plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk fileiv halaman persembahan om dewa suksma...

i

AKTIVITAS ANTIANGIOGENESIS EKSTRAK ETANOL BUAH

MENGKUDU (Morinda citrifolia L.) TERHADAP CHORIOALLANTOIC

MEMBRANE YANG DIINDUKSI BASIC FIBROBLAST GROWTH

FACTOR

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Pande Putu Krisna Wedana

NIM : 108114030

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2014

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Om Dewa suksma parama acintya ya namah swaha

Sarwa karya prasidhantam

Om santih santih santi Om

Akhir dari upaya terbaik kita adalah awal dari campur tangan Tuhan.

Maka bekerjalah sebaik mungkin, lalu bersabarlah seyakin mungkin.

Ku persembahkan skripsi ini untuk :

Tuhan ku “Ida Sang Hyang Widhi Wasa”, sebagai pelindung dan sumber

kekuatanku . . .

Papa dan Mama tercinta sebagai motivator terbesar dalam hidupku . . .

Pande Made Bayu Wedayana, Pande Nyoman Wahyu Wedadana adikku

dan keluarga besar yang selalu memberi dukungan dan doa . . .

Bapak Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt yang selalu membimbing dengan sabar .

Sahabat dan teman-teman seperjuangan Nover, Stien dan Retno

Almamaterku tercinta Universitas Sanata Dharma . . .


v


vi


vii

PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat-Nya, penulis dapat

menyelesaikan skripsi berjudul “Aktivitas Antiangiogenesis Ekstrak Etanol

Buah Mengkudu (Morinda citrifolia L) terhadap CAM yang diinduksi bFGF“

dengan baik dan tepat waktu.

Skripsi ini dibuat untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar

Sarjana Farmasi (S.Farm.) program studi Farmasi Universitas Sanata Dharma.

Penulis menyadari bahwa dalam pelaksanaan dan penyusunan skripsi,

tidak terlepas dari bantuan dan campur tangan dari berbagai pihak. Oleh karena

itu, pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada :

1. Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan rahmatnya selama ini.

2. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

3. Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt., sebagai Dosen Pembimbing Utama

skripsi ini atas segala kesabarannya telah memberikan bimbingan,

pengarahan, tuntunan, dukungan dan motivasi selama penelitian dan

penyusunan skripsi.

4. Ibu, Bapak, Ninik, Bayu, Komang, Tante-tante, Om dan Keluarga

Besar Pande tercinta yang tidak putus-putusnya mendoakan dan

memberi dukungan hingga penulis bisa menyelesaikan skripsi dengan

baik.

5. Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt, selaku Dosen Penguji yang telah

memberikan kritik dan saran selama penyusunan skripsi.


viii

6. Agustina Setiawati, M.Sc., Apt, selaku Dosen Penguji yang telah

memberikan kritik dan saran selama penyusunan skripsi.

7. Ni Putu Cintya Maharani penyemangatku yang selalu setia menemani

dan memberikan masukan positif.

8. Teman-teman seperjuangan Nover, Stien dan Retno atas segala

kerjasama, bantuan dan semangat yang selalu bergelora dalam

penyusunan skripsi ini dari awal hingga akhir.

9. Sahabat-sahabat sejati, Therezita S. L., Inggrid R. T., Angelina

Pangala, Tirzayana A. T., Catharina A., Pricilla Diana V. V., dan

Catharina S. atas bantuan, kerjasama dan motivasi yang diberikan.

10. Seluruh warga FKK angkatan 2010 kelas C dan semua teman Farmasi

USD atas semngat kebersamaan dan keceriaan selama menempuh S1

di Fakultas Farmasi Sanata Dharma.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh

karena itu peneliti menerima kritik dan saran yang membatu dan bermanfaat bagi

pengembangan ilmu pengetahuan, serta dapat menjadi acuan bagi penelitian-

penelitian selanjutnya.

Penulis


ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL................................................................................................i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING......................................................ii

HALAMAN PERSEMBAHAN........……………………………………….........iii

PRAKATA..............................................................................................................iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA................................................................vi

DAFTAR ISI..........................................................................................................vii

DAFTAR TABEL...................................................................................................xi

DAFTAR GAMBAR.............................................................................................xii

DAFTAR LAMPIRAN.........................................................................................xiii

INTI SARI.............................................................................................................xiv

ABSTRACT............................................................................................................xvi

BAB I. PENGANTAR......................................................................................... 1

A. LATAR BELAKANG................................................................................ 1

1. Perumusan masalah…………………………………………………...4

2. Keaslian penelitian…………………………………………………….4

3. Manfaat penelitian……………………………………………………..4

B. TUJUAN PENELITIAN………………………………………………….5

a. Tujuan umum ........................................................................................5

b. Tujuan khusus........................................................................................5


x

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA....................................................................6

A. Mengkudu…………………………………………………………………........6

1. Sistematika tumbuhan ………………………………….....………………6

2. Nama daerah ………...........………………………………………………..7

3. Deskripsi………………………………………………………………........7

4. Kandungan kimia dan manfaat .…...……………………….………............7

B. Ekstraksi ……………………………………………………………………….8

C. Kanker ………………………………………………………………………..10

1. Definisi kanker……………………………………………………… ……10

2. Penyebab kanker……………………………………………………….....11

3. Morfologi sel kanker……………………………………………………...12

4. Proses terjadinya kanker…………………………………………………..14

D. Angiogenesis………………………………………………………………….15

E. b-FGF…………………………………………………………………………18

1. Basic fibroblast growth factor……………………………………………18

F. Chorioallantoic Membrane…………………………………………………...21

G. Landasan Teori………………………………………………………………..23

H. Hipotesis………………………………………………………………………24

BAB III METODE PENELITIAN……………………………………………….25

A. Jenis dan Rancangan Penelitian……………………………………………….25

B. Variabel……………………………………………………………………….25

1. Variabel utama……………………………………………………………25

2. Variabel pengacau…………………………………………………….......26


xi

3. Definisi operasional ………………………………………………............26

C. Bahan Penelitian……………………………………………………………....27

D. Alat Penelitian………………………………………………………………...27

E. Tata Cara Penelitian ………………………………………………………….28

1. Determinasi tanaman …………………………………………………......28

2. Preparasi ekstrak etanol buah mengkudu………………………………....28

3. Sterilisasi alat……………………………………………………………...29

4. Pembuatan larutan uji basic fibroblast growth factor………………….....29

5. Uji angiogenesis…………………………………………………………..29

F. Analisis Data………………………………………………………………….31

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN………………………………………...33

A. Hasil Determinasi dan Ekstraksi Buah Mengkudu………………………33

B. Aktivitas Basic Fibroblast Growth Factor Dalam Menginduksi

Angiogenesis……………………………………………………………..34

C. Uji Daya Hambat Ekstrak Etanol Buah Mengkudu Morinda Citrifolia L.

Terhadap Angiogenesis Pada CAM Terinduksi bFGF…………………...38

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN………………………………………….46

A. Kesimpulan………………………………………………………………46

B. Saran………………………………………………………………….......46

DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………………47

LAMPIRAN ……………………………………………………………………..54

BIOGRAFI PENULIS…………………………………………………………...70


xii

DAFTAR TABEL

Tabel I Jumlah Pembuluh Darah Baru Kelompok Kontrol Paper Disc,

Kontrol Pelarut, Kontrol bFGF + Pelarut dan Kelompok Perlakuan

…….............................................................................. 37

Tabel II Persentase Penghambatan Angiogenesis Dengan Varian

Konsentrasi Ekstrak Etanol Buah Mengkudu (Morinda citrifolia. L

) ………….. ................................................................................39

Tabel III Matriks Signifikasi % Penghambatan Angiogenesis (P < 0,05)…41

Tabel IV Rata-rata dan Standar Deviasi Pembuluh Darah Baru…………...61

Tabel V Persentase Penghambatan Angiogenesis…………………………63


xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1 Buah Mengkudu Morinda citrifolia, L.……………….………......6

Gambar 2 Persentase penghambatan angiogenesis………………………......39

Gambar 3 Diagram Batang Rata-Rata Perbandingan jumlah pembuluh darah

antarkelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol Morinda

citrifolia L…………………….......................................................42


xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Foto Buah Mengkudu Morinda citrifolia. L………..........55

Lampiran 2 Foto Serbuk Morinda citrifolia. L……………………….55

Lampiran 3 Foto Ekstrak Kental Etanol Buah Mengkudu Morinda

citrifolia. L………………………………………………..56

Lampiran 4 Foto Pembuatan larutan uji dan larutan basic Fibroblast

Growth Factor (bFGF)…………………………………...56

Lampiran 5 Foto Pembuatan Jendela Berukuran 1x1 cm……………..57

Lampiran 6 Data Perhitungan Rendemen Ekstrak Etanol Buah

Mengkudu………………………………………………...57

Lampiran 7 Data Perhitungan Pengenceran bFGF…………………....58

Lampiran 8 Perhitungan Berat Ekstrak dan Volume DMSO……….....59

Lampiran 9 Persentase Penghambatan Angiogenesis…………………61

Lampiran 10 Foto Pengamatan makroskopik pembentukan pembuluh

darah pada setiap kelompok……………………………....64

Lampiran 11 Analisis uji statistik normalitas…………………………...65

Lampiran 12 Analisis uji statistik one way anova………………………65

Lampiran 13 Analisis uji statistik Tukey…………………...…………..67

Lampiran 14 Hasil Determinasi………………………………………...69


xv

INTISARI

Salah satu strategi penghambatan perkembangan kanker adalah dengan

menghambat proses angiogenesis. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek

antiangiogenesis ekstrak etanol buah Morinda citrifolia. L menggunakan metode

chorioallantoic membrane (CAM). CAM telur ayam berembrio umur 8-9 hari

diberi perlakuan bFGF (induktor angiogenesis) dan ekstrak etanol buah Morinda

citrifolia. L kemudian diinkubasi selama 3 hari untuk selanjutnya diamati respon

angiogenesisnya.

Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan didapatkan hasil ekstrak

etanol buah Morinda citrifolia. L mampu menghambat angiogenesis pada CAM.

Penelitian ini menunjukkan bahwa kandungan ekstrak etanol buah mengkudu

memiliki aktivitas antiangiogenesis. Kemampuan penghambatan angiogenesis

ekstrak etanol buah Morinda citrifolia. L adalah pada konsentrasi 100 µg/ml,

ekstrak mempunyai kemampuan menghambat sebesar 12,86% ; konsentrasi 150

µg/ml sebesar 37,17% ; konsentrasi 225 µg/ml sebesar 50,03%.

Kata kunci : Morinda citrifolia L., angiogenesis, Chorioallantoic Membrane

(CAM), bFGF.


xvi

ABSRACT

One strategy is the inhibition of the progression of cancer by inhibiting

angiogenesis process. This study aims to determine the antiangiogenesis effects of

ethanol extract of Morinda citrifolia. L fruit using the method of chorioallantoic

membrane (CAM). CAM embryonated chicken eggs 8-9 days of age treated with

bFGF (inductor angiogenesis) and ethanol extract of Morinda citrifolia. L fruit

and then incubated for 3 days then observed the response to angiogenesis.

Based on the results of research conducted showed ethanol extract of

Morinda citrifolia. L fruit was able to inhibit angiogenesis in CAM. This study

shows that the content of the ethanol extract of noni fruit has a antiangiogenesis

activity. Angiogenesis inhibition ability of ethanol extract of Morinda citrifolia. L

fruit is at a concentration of 100 ug / ml, the extract has the ability to inhibit by

12.86%; concentration of 150 ug / ml was 37.17%; concentration of 225 ug / ml

was 50.03%.

Kata kunci : Morinda citrifolia L., angiogenesis, Chorioallantoic Membrane

(CAM), bFGF.


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Menurut Organisasi Kesehatan Dunia setiap tahun penderita kanker di

dunia bertambah 6,25 juta orang. Di Indonesia diperkirakan setiap tahun terdapat

100 penderita baru dari setiap 100.000 penduduk. Penyakit kanker menduduki

urutan ketiga penyebab kematian di Indonesia (Nugroho dkk, 2000).

Banyaknya usaha dilakukan untuk mencegah dan mengobati penyakit

kanker. Pengobatan medis seperti kemoterapi, pembedahan, dan penyinaran

bukanlah pilihan yang diminati pasien karena biaya obat dan perawatan yang

mahal dan menimbulkan efek samping setelah terapi yang tidak diinginkan seperti

daya tahan tubuh menurun, rambut rontok, kulit dan gigi menjadi rusak (Nafrialdi

& Gan 1982). Oleh karena itu perlu adanya alternatif pencegahan dan pengobatan

kanker yang aman dan mudah tersedia dengan memanfaatkan dan mengkonsumsi

bahan alami yang terdapat dan tumbuh di daerah yang terjangkau pada penderita

kanker.

Penggunaan tanaman obat dalam pengobatan dan pencegahan penyakit

sudah lama dikenal masyarakat. Saat ini tanaman obat yang sering digunakan oleh

masyarakat adalah mengkudu. Mengkudu (Morinda citrifolia) merupakan

tanaman liar yang banyak tumbuh di tepi pantai di seluruh Nusantara. Buah

mengkudu merupakan tanaman obat yang cukup potensial untuk dikembangkan.

Hampir semua tanaman mengkudu mengandung berbagai senyawa yang berguna


2

untuk pengobatan maupun menjaga kesehatan tubuh (Bestari, 2005). Menurut

Will Mcclatchey, (2002) (dalam jurnal Aruma, et al., 2013), menyebutkan bahwa

buah mengkudu mengandung berbagai komponen seperti vitamin C, vitamin A,

terpenoid, alkaloid, antrakuinon (damnachantal, mirindon, rubiadin-1-metil eter),

rutin, alizarin, asam kapirat, kumarin, skopoletin dan flavonoid.

Pada penelitian (Hiramatsu dkk., 1993) menyebutkan bahwa buah

mengkudu dapat menghambat pertumbuhan tumor dengan merangsang sistem

imun yang melibatkan makrofag atau limfosit. Buah mengkudu memiliki aktivitas

adaptogen, yang artinya bahwa buah mengkudu termasuk salah satu nutrisi yang

dapat mengembalikan fungsi sel yang abnormal menjadi normal.

Berdasarkan hasil penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya

menunjukkan bahwa buah mengkudu diketahui mempunyai efek antikanker.

Penelitian lebih lanjut untuk mengetahui efek antikanker dari ekstrak etanol buah

mengkudu, termasuk efek antiangiogeniknya, yang sangat menarik dan penting

untuk dilakukan. Hal ini didukung oleh hasil-hasil penelitian sebelumnya yang

telah menyatakan bahwa kandungan-kandungan senyawa aktif buah mengkudu

memiliki efek antikanker.

Metode CAM merupakan salah satu media yang paling umum digunakan

untuk mempelajari respon angiogenesis. Ini karena CAM merupakan suatu

membran yang kaya akan pembuluh darah (Ribatti dkk., 1998), sehingga

pengamatan terhadap respon angiogenesis akan lebih mudah diamati. Keunggulan

metode CAM itu sendiri yaitu telur ayam berembrio mudah didapat, relatif murah

dan mudah dikerjakan dilaboratorium (Vu dkk., 1985 cit Kirchner dkk, 1996).


3

Selain itu di dalam telur berembrio memiliki lingkungan yang tertutup dan

terlindung oleh cangkang telur, sehingga aman, mudah dipegang dan dipelihara

selama inkubasi di laboratorium (Evans, 1991).

Menurut (Hirazumi, 1999) menyatakan bahwa buah mengkudu

mengandung substansi polysaccharide-rich yang mempunyai aktivitas anti tumor.

Berdasarkan hasil penelitiannya terbukti bahwa ekstrak etanol buah mengkudu

mampu mengatasi kanker dan infeksi. Pernyataan serupa dikemukakan oleh

(Wang, 2001), mengkudu mengandung senyawa yang mampu memperbaiki

kerusakan DNA. Pernyataan tersebut didukung oleh (Hiramatsu dkk., 1993)

bahwa mengkudu mengandung zat anti tumor yang dapat meningkatkan respon

sel-sel T dan makrofag.

Penelitian ini dilakukan dengan penentuan dosis dan pemberian ekstrak

etanol buah mengkudu (Morinda citrifolia. L). Menurut Thararat nualsnit et al.,

(2012), mengatakan bahwa ekstrak mengkudu mengandung sebuah antrakuinon

(damnachantal). Adanya kandungan antrakuinon pada ekstrak buah mengkudu

yang memiliki aktivitas dalam mengubah fungsi sel yang abnormal menjadi

normal dan juga berpotensi sebagai antikanker karena sifatnya sebagai

antiangiogenesis (menghambat pembentukan pembuluh darah baru pada sel

kanker). Penelitian buah mengkudu dengan menggunakan metode CAM belum

pernah dilakukan di Indonesia, terutama terkait dengan efek antiangiogenesis.

Oleh karena itu, penelitian untuk membuktikan efek antiangiogenesis ekstrak

etanol buah mengkudu yang diinduksi bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor)

perlu dilakukan.


4

1. Perumusan masalah

a. Apakah ekstrak etanol buah mengkudu memiliki aktivitas antiangiogenesis

pada CAM embrio ayam yang diinduksi bFGF ?

b. Adakah hubungan antara konsentrasi ekstrak etanol buah mengkudu dengan

aktivitas antiangiogenesis pada CAM embrio ayam yang diinduksi bFGF ?

2. Keaslian penelitian

Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang uji angiogenesis buah

mengkudu pernah dilakukan oleh Hornick, et al, 2003 melakukan penelitian

tentang Penghambatan inisiasi angiogenik dan gangguan pembuluh darah baru

dengan jus dari mengkudu. Perbedaan penelitian ini dengan penelitian

sebelumnya adalah buah mengkudu yang digunakan didapat dari Bangli, Bali,

yang kemudian diolah menjadi simplisia di Bantul, Yogyakarta. Model uji

antiangiogenesis yang digunakan adalah metode CAM dengan membran

chorioallantoic embrio ayam yang telah diinduksi bFGF. Perbedaan juga terletak

pada konsentrasi ekstrak buah mengkudu yang akan di gunakan. Sepengetahuan

penulis, penelitian uji antiangiogenesis buah mengkudu dengan metode CAM

menggunakan chorioallantoic membrane embrio ayam yang diinduksi bFGF

belum pernah dilakukan.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis

Dapat memperkaya ilmu pengetahuan mengenai adanya aktivitas

antiangiogenesis pada buah mengkudu.


5

b. Manfaat metodologi

Dapat memberikan pengetahuan mengenai tata cara pengujian aktivitas

anti-angiogenesis ekstrak etanolik buah mengkudu mengunakan metode

CAM pada embrio ayam yang diinduksi bFGF.

c. Manfaat praktis

Dapat memberikan informasi mengenai adanya aktivitas antiangiogenesis

pada buah mengkudu.

B. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum :

Untuk memberikan informasi kepada masyarakat tentang ekstrak buah

mengkudu sebagai obat antikanker.

2. Tujuan khusus :

Untuk mengetahui aktivitas antiangiogenesis dari ekstrak buah mengkudu dan

untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi ekstrak buah mengkudu

dengan aktivitas antiangiogenesis.


6

BAB II

PENELAHAAN PUSTAKA

A. Mengkudu

1. Sistematika tumbuhan

Berikut sistematika tumbuhan mengkudu :

Dunia : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Sub Divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledonae

Bangsa : Rubiales

Suku : Rubiaceae

Marga : Morinda

Jenis : Morinda citrifolia L. (Backer & Brink, 1965).

Gambar 1. Buah Mengkudu (Morinda citrifolia, L.) (Backer & Brink, 1965).


7

2. Nama daerah

Morinda citrifolia L. mempunyai nama daerah ; Pace (Jawa), Cangkudu

(Pasundan), Kodhuk (Madura), Bakudu (Sumatra), Wangkudu (Kalimantan),

Bakulu (Nusa Tenggara) (Suryowinoto, 1997).

3. Deskripsi

Mengkudu termasuk jenis tanaman pohon dan berbatang bengkok,

ketinggian dapat mencapai 3-8 m. Daun tunggal dengan ujung dan pangkal

kebanyakan runcing. Buahnya termasuk buah bongkol, benjol-benjol tidak teratur,

berdaging, jika masak daging buah berair. Buah masak berwarna kuning kotor

atau putih kekuning-kuningan dengan panjang 5-10 cm, lebar 3-6 cm

(Suryowinoto, 1997).

Tanaman mengkudu berbuah sepanjang tahun. Mudah tumbuh pada

berbagai tipe lahan, dengan daerah penyebaran dari dataran rendah hingga

ketinggian 1500 dpl. Ukuran dan bentuk buahnya bervariasi, pada umumnya

mengandung banyak biji, dalam satu buah terdapat ≥ 300 biji, namun ada juga tipe

buah mengkudu yang memiliki sedikit biji. Bijinya dibungkus oleh suatu lapisan

atau kantong biji, sehingga daya simpannya lama dan daya tumbuhnya tinggi.

Dengan demikian, perbanyakan mengkudu dengan biji sangat mudah dilakukan

(Djauhariya dkk., 2006).

4. Kandungan kimia dan manfaat

Buah mengkudu mengandung scopoletin, sebagai analgesik, antiradang,

antibakteri. Antrakuinon (damnachantal), sebagai antibakteri, antikanker,

imunostimulan. Alizarin, Acubin, L. Asperuloside, dan flavonoid sebagai


8

antibakteri. Vitamin C, sebagai antioksidan (Peter, 2005; Waha, 2000; Winarti,

2005).

Di dalam buah mengkudu terkandung zat-zat berkaitan dengan kesehatan

dan telah dibuktikan hanya terdapat di dalam mengkudu. Tanaman mengkudu

mengandung berbagai vitamin, mineral, enzim alkaloid, proxeronin yang dapat

dibentuk menjadi xeronin, ko-faktor dan sterol tumbuhan yang terbentuk secara

alamiah (Waha, 2001).

Mengkudu mengandung zat antikanker yang dinamakan damnacanthal

adalah sebuah antrakuinon (Hiramatsu et al., 1993). Zat tersebut paling efektif

untuk melawan sel-sel abnormal dibanding zat-zat antikanker yang terdapat dalam

tumbuhan lainnya. Senyawa scopoletin dalam buah mengkudu ditemukan pada

tahun 1993 oleh para peneliti di Universitas Hawaii (Waha, 2001). Selanjutnya,

ditemukan bahwa scopoletin dapat memperlebar saluran pembuluh darah yang

menyempit dan melancarkan peredaran darah. Selain itu, juga scopoletin juga

dapat membunuh beberapa tipe bakteri dan bersifat fungisida terhadap bakteri

Pythium sp dan bersifat anti peradangan dan alergi (Waha, 2001).

B. Ekstraksi

Ekstraksi adalah penyarian zat-zat berkhasiat atau zat-zat aktif dari bagian

tanaman obat, hewan dan beberapa jenis ikan termasuk biota laut. Zat-zat aktif

terdapat di dalam sel, namun sel tanaman dan hewan berbeda demikian pula

ketebalannya, sehingga diperlukan metode ekstraksi dengan pelarut tertentu dalam

mengekstraksinya. Tujuan ekstraksi bahan alam adalah untuk menarik komponen


9

kimia yang terdapat pada bahan alam. Ekstraksi ini didasarkan pada prinsip

perpindahan massa komponen zat ke dalam pelarut, yang menyebabkan

perpindahan mulai terjadi pada lapisan antar muka kemudian berdifusi masuk ke

dalam pelarut (Harborne, 1996). Menurut (Badan Pengawasan Obat dan Makanan

RI, 2010) ekstrak adalah sediaan kering, kental atau cair yang dibuat dengan

menyari simplisia, diluar cahaya matahari langsung. Ekstrak kering harus mudah

digerus menjadi serbuk. Cairan penyari yang dapat digunakan dalam pembuatan

ekstrak yaitu air, etanol, eter atau campuran etanol dan air.

Metode maserasi merupakan salah satu metode ekstraksi sederhana yang

dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari selama

beberapa hari pada temperatur kamar dan terlindung dari cahaya sambil diaduk

(Badan Pengawasan Obat dan Makanan RI, 2010). Dengan metode maserasi,

cairan penyarian masuk ke dalam sel melewati dinding sel sehingga isi sel akan

larut akibat perbedaan konsentrasi antara larutan dalam sel dan di luar sel. Larutan

dengan konsentrasi tinggi akan terdesak keluar dan diganti oleh cairan penyari

dengan konsentrasi rendah (proses difusi). Peristiwa tersebut akan terjadi secara

berulang-ulang hingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel

dan di dalam sel. Selanjutnya, endapan dipisahkan dan filtrat dipekatkan

(Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1986). Pada proses akhir

ekstraksi semua atau hampir pelarut diuapkan dan serbuk yang tersisa

diperlakukan sedemikian rupa hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan

(Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2005).


10

C. Kanker

1. Definisi kanker

Sel kanker merupakan the outlaw cell karena tumbuh secara tidak teratur,

melanggar kaidah normal, tidak peduli akan kontrol dalam perbanyakan, dan

menggunakan agendanya sendiri (Sofyan, 2000). Artinya sel tersebut mampu

memanipulasi lingkungan dan faktor-faktor yang dapat mendukung

pertumbuhannya. Sel kanker mampu berproliferasi secara cepat dan tidak

terkontrol pada satu sisi yang lain, ia juga mempunyai kemampuan untuk tidak

mengalami apoptosis (program bunuh diri sel). Sel kanker juga dapat mencegah

dirinya untuk tidak mengalami diferensiasi atau melakukan diferensiasi agar dapat

terus tumbuh. Sel kanker juga kehilangan inhibisi kontak dengan sel yang lain

atau dengan matriks ekstraseluler, sifat yang pada sel normal dapat mencegah

pertumbuhan tidak terkendali. Untuk memperbesar masa selnya, sel kanker dapat

membentuk pembuluh darah (angiogenesis) yang akan menyuplai oksigen, nutrisi

dan protein-protein yang berguna untuk pertumbuhannya. Adanya pembuluh

darah ini juga kemungkinan sel kanker untuk menginvasi jaringan lain dan

bermetastasis (King, 2000 ; Hanalan dan Weinberg, 2000; Mulyadi, 1996), dan

membentuk masa pada daerah baru di dalam tubuh (Sofyan, 2000).

Menurut WHO, kanker adalah istilah umum untuk satu kelompok besar

penyakit yang dapat mempengaruhi setiap bagian dari tubuh. Istilah lain yang

digunakan adalah tumor ganas dan neoplasma. Kanker juga dapat didefinisikan

sebagai pertumbuhan sel-sel baru secara abnormal yang tumbuh melampaui batas

normal, dan yang kemudian dapat menyerang bagian tubuh dan menyebar ke


11

organ lain. Proses ini disebut metastasis. Metastasis merupakan penyebab utama

kematian akibat kanker (WHO, 2009).

Terjadinya kanker disebabkan oleh sel abnormal jaringan tubuh yang

tumbuh dan berkembang dengan cepat dan tak terkendali. Sel abnormal akan

menyusup ke jaringan di sekitarnya (invasif) dan terus menyebar melalui jaringan

ikat dan darah serta menyerang organ-organ penting dan sel saraf tulang belakang.

Saat sel abnormal tersebut menumpuk, mendesak, serta merusak jaringan dan

organ yang ditempatinya barulah proses ini disebut tumor ganas atau kanker (

Zuhud, 2011).

2. Penyebab kanker

Secara pasti penyebab kanker yang menimbulkan pertumbuhan sel yang

terus menerus, menembus batas normal yang akhirnya dapat menginvasi jaringan

yang lain belum diketahui. Meski gelap, namun ada indikasi cukup kuat bahwa

ada tiga agen yang menyebabkan kanker, yaitu agen kimia, fisika dan biologik

(Sinardi & Yuswanto, 2000).

Kelainan kongenital akan menyebabkan tubuh kehilangan kemampuan

menetralisir karsinogen yang masuk tubuh, mereparasi kerusakan gen, menjaga

imunitas tubuh dan mematikan sel kanker yang baru tumbuh. Karsinogenesis

adalah bahan, zat atau organisme yang menyebabkan kanker. Karsinogen inilah

yang mempunyai peran terbesar sebagai penyebab kanker (Schneider, 1997).


12

3. Morfologi sel kanker

Sifat fisiologis sel kanker sendiri meliputi enam perubahan esensial berikut ini.

1) Kemampuan sel dalam mencukupi kebutuhan signal pertumbuhannya

sendiri

Sel memerlukan signal pertumbuhan mitogenik sebelum mereka berpindah

dari fase istirahat menuju fase aktif proliferatif. Ketergantungan pada signal

pertumbuhan ini tampak ketika sel normal mengalami propagasi dalam

kultur, di mana ploriferasi (memperbanyak diri) hanya terjadi ketika

ditambah dengan faktor mitogenik yang cukup dan terintegrasi di dalam

sel. Sebaliknya sel tumor akan melakukan regenerasi tergantung pada

signal pertumbuhannya sendiri (Hanahan & Weinberg, 2000).

2) Ketidakpekaan sel terhadap signal anti pertumbuhan

Signal anti pertumbuhan dapat menghentikan proliferasi (memperbanyak

diri) sel dengan dua mekanisme yaitu sel dipaksa keluar jalur aktif

proliferasi menuju fase istirahat atau sel akan diinduksi yang kemudian

akan melepaskan potensi proliferasi secara permanen menuju fase akhir

pembelahan (post mitotic). Sel kanker harus dapat menghindari signal anti

proliferatif ini, jika mereka ingin terus tumbuh (Hanahan & Weinberg,

2000).

3) Kemampuan sel untuk mencegah apoptosis

Apoptosis merupakan program kematian sel. Pada keadaan ini, membran

sel dirusak, sitoplasma dan skeleton inti pecah, sitosol terlepas, kromosom

mengalami degradasi, sehingga akhirnya sel tersebut dimakan sel tetangga


13

dan hilang. Sel kanker mempunyai kemampuan untuk mencegah apoptosis.

Resistensi terhadap apoptosis ini diperoleh sel kanker melalui beberapa

cara, yang paling umum adalah melalui sebuah mutasi yang melibatkan

tumor supresor p53. Dengan adanya p53 yang abnormal, maka akan

membiarkan sel yang mengandung DNA yang rusak untuk tetap bertahan

dan melakukan replikasi yang diteruskan dengan proliferasi. Kemampuan

sel dalam melakukan replikasi diperlukan untuk perkembangan sel kanker

menjadi sel malignan (Hanahan & Weinberg, 2000).

4) Kemampuan sel melakuan replikasi potensial secara terbatas

Pada jaringan dewasa yang normal, sel-sel tetap terpelihara dalam jumlah

tetap. Pada beberapa jaringan, misalnya tulang, keadaan ini diatur oleh

tingginya kecepatan pembelahan sel yang diimbangi dengan hilangnya sel

dengan kecepatan yang sama (Thurston & Lobo), 1988). Yang terjadi pada

sel kanker, tidaklah demikian, mereka terus tumbuh dan tidak mati. Hal ini

ditunjukkan dengan adanya potensial replikasi yang terbatas, yang

diperlukan oleh sel kanker selama masa perkembangannya sampai mejadi

tumor ganas (Hanahan & Weinberg, 2000).

5) Kemampuan sel dalam menopang angiogenesis

Oksigen dan nutrisi yang disuplai oleh pembuluh darah sangat penting

artinya bagi kelangsungan hidup sel. Tingginya ketergantungan sel

terhadap pembuluh darah kapiler untuk mensuplai kedua kebutuhan di atas,

menyebabkan sel-sel ini kemudian membentuk pembuluh darah baru. Hal

inilah yang dilakukan oleh sel kanker untuk memperbesar ukurannya, agar


14

mereka dapat melakukan ekspansi ke jaringan lain. Oleh karena itu, sel

kanker terus mengembangkan kemampuan angiogenesisnya (Hanahan &

Weinberg, 2000).

6) Kemampuan sel malakukan metastasis dan invasi

Dalam masa perkembangannya, cepat atau lambat sebagian besar jenis

kanker manusia, massa tumor primernya dapat melahirkan sel-sel sekunder.

Sel-sel sekunder tersebut dapat berpindah tempat ke jaringan lain,

menginvasi jaringan darah dan berhenti pada tempat-tempat tertentu,

kemudian sel akan tumbuh dan berkembang membentuk koloni baru

(Hanahan & Weinberg, 2000).

4. Proses terjadinya kanker

Kanker terjadi sebagai akibat dari perubahan sel sehingga sel terlepas dari

mekanisme pengaturan pertumbuhan normal. Perubahan sel ini dikenal dengan

istilah transformasi. Sebagai dasar transformasi adalah kelainan (mutasi) di dalam

gen dari kanker, sehingga kanker dikatakan sebagai suatu gangguan atau kelainan

genetik.

Tingkat perubahan sel pada pertumbuhan kanker adalah sebagai berikut :

Hiperplasi, yaitu perkembangan organ tubuh akibat pertumbuhan sel-sel

baru yang abnormal karena hilangnya kontrol pertumbuhan. Metaplasia, yaitu

perubahan epitel suatu jenis jaringan dewasa menjadi jaringan lain yang juga

dewasa. Displasi, yaitu perubahan sel dewasa ke arah kemunduran dalam hal

bentuk, besar orientasinya. Masih bersifat reversibel. Anaplasi, yaitu perubahan


15

serupa displasi yang menyimpang lebih jauh dari normal. Merupakan suatu ciri

tumor ganas yang bersifat irreversibel. Karsinoma insitu yaitu gambaran sel

menjadi sangat atipik namun belum terdapat pertumbuhan infiltratif. Invasi, yaitu

sel kanker telah menembus lapisan basal jaringan (Sinardi & Yuswanto, 2000).

D. Angiogenesis

Angiogenesis adalah proses pembentukan pembuluh darah baru. Proses ini

bermanfaat bagi keadaan fisiologi normal, seperti pada penyembuhan luka,

mentruasi, proses reproduksi, perkembangan embrio, sebaliknya, juga menjadi

faktor penting dalam pertumbuhan beberapa penyakit, termasuk kanker (Leahy,

2003; King, 2000; Folkman, 1996).

Angiogenesis adalah rate elimiting step pada sel kanker yang menentukan

terjadinya metastasis atau pertumbuhan menjadi ukuran yang lebih besar dari

1mm (King, 2000). Angiogenesis merupakan langkah yang krusial bagi tumor

untuk berubah dari ukuran yang kecil dan tidak berbahaya menjadi besar, bersifat

malignan, dan dapat menyebar ke organ yang lain (Folkman, 1996). Lebih dari

2500 Ilmuan melaporkan bahwa angiogenesis sangat berhubungan dengan

pertumbuhan dan perkembangan tumor (Brem, 1999).

Jika sel normal berubah menjadi sel kanker dan berfloriferasi dengan cepat,

maka akan membentuk akumulasi sel. Semakin banyak sel membelah, maka sel-

sel anakan tersebut akan semakin jauh dari kapiler. Sebelum menjadi

angiogenesis, terjadi keadaan stady state, di mana ada keseimbangan antara sel-sel

yang mati dan berfloriferasi. Matinya sel-sel dikarenakan kurang tersedianya


16

nutrisi, oksigen, dan protein-protein growth factor yang didifusikan dari kapiler.

Pada fase ini tumor disebut sebagai “tumor in situ” (Folkman, 1996).

Seperti diketahui, transfer oksigen dari pembuluh darah ke sel-sel, termasuk

sel tumor, dilakukan melalui mekanisme difusi. Proses dipengaruhi oleh jarak

antara pembuluh darah dengan sel tersebut. Ada nilai limit di mana difusi itu tidak

terjadi dan sel akhirnya mengalami hipoksia. Data dari angiogram menyatakan

pada percobaan menggunakan Dunning rat prostate carcinoma xenograft nilai

limit tersebut adalah 110 µm. Daerah yang mengalami hipoksia tersebut dapat

mengalami nekrosis ( Kerbel & Folkman 2002).

Angiogenesis diaktifkan oleh bermacam-macam pemicu fisiologi seperti

gangguan sistem homeostatis oksigen dan diregulasi oleh sistem hormonal, serta

dikontrol oleh keseimbangan antara faktor proangiogenik dan antiangiogenik

(Keshet dan Sasson, 1999). Aktivator angiogenesis dapat dikategorikan menjadi

tujuh, yaitu (1) faktor pertumbuhan, (2) protease, (3) trance elemen, (4) onkogen

(5) molekul sinyal transduksi (6) cytokine dan (7) inducer endogen (Brem, 1999).

Angiogenesis dapat terjadi pada ujung-ujung sel endotel diikuti oleh

pembentukan tunas-tunas kapiler baru yang saling beranastomose membentuk

putaran seperti jari-jari lingkaran. Pembentukan tunas pembuluh darah

berlangsung terus menerus mencapai sumber stimulus. Tunas pembuluh darah ini

terbentuk dari tunas mikrovaskuler, kebanyakan berasal dari venula dan kapiler

(Schor & Schor, 1983). Warren dkk. (1972) melaporkan bahwa tunas pembuluh

darah terutama berasal dari sel endotel kapiler, venula dan kadang-kadang dari

arteriola.


17

Pertumbuhan angiogenesis dapat terjadi melalui tiga fase, yaitu inisiasi

oleh faktor pertumbuhan tumor melalui rute parakrin, stimulasi proliferasi dan

invasi sel endotel, dan yang terakhir, yaitu maturasi dan diferensiasi sel endotel (

King, 2000). Fase-fase ini mencakup proses-proses seperti degradasi membran

basalis, invasi stroma, morphogenesis pembuluh kapiler, penggabungan pembuluh

darah kapiler menjadi pembuluh darah yang lebih besar, dan menambah pelindung

sel periendhotelial (Keshet & Sasson, 1999).

Degradasi membran basalis diawali dengan dilatasi dengan peningkatan

permeabilitas pembuluh darah. Sel endotel menjadi tegang, hubungan antar sel

hilang dan diikuti dengan hancurnya membran basalis. Selanjutnya sel endotel

bergerak menembus membran basalis dan mengadakan migrasi ke dalam stroma

jaringan perivaskuler menuju sumber stimulus angiogenik. Kembudian sel endotel

akan mengalami proliferasi atau mitosis. Proses diakhiri dengan maturasi tunas-

tunas kapiler yang diikuti dengan sintesis dinding pembuluh darah dan membrane

basalis yang baru serta diferensiasi arteriola dan venula. Ketika membran basalis

terbentuk, pembuluh darah menjadi struktur yang semipermiabel menyerupai

pembuluh darah dewasa. Sel fibroblas bermigrasi menuju pembuluh darah baru,

melingkar dan selanjutnya menjadi lapisan seluler dan adventisial (Schor & Schor,

1983).

E. b-FGF

1. b-FGF ( basic Fibroblast Growth Factor)

FGF merupakan keluarga dari sedikitnya tujuh buah protein yang

mempengaruhi pertumbuhan dan diferensiasi sel yang berasal dari masenkim serta


18

neuroektoderm. Reseptornya berupa protein transmembran dan membentuk suatu

subkelompok keluarga reseptor tirosin kinase (Murray & Keeley, 1993).

Basic fibroblast growth factor (bFGF) merupakan polipeptida yang

mengandung 50% asam amino, yang dapat menstimulasi pertumbuhan dan

diferensiasi pada beberapa tipe sel termasuk fibroblast, sel endotel dan sel syaraf

(King, 2000).

Basic fibroblast growth factor (bFGF) sedikit diproduksi pada sel normal

tapi pada sel kanker dan sel yang berada pada lingkungan yang kekurangan

oksigen (hypoksia), b-FGF diproduksi dalam jumlah yang besar (King, 2000).

Ekspresi yang berlebihan dari polipeptida b-FGF normal tidak dapat

menginduksi transformasi sel. Hanya jika b-FGF diubah strukturnya hingga

perubahan struktur ini mengijinkan produknya memasuki jalur sekresi normal,

maka b-FGF akan menjadi onkogen. Oleh karena itu, transformasi autocrine oleh

b-FGF mungkin berperan dalam perkembangan kanker pada manusia (King,

2000).

bFGF merupakan faktor angiogenik yang poten karena b-FGF dapat

menstimulasi ketiga fase yang dibutuhkan dalam proses angiogenesis yaitu

proliferasi, sekresi protease, dan kemotaksis sel endotel. Selain itu, b-FGF juga

mempunyai reseptor yang terdistribusi lebih luas dibandingkan reseptor Vascular

Endothelial Growth Factor (VEGF) (King, 2000).

bFGF yang diekspresikan pada CAM merupakan faktor penentu pada

proses vaskularisasi pada masa perkembangan. Pemberian sejumlah tertentu

bFGF pada cairan kario alantois akan memberikan hasil yang pararel dengan


19

pemeberian bFGF pada CAM. Hal ini menunjukkan bahwa bFGF memang

dikeluarkan oleh sel-sel tersebut dan diakumulasikan pada lingkungan

ekstraseluler. bFGF akan berinteraksi dengan sel endothelial melalui reseptor

FGF tirosin kinase (Ribatti dkk., 1995 & 1998). Pemberian bFGF adalah untuk

menginduksi terjadinya angiogenesis pada CAM dibuat seperti yang terjadi pada

jaringan yang terkena tumor.

Kemampuan bFGF menginduksi angiogenesis ini dapat melalui berbagai

jalur, salah satunya yaitu dengan menginduksi ekspresi mRNA COX-2. COX-2

adalah salah satu jenis enzim yang menpunyai pernan kunci pada konversi asam

arakhidonat menjadi prostaglandin (PG). prostaglandin yang berasal dari COX-2

mengupregulasi produksi faktor pertumbuhan termasuk VEGF dan bFGF melalui

mekanisme parakrin. VEGF adalah mitogen yang spesifik terhadap sel endothelial

yang menyebabkan perubahan bentuk, produksi protease dan migrasi sel.

Kesemua proses itu sangat diperlukan dalam pembentukan pembuluh darah baru.

Jadi mekanisme bFGF dalam menginduksi angiogenesis ini, yaitu dengan

meningkatkan produksi COX-2 yang ekspresinya akan menghasilkan

prostaglandin dalam jumlah besar yang selanjutnya akan mengupregulasi produksi

VEGF (Leahy, 2003).

Selain itu, produksi COX-2, bFGF juga dapat menginduksi angiogenesis

melalui mekanisme yang lain, yaitu dengan merangsang sekresi protease sel

endothelial (King, 2000). Sekresi protease menjadi penting karena angiogenesis

sangt membutuhkan proteolysis dari matriks eksraseluler selain proliferasi dan

migrasi sel endothelial (Stetler-Stevenson, 1999).


20

Protease yang dipengaruhi bFGF antara lain, yaitu plasmin yang dapat

menghasilkan degradasi komponen terbesar ECM. Plasmin merupakan hasil

aktivasi dari proenzim plasminogen. Aktivasi plasminogen ini diawali dari bFGF

mengupregulasi produksi urokinase plasminogen (uPA). Sekeresi uPA akan

mengikat reseptornya (uPAR) pada permukaan sel endothelial. uPAR berinteraksi

dengan non katalitik amino terminal (ATF) dari rantai tunggal pro uPA. Ikatan

zymogen secara proteolitik diaktifkan dalam bentuk rantai ganda. Hal ini akan

mempercepat aktivasi proenzim plasminogen menjadi plasmin (Ribatti dkk,

1999).

Degradasi Extracelluler–matrix (ECM) tergantung uPA/plasmin dengan

pergerakan yang konsekuen dari faktor angiogenesis yang disimpan, dipengaruhi

oleh bioavailibilitas bFGF di ECM. Sintesis bFGF baru disimpan di ECM dan

karena adanya ikatan dengan heparin sulfat maka pengeluaran bFGF dari ECM

terhindar dari inaktivasi dan sangat membantu dalam proses difusinya. uPA dapat

memfasilitasi angiogenesis dengan meningkatkan bioavailibilitas bFGF simpanan

ECM (Ribatti, 1999).

Mekanisme lain yang dapat menyebabkan terjadinya angiogenesis akibat

dari pemberian induktor bFGF yaitu dengan menginduksi integrin αvβ3 (King,

2000) dan dapat menyebabkan sel menginvasi sekitar ECM dan memasuki cell

cycle. Integrin αvβ3 dapat mengikat matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) (Eliceiri

dkk, 1999) dan mendegradasi komponen ECM yang merupakan barrier sel

endothelial sehingga terjadi migrasi sel (Stetler-Stevenson, 1999). Integrin αvβ3

juga berperan sebagai media pada proses adhesi sel di ECM. Adhesi sel ini akan


21

berperan penting dalam signaling intraseluler yang meregulasi pertahanan diri sel,

proliferasi dan migrasi (Eliceiri dkk, 1999).

F. Chorioallantoic Membrane (CAM)

Alantois merupakan salah satu membran (bungkus) ekstraembrionik.

Membran ini secara temporer membantu keperluan selama perkembangan

embrional dan mempunyai fungsi yang cukup penting, tetapi tidak bergabung

dalam tubuh hewan dewasa karena akan mati pada saat penetasan tiba. Alantois

terbentuk dari lapisan endoderma dan mesoderma splanchis ekstraembrional.

Dalam perkembangannya akan bergabung dalam karion membentuk membran

kario alantois (Patten, 1978 ; Storer dkk, 1979).

Chorioallantoic Membrane (CAM) dari embrio ayam adalah sebuah

membran tipis dengan jaringan yang kaya akan pembuluh darah, yang menyerupai

jaringan endometrium pada uterus (Ribatti dkk, 1998). Ketika CAM

tervaskularisasi dengan tinggi, CAM merupakan media yang cocok/baik untuk

propagasi virus dan mikroorganisme yang lain (Gojovic & Gruss, 1998).

CAM, muncul pada hari ke-4 atau ke-5 diikuti pertumbuhan pembuluh

darah yang meluas diatas permukaan kuning telur dan segera menutup seluruh

daerah tersebut (Knighton, 1977). Membran yang sangat kaya akan pembuluh

darah ini berhubungan dengan sirkulasi embrionik melalui arteri dan vena

alantois. Melalui sirkulasi ini berlangsung pertukaran oksigen dan karbondioksida

yang dibutuhkan oleh embrio. Selain berfungsi sebagai sistem sirkulasi, tempat

pernafasan dan bertanggung jawab terhadap perkembangan embrio, bagian ini


22

juga berfungsi sebagai tempat pembuangan dan pencernaan (Patten, 1978; Storer

dkk.,1979). Menurut Folkam (1971), membran kario alantois embrio ayam dapat

digunakan sebagai salah satu metode untuk mempelajari respon angiogenesis

terhadap implan jaringan tumor.

Pembuluh darah baru dalam embrio sendiri terbentuk melalui dua proses

berbeda, yaitu vaskulogenesis dan angiogenesis. Vaskulogenesis meliputi

diferensiasi (menjadi pembuluh darah) sel endotel dari precursor mesodermal,

yang hanya terjadi selama masa perkembangan embrionik, sedangkan

angiogenesis pembuluh darah baru dihasilkan dari prekursor mesodermal sebelum

embrio hidup. Pembuluh-pembuluh kapiler baru yang terbentuk melalui

angiogenesis kemudian akan bercabang atau membelah menjadi dua dari

pembuluh darah asalnya (Ferrara & Alitalo, 1999).

G. Landasan Teori

Kanker merupakan suatu pertumbuhan atau membengkaknya massa dari

sel yang abnormal yang bersifat ganas. Sel kanker untuk tumbuh dan berkembang

dengan cara mengambil nutrisi dan oksigen dari inang (host) yaitu dengan cara

membentuk pembuluh darah baru (angiogenesis) dari pembuluh darah baru yang

sudah ada. Menghambat proses angiogenesis dari sel kanker akan menyebabkan

sel kanker mengalami penghambatan pertumbuhan, kelaparan dan pada akhirnya

akan mati. Terapi kanker yang selama ini digunakan adalah agen kemoterapi yang

bersifat sitotoksik, terapi ini dianggap kurang spesifik karena selain merusak sel


23

kanker juga dapat mempengaruhi sel normal yang lain (Hanahan & Weinberg,

2000).

Antiangiogenesis adalah suatu proses penghentian pembentukan pembuluh

darah baru. Pada jaringan normal, pembuluh darah baru terbentuk selama

pertumbuhan dan perbaikan jaringan, misalnya ketika proses penyembuhan luka,

dan selama perkembangan janin di masa kehamilan. Pembuluh darah membawa

oksigen dan nutrisi ke jaringan yang diperlukan untuk pertumbuhan dan bertahan

hidup. Demikian juga pada kanker. Melalui proses yang kompleks, sel-sel endotel

(membentuk pembuluh darah) bisa membelah diri dan tumbuh membentuk

pembuluh darah baru. Proses ini disebut angiogenesis dan terjadi pada jaringan

sehat maupun pada jaringan kanker (Ribatti et al., 2002).

Buah mengkudu yang sudah banyak dikenal sejak dulu hingga saat ini

mengandung zat antikanker. Berdasarkan hasil penelitian, disebutkan bahwa

Morinda citrifolia mengandung komponen bioaktif seperti flavonoid, triterpen,

triterpenoid, atrakuinon, dan saponin dalam jumlah yang signifikan. Senyawa

flavonoid yang terkandung dalam mengkudu bermanfaat sebagai antioksidan yang

terbukti memiliki aktivitas sebagai hepatoprotektif pada uji in vivo. Selain itu,

flavonoid yang terkandung dalam tanaman ini juga terbukti mampu mencegah

terjadinya kanker.

Menurut (Hirazumi, 1999) menyatakan bahwa buah mengkudu

mengandung substansi polysaccharide-rich yang mempunyai aktivitas anti tumor.

Berdasarkan hasil penelitiannya terbukti bahwa ekstrak etanol buah mengkudu

mampu mengatasi kanker dan infeksi. Pada penelitian (Hornick dkk, 2003)


24

tentang penghambatan inisiasi angiogenik dan gangguan pembuluh darah baru

dengan jus dari mengkudu yang terbukti bahwa jus mengkudu memiliki aktivitas

antiangiogenesis. Pada penelitian ini dilakukan untuk membuktikan aktivitas

antiangiogenesis dari ekstrak buah mengkudu dan untuk mengetahui hubungan

antara konsentrasi ekstrak buah mengkudu dengan aktivitas antiangiogenesis.

H. Hipotesis

1. Ekstrak etanol buah mengkudu memiliki aktivitas antiangiogenesis pada CAM)

embrio ayam yang diinduksi bFGF.

2. Terdapat hubungan antara konsentrasi ekstrak etanol buah mengkudu dengan

aktivitas antiangiogenesis pada CAM embrio ayam yang diinduksi bFGF.


25

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni. Jenis

penelitian yang dilakukan termasuk jenis penelitian eksperimental murni yaitu

dengan melakukan percobaan pada kelompok perlakuan dan dibandingkan dengan

kelompok kontrol. Rancangan penelitian ini menggunakan rancangan lengkap

pola searah. Penelitian ini dilakukan secara lengkap, yaitu terdapat kontrol negatif,

kontrol positif dan kelompok perlakuan. Pola searah, yaitu dengan memberikan

perlakuan yang sama dengan kelompok perlakuan. Penelitian ini dilakukan di

Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Laboratorium Steril Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran

Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel utama

a. Variabel bebas berupa konsentrasi ekstrak buah mengkudu .

b. Variabel tergantung berupa banyaknya pembuluh darah baru.

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu

pemanenan, umur buah yang dipanen, cara panen, cara pengeringan dan

pembuatan simplisia, dan jumlah (gram) buah segar yang digunakan.


26

b. Variabel pengacau tak terkendali berupa cuaca dan musim, kelembaban

ruangan.

3. Definisi operasional

a. Ekstrak etanol buah mengkudu adalah ekstrak kental yang diperoleh dengan

mengekstraksi serbuk kering buah mengkudu seberat 100 g yang kemudian

dilarutkan dengan etanol 70% secara maserasi (perendaman) selama ± 24

jam, hasil maserasi kemudian disaring menggunakan corong Buchner, yang

dilapisi kertas saring, sehingga diperoleh filtrat. Lalu hasil penyaringan

(filtrat) diuapkan pelarutnya dengan Rotary Evaporator hingga diperoleh

ekstrak kental etanol buah mengkudu.

b. Konsentrasi ekstrak etanol buah mengkudu adalah sejumlah (µg/ml) ekstrak

etanol buah mengkudu untuk masing-masing perlakuan. Ekstrak etanol buah

mengkudu dibuat dengan mengekstraksi sejumlah (gram) buah mengkudu

dalam pelarut polar (etanol).

c. Penurunan jumlah pembuluh darah baru adalah kemampuan ekstrak etanol

buah mengkudu pada konsentrasi tertentu untuk menurunkan jumlah

pembuluh darah baru pada Chorioallantoic membrane terinduksi bFGF

d. Pembuluh darah baru adalah serabut-serabut pembuluh darah yang keluar

dari pembuluh darah utama.

C. Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan antara lain : ekstrak buah mengkudu, Chorio

Allantoic Membrane (CAM) yang berasal dari telur ayam Standard Patogen Free


27

(SPF) dalam kondisi terinkubasi, larutan bFGF, PBS, kertas payung, paper disc,

aqua steril, etanol 96%, etanol 70% teknis, kertas Whatman filter, DMSO 0,2 %

(Dimethyl sulfoxide), aquabidest steril, iodium, paper disc berisi ampisilin.

D. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain : oven (merk

memmert), ayakan, bejana maserasi, shaker (merk innova 2100), chamber, labu

alas bulat, Laminar Air Flow (LAF) (Local), autoklaf (merk KR 40D), incubator

(jishampai), lampu, mini drill, gunting, kamera, teropong telur, gunting bengkok,

penyedot udara, scalpel, kaca pembesar, gunting bedah dan alat – alat gelas

(pyrex), rotary evaporator (merk buchi).

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Untuk memastikan bahan yang digunakan benar-benar ekstrak buah

mengkudu, maka sebelumnya dilakukan determinasi terlebih dahulu. Determinasi

dilakukan di Laboratorium Sistematika Tumbuhan, Fakultas Biologi Universitas

Gadjah Mada Yogyakarta berdasarkan “Flora of Java”.

2. Preparasi ekstrak etanol buah mengkudu

Buah mengkudu pascapanen, berwarna putih kekuningan merata, dan

daging buah masih keras dicuci bersih. Buah ditiriskan dan dipotong-potong tipis.

Buah mengkudu dibersihkan di bawah air mengalir untuk menghilangkan kotoran

yang menempel pada buah tersebut. Setelah itu dikeringkan dengan cara dijemur


28

di bawah sinar matahari dengan ditutup kain hitam. Simplisia yang kering

kemudian di serbuk menggunakan blender, dan kemudian di ayak dengan ayakan.

Simplisa serbuk ditimbang sebanyak 100 gram dan dituang kedalam bejana

maserasi. Kemudian ditambah etanol 70% sampai terendam sempurna dan

dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama ± 24 jam.

Kemudian disaring dengan kertas Whatman filter dengan corong Buchner. Lalu

hasil penyaringan (filtrat) diuapkan pelarutnya dengan Rotary Evaporator hingga

diperoleh ekstrak kental etanol buah mengkudu.

3. Sterilisasi alat

Alat-alat yang digunakan untuk uji antiangiogenesis dicuci bersih dan

dikeringkan kemudian dibungkus dengan kertas payung dan disterilkan dengan

pemanasan basah dalam autoklaf, suhu 121oC selama 15-30 menit.

4. Pembuatan larutan uji dan larutan basic Fibroblast Growth Factor

(bFGF)

a. Preparasi bFGF sebagai induktor angiogenesis. bFGF yang digunakan

sebanyak 25 ng/µl yang kemudian diencerkan dengan PBS (PH 7,4) menjadi

1 ng/µl. Dosis tiap telur 10 ng/µl. Preparasi bFGF ini dilakukan secara

aseptis di dalam Laminar Air Flow (LAF).

b. Preparasi sediaan larutan uji. Ekstrak etanol buah mengkudu dilarutkan

dengan DMSO 0,2 % secukupnya dan aquabidest steril untuk kemudian

dibuat seri konsentrasi 100 µg/ml, 150 µg/ml dan 225 µg/ml. Preparasi

dilakukan secara aseptis dalam Laminar Air Flow (Rachael dkk, 2003).


29

5. Uji angiogenesis

Satu atau beberapa hari sebelum diberi perlakuan telur diinkubasi dalam

inkubator laboratorium pada suhu 37oC agar dapat menyesuaikan diri dengan

lingkungan barunya. Telur ayam usia 8-9 hari diberikan perlakuan. Tahap awal

perlakuan, yaitu dengan membersihkan telur dari kotoran yang menempel di

cangkang telur menggunakan alkohol 70%. Telur diberi tanda pada kerabang telur

yang meliputi batas ruang udara, lokasi embrio dan daerah yang akan dibuat

segiempat (jendela) berukuran 1x1 cm di atas embrio menggunakan pensil. Lokasi

embrio diketahui melalui candling menggunakan cahaya lampu pada telur.

Kerabang telur pada bagian kutub yang mengandung ruang udara dan kerabang di

atas embrio dibersihkan dengan larutan yodium. Selanjutnya pada ruang udara

tersebut dibuat lubang kecil dan pada daerah yang dibuat segiempat (jendela)

dibuat luka dengan menggunakan mini drill dan scalpel.

Udara dari ruang udara disedot dengan karet penghisap sampai berpindah

dari kutub kerabang bagian atas telur. Perlakuan ini dilakukan dengan posisi telur

horizontal, di ruang gelap, dan melalui candling, sehingga ruang udara buatan

yang terbentuk di atas embrio dapat terlihat.

Kerabang telur di atas embrio dipotong dengan mini drill untuk membuat

lubang segiempat dengan luas 1x1 cm. Melalui lubang ini bFGF dan ekstrak uji

diimplantasi ke dalam paper disc. Subyek uji berupa telur dibagi secara acak

dalam enam kelompok (masing-masing perlakuan terdiri dari lima telur), sebagai

berikut :


30

a. Kelompok I adalah telur dengan implantasi paper disc.

b. Kelompok II adalah implantasi paper disc + pelarut (DMSO – aquabidest

steril).

c. Kelompok III kelompok kontrol bFGF + pelarut adalah kelompok telur

dengan implantasi paper disc termuati bFGF 10 ng + pelarut (DMSO –

aquabidest steril) sebanyak 10µl.

d. Kelompok IV, V dan VI merupakan telur yang digunakan untuk melihat efek

penghambatan ekstrak etanol buah mengkudu dengan tiga variasi kadar.

Setelah diberi perlakuan implantasi paper disc sesuai kelompok perlakuan,

lubang kecil pada daerah kutub dan lubang segiempat ditutup dengan paraffin

yang dicairkan. Kemudian telur diinkubasi pada suhu 37oC dengan kelembaban

relatif 60% selama tiga hari atau 72 jam dengan inkubator, kemudian telur

dimasukkan ke dalam kulkas selama 24 jam. Telur dibuka (umur 13 hari) dengan

cara menggunting cangkang telur menjadi dua bagian dimulai dari cangkang yang

dekat dengan rongga udara menggunakan gunting bedah secara hati-hati agar

tidak merusak membran korio alantois telur. Setelah itu, membran korio alantois

dibersihkan secara hati-hati dengan aquabidest steril. Membran korio alantois

yang melekat pada bagian cangkang yang terdapat paper disc diamati secara

makroskopik. Pengamatan makroskopis dilakukan secara langsung dan tidak

langsung. Pengamatan makroskopik secara langsung dilakukan dengan bantuan

kaca pembesar dan dikuantifikasi dengan menghitung jumlah pembuluh darah

baru yang terbentuk pada paper disc dan di sekitar paper disc dan secara tidak

langsung dengan foto kamera hasil CAM. Pembuluh darah baru yang dihitung,


31

yaitu pembuluh darah yang tipis pada paper disc dan di sekitar paper disc (Paten,

1978 ; Storer dkk, 1879).

F. Analisis data

Data berupa persentase terbentuknya pembuluh darah baru (angiogenesis)

pada CAM dengan ekstrak etanol buah mengkudu. Selanjutnya dihitung sebagai

persentase pertumbuhan relatif terhadap kelompok III (kontrol bFGF + pelarut)

dengan menggunakan rumus :

% persentase pertumbuhan pembuluh darah = x 100%

Keterangan :

a = jumlah pembuluh darah baru rata-rata konsentrasi ekstrak etanol buah

mengkudu

b = jumlah pembuluh darah baru rata-rata kontrol bFGF

Untuk % penghambatnya :

% penghambatan = 100% - persentase pertumbuhan relatif terhadap

kontrol

Data penelitian uji antiangiogenesis berupa banyaknya pembuluh darah

baru pada dan sekitar paper disc yang dianalisis menggunakan analisis satu arah

Anova yang kemudian dilanjutkan dengan uji Tukey untuk melihat adanya

perbedaan yang bermakna antar kelompok perlakuan.


32

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas anti angiogenesis dari

ekstrak buah mengkudu dan untuk mengetahui kekerabatan antara konsentrasi

ekstrak buah mengkudu dengan aktivitas antiangiogenesis. Tujuan tersebut dapat

tercapai dengan serangkaian pengujian.

A. Hasil Determinasi dan Ekstraksi Buah Mengkudu

Determinasi bahan dilakukan agar bahan tanaman percobaan benar-benar

buah mengkudu. Determinasi dilakukan di Laboratorium Sistematika Tumbuhan,

Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta, berdasarkan buku “Flora

of Java”. Hasil determinasi terbukti bahwa buah yang digunakan dalam penelitian

adalah jenis Morinda citrifolia. L. Hasil determinasi ditampilkan pada Lampiran

14.

Pembuatan ekstrak etanol buah mengkudu menggunakan metode

penyarian yaitu maserasi. Pemilihan metode maserasi karena metode ini efektif

untuk menyari senyawa-senyawa yang tidak tahan pemanasan atau senyawa yang

mudah menguap. Prinsip pelarutan senyawa aktif dengan metode maserasi adalah

dinding sel ditembus cairan penyari sehingga cairan penyari masuk ke rongga sel.

Senyawa aktif yang dimaksud pada penelitian ini adalah senyawa yang memiliki

efek farmakologi. Dengan metode maserasi, cairan penyarian masuk ke dalam sel

melewati dinding sel sehingga isi sel akan larut akibat perbedaan konsentrasi


33

antara larutan dalam sel dan di luar sel. Larutan dengan konsentrasi tinggi akan

terdesak keluar dan diganti oleh cairan penyari dengan konsentrasi rendah (proses

difusi). Peristiwa tersebut akan terjadi secara berulang-ulang hingga terjadi

keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Selanjutnya

endapan dipisahkan dan filtrat dipekatkan.

Saat melakukan maserasi juga dilakukan pengadukan. Pengadukan

dilakukan agar konsentrasi larutan di luar butir serbuk simplisia rata dan tidak

terjadi kejenuhan, sehingga proses osmosis dan difusi akan terus berjalan. Pelarut

yang digunakan adalah etanol 70 % yang diharapkan dapat menyari kandungan

senyawa aktif pada buah mengkudu. Ekstrak kental yang diperoleh berwarna

coklat. Dari serbuk simplisia diperoleh ekstrak kental 15,68 gram, sehingga

rendemen ekstrak dihasilkan sebesar 15,68 %.

B. Aktivitas basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) dalam menginduksi

angiogenesis

Pada penelitian ini untuk mengetahui aktivitas bFGF dalam menginduksi

angiogenesis digunakan metode CAM. Metode CAM sudah digunakan untuk

jangka waktu yang lama pada pendekatan bermacam-macam transplantasi (Ribatti

dkk., 1998). Beberapa kelebihan yang dimiliki oleh CAM diantaranya yaitu telur

ayam berembrio mudah didapatkan, relatif murah dan mudah dikerjakan di

laboratorium (Vu dkk., 1985 cit Kirchner dkk, 1996). Selain itu, di dalam telur

berembrio tercipta lingkungan yang tertutup dan terlindung oleh cangkang telur,

sehingga aman, mudah dipegang dan dipelihara selama inkubasi di laboratorium.


34

Lingkungan tertutup tersebut relatif konstan karena keberadaan cairan ekstra

embrionik dan beberapa membran pembungkus dalam telur ayam berembrio

(Evans, 1991).

CAM embrio ayam sendiri merupakan salah satu media yang paling umum

digunakan untuk mempelajari respon angiogenesis. Ini karena CAM merupakan

suatu membran yang kaya akan pembuluh darah (Ribatti dkk., 1998), sehingga

pengamatan terhadap respon angiogenesis akan lebih mudah diamati. Telur ayam

berembrio yang dipergunakan untuk uji respon angiogenesis dapat dilakukan

setelah terbentuknya CAM pada hari ke-4 (Patten, 1978) dan implantasi ke dalam

CAM dapat dilakukan pada telur berembrio umur 5-16 hari (Knighton dkk., 1977).

Berdasarkan hasil uji pendahuluan, implantasi ke dalam CAM dilakukan

telur berumur 8 atau 9 hari, karena pada umur tersebut letak rongga udara lebih

mudah diamati dengan pembuluh darahnya pun sudah lebih banyak dan lebih

jelas. Selain itu menurut penelitian Ariyanti (1999), pembuluh darah CAM yang

mulai tumbuh pada telur umur 4 hari lebih sensitif terhadap kerusakan pembuluh

darah akibat trauma dari luar, seperti goncangan.

Penelitian ini menggunakan rancangan acak pola searah, setiap telur uji

mendapatkan peluang yang sama untuk dimasukkan dalam kelompok tertentu dan

hanya mendapatkan satu kali perlakuan. Penelitian ini menggunakan 30 butir telur

untuk kelompok kontrol. Untuk kelompok I (paper disc), kelompok II (DMSO –

aquabidest steril) dan kelompok III (bFGF + pelarut). Masing-masing kelompok

mendapatkan 10 telur.


35

Analisis hasil yang dilakukan meliputi pengamatan secara makroskopik.

Pengamatan makroskopik dilakukan secara kualitatif dengan membandingkan

pertumbuhan pembuluh darah baru pada kelompok uji penghambatan

angiogenesis dengan kelompok III (bFGF + pelarut). Pengamatan secara kualitatif

dikuantifikasi dengan menghitung jumlah pembuluh darah baru pada (bFGF dan

ekstrak buah mengkudu). Pembuluh darah baru adalah pembuluh darah rambut

yang keluar dari pembuluh darah utama. Kemampuan ekstrak buah mengkudu

sebagai antiangiogenik dilihat dari persentase penghambatan angiogenesis pada

CAM embrio ayam.

Parameter terjadinya angiogenesis baru pada CAM dilihat dari

bertambahnya jumlah pembuluh darah baru pada kelompok yang diberi bFGF

dibandingkan dengan kelompok tanpa diberi bFGF. Hal ini dapat dilihat dari hasil

penelitian, di mana pengamatan makroskopik pada CAM untuk kelompok I (paper

disc) dan kelompok III (bFGF + pelarut) menunjukan adanya perbedaan

pertumbuhan pembuluh darah baru di CAM, dan berdasarkan hasil uji tukey

menunjukkan hubungan berbeda bermakna (P < 0,05) (Tabel I dan Tabel IV). Hal

ini berarti bFGF meningkatkan pembuluh darah baru pada CAM. Parameter untuk

mengetahui apakah pelarut ekstrak (DMSO 0,2 %) mempengaruhi hasil uji

antiangiogenesis dengan meningkatkan aktivitas antiangiogenesis dengan cara

membandingkan hasil uji antara kontrol pelarut dengan kontrol paper disc.

Berdasarkan hasil uji menunjukan jumlah pembuluh darah baru antara kontrol

paper disc dengan kontrol pelarut hampir sama dan berdasarkan hasil uji tukey

menunjukkan berbeda tidak bermakna (P > 0,05) (Tabel I dan Tabel IV). Hal ini


36

berarti bahwa DMSO 0,2 % tidak memiliki aktivitas antiangiogenesis sehingga

tidak mempengaruhi hasil uji.

Pembuluh darah baru yang terbentuk pada CAM akibat induksi oleh bFGF

diamati pada hari ketiga setelah pemberian bFGF. Setelah telur dibuka, kemudian

dilakukan pengamatan makroskopik. Hasil pengamatan makroskopik pada kontrol

bFGF + pelarut menunjukan adanya pertumbuhan pembuluh darah baru yang

banyak di sekitar paper disc, yang mengarah secara radial menuju paper disc.

Pertumbuhan pembuluh darah baru pada kelompok III (kontrol bFGF + pelarut)

lebih banyak dibandingkan dengan kelompok I (paper disc) dan kelompok II

(kontrol pelarut). Pengamatan makroskopik dan jumlah pembuluh darah baru

yang terbentuk pada kelompok kontrol ditampilkan pada Lampiran 5 dan Tabel I.

Tabel I. Jumlah pembuluh darah baru kelompok kontrol paper disc, kontrol

pelarut, kontrol bFGF + pelarut dan kelompok perlakuan

Kelompok kontrol N Jumlah pembuluh darah baru X ± SD

Kontrol paper disc 3 14,33 ± 1,15

Kontrol pelarut 3 13 ± 2

Kontrol bFGF + pelarut 3 23,33 ± 0,58

Konsentrasi 100 µg/ml 3 20,33 ± 1,52



Keterangan :

n = jumlah pengamatan

C. Uji daya hambat ekstrak etanol buah Morinda citrifolia L. terhadap

angiogenesis pada CAM terinduksi bFGF

Respon penghambatan ekstrak etanol buah Morinda citrifolia L. terhadap

angiogenesis dapat diamati pada kelompok telur kelompok IV, V dan VI dengan


37

konsentrasi 100, 150 dan 225 µg/ml. Pemberian larutan dengan konsentrasi

tersebut berdasarkan pada penelitian penelitian sebelumnya yang menyatakan

bahwa ekstrak buah mengkudu memiliki Inhibitory Concentration = IC50

terhadap COX-2 sebesar 150 µg/ml (Rachel dkk, 2003).

Untuk pengamatan makroskopik CAM pada kelompok perlakuan ekstrak

etanol buah mengkudu menunjukan penurunan jumlah pertumbuhan pembuluh

darah baru dibandingkan dengan kelompok III (kontrol bFGF - DMSO -

aquabidest steril). Urutan jumlah pertumbuhan pembuluh darah dari terbanyak

yaitu kelompok perlakuan ekstrak etanol buah mengkudu dengan konsentrasi 100,

150 dan 225 µg/ml. Hal ini menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi

ekstrak etanol buah mengkudu yang digunakan semakin sedikit jumlah

pertumbuhan pembuluh darah baru. Hal ini dapat dilihat pada Lampiran 5 dan

Tabel I.

Persentase pembuluh darah baru masing-masing kelompok perlakuan

ekstrak etanol buah mengkudu dibandingkan dengan persentase pembuluh darah

baru kelompok kontrol III (bFGF – DMSO – Aquabidest Steril) untuk

menghitung respon angiogenesis dan persentase penghambatan angiogenesisnya.

Hasil perhitungan menunjukan bahwa pada konsentrasi terkecil yaitu 100 µg/ml,

diperoleh persentase penghambatan terkecil yaitu sebesar 12,86 %. Konsentrasi

150 µg/ml persentase penghambatannya sebesar 37,17%. Sedangkan persentase

penghambatan konsentrasi terbesar ada pada konsentrasi 225 µg/ml dengan angka

penghambatan 50,03 %. Hal ini menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi


38

ekstrak buah mengkudu yang digunakan, maka persentase penghambatannya akan

semakin besar.

Tabel II. Persentase penghambatan angiogenesis dengan varian konsentrasi

ekstrak etanol buah mengkudu (Morinda citrifolia. L ) Kelompok perlakuan n Persentase penghambatan angiogenesis (%)

Konsentrasi 100 µg/ml 3 12,86



Gambar 2. Persentase penghambatan angiogenesis

Dengan adanya kenaikan kadar ekstrak maka pembuluh darah pada CAM

semakin berkurang, baik dalam paper disc maupun di daerah sekitar paper disc.

Data yang diperoleh kemudian diuji statistik dengan menggunakan analisis satu

arah Anova yang kemudian dilanjutkan dengan uji Tukey untuk melihat adanya

perbedaan bermakna antar kelompok perlakuan. Terlebih dahulu dilakukan uji

normalitas dengan (P > 0,05) dan taraf kepercayaan 95%. Dari uji normalitas yang

dilakukan, maka diperoleh data sebagai berikut : kelompok I (paper disc) 0,766,

kelompok II (kontrol pelarut) 1,000, kelompok III (kontrol bFGF + pelarut) 0,766


39

dan untuk ekstrak etanol buah mengkudu 100; 150; dan 225 µg/ml berturut-turut

adalah 0,991; 0,991 dan 0,766, bahwa data yang diperoleh terdistribusi normal (P

> 0,05). Hasil uji statistik normalitas dapat dilihat pada Lampiran 6.

Kemudian dilanjutkan dengan uji homogenitas di mana data dikatakan

homogen apabila (P > 0,05). Hasil yang didapat dari uji homogenitas

menunjukkan bahwa data mempunyai varian yang homogen dengan hasil 0,179,

sehingga analisis statistik dapat dilanjutkan dengan uji Tukey. Dari hasil uji Tukey

diperoleh data sebagai berikut : Terdapat perbedaan yang bermakna (P < 0,05)

antara kelompok kontrol bFGF + pelarut dengan kelompok perlakuan ekstrak

etanol buah mengkudu pada konsentrasi 2 dan konsentrasi 3, namun antara

kontrol bFGF + pelarut dengan konsentrasi 1 menunjukan berbeda tidak bermakna

(P > 0,05). Hal ini berarti bahwa ekstrak etanol buah mengkudu memiliki aktivitas

antiangiogenesis pada konsentrasi 2 dan konsentrasi 3.

Hasil uji tukey antara konsentrasi 2 dan konsentrasi 3 menunjukan berbeda

tidak bermakna (P > 0,05), hal ini menunjukan bahwa tidak ada peningkatan

aktivitas antiangiogenesis antara konsentrasi 2 dengan konsentrasi 3 yang

signifikan. Berdasarkan hal tersebut menunjukan, bahwa peningkatan konsentrasi

ekstrak etanol buah mengkudu tidak meningkatkan aktivitas antiangiogenesisnya.

Hasil uji statistik Tukey dapat dilihat pada Lampiran 12 dan Tabel III.


40

Tabel III. Matriks signifikasi % penghambatan angiogenesis (P < 0,05)

Kelompok Kontrol bFGF

+ pelarut

Konsentrasi

100 µg/ml

Konsentrasi

150 µg/ml

Konsentrasi

225 µg/ml

Kontrol bFGF

+ pelarut

- 0,356 0,001* 0,000*

Konsentrasi

100 µg/ml

0,356 - 0,019* 0,001*

Konsentrasi

150 µg/ml

0,001* 0,019* - 0,356

Konsentrasi

225µg/ml

0,000* 0,001* 0,356 -

Tanda * : menunjukan berbeda bermakna pada level 0,05

0

5

10

15

20

25

Mea

n j

umla

h pe

mbu

luh

dara

h

Gambar 3. Diagram batang rata-rata perbandingan jumlah pembuluh darah

antarkelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol Morinda citrifolia L.

Secara umum inhibitor angiogenesis adalah obat yang mampu

menghambat pertumbuhan pembuluh darah baru (angiogenesis). Penghambatan

pembuluh darah baru tersebut diharapkan dapat menghentikan suplai oksigen dan


41

nutrien ke sel tumor (MacDonald, 2003). Kemungkinan titik tangkap

antiangiogenesis dari senyawa yang terkandung dalam ekstrak etanol buah

mengkudu adalah sebagai berikut.

1. Menghambat secara langsung sel endothelial

Sel endothelial adalah sel yang membentuk dinding pembuluh darah, yang

merupakan sumber pembuluh darah baru (MacDonald, 2003). Untuk mendukung

pertumbuhan sel kanker memerlukan angiogenesis, dimana proses angiogenesis

itu tergantung pada sel endothelial.

Senyawa polifenol dalam anggur yaitu resveratrol diketahui mampu

menghambat pertumbuhan kapiler sel endothelial dan senyawa polifenol yang

terkandung dalam daun tanaman cangkring Erythrina fusca Lour, juga mampu

menghambat pertumbuhan kapiler sel endothelial, sehingga kemungkinan

kandungan polifenol (flavonoid) dan antrakuinon (damnachantal) dalam ekstrak

etanol buah mengkudu (Morinda citrifolia L.) memiliki aktivitas yang sama

dalam proses penghambatan pertumbuhan kapiler sel endothelial, di mana

senyawa tersebut mampu menghambat fosforilasi dari mitogen active protein

kinase (MAP kinase) terinduksi bFGF. MAP kinase merupakan komponen yang

penting dalam jalur signal proliferasi sel endotel untuk pembentukan pembuluh

darah baru.

2. Menghambat faktor pertumbuhan

Pada jaringan kanker, sel tumor memproduksi faktor pertumbuhan sendiri

seperti VEGF, FGF, dan EGF. Faktor pertumbuhan tersebut mempunyai


42

kemampuan menginduksi pembuluh darah yang ada di sekeliling sel tumor

tersebut (MacDonald, 2003).

Pada penelitian ini faktor pertumbuhan berupa bFGF diinduksi dari luar

CAM. Fibroblast Growth Factor (FGF) dikenal sebagai stimulator yang poten

untuk proliferasi dan angiogenesis pembuluh darah sel endothelial. Proses signal

transduksi dimulai dengan adanya rangsangan dari luar yang berupa faktor

pertumbuhan, dalam hal ini berupa bFGF. Basic Fibroblast Growth Factor

(bFGF) selanjutnya akan berinteraksi dengan sel endothelial melalui reseptor FGF

tirosin kinase dan heparin sulfat proteoglikan (HAPGs) yang ada dipermukaan

matriks ekstraseluler. Reseptor akan menyampaikan signal ke protein di

sitoplasma (Ribatti dkk, 1999; Weinberg, 1996).

Menurut Tosetti dkk. (2002) flavonoid mampu mengurangi angiogenesis

melalui mekanisme penghambatan reseptor tirosin kinase. Senyawa flavonoid

yang kemungkinan terkandung dalam ekstrak etanol buah mengkudu

kemungkinan mampu menghambat bFGF, sehingga stimulasi bFGF tidak sampai

ke reseptor di permukaan sel. Akibatnya bFGF tidak dapat ditangkap oleh reseptor

sehingga terjadi ikatan antara bFGF dengan reseptor dan aktivitas proliferasi pun

tidak terjadi, sedangkan menurut Thararat nualsnit et al., (2012) (dalam jurnal

Aruma, et al., 2013), mengatakan bahwa ekstrak mengkudu mengandung sebuah

antrakuinon (damnachantal). Adanya kandungan antrakuinon pada ekstrak buah

mengkudu yang memiliki aktivitas dalam mengubah fungsi sel yang abnormal

menjadi normal dan juga berpotensi sebagai antikanker karena sifatnya sebagai


43

antiangiogenesis (menghambat pembentukan pembuluh darah baru pada sel

kanker).

3. Penghambatan terhadap COX-2

Ekstrak etanol buah mengkudu kemungkinan mampu menghambat COX-2

pada CAM terinduksi bFGF. Sel endothelial yang diaktifkan/dirangsang oleh

bFGF akan memacu COX-2 pada sintesis sejumlah besar prostaglandin (PG).

Prostaglandin mempunyai kemampuan untuk mempromosikan proliferasi sel

kapiler endothelial, sehingga sel endothelial akan membentuk pembuluh darah

baru (angiogenesis). Penghambatan terhadap COX-2 akan mengurangi secara

poten proliferasi sel endothelial, karena produksi PG menjadi terlambat.

Akibatnya sel endothelial tidak bisa mengalami angiogenesis.

Pada penelitian ini, terbukti bahwa ekstrak etanol buah mengkudu mampu

menghambat pembentukan pembuluh darah baru. Penghambatan tersebut di

mungkinkan adanya kandungan senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak

etanol buah mengkudu (Morinda citrifolia L.), yang memiliki aktivitas sebagai

inhibitor angiogenesis. Menurut Will Mcclatchey, (2002) (dalam jurnal Aruma, et

al., 2013), menyebutkan bahwa buah mengkudu mengandung berbagai komponen

seperti vitamin C, vitamin A, terpenoid, alkaloid, antrakuinon (damnachantal,

mirindon, rubiadin-1-metil eter, glikosida), rutin, alizarin, asam kapirat, dan

flavonoid. Mekanisme penghambatan angiogenesis ekstrak buah mengkudu belum

dapat dipastikan tetapi dimungkinkan dengan menghambat migrasi sel endotel,

menghambat matrix metalloproteinase (MMPs), atau melaui pengeblokan signal


44

angiogenesis yang dihasilkan oleh induksi bFGF oleh senyawa flavonoid,

antrakuinon dan alkaloid buah mengkudu (Elkin dkk, 2000).


45

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil yang diperoleh dan analisis statistik yang telah

dilakukan, maka dapat disimpulkan :

1. Pemberian ekstrak etanol buah mengkudu dengan konsentrasi 150, dan 225

µg/ml mempunyai aktivitas antiangiogenesis pada CAM.

2. Tidak ada hubungan antara peningkatankonsentrasi ekstrak etanol buah

mengkudu dengan aktivitas antiangiogenesis pada CAM embrio ayam yang

diinduksi bFGF

B. Saran

1. Identifikasi dan isolasi senyawa murni pada buah mengkudu sebagai

antiangiogenesis, sehingga bisa diketahui mekanisme penghambatannya secara

spesifik.

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui mekanisme aktivitas

antiangiogenesis dari senyawa spesifik yang memiliki aktivitas

antiangiogenesis dalam buah mengkudu.


46

DAFTAR PUSTAKA

Ariyanti, T., 1999, Penggunaan Model Tumor Angiogenesis faktor untuk Deteksi

Biologis Karsinogenesis Paru Serviks Uterus Mencit (Mus musculus) yang

Diinduksi dengan Benzo(a)piren, Tesis, Program Pasca Sarjana UGM,

Jogjakarta.

Backer and Brink, V.B., 1965, Flora of Java, Wolters Mood Hoff N. V.,

Netherlands, pp 167-173

Badan Pengawasan Obat dan Makanan RI, 2010, Acuan Sediaan Herbal, 5 (1),

Badan Pengawasan Obat dan Makanan RI, pp. 6-7.

Badan Pengawasan Obat dan Makanan RI, 2005, Standarisasi Ekstrak Tumbuhan

Obat Indonesia, Salah Satu Tahapan Penting dalam Pengembangan Obat

Asli Indonesia, 6, Badan Pengawasan Obat dan Makanan RI, pp. 5.

Bergers, G., Hanahan, D., 2008, Modes of resistance to anti-angiogenic therapy.

Nat Rev Cancer 8: 592–603.

Bestari, J., Parakkasi. A., and Akil, S., 2005, Pengaruh pemberian tepung daun

mengkudu (Morinda citrifolia. L) yang direndam air panas terhadap

penampilan ayam boiler, Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan

Veteriner, 704.

Bosman, F.T., 1999, Aspek-aspek Fundamental Kanker, In Van de Velde, C.J.H.,

Bosman, F.T., Wagner, D.J.Th.(Eds)., Onkology, diterjemahkan oleh Arjono,

Edisi kelima, Panitia Kanker RSUD DR Sardjito, Jogjakarta, 3-10

Djauhariya, Endjo, 2003, Mengkudu (Morinda citrifolia L.) Tanaman Obat

Potensial, Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat. Pengembangan

Teknologi TRO, 15(1) : 1-16.

Djauhariya, E., Raharjo, M., dan Ma‟un, 2006, Karakterisasi Morfologi dan Mutu

Buah Mengkudu. Buletin Plasma Nutfah, 12(1) : 1-8.

Eliceiri, B.P., and Cheresh, D.A., 1999, The role of αv Integrins During

Angiogenesis : Insight Into Potential Mechanism of Action and Clinical

Development, J., Clint. Invest, vol 103 : 1227-1230.

Elkin, M. dkk., 2000, “Halofuginone: a potent inhibitor of critical steps in

angiogenesis progression”, The FASEB Journal, 14, 2477-2485.

Evans, C.W., 1991, The Metastatic Cell, Edisi pertama, Champman and Hall,

London, pp. 191-289.


47

Folkman, J., 1971, Tumour Angiogenesis: Therapeutic Implications, New

England J. Medicine, 285(21); 1182-1186.

Folkman, J, 1996, Fighting Cancer by Attaching its Blood Supply, Scientific

American 19: 116-119.

Ferrara, N., and Alitalo, K., 1999, Clinical Application of Angiogenic Growth

Factors and Their Inhibitor, Nature Medicine, 5 (12) : 1359-1364.

Gajovic, S., and Gruss, P., 1988, Differentiation oh The Mouse Embryoid Bodies

Grafted on The Chariallantoic Membrane oh The Chick Embryo, Int.J. Dev.

Biol., 42: 225-228.

Giavazzi, R., Albini, A., Bussolino, F., DeBraud, F., Presta, M., Ziche, M., Costa,

A., 2000, The biological basis for antiangiogenic therapy (meeting report),

European Journal of Cancer., 36: 1913-1918

Grant, B,. 2008, Medical Nutrition Therapy for Cancer Prevention, Treatment,

and Recovery. Di dalam: Mahan LK, Stump SE, editor. Krause’s Food,

Nutrition & Diet Therapy. USA: Saunders Elsevier, pp. 25.

Hanahan, D., and Weinberg, R.A., 2000, The Hallamarks of Cancer, Cell, Cell

Press, P. 57-70.

Harborne, J. B. 1996. Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisa

Tumbuhan Diterjemahkan oleh : K. Padmawinata dan I. Soediro. Penerbit

ITB, Bandung.

Heyne, K., 1987, Tumbuhan Berguna Indonesia, vol.3, Badan Litbang Kehu-

tanan, Jakarta, pp. 1795-1799.

Hiramatsu, Tomonori, Imoto, Masaya, Koyano, Umezawa, Kazuo, 1993,

Induction of normal Phenotypes in Ras-Transformed cell by Damnacanthal

from Morinda Citrifolia. Cancer Letters. 73 (3) : 161-166.

Hirazumi A, Furusawa E., 1999, An immunomodulatory polysacchariderich

substance from the fruit juice of Morinda citrifolia (noni) with antitumour

activity. Phytother Res. 13(5):380-387.

Kerbel, R., Folkman, J., 2002, Clinical Translation of Angiogenesis Inhibitors,

Nature Cancer Rev., 2: 727-739.

Keshet, E., and Sasson, S.A.B., 1999, Anticancer Drug Targets : Approaching

Angiogenesis, J. Clin. Invest, vol 104 : 11 : 1497-1500.


48

Kirchner, M.L., Schmidt, P.S., and Gruber, S.B., 1996, Quantitation of

Angiogenesis in The Chick Charioallantoic Membrane Model Using Fractal

Analysis, Microvascular Research, 51:2-14.

King, R.J.B., 2000, Cancer Biology, 2nd

edition, Pearson Education Ltd., London,

pp. 1-4. 10-13.228-231.

Knighton, D.,Ausprunk, D., Tapper, D., and Folkman, J., 1977, Avascular and

Vascular Phases of Tumour Growth in the Chick Embryo, British J. Cancer,

35 : 347-356.

Leahy, K.M., Koki, A.T., and Masferrer, J.L., 2003, Role of Cyclooxygenases in

Angiogenesis, www. Bentham.org/cmc-sample/masferner/masferner.htm,

diakses Mei 2014.

Lemmens, R.H.M.J., Banyapraphatsara, N., 2003, Morinda L. Dalam : Lemmens,

R.H.M.J., Banyapraphatsara, N., Plant Resources of South-East Asia No 12

(3) Medical and Poisonous Plant 3, Prosea Foundation, Bogor, pp. 302-305.

MacDonald, M.D.T., angiogenesis Inhibitors A New Frontier in Cancer Therapy,

Children‟s National Medical Center, Washington

Mulyadi, 1996, Kanker, Karsinogen, Karsinogenesis, dan Antikanker, Tiara

Wacana Yogya, Yogyakarta.

Murray, R.K, Keeley, F.W., 1993, Matriks Ekstraseluler, dalam Biokimia Harper,

diterjemahkan oleh : Hartono, A., Edisi 24, Penerbit EGC, Jakarta, pp. 562.

Nayak, B. Shivananda, Marshall, Julien R., Isitor, Godwin, and Adogwa, 2010,

Hypoglycemic and Hepatoprotective Activity of Fermented Fruit Juice of

Morinda citrifolia (Noni) in Diabetic rats, Evidence – Based Compementary

and Alternative Medicine, Vol.2011, No. 875293.

Novalina, 2003, Penggunaan Tanaman Obat Sebagai Upaya Alternatif dalam

Terapi Kanker. Pengantar ke Falsafah Sain. PPS Institut Pertanian Bogor.

Ogata, Y., 1986, Medicinal Herb Index in Indonesia, 2nd

ed., PT. Eisai Indonesia,

Tokyo, pp. 276.

Papetti M., Herman IM., 2002, Mechanisms of normal and tumor-derived

angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol 282: C947-C970.

Patten, B.M., 1978, Extra-Embryonic Membranes, dalam Early Embriology of

The Chick, Edisi ke-5, Graw-Hill Publishing Company LTD, New Dehli, pp.

147-151,175.


49

Peter, 2005, Chemical Constituents and Noni‟s Function, Noni News Indian

Magazine, Edisi Oktober (2) X.

Pramono, S., 2006, Strategi dan Tahapan Menuju Produksi Obat Herbal

Terstandar dan Fitofarmaka bagi Perusahaan Jamu, dalam Prosiding Seminar

Nasional Tumbuhan obat Indonesia XXIX, UNS Press, Surakarta, 1.

Pratiwi, I., 2009, Uji Antibakteri Ekstrak Kasar Daun Acalypha indica terhadap

Bakteri Salmonella choleraesuis dan Salmonella typhimurium, Skripsi,

Jurusan Biologi FMIPA UNS, Surakarta.

Rafii S., 2002, Efficient mobilization and recruitment of marrow-derived

endothelial and hematopoietic stem cells by adenoviral vectors expressing

angiogenic factors. J Gene Ther 9: 631–641.

Ribatti, D., Urbinati, C., Nico, B., Rusnati, M., Roncali, L., and Presta, M., 1995,

Endogenous Basic Fibroblast Growth Factor is Implicated in the

Vascularization of the Chick Embryo Charioallantoic Membrane, Dev.Biol.,

170: 39-48.

Ribatti, D., Bertossi, M., Nico, B., Vacca, A,, Ria, R., Riva, A., Roncali, L., and

Presta, M., 1998, Role of the basic Fibroblast Growth Factor in the Formation

of the Capillary Plexux in the Chick Embryo Charioallantoic Membrane. An

In Situ Hybridization, Immunohistochemical and Ultrastructural Study, J.

Submicrose. Cytol. Pathol., 30 : 127-136.

Ribatti, D.,Vacca, A., Giuliani, R., Gualandris, A., Roncali, L., Nolli, M.L.,

Presta, M., 1999, In Vivo Angiogenic Activity of Urokinase : role of

Endogenous Fibroblast Growth Factor-2, Journal of Cell Science, 112: 4213-

4221.

Ribbati, D., Vacca, A., Presta, M., 2002, The discovery of angiogenic factors: A

historical review, General Pharmacology., 35: 227-231.

Sambamurty, A.V.S.S. 2005, Taxonomy of Angiosperms, I. K. International Pvt

Ltd. New Delhi, pp. 404.

Schneider, A.K., 1997, Cancer Genetic, Encyclopedia of Human Biology, 2nd

,

Academic Press, pp. 311-321.

Schor, A.M., and Schor, S.L., 1983, Tumour Angiogenesis, J. Pathology, 141 :

385-413.

Sofyan, R., 2000, Terapi kanker pada Tingkat Molekuler, Cermin Dunia

Kedokteran, 127: 5-10.


50

Stetler-Stevenson, W.G., 1999, Matrix Metalloproteinases in Angiogenesis : A

Moving Target for Therapeutic Intervetion, J. Invest, vol 103 : 9 : 1237-1241.

Storer, T.J., Stebbins, R.C., Usinger, R.L., and Nybakker, J.W., 1979,

Reproduction and Development, dalam General Zoology, Edisi ke-6, Mc

Graw-Hill Book Company, New York, pp. 191-194.

Suryowinoto, S. M., 1997. Flora Eksotika, Tanaman Peneduh. Penerbit Kanisius,

Yogyakarta.

Thararat N, Pleumchitt R, Wandee G, Seong-Ho L, Darunee L, Seung JB., 2012,

Damnacanthal, a noni component, exhibits antitumorigenic activity in human

colorectal cancer cells. The Journal of Nutritional Biochemistry. 23: 915–923.

Tosetti, F., Ferrari, N., De Flora, S., Albini, A,, 2002, Angioprevention :

Angiogenesis is a Common and Key Target for cancer Chemopreventive

Agent, FASEB, 16: 2-14.

Waha, M. G., 2000, Sehat dengan Mengkudu. Jakarta: MSF Group: 1-16.

Waha, M. G., 2001, Sehat dengan mengkudu.MSF Group, Jakarta, pp. 1- 44.

Wang MY, Su C 2001, Cancer preventive effect of Morinda citrifolia (Noni).

Ann. N. Y. Acad. Sci. 952:161-168.

Wiseman M., 2007, Essential of Human Nutrition, New York : Oxford University

Press, pp. 9.

Winarti, C. 2005, Peluang Pengembangan Minuman Fungsional dari Buah

Mengkudu (Morinda citrifolia L.). Jurnal Litbang Pertanian. 24 (4) : 149-

155.

Yuswanto, Ag., Sinardi., F., 2000, Kanker, Universitas Sanata Dharma,

Yogyakarta, pp. 1-5.

Zetter , B.R., 1980, Migration of Capillary Endothelial cells is Stimulated by

Tumour-Derived Factor, Nature, 285:41-43

Zuhud, AM. E., 2011, Kanker Lenyap Berkat Sirsak, PT AgroMedia Pustaka,

Jakarta, pp. 9.


51

LAMPIRAN


52

Lampiran 1. Foto Buah Mengkudu (Morinda citrifolia. L)

Lampiran 2. Foto Serbuk (Morinda citrifolia. L)


53

Lampiran 3. Foto Ekstrak Kental Etanol Buah Mengkudu (Morinda

citrifolia. L)

Lampiran 4. Foto Pembuatan larutan uji dan larutan basic Fibroblast Growth

Factor (bFGF)


54

Lampiran 5. Foto Pembuatan Jendela Berukuran 1x1 cm

Lampiran 6. Data Perhitungan Rendemen Ekstrak Etanol Buah Mengkudu

A. Penimbangan

Bobot cawan = 43,18 gram

Bobot cawan + ekstrak = 58,86 gram

Bobot ekstrak = 15,68 gram

Bobot buah mengkudu yang digunakan = 100 gram

B. Rendemen Ekstrak Etanol Buah Mengkudu

Rendemen ekstrak etanol buah mengkudu = x 100%

= x 100%

= 15,68%


55

Lampiran 7. Data Perhitungan Pengenceran bFGF

A. Pengenceran bFGF

Konsentrasi awal bFGF (C1) adalah 25

Konsentrasi bFGF yang diinginkan (C2) adalah 1

konsentrasi setiap telur adalah 10 ng.

V = = = 10 µl

Setiap telur diinduksi dengan volume induksi bFGF sebesar 10µl.

Telur yang digunakan untuk masing-masing perlakuan adalah 10 telur

Kontrol bFGF

Total telur = 10 telur

Volume bFGF yang dibutuhkan = total telur x volume induksi bFGF

= 10 x 10 µl = 100 µl

V1 x C1 = V2 x C2

V1 x 25 ng/µl = 100 µl x 1 ng/µl

V1 =

V1 = 4 µl

Larutan bFGF (25 ng/µl) diambil 4 µl kemudian ditambahkan dengan pelarut

bFGF yaitu PBS.

Volume PBS yang ditambahkan = 100 µl - 4 µl = 96 µl


56

Konsentrasi Ekstrak Etanol Buah Mengkudu

Terdapat 3 macam variasi konsentrasi ekstrak yaitu (100 µg/ml, 150 µg/ml dan

200 µg/ml).

Total telur = 3x 10 telur = 30 telur.

Volume bFGF yang dibutuhkan = total telur x volume induksi bFGF

= 30 x 10 µl = 300 µl

V1 x C1 = V2 x C2

V1 x 25 ng/µl = 300 µl x 1 ng/µl

V1 =

V1 = 12 µl

V1 = larutan bFGF ( 25 ng/µl) diambil 12 µl kemudian ditambahkan dengan

pelarut bFGF yaitu PBS

Volume PBS yang ditambahkan = 100 µl – 12 µl = 88 µl

Lampiran 8. Perhitungan Berat Ekstrak dan Volume DMSO

A. Berat Ekstrak untuk Masing-masing Konsentrasi Ekstrak

Konsentrasi 100 µg/ml

m = C x V

100 µg/ml = 0,1 mg/ml

0,1 mg/ml x 200 ml

m = 20 mg = 0,02 g ditambah 0,4 ml DMSO add sampai 200 ml


57


m = C x V

150 µg/ml = 0,15 mg/ml

0,15 mg/ml x 200 ml



m = C x V

225 µg/ml = 0,25 mg/ml

0,25 mg/ml x 200 ml


B. Volume DMSO

Konsentrasi awal DMSO (C1) adalah 99,5%

Konsentrasi yang diinginkan (C2) adalah 0,2%

V1 x C1 = V2 x C2

V1 x 99,5% = 200 ml x 0,2%

V1 = = 0,4 ml

Untuk membantu dalam melarutkan ekstrak etanol buah mengkudu, setiap

konsentrasi ekstrak ditambahkan 0,4 DMSO


58

Lampiran 9. Persentase Penghambatan Angiogenesis

Tabel IV. Rata-rata dan Standar Deviasi Pembuluh Darah Baru

Kelompok

Jumlah

Pengamatan

Jumlah

Pembuluh

Darah

Rata-Rata

Standar

Deviasi

Kontrol Blank

3

15

14,33

1,15 11

15

Kontrol Pelarut

3

13

13

2 11

15

Kontrol bFGF

3

24

23,33

0,58 23

23

Konsentrasi I

(100µg/ml)

3

22

20,33

1,52 19

20

Konsentrasi II

(150µg/ml)

3

13

14,66

1,52 15

16

Konsentrasi III

(225µg/ml)

3

10

11,66

2,88 10

15

A. Persentase Penghambatan Angiogenesis

Persentase Pertumbuhan Pembuluh Darah Baru = x 100%

a = jumlah pembuluh darah baru rata-rata konsentrasi ekstrak etanol buah

mengkudu

b = jumlah pembuluh darah baru rata-rata kontrol bFGF

Persentase Penghambatan Angiogenesis

= 100 – Persentase Pertumbuhan Pembuluh Darah baru


59

Konsentrasi I (100 µg/ml)

Persentase Pertumbuhan Pembuluh Darah Baru = x 100% = 87,14%

Persentase Penghambatan Angiogenesis = 100% - 87,14% = 12,86%

Konsentrasi II (150 µg/ml)

Persentase Pertumbuhan Pembuluh Darah Baru = x 100% = 62.83%


Konsentrasi III (225 µg/ml)

Persentase Pertumbuhan Pembuluh Darah Baru = x 100% = 49,97%


Tabel V. Persentase Penghambatan Angiogenesis

Kelompok

X ± SD

Persentase

Pertumbuhan

Pembuluh Darah

Baru (%)

Persentase

Penghambatan

Angiogenesis (%)

Konsentrasi I

(100 µg/ml)

20,33

87,14

12,86

Konsentrasi II

(150 µg/ml)

14,66

62,83

37,17

Konsentrasi III

(225 µg/ml)

11,66

49,97

50,03


60

Lampiran 10. Foto Pengamatan makroskopik pembentukan pembuluh darah

pada setiap kelompok

Kontrol paper disc Kontrol pelarut

Kontrol bFGF + pelarut Konsentrasi I (100 µg/ml)

Konsentrasi II (150 µg/ml) Konsentrasi III (225 µg/ml)


61

Lampiran 11. Analisis uji statistik normalitas

Lampiran 12. Analisis uji statistik one way anova


62


63

Lampiran 13. Analisis uji statistik Tukey


64

Lampiran 14. Hasil determinasi


65


66

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul „Aktivitas

AntiAngiogenesis Ekstrak Etanol Buah

Mengkudu Morinda citrifolia L. terhadap CAM

yang diinduksi bFGF’ yang bernama lengkap

Pande Putu Krisna Wedana lahir di Bangli pada

tanggal 3 April 1992 adalah putra pertama dari

pasangan I Wayan Sumantra dengan Nyoman

Mudiani. Penulis mengawali masa pendidikannya di

TK Bhayangkari (1996-1998), kemudian

melanjutkan pendidikan di tingkat Sekolah Dasar di

SD No.2 Bangli (1998-2004). Pendidikan Sekolah

Menengah Pertama di SMP Negeri 1 Bangli (2004-

2007), kemudian melanjutkan pendidikan tingkat

menengah atas di SMA Negeri 2 Bangli (2007-

2010). Penulis kemudian melanjutkan pendidikan

sarjana di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2010. Selama

menempuh pendidikan di Universitas Sanata Dharma, penulis aktif dalam

kegiatan kepanitiaan di dalam dan di luar kampus, serta aktif dalam organisasi

UKF Hindu sebagai pengurus. Selain itu penulis juga aktif mengikuti seminar di

dalam maupun luar kampus.


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk fileiv halaman persembahan om dewa suksma...

Documents