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Vorlesung „Zellbiologie Physiologie und Genetik“

SoSe 2016

Pflanzenpigmente und Photosynthese

Prof. Dr. Iris Finkemeier

Institut für Biologie und Biotechnologie der Pflanzen

Chloroplasten 2

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Die Photosynthese besteht aus zweimiteinander verbundenen Reaktionen

Adapted from Kramer, D.M., and Evans, J. R. (2010). The importance of energy balance in improving photosynthetic productivity. Plant Physiol.155: 70–78.

Chloroplast2 H2O O2 + 2 H+ + 2 ADPH+

ATP

Die Lichtreaktionen in der Thylakoidmembran

Die Kohlenstofffixierungim Stroma

2 NADP+

2 NADPH

2 H+e−

e−

„Linearer“ Elektronentransport dient der Erzeugung von Reduktionskraft (NADPH)

und eines Protonengradienten, der die ATP-Synthese antreibt

Buchanan et al., „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“; Amer. Soc. of Plant Physiol.

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Photosynthetischer linearer ElektronentransportOxidation von Wasser und Reduktion von NADPH

Wellenlängen des Lichts

Gammastrahlen

Röntgenstrahlen

IR

Visible

UV

Mikrowellen

Radiowellen

1 nm 1 μm 1 mm 1 mWellenlängen

500nm

400nm

600nm

Wellenlängen

Viel EnergieHohe FrequenzKurze Wellenlänge

Geringe EnergieGeringe FrequenzLange Wellenlänge

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Lichtabsorption

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Das Blatt er-scheint grün, weil alle Wellen-längen außer grün absorbiert werden

Grünlücke

Wichtige Pigmente der Photosynthese

300 400 500 600 700 800

Wellenlänge (nm)

Abs

orpt

ions

spek

trum

phot

osyn

thet

isch

erP

igm

ente Chlorophyll a

Chlorophyll bβ-CarotinPhycoerythrinPhycocyanin

Akz

ess

oris

che

Pig

men

te

β-Carotin

Chlorophyll a

Tetrapyrrolring mitMg im Zentrum

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polarem Tetrapyrrol-Ring („farbig“, durch konjugierte Doppelbindungen)

zentralem Magnesium-Atom (Mg2+-freies „Chlorophyll“ = Phaeophytin, griech. hässlich)

hydrophobem Phytolschwanz (dient der Membran-Verankerung)

nicht-kovalenter Assoziation mit sogen. „chlorophyll-binding proteins“ (CBPs)

Chlorophylle unterscheiden sich in ihren Seitengruppen und im Tetrapyrrolring (Abb. ob.)

Seitengruppen (Methyl-, Aldehyd-, etc.), bedingen die Position der Absorptionsbanden

AldehydMethylChlorophyllePorphyrin-Ringsystem mit zentralem Metall-Atom (Magnesium)

bestehen aus:

CarotinoideAlle photosynthetischen Membranen enthalten neben ChlorophyllenCarotinoide (nicht-kovalent an Chlorophyll-Bindeproteine gekoppelt)

Carotinoide sind lipophile, gelb-orange Pigmente mit konjugierten Doppel-bindungen (aliphat. Kette) und endständ. „Ionon“-Ringen (-Carotin-Derivate)

Xanthophylle enthalten Sauerstoff sind daher weniger lipophil als -Carotin Carotinoide sind „akzessorische“ Photosynthese (PS)-Pigmente Funktion: Schutz des PS-Apparates vor zu hoher Lichtenergie (O2-Radikalen)

Eigenschaften zeigen sich bei chromatographischer Trennung

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Anthocyane 11

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Das Grundgerüst der Anthocyane besteht aus einem sauerstoff-haltigen Heterocyclus (Pyran) mit ankondensiertem Benzolring.

Der Absorptionsbereich wird außer von der Molekülstruktur auch vom pH-Wert der Umgebung beeinflusst. Im sauren Milieu überwiegt die Rot-färbung, im basischen vor allem Blau- und Violetttöne.

• Kein Pigment der Photosynthese

• Wird in der Vakuole gespeichert

• Wird vermehrt unter Stress gebildet

• Kommt vor allem in Epidermiszellen vor

• UV-Schutz für die Photosynthese

Photosynthese:Wirk- und Absorptionsspektrum 12

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Eigenschaft der Pigmente:

Wenn Chlorophylle oder andere Pigmente Licht absorbieren, werden Elektronen auf ein höheres Energieniveau gehoben

Pigment + Licht = Pigment*

Pigmente: Anregung durch Licht14

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S0

S1

S2

Wärme

EFlu

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Die Chlorophyll-Fluoreszenz ist ein diagnostisches Werkzeug zum Nachweis und zur Untersuchung der Photosynthese (Effizienz)

PhotosyntheseLicht

Fluoreszenz Wärme

Zellen des Schwamm-parenchyms(Tabak-Blatt)

Der angeregte Zustand von Chlorophyll ist kurzfristig. Rückkehr zum Grundzustand

kann auf vier Wegen erfolgen:

Chl

Chl*Photon

4. Elektronenübertragung (Photochemie): Energie wird als energiereiches Elektron auf benachbartes Molekül übertragen (Elektronenakzeptor) und hinterlässt Elektronenlücke im ursprünglichen Molekül (Ladungs-trennung).

1. Relaxation (Nicht-photochemisches quenchen; Energie wird in Wärme umgewandelt)

2. Fluoreszenz (Energie wird in Form von langwelligerem Licht abgestrahlt)

3. Resonanzenergieübertragung (Excitonentransfer):Energie wird auf anderes Pigmentmolekül übertragen und regt dieses an.

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Trennplatte im Dunkeln

(bei Blaulicht-Anregung)

Chlorophylle relaxieren vom 1. Anregungszustand durch Abgabe von rotem Fluoreszenz-Licht

Carotin(oide) relaxieren dagegen „thermisch“ (strahlungslos)

Carotinoide Chl b, a -Carotin

abnehmende Polarität (bessere Pigment-Löslichkeit in der mobilen Phase (hydrophobes Laufmittel)

Dünnschicht-chromatographische Trennung

von Blattpigmenten

(feste Phase: Papier, Kieselgel)

START

Carotinoide Chl b, a -Carotin

Photosynthese und Lichtintensität

Adapted from Li, Z., Wakao, S., Fischer, B.B. and Niyogi, K.K. (2009). Sensing and responding to excess light. Annu. Rev.Plant Biol. 60: 239-260.

Light intensity

Rat

e o

f p

ho

tosy

nth

esis

Bei geringerLichtintensität:

Lichtintensitätlimitiert

Photosynthese-leistung

Bei hoher Lichtintensität: Zu viel Licht kann die

Photosynthesekomplexe schädigen

Der metabolische und physiologische Status der Pflanze oder Zelledefiniert wieviel Licht

“zu viel” ist

Optimal conditions

Stressed conditions

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Dissipation von zu viel Licht via “non-photochemical quenching” NPQ

“Non-photochemical quenching” Setzt sich zusammen aus:

qE = Energie-abhängiges Quenching: Xanthophyll-ZyklusqT = State transition: Bewegung von LHCIIqI = Photoinhibition: Verlust der Photosyntheseleistungdurch Licht-induzierte Schädigung

Chl

1Chl*

Photon Non-photochemical quenching (NPQ)

Energie-abhängiges quenching (qE) macht den Haupteil von NPQ aus

PSII

[H+]

LHC PSIILHC

Normallicht: HoheEffizienz der Photosynthesebei Ausnutzungder vollenLichtenergie

[H+]

[H+]

[H+][H+]

VDEStarklicht:Energie-abhängigesquenching 1. Ansäuerung des Lumens aktiviert dieViolaxanthin De-epoxidase (VDE)

2. VDE wandeltViolaxanthin in Zeaxanthin um. Absorption des Lichts durch Zeaxanthin führt zurDissipation der Lichtenergie

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Zu viel Anregungsenergie kann zu photo-oxidativen Schäden führen

Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd Demmig-Adams, B. and Adams, W.W. (2000). Photosynthesis: Harvesting sunlight safely. Nature. 403: 371-374.

Photonen-angeregtes Chlorophyll bildet angeregtes SingulettChlorophyll 1Chl*1Chl* kehrt zum Grundzustandzurück durch:

PhotochemieFluoreszenzDissipation

(z.B., Hitze, NPQ)

Alternativ, wird 1Chl* zumangeregten Triplett Chlorophyll 3Chl* umgewandelt, welches seine Energie auf Sauerstoff transferiert. Dabei entsteht Singulett-Sauerstoff, der Zellschädenverursachen kann.

P

F

D

NPQ

Salzstress

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Verschiedene Pflanzenspezies habeneine unterschiedliche Salztoleranz

Arabidopsis thaliana

Saltbush (Atriplex amnicola) ist ein Halophyt

Reprinted by permission of Annual Reviews from Munns, R. and Tester, M. (2008). Mechanisms of salinity tolerance. Annu. Rev. Plant Biol. 59: 651-681.

Warum bedeutet zu viel Salz Stress für die Pflanze?

Adapted from Horie, T., Karahara, I. and Katsuhara, M. (2012). Salinity tolerance mechanisms in glycophytes: An overview with the central focus on rice plants. Rice. 5: 11; see also Munns, R. and Tester, M. (2008). Mechanisms of salinity tolerance. Annu. Rev. Plant Biol. 59: 651-681 and Shabala, S. and Pottosin, I. (2014). Regulation of potassium transport in plants under hostile conditions: implications for abiotic and biotic stress tolerance. Physiol. Plant. 151: 257-279.

Salzstress

Ionen Imbalance: zu wenig K+ / zuvielNa+ Influx

inhibiert:Wasseraufnahme, Wachstum, Photosynthese

inhibiert:

Enzymaktivitäten, Photosynthese

Osmotischer StressOxidativerStress

inhibiert:

Enzymaktivitäten, Photosynthese

resultiert in:Blatt Seneszenz

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Praktikumsversuch: 1. Pigmentkonzentrationen

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To do:Pro Arbeitsgruppe:

Entnehmen sie pro Behandlung vier Blattscheiben für je zwei Replikate für:1. Chlorophyll a,b und Carotinoide Bestimmung2. Anthocyan Bestimmung

Für die zuverlässige Bestimmung der Mittelwerte benötigen wir insgesamt 5 Replikate. Die anderen 3 Replikate messen sie mit Extrakten ihrer Nachbar-AGs.

Kontrolle 50 mM NaCl 150 mM NaCl

Praktikumsversuch: 1. Pigmentkonzentrationen

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Chl a = 0,013730 A663 – 0,000897 A537 – 0,003046 A647

Das Lambert-Beer‘sche Gesetz stellt einen quasilinearen Zusam-menhang zwischen Konzentration und Absorption her (< 0.8).

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Abb. 1: Konzentration von Pigmenten in Arabidopsis thalianaBlättern nach einwöchiger Behandlung mit 0, 50 und 150 mMNaCl an vier Wochen alten Pflanzen (n= 5, MW +- SA)

Ergebnisse

Fluoreszenz‐basierte Photosynthesemessungen mit Hilfe der

Puls‐Amplituden‐Modulations Fluorometrie (PAM)

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Nach gesättigtem Lichtpuls: MaximaleFluoreszenz, es sind alle PSII

Reaktionszentren geschlossen

Murchie, E.H. and Lawson, T. (2013). Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications. J. Exp. Bot. 64: 3983-3998 by permission of Oxford University Press.

P680 → P680* → P680+

Pheo → Pheo−

e-e−

QA → QA−

e-e−

QB → QB−

e-e−

Reaktionszentrenvorübergehend

geschlossen

Gesättigter Lichtpuls führt zuFluoreszenzpuls(emittiertes Licht)

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Y(II) 90 µE =

Die Quanteneffizienz Y(II) wird bei ansteigenden Lichtintensitätengemessen (0, 90, 190, 420 , 820 μE). Daraus lässt sich eine Schätzung derElektronentransportrate der Photosynthese zu unterschiedlichenLichtbedingungen ermitteln.

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Praktikumsversuch: 2. Photosynthese

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To do:Pro Arbeitsgruppe:

Messen sie an je einem Rosettenblatt der drei Behandlungen (0, 50 150 mMNaCl): 1. Fv/Fm-Wert (dunkeladaptiert), 2. Y(II) bei (90, 190, 420, 820 μE) Blatt jeweils vorher 5 min an neue

Lichtintensität gewöhnen. Notieren sie gleichzeitig den ETR-Wert

Kontrolle 50 mM NaCl 150 mM NaCl

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Aktinisches Licht an = Photosynthese anFür Messung maximaler Quanteneffizienz von PSII (Fo, Fm) vorher ausschalten!

Stufen für Einstellung der Lichtstärke

Benutzeroberfläche PAM-Software

Für Messung Fo,Fm anklicken

Für Y(II)-Messung anklicken

Aktinisches Licht an = Photosynthese anFür Messung Y(II) anschalten!

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(A) (B)

(C)

Abb. 2: PAM-Messungen an Arabidopsis thaliana Blättern nach einwöchiger Behandlung mit 0, 50und 150 mM NaCl an vier Wochen alten Pflanzen. (A) Maximale Effizienz von PSII, (B)Quanteneffizienz von PSII bei vier verschiedenen Lichtintensitäten, (C) Elektronentransportrate beivier verschiedenen Lichtintensitäten (n= 5, MW +- SA).

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Das Protokoll

1. Kurze Einleitung: Bedeutung von Salzstress für die Photosynthese (1 Seite maximal)

2. Ergebnisse: Beschreibung der Ergebnisse. Was passiert unter den verschiedenen Salzkonzentrationen mit Pigmenten und Photosyntheseleistung. Beantwortung der Fragestellung. Darstellung der Tabellen und Abbildungen. Verweis auf Abbildungen im Text. Beschriften sie ihre Abbildung richtig! Achsenbeschriftung, Legende und Abbildungsunterschrift!

3. Diskussion: Entsprechen die Ergebnisse den Erwartungen der Versuchshypothese?

4. Quellen

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Arbeitssicherheit 37

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Aceton Methanol Salzsäure

VielErfolg!