK METANOLIK BUAH LABU SIAM
(Sechium edule Jacq. Swartz.)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Angela Natalia Meta Karvitasari
NIM : 088114070
FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA2012
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
i
UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN
KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI AIREKSTRAK METANOLIK BUAH LABU SIAM
(Sechium edule Jacq. Swartz.)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:Angela Natalia Meta Karvitasari
NIM : 088114070
FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA2012
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
“Tidak ada rahasia kesuksesan. Ini adalah hasil dari persiapan, kerja keras,
dan belajar dari kegagalan.”
(Colin Powell)
Skripsi ini aku persembahkan kepada :
Ibu, Bapak, keluarga besarku,
sebagai ungkapan rasa hormat dan baktiku,
Laki-laki yang selalu menyebut namaku di setiap doanya,
semua sahabat, teman, dan almamaterku.
“Tuhan takkan terlambat
Juga tak akan lebih cepat
Ajarlah kami setia s’lalu menanti waktuMu Tuhan.”
(1 Korintus 10 : 13 & Pengkotbah 3 : 11a)
“Jenius adalah 1% inspirasi
dan 99% keringat. Tidak ada
yang dapat menggantikan
kerja keras. Keberuntungan
adalah sesuatu yang terjadi
ketika kesempatan bertemu
dengan kesiapan.”
(Thomas Alfa Edison)
“Kebahagiaan terbesar dalam
kehidupan adalah keyakinan
bahwa kita dicintai apa
adanya, atau lebih tepatnya
dicintai tanpa mempedulikan
diri kita yang apa adanya.”
(Victor Hugo)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PRAKATA
Puji syukur kepada Tuhan karena berkat rahmat dan karunia-Nya penulis
dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan
Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan
Kandungan Fenolik Total Fraksi Air Ekstrak Metanolik Buah Labu Siam
(Sechium edule Jacq. Swartz.)” sebagai salah satu syarat guna memperoleh gelar
Sarjana Farnasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Dalam proses penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari
bantuan dan dukungan dari semua pihak sehingga skripsi ini dapat terselesaikan
dengan baik. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan
terimakasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Prof. Dr. CJ. Soegihardjo, Apt. Sebagai Dosen Pembimbing yang telah
memberikan bimbingan, pengarahan serta ilmu dalam penelitian dan
penyusunan skripsi ini.
2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. sebagai Dosen Penguji atas pengarahan dan
kesediaannya menguji skripsi ini.
3. Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si. sebagai Dosen Penguji atas pengarahan dan
kesediaannya menguji skripsi ini.
4. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. sebagai Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma.
5. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
6. Bapak dan Ibu atas doa dan restu serta dukungan baik moril dan materiil
sehingga skripsi ini bisa selesai serta kasih sayang yang tiada tara.
7. Fransiskus Endi Bawono Utomo dan keluarga yang selalu mendoakan dan
mendukung agar skripsi ini cepat untuk diselesaikan.
8. Sahabat-sahabatku, Fransisca Dian Permanasari, Margaretha Ratih
Vitaningrum, Intan Chintya Dewi, Wilfrida Maria Du’a, Anastasia Fillipa
Veritas, dan Margareta Efa Putri atas doa dan dukungannya selama ini.
9. DPPH team (Valentinus Widyawan, Rollando, Aldo Sahala, dan Anthonius
Pandu) terimakasih atas kerjasama yang telah dilewati bersama dalam
penelitian ini.
10.Teman-teman Farmasi kelas B angkatan 2008, dan FST 2008.
11. Teman-teman KKN kelompok 20 (Gondang Pusung) atas doa dan
dukungannya selama ini.
12.Semua pihak yang telah memberi dukungan dan bantuan yang tidak dapat
desebutkan satu persatu.
Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini banyak kekurangan dan
jauh dari sempurna, untuk itu dengan segala kerendahan hati penulis
mengharapkan saran dan kritik guna perbaikan dan penyempurnaan skripsi ini.
Harapan penulis semoga penelitian dan penyusunan skripsi ini bermanfaat bagi
perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang Farmasi.
Yogyakarta, Januari 2012
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL............................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING..................................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN............................................................................... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN............................................................................ iv
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI................................................... v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA................................................................ vi
PRAKATA............................................................................................................ vii
DAFTAR ISI.......................................................................................................... ix
DAFTAR TABEL................................................................................................ xiii
DAFTAR GAMBAR........................................................................................... xiv
DAFTAR LAMPIRAN........................................................................................ xvi
INTISARI........................................................................................................... xvii
ABSTRACT......................................................................................................... xviii
BAB I PENGANTAR............................................................................................. 1
A. Latar Belakang.................................................................................................. 1
1. Permasalahan................................................................................................ 3
2. Keaslian penelitian....................................................................................... 4
3. Manfaat yang diharapkan............................................................................. 4
B. Tujuan............................................................................................................... 5
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA...................................................................... 6
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
A. Labu Siam......................................................................................................... 6
1. Klasifikasi tanaman...................................................................................... 6
2. Nama lain...................................................................................................... 6
3. Morfologi tanaman....................................................................................... 7
4. Deskripsi tanaman.........................................................................................7
5. Kandungan kimia.......................................................................................... 8
6. Kegunaan labu siam..................................................................................... 9
7. Penelitian antioksidan................................................................................. 10
B. Senyawa Fenolik............................................................................................. 10
C. Radikal Bebas.................................................................................................. 13
D. Antioksidan..................................................................................................... 17
E. Pengukuran Aktivitas Antioksidan................................................................. 21
F. Metode DPPH................................................................................................. 23
G. Ekstraksi.......................................................................................................... 24
H. Spektrofotometer Visibel................................................................................ 27
I. Validasi Metode Analisis................................................................................ 29
J. Landasan Teori................................................................................................ 31
K. Hipotesis.......................................................................................................... 32
BAB III METODE PENELITIAN........................................................................ 33
A. Jenis dan Rancangan Penelitian...................................................................... 33
B. Variabel dan Definisi Operasional.................................................................. 33
C. Bahan Penelitian.............................................................................................. 34
D. Alat Penelitian................................................................................................. 35
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
E. Tata Cara Penelitian........................................................................................ 35
1. Determinasi tanaman.................................................................................. 35
2. Pembuatan ekstrak metanol dan fraksi air buah labu siam......................... 35
3. Uji pendahuluan.......................................................................................... 36
4. Penentuan aktivitas antioksidan................................................................. 37
5. Penentuan kandungan fenolik total............................................................ 39
6. Analisis Hasil............................................................................................. 41
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN.............................................................. 42
A. Hasil Determinasi Tanaman............................................................................ 42
B. Hasil Pengumpulan Bahan.............................................................................. 42
C. Hasil Preparasi Sampel................................................................................... 43
D. Hasil Uji Pendahuluan..................................................................................... 48
1. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan........................................................ 48
2. Uji pendahuluan fenolik............................................................................. 49
E. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan......................................... 50
1. Penentuan operating time (OT).................................................................. 51
2. Penentuan panjang gelombang maksimum................................................ 53
F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan.......................................... 54
1. Akurasi....................................................................................................... 56
2. Presisi......................................................................................................... 59
3. Linearitas.................................................................................................... 59
4. Spesifitas.................................................................................................... 60
G. Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH........................ 62
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
H. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total........................ 68
1. Penentuan operating time (OT).................................................................. 69
2. Penentuan panjang gelombang maksimum................................................ 70
I. Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total......................... 71
1. Akurasi....................................................................................................... 72
2. Presisi......................................................................................................... 72
3. Liniearitas................................................................................................... 74
4. Spesifitas.................................................................................................... 74
J. Hasil Estimasi Kandungan Fenolik Total....................................................... 76
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN................................................................ 81
A. Kesimpulan..................................................................................................... 81
B. Saran................................................................................................................ 81
DAFTAR PUSTAKA........................................................................................... 82
LAMPIRAN.......................................................................................................... 86
BIOGRAFI PENULIS........................................................................................ 111
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
DAFTAR TABEL
Tabel I. Contoh beberapa radikal bebas (Haliwell dan Guitteridge, 2000)...14
Tabel.II. Kekuatan antioksidan dengan metode DPPH (Ariyanto cit.
Sambada, 2011)................................................................................ 24
Tabel III. Rentang akurasi yang dapat diterima (Harmita, 2004).................... 30
Tabel IV. Rentang CV yang masih dapat diterima (Harmita, 2004)................ 30
Tabel V. Hasil % recovery dan %CV uji aktivitas antioksidan rutin...............57
Tabel. VI. Hasil % recovery dan %CV uji aktivitas antioksidan fraksi air....... 58
Tabel VII. Hasil %IC rutin menggunakan radikal DPPH.................................. 65
Tabel VIII. Hasil %IC fraksi air menggunakan radikal DPPH............................ 66
Tabel IX. Hasil IC50 fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam dan rutin..... 67
Tabel X. Hasil % recovery dan %CV penetapan kadar fenolat...................... 73
Tabel XI. Hasil absorbansi berbagai seri konsentrasi asam galat..................... 78
Tabel XII. Hasil absorbansi fraksi air................................................................ 79
Tabel XIII. Hasil kandungan fenolik total fraksi air............................................ 79
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Reaksi antara senyawa fenol dengan pereaksi Follin-Ciocalteu
(Sambada, 2011) .........................................................................12
Gambar 2. Struktur kimia asam galat (Mongkolsilp et al., 2004)................ 13
Gambar 3. Struktur kimia beberapa antioksidan sintetik (Pokorny et al.,
2001)........................................................................................... 19
Gambar 4. Mekanisme pembentukan radikal antioksidan (Sihombing,
2011)........................................................................................... 20
Gambar 5. Reaksi reduksi DPPH (Prakash, Rigelhof, Miller, 2001)............ 23
Gambar 6. Diagram Spektrofotometer UV-Vis (Sastrohamidjodjo, 2001).. 28
Gambar 7. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol
negatif [blanko], B = larutan uji [fraksi air ekstrak
metanolik nuah labu siam], C = kontrol positif
[rutin])......................................................................................... 49
Gambar 8. Hasil uji pendahuluan fenolik (A = kontrol positif [asam galat],
B = larutan uji [fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam],
C = kotrol negatif [blanko])........................................................ 50
Gambar 9. Hasil grafik penentuan OT rutin.................................................. 52
Gambar 10. Hasil grafik penentuan OT fraksi air........................................... 52
Gambar 11. Hasil scanning λ maksimum DPPH pada berbagai konsentrasi..54
Gambar 12. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan rutin......... 55
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
Gambar 13. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan fraksi air
ekstrak metanolik buah labu siam............................................... 55
Gambar 14. Hasil scanning rutin pada λ 400-600 nm.................................... 60
Gambar 15. Hasil scanning fraksi air pada λ 400-600 nm.............................. 61
Gambar 16. Hasil scanning metanol pada λ 400-600 nm............................... 61
Gambar 17. Perubahan warna DPPH disertai dengan penurunan absorbansi
(Molyneux, 2004)....................................................................... 63
Gambar 18. Gugus kromofor dan auksokrom DPPH (Prakash et al., 2001).. 63
Gambar 19. Struktur rutin (Santos, Mazo, Cavalheiro, 2008)........................ 64
Gambar 20. Grafik penentuan OT penetapan kandungan fenolat................... 69
Gambar 21. Hasil scanning λ maksimum senyawa berwarna biru
(molybdenum blue) pada berbagai konsentrasi asam galat......... 70
Gambar 22. Kurva persamaan regresi linier penetapan kadar fenolat total.... 71
Gambar 23. Hasil scanning larutan asam galat pada λ 600-800 nm............... 75
Gambar 24. Hasil scanning fraksi air pada λ 600-800 nm............................. 75
Gambar 25. Hasil scanning metanol-air pada λ 600-800 nm.......................... 76
Gambar 26. Struktur asam galat (Mongkolsilp et al., 2004)........................... 77
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman labu siam.........................86
Lampiran 2. Gambar tanaman labu siam dari daerah Sawangan (Magelang)... 87
Lampiran 3. Perhitungan rendemen....................................................................87
Lampiran 4. Data penimbangan bahan.............................................................. 88
Lampiran 5. Data perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding
dan larutan uji................................................................................ 89
Lampiran 6. Scanning pengkoreksi................................................................... 91
Lampiran 7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan.................................... 97
Lampiran 8. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH............... 101
Lampiran 9. Perhitungan nilai IC50 fraksi air ekstrak metanol buah labu
siam dan rutin.............................................................................. 102
Lampiran 10. Uji statistik aktivitas antioksidan dengan SPSS 17.0.................. 103
Lampiran 11. Penimbangan untuk uji kandungan fenolik total......................... 104
Lampiran 12. Optimasi penentuan kandungan fenolik total.............................. 104
Lampiran 13. Penentuan kandungan fenolik total............................................. 108
Lampiran 14. Skema jalannya penelitian........................................................... 109
Lampiran 15. Uji kualitatif fraksi etil asetat....................................................... 110
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvii
INTISARI
Antioksidan adalah senyawa yang dapat menyumbangkan satu atau lebihelektron kepada radikal bebas, sehingga radikal bebas tersebut dapat diredam.Akibatnya, kerusakan sel oleh radikal bebas dapat dihambat. Labu siam (Sechiumedule Jacq. Swartz.) merupakan sayuran yang banyak disukai dan diketahuimemiliki senyawa fenolik. Senyawa fenolik merupakan senyawa di dalamtanaman yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan.
Penelitian ini dilakukan untuk menentukan aktivitas antioksidan dankandungan fenolik total fraksi air ekstrak metanol buah labu siam. Ekstrakmetanol diperoleh dari proses maserasi buah labu siam dengan penyari metanol.Ekstrak metanol buah labu siam kemudian dilarutkan dengan air kemudiandipartisi dengan wash bensin dan etil asetat. Fraksi air yang diperoleh diujiaktivitas antioksidannya dengan menggunakan metode 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil(DPPH). Hasil dari pengukuran aktivitas antioksidan dinyatakan melalui nilai IC50yang merupakan konsentrasi yang menyebabkan penurunan 50% dari konsentrasiDPPH awal. Adanya senyawa antioksidan akan mengubah warna larutan DPPHdari ungu menjadi kuning dan disertai penurunan absorbansi DPPH. AbsorbansiDPPH dibaca dengan menggunakan spektrofotometer pada λ maksimum 515,8nm. Penentuan kandungan fenolik total menggunakan metode Folin-Ciocalteaudan dinyatakan dengan nilai masa ekivalen asam galat per g fraksi air ekstrakmetanol buah labu siam. Senyawa fenolik akan dioksidasi oleh pereaksi fenolFolin-Ciocalteau dalam suasana basa sehingga terbentuk larutan berwarna biru.Larutan tersebut memiliki λ maksimum 750 nm. Hasil uji aktivitas antioksidanpada fraksi air mempunyai nilai IC50 sebesar (51,89 + 0,48) μg/ml dan tergolongdalam aktivitas antioksidan kuat. Kandungan fenolik total sebesar (6,56 + 0,05)mg ekivalen asam galat per g fraksi air.
Kata kunci : fraksi etil asetat ekstrak metanol buah labu siam (Sechiumedule Jacq. Swartz.), aktivitas antioksidan, DPPH, kandungan fenolik total.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xviii
ABSTRACT
Antioxidants are compounds that can donate one or more electrons to freeradicals, so that free radicals can be muted. Consequently, cell damage by freeradicals can be inhibited. Chayote (Sechium edule Jacq. Swartz.) is a vegetablemuch to preferred and know to have phenolic compounds. Phenolic compoundsare compounds in plants that have antioxidant activity.
This research was conducted to determine the activity and content ofphenolic antioxidants and total the water fraction from methanolic extract ofchayote. This research was conducted to determine the antioxidants activity andtotal phenolic contents of water fraction methanolic extract of chayote. Themethanolic extract obtained by maceration using the methanol solvents and thenwas reconstituted with water and partitioned with wash-bensin and ethyl acetate.The fraction of water obtained were tested using using the radical DPPH,expressed as IC50 is the concentration that causes a decrease of 50% of earlyDPPH concentration.The presence of antioxidant compounds, wil change colourof DPPH from purple to yellow and the absorbance decreases. Absorbancereading was conducted with spectrophotometry at the wave length at 515,8 nm.Total Phenolics contentdetermined by the Folin-Ciocalteau method, expressed asmg equivalent gallic acid per g of water fraction. Phenolics compound willoxidated by Follin-Ciocalteu reagent in alkaline conditions, formed blue solution.The solution has maximum λ at 750 nm. The result of antioxidant activity test ofwater fraction is IC50 (51.89 + 0.48) μg/ml and belonging to the strong antioxidantactivity. Total phenolic content is (6.56 + 0.05) mg equivalent gallic acid per g ofwater fraction
Keywords : water fraction from methanolic extract of chayote (Sechiumedule Jacq. Swartz.), antioxidant, DPPH, total phenolic content
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Penggunaan senyawa antioksidan saat ini semakin meluas seiring dengan
semakin besarnya pemahaman masyarakat tentang peranannya dalam
menghambat penyakit degeneratif seperti penyakit jantung, arteriosclerosis,
kanker, serta gejala penuaan dini. Masalah-masalah ini berkaitan dengan
kemampuan antioksidan untuk bekerja sebagai inhibitor reaksi oksidasi oleh
radikal bebas reaktif yang menjadi salah satu pencetus penyakit-penyakit di atas
(Tahir, Wijaya, Widianingsih, 2003).
Radikal bebas bersifat reaktif karena mempunyai elektron yang tidak
berpasangan pada orbit terluarnya. Reaksi radikal ini berlangsung secara berantai
sehingga akan menghasilkan radikal bebas baru yang jumlahnya terus bertambah.
Radikal bebas yang berlebihan akan menyerang bagian tubuh yang sehat maupun
yang sakit sehingga dalam jangka waktu yang lama akan menyebabkan timbulnya
berbagai macam penyakit (Sauriasari, 2006).
Antioksidan merupakan suatu senyawa kimia yang dapat
menyumbangkan satu atau lebih elektron kepada radikal bebas, sehingga radikal
bebas tersebut dapat diredam (Suhartono, 2002). Antioksidan dapat berasal dari
bahan alam maupun sintetis. Adanya kekhawatiran akan efek samping yang belum
diketahui dari antioksidan sintetik menyebabkan antioksidan alami menjadi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
alternatif yang dibutuhkan (Sunarni, 2005). Hal ini yang menyebabkan adanya
penelitian eksplorasi sumber antioksidan alam yang berasal dari tumbuhan.
Labu siam memiliki efek diuretik yang dapat melancarkan buang air
kecil sehingga kelebihan asam urat bisa dikeluarkan. Selain itu juga bisa
menurunkan lemak darah (kolesterol atau trigliserida), mengobati tekanan darah
tinggi, diabetes, dan memperlancar proses pencernaan. Labu siam juga dapat
menyembuhkan gangguan sariawan, panas dalam, serta menurunkan demam pada
anak-anak karena mengandung banyak air (Ekowahyuni, 2002).
Flavonoid, tanin, dan polifenol merupakan golongan senyawa yang
berpotensi sebagai antioksidan. Senyawa-senyawa tersebut banyak terdapat pada
teh, buah-buahan, dan sayuran (Sofia, 2006). Dalam penelitiannya Marliana,
Suryanti dan Suyono (2005) mengemukakan bahwa labu siam mengandung
flavonoid. Selain itu, Melo, Lima dan Maciel (2006) melaporkan bahwa ekstrak
metanol labu siam mengandung fenolat, flavonoid, tanin terkondensasi, dan asam
askorbat.
Labu siam mengandung senyawa-senyawa yang berpotensi sebagai
antioksidan karena itu penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas
antioksidan buah labu siam dan kandungan fenolik total dari buah labu siam.
Diharapkan dengan diketahuinya potensi buah labu siam sebagai antioksidan,
dapat meningkatkan kegunaan buah labu siam sebagai bahan pangan fungsional.
Senyawa fenolik merupakan sekelompok metabolit sekunder yang
mempunyai cincin aromatik yang terikat dengan satu atau lebih substituen gugus
hidroksi (OH). Oleh karena itu pada umumnya senyawa tersebut larut dalam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
pelarut polar (Markham,1988). Metanol dipilih sebagai penyari karena metanol
merupakan pelarut universal dan penetrasinya ke dalam sel-sel tanaman lebih kuat
dibanding etanol maupun cairan penyari yang lain (Depkes RI b, 2000). Pemilihan
fraksi air didasarkan pada kandungan senyawa fenolik yang terdapat pada buah
labu siam yang mempunyai kelarutan yang baik pada pelarut polar seperti air
sehingga diharapkan aktivitas antioksidan pada fraksi air ini cukup baik.
Salah satu uji untuk menentukan aktivitas antioksidan adalah metode
DPPH (1,1Diphenyl-2-picrylhidrazyl). Pada metode ini penangkap radikal bebas
menyebabkan elektron menjadi berpasangan yang kemudian menyebabkan
penghilangan warna. Nilai aktivitas antioksidan diketahui melalui nilai IC50 yang
merupakan konsentrasi yang menyebabkan penurunan 50% dari konsentrasi
DPPH awal (Sunarni, 2005). Salah satu keuntungan uji aktivitas antioksidan
dengan metode DPPH adalah dapat dikerjakan dengan cepat dan sederhana
dibanding metode lain. Karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
aktivitas antioksidan buah labu siam dengan metode DPPH. Dalam penelitian ini
juga dilakukan penetapan kandungan fenolik total dengan metode Folin-
Ciocalteau .
1. Permasalahan
a. Berapa nilai aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak metanol buah labu siam
yang dinyatakan sebagai IC50 dengan metode DPPH?
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
b. Berapakah kandungan fenolik total fraksi air ekstrak metanol buah labu siam
yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat?
2. Keaslian penelitian
Uji aktivitas antioksidan buah labu siam (Sechium edule Jacq. Swartz.)
merupakan hasil modifikasi penelitian Tri Wahyuni (2009). Pada penelitian Tri
Wahyuni dilakukan uji aktivitas antioksidan buah labu siam dengan metode
emulsi-skaroten-asam-linoleat. Sedangkan Ratih Indah Syari Pratiwi (2011) telah
melakukan penelitian karakterisasi simplisia dan uji aktivitas antioksidan ekstrak
n-heksan, etil asetat dan etanol herba labu siam (Sechium edule Sw) dengan
metode DPPH.
Pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak
metanol buah labu siam dengan metode DPPH. Sejauh penulusuran dan
pengamatan peneliti modifikasi yang dilakukan belum pernah dikerjakan.
3. Manfaat yang diharapkan
a. Manfaat praktis, penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi
bagi penelitian lebih lanjut maupun masyarakat mengenai potensi buah labu siam
sebagai antioksidan alami.
b.Manfaat teoritis, penelitian ini diharapkan dapat memberikan
sumbangan terhadap perkembangan ilmu pengetahuan dalam bidang farmasi,
khususnya tentang penggunaan metode DPPH dalam menguji aktivitas
antioksidan bahan alam.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
B. Tujuan
1. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak metanol buah labu
siam yang dinyatakan sebagai IC50 dengan metode DPPH.
2. Mengetahui kandungan fenolik total fraksi air ekstrak metanol buah labu siam
yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Labu Siam
1. Klasifikasi tanaman
Klasifikasi tanaman buah labu siam dalam sistematika tumbuhan adalah
sebaga berikut.
Devisi : Spermatophyta
Subdivisi : Angiospermae
Kelas : Dicotiledonea
Sub kelas : Dilleniidae
Ordo : Violales
Bangsa : Cucurbitales
Keluarga : Cucurbitaceae
Marga : Sechium
Varietas : Sechium edule (Jacq.) Swartz (Backer and van Den Brink, 1968).
Labu siam termasuk salah satu spesies famili Cucurbitaceae dan
merupakan satu-satunya spesies dalam genus Sechium (Heyne, 1987).
2. Nama lain
Sumatera (Melayu) : Labu Siem
Jawa Barat (Sunda) : Gambas, Waluh Siam
Jawa Tengah : Labu Jipang, Waluh Jipang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
Jawa Timur : Manisah
Nama internasional : chayote atau chajota (Depkes RI a, 2000).
3. Morfologi tanaman
Habistus labu siam berupa perdu dan merambat. Batangnya lunak,
beralur, banyak cabang, terdapat pembelit berbentuk spiral, kasap, dan berwarna
hijau. Daunnya tunggal, tepi bertoreh, ujung meruncing, kasap, panjang 4-25 cm,
lebar 3-20 cm, tangkai panjang, pertulangan menjari, dan berwarna hijau. Bunga
merupakan bunga majemuk, berada di ketiak daun, kelopak bertaju lima, mahkota
beralur, benang sari lima, kepala sari berwarna jingga, putik satu. Buah berbentuk
lonjong, menggantung, permukaan berlekuk, dan berwarna hijau keputihan. Biji
berbentuk pipih, berkeping dua, dan berwarna putih. Akar berupa akar tunggang,
dan putih kecoklatan (Backer and van den Brink, 1968).
4. Deskripsi tanaman
Tanaman labu siam bersifat merambat dengan alat yang berbentuk pilin.
Tanaman ini berbatang panjang, lebih kuat dari mentimun dan bersifat tahunan.
Batang tanamannya kecil tetapi sangat panjang. Buahnya berbentuk bola lampu
dan beraluralur sebanyak 5-20 buah. Buahnya lunak (berdaging) dan banyak
mengandung air (Sunarjono, 2006). Kulit buah tipis dengan daging yang tebal.
Bila dikupas kandungan getahnya keluar. Oleh karena itu, perlu direndam
sebentar dalam air sebelum dimasak. Ada juga yang merebus labu siam muda
langsung beserta kulitnya untuk dijadikan lalap (Nazaruddin, 1998). Pada
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
permukaan buahnya tumbuh bulu-bulu yang tajam dan jarang seperti duri
(Sunarjono, 2006).
Labu siam dapat ditanam di dataran rendah maupun dataran tinggi.
Tempat yang berhawa sejuk, pegunungan paling disukai oleh tanaman tersebut. Di
dataran rendah labu siam sebaiknya ditanam di pinggir-pinggir kolam. Tanaman
tersebutdirambatkan pada para-para di atas kolam karena tempat tersebut lembap
(Sunarjono, 2006).
Labu siam berasal dari Amerika Tengah dan telah beradaptasi pada
daerah tropika serta daerah subtropika yang bebas embun beku. Tanaman ini
paling luas diusahakan di Amerika Tengah, Hindia Barat dan telah dimasukan ke
Malawi, Thailand, Filipina, dan menjadi sayuran penting di beberapa bagian dari
Hindia dan Asia. Akar buah labu siam yang berdaging juga dapat dimakan
(Ronoprawiro, 1993).
5. Kandungan kimia
Buah labu siam mengandung saponin, alkaloid, tanin, polifenol, antiosin,
dan flavonoid (Andrade-Cetto dan Heinrich (cit., Khikmawati, 2009).
Penelitian Marliana, Suryanti, Suyono (2005) yang melakukan penapisan
fitokimia pada ekstrak etanol labu siam dan menghasilkan bahwa ekstrak etanol
labu siam mengandung alkaloid, saponin, kardenolin/bufadienol, dan flavonoid.
Dari penelitian Melo, et al. (2006), menghasilkan bahwa daging buah labu siam
mengandung fenolat sebesar 5,93 ± 0,31 mg katekin/100 g labu siam basah, tanin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
terkondensasi 75,73 ± 3,25 mg proantosianidin/100 g labu siam basah, dan
flavonoid 1,92 ± 0,09 mg kuersetin /100 g labu siam basah.
6. Kegunaan labu siam
Labu siam memiliki efek diuretik yang dapat melancarkan buang air
kecil sehingga kelebihan asam urat bisa dikeluarkan. Selain itu juga bisa
menurunkan lemak darah (kolesterol atau trigliserida), mengobati tekanan darah
tinggi, diabetes, dan memperlancar proses pencernaan. Diduga kandungan serat
dalam labu siam dapat memperlancar proses pencernaan. Labu siam juga dapat
menyembuhkan gangguan sariawan, panas dalam, serta menurunkan demam pada
anak-anak karena mengandung banyak air (Ekowahyuni, 2002).
Sifat diuretik dari labu siam dapat menurunkan tekanan darah tinggi
karena melalui urine yang banyak terbuang kandungan garam di dalam darah pun
ikut berkurang. Berkurangnya kadar garam yang bersifat menyerap atau menahan
air ini akan meringankan kerja jantung dalam memompa darah sehingga tekanan
darah akan menurun. Kandungan alkaloidnya berfungsi sebagai vasodilator.
Penderita diabetes melitus juga cocok mengonsumsi labu siam yang telah
dikukus. Kandungan patinya mengenyangkan sehingga penderita diabetes melitus
tak lagi mengonsumsi makanan pokok secara berlebihan (Ekowahyuni, 2002).
Labu siam juga memiliki efek antioksidan dan antimikrobial (Priantono (cit.,
Khikmawati, 2009).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
7. Penelitian antioksidan
Tri Wahyuni (2009) telah melakukan penelitian terhadap ekstrak metanol
buah labu siam dengan metode metode emulsi-karoten-asam-linoleat yang
dimodifikasi dan diperoleh hasil ekstrak metanol buah labu siam memiliki
aktivitas antioksidan lebih besar dibanding BHT (Butil Hidroksi Toluen) dan tidak
beda nyata dengan aktivitas antioksidan PG (Propil Galat). Golongan senyawa
kimia yang terdapat dalam ekstrak metanol buah labu siam adalah fenolat,
flavonoid, tanin terkondensasi, dan karotenoid.
Ratih Indah Syari Pratiwi (2011) telah melakukan penelitian karakterisasi
simplisia dan uji aktivitas antioksidan ekstrak n-heksana, etil asetat dan etanol
herba labu siam (Sechium Edule Sw) dengan metode DPPH. Dari hasil penelitian
diperoleh bahwa pada ekstrak n-heksana mempunyai nilai IC50 sebesar 156,14
μg/mL, ekstrak etil asetat mempunyai nilai IC50 sebesar 135,15 μg/mL dan ekstrak
etanol mempunyai nilai IC50 sebesar 147,24 μg/mL. Semua ekstrak memiliki
aktivitas antioksidan.
B. Senyawa Fenolik
Senyawa fenolik merupakan sumber antioksidan alami yang aman
digunakan dan merupakan golongan mayoritas senyawa yang bertindak sebagai
antioksidan. Aktivitas antioksidan dari fenolik didapatkan dengan cara mereduksi
radikal bebas sehingga radikal menjadi stabil (Marxen, Vanselow, Lippemeier,
Hitze, Ruser, dan Hansen, 2007). Ketertarikan lain terhadap senyawa fenolik
adalah sifat antioksidannya yang kuat serta toksisitasnya yang rendah dibanding
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
dengan senyawa antioksidan sintesis seperti BHA dan BHT (Caillet, Salmieri,
Lacroix, 2006).
Senyawa fenolik merupakan sekelompok metabolit sekunder yang
mempunyai cincin aromatik yang terikat dengan satu atau lebih substituen gugus
hidroksi (OH) yang terbentuk melalui jalur metabolisme asam sikimat-fenil
propanoid dan jalur aseat-polimalonat. Termasuk dalam kelompok senyawa ini
adalah fenol sederhana, asam fenolat, kumarin, tanin dan flavonoid. Dalam
tananaman, senyawa-senyawa ini biasanya berada dalam bentuk glikosida atau
esternya (Proestos, Sereli, Komaitis, 2006). Golongan yang terbanyak dari
senyawa fenolik adalah flavonoid. Pada umumnya flavonoid larut dalam pelarut
polar (Markham,1988).
Senyawa fenolik dalam suatu sampel secara kualitatif dan kuantitatif
dapat ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah
dengan adanya senyawa yang dapat mereduksi reagen fenol Folin-Ciocalteu, akan
menyebabkan terbentuk senyawa berwarna biru yang proporsional dengan jumlah
senyawa yang dapat mereduksi dan dinyatakan dalam nilai ekuivalen asam galat
(Abdul-Fadl, 1949).
Metode Folin-Ciocalteu pertama kali dikembangkan pada tahun 1927
untuk menganalisis asam amino tirosin. Adanya senyawa fenolik akan dioksidasi
oleh reagen asam fosfomolibdat-tungstat menghasilkan produk senyawa berwarna
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
yang dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum 745-750
nm :
Na2WO4/Na2MoO4 (fenol-MoW11O40)-4
Mo(IV) (kuning) + e- Mo(V) (Biru)
Metode ini sederhana, sensitif, dan teliti. Metode ini terjadi dalam suasana basa
sehingga dalam penentuan kadar fenolik dengan pereaksi Folin-Ciocalteu
digunakan natrium karbonat yang bertujuan untuk membentuk suasana basa
(Prior, Wu, Schaich, 2005).
Gambar 1. Reaksi antara senyawa fenol dengan pereaksi Follin-Ciocalteu(Sambada, 2011)
Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai ekivalen asam galat. Asam
galat (Gambar 2) merupakan asam dengan 3 gugus hidroksi fenolik sehingga
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
dapat digunakan sebagai senyawa baku untuk menetapkan kadar senyawa fenolik
total. Alasan lain penggunaan asam galat sebagai pembanding adalah tersedianya
asam galat dalam kemurnian yang tinggi dan stabil serta harganya yang relatif
lebih murah dibandingkan dengan senyawa standar yang lain (Mongkolsilp,
Pongbupakit, Sae-Lee, Sitthithaworn, 2004).
Gambar 2. Struktur kimia asam galat (Mongkolsilp et al., 2004)
C. Radikal Bebas
Radikal bebas secara sederhana didefinisikan sebagai suatu spesies yang
mampu berada dalam keadaan tersendiri yang memiliki satu atau lebih elektron
tidak berpasangan pada orbit terluarnya. Kehadiran satu atau lebih elektron tidak
berpasangan biasanya menyebabkan radikal bebas sangat mudah tertarik oleh
medan magnet, dan terkadang menyebabkan radikal bebas sangat reaktif,
meskipun reaktivitas kimia radikal bervariasi pada spektrum yang luas (Haliwell
dan Guitteridge, 2000).
Elektron yang tidak berpasangan cenderung untuk membentuk pasangan
dengan menarik elektron dari senyawa lain sehingga terbentuk radikal baru.
Radikal bebas memiliki dua sifat sebagai berikut.
1) Reaktivitas tinggi karena cenderung menarik elektron, dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
2) dapat mengubah suatu molekul menjadi suatu radikal lain (Sjabana dan
Bahalwan, 2002).
Tabel I. Contoh beberapa radikal bebas (Haliwell dan Guitteridge,2000)
Nama FormulaAtom hidrogen H∙Triklorometil CCl∙
3
Superoksid O.2
Hidroksil OH∙Tiol/pertiol RS∙Peroksil,alkoksil RO∙Oksida nitrogen NO∙Radikal nitrogen C6H5N=N∙
Elektron dari radikal bebas yang tidak berpasangan ini sangat mudah
menarik elektron dari molekul lainnya sehingga radikal bebas tersebut menjadi
lebih reaktif. Oleh karena sangat reaktif, radikal bebas sangat mudah menyerang
sel-sel yang sehat di dalam tubuh. Bila tidak ada pertahanan yang cukup optimal
maka sel-sel sehat tersebut menjadi tidak sehat atau sakit (Hernani dan Rahardjo,
2005).
Teori modern dari ROS (Reactive Oxygen Species) menyatakan bahwa
ROS memainkan peran ganda. ROS tidak hanya berhubungan dengan peroksidasi
lipid yang menyebabkan kerusakan pada makanan, tetapi juga menyebabkan
berbagai macam penyakit seperti proses penuaan sel, mutagenesis, karsinogenis,
penyakit jantung, diabetes, dan neurodegenerasi (Zou, Lu, Wei, 2004).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
Secara umum, pembentukan radikal peroksi yang akan menyerang asam
lemak adalah sebagai berikut.
1. Tahap inisiasi
Tahap inisiasi merupakan awal pembentukan radikal asam lemak, reaksinya
sebagai berikut :
RH R* + H*
2. Tahap propagasi
Tahap propagasi merupakan pemanjangan rantai radikal, radikal asam lemak akan
bereaksi dengan oksigen membentuk radikal peroksi.
R* + O2 ROO*
ROO* + RH ROOH +R*
3. Tahap terminasi
Tahap terminasi merupakan bereaksinya radikal dengan radikal lain membentuk
molekul yang stabil. Reaksinya sebagai berikut :
ROO* +ROO* non radikal
R* + ROO* non radikal
R* + R* non radikal
(Winarsi, 2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
Radikal bebas, khususnya radikal hidroksil dapat merusak tiga senyawa
yang merupakan penyusun makhluk hidup, yaitu :
1. Asam lemak, khususnya asam lemak tak jenuh yang merupakan komponen
penting fosfolipid yang menyusun membran sel.
2. DNA, yang merupakan perangkat gengetik sel.
3. Protein yang memegang peranan penting seperti enzim, reseptor, antibodi, dan
sitoskeleton (Sjabana dan Bahalwan, 2002).
Target utama radikal bebas adalah protein, asam lemak tak jenuh dan
lipoprotein, serta unsur DNA termasuk karbohidrat. Senyawa radikal bebas bebas
di dalam tubuh dapat merusak asam lemak tak jenuh ganda pada membran sel
sehingga dinding sel menjadi rapuh, merusak basa DNA sehingga mengacaukan
sistem genetika selanjutnya terjadi pembentukan sel kanker (Winarsi, 2007).
Oksidan dan radikal bebas memiliki sifat-sifat yang mirip dan
menghasilkan akibat yang sama meskipun melalui proses yang berbeda. Inilah
yang menyebabkan pengertian keduanya menjadi sering rancu. Oksidan adalah
senyawa yang dapat menarik atau menerima elektron. Sifat radikal bebas yang
mirip dengan oksidan terletak pada kecenderungannya untuk menarik elektron.
Sama halnya dengan oksidan, radikal bebas adalah juga penerima elektron,
sehingga radikal bebas digolongkan dalam oksidan, tetapi tidak semua oksidan
adalah radikal bebas (Sjabana dan Bahalwan, 2002).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
D. Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang dapat mengikat radikal bebas,
akibatnya kerusakan sel dapat dihambat (Winarsi, 2007). Antioksidan dapat
menghambat ROS (Reactive Oxygen Species) dan radikal bebas lainnya sehingga
antioksidan dapat mencegah penyakit-penyakit yang dihubungkan dengan radikal
bebas seperti karsinogenesis, kardiovaskuler, dan penuaan (Halliwell dan
Gutteridge, 2000).
Tubuh memiliki sistem pertahanan internal terhadap radikal bebas. Sistem
pertahanan tersebut dapat dikelompokkan menjadi tiga golongan sebagai berikut.
1) Antioksidan primer, yaitu antioksidan yang dapat menghalangi pembentukan
radikal bebas baru. Yang termasuk dalam golongan ini adalah superoksida
dismutase (SOD) dan katalase. SOD akan mengkatalisis dismutasi radikal
anion superoksida menjadi oksigen dan hidrogen peroksida, sedangkan
katalase akan mengubah hidrogen peroksida menjadi oksigen dan air ( Niki et
al., 1995 cit Hertiani, 2000).
2) Antioksidan sekunder atau penangkap radikal (radical scavenger), yaitu
antioksidan yang dapat menekan terjadinya reaksi rantai baik pada awal
pembentukan rantai maupun pada fase elongasi ( Niki et al., 1995 cit Hertiani,
2000).
3) Antioksidan tersier, yaitu antioksidan yang memperbaiki kerusakan-kerusakan
yang telah terjadi, yang termasuk golongan ini adalah enzim yang memperbaiki
DNA dan metionin sulfoksida reduktase ( Niki et al., 1995 cit Hertiani, 2000).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
Sumber antioksidan dalam sistem biologi, yaitu :
a) Enzim (superoksid dismutase, glutation peroksidase dan katalase),
b) molekul besar (albumin, seruloplasmin, ferritrin dan protein lain),
c) molekul kecil (asam askorbat, glutation, asam urat, tokoferol, karetenoid, dan
polifenol), dan
d) hormon (estrogen, angiotensin, melatonin) (Prior et al., 2005).
Menurut sumbernya, antioksidan dapat digolongkan menjadi dua macam,
yaitu antioksidan sintetik dan alami. Antioksidan sintetik merupakan antioksidan
yang dibuat melalui sintesis secara kimia sedangkan antioksidan alami merupakan
antioksidan yang diproduksi langsung oleh tumbuhan maupun tubuh (Gulcin,
Uguz, Oktay, Beydemir, dan Kufrevioglu, 2004).
Beberapa senyawa antioksidan sintetik yang sering digunakan untuk
memperlambat oksidasi lipid dalam makanan adalah senyawa-senyawa fenolik
seperti ter-butil hidroksi anisol (BHA), ter-butil hidroksi toluen (BHT), propil
galat (PG) dan ter-butil hidrokuinon (TBHQ) (Pokorny, Yanishlieva, Gordon,
2001). Menurut penelitian, penggunaan antioksidan sintetik dalam jumlah tinggi
dapat mengakibatkan timbulnya kanker di sekitar lambung pada tikus dan tupai.
Sejumlah penelitian yang lain mengatakan bahwa pemberian BHA akan
mengakibatkan alergi pada sejumlah orang karena terganggunya kesetimbangan
metabolisme lemak yang terdapat dalam tubuh (Yuliarti, 2007).
Antioksidan sintetis mempunyai efektifitas yang tinggi, namun kurang
aman bagi kesehatan sehingga penggunaannya diawasi dengan ketat di berbagai
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
negara. Oleh karena itu, perlu dicari sumber antioksidan alami yang lebih aman
daripada antioksidan sintetis untuk dikembangkan. Antioksidan alami bisa berasal
dari rempah-rempah, buah atau tanaman (Pujimulyani, 2003).
Gambar 3. Struktur kimia beberapa antioksidan sintetik (Pokornyet al., 2001)
Sekarang ini, banyak perhatian terarah pada antioksidan alami terutama
senyawa fenolik yang mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi (Zin, Hamid,
Osman, Saari, 2004).
Efek antioksidan mengacu pada seyawa fenolik, seperti flavonoid, asam
fenolat dan diterpen fenolik. Senyawa-senyawa polifenol mampu menghambat
autooksidasi melalui mekanisme penangkapan radikal dengan cara
menyumbangkan satu elektron yang tidak berpasangan dalam radikal bebas
sehingga banyaknya radikal bebas menjadi berkurang (Pokorny et al.,2001).
Setelah bereaksi dengan radikal bebas dan menyumbangkan satu
elektronnya antioksidan akan membentuk radikal antioksidan namun radikal
antioksidan ini bersifat tidak reaktif karena distabilkan oleh cincin fenolik
(Pokorny et al.,2001).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
Gambar 4. Mekanisme pembentukan radikal antioksidan (Sihombing, 2011)
Aktivitas senyawa polifenol sebagai antioksidan meliputi tiga
mekanisme, yaitu :
a. Aktivitas penangkapan radikal bebas dengan proses transfer elektron,
b. mencegah spesies senyawa reaktif memproduksi katalisis melalui reaksi
pengkelatan logam, dan
c. interaksi dengan antioksidan lain untuk meningkatkan aktivitasnya (Winarsi,
2007).
Mekanisme lain yang sering terjadi adalah menghambat peruraian
hidroperoksidase menjadi radikal bebas. Hidroperoksidase yang berasal dari lipid
dapat terurai menjadi membentuk radikal bebas peroksil dan hidroksil dengan
katalis logam berat. Karena itu, senyawa-senyawa yang dapat mengkelat logam
juga termasuk dalam antioksidan. Beberapa senyawa disebut sebagai sinergis
karena senyawa tersebut dengan sendirinya tidak mempunyai aktivitas antioksidan
akan tetapi senyawa tersebut dapat meningkatkan aktivitas antioksidan senyawa
lain (Pokorny et al., 2001).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
Suatu epidemologi menunjukkan bahwa dengan mengkonsumsi sayuran
dan buah-buahan dapat melindungi tubuh melawan kerusakan oksidatif dengan
menghambat atau meredam radikal bebas. Hal ini disebabkan karena kandungan
senyawa-senyawa yang mampu menangkap radikal bebas seperti polifenol (Zin et
al., 2004).
E. Pengukuran Aktivitas Antioksidan
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan baik secara kualitatif
maupun kuantitatif. Uji kualitatif dilakukan untuk mengetahui apakah suatu
senyawa memiliki aktivitas antioksidan atau tidak, yang dapat dilakukan dengan
kromatografi kertas atau kromatografi lapis tipis. Uji kuantitatif dilakukan untuk
mengetahui seberapa besar kemampuan suatu senyawa tersebut sebagai
antioksidan (Pokorny et al., 2001). Secara kuantitatif, terdapat beberapa metode
untuk mengetahui aktivitas suatu senyawa sebagai antioksidan yang diantaranya :
1. Pengujian penangkapan radikal
Pengujian dengan cara ini dilakukan dengan mengukur penangkapan radikal
sintetik dalam pelarut polar seperti metanol atau etanol pada suhu kamar. Radikal
sintetik yang biasa digunakan adalah DPPH (2,2-difenil-1-pikril hidrazil) dan 2
(2,2’-azinobis(3-etil benztiazolin-asam sulfonat)). Dengan uji ini, penangkapan
radikal DPPH oleh suatu senyawa diikuti dengan penurunan absorbansi pada
517nm yang terjadi karena reduksi radikal tersebut oleh antioksidan menurut
reaksi :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
DPPH∙+ AH DPPH-H + A
∙
DPPH∙+ R
∙DPPH-R
(Pokorny et al., 2001).
2. Pengujian aktivitas antioksidan dengan sistem linoleat-tiosianat
Asam linoleat merupakan asam lemak tak jenuh dengan dua buah ikatan rangkap
yang mudah mengalami oksidasi membentuk peroksida. Peroksida ini selanjutnya
mengoksidasi ion fero menjadi ion feri. Ion feri bereaksi dengan amonium
tiosianat membentuk kompleks feri-tiosianat (Fe(CNS)3) yang berwarna merah.
Intensitas warna merah ini diukur absorbansinya pada panjang gelombang 490
nm. Semakin intens warna merahnya menunjukkan bahwa semakin banyak
peroksida yang terbentuk (Pokorny et al., 2001).
3. Pengujian dengan asam tiobarbiturat atau TBA (Thio Barbituric Acid)
Pengujian ini berdasarkan adanya malonaldehid yang terbentuk dari asam lemak
bebas tidak jenuh dengan paling sedikit mempunyai tiga ikatan rangkap dua.
Malonaldehid selanjutnya bereaksi dengan asam tiobarbiturat membentuk produk
kromogen yang berwarna merah yang dapat diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 532 nm (Pokorny et al., 2001).
4. Pengujian dengan sistem β-karoten-linoleat
Pengujian ini dilakukan dengan mengamati kecepatan terjadinya pemucatan
warna β-karoten (Pokorny et al., 2001).
Selain dengan keempat metode diaatas, antioksidan dapat ditentukan
dengan bilangan peroksidase, bilangan para-anisidin, dan dengan bilangan
oktanoat (Pokorny et al., 2001).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
F. Metode DPPH
Salah satu uji untuk menentukan aktivitas antioksidan penangkap radikal
adalah metode 1,1 Diphenyl-2-picrylhidrazyl (DPPH). Metode DPPH
memberikan informasi reaktivitas senyawa yang diuji dengan suatu radikal stabil.
DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna
violet gelap. Penangkap radikal bebas menyebabkan elektron menjadi
berpasangan yang kemudian menyebabkan penghilangan warna yang sebanding
dengan jumlah elektron yang diambil (Sunarni, 2005).
Reaksi reduksi DPPH dapat dilihat sebagai berikut.
Gambar 5. Reaksi reduksi DPPH (Prakash, Rigelhof, Miller, 2001)
Aktivitas antioksidan merupakan kemampuan suatu senyawa atau ekstrak
untuk menghambat reaksi oksidasi yang dapat dinyatakan dengan persen
penghambatan. Parameter yang dipakai untuk menunjukan aktivitas antioksidan
adalah harga konsentrasi efisien atau efficient concentration (EC50) atau Inhibition
Concentration (IC50), yaitu konsentrasi suatu zat antioksidan yang dapat
menyebabkan 50% DPPH kehilangan karakter radikal atau konsentrasi suatu zat
antioksidan yang memberikan % penghambatan 50% ( Molyneux, 2004 ).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
Metode DPPH memiliki kelebihan antara lain yaitu mudah digunakan,
mempunyai tingkat sensitifitas yang tinggi, dan dapat menganalisis sejumlah
besar sampel dalam jangka waktu yang singkat (Kim, Lee.K, Lee.H, Lee.C,
2002).
Tabel.II. Kekuatan antioksidan dengan metode DPPH (Ariyanto cit.Sambada, 2011)
Intensitas Nilai IC50Sangat kuat < 50 µg/mlKuat 50-100 µg/mlSedang 101-150 µg/mlLemah >150 µg/ml
G. Ekstraksi
Ekstrak merupakan sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi
senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut
yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau
serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah
ditetapkan (Depkes RI b, 2000).
Ekstraksi merupakan kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat
larut dalam pelarut cair sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut.
Senyawa aktif yang terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkan ke
dalam minyak atsiri, alkaloid, flavonoid dan lain-lain. Struktur kimia yang
berbeda-beda akan mempengaruhi kelarutan serta stabilitas senyawa-senyawa
tersebut terhadap pemanasan, udara, cahaya, logam berat, dan derajat keasaman
(Depkes RI b, 2000).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Ada beberapa metode ekstraksi yang sering digunakan, antara lain :
maserasi, perkolasi, sokletasi dan infundasi. Maserasi adalah proses ekstraksi
simplisia menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau
pengadukan pada temperatur kamar. Secara teknologi, maserasi termasuk
ekstraksi dengan prinsip pencapaian konsentrasi pada keseimbangan (Depkes RI
b, 2000).
Maserasi merupakan proses yang paling tepat yang mana obat yang
sudah halus memungkinkan untuk direndam dengan pelarut sampai meresap dan
melunakkan susunan sel, sehingga zat-zat yang mudah larut akan melarut. Dalam
proses maserasi, bahan biasanya ditempatkan dalam wadah/bejana bermulut lebar.
Bersama pelarut yang sudah ditetapkan, bejana ditutup rapat, dan isinya dikocok
berulang-ulang selama 2-14 hari. Pengocokan memungkinkan pelarut mengalir
nerulang-ulang ke seluruh permukaan dari bahan yang sudah halus (Ansel, 1989).
Beberapa modifikasi dapat dilakukan pada metode maserasi, yakni:
1. Digesti, merupakan maserasi dengan pemanasan lemah pada suhu 400-500C.
Maserasi seperti ini hanya digunakan untuk zat aktif yang tahan terhadap
pemanasan.
2. Maserasi dengan mesin pengaduk. Adanya penggunaan mesin pengaduk yang
berputar terus-menerus dapat mempersingkat waktu maserasi terjadi 6-24 jam.
3. Remaserasi, merupakan maserasi dengan cairan penyari yang ada dua. Serbuk
simplisia dimaserasi dengan cairan pertama, dienapkan tuangkan dan diperas,
kemudia dimaserasi kembali dengan cairan yang kedua.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
4. Maserasi melingkar, merupakan proses maserasi dengan cairan penyari yang
selalu bergerak dan menyebar, dengan demikian proses maserasi akan menjadi
lebih baik. Cairan penyari dipompa dari bawah bejana penyari, melalui pipa
penghubung dan kemudian masuk kembali ke bejana penyari dengan cara
diemburkan oleh alat penyembur ke permukaan serbuk simplisia. Proses tersebut
dilakukan secara berulang hingga cairan penyari menjadi jenuh oleh zat aktif
(Ansel, 1989).
Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai
sempurna (exhausted etraction) yang umumnya dilakukan pada temperatur
ruangan. Proses ini terdiri atas tiga tahap yaitu pengembangan bahan, tahap
maserasi antara dan tahap perkolasi sebenarnya yang berupa penetesan dan
penampunga ekstrak (Depkes RI b, 2000).
Soxhletasi adalah ekstraksi dengan menggunakan alat khusus yang mana
pelarut yang digunakan untuk menyari selalu baru sehingga ekstraksi yang
kontinyu dapat terjadi. Pelarut yang selalu baru tersebut didapat dengan
menguapkan pelarut yang ada dan diembunkan kembali oleh pendingin balik
(Depkes RI b, 2000).
Infusa adalah sediaan cair yang dibuat dengan mengekstraksi simplisia
nabati dengan air pada suhu 900C selama 15 menit. Prinsip kerja infundasi adalah
simplisia dengan derajat halus yang sesuai dalam panci secukupnya, dipanaskan di
atas tangas air selama 15 menit, terhitung mulai suhu mencapai 900C sambil
sekali-kali diaduk, diserkai selagi panas melalui kain flanel, ditambah air panas
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
secukupnya melalui ampas sehingga diperoleh volume infus yang dikehendaki
(jika tidak dinyatakan lain, dibuat infusa 10%) (Depkes RI b, 2000).
Flavonoid merupakan senyawa fenolik terbanyak yang terdapat di dalam
tumbuhan. Untuk menganalisis flavonoid lebih ideal menggunakan tumbuhan
yang segar meskipun pada simplisia kering yang disimpan dengan hati-hati
selama bertahun-tahun masih mungkin memberikan hasil yang bagus. Namun,
dalam bahan yang sudah dikeringkan dan disimpan dalam waktu yang lama,
terdapat kecenderungan glikosida diubah menjadi bentuk aglikonnya oleh fungi,
dan aglikon ini mudah teroksidasi oleh adanya cahaya maupun udara (Markham,
1988).
H. Spektrofotometer Visibel
Apabila cahaya mengenai suatu senyawa, maka sebagian dari cahaya
tersebut akan diserap oleh molekul-molekul sesuai dengan struktur molekul.
Apabila besarnya perbedaan energi antara keadaan tingkat dasar dengan keadaan
tereksitasi suatu senyawa dengan besarnya energi cahaya yang mengenainya
sama, maka elektron-elektron pada keadaan dasar akan tereksitasi ke tingka energi
eksitasi dan sebagian energi cahaya yang sesuai dengan panjang gelombang ini
diserap. Perbedaan energi antara tingkat dasar dan tingkat tereksitasi untuk setiap
senyawa besarnya berbeda-beda sehingga frekuensi yang diserap juga akan
spesifik untuk tiap-tiap senyawa (Sastrohamidjodjo, 1991).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
Instrumen yang digunakan untuk mempelajari serapan atau emisi radiasi
elektromagnetik sebagai fungsi dari panjang gelombang disebut spektrometer atau
spektrofotometer. Cara kerja spektrofotometer UV-Vis sebagai berikut.
a. Sinar dari sumber radiasi diteruskan menuju monokromator,
b. monokromator sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah cahaya
yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monokromatis,
c. cahaya monokromatis kemudian dilewatkan pada sampel. Digunakan kuvet
untuk meletakkan sampel, kuvet biasa terbuat dari gelas atau kuarsa transparan,
d. detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan
mengubahnya menjadi arus listrik, dan
e. meter/pencatat akan menangkap besarnya isyarat listrik yang berasal dari
detektor (Sastrohamidjodjo, 2001).
Gambar 6. Diagram Spektrofotometer UV-Vis (Sastrohamidjodjo, 2001)
Senyawa yang mempunyai gugus kromofor apabila mengalami interaksi
denga radiasi elektromagnetik pada daerah UV-Vis (200-800 nm) maka akan
menghasilkan transisi elektromagnetik dan spektra absorbansi elektromagnetik.
Spektra absorbansi tersebut dapat digunakan untuk analisis kuantitatif
dikarenakan jumlah radiasi elektromagnetik yang diserap sebanding dengan
jumlah molekul penyerapnya. Spektrum UV mempunyai absorbansi antara 100-
400 nm, sedangkan spektrum visibel atau tampak mempunyai absorbansi antara
400-800 nm (Fessenden dan Fesenden, 1995).
Sumberradiasi
Monokromator
Meter/pencatat
DetektorSelpenyerap
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
Panjang gelombang cahaya UV atau tampak yang diserap oleh suatu
senyawa tergantung pada kemudahan promosi elektron. Molekul-molekul akan
menyerap pada panjang gelombang yang lebih pendek apabila molekul tersebut
membutuhkan lebih banyak energi untuk promosi elektron (Fessenden dan
Fesenden, 1995).
Atom gugus fungsional seperti OH, NH2, Cl yang memiliki elektron
tidak berpasangan (non bonding) tidak menunjukkan absorbsi sendiri, tetapi dapat
mempengaruhi intensitas suatu pita absorbsi atau panjang gelombang dari suatu
kromofor. Gugus-gugus ini disebut sebagai auksokrom. Apabila intensitas
absorbsi meningkat maka dinamakan efek hiperkromik, sedangkan bila intensitas
absorbsi menurun dinamakan efek hipokromik. Apabila yang berubah panjang
gelombangnya maka dapat terjadi pergeseran hipsokromik yaitu pergeseran ke
arah panjang gelombang yang lebih pendek atau pergeseran batokromik, yaitu
pergeseran ke arah pajang gelombang yang lebih panjang (Sastrohamidjojo,
1991).
I. Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis merupakan ukuran untuk membuktikan bahwa
metode yang digunakan memberikan hasil seperti yang diharapkan dengan
kecermatan dan ketelitian yang memadai (Mulja dan Hanwar, 2003).
Parameter validasi metode analisis antara lain adalah akurasi, presisi dan
linearitas. Akurasi suatu metode merupakan keterdekatan nilai pengukuran dengan
nilai sebenarnya dari analit dalam sampel (Mulja dan Hanwar, 2003).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
Tabel III. Rentang akurasi yang dapat diterima (Harmita, 2004)
Analit pada matriksampel
Rata-rata yangdiperoleh (%)
100 98-102>10 98-102>1 97-103
>0,1 95-1050,01 90-1070,001 90-107
0,000.1(1 ppm) 80-1100,000.01(100 ppb) 80-1100,000.001(10 ppb) 60-1150,000.000.1(1ppb) 40-120
Presisi suatu metode analisis merupakan sejumlah pancaran hasil yang
diperoleh dari analisis berulangkali pada suatu sampel homogen. Presisi
dinyatakan dalam standar deviasi atau koefisien variasi (Mulja dan Hanwar,
2003).
Tabel IV. Rentang CV yang masih dapat diterima (Harmita, 2004)
Analit pada matriksampel (%)
KV (%)
>1 2,50,001 5
0,000.1 (1ppm) 160,0000.000.1 (1ppb) 32
Linieritas pada suatu metode analisis dari suatu prosedur analisis
merupakan kemampuannya untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung
proporsional dengan konsentrasi (jumlah) analit di dalam sampel. Persyaratan data
linieritas yang bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien korelasi ( r ) > 0,999
(Mulja dan Hanwar, 2003).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode untuk mengukur dengan
akurat respon analit diantara seluruh komponen sampel potensial yang mungkin
ada dalam matriks sampel (Mulja dan Hanwar, 2003).
J. Landasan Teori
Radikal bebas merupakan senyawa yang tidak stabil karena memiliki
elektron yang tidak berpasangan pada kulit terluarnya. Radikal bebas akan
menstabilkan diri dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul di
sekitarnya sehingga dapat menyebabkan kerusakan sel dan selanjutnya akan
menimbulkan berbagai macam penyakit. Oleh karena itu, diperlukan senyawa
antioksidan yang dapat menghambat reaksi oksidasi radikal bebas. Senyawa
fenolik merupakan antioksidan alami yang terdapat pada tumbuhan dan aman
untuk digunakan.
Buah labu siam merupakan sayuran yang telah banyak dikonsumsi oleh
masyarakat Indonesia sebagai makanan sehari-hari. Senyawa fenolik yang
terdapat pada buah labu siam adalah flavonoid.
Senyawa fenol seperti vitamin E dan flavonoid yang terdapat pada
tanaman mampu berfungsi sebagai antioksidan. Flavonoid dapat mendonorkan
atom hidrogen ke radikal bebas sehingga radikal bebas menjadi stabil.
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan metode DPPH.
DPPH merupakan suatu radikal bebas ketika elektronnya menjadi berpasangan
oleh karena adanya senyawa antioksidan maka akan terjadi peluruhan warna
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
larutan DPPH dari ungu menjadi kuning dan menyebabkan penurunan absorbansi
secara stokiometri yang sesuai dengan jumlah elektron yang diambil .
Kandungan total fenolik ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu.
Dengan adanya senyawa fenolik dalam sampel akan mereduksi reagen fenol
Folin-Ciocalteu sehingga terbentuk larutan berwarna biru dimana intensitas warna
biru yang dihasilkan sebanding dengan kandungan fenolik dalam sampel.
K. Hipotesis
Fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam memiliki aktivitas
antioksidan dinyatakan sebagai IC50 dan memiliki kandungan fenolik yang
dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental karena adanya
perlakuan terhadap senyawa uji.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel
a. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam.
b. Variabel tergantung berupa kemampuan fraksi air ekstrak metanolik daun sirih
untuk menangkap radikal DPPH (%IC).
c. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu
pemanenan, umur buah yang dipanen dan jumLah buah segar yang digunakan.
d. Variabel pengacau tak terkendali berupa cahaya matahari, curah hujan, cuaca,
kelembapan ruangan, dan komposisi senyawa penyusun ekstrak.
2. Definisi operasional
a. Buah labu siam merupakan buah dari tanaman labu siam yang dipetik dari
daerah Sawangan, Kecamatan Muntilan, Kabupaten Magelang
b. Ekstrak buah labu siam adalah ekstrak kental yang diperoleh dari hasil
maserasi dengan metanol.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
c. DPPH adalah salah satu metode yang digunakan untuk menguji aktivitas
antioksidan. DPPH merupakan suatu radikal bebas yang akan bereaksi dengan
senyawa antioksidan dan menyebabkan terjadinya peluruhan warna DPPH dari
ungu menjadi kuning sehingga absorbansi DPPH akan menurun.
d. Persen inhibition concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan
kemampuan fraksi air ekstrak metanolik daun sirih untuk menangkap radikal
DPPH.
e. IC50 adalah nilai konsentrasi fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam yang
menghasilkan penangkapan 50% radikal DPPH.
C. Bahan Penelitian
Bahan tanaman yang digunakan adalah buah labu siam yang diperoleh
dari daerah Sawangan, Kecamatan Muntilan, Kabupaten Magelang. Bahan kimia
farmasetis (CV. General Labora) berupa metanol dan akuades. Bahan kimia pro
analitik (E.Merck) berupa metanol, silika G254, n-butanol, asam asetat glasial.
Bahan kualitas pro analitik (Sigma) berupa rutin, DPPH, asam galat, Folin-
Ciocalteu, DMSO. Bahan kualitas teknis Brataco Chemica berupa wash bensin
aluminium foil dan etilasetat.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
D. Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa vortex (Junke &
Kunkel), spektrofotometer UV-VIS (Perkin Elmer Lamda 20), blender, corong,
Buchner, oven, mikropipet 10-1000 µL; 1-10 mL (Acura 825, Socorex), neraca
analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P), vacuum rotary evaporator (Junke &
Kunkel), waterbath (Labo-tech, Heraceus), tabung reaksi bertutup, dan alat-alat
gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki).
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi sampel buah labu siam yang digunakan berdasarkan
pengamatan ciri morfologinya dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2.Pembuatan ekstrak metanol dan fraksi air buah labu siam
Buah labu siam diperoleh dari daerah Sawangan, Kecamatan Muntilan,
Kabupaten Magelang. Buah labu siam dicuci dan dibersihkan kemudian dikupas
kulitnya, dibuang bijinya kemudian diblender dan dimaserasi dengan pelarut
metanol. Maserasi diulangi sebanyak 3 kali. Maserasi yang pertama dilakukan
selama 2 x 24 jam, kemudian disaring dengan penyaring Buchner sehingga
diperoleh filtrat dan ampas. Ampas dimaserasi lagi selama 1 x 24 jam. Ampas
yang didapat dimaserasi kembali selama 1 x 24 jam. Kemudian filtrat digabung
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
dan diuapkan pelarutnya dengan rotary evaporator sampai tidak ada pelarut yang
menetes lagi.
Ekstrak kental metanol yag diperoleh ditambahkam dengan air hangat
sebanyak 300 mL dan dipartisi dengan wash bensin dengan perbandingan pelarut
1:1 v/v, kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna. Fase air akan berada
pada paling bawah, sedangkan fase wasbensin berada pada bagian atas.
Selanjutnya, fase air dipisahkan dan dipartisi lagi dengan etilasetat dengan
perbandingan pelarut 1:1 v/v. Setelah dipisahkan fraksi air diuapkan dengan
vacum rotary evaporator. Lalu hasil fraksi tersebut digunakan analisis lebih
lanjut.
3.Uji Pendahuluan
a. Uji fenolik, sejumlah 0,5 mL larutan uji 750,0 µg/mL dan larutan
pembanding asam galat 150,0 µg/mL ditambahkan 2,5 mL pereaksi fenol Folin-
Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v) kedalam tabung
reaksi. Diamkan selama 10 menit. Tambahkan 7,5 mL larutan natrium karbonat 1
M. Kemudian amati warna larutan tersebut.
b.Uji pendahuluan aktivitas antioksidan, sebanyak 1 mL larutan DPPH
dimasukan ke dalam masing-masing tiga tabung reaksi. Ditambahkan masing-
masing dengan 1 mL metanol p.a, larutan pembanding rutin 37,5 μg/mL , dan
larutan uji 200,0 μg/mL. Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan 3 mL
metanol p.a. Larutan tersebut kemudian divortex selamam 30 detik. Setelah 30
menit, amati warna pada larutan tersebut.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
4.Penentuan aktivitas antioksidan fraksi etil asetat dengan metode DPPH
a. Pembuatan larutan DPPH, sebanyak 15,7 mg DPPH dilarutkan ke
dalam metanol p.a sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM.
Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.
b.Pembuatan larutan stok rutin, sebanyak 2,5 mg rutin dilarutkan dengan
metanol p.a sampai 10,0 mL.
c. Pembuatan larutan standar rutin, diambil sebanyak 0,5; 1,0; 1,5; 2,5;
3,0 mL larutan stok rutin, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL,
sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar rutin sebesar 12,5; 25,0; 37,5; 50,0;
dan 62,5 μg/mL.
d. Pembuatan larutan uji, sejumlah 25,0 mg fraksi air ditimbang dan di ad
metanol p.a sampai 25,0 mL. Diambil sebanyak 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 mL larutan
tersebut, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh
konsentrasi larutan uji sebesar 100; 150; 200; 250; 300 μg/mL.
e. Penentuan operating time, sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukan
kedalam masing-masing tiga labu ukur 10 mL, ditambahkan masing-masing
dengan 2 mL larutan pembanding rutin 12,5; 37,5 dan 62,5 μg/mL. Selanjutnya,
larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan
tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya
denga spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 517 nm selama 1 jam.
Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 100; 200; 300 μg/mL.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
f. Penentuan panjang gelombang maksimum, pada 3 labu ukur 10 mL,
dimasukan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mL larutan DPPH. Ditambahkan larutan
tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH
menjadi 0,020; 0,040; dan 0,080 mM. Larutan tersebut kemudian divortex selama
30 detik. Diamkan selama OT. Lalu dilakukan scanning panjang gelombang
serapan maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang
400-600 nm.
g. Penentuan aktivitas antioksidan
(i). Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol) , pada labu ukur 10
mL, dimasukan sebanyak 2 mL larutan DPPH. Ditambahan larutan tersebut
dengan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca
absorbansinya pada saat OT dan panjang gelomabang maksimum. Pengerjaan
dilakukan sebanyak 5 kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji
larutan pembanding dan uji.
(ii). Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji, sebanyak 2 mL
larutan DPPH dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup kemudian ditambah
dengan 2 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai seri konsentrasi telah
dibuat. Selanjutnya, larutan tersebut ditambah dengan metanol p.a hingga tanda
batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan diamkan selama
OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang
gelombang maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakukan dengan lima kali
replikasi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
h. Validasi metode uji aktivitas antioksidan, hasil dari proedur 4g (i)
dan (ii) divalidasi akurasi (% recovery), presisi (%CV) spesifisitas (spektra
kontrol), dan linearitas (nilai r).
% Recovery =
% CV = x 100%
i. Estimasi aktivitas antioksidan, hasil dari prosedur 4g (i) dan (ii)
dihitung nilai % IC dan IC50 untuk rutin dan fraksi air ekstrak metanolik buah
labu siam.
5. Penentuan kandungan fenolat total
Kandungan fenolik total ditentukan dengan menggunakan metode
spektrofotometri sesuai dengan penelitian Nusarini ( 2007). Langkah kerjanya
meliputi dua tahap, yakni:
a. Pembuatan kurva baku asam galat, dibuat larutan asam galat dengan
konsetrasi 500 µg/mL dalam akuades : methanol p.a (1:1). Diambil sebanyak 0,5 ;
1; 1,5; 2; dan 2,5 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan akuades : methanol
p.a (1:1) sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat
sebesar 25; 50; 75 ; 100 ; dan 125 µg/mL.
b. Pembuatan larutan uji, sejumlah 10,0 mg fraksi air ditimbang dan di
ad metanol p.a sampai 10,0 mL.
c. Penentuan Operating time, sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 25; 75;
dan 125 μg/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah
diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
mL natrium karbonat 1 M. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit.
d. Penentuan panjang gelombang maksimum, sebanyak 0,5 mL larutan
asam galat 25; 75; dan 125 μg/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-
Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:1 v/v). Larutan selanjutnya
ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Diamkan selama OT,
absorbansinya dibaca pada λ maksimum dengan spektrofotometer visibel pada
panjang gelombang 600-800 nm.
e. Pengukuran absorbansi larutan asam galat, sebanyak 0,5 mL larutan
asam galat 25; 50; 75; 100 dan 125 μg/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen
Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya
ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Diamkan selama OT,
absorbansinya dibaca pada λ maksimum dengan spektrofotometer visibel.
Dilakukan 5 kali replikasi.
f. Validasi metode penetapan kandungan fenolat total, hasil prosedur
5e divalidasi akurasi (% recovery), presisi (%CV) spesipisitas (spektra kontrol),
dan linearitas (nilai r).
% Recovery =
% CV = x 100%
g. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji, diambil 0,5 mL larutan
uji ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan
dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium
karbonat 1 M. Diamkan selama OT, absorbansinya dibaca pada λ maksimum
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
dengan spektrofotometer visibel. Dilakukan lima kali replikasi. Kandungan
fenolik total dinyatakan sebagai mg ekivalen asam galat dalam setiap per g fraksi.
6.Analisis Hasil
Aktivitas penangkapan radikal DPPH (%) dihitung dengan rumus :
Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 menggunakan
persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun
pembanding sedangkan sumbu y adalah %IC. Lalu dianalisis secara statistik
Mann-Whitney untuk menentukan ada atau tidak adanya perbedaan bermakna
antara IC50 larutan pembanding dan larutan uji.
Uji kandungan fenolisk total menghasilkan nilai mg ekivalen asam galat
dalam setiap per g fraksi. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linier
dengan data kurva baku.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman labu siam dilakukan di Laboratorium Kebun
Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Determinasi ini dilakukan untuk mengetahui kebenaran identitas tanaman yang
akan diuji sehingga kesalahan pengambilan sampel dalam suatu penelitian dapat
dihindari.
Dari hasil determinasi tersebut dapat dinyatakan bahwa sampel buah labu
siam yang digunakan dalam penelitian ini memang benar-benar diambil dari
tanaman labu siam (Sechium edule Squartz) (lampiran 1).
B. Hasil Pengumpulan Bahan
Buah labu siam diperoleh dari daerah Sawangan, Kecamatan Muntilan,
Kabupaten Magelang pada bulan September 2011. Pengambilan bahan dari satu
tempat, hal ini untuk menghindari variasi kandungan senyawa aktif tanaman.
Buah labu siam yang digunakan adalah buah yang masih muda berwarna hijau
dan bagian ujung buah belum mengeluarkan tunas dan terbelah. Buah yang
diperoleh adalah sebesar 1 kg dan masing-masing memiliki ukuran yang
bervariasi. Panjang buah labu siam yang diperoleh antara 10-13 cm.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
Buah labu siam dipetik pada pagi hari agar senyawa fenolik yang terdapat
pada tanaman belum termetabolisme menjadi bentuk metabolit sekunder lain.
Gambar tanaman dan buah labu siam disajikan pada lampiran 2.
C. Hasil Preparasi Sampel
Preparasi sampel ini dilakukan untuk mendapatkan fraksi air ekstrak
metanol buah labu siam yang diduga dalam fraksi tersebut mengandung senyawa
antioksidan. Sampel yang digunakan merupakan buah labu siam segar. Digunakan
sampel segar karena bertujuan untuk menjaga kestabilan senyawa fenolik di
dalam tanaman karena senyawa fenolik cenderung mengalami perubahan susunan
dengan adanya pengeringan atau pemanasan. Perubahan yang terjadi dapat
menurunkan aktivitas antioksidan dari senyawa fenolik (Markam, 1988)
Alasan lain digunakan sampel segar adalah untuk menjaga stabilitas
senyawa fenolik pada tanaman. Menurut Handayani (2011) proses pengeringan
dapat memicu terjadinya peristiwa browning dan blackening. Peristiwa tersebut
terjadi dipicu oleh reaksi oksidasi akibat adanya pemanasan yang dikatalis oleh
enzim fenol oksidase atau polifenol oksidase sehingga menyebabkan senyawa
fenolik berubah menjadi quinon dan kemudian dipolimerasi menjadi pigmen
melaniadin. Senyawa fenolik dalam bentuk polimer tersebut yang tidak memiliki
aktivitas antioksidan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
Buah labu siam segar dihilangkan kulitnya terlebih dahulu kemudian
dicuci untuk menghilangkan getah-getah yang terdapat pada permukaan buah.
Buah labu siam yang telah dikupas harus segera diolah karena untuk menghindari
peristiwa browning pada buah. Ketika buah dikupas atau dipotong, enzim yang
tersimpan di dalam jaringan buah akan terbebas. Apabila enzim tersebut
mengalami kontak dengan oksigen di udara, fenolase akan mengkatalisis konversi
biokimia dari senyawa fenolik yang terdapat pada buah sehingga senyawa fenolik
akan berubah menjadi bentuk polimer yang tidak memiliki aktivitas antioksidan.
Buah labu siam yang telah bersih dipotong kecil-kecil supaya lebih mudah
diblender. Buah labu siam diblender terlebih dahulu untuk memperkecil ukuran
pemukaan agar penyari dapat kontak lebih luas dengan simplisia. Lalu dilakukan
proses maserasi dengan metanol. Dipilih metode ekstraksi dengan maserasi karena
ekstraksi ini tidak melibatkan pemanasan sehingga perubahan-perubahan senyawa
dapat dihindari. Selain itu, proses maserasi sangat menguntungkan untuk isolasi
senyawa bahan alam karena dengan perendaman ekstrak tumbuhan dapat
menyebabkan pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan
antara di dalam dan di luar sel sehingga metabolit sekunder yang ada di dalam
sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan
sempurna.
Metanol dipilih sebagai penyari karena metanol merupakan pelarut
universal dan penetrasinya ke dalam sel-sel tanaman lebih kuat dibanding etanol
maupun cairan penyari yang lain (Depkes RI b, 2000). Hal tersebut dikarenakan
metanol memiliki viskositas yang lebih rendah dibandingkan etanol walaupun
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
keduanya memiliki polaritas yang hampir sama. Metanol memiliki konsistensi
yang lebih encer menyebabkan metanol lebih mudah berdifusi menembus sel-sel
tanaman (Pedricilli, 2001). Selain itu, metanol memiliki presentase OH yang lebih
besar dibandingkan dengan etanol sehingga proses pembasahan bahan dan
ekstraksinya lebih efektif.
Maserasi dilakukan dalam tabung erlenmeyer tertutup agar metanol tidak
menguap karena sifat metanol mudah menguap pada suhu kamar. Selain itu, juga
untuk mencegah masuknya kontaminan dari luar. Tabung erlenmeyer dibungkus
dengan alumunium foil agar tidak terkena cahaya matahari atau sinar matahari
langsung. Hal ini dikarenakan ada beberapa senyawa dapat bereaksi oleh adanya
cahaya dan juga dapat mengalami kerusakan oleh sinar ultraviolet matahari.
Maserasi dilakukan selama 2x24 jam dan dibantu dengan shaker agar
proses maserasi lebih efektif karena penyari lebih banyak kontak langsung dengan
sel-sel dalam buah labu siam dibandingkan jika hanya didiamkan saja.
Penyaringan dilakukan dengan bantuan pompa vakum karena jumlah bahan
banyak sehingga membutuhkan waktu yang lama jika disaring secara biasa.
Ampas yang diperoleh dari hasil penyaringan diremaserasi dengan metanol
selama 1x24 jam kemudian dilakukan penyaringan dengan pompa vakum, filtrat
disimpan dan ampas kembali diremaserasi selama 1x24 jam dengan penyari
metanol. Remaserasi ini bertujuan untuk memaksimalkan proses penyarian agar
diperoleh lebih banyak senyawa fenolik.
Filtrat yang diperoleh dari hasil penyaringan tersebut diupkan pelarutnya
menggunakan vaccum rotary evaporator (rotavapor) pada suhu 400C-500C.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
Tujuan digunakannya rotavapor agar filtrat metanol yang akan diuapkan
pelarutnya tidak mengalami kontak dengan panas yang berlebihan dengan
demikian, kerusakan senyawa-senyawa kimia yang terkadung dalam filtrat
metanol dapat dihindari.
Rotavapor menggunakan prinsip penguapan dengan pengurangan tekanan.
Suatu cairan akan mendidih jika tekanan uap cairan sama dengan tekanan
atmosfir di sekelilignya. Oleh karena itu, adanya pengurangan tekanan pada alat di
bawah tekanan atmosfir dapat menyebabkan metanol mendidih dibawah titik
didih normalnya (Depkes RI, 1986). Pada penguapan tersebut hampir semua
metanol teruapkan. Sisa metanol dan air yang tertinggal dalam ekstrak kemudian
diuapkan dengan waterbath dan dibantu dengan kipas angin untuk mempercepat
penguapan. Hasil penguapan ini selanjutya disebut ekstrak metanolik buah labu
siam. Hasil ektsrak metanolik buah labu siam yang diperoleh dari proses maserasi
adalah sebesar 64,6 g sehingga diperoleh rendemen ekstrak metanolik sebesar
6,5%.
Setelah didapatkan ekstrak kental metanolik buah labu siam, kemudian
ekstrak dilarutkan dengan air hangat sebanyak 300 mL. Digunakan air hangat agar
lebih mudah melarutkan ekstrak. Ekstrak dipartisi dengan wash bensin di dalam
corong pisah dengan perbandingan air dan wash bensin 1 : 1. Fraksi air berada
dibagin bawah sedangkan fraksi wash bensin berada pada bagian atas. Hal ini
dikarenakan berat jenis wash bensin lebih kecil dibandingkan berat jenis air. Berat
jenis wash bensin adalah 0,730 sedangkan berat jenis air adalah 0,996.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
Partisi dengan wash bensin ini bertujuan untuk menghilangkan zat-zat
kimia yang bersifat nonpolar seperti lipid dan klorofil yang dapat mengganggu
proses analisis, sedangkan dalam fraksi air terlarut senyawa-senyawa fenolik akan
dianalisis selanjutnya.
Proses eksrtaksi dilakukan berulang sebanyak 3 kali agar ekstraksi lebih
efektif dan senyawa fenolik terlarut seluruhnya dalam fraksi air. Penggojogan
lemah pada proses ekstraksi dimaksudkan agar tidak terbentuk emulsi yang dapat
menyebabkan proses pemisahan menjadi lebih lama (Matsuda,2001).
Setelah didapatkan fraksi air pertama kemudian fraksi tersebut diekstraksi
cai-cair dengan etil asetat. Hal ini bertujuan untuk memurnikan senyawa fenolik
yang didapatkan. Fraksi etil asetat akan berada di atas sedangkan fraksi air berada
di bawah. Hal ini dikarenakan berat jenis etil asetat (0,898) lebih kecil
dibandingkan berat jenis air (0,996). Fraksi etil esetat dibuang sedangkan fraksi
air akan dianalisis.
Senyawa fenolik dapat berbentuk glikosida maupun aglikonnya. Dalam
bentuk glikosida senyawa fenolik bersifat polar, sedangkan dalam bentuk
aglikonnya senyawa fenolik bersifat lebih nonpolar. Karena itu, tidak menutup
kemungkinan adanya senyawa fenolik yang terlarut dalam air maupun etil asetat
yang bersifat semi polar. Peneliti tertarik untuk menguji aktivitas antioksidan
fraksi air dibandingkan fraksi etil asetat karena kandungan senyawa fenolik yang
terdapat pada buah labu siam yang mempunyai kelarutan yang baik pada pelarut
polar seperti air, sehingga diharapkan aktivitas antioksidan pada fraksi air ini
cukup baik. Lima dan Maciel (2006) melaporkan bahwa ekstrak metanol labu
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
siam mengandung fenolat, flavonoid, tanin terkondensasi, dan asam askorbat.
Selain itu peneliti telah melakukan uji pendahuluan terhadap fraksi etil asetat dan
memberikan hasil bahwa fraksi etil asetat tidak menunjukkan adanya senyawa
fenolik dan aktivitas antioksidan (lampiran 15). Fraksi air yang didapatkan
diuapkan pelarutnya dengan pemanasan menggunakan waterbath dengan bantuan
kipas angin sehingga diperoleh ekstrak kental air buah labu siam.
Berat fraksi air yang didapatkan sebesar 26,1 g dengan rendemen. 2,6 %
Fraksi tersebut disimpan dalam cawan poselin ditutup dengan plastik dan
alumunium foil lalu disimpan dalam eksikator. Hal ini dilakukan untuk
menghindari adanya kerusakan senyawa fenolik dalam fraksi air tersebut dari
pengaruh cahaya, udara maupun kelembaban.
D. Hasil Uji Pendahuluan
1. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
Tujuan uji ini adalah untuk mengetahui secara kualitatif aktivitas
antioksidan dari fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam. Uji ini
menggunakan reaksi antara senyawa uji dan DPPH. Molekul radikal DPPH akan
bereaksi dengan atom hidrogen yang dilepaskan oleh senyawa uji sehingga
senyawa DPPH mengalami pengurangan intensitas warna ungu atau berubah
menjadi kuning sampai jernih (Prior et al., 2005). Pengujian menunjukan hasil
positif dengan berubahnya warna larutan uji menjadi kuning. Hal ini
menunjukkan potensi fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam dalam
menangkap radikal DPPH.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
Gambar 7. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol negatif[blanko], B = larutan uji [fraksi air ekstrak metanolik nuah labu siam], C =
kontrol positif [rutin])
2. Uji pendahuluan fenolik
Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui secara kualitatif kandungan
senyawa fenolik dalam fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam. Prinsip uji ini
adalah reaksi oksidasi reduksi dari ion fenolat senyawa uji dengan pereaksi fenol
Folin-Ciocalteu. Dengan adanya natrium karbonat yang bersifat basa akan
mengubah senyawa fenolik dari senyawa uji menjadi ion fenolat. Ion fenolat dapat
mereduksi reagen fenol Folin-Ciocalteu sehingga menyebabkan terbentuknya
senyawa berwarna biru (Abdul-Fadl,1949). Pengujian menunjukan hasil positif
dengan terbentunya warna biru pada larutan uji (gambar 8). Hal ini menunjukkan
bahwa fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam mengandung senyawa fenolik.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
Gambar 8. Hasil uji pendahuluan fenolik (A = kontrol positif [asamgalat], B = larutan uji [fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam], C =
kotrol negatif [blanko])
E. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan
Pengujian aktivitas penangkapan radikal bebas dari fraksi air ektrak
metanolik buah labu siam menggunakan metode DPPH dengan pertimbangan
dalam sampel terdapat senyawa yang mempunyai kemampuan menangkap radikal
DPPH. Pertimbangan yang lain adalah karena metode ini mudah digunakan,
mempunyai tingkat sensitifitas yang tinggi, dan dapat menganalisis sejumLah
besar sampel dalam jangka waktu yang singkat (Kim et al, 2002).
Mekanisme reaksi antara senyawa uji dan DPPH yaitu molekul radikal
bebas DPPH akan bereaksi dengan atom hidrogen yang dilepaskan oleh senyawa
uji sehingga senyawa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil mengalami pengurangan
intensitas warna ungu atau menjadi warna kuning sampai jernih (Gulcin et al.,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
2004). Berkurangnya intensitas warna ungu dari larutan DPPH menunjukkan
potensi aktivitas antioksidan dari senyawa uji. Secara kuantitatif dapat dihitung
dengan berkurangnya absorbansi larutan tersebut.
Pengukuran aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH menggunakan
spektrofotometri. DPPH mempunyai λ maksimum pada 517 nm. (Sunarni, 2005).
Karena itu untuk memastikan bahwa tidak ada gangguan pengukuran pada daerah
λ maksimum DPPH tersebut dilakukan scanning λ maksimum pada pelarut, fraksi
air dan rutin pada daerah 400-600 nm. Adanya gangguanpengukuran pada daerah
λ maksimum DPPH dapat menyebabkan pengukuran absorbansi DPPH menjadi
tidak akurat. Dari hasil scanning λ maksimum terhadap pelarut metanol, fraksi air,
dan rutin tidak menunjukkan adanya gangguan pada daerah λ maksimum DPPH.
Hasil scanning λ maksimum pada daerah 400-600 nm dapat dilihat pada lampiran
6.
Sebelum melakukan pengujian aktivitas antioksidan senyawa uji perlu
dilakukan proses optimasi metode DPPH terlebih dahulu. Proses optimasi
meliputi penentuan operating time (OT) dan scanning λ maksimum DPPH.
1. Penentuan operating time (OT)
Penentuan OT ini perlu dilakukan untuk memperoleh rentang waktu
dimana larutan uji dan rutin sudah mereduksi radikal DPPH dengan sempurna
sehingga diperoleh nilai absorbansi yang stabil dengan demikian kesalahan
analisis dapat diminimalkan. Operating time dihitung mulai dari larutan sampel
maupun rutin direaksikan dengan DPPH. Penentuan OT dilakukan terhadap tiga
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
konsentrai larutan sampel dan rutin seagai larutan pembanding yang direaksikan
dengan DPPH dan diukur absorbasinya pada λ maksimum DPPH yaitu 517nm.
Pengukuran absorbansi dilakukan setiap 5 menit selama 60 menit.
Gambar 9. Hasil grafik penentuan OT rutin
Gambar 10. Hasil grafik penentuan OT fraksi air
00,10,20,30,40,50,60,70,80,9
0
Abso
rban
si
00,10,20,30,40,50,60,70,80,9
0
52
konsentrai larutan sampel dan rutin seagai larutan pembanding yang direaksikan
dengan DPPH dan diukur absorbasinya pada λ maksimum DPPH yaitu 517nm.
Pengukuran absorbansi dilakukan setiap 5 menit selama 60 menit.
Gambar 9. Hasil grafik penentuan OT rutin
Gambar 10. Hasil grafik penentuan OT fraksi air
30 60
Waktu (menit)
Penentuan OT rutin
2.5 µg/mL
7.5 µg/mL
12.5 µg/mL
20 40 60 80
52
konsentrai larutan sampel dan rutin seagai larutan pembanding yang direaksikan
dengan DPPH dan diukur absorbasinya pada λ maksimum DPPH yaitu 517nm.
Pengukuran absorbansi dilakukan setiap 5 menit selama 60 menit.
Gambar 9. Hasil grafik penentuan OT rutin
Gambar 10. Hasil grafik penentuan OT fraksi air
2.5 µg/mL
7.5 µg/mL
12.5 µg/mL
20 ug/ml
40ug/ml
60 ug/ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
53
Berdasarkan hasil yang diperoleh pada gambar 9 dan 10, dari menit ke-5
sanpai ke-60 absorbansi larutan uji fraksi air dan larutan pembanding rutin
semakin stabil, hal ini menunjukkan bahwa reaksi antara DPPH dengan senyawa
antioksidan semakin sempurna. Dari hasil tersebut ditetapkan OT larutan
pembanding rutin pada menit ke-30 sedangkan larutan uji pada menit ke-25.
2. Penentuan panjang gelombang maksimum
Tahap selanjutnya adalah penentuan λ maksimum DPPH. Pengukuran
absorbansi larutan uji dilakukan pada λ maksimum karena pada λ maksimum
sedikit perubahan konsentrasi akan memberikan perubahan absorbansi yang besar
sehingga akan didapatkan kepekaan analisis yang maksimum. Penentuan λ
maksimum dilakukan terhadap larutan DPPH pada λ visibel 400-600 nm. Secara
teoritis λ maksimum larutan DPPH adalah 517 nm (Sunarni, 2005). DPPH
memiliki gugus kromofor dan auksokrom sehingga dapat terukur pada daerah
visibel selain itu adanya elektron yang tidak berpasangan pada struktur DPPH
menyebabkan larutan DPPH berwarna unggu dan mempunyai serapan yang kuat
pada 517 nm. Dari hasil pengukuran diperoleh λ maksimum DPPH, yaitu 515,8
nm.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
54
Gamba 11. Hasil scanning λ maksimum DPPH pada berbagai konsentrasi
F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan
Validasi metode analisis merupakan ukuran untuk membuktikan bahwa
metode yang digunakan memberikan hasil seperti yang diharapkan dengan
kecermatan dan ketelitian yang memadai (Mulja dan Hanwar, 2003).
Parameter validasi metode analisis yang dilakukan untuk menguji
validitas metode uji aktivitas antioksidan antaralain analisis akurasi, presisi,
linearitas dan spesifitas. Dalam pengujian digunakan lima replikasi larutan
pembanding rutin dan larutan uji fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam
sehingga didapatkan lima persamaan regresi linier antara konsentrasi rutin dan
larutan uji dengan % IC. Dari kelima persamaan tersebut dipilih persamaan
dengan nilai liniaritas ( r ) yang paling baik untuk menghitung konsentrasi terukur
rutin dan juga larutan uji sehingga % recovery dan % CV dapat dihitung. Gambar
54
Gamba 11. Hasil scanning λ maksimum DPPH pada berbagai konsentrasi
F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan
Validasi metode analisis merupakan ukuran untuk membuktikan bahwa
metode yang digunakan memberikan hasil seperti yang diharapkan dengan
kecermatan dan ketelitian yang memadai (Mulja dan Hanwar, 2003).
Parameter validasi metode analisis yang dilakukan untuk menguji
validitas metode uji aktivitas antioksidan antaralain analisis akurasi, presisi,
linearitas dan spesifitas. Dalam pengujian digunakan lima replikasi larutan
pembanding rutin dan larutan uji fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam
sehingga didapatkan lima persamaan regresi linier antara konsentrasi rutin dan
larutan uji dengan % IC. Dari kelima persamaan tersebut dipilih persamaan
dengan nilai liniaritas ( r ) yang paling baik untuk menghitung konsentrasi terukur
rutin dan juga larutan uji sehingga % recovery dan % CV dapat dihitung. Gambar
54
Gamba 11. Hasil scanning λ maksimum DPPH pada berbagai konsentrasi
F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan
Validasi metode analisis merupakan ukuran untuk membuktikan bahwa
metode yang digunakan memberikan hasil seperti yang diharapkan dengan
kecermatan dan ketelitian yang memadai (Mulja dan Hanwar, 2003).
Parameter validasi metode analisis yang dilakukan untuk menguji
validitas metode uji aktivitas antioksidan antaralain analisis akurasi, presisi,
linearitas dan spesifitas. Dalam pengujian digunakan lima replikasi larutan
pembanding rutin dan larutan uji fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam
sehingga didapatkan lima persamaan regresi linier antara konsentrasi rutin dan
larutan uji dengan % IC. Dari kelima persamaan tersebut dipilih persamaan
dengan nilai liniaritas ( r ) yang paling baik untuk menghitung konsentrasi terukur
rutin dan juga larutan uji sehingga % recovery dan % CV dapat dihitung. Gambar
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
55
berikut menunjukkan kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan larutan
pembanding rutin dan larutan uji fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam.
Gambar 12. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan rutin
Gambar 13. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan fraksi airekstrak metanolik buah labu siam
y = 5.834x + 16.303r = 0.9973
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12 14
%IC
(%)
Konsentrasi (µg/mL)
Kurva persamaan regresi linearaktivitas antioksidan rutin
y = 1,1594x-10,1462r = 0.9908
0
10
20
30
40
50
60
70
0 10 20 30 40 50 60 70
%IC
(%)
Konsentrasi (µg/mL)
Kurva persamaan regresi linier aktivitasantioksidan fraksi air labu siam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
56
Gambar 12 dan 13 menunjukkan korelasi yang baik antara konsentrasi
rutin dan larutan uji dengan %IC. Hal ini ditunjukkan dengan nilai koefisien
korelasi (r) mendekati satu yang mengandung arti semakin besar konsentrasi rutin
maupun larutan uji maka semakin bear pula % IC yang dihasilkan.
1. Akurasi
Akurasi suatu metode merupakan keterdekatan nilai pengukuran dengan
nilai sebenarnya dari analit dalam sampel. Akurasi dinyatakan dengan nilai
perolehan kembali (%recovery). Nilai %recovery diperoleh dari data hubungan
antara seri konsentrasi rutin dan fraksi air dengan aktivitas antioksidan yang
dihasilkan. Tabel berikut menunjukkan % recovery rutin dan larutan uji fraksi air.
Dari data yang terdapat pada tabel V dan VI menunjukkan rentang
%recovery rutin adalah 90,42%-107,94%, sedangkan % recovery larutan uji
berada dalam rentang 90,07%- 114,95% Persyaratan rentang % recovery yang
baik untuk bahan p.a seperti rutin pada kadar sekitar 10 ppm adalah 90%-107%
(Harmita, 2004). Sedangkan rentang % recovery yang baik untuk bahan alam
adalah 80%-120%. Rentang % recovery rutin maupun larutan uji masuk dalam
persyaratan sehingga dapat dapat dikatakan metode ini memiliki akurasi yang baik
karena memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
57
Tabel V. Hasil % recovery dan %CV uji aktivitas antioksidan rutin
Rutin
Konsentrasiteoritis(µg/mL)
%IC(%)
Konsentrasiterukur(µg/mL)
%Recovery(%) SD
% CV(%)
seri 1 2,5 30,45 2,42 95,45 1,80 1,942,5 29,92 2,33 92,622,5 29,55 2,27 90,422,6 30,06 2,36 92,442,5 29,99 2,35 92,35
seri 2 5,1 44,83 4,89 96,25 0,50 0,525,0 44,66 4,86 96,425,0 44,20 4,78 95,265,1 44,75 4,87 95,585,1 44,76 4,88 96,00
seri 3 7,6 63,60 8,11 106,37 0,80 0,757,6 63,78 8,14 107,637,5 63,73 8,13 107,947,7 63,73 8,13 106,257,6 63,59 8,10 106,35
seri 4 10,2 75,96 10,22 100,63 0,50 0,5010,1 75,03 10,06 99,8510,0 75,11 10,08 100,3910,2 75,59 10,16 99,6210,2 75,99 10,23 100,68
seri 5 12,7 88,99 12,46 98,09 1,20 1,2212,6 89,09 12,47 99,0112,6 89,77 12,59 100,3312,8 88,59 12,39 97,1712,7 88,73 12,41 97,74
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
58
Tabel. VI. Hasil % recovery dan %CV uji aktivitas antioksidan fraksi air
Fraksi Air
Konsentrasiteoritis(µg/mL)
%IC(%)
Konsentrasiterukur(µg/mL)
%Recovery(%) SD
% CV(%)
seri 1 20,16 12,56 19,58 97,13 2,90 3,1420,32 11,07 18,30 90,0720,24 11,24 18,44 91,1220,32 11,11 18,33 90,2320,16 11,59 18,74 92,98
seri 2 30,24 30,16 34,76 114,95 1,30 1,1530,48 30,09 34,70 113,8630,36 29,89 34,53 113,7330,48 29,74 34,40 112,8730,24 28,91 33,69 111,39
seri 3 40,32 35,20 39,11 97,01 0,60 0,6240,64 34,90 38,85 95,6040,48 34,83 38,79 95,8340,64 35,24 39,15 96,3340,32 34,53 38,54 95,58
seri 4 50,40 48,32 50,43 100,05 0,80 0,8150,80 47,87 50,04 98,5150,60 47,64 49,84 98,5050,80 48,04 50,18 98,7950,40 47,02 49,31 97,83
seri 5 60,48 60,87 61,26 101,28 1,70 1,6960,96 59,96 60,46 99,1960,72 61,80 62,05 102,1960,96 59,15 59,77 98,0460,48 60,97 61,34 101,42
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
59
2. Presisi
Presisi dinyatakan dengan nilai % CV. Persyaratan nilai % CV yang baik
untuk bahan p.a pada konsentrasi sekitar 10 ppm adalah < 5% sedangkan nilai %
CV yang baik untuk bahan alam < 15 % (Harmita, 2004). Berdasarkan nilai %
CV dari data hubungan antara konsentrasi rutin dan larutan uji dengan %IC
diperoleh nilai %CV rutin berada dalam rentang 0,5%-1,94% sedangkan %CV
larutan uji berada dalam rentang 0,62%-3,14%. Dengan demikian baik rutin
maupun larutan uji memiliki % CV yang baik karena memenuhi persyaratan yang
ditetapkan sehingga dapat dikatakan metode ini memiliki presisi yang baik.
3. Linearitas
Linieritas pada suatu metode analisis dari suatu prosedur analisis
merupakan kemampuannya untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung
proporsional dengan konsentrasi (jumlah) analit di dalam sampel. Linearitas
biasanya dinyatakan dalam istilah variansi sekitar arah garis regresi yang dihitung
berdasarkan persamaan matematik data yang diperoleh dari hasil uji analit dalam
sampel dengan berbagai konsentrasi analit. Hasil nilai koefisien korelasi (r)
persamaan regresi linier utuk rutin yang paling bagus adalah pada replikasi I,
yaitu 0,9973 sedangkan untuk fraksi air nilai koefisien korelasi yang paling bagus
adalah pada replikasi V, yaitu 0,9908. Menurut APVMA (Australian Pesticides &
Veterinary Medicines Authory) persyaratan liniearitas yang baik untuk bahan p.a
konsentrasi 10 ppm adalah > 0,99, sedangkan untuk fraksi air nilai r >0,8000
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
60
menunjukkan kekuatan korelasi yang sangat kuat (Dahlan, 2011). Nila r rutin dan
fraksi air memenuhi persyaratan maka metode ini memiliki liniearitas yang baik.
4. Spesifitas
Spesifitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur
zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang
mungkin ada dalam matriks sampel (Harmita, 2004). Uji dilakukan dengan
mengukur absorbsi fraksi air, rutin, dan pelarut pada λ maksimum DPPH apakah
memberi serapan yang dapat mengganggu pengukuran absorbansi DPPH.
Gambar 14. Hasil scanning rutin pada λ 400-600 nm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
61
GambaR 15. Hasil scanning fraksi air pada λ 400-600 nm
Gambar 16. Hasil scanning metanol pada λ 400-600 nm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
62
Dari hasil spektra terlihat bahwa larutan rutin, larutan uji fraksi air
ekstrak metanolik buah labu siam dan pelarut metanol tidak menunjukkan adanya
gangguan berarti terhadap absorbansi DPPH. Dengan demikian dapat dikatakan
metode ini memilki spesifitas yang baik.
G. Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH
Metode DPPH merupakan salah satu uji kuantitatif untuk mengetahui
seberapa besar aktivitas fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam sebagai
antioksidan. Ketika radikal DPPH ditangkap oleh senyawa antioksidan yang
mampu mendonorkan atom hidrogen maka DPPH akan tereduksi membentuk
DPPH-H tereduksi. Perubahan bentuk DPPH menjadi bentuk tereduksi ini
menyebabkan perubahan warna larutan DPPH dari unggu menjadi kuning.
Perubahan warna ini diikuti penurunan absorbansi DPPH sehingga aktivitas
antioksidan penangkapan radikal dapat diketahui dengan menghitung rasio
penurunan absorbansi DPPH (Molyneux, 2004).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
63
Gambar 17. Perubahan warna DPPH disertai dengan penurunanabsorbansi (Molyneux, 2004).
Gambar 18. Gugus krsomofor dan auksokrom DPPH (Prakash et al.,2001)
Untuk menunjukkan besar kemampuan suatu senyawa sebagai
antioksidan maka digunakan parameter IC50. IC50 merupakan konsentrasi senyawa
antioksidan yang dibutuhkan untuk megurangi raikal DPPH sebesar 50% (Zou et
al.,2004). Nilai IC50 diperoleh dari suatu persamaan regresi linier yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
64
menyatakan hubungan antara konsentrasi senyawa uji dengan persen penangkapan
radikal (%IC). Semakin kecil nilai IC50, semakin kuat senyawa uji tersebut
sebagai antioksidan.
Nilai IC50 dari fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam akan
dibandingkan dengan nilai IC50 dari rutin. Digunakan rutin sebagai pembanding
karena diketahui rutin memiliki potensi aktivitas antioksidan penangkap radikal
bebas yang kuat. Rutin merupakan salah satu senyawa fenolik yang tergolong
flavonoid. Aktivitas antioksidan rutin berasal dari gugus O-dihidroksi yang
terdapat pada cincin B rutin.
Gambar 19. Struktur rutin (Santos, Mazo, Cavalheiro, 2008)
Hasil penentuan aktivitas antioksidan pada rutin dan fraksi air ekstrak
metanolik buah labu siam dapat dilihat pada tabel berikut.
64
menyatakan hubungan antara konsentrasi senyawa uji dengan persen penangkapan
radikal (%IC). Semakin kecil nilai IC50, semakin kuat senyawa uji tersebut
sebagai antioksidan.
Nilai IC50 dari fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam akan
dibandingkan dengan nilai IC50 dari rutin. Digunakan rutin sebagai pembanding
karena diketahui rutin memiliki potensi aktivitas antioksidan penangkap radikal
bebas yang kuat. Rutin merupakan salah satu senyawa fenolik yang tergolong
flavonoid. Aktivitas antioksidan rutin berasal dari gugus O-dihidroksi yang
terdapat pada cincin B rutin.
Gambar 19. Struktur rutin (Santos, Mazo, Cavalheiro, 2008)
Hasil penentuan aktivitas antioksidan pada rutin dan fraksi air ekstrak
metanolik buah labu siam dapat dilihat pada tabel berikut.
64
menyatakan hubungan antara konsentrasi senyawa uji dengan persen penangkapan
radikal (%IC). Semakin kecil nilai IC50, semakin kuat senyawa uji tersebut
sebagai antioksidan.
Nilai IC50 dari fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam akan
dibandingkan dengan nilai IC50 dari rutin. Digunakan rutin sebagai pembanding
karena diketahui rutin memiliki potensi aktivitas antioksidan penangkap radikal
bebas yang kuat. Rutin merupakan salah satu senyawa fenolik yang tergolong
flavonoid. Aktivitas antioksidan rutin berasal dari gugus O-dihidroksi yang
terdapat pada cincin B rutin.
Gambar 19. Struktur rutin (Santos, Mazo, Cavalheiro, 2008)
Hasil penentuan aktivitas antioksidan pada rutin dan fraksi air ekstrak
metanolik buah labu siam dapat dilihat pada tabel berikut.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
65
Tabel VII. Hasil %IC rutin menggunakan radikal DPPH
ReplikasiKonsentrasi(μg/mL)
Absorbansilarutanpembanding
%IC(%) Persamaan regresi linear
1
2,5 0,619 30,45 y = Bx + A5,1 0,491 44,83 y = 5,8347 x + 16, 3037,6 0,324 63,6 r = 0,9973
10,2 0,214 75,9612,7 0,098 88,99
2
2,5 0,623 29,92 y = Bx + A5,0 0,492 44,66 y = 5,9010 x + 15,88257,6 0,322 63,78 r = 0,9968
10,1 0,222 75,0312,6 0,097 89,09
3
2,5 0,620 29,55 y = Bx + A5,0 0,491 44,2 y = 6,0304 x + 15, 0457,5 0,320 63,64 r = 0,9971
10,0 0,219 75,1112,6 0,090 89,77
4
2,6 0,619 30,06 y = Bx + A5,1 0,489 44,75 y = 5,8004 x + 16,16947,7 0,321 63,73 r = 0,9967
10,2 0,216 75,5912,8 0,101 88,59
5
2,5 0,621 29,99 y = Bx + A5,1 0,490 44,76 y = 5,8545 x + 15,99777,6 0,323 63,59 r = 0,9969
10,2 0,213 75,9912,7 0,100 88,73
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
66
Tabel VIII. Hasil %IC fraksi air menggunakan radikal DPPH
ReplikasiKonsentrasi(μg/mL)
Absorbansilarutan fraksiair
%IC(%) Persamaan regresi linear
1
20,16 0,780 12,56 y = Bx + A30,24 0,623 30,16 y = 1,1588 x - 8,497740,32 0,578 35,2 r = 0,9899
50,4 0,461 48,3260,48 0,349 60,87
2
20,32 0,795 11,07 y = Bx + A30,48 0,625 30,09 y = 1,1379 x - 9,4407140,64 0,582 34,9 r = 0,9874
50,8 0,466 47,8760,96 0,358 59,96
3
20,24 0,790 11,24 y = Bx + A30,36 0,624 29,89 y = 1,1747 x - 10, 471940,48 0,580 34,83 r = 0,98817
50,6 0,466 47,6460,72 0,340 61,8
4
20,32 0,792 11,11 y = Bx + A30,48 0,626 29,74 y = 1,1261 x - 9,104740,64 0,577 35,24 r = 0,9878
50,8 0,463 48,0460,94 0,364 59,15
5
20,16 0,786 11,59 y = Bx + A30,24 0,632 28,91 y = 1,1594 x - 10,146240,32 0,582 34,53 r = 0,9908
50,4 0,471 47,0260,48 0,347 60,97
Dari tabel VII dan VIII dapat terlihat bahwa pada berbagai seri konsentrasi
rutin maupun larutan uji fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam semakin
besar konsentrasi larutan maka semakin kecil absorbansi yang dihasilkan. Hal ini
disebabkan semakin besar konsentrasi larutan maka semakin banyak senyawa
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
67
antioksidan yang mendonorkan atom hidrogen kepada radikal DPPH sehingga
terjadi peluruhan warna larutan DPPH.
Tabel IX. Hasil IC50 fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam dan rutin
Bahan
Uji
IC50
rata-rata
(μg/mL) SD
% CV
(%)
Rep. 1
(μg/mL)
Rep. 2
(μg/mL)
Rep. 3
(μg/mL)
Rep. 4
(μg/mL)
Rep. 5
(μg/mL)
Rutin 5,77 5,78 5,80 5,83 5,81 5,80 0,02 0,34
Fraksi air 51,36 52,24 51,48 52,49 51,88 51,89 0,48 0,93
Pada tabel IX, rata-rata nilai IC50 rutin sebesar 5, 80 (μg/mL) , sedangkan
larutan uji sebesar 51,89 (μg/mL). Untuk melihat signifikansi antara nilai IC50
rutin denga larutan uji maka data nilai aktivitas antioksidan diuji secara statistik.
Pengujian dilakukan dengan menggunakan software SPSS Statistics 17.0.
Langkah pertama dilakukan uji Shapiro-Wilk karena sampel yang digunakan < 50
(Dahlan, 2011). Uji ini bertujuan untuk mengetahui apakah data mengikuti
distribusi normal atau tidak. Hipotesis null (Ho) adalah data %IC berdistribusi
normal sedangkan Hipotesis alternatif adalah data %IC berdistribusi tidak normal.
Dari hasil perhitungan Shapiro-Wilk diperoleh nilai signifikansi (p) rutin sebesar
0,012 dan larutan uji sebesar 0,030. Nilai signifikansi tersebut lebih kecil dari
nilai signifikansi yang ditentukan yaitu 0,05 (taraf kepercayaan 95%) sehingga Ho
ditolak. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa data %IC rutin dan larutan uji
berdistribusi tidak normal. Karena distribusi data tidak normal selanjutnya
dilakukan uji non parametrik.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
68
Uji non parametrik yang digunakan adalah uji Mann-Whitney karena
nilai IC50 antara rutin dan larutan uji ini tidak saling berhubungan. Uji Mann-
Whitney ini bertujuan sebagai parameter induktif untuk melihat signifikansi nilai
IC50 antara rutin dan larutan uji. Hipotesis null (Ho) adalah nilai IC50 rutin tidak
lebih kecil dari larutan uji sedangkan Hipotesis alternatif adalah nilai IC50 rutin
lebih kecil daripada larutan uji. Hasil pengujian memperoleh nilai signifikansi
sebesar 0,009 antara rutin dan larutan uji. Nilai signifikansi tersebut lebih kecil
dari nilai signifikansi yang ditentukan yaitu 0,05 (taraf kepercayaan 95%)
sehingga Ho ditolak. Dari nilai tersebut dapat disimpulkan bahwa nilai IC50 rutin
lebih kecil dari larutan uji yaitu fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam.
Berdasarkan penggolongan tingkat kekuatan antioksidan, rutin memiliki
tingkat aktivitas antioksidan sangat kuat sedangkan fraksi air ekstrak metanolik
buah labu siam memiliki tingkat aktivitas antioksidan kuat yang berarti bahwa
larutan uji fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam mempunyai aktivitas
antioksidan yang lebih lemah daripada rutin.
H. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total
Adanya aktivitas antioksidan dari larutan uji fraksi air ekstrak metanolik
buah labu siam kemungkinan disebabkan karena kandungan fenoliknya. Banyak
penelitian melaporkan bahwa senyawa fenolik dianggap sebagai komponen
antioksidan terpenting pada tanaman dan memberikan korelasi yang bagus antara
konsentrasi fenolik dengan aktivitas antioksidannya (Zin et al,2004).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
69
Kandungan fenolik total diekspresikan dengan ekivalen asam galat dan
ditentukan dengan metode spektrofotometri menggunakan pereaksi Follin
Ciocalteu (Abdul-Fadl, 1949). Sebelum dilakukan penetapan kandungan fenolik
total terlebih dahulu dilakukan proses optimasi. Proses optimasi meliputi
penentuan operating time (OT) dan penentuan λ maksimum.
1. Penentuan operating time (OT)
Penentuan OT ini bertujuan untuk mendapatkan rentang waktu dimana
reaksi anatra asam galat dan pereaksi Follin Ciocalteu telah berlangsung secara
sempurna sehingga menghasilkan absorbansi yang stabil. Hal ini dapat
mengurangi tingkat kesalahan dalam analisis.
Gambar 20. Grafik penentuan OT penetapan kandungan fenolat
Dari gambar diatas dapat terlihat absorbansi mulai stabil pada menit ke
15. Hal ini menunjukkan bahwa reaksi antara asam galat dan Follin Ciocalteu
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 5 10 15 20 25 30 35
25 ug/ml
75 ug/ml
Penentuan OT kandungan fenolik
Abso
rban
si
waktu (menit)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
70
telah berlangsung sempurna sejak menit ke-15 karena itu ditentukan OT adalah
15 menit.
2. Penentuan panjang gelombang maksimum
Penentuan λ maksimum ini perlu dilakukan karena pengukuran
absorbansi larutan uji pada λ maksimum akan memberikan sensitifitas yang
tinggi. Pada λ maksimum sedikit perubahan konsentrasi akan memberikan
perubahan absorbansi yang besar. Penentuan λ maksimum ini dilakukan dengan
mereaksikan pereaksi Folin Ciocalteu dengan asam galat pada konsentrasi 50
µg/mL;100 µg/mL dan 150 µg/mL sehingga dihasilkan senyawa berwarna biru.
Berdasarkan hasil spektra (Gambar 21) terlihat bahwa senyawa molybdenum blue
yang dihasilkan dari reaksi antara senyawa fenolik dan Follin Ciocalteu memiliki
λ maksimum pada 750 nm. Hal ini sesuai dengan λ maksimum teoritis metode
Follin Ciocalteu berada pada rentang λ 745-750 nm (Prior et al., 2005).
Gambar 21. Scanning λ maksimum senyawa berwarna biru (molybdenumblue) pada berbagai konsentrasi asam galat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
71
I. Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total
Untuk menguji validitas metode penetapan kandungan fenolik total ini
digunakan beberapa parameter, antara lain analisis akurasi, presisi, linearitas dan
spesifitas. Dalam pengujian digunakan lima replikasi sehingga didapatkan lima
persamaan regresi linier antara konsentrasi asam galat dengan absorbansi yang
didapat. Dari kelima persamaan tersebut dipilih persamaan dengan nilai liniaritas (
r ) yang paling baik untuk menghitung konsentrasi terukur rutin dan juga larutan
uji sehingga % recovery dan % CV dapat dihitung. Persamaan regresi liner yang
paling baik yaitu 0,9999 didapatkan dari replikasi II dengan y = 0,004 x + 0,1392
Gambar 22 menunjukkan kurva persamaan regresi linier asam galat.
Gambar 22. Kurva persamaan regresi linier penetapan kadar fenolat total
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 50 100 150
Kurva persamaan regresi linier asam galat
Kurva persamaan regresilinier asam galat
Linear (Kurva persamaanregresi linier asam galat)
konsentrasi (µg/ml)
abso
rban
si
y = 0,004 x + 0,1392r = 0,9999
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
72
1. Akurasi
Akurasi suatu metode dinyatakan dengan nilai perolehan kembali
(%recovery) yang menyatakan keterdekatan nilai pengukuran dengan nilai
sebenarnya dari analit dalam sampel.
Dari data yang terdapat pada tabel.X menunjukkan rentang % recovery
konsentrasi asam galat adalah 94,18% - 104,17%. Persyaratan rentang %recovery
yang baik untuk bahan p.a seperti asam galat pada kadar sekitar 150 ppm adalah
90%-107% (Harmita, 2004). Rentang %recovery asam galat masuk dalam
persyaratan sehingga dapat dapat dikatakan metode ini memiliki akurasi yang baik
karena memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan.
2. Presisi
Presisi dinyatakan dengan nilai % CV. Persyaratan nilai % CV yang baik
untuk bahan p.a pada konsentrasi sekitar 150 ppm adalah < 5%. Berdasarkan nilai
% CV dari data hubungan antara konsentrasi asam galat dengan absorbansi
diperoleh nilai %CV asam galat berada dalam rentang 1,1% - 3,43%. Dengan
demikian asam galat memiliki % CV yang baik karena memenuhi persyaratan
yang ditetapkan sehingga dapat dikatakan metode ini memiliki presisi yang baik.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
73
Tabel X. Hasil % recovery dan %CV penetapan kadar fenolat
Replikasi
konsentrasiteoritis(µg/mL)
Absorbansiasam galat
Konsentrasiterukur
%Recovery(%) SD
%CV(%)
seri 1 25,30 0,24 24,45 96,64 3,40 3,4225,10 0,24 25,20 100,4025,15 0,24 26,20 104,1725,30 0,24 25,20 99,6025,20 0,24 24,20 96,03
seri 2 50,60 0,34 49,45 97,73 1,40 1,4350,20 0,34 50,20 100,0050,30 0,34 48,95 97,3250,60 0,33 48,70 96,2550,40 0,34 49,70 98,61
seri 3 75,90 0,44 73,95 97,43 2,40 2,4575,30 0,44 74,95 99,5475,45 0,43 73,70 97,6875,90 0,44 76,20 100,4075,60 0,42 71,20 94,18
seri 4 101,40 0,54 99,95 98,57 1,20 1,20100,40 0,54 100,70 100,30100,60 0,55 102,70 102,09101,20 0,54 101,20 100,00100,80 0,54 100,70 99,90
seri 5 126,50 0,64 124,95 98,77 1,10 1,11125,50 0,64 125,45 99,96125,75 0,64 125,95 100,16126,50 0,63 123,20 97,39126,00 0,64 124,20 98,57
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
74
3. Linearitas
Linieritas pada suatu metode analisis dari suatu prosedur analisis
merupakan kemampuannya untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung
proporsional dengan konsentrasi (jumLah) analit di dalam sampel. Persyaratan
data linieritas yang bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien korelasi ( r ) >
0,999 (Mulja dan Hanwar, 2003). Metode ini memiliki linearitas yang baik karena
pada replikasi ke II diperoleh nilai r = 0,9999.
4. Spesifitas
Spesifitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur
zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang
mungkin ada dalam matriks sampel (Harmita, 2004). Dari hasil spektra terlihat
bahwa larutan asam galat, larutan uji fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam,
dan pelarut metanol-air tidak menunjukkan adanya gangguan berarti terhadap
absorbansi senyawa biru yang dihasilkan. Dengan demikian dapat dikatakan
metode ini memilki spesifitas yang baik.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
75
Gambar 23. Hasil scanning larutan asam galat pada λ 600-800 nm
Gambar 24. Hasil scanning fraksi air pada λ 600-800 nm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
76
Gambar 25. Hasil scanning metanol-air pada λ 600-800 nm
J. Hasil Estimasi Kandungan Fenolik Total
Senyawa fenolik yang banyak terkandung di dalam tanaman memiliki
peran penting dalam mengurangi resiko penyakit jantung koroner, kanker dan
beberapa penyakit lain yang disebabkan oleh radikal bebas (Makris, 2003). Oleh
karena itu, pada penelitian ini juga dilakukan penetapan kandungan fenolik total
untuk mengetahui hubungan antara aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak
metanolik buah labu siam dengan kandungan fenolik totalnya.
Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai ekivalen asam galat. Asam
galat (Gambar 26) merupakan asam dengan 3 gugus hidroksi fenolik sehingga
dapat digunakan sebagai senyawa baku untuk menetapkan kadar senyawa fenolik
total. Alasan lain penggunaan asam galat sebagai pembanding adalah tersedianya
asam galat dalam kemurnian yang tinggi dan stabil serta harganya yang relatif
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
77
lebih murah dibandingkan dengan senyawa standar yang lain (Mongkolsilp et al.,
2004).
Gambar 26. Struktur asam galat (Mongkolsilp et al., 2004).
Senyawa fenolik dalam suatu sampel secara kualitatif dan kuantitatif dapat
ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah dengan
adanya senyawa yang dapat mereduksi reagen fenol Folin-Ciocalteu, akan
menyebabkan terbentuk senyawa berwarna biru yang proporsional dengan
jumLah senyawa yang dapat mereduksi dan dinyatakan dalam nilai ekuivalen
asam galat (Abdul-Fadl,1949).
Senyawa fenolik akan menjadi ion fenolat dalam suasana basa karena itu
dalam penelitian ditambahkan natrium karbonat untuk mempermudah reaksi
antara senyawa fenolik dengan pereaksi Folin-Ciocalteu yang berisi reagen asam
fosfomolibdat-fosfotungstat. Senyawa fenolik akan dioksidasi oleh asam dari
pereaksi Folin-Ciocalteu, sedangkan pereaksi Folin-Ciocalteu akan mendapatkan
proton dari senyawa fenolik dan air (tereduksi) sehingga mengahasilkan senyawa
berwarna biru (molybenum-blue).
Hasil pengukuran absorbansi berbagai konsentrasi asam galat setelah
direaksikan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu dapat dilihat pada tabel XI.
77
lebih murah dibandingkan dengan senyawa standar yang lain (Mongkolsilp et al.,
2004).
Gambar 26. Struktur asam galat (Mongkolsilp et al., 2004).
Senyawa fenolik dalam suatu sampel secara kualitatif dan kuantitatif dapat
ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah dengan
adanya senyawa yang dapat mereduksi reagen fenol Folin-Ciocalteu, akan
menyebabkan terbentuk senyawa berwarna biru yang proporsional dengan
jumLah senyawa yang dapat mereduksi dan dinyatakan dalam nilai ekuivalen
asam galat (Abdul-Fadl,1949).
Senyawa fenolik akan menjadi ion fenolat dalam suasana basa karena itu
dalam penelitian ditambahkan natrium karbonat untuk mempermudah reaksi
antara senyawa fenolik dengan pereaksi Folin-Ciocalteu yang berisi reagen asam
fosfomolibdat-fosfotungstat. Senyawa fenolik akan dioksidasi oleh asam dari
pereaksi Folin-Ciocalteu, sedangkan pereaksi Folin-Ciocalteu akan mendapatkan
proton dari senyawa fenolik dan air (tereduksi) sehingga mengahasilkan senyawa
berwarna biru (molybenum-blue).
Hasil pengukuran absorbansi berbagai konsentrasi asam galat setelah
direaksikan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu dapat dilihat pada tabel XI.
77
lebih murah dibandingkan dengan senyawa standar yang lain (Mongkolsilp et al.,
2004).
Gambar 26. Struktur asam galat (Mongkolsilp et al., 2004).
Senyawa fenolik dalam suatu sampel secara kualitatif dan kuantitatif dapat
ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah dengan
adanya senyawa yang dapat mereduksi reagen fenol Folin-Ciocalteu, akan
menyebabkan terbentuk senyawa berwarna biru yang proporsional dengan
jumLah senyawa yang dapat mereduksi dan dinyatakan dalam nilai ekuivalen
asam galat (Abdul-Fadl,1949).
Senyawa fenolik akan menjadi ion fenolat dalam suasana basa karena itu
dalam penelitian ditambahkan natrium karbonat untuk mempermudah reaksi
antara senyawa fenolik dengan pereaksi Folin-Ciocalteu yang berisi reagen asam
fosfomolibdat-fosfotungstat. Senyawa fenolik akan dioksidasi oleh asam dari
pereaksi Folin-Ciocalteu, sedangkan pereaksi Folin-Ciocalteu akan mendapatkan
proton dari senyawa fenolik dan air (tereduksi) sehingga mengahasilkan senyawa
berwarna biru (molybenum-blue).
Hasil pengukuran absorbansi berbagai konsentrasi asam galat setelah
direaksikan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu dapat dilihat pada tabel XI.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
78
Tabel XI. Hasil absorbansi berbagai seri konsentrasi asam galat
ReplikasiKonsentrasi
(µg/mL) AbsorbansiPersamaan regresi
linear
1
25,3 0,237y = Bx + A
y = 0,0039 x + 0,1356r = 0,9999
50,6 0,33775,9 0,435101,2 0,539126,5 0,639
2
25,1 0,24y = Bx + A
y = 0,004 x + 0,1392r = 0,9999
50,2 0,3475,3 0,439100,4 0,542125,5 0,641
3
25,1 0,244y = Bx + A
y = 0,0040 x + 0,1373r = 0,9992
50,3 0,33575,45 0,434100,6 0,55125,75 0,643
4
25,3 0,24y = Bx + A
y = 0,0039 x + 0,1406r = 0,9993
50,6 0,33475,9 0,444101,2 0,544126,5 0,632
5
25,2 0,236
y = Bx + Ay = 0,00398 x + 0,134
r = 0,9991
50,4 0,33875,6 0,424100,8 0,542126 0,636
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
79
Tabel XII. Hasil absorbansi fraksi air
Replikasi
Konsentrasifraksi air(µg/mL) Absorbansi
1 10200,676
2 10100,662
3 10300,681
4 10400,689
5 10200,677
Tabel XIII. Hasil kandungan fenolik total fraksi air
Kandunganfenolik
(µg/mL)
Kandungan fenolik(mg ekivalen asamgalat per g fraksi)
Rata-rata (mgekivalen asam
galat per g fraksi) SD
134,20 6,58 6,560,05
130,70 6,47135,45 6,58137,45 6,61134,45 6,59
Dalam pembuatan kurva baku dilakukan lima replikasi sehingga
didapatkan lima persamaan regresi linier antara konsentrasi asam galat dengan
absorbansi yang didapat. Dari ketiga persamaan tersebut dipilih persamaan
dengan nilai liniaritas ( r ) yang paling baik. Persamaan regresi linier yang paling
baik diperoleh dari replikasi II dengan y = 0,004 x + 0,1392 dan r = 0,9999.
Dengan menggunakan persamaan tersebut diperoleh kandungan fenolik total
fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam sebesar 6,56 mg ekivalen asam galat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
80
per g fraksi. Namun nilai tersebut kurang valid karena absorbansi dari fraksi air
berada di luar dari rentang absorbansi kurva baku asam galat.
Di dalam labu siam juga mengandung asam askorbat karena itu, aktivitas
antioksidan dari labu siam tidak hanya dipengaruhi oleh kandungan senyawa
fenolik namun juga bisa karena kandungan asam askorbat di dalamnya.
Kandungan fenolik total diekspresikan dengan %b/b ekivalen asam galat
karena belum diketahuinya struktur kimia senyawa fenolik yang terdapat pada
total fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
81
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Nilai aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak metanol buah labu siam dengan
menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50 sebesar (51,89 +
0,48) µg/ml.
2. Kandungan fenolik total fraksi air ekstrak metanol buah labu siam yang
dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat sebesar (6,56 + 0,05) mg ekivalen
asam galat per g fraksi air.
B. Saran
1. Perlu dilakukan pengenceran pada fraksi air ekstrak metanol buah labu siam agar
diperoleh nilai absorbansi yang masuk dalam rentang absorbansi kurva baku asam
galat dalam penentuan kandungan fenolik total.
2. Perlu dilakukan uji korelasi antara kandungan fenolik pada fraksi air ekstrak
metanolik buah labu siam dengan aktivitasnya sebagai antioksidan.
3. Perlu dilakukan isolasi lebih lanjut dan elusidasi struktur untuk mengetahui
senyawa fenolik yang memiliki aktivitas antioksidan dalam fraksi air ekstrak
metanol buah labu siam.s
4. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut yang mendukung aktivitas antioksidan
buah labu siam sebagai antikanker.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
82
DAFTAR PUSTAKA
Abdult-Fadl, M.A.M., 1949, Colorimetric Determination of Potassium by Folin-Ciocalteu Phenol Reagent, Postgraduate Medical School, London, 44,282.
Ansel, C. H., 1989, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi, edisi IV, 607-609, UIPress, Jakarta.
APVMA, 2004, Guidelines For The Validation Of Analytical Methods For ActiveConstituent, Agricultural And Veterinary Chemical Products, Australia
Backer, C., A., and van den Brink Jr, R., C., B., 1968, Flora of Java, volume I, 1-306,N.V.P Noordhooff Groningen, Netherland
Caillet, S., Salmieri, S., and Lacroix, M., 2006, Evaluatio of free radical-scavenging properties of commericial grape phenol extracts by a fastcolorimetric method, J. Food Chem., 95: 1-6
Dahlan, M. S., 2011, Statistik Untuk Kedokteran dan Kesehatan, 24-25, 169,Salemba Medika, Jakarta
Depkes RI, 1986, Sediaan Galenik, 10-13, Departemen Kesehatan RepublikIndonesia, Jakarta.
Depkes RI a, 2000, Inventaris Tanaman Obat Indonesia (I), Jilid 1, 213-214,Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Jakarta.
Depkes RI b, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, cetakanpertama, 6, 13-38, Departemen Kesehatan RI, Jakarta.
Ekowahyuni, P., 2002, Makalah falsafah Sains :Fenomena vivipary Labu Siam(Sechium edule Jacq Swartz) Varietas Lokal Desa Barukupa BawahCipanas, Program Pasca Sarjana IPB, Bandung.
Fessenden, R.J., dan Fessenden J.S., 1995, Kimia Organik, Jilid II, 119-220,diterjemahkan oleh Pujaatmaka, A.H., edisi ketiga, Penerbit Erlangga,Jakarta.
Gulcin, I., Uguz, M.T., Oktay, M., Beydemir, S., Kufrevioglu, O.I., 2004,Evaluation of the Antioxidant and Antimicrobial Activities of Clary Sage(Salvia sclarea L.), Turk. J., Agric. For., 28: 25-33.
Halliwell, B., and Gutteridge J. M. C., 2000, Free Radical in Biology andMedicine, 1-231, 353-435, Oxford University Press, New York.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
83
Handayani, 2011, Proses Pencoklatan pada Buah Apel,http://teknologi.kompasiana.com/terapan/2011/05/13/prosespencokelatan-pada-buah-apel/, diakses pada tanggal 3 Desember 2011
Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi dan Cara Perhitungan,Departemen FMIPA UI, Depok, pp. 5-13.
Hernani dan Rahardjo M., 2005, Tanaman Berkhasiat Antioksidan, PenebarSwadaya, Bogor.
Hertiani, T., 2000, Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid Antioksidan dariDaun Plantago Mayor L., Tesis, Program Pasca Sarjana UGM,Yogyakarta.
Heyne, K., 1987, Tumbuhan Berguna Indonesia, Jilid III, diterjemahkan olehBadan Litbang Kehutanan, hal. 1819, Yayasan Sarana Wana Jaya,Jakarta.
Khikmawati, W., H., 2009, Pengaruh Pemberian Perasan Buah Labu SiamTerhadap Penurunan Kadar Glukosa Daraah Pada Kelinci Jantan NewZealand yang Dibebani Glukosa, Skripsi, Universitas MuhammadiyahSurakarta, Surakarta.
Kim, D.K., Lee, K.W., Lee, H.J., and Lee C.Y., 2002, Vitamin C equivalentantioxidant capacity (VCEAC) of phenolic phytochemicals, J. AgricFood Chem., 50, 3713-3717.
Markham, K.R., 1988, Tecniques of Flavonoid Identification, diterjemahkan olehPadmawinata, K., hal. 15, ITB, Bandung.
Marliana, SD., Suryanti V., Suyono, 2005, Skrining Fitokimia dan AnalisisKromatografi Lapis Tipis Komponen Kimia Buah Labu Siam (Sechiumedule Jacq. Swartz.) dalam Ekstrak Etanol, Biofarmasi., 3 (1): 26-3.
Marxen, K., Vanselow, K.H., Lippemeier, S., Hitsze, R., Ruser, A., dan Hansen,U., 2007, Determination of DPPH Radical Oxidation Caused byMethanolic Extract of Some Mircroalgal Species by Linear RegressionAnalysis of Spectrofotometric Measurements, Sensors, 7(2007), 2080-2095, Jerman.
Matsuda, H., Morikawa, T., Ueda, H., Yoshikawa M., 2001, Medical Foodstuffs.XXVII, Chem. Pharm. Bull., Tokyo, 49 (10), 1368-1371.
Melo, E., Lima, V., Maciel, M, 2006, Polyphenol, Ascorbic acid and TotalCarotenoid Contents in Common Fruits and Vegetables Brazil, BrazilianJournal of Food Technology, Vol. 9 : 89-94.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
84
Molyneux, P., 2004, The Use of The Stable ree Radical DPPH for EstimatingAntioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci. Technol., 26 (2), 211-219
Mongkolsilp, S., Pongbupakit, I., Sae-Lee, N., Sitthithaworn, W., 2004, Radicalscavenging activity and total phenolic content of medical plants ofmedicinal plants used in primary healt care, SWU J. Pharm Sci, 9: 2-35.
Mulja, M., Hanwar, D., 2003, Prinsip-prinsip dan Cara Berlaboratorium yang baik(Good Laboratory Practice), Majalah Farmasi Airlangga, Volume III,No.2, 71 – 76.
Nazaruddin, 1998, Sayuran Dataran Rendah, 104-105, Penebar Swadaya, Jakarta.
Nusarini, N.M.R., 2007, Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat EkstrakMetanolik Herba Ketul (Bidens pilosa L.), Skripsi, 15-20, FakultasFarmasi Universitas Gajah Mada, Yogyakarta.
Pedricilli, P., 2001, Antioxidant Mechanism of Flavonoid, Solvent Effect on RateConstant for Chain Breaking Reaction of Quersetin and EpicathecininAutoxidation of Metyl Linoleat, J. Agric. Food Chem, 49.
Pokorny J., Yanishlieva, N., Gordon., 2001, Antioxidant in Food : PracticalApplications, CRC Press, New York.
Prakash, A., Rigelhof, F., Miller, E., 2001, Antioxidant Activity, MedalliaonLaboratories.
Pratiwi, R. I. S., 2011, Karakterisasi Simplisia dan Uji Aktivitas AntioksidanEkstrak n-Heksan, Etil Asetat, dan Etanol Herba Labu Siam, Skripsi,Universitas Sumatra Utara, Medan.
Prior, R.L., Wu, X., and Schaich, K., 2005, Standarized methods for thrdetermination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietarysupplements, J. Agric. Food Chem., 55: 2698A-J.
Proestos, C., Sereli, D., and Komaitis, M., 2006, Determination of phenoliccompounds in aromatic plant by RP-HPLC and GC-MS, J.Food Sci., 95:44-52.
Pujimulyani D., 2003, Pengaruh bleanching terhadap sifat antioksidan sirup kunirputih (Curcuma mangga val.), Agritech, 23(3): 137-141.
Ronoprawiro, S. ,1993, Produksi Sayuran di Daerah Tropika, Terjemahan :Vegetable Production in The Tropics. C.N.Williams, 203, UGM Press,Yogyakarta.
Sambada, D. L. E., 2011, Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal DPPHdan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Air Ekstrak EtanolikDaun Selasih, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
85
Sambada, edhi, 2011, Metode penetapakn kandungan fenolik total dengan folin-ciocalteu, http://edhisambada.wordpress.com/2011/02/18/metode-folin-ciocalteu/, diakses tanggal 23 Desember 2011
Sastrohamidjojo, H., 1991, Spektroskopi, 1-114, Liberty, Yogyakarta
Sastrohamidjojo, H., 1991, Spektroskopi, edisi II, Liberty, Yogyakarta
Saurisari, R., 2006, Mengenal dan Menangkal Radikal Bebas,http://www.beritaiptek.com, diakes tanggal 11 Maret 2011.
Sidney X., dos Santos, Luiz H., Mazo, Eder T., G., Cavalheiro, 2008, The use of agraphite-silicone rubber composite electrode in the determination of rutinin pharmaceutical formulation, J. Braz. Chem. Soc, vol.19 no.8, SaoPaulo, Brazil
Sihombing, Ninda, 2011, Mekanisme antioksidan menetralkan radikal bebas,http://nindasihombing.blogspot.com/2011/03/catatan-kuliahnutraseutikal-sebelum.html, diakses tanggal 23 Desember 2011
Sjabana, M.G., dan Jovanovic, J.V., 2002, Seri Referensi Herbal : PesonaTradisional dan Ilmiah Buah Mengkudu (Morinda citrifolia L.), 5-20,Salemba Medika, Jakarta.
Sofia, D., Antioksidan dan Radikal Bebas, http://www.chemistry.org, diaksestanggal 1 Mei 2011.
Sunarjono, H., 2004, Bertanam 30 Jenis Sayuran, 115-117. Penebar Swadaya,Jakarta.
Sunarni, T., 2005, Aktivitas Antioksidan Penangkap Radikal Bebas Beberapakecambah Dari Biji Tanaman Familia Papilionaceae, 53-61, JurnalFarmasi Indonesia 2 (2), Jakarta.
Tahir, I., Wijaya, K., Widianingsih, D., 2003, Terapan Analisis Hansch UntukAktivitas Antioksidan senyawa Turunan Flavon/Flavonol, Seminar onChemometrics-Chemistry Dept Gadjah Mada University, Yogyakarta.
Wahyuni, Tri, 2009, Aktivitas Antioksidan Buah Labu Siam (Sechium eduleSwartz), Skripsi, Universitas Sebelas Maret, Surakarta.
Winarsi, W., 2007, Antioksidan Alami dan Radikal Bebas, Kanisius, Yogyakarta,pp. 13, 77.
Yuliarti, N., 2007, Awas! Bahaya di Balik Lezatnya Makanan, 120, Andi,Yogyakarta.
Zin, Z. M., Hamid, A. A., Osman, A., Saari, N., 2006, Antioxidative Activities ofChromatographic Fractions Obtained from Root, Fruit, and Leaf ofMengkudu (Morinda citrifolia L.), Food Chemistry, Vol. 94 : 169-178.
Zou, Y., Lu, Y., dan Wei, D., 2004, Antioxidant Activity of Flavonoid-RichExtract of Hypericum Perforatum L in vitro, J. Agric Food Chem., 52:5032-5039.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
86
LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman labu siam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
87
Lampiran 2. Gambar tanaman labu siam dari daerah Sawangan (Magelang)
Lampiran 3. Perhitungan rendemen
Bobot buah labu siam = 1000 g
Fraksi air
Penimbangan Cawan I Cawan IICawan porselen 52,7561 g 53, 8417 gCawan porselen + fraksi air 65, 1848 g 67, 4953 gBobot fraksi 12, 4287 g 13,6536 gTotal bobot fraksi 26,0823 g
Rendemen fraksi air = x 100 %
= , x 100 %
= 2,6 %
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
88
Lampiran 4. Data penimbangan bahan
1. DPPH
Penimbangan Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5Bobot kertas 0,2122 g 0,2352 g 0,2256 g 0,2117 g 0,2327 gBobot kertas +DPPH
0,2279 g 0,2509 g 0,2415 g 0,2346 g 0,2485 g
Bobot sisa 0,2124 g 0,2353 g 0,2258 g 0,2118 g 0,2329 gBobot DPPH 0,0155 g 0,0156 g 0,0157 g 0,0158 g 0,0156 g
2. Rutin
Penimbangan Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5Bobot kertas 0,2358 g 0,2234 g 0,2561 g 0,2342 g 0,2376 gBobot kertas +rutin
0,2384 g 0,2267 g 0,2587 g 0,2368 g 0,2403 g
Bobot sisa 0,2359 g 0,2236 g 0,2562 g 0,2343 g 0,2378 gBobot rutin 0,0025 g 0,0025 g 0,0025 g 0,0025 g 0,0025g
3. Fraksi air
Penimbangan Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5Bobot cawan 21,6747 g 23,2374 g 25,1211 g 22,2743 g 23,1197 gBobot cawan +rutin
21,7000 g 23,2630 g 25,1466 g 22,2998 g 23,1450 g
Bobot sisa 21,6748 g 23,2376 g 25,1213 g 22,2744 g 23,1198 gBobot rutin 0,0252 g 0,0254 g 0,0253 g 0,0254 g 0,0252 g
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
89
Lampiran 5. Data perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding dan
larutan uji
1. DPPH
Contoh perhitungan molar DPPH
Replikasi 1
BM = 394,33
Mol = = , , = 00393M = = , , = 0,393
2. Rutin (larutan pembanding)
Konsentrasi Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5Seri 1 2,5 µg/ml 2,5 µg/ml 2,5 µg/ml 2,5 µg/ml 2,5 µg/mlSeri 2 5,1 µg/ml 5,0 µg/ml 5,0 µg/ml 5,1 µg/ml 5,1 µg/mlSeri 3 7,6 µg/ml 7,6 µg/ml 7,5 µg/ml 7,6 µg/ml 7,6 µg/mlSeri 4 10,2 µg/ml 10,1 µg/ml 10,0 µg/ml 10,2 µg/ml 10,1 µg/mlSeri 5 12,7 µg/ml 12,6 µg/ml 12,5 µg/ml 12,7 µg/ml 12,7 µg/ml
Contoh perhitungan konsentrasi larutan pembanding :
Replikasi 1
Konsentrasi larutan stok rutin = , = 250 μ /Konsentrasi larutan intemediet pembanding (seri 1)
V1 x C1 = V2 x C2
0,5 ml x 250 µg/ml = 10 x C2
C2 = 12,5 µg/ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
90
Konsentrasi larutan pembanding (seri 1) :
V1 x C1 = V2 x C2
2 ml x 12,5 µg/ml = 10 x C2
C2 = 2,5 µg/ml
3. Fraksi air (larutan uji)
Konsentrasi Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5Seri 1 20,2 µg/ml 20,3 µg/ml 20,2 µg/ml 20,3 µg/ml 20,2 µg/mlSeri 2 30,2 µg/ml 30,5 µg/ml 30,4 µg/ml 30,5 µg/ml 30,2 µg/mlSeri 3 40,3 µg/ml 40,6 µg/ml 40,5 µg/ml 40,6 µg/ml 40,3 µg/mlSeri 4 50,4 µg/ml 50,8 µg/ml 50,6 µg/ml 50,8 µg/ml 50,4 µg/mlSeri 5 60,5 µg/ml 61,0 µg/ml 60,7 µg/ml 60,9 µg/ml 60,5 µg/ml
Contoh perhitungan konsentrasi larutan uji:
Replikasi 1
Ditimbang 25,2 mg ditambahkan metanol p.a sampai 25 ml, sehingga
komsemtrasinya 1008 µg/ml.
Intermediet (seri 1)
V1 x C1 = V2 x C2
1 ml x 1008 µg/ml = 10 x C2
C2 = 100,8 µg/ml
Konsentrasi larutan uji (seri 1)
V1 x C1 = V2 x C2
2 ml x 100,8 µg/ml = 10 x C2
C2 = 20,16 µg/ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
91
Lampiran 6. Scanning pengkoreksi
1. Scanning metanol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
92
2. Scanning metanol : air (1:1 v/v)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
93
3. Scanning rutin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
94
4. Scanning asam galat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
95
5. Scanning fraksi air (400-600 nm)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
96
6. Scanning fraksi air (600-800 nm)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
97
Lampiran 7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan
1. Penentuan OT
Waktu(menit)
Konsentrasi rutin (µg/ml) Konsentrasi fraksi air (µg/ml)2,5 7,5 12,5 20 40 60
5 0,534 0,435 0,092 0,821 0,624 0,41910 0,503 0,334 0,087 0,819 0,62 0,39515 0,483 0,311 0,086 0,811 0,613 0,38220 0,480 0,285 0,083 0,795 0,596 0,36625 0,476 0,270 0,081 0,78 0,583 0,35230 0,475 0,260 0,080 0,78 0,583 0,35235 0,475 0,260 0,080 0,78 0,583 0,35240 0,475 0,260 0,080 0,78 0,583 0,35245 0,475 0,260 0,080 0,78 0,583 0,35250 0,475 0,260 0,080 0,78 0,583 0,35255 0,475 0,260 0,080 0,78 0,583 0,35260 0,475 0,260 0,080 0,78 0,583 0,352
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
98
2. Penentuan λ maksimum
a. Scanning DPPH 0,020 Mm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
99
b. Scanning DPPH 0,040 mM
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
100
c. Scanning DPPH 0,080 mM
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
101
Lampiran 8. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH
% IC= ( / 100 %Rutin
Replikasi Konsentrasi(μg/ml)
Absorbansikontrol
Absorbansilarutan
pembanding
%IC(%)
Persamaan regresilinear
1
2,5
0,890
0,619 30,45 y = Bx + A5,1 0,491 44,83 y = 5,8347 x + 16, 3037,6 0,324 63,6 r = 0,997310,2 0,214 75,9612,7 0,098 88,99
Fraksi air
Replikasi Konsentrasi(μg/ml)
Absorbansikontrol
Absorbansilarutan
fraksi air%IC (%) Persamaan regresi
linear
1
20,16
0,892
0,780 12,56 y = Bx + A30,24 0,623 30,16 y = 1,1588 x - 8,497740,32 0,578 35,2 r = 0,989950,4 0,461 48,3260,48 0,349 60,87
Contoh perhitungan nilai %IC
Rutin (replikasi 1, konsentrasi 2,5 µg/ml)
% IC = , ,, x 100 % = 30,45 %
Fraksi air (replikasi 1, konsentrasi 20,16 µg/ml)
% IC = , ,, x 100 % = 12,56 %
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
102
Lampiran 9. Perhitungan nilai IC50 fraksi air ekstrak metanol buah labu
siam dan rutin
Bahan
Uji
IC50
rata-rata
(μg/ml) SD
%
CV
(%)
Rep. 1
(μg/ml)
Rep. 2
(μg/ml)
Rep. 3
(μg/ml)
Rep. 4
(μg/ml)
Rep. 5
(μg/ml)
Rutin 5,77 5,78 5,80 5,83 5,81 5,80 0,02 0,34
Fraksi
air 51,36 52,24 51,48 52,49 51,88 51,89 0,48 0,93
Keterangan : Rep = Replikasi ; SD = Simpangan Deviasi ; dan CV =Coefficient of Variant
Persamaan regresi linier dari konsentrasi dengan %IC adalah Bx + A
y = aktivitas antioksidan (%IC)
x = konsentrasi (µg/ml)
IC50 adalah nilai x pada saat y sebesar 50%
Contoh perhitungan nilai IC50 (Rutin replikasi 1)
y = 5,8347 x + 16, 303
50 = 5,8347 x + 16, 303
x = 5,77 µg/ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
103
Lampiran 10. Uji statistik aktivitas antioksidan dengan SPSS 17.0
1. Uji normalitas
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
Rutin .167 25 .069 .891 25 .012
F.Air .139 25 .200* .910 25 .030
a. Lilliefors Significance Correction
*. This is a lower bound of the true significance.
2. Uji Mann-Whitney
Test Statisticsb
Kadar
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 15.000
Z -2.611
Asymp. Sig. (2-tailed) .009
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008a
a. Not corrected for ties.
b. Grouping Variable: Faktor
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
104
Lampiran 11. Penimbangan untuk uji kandungan fenolik total
Penimbangan asam galat
Penimbangan Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5Bobot kertas 0,2341 g 0,2386 g 0,2256 g 0,2178 g 0,2357 gBobot kertas +asam galat
0,2393 g 0,2438 g 0,2307 g 0,2230 g 0,2410 g
Bobot sisa 0,2342 g 0,2388 g 0,2257 g 0,2179 g 0,2359 gBobot asamgalat
0,0051 g 0,0050 g 0,0050 g 0,0051 g 0,0051 g
Penimbangan fraksi air
Bobot Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5Cawan 21,1287 g 21,1342 g 25,6591 g 23,6087 g 24,2625gCawan + fraksi air 21,1389 g 21,143 g 25,6694 g 23,6191 g 24,2729 gIsi 0,0102 g 0,0101 g 0,0103 g 0,0104 g 0,0104 g
Lampiran 12. Optimasi penentuan kandungan fenolik total
1. Penentuan OT
Waktu(menit)
Konsentrasi asam galat (µg/ml)
25 50 1255 0,252 0,563 0,69410 0,274 0,59 0,71615 0,274 0,59 0,76920 0,274 0,59 0,76925 0,274 0,59 0,76930 0,274 0,59 0,769
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
105
2. Scanning λ maksimum
a. Scanning penentuan kandungan fenolik total asam galat 25 µg/ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
106
b. Scanning penentuan kandungan fenolik total asam galat 75 µg/ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
107
c. Scanning penentuan kandungan fenolik total asam galat 125 µg/ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
108
Lampiran 13. Penentuan kandungan fenolik total
Contoh perhitungan kandungan fenolik total
Replikasi 1
y = 0,004 x + 0,1392
0,676 = 0,004 x + 0,1392
x = 134,2 µg/ml
Kandungan fenolik total
x. = 0,1342 . ,, = 6,58
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
109
Lampiran 14. Skema jalannya penelitian
Determinasi tanaman
Pengumpulan bahan
Pembuatan ekstrak etanolik buah labu siam
Fraksi washbensin Fraksi air I
Ekstraksi cair-cair dengan etilasetat
Fraksi air II Fraksi etil asetat
Uji pendahuluan
Optimasi metode penetapankandungan fenolik total
Optimasi uji aktivitasantioksidan
Validasi metode penetapankandungan fenolik total
Estimasi penetapankandungan fenolik total
Validasi metode ujiaktivitas antioksidan
Estimasi aktivitasantioksidan
Ekstraksi cair-cair dengan washbensin dan air
Analisis statistik denganSPSS 17.0
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
110
Lampiran 15. Uji kualitatif fraksi etil asetat
a. Uj kualitati aktivitas antioksidan
(A= rutin ; B = fraksi etil asetat)
b. Uji kualitatif kandungan fenolik total
(A = fraksi etil asetat ; B = asam galat ; C = pelarut)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
111
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi yang berjudul “Uji AktivitasAntioksidan Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan KandunganFenolik Total Fraksi Air Ekstrak Metanolik BuahLabu Siam (Sechium edule Jacq. Swartz.)”memiliki nama lengkap Angela Natalia MetaKarvitasari. Penulis lahir di Purwokerto, JawaTengah pada tanggal 23 Desember 1989,merupakan anak tunggal dari pasangan RichardusEko Nugroho dan Cornelia Widiastuti. Pendidikanformal yang telah ditempuh oleh penulis: TK Santa
Maria Purwokerto (1994-1996), SD Bruderan Purwokerto (1996-2002), SMPNegeri 1 Purwokerto (2002-2005), SMA Negeri 1 Purwokerto (2005-2008). Padatahun 2008, penulis melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Universitas SanataDharma (USD) Yogyakarta. Selama kuliah penulis aktif dalam kegiatan mudikadi Keuskupan Purwokerto. Selain itu, penulis juga aktif dalam beberapakepanitiaan baik di dalam universitas maupun diluar universitas antara lain PanitiaPharmacy Performance (2009), Panitia Bakti Sosial Aksi Puasa PembangunanPengabdian Masyarakat (2009), Panitia Wisata Rohani Mudika KeuskupanPurwokerto (2009), Panitia Wisata Rohani Wanita Katolik KeuskupanPurwokerto (2010) serta menjadi beberapa peserta seminar seperti seminar HerbaMedicines (2008), seminar Kanker Serviks dan Kanker Paru-Paru (2011), seminarHIV-AIDS (2011)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI