pengaruh krioprotektan dmso (dimethyl … · pengaruh penambahan dmso pada saat kriopreservasi...

65
i PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL SULFOXIDE) TERHADAP TINGKAT MATURASI DAN FERTILISASI OOSIT SAPI BALI HILMA UTAMI PUTRI I111 13 073 FAKULTAS PETERNAKAN UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2017 SKRIPSI

Upload: lamthuy

Post on 19-Mar-2019

220 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

i

PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL SULFOXIDE)

TERHADAP TINGKAT MATURASI DAN FERTILISASI OOSIT SAPI

BALI

HILMA UTAMI PUTRI

I111 13 073

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2017

SKRIPSI

Page 2: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

ii

PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL SULFOXIDE)

TERHADAP TINGKAT MATURASI DAN FERTILISASI OOSIT SAPI

BALI

HILMA UTAMI PUTRI

I111 13 073

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana

pada Fakultas Peternakan Universitas Hasanuddin

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2017

SKRIPSI

Page 3: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

iii

Page 4: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

iv

Page 5: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

v

ABSTRAK

HILMA UTAMI PUTRI (I111 13 073) Pengaruh Krioprotektan

DMSO(Dimethyl Sulfoxide) TerhadapTingkat Maturasidan Fertilisasi Oosit Sapi

Bali. Dibawah bimbingan MUHAMMAD YUSUF sebagai pembimbing utama

dan HERRY SONJAYA sebagai pembimbing anggota.

Selama proses kriopreservasi, oosit mengalami cekaman dingin yang

menyebabkan kerusakan sel oosit, oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk

mengetahuipengaruh penambahan krioprotektan DMSO kedalam media

kriopreservasi terhadap tingkat maturasi dan fertilisasi oosit. Koleksi oosit berasal

dari ovarium sapi Bali betina yang disembelih yang selanjutnya dicacah, diseleksi

dan dikriopreservasi.Sebanyak 144 oosit dibagi kedalam empat perlakuan,

masing-masing sebanyak 36 oosit; yakni penambahan DMSO 5%, 10%, dan 15%.

Perolehan data hasil penelitian ini dianalisis dengan menggunakan Chi-Square

2x2 Contingency Table pada masing-masing perlakuan. Hasil penelitian

menunjukan bahwa tingkat maturasi oosit pada tahap M-II optimum dicapai pada

perlakuan penambahan DMSO sebanyak 10% sedangkan tingkat fertilisasi

tertinggi pada tahap PN-II dihasilkan oleh oosit perlakuan 10% DMSO.

Kata Kunci: kriopreservasi, DMSO, Oosit, Maturasi, Fertilisasi,Sapi Bali.

Page 6: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

vi

ABSTRACT

HILMA UTAMI PUTRI (I111 13 073)Effect of Cryoprotectant DMSO

(Dimethyl Sulfoxide) On Maturation and Fertilization rate of Bali Cow's Oocytes.

Supervised byMUHAMMAD YUSUF and HERRY SONJAYA.

During the cryopreservation process, the oocytes suffered from cold shock that

possibly causes oocytes cell damage, therefore, this study aimed to determine the

effects of adding DMSO in to crypreservation media on maturation and

fertilization rates of the oocytes. Oocytes were collected from ovarium of

slaughtered Bali cows, trought slicing, selection, and cryopreserved : a total of

144 oocytes were divided in to four treatments whereas each treatment was 36

oocytes, respectively addition 5%, of DMSO, 10% and 15% in to

cryopreservation media. Data obtained in this study were analized using Chi-

Square 2x2 Contingency table at each treatment. The results of this study showed

that an optimum maturation rate of oocytes on M-II were obtained on the addition

of 10% of DMSO, while higher fertilization rate was obtained on PN-II higher

from addition of 10% DMSO.

Keywords: cryopreservation, DMSO, Oosit, Maturation, Fertilization, Bali Cow.

Page 7: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

vii

KATA PENGANTAR

Bismillahirahmanirahim…..

Assalamualaikumwarahmatullahiwabarakatuh

Puji syukur kita panjatkan kehadirat Allah SWT, karena rahmat dan

hidayah-Nya sehingga Tugas Akhir/Skripsi ini dapat diselesaikan dengan tepat

waktu. Skripsi dengan judul “Pengaruh Krioprotektan DMSO (Dimethyl

Sulfoxide) Terhadap Tingkat Maturasidan Tingkat FertilisasiOositSapi Bali”

Sebagai Salah Satu Syarat untuk memperoleh Gelar Sarjana pada Fakultas

Peternakan Universitas Hasanuddin, Makassar.

Ucapan terima kasih dan penghargaan setinggi-tingginya penulis

hanturkan dengan rasa hormat kepada:

1. Dr. Muhammad Yusuf, S.Pt selaku Pembimbing Utama, dan Prof. Dr. Ir.

H. Herry Sonjaya, DEA, DES. selaku Pembimbing Anggota, atas segala

bantuan dan keikhlasannya untuk memberikan bimbingan, nasehat dan

saran-saran sejak awal penelitian sampai selesainya skripsi ini.

2. Secara khusus penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya

dengan segenap cinta dan hormat kepada ayahanda Abd. Hatta dan ibunda

Kusumawati atas segala doa, motivasi dan kasih sayang serta materi yang

diberikan kepada penulis dan saudara-saudara saya Agum Utama, Hykma

Shakila dan Muhammad Ukail Waldan yang senantiasa membantu,

membericandatawa dan memberikan motivasi untuk selalu lebih semangat.

3. Prof. Dr. Ir. H. Latief Toleng M.sc., Prof. Dr. Ir. Djoni Prawira

Rahardja., dan Prof. Dr. Ir. Lellah Rahim M.Sc.selaku dosen pembahas

yang telah memberikan saran-saran dan masukan untuk perbaikan skripsi

Page 8: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

viii

ini.

4. Dr. Rohani, S.Pt. M.Si selaku Penasehat Akademik yang telah memberikan

bantuan dan motivasi kepada penulis.

5. Prof. Dr. Ir. H. Sudirman Baco, M.Sc selaku Dekan Fakultas Peternakan

dan seluruh Staf Pengawai Fakultas Peternakan, terima kasih atas segala

bantuan kepada penulis selama menjadi mahasiswa.

6. Prof. Dr. drh. Hj. Ratmawati Malaka, M.Sc selaku Ketua Program Studi

Peternakan, terima kasih atas segala bantuan kepada penulis

7. Dr. Hasbi, S.Pt. M.Si selaku pembimbing Laboratorium penulis

melaksanakan penelitian.

8. Semua dosen-dosen Fakultas Peternakan Universitas Hasanuddin yang telah

memberikan ilmunya kepada penulis.

9 99. Sahabat-sahabat tercinta yang selalu mendukung dikeadaan apapun Andi

Musdalifah, Maghfira Mansur S.Pt, Irma Eka Lestari, Hamdana,

Rahmadana Bahar

10 Sahabat-sahabat “PETERNAKAN B”Arda Runita, Indah Sari Nur

Utami, Syahidah, Hayu Fitryani, Asri Pusfita, Arda Runita, Syahidah,

Nursanti, Saharia, Nurhikmawati, Nita Kurnia Putri, Khasrima Mulya

Utari, Sari Putri, Abeng Daisuri, Ummy Kalsum, Nurhasnah, Tri

Wahyuni, Indah Sari Nur Utami, Nabila Chaerunnisa, Ahmad syakir,

Dwi Suprapto, Abd. Rahman, Insan Putra Pratama, Wahyu, Gede

Suamba, Aprianto Mandala Putra, Fulki Alen, Muhammad

Nurhidayat, Misbahuddin, Muh. Kasim, Ardianto, Sofyan Basri, Jamal

Heri, Haidil Kunang, Amir Mirzad terima kasih yang setinggi-tingginya

Page 9: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

ix

serta penghargaan yang sebesar-besarnya atas segala cinta, pengorbanan,

bantuan, pengertian, candatawa serta kebersamaan selama ini, waktu yang

dilalui sungguh merupakan pengalaman hidup yang berharga dan tak

mungkin untuk terlupakan dan terima kasih telah memberiku sedikit tempat

dihatimu untuk menjadikanku sahabat dan teriring dengan doa semoga

rekan dan sahabatku sukses selalu.

11. Andi Suaib terima kasih atas motivasi, dukungan, pengertian dan segala

kebaikan serta bantuan yang telah berikan kepada penulis.

12. Kepada sahabat ”TEAM PKL” AndiMusdalifah, Nawawi, Ofir

Tangkelangi, Firdaus, Majdah Pratiwi, Radinda dan Dinda Febrianti

Adam terima kasih atas kerja samanya, segala kebaikan serta bantuan yang

kalian barikan kepada penulis.

13. Kepada sahabat “ TEAM PENELITIAN” Asri Pusfita, Dewi Sartika,

Hikmayani Iskandar, Andi Nurul airin Arif, Nawawi, dan M.

Nasrullah, terima kasih atas segala kebaikan serta bantuan yang kalian

berikan kepada penulis selama penelitian.

14. Teman-teman HPMG (Himpunan Pelajar Mahasiswa Gowa)terima

kasih atas motivasi dan candatawa selama penulis menjadi anggota

15. Teman-teman HIMAPROTEK UH, terima kasih atas ilmu, pembelajaran,

nasehat-nasehat kebersamaan, kebaikan, amanah yang kalian berikan

selama penulis berorganisasi.

Page 10: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

x

16 16. Kakak-kakak SOLANDEVEN’11, FLOCK MENTALITY‘12, LION’10,

MATADOR’10, SITUASI’10 DAN ADIK-ADIK ANT’14, RANTAI’15

terima kasih atas segala kebaikan serta candatawa yang kalian berikan

kepada penulis.

17. Terima kasih sebesar-besarnya kepada Mama Caya, Dg, Sai, Kak Suri

Jasmip atas bantuannya kepada penulis.

19. Sahabat-sahabat teman seperjuangan, teman angkatan LARFA’13, terima

kasih atas motivasi dan segala kebaikan serta bantuan yang kalian berikan

kepada penulis.

20. Teman-teman “ KKN Desa Sawitto” Ferty Desi Andriana, Syarifah

Nadrah, Anny Jumarni, Ichwan Rasyidin Hadi Abbas, Jeremy Caesar,

Jois dan teman-teman Se-kecamatanBunginKabupatenEnrekang.

21. Semua Pihak yang tidak dapat penulis sebut satu persatu, terima kasih

banyak atas segala bantuannya.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih terdapat

kekurangan dan kesalahan. Penulis mengharapkan kritikan dan saran yang bersifat

membangun demi kesempurnaan skripsi ini.

Makassar, Juli 2017

Hilma Utami Putri

Page 11: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

xi

DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL ................................................................................. i

HALAMAN JUDUL .................................................................................... ii

PERNYATAAN KEASLIAN ...................................................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... iv

ABSTRAK .................................................................................................... v

ABSTRACT .................................................................................................. vi

KATA PENGANTAR .................................................................................. vii

DAFTAR ISI ................................................................................................. xii

DAFTAR TABEL......................................................................................... xiv

DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xv

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ xvi

PENDAHULUAN ......................................................................................... 1

TINJAUAN PUSTAKA

Ovarium dan Aktifitasnya ....................................................................... 4

Perkembangan Folikulogenesis dan Oogenesis ...................................... 4

Tingkat kematangan Oosit secara In Vitro ............................................. 8

Fertilisasiin Vitro .................................................................................... 12

Kriopreservasi Oosit ............................................................................... 16

Krioprotektan .......................................................................................... 17

METODE PENELITIAN

Waktu danTempat ................................................................................... 20

Materi Penelitian ..................................................................................... 20 Metode Penelitian ................................................................................... 21

HASIL DAN PEMBAHASAN

Tingkat Maturasi Oosit Sapi Bali dengan Penambahan DMSO

(Dimethyl sulfoxide) Berbeda.................................................................. 27

Halaman

Page 12: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

xii

Tingkat Fertilisasi Oosit Sapi Bali dengan Penambahan DMSO

(Dimethyl sulfoxide) Berbeda.................................................................. 31

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan ............................................................................................. 26

Saran ....................................................................................................... 36

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 37

RIWAYAT HIDUP

Page 13: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

xiii

DAFTAR TABEL

No. Teks

1. Pengaruh penambahan DMSO padasaat kriopreservasi oosit sapi bali terhadap

rata-rata persentase tingkat maturasi oosit ............................................................ 29

2. Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali

terhadap rata-rata persentase tingkat Fertilisasi oosit ......................................... 33

Halaman

Page 14: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

xiv

DAFTAR GAMBAR

No. Teks Halaman

1. Diagram Alir Prosedur Penelitian ....................................................... 22

2. Proses Perubahan Oosit dalam Tahapan Penelitian ............................ 27

3. Tahapan Maturasi Oosit srtrlah dikriopreservasi ................................ 28

4. Tingkat Pembentukan Pronukleus....................................................... 32

Page 15: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

xv

DAFTAR LAMPIRAN

No. Teks

1. Lampiran 1. Komposisi media Maturasi oosit. ................................................... 43

2. Lampiran 2. Komposisi media Fertilisasi oosit. ................................................. 43

3. Lampiran 3. Komposisi media Kriopreservasi. .................................................. 43

4. Lampiran 4. Data perhitungan tingkat Maturasi. ................................................ 44

5. Lampiran 5. Data perhitungan tingkat Fertilisasi................................................ 45

6. Lampiran 6. Dokumentasi Penelitian .................................................................. 46

Halaman

Page 16: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

1

PENDAHULUAN

Teknologi reproduksi merupakan satu kesatuan dari teknik-teknik

rekayasasistem reproduksi hewan yang dikembangkan melalui suatu proses

penelitian dalam bidang reproduksi hewan secara terus menerus dan

berkesinambungan dengan hasil berupa alat, dan metoda yang dapat diaplikasikan

dengan tujuan tertentu.Terdapat banyak sekali teknologi reproduksi yang bisa

diterapkan dalam pelaksanaan kegiatan usaha peternakan yang ditujukan untuk

meningkatkan populasi dan produksi. Beberapa diantaranya telah dipakai di

Indonesia namun sebagian besar masih merupakan teknologi yang langka yang

umumnya dikarenakan biaya perlakuannya dan peralatannya sangat mahal

(Novalina, 2009).

Pada masa ini, bioteknologi berkembang sangat pesat, Kemajuan ini

ditandai dengan ditemukannya berbagai macam teknologi contoh bioteknologi

pada bidang peternakan, khususnya bioteknologi reproduksi adalahTeknologi

fertilisasi in vitro (IVF) yang menggunakan ovarium sapi betina yang terlanjur

dipotong di rumah potong hewan (RPH). Ovarium sapi betina dari RPH masih

bisa dimanfaatkan karena bagian korteks ovarium merupakan tempat

perkembangan oosit yang merupakan salah satu bahan dalam produksi embrio

secara in vitro (Kaiin et al. 2008; Pujo et al. 2004).

Teknologi fertilisasi in vitro (IVF) saat ini masih dilakukan dengan

memanfaatkan oosit segar, namun kendala yang dihadapi adalah oosit mamalia

memiliki daya tahan hidup yang sangat terbatas sehingga tidak dapat disimpan

dalam waktu yang lama pada suhu kamar (Vieira et al., 2002).

Page 17: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

2

Keterbatasan waktu simpan ini dapat diatasi dengan teknik penyimpanan

beku (kriopreservasi) oosit untuk mempertahankan kelangsungan hidup sel

sehingga viabilitas oosit dapat dipertahankan dengan cara mereduksi fungsi dan

aktivitas metabolik tanpa terjadinya kerusakan membran. Keberhasilan

kriopreservasi oosit akan memungkinkan tersedianya oosit beku sehingga

mempermudah pengaturan waktu di dalam produksi embrio in vitro dan secara

umum merupakan upaya penyimpanan dan pemeliharaan plasma nutfah. Selain

itu, keberhasilan kriopreservasi oosit akan memperbaiki teknik penyediaan embrio

sehingga oosit segar tidak diperlukan lagi.

Selama proses kriopreservasi diperlukan suatu krioprotektan.

Krioprotektan merupakan zat kimia non elektrolit yang berungsi mereduksi

pengaruh letal proses pemaparan kriopreservasi sel diantaranya baik yang berupa

efek larutan maupun pembentukan kristal es ekstra atau intraseluler sehingga

dapat menjaga viabilitas sel setelah kriopreservasi (Ernawati, 1999).

Dalam proses kriopreservasi diperlukan suatu krioprotektan. Krioprotektan

selain dapat melindungi sel juga ternyata diduga dapat menimbulkan kerusakan

pada sel akibat pengaruh toksisitasnya. Derajat proteksi dari bahan krioprotektan

terhadap proses kristalisasi pada masa pembekuan tergantung dari jenis dan

konsentrasi krioprotektan yang dipakai serta lama paparan, maka dari itu perlu

dilakukan pengujian apakah krioprotektan DMSO bisa digunakan pada proses

kriopreservasi oosit sapi Bali dengan konsentrasi yang sesuai.

Tujuan dari penelitian ini adalah Untuk mengetahui pengaruh pemberian

krioprotektan DMSO(Dimethyl Sulfoxide) terhadap tingkat Maturasi dan tingkat

Fertilisasi oosit.

Page 18: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

3

Kegunaan dari penelitian ini adalah agar dapat mengetahui pengaruh

pemberian krioprotektan DMSO dengan konsentrasi yang tepat sehingga dapat

mempertahankan tingkat Maturasi dan tingkat Fertilisasi oosit.

Page 19: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

4

TINJAUAN PUSTAKA

Ovarium dan Aktivitasnya

Saluran reproduksi betina merupakan salah satu sistem dalam tubuh hewan

yang mengalami perkembangan dan perubahan morfologi saat terjadi kebuntingan

(Kimura et al., 1999). Ditambahkan oleh Priedkalns (1989), bahwa ovarium

mengalami serangkaian perubahan morfologi dan fisiologi selama siklus estrus

dan proses reproduksi. Ovarium mempunyai fungsi ganda, yaitu sebagai organ

eksokrin yang menghasilkan oosit (sel telur) dan sebagai organ endokrin yang

menghasilkan hormon steroid (estrogen dan progesteron) (Jalaluddin, 2014).

Ovarium terletak di dalam kavum abdominalis, menggantung, dan bertaut

melalui mesovarium ke uterus (Hafez dan Hafez, 2000; Hamny, 2006). Struktur,

bentuk, dan ukuran ovarium masing- masing hewan sangat bervariasi tergantung

kepada spesies, umur, tahap siklus seksual, dan jumlah anak yang dilahirkan

(Priedkalns, 1989; Hafez dan Hafez, 2000). Ovarium sebelah kanan biasanya

lebih besar daripada ovariumsebelah kiri. Sapi memiliki ovarium dengan ukuran

panjang sekitar 3,8 cm, lebar 2 cm, dan tinggi 1,5 cm (Frandson et al., 2003).

Perkembangan Folikulogenesis dan Oogenesis

Proses pertumbuhan folikel, ovulasi dan pembentukan CL sangat

dipengaruhi oleh sirkulasi hormon reproduksi dalam tubuh. Gonadotrophin

releasing hormone (GnRH) yang dihasilkan oleh hypothalamus berfungsi

menstimulasi pengeluaran folicle stimulating hormone (FSH) dan luteinizing

hormone (LH) oleh hipofisa anterior sebagai respons terhadap estrogen atau

progesteron. Ketika pro ses pertumbuhan folikel kecil (Recruitment) berlangsung,

mRNA meningkat. Pada saat seleksi morfologis, folikel dominan mengandung

Page 20: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

5

estrogen dengan konsentrasi tinggi dalam cairan folikel dan segera setelah proses

seleksi berakhir, maka folikel dominan banyak mengandung mRNA untuk

reseptor gonadotrophin dan hormon steroid (Fortune,et al., 2001). Perkembangan

folikel pada sapi dan domba ditandai dengan adanya gelombang pertumbuhan

folikel. Satu gelombang didefinisikan sebagai suatu proses pertumbuhan folikel

yang sinkron dari beberapa folikel kecil.Dari kelompok folikel kecil tersebut,

salah satu diantaranya akan terseleksi dan tumbuh menjadi folikel dominan,

sedangkan folikel lainnya akan terhenti pertumbuhannya dan menuju atresi.

Setelah mencapai ukuran maksimal, folikel dominan juga akan mengalami atresi

dan regresi. Perkembangan folikel pada sapi dan domba ditandai dengan adanya

gelombang pertumbuhan folikel. Pada gelombang yang kedua folikel dominannya

akan menjadi folikel ovulatory sedangkan folikel dominan dari gelombang ketiga

akan mengalami ovulasi (Fortune,et al., 2001).

Folikulogenesis adalah proses perubahan yang ditandai dengan

adanyaperubahan proliferasi dan differensiasi komponen sel pada folikel.

Dinamikafolikel terjadi selama folikel merupakan perubahan tahap perkembangan

folikelmulai dari folikel primordial sampai folikel tersier termaksud perubahan

ekspresimRNA yang mengkode reseptor GnRH, horm on steroid dan diikuti

seleksifolikel. Perkembangan folikel akan menyediakan lingkungan yang optimal

untukmaturasi oosit sehingga siap untuk fertilisasi.Folikulogenesis berhubungan

dengan perkembangan sekelompok folikeldengan berbagai tahap perkembangan,

kemudian sejumlah folikel akan terseleksiuntuk berkembang lebih lanjut

(Armstrong and webh, 1997). Folikulogenesisdapat dibagi menjadi tiga tahap:

Page 21: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

6

1. Rekrutmen, tahap pertumbuhan pool folikel yang cepat. Pertumbuhan initerjadi

dari folikel primordial menjadi folikel primer dan folikel sekunder.

2. Seleksi, proses penseleksian folikel untuk pertumbuhan lebih lanjut

menjadifolikel subordinat.

3. Dominasi, proses perkembangan folikel dominan yang cepat danperkembangan

folikel subordinat akan tertekan oleh folikel dominan. Dominasi folikel dan

penghambatan pertumbuhan folikel subordinat disebabkan olehmeningkatnya

follicle growth inhibiting factor (FGIF) yang diproduksi olehfolikel dominan.

FGIF akan menghambat proliferasi sel granulosa yangmenstimulasi FSH dan

aktivitas aromatase, selain itu juga menghambatvaskularisasi folikel

subordinat.

Selain hormon, proses folikulogenesis dikontrol oleh faktor endokrim

atauparaktrim seperti growth factor misalnya insulin-like growth factor

(IGF),Transforming Growth factor (TGF ), Fibroblast Growth Factor (FGF)

danEpidermal Growth Factor (EGF). IGF berfungsi untuk menstimulasi

proliferasivdan diferensiasi sel granulosa dan sel theca.

Hormon gonadtropin pada level seluler TGF berperan untukmenghambat

fragmen sel granulosa dan sel theca FGF akan menstimulasiproliferasi sel theca,

menghambat stimulasi FSH yang menginduksi ekspresireseptor LH pada sel

granulosa, dan mereduksi ikatan IGF pada jaringan techa.FGF bersama Extra

Celluler Matrix (ECM) dapat mengatur stabilitas dan penggabungan Growth

Factor (Amstrong dan Webh, 1997).

Menurut McGee dan Hsueh (2000), ada dua tahap utama yang terjadi

padaperkembangan folikel yaitu initial recruitment dan cyclic cecruitment.

Page 22: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

7

Initialrecruitment adalah perkembangan folikel yang berlangsung terus-menerus

mulaidari pembentukan folikel sampai sebelum masa pubertas. Perkembangan

initerjadi pada folikel tahap primordial, dimana perkembangan folikel

tidakmempengaruhi hormon gonadtropin. Folikel akan berkembang dari

berkembangakan mengalami dormansi. Oosit mulai tumbuh namun

perkembangan tidakmencapai germinal vesicle breakdown (GVBD). Sedangkan

cyclic recruitmentdimulai setelah masuk masa pubertas. Perkembangan terjadi

pada folikel tahapantral dimana perkembangan telah dipengaruhi oleh FSH dan

LH. Folikel yangtidak berkembang akan mengalami atresi. Oosit berkembang

sempurna darimampu mencapai tahap germinal vesicle breakdown (GVBD).

Folikel primordial terdiri atas satu oosit primer yang dibungkus

olehselapis sel folikel pipih yang saling melekat melalui desmosom, kemudian

dilapisioleh sebuah membran basal yang merupakan batas antara folikel avaskular

danstroma di sekitarnya. Selama siklus birahi, terjadi perubahan struktur dari

folikelsampai akhirnya mencapai folikel de graff, perkembangan

folikelmelibatkan perubahan pada sel-sel folikel, oosit primer dan stroma di

sekitar.

Oogenesis adalah suatu proses pembentukan, pertumbuhan dan

pematangan dari gamet betina. Dimulai sejak embrional sampai setelah dilahirkan

dan mencapai puncakya pada saat ovulasi (Austin dan short, 1982).

Proses pembentukan sel kelamin betina terdiri dari dua tahap. Tahap yang

pertama adalah periode proliferasi yang terjadi pada saat prenatal sampai sebelum

atau sesaat setelah fetus dilahirkan. Selama itu proses yang terjadi adalah sel

benih primordial mengalami deferensiasi menjadi oogenia dan mengalami

Page 23: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

8

pembelahan mitosis. Beberapa oogenia akan terus bermitosis dan berdiferensiasi

menjadi oosit primer. Oosit primer dengan inti pada tahap profase I dan dikelilingi

sel epitel disebut folikel primordial (Hafez, 2000). Menjelang lahir semua inti

oosit primer telah selesai membelah dan tertahan pada profase I tahap diploten.

Inti oosit pada tahap ini dicirikan dengan adanya membrane inti yang utuh dan

nucleolus yang jelas disebut germinal vesicle (GV) (Van den Hurk,et al.,1997).

Pertumbuhan oosit terbagi dua fase. Fase I oosit tumbuh cepat dan erat

hubungannya dengan perkembangan folikel ovari. Pada folikel primordial

aktivitas proliferasi sel epitel pipih yang mengelilingi sel telur akan dimulai

dengan membentuk satu lapis sel kuboid yang mengelilingi sel telur dan disebut

folikel primer. Sel kuboid akan terus berproliferasi membentuk multilayer sel

granulosa yang akan mengelilingi sel telur dan tahap ini disebut dengan folikel

sekunder. Proliferasi akan terus berlanjut hingga folikel membentuk antrum

folikuli yang disebut folikel tersier (Van den Hurk et al., 1997). Folikel tersier

akan dikelilingi oleh sel teka internal dan eksternal yang menghasilkan estrogen.

Antrum folikuli akan bertambah besar seiring dengan perkembangan sel folikel

tersier. Pertumbuhan folikel selanjutnya akan tergantung pada hormon

gonadotropin untuk mencapai folikel de graaf yang diakhiri dengan proses

ovulasi. Bertambah besar diameter folikel ovari Merupakan ciri dari fase II.

Pertumbuhan folikel dalam ovarium dipengaruhi oleh hormon Gonadotropin serta

sekresi hormon dari sel granulosa dan sel teka (Hafez, 2000).

Tingkat Kematangan Oosit Secara In Vitro

Pematangan oosit diluar ovarium atau tubuh hewan disebut dengan

pematangan in vitro atau In Vitro Maturation (IVM). Pematangan in vitro

Page 24: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

9

merupakan salah satu tahap yang penting dari rangkaian produksi embrio in vitro.

Oosit untuk memproduksi embrio in vitro yang diperoleh dari ovarium hewan

betina yang masih hidup maupun betina mati dari Rumah Potong Hewan (RPH)

dengan tanpa memperhatikan fase siklus birahi (Ball,et al.,1984).

Maturasi oosit secara in vitro adalah pemasakan oosit muda atau

pengaktifan oosit muda dalam medium diluar tubuh (Prochaska,et al.,1993).

Keberhasilan pembuahan secara in vitro didukung oleh proses maturasi oosit in

vitro yang baik (Down, 1993). Shamsuddin et al (1993) menyatakan bahwa

maturasi oosit in vitro dimaksudkan agar oosit primer dapat berkembang menjadi

oosit sekunder yang akan melakukan proses pembelahan meiosis dengan normal

dan sempurna sehingga menghasilkan sel telur yang siap untuk dibuahi.

Oosit akan mengalami proses maturasi secara spontan adanya media

yang sesuai (Hafez,2000). Proses pematangan oosit memerlukan medium yang

berfungsi sebagai tempat penyediaan nutrisi dan sekaligus tempat pembuangan

metabolit. Zat nutrisi yang diperlukan harus selektif dan mempunyai konsentrasi

yang sesuai, serta memiliki pH, susunan gas dan osmolaritas larutan fisiologis

(Supriatna dan Pasaribu, 1992). pH harus dijaga tetap sekitar 7,2 dan 7,4,

sedangkan osmolaritas ialah ukuran konsentrasi partikel terlarut dalam suatu

larutan (osm/L).

Selama maturasi oosit sapi, struktur kromatin dalam oosit yang belum

matang (Immature) berupa membran nukleus utuh (GV) dimulai dari pembelahan

meiosis pertama dilanjutkan dengan pembelahan meiosis kedua menunjukkan

bahwa 90% dari oosit sapi mengalami pematangan pada 24 jam setelah dilakukan

kultur. Membran nukleus menghilang setelah 5-6 jam GVBD dan M-I dicapai

Page 25: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

10

setelah 12 jam dan M-II dicapai setelah 19 jam dan diperkirakan pematangan inti

tersebut lebih cepatin vitro daripada in vivo(Gordon,1997).

Pada proses pematangan sel telur secarain vitro dipengaruhi oleh beberapa

faktor diantaranya medium pematangan dan lingkungan penyimpanan (Incubator).

Medium standar untuk pematangan in vitro sel telur sapi adalah TCM-199. Agar

menunjang keberhasilan proses maturasi in vitro dilakukan inovasi komposisi dan

penambahan suplemen untuk mendapatkan kondisi medium yang optimsl.

Suplemen seperti serum, hormon estradiol, hormon gonadotropin (FSH dan LH),

mineral, glukosa, piruvat dan asam amino ditambahkan untuk membantu

transformasi inti (Sirard dan Blondin 1996).

Menurut Sirard dan Blondin (1996), lima faktor yang sangat berkompeten

dalam keberhasilan pematangan oosit adalah morfologi cumulus, ukuran folikel,

kesehatan folikel, stimulasi ovarium dan prosedur pematangan oosit sebelum

dimulainya inkubasi. Laju proses maturasi oosit sapi, domba dan babi relatif

lambat karena membutuhkan waktu untuk sintesa protein aktif untuk persiapan

pemulaan meiosis. Pada sapi proses maturasi inti secara in vivo membutuhkan

waktu kurang lebih 24 jam. Selama maturasi, inti oosit sapi yang masuk tahap

profase pada awal meiosis I mengalami pengurangan kompemen kromosom

menjadi haploid (n=30 kromosom). Pada tahap molekuler, di dalam oosit

mengalami banyak interaksi antara siklus molekuler dengan substrat target pada

inti dan sitoplasma.

Penilaian terhadap kualitas oosit sebagai salah satu upaya melakukan

seleksi terhadap oosit yang akan dimaturasi sangat mempengaruhi keberhasilan

produksi embrio in vitro. Morfologi oosit berdasarkan kekompakan dan jumlah

Page 26: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

11

lapisan sel kumulus berakibat positif terhadap maturasi, fertilisasi dan

pertumbuhan serta perkembangan embrio in vitro (De Wit, et al., 2000; Bilodeau -

Goeseels dan Panich, 2002). Tidak satu pun oosit yang gundul mampu mencapai

embrio tahap 8-16 sel (Khurana dan Niemann, 2000).

Pematangan oosit meliputi pematangan sitoplasma dan inti (Rahman et al.,

2001) yang merupakan proses yang sangat penting dalam mendukung

keberhasilan fertilisasi dan perkembangan embrio selanjutnya. Proses pematangan

inti yang berhubungan dengan aktivitas sintesis RNA, ditandai dengan perubahan

inti dari fase diploten ke metafase II. Membran inti akan mengadakan penyatuan

dengan vesikel membentuk Germinal Vesicle (GV) dan kemudian akan

mengalami pelepasan membran inti Germinal Vesicle Break Down (GVBD).

Setelah GVBD terbentuk, kromosom dibungkus oleh mikrotubulus dan

mikrofilamen yang sangat mempengaruhi keberhasilan pembelahan meiosis.

Seiring dengan proses tersebut maka kebutuhan oksigen oosit akan meningkat.

Oosit yang telah mengalami GVBD selanjutnya akan mencapai tahap metafase I.

Metafase I (M-I) terjadi setelah 12-14 jam inkubasi dan diikuti oleh tahap anafase

(A-I) dan telofase (T-I) yang berlangsung relatif sangat rendah dan berbeda nyata

dengan kelompok lainnya. Hambatan terhadap perkembangan folikel yang

dihasilkan oleh folikel dominan ternyata juga mempengaruhi kualitas oosit yang

dihasilkan.

Faktor yang dapat mendukung keberhasilan tingkat pematangan inti oosit

menurut Zheng and Sirard (1992) adalah terjadinya ekspansi sel-sel kumulus,

pematangan inti yang mencapai M-II dan pematangan sitoplasma. Kualitas oosit

juga dipengaruhi oleh suhu dan waktu penyimpanan ovarium sebelum dikoleksi.

Page 27: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

12

Umumnya oosit diambil dari ovarium dalam jangka waktu 1 sampai 2 jam setelah

pemotongan, dengan suhu penyimpanan sekitar 30˚C, karena penurunan suhu

oosit yang diaspirasi dari folikel sampai jauh dibawah suhu fisiologik tubuh

berpengaruh negatif pada viabilitas oosit, dalam bentuk abnormalitas pada semua

fase meiosis. Hal ini didukung dengan penelitian Zhanget., al (1990) yang

menunjukkan bahwa ovarium yang dibawa pada suhu 0 sampai 2˚C menghasilkan

angka fertilisasi dan perkembangan embrio yang nyata lebih rendah dibandingkan

dengan ovarium yang dibawa pada suhu 18 sampai 20˚C ataau 30 sampai 32 ˚C.

Hubungan yang sangat dekat antar sel-sel granulosa dan sel-sel kumulus disekitar

oosit akan mengakibatkan pematangan oosit tertahan untuk tidak mengalami

meiosis, apabila hubungan ini meregang oleh faktor-faktor pematangan oosit atau

sel-sel kumulus yang terekspansi, akan mengakibatkan gap junction dengan cepat

menurun jumlahnya, sebagai akibat akses penghambatan berlangsungnya meiosis

berkurang drastis. Oleh karenanya terjadi ekspansi sel-sel kumulus atau aktivasi

sel-sel kumuluss, digunakan sebagai salah satu indikasi kematangan oosit

(Pisastyani,2003).

Peran sel kumulus setiap spesies berbeda, pada oosit tanpa sel-sel kumulus

dapat berkembang sampai tingkat pematangan M-II dan dapat difertilisasi.

Pematangan dapat dilakukan pada oosit yang gundul (tanpa sel-sel kumulus)

asalkan keadaan sitoplasma tersebut masih bagus dan kompak (Cox,et al., 1993).

Fertilisasi In Vitro

Fertilisasi merupakan proses kompleks yang menghasilkan penggabungan

dua gamet, penataan ulang jumlah kromosom dan dimulainya perkembangan

individu baru. Proses fertilisasi ini hanya dapat terjadi setelah didahului proses

Page 28: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

13

kapasitasi spermatozoa (Gordon, 2003). Selain kapasitasi, motilitas sperma yang

tinggi juga diperlukan untuk mampu mencapai fertilisasi. Fertilisasi in vitro

merupakan tahapan selanjutnya setelah IVM. Prosedur umum yang dilakukan

diawali dengan penyiapan spermatozoa. Teknik preparasi spermatozoa, medium

preparasi dan medium fertilisasi yang digunakan dalam rangkaian proses IVF

berbeda-beda tergantung pada masing-masing laboratoriumnya dan penelitinya.

Masuknya sperma ke dalam sel telur menyebabkan terjadinya rangkaian

perubahan yang cepat yaitu penyelesaian pembelahan meiosis; penyatuan

pronukleus jantan dan betina serta gerakan kompleks dari zat-zat dalam

sitoplasma telur; laju konsumsi oksigen dan sintesis protein dalam telur spesies

tertentu meningkat. Segera setelah fertilisasi, di dalam embrio mulai ada sel-sel

yang memisahkan diri dan terjadi pembelahan sel yang berturut-turut (Salisbury

dan VanDemark, 1985). Dalam tingkat ini embrio mengalami pembelahan

menjadi sel-sel yang ukurannya berangsur-angsur mengecil sampai ukurun

tertentu. Tiap sel yang terbentuk disebut blastomer (Sagi, 1999).

Pada saat fertilisasi in vitro dan perkembangan embrio, sel cumulus

memberikan pengaruh positif. Tingkat pembelahan dan perkembangan embrio

lebih rendah ketika oosit dibebaskan dari sel kumulus, namun tidak diikuti oleh

tingginya tingkat pembelahan dan perkembangan selanjutnya (Nandi et al., 1998).

Sel-sel kumulus mampu meningkatkan area kontak antara spermatozoa dan oosit

(Cox et al., 1993) dan dengan memilih subpopulasi sperma yang mampu

berinteraksi dengan oosit.

Page 29: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

14

Tahapan penting sebelum fertilisasi yaitu preparasi oosit dan spermatozoa,

preparasi oosit dan spermatozoa sangat penting agar proses fertilisasi dapat

terjadi.

Preparasi oosit yaitu maturasi oosit, langkah ini penting karena salah satu

syarat keberhasilan fertilisasi adalah oosit yang matang, yaitu oosit yang sudah

mencapai tahap metafase II. Menurut Boediono et al. (2000) fertilisasi hanya bisa

terjadi pada oosit yang telah mencapai tahap metafase II. Media yang digunakan

di setiap tahap produksi embrio in vitro berbedabeda. Media maturasi oosit yang

digunakan adalah TCM-199, media ini memiliki kemampuan yang baik untuk

pematangan oosit secara in vitro, dan merupakan standar media yang digunakan

untuk pematangan oosit kambing dan sapi (Takahashi et al. 1996).

Preparasi spermatozoa meliputi pencucian spermatozoa dari pengencer dan

kapasitasi spermatozoa. Kapasitasi spermatozoa secara in vitro dilakukan untuk

meningkatkan motilitas dan kemampuan spermatozoa dalam pelepasan tudung

akrosom dan asam hyaluronidase. Fungsi asam hyaluronidase untuk

memudahkan spermatozoa menembus zona pelusida dan membran vitelin oosit.

Kapasitasi spermatozoa dilakukan di dalam media SWS, media tersebut

merupakan BO solution yang ditambah heparin dan kafein yang berfungsi untuk

kapasitasi spermatozoa. Menurut Im et al. (1995) BO solution yang ditambah

heparin dan kafein berguna sebagai agen kapasitasi spermatozoa agar dapat

memfertilisasi oosit.

Tahapan maturasi oosit, kapasitasi sepermatozoa, fertilisasi in vitro, dan

kultur embrio dilakukan di dalam inkubator CO2 dengan kadar CO2 5%. Kadar

tersebut berguna untuk menjaga pH media tetap stabil. Kondisi pH yang terlalu

Page 30: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

15

tinggi atau rendah akan menyebabkan kestabilan media terganggu, dan bersifat

toksik terhadap embrio. Suhu inkubator selama maturasi adalah 38.5˚c, suhu

tersebut merupakan suhu yang optimal untuk maturasi oosit dan kultur embrio

(Lequaere et al. 2003). Waktu maturasi oosit dilakukan selama 18-24 jam, waktu

tersebut berguna untuk mencegah oosit membelah secara partenogenesis (Sirard

dan Blodin 1996).

Media kultur embrio adalah CR1aa, media tersebut merupakan semi

defined medium yang telah digunakan untuk embrio pada sapi (Rosenkrans et al.

1993; Rosenkrans dan First 1994). Media CR1aa mengandung media minimum

dasar penting yang merupakan campuran dari asam amino, vitamin, garam-garam

anorganik, ribonucleosides dan deoxyribonucleosides (Sagirkaya et al. 2004).

Media yang digunakan untuk maturasi, fertilisasi, dan kultur embrio ditambah

FCS, fungsi FCS sendiri merupakan faktor pertumbuhan yang berfungsi

mendukung pematangan oosit dan perkembangan embrio dengan cara

meningkatkan proliferasi dan diferensiasi sel (Margawati 1999). Selain

ditambahFCS, media juga ditambah antibotik. Antibiotik yang ditambahkan

yaitupenicillin dan streptomycin yang berguna untuk mencegah kontaminasi

mikroorganisme di dalam media. Kontaminasi mikroorganisme yang akan

mengganggu perkembangan oosit dan embrio dengan cara menghabiskan nutrisi

yang dibutuhkan oleh oosit dan embrio, dan menghasilkan sisa-sisa metabolisme

yang dapat meracuni oosit dan embrio.

Prinsip bioteknologi fertilisasi in vitro (FIV) sendiri adalah pembuahan sel

telur oleh spermatozoa di luar tubuh hewan betina yang direkayasa untuk

Page 31: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

16

memproduksi embrio dalam jumlah banyak, dan dapat meningkatkan mutu

genetik (Vicanco dan Mackie 2001).

Kriopreservasi Oosit

Kriopreservasi oosit yaitu penyimpanan oosit pada suhu yang sangat

rendah (-196˚ C) dengan penambahan krioprotektan. Tujuan kriopreservasi adalah

untuk penyimpanan, pemeliharaan menjamin dan mempertahankan kelangsungan

hidup sel sertamemperbaiki lingkungan alamiah. Teknik kriopreservasi yang baik

akan dapat mempertahankan viabilitas oosit dengan cara mereduksi fungsi dan

aktivitas metabolik sel tanpa terjadinya kerusakan membran maupun organel sel.

Dengan demikian teknik kriopreservasi dapat digunakan untuk menyimpan

sumber genetik dalam bentuk beku (Wahjuningsih, 2013).

Teknik kriopreservasi dapat dibedakan atas teknik kriopreservasi

konvensional (conventional slowfreezing) dan kriopreservasi secara cepat (rapid

freezing). Teknik kriopreservasi konvensional adalah teknik kriopreservasi yang

lebih menekankan pada proses pembekuan lambat. Pada teknik ini, suhu

diturunkan secara bertahap dengan mesin pendingin yang dapat diprogram.

Dengan teknik ini kristal es masih terbentuk, baik ekstraseluler maupun

intraseluler, sehingga dapat menyebabkan terjadinya kerusakan sel. Hal ini

disebabkan oleh elektrolit yang menumpuk akan merusak dinding sel sehingga

pada waktu pencairan kembali permeabilitas membran plasma akan menurun dan

sel akan mati. Pembentukan kristal es kemungkinan berkaitan dengan perubahan

tekanan osmotik dalam fraksi yang tidak mengalamipembekuan (Watson, 2000).

Teknik kriopreservasi cepat adalah proses pemadatan konsentrasi

krioprotektan (ekstraseluler maupun intraseluler). Pada teknik ini, sebagian besar

Page 32: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

17

air di dalam sel dikeluarkan sebelum terjadi pembekuan intraseluler dan

digantikan dengan krioprotektan, sehingga pada saat pembekuan tidak terjadi

kristal es (Valerdiet al., 2009). Prosesnya meliputi (a) dehidrasi, yaitu proses

pergantian cairan sitoplasma dengan larutan krioprotektan melalui proses difusi ke

dalam sel; (b) pembekuan, tahapan pada saat sel atau organ dan larutan berada

dalam nitrogen cair (-196˚C) membentuk padatan solid glass; (c) warming, yaitu

tahap terjadinya perubahan kembali bentuk padatan menjadi cair; serta (d)

rehidrasi, yaitu proses masuknya kembali air ke dalam sel untuk menggantikan

kedudukan krioprotektan.

Penggunaan prosedur kriopreservasi oosit secara komersial masih sangat

terbatas salah satu tantangan adalah membuat metode kriopreservasi oosit yang

menjamin viabilitas tinggi. Terdapat dua metode kriopreservasi yaitu metode

konvensional dan vitrifikasi. Kedua metode ini mempunyai kelebihan dan

kekurangan. Pada awal studi tentang kriopreservasi, dilakukan kriopreservasi

menggunakan metode konvensional, namun saat ini metode vitrifikasi lebih sering

diaplikasikan. Kelebihan dari metode vitrifikasi adalah pemadatan cairan tanpa

melalui pembentukan kristal es (Shaw et al., 2000). Metode tersebut sederhana,

murah, dan tidak memerlukan alat khusus untuk menurunkan suhu secara

bertahap sehingga mudah diaplikasikan ditempat yang memiliki kontainer

nitrogen cair.

Krioprotektan

Krioprotektan adalah zat kimia non elektrolit yang berungsi mereduksi

pengaruh letal proses pemaparan kriopreservasi sel diantaranya baik yang berupa

Page 33: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

18

efek larutan maupun pembentukan kristal es ekstra atau intraseluler sehingga

dapat menjaga viabilitas sel setelah kriopreservasi (Ernawati, 1999).

Krioprotektan adalah zat kimia nonelektrolit yang berperan dalam

mengurangipengaruh mematikan selama pembekuan baikberupa pengaruh larutan

maupun adanyapembentukan kristal es sehingga viabilitas seldapat dipertahankan

(Blanco et al,.2000).

Berdasarkan sifat permeabilitas membrane, krioprotektan terbagi menjadi

2 kelompok : (1) krioprotektan yang dapat keluar masuk melalui membrane

disebut krioprotektan intraseluler dan biasanya memiliki ukuran molekul yang

kecil, (2) krioprotektan dengan molekul besar, tidak dapat menembus membrane

sel disebut krioprotektan ekstraseluler (Wahjuningsih, 2013).

Syarat-syarat krioprotektan antara lain, tidak beracun, mampu menembus

membrane sel, mampu menahan elektrolit-elektrolit (Chao dan Liao, 2001).

Menurut stoss (1983) krioprotektan dibedakan menjadi dua, yaitu krioprotektan

yang dapat menembus dinding sel. krioprotektan yang dapat menembus dinding

sel (intraseluler) berfungsi memberikan perlindungan yang lebih baik pada laju

pendinginan yang lambat, misalnya methanol, dimethyl sulfoxide (DMSO), etilen

glukol (EG) dan gliserol. Krioprotektan yang tidak penembus dinding sel

(ekstraseluker) lebih sesuai untuk laju pembekuam cepat, misalnya monosakarida,

polisakarida, polivinilpirolidon (PVP), destran dan protein.

Penambahan krioprotektan dapat memelihara keutuhan membran dan

meningkatkan potensial osmotik media sehingga cairan di dalam sel mengalir

keluar dan terjadi dehidrasi.Krioprotekan yang umum digunakan adalah DMSO,

gliserol, PEG, sorbitol, dan manitol.Senyawa dalam krioprotektan dapat dipisah

Page 34: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

19

menjadi dua, yaitu senyawa yang dapat masuk ke dalam sel (permeating agent)

seperti DMSO, gliserol (pada suhu tertentu) dan yang tidak dapat masuk ke dalam

sel (non permeating agent) seperti sukrosa dan gula alkohol (manitol, sorbitol)

(Ika dan Ika, 2003).

Sulfoxide Dimetil (DMSO), adalah senyawa organosulfur dengan rumus

(CH3) 2SO. Cairan tidak berwarna ini merupakan pelarut polar aprotik yang dapat

melarutkan baik senyawa polar dan nonpolar dan larut dalam berbagai pelarut

organik maupun air (Gazali dan Tambing,2001).

Penggunaankrioprotektan DMSO sebagai krioprotektan pertama dalam

bidang kriopreservasi ditemukan secara kebetulan pada tahun 1948 karena

kesalahanpemberian label pada bahan atau media pembekuan sperma unggas.

Sejak temuan tersebut keberhasilan yang pesat dilaporkan pada pembekuan

sperma dan embrio. Krioprotektan DMSO dan gliserol, keduanya memiliki berat

molekul yang rendah, telah dikenal sebagai bahan cryoprotectant terhadap

kerusakan dari suhu dingin selama lebih dari 30 tahun.

Page 35: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

20

METODE PENELITIAN

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai April 2017 bertempat

di Laboratorium Fertilisasi dan In Vitro gedung Pusat Kegiatan Penelitian (PKP)

Universitas Hasanuddin, Makassar.

Materi Penelitian

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah tabung reaksi, labu ukur,

gelas ukur, timbangan analitik, pinset, mikroskop, scalpel, inkubator CO2 (pada

suhu 37˚ C, 5% CO2) pipet pasteur, petri sekali pakai (Nunc, diameter 3,5 Cm),

alat sterilisasi (Oven dan autokla), ater bath, mikro pipet, laminar air flo, bunsen,

gunting bedah, pipet volumentrik, objek glass, cover glass, caan petri, selang inus

dan refrigerator.

Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah ovarium sapi bali yang

diperoleh dari Rumah Potong Hewan (RPH) Tamangapa, Kota Makassar, Provinsi

Sulawesi Selatan, kemudian oosit diseleksi berdasarkan keadaan sitoplasma dan

sel-sel kumulus. Bahan lain yang digunakan yaitu tissu, alkohol 70%, aquades,

NaCl fisiologis 0,9%, nitrogen cair -196˚ C, vaselin, enzim hyaluronidase (Sigma,

USA), Krioprotektan DMSO, paraffin, mineral oil (sigma chemical co. St. Louis

MO, USA), aceto orcein, asam asetat dan ethanol absolut, medium IVF (In Vitro

Fertilisasi), medium IVM (In Vitro Maturasi).

Page 36: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

21

Metode Penelitian

a. Rancangan penelitian

Penelitian menggunakan metode eksperimental laboratorium

berdasarkananalisis Chi-Square 2x2 Contingency Tabledengan 4 perlakuan

dengan konsentrasi larutan masing-masing berbeda, susunan sebagai berikut.

A : Kontrol

B : Oosit dengan penambahan Krioprotektan DMSO 5 %

C : Oosit dengan penambahan Krioprotektan DMSO 10 %

D : Oosit dengan penambahan Krioprotektan DMSO 15 %

Page 37: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

22

b. Prosedur penelitian

Diagram alir prosedur selama penelitian :

Gambar 1. Diagram Alir Prosedur Penelitian

Koleksi Oosit

Ovarium yang diperoleh dari RPH Tamangapa Makassar menggunakan

Larutan fisiologis NaCl 0.9% terlebih dahulu dibilas dua kali pada NaCl 0.9% .

Kemudian ovarium di cacah pada petridish yang telah dicuci dan dikeringkan dan

diisi media koleksi (Phosphat Buffered Saline/PBS + 10% Fetal Bovine

Serum/FBS). Kemudian oosit diseleksi berdasarkan gradenya.

Kriopreservasi

Pengambilan ovarium di RPH (Rumah Potong Hewan)

Pencacahan ovarium Osit (PBS (Phosphat Buffered

saline) +10%Serum)

Seleksi dengan klasiikasi oosit

Kriopreserasi krioprotektan DMSO (0 %, 5%, 10%, 15%) + PBS(Phosphat

Buffered Saline) (24 jam)

24

9

Thawing / pengenceran kembali (20 detik)

Media Maturasi(24 jam)

Media Fertilisasi(16-18 jam)

Evaluasi Tingkat Kematangan inti &

Tingkat Fertilisasi

Page 38: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

23

Oosit yang telah terseleksi dan telah melalui dua kali pencucian,

selanjutnya dipindahkan ke media pembekuan dengan pemaparan media

krioprotektan DMSO (Dimethyl sulfoxide) dengan konsentrasi (0%, 5%, 10% dan

15%) selama 2 jam dan dimasukkan kedalam straw. Kemudian disimpan didalam

kontainer berisi nitrogen selama 24 jam.

Thawing /Pengenceran kembali

Setelah kriopreservasi selama 20 menit selanjutnya oosit di thawing

kemudian mengevaluasi perkembangan oosit dari segi morfologi serta viabilitas.

Maturasi Oosit In Vitro

Oosit yang telah dikriopreservasi selanjutnya dicuci pada media maturasi

sebanyak 2 kali. Oosit dimasukkan pada dish maturasi yang terdiri atas TCM 199

(2000 μl), BSA (0.0060 mg), hormon PMSG (20 μl), hormon HcG (20 μl) dan

antibiotik gentamycin (4 μl). Kemudian dilapisi menggunakan mineral oil ± 3 ml

hingga menutupi seluruh permukaan media maturasi. Selanjutnya dimasukkan ke

incubator selama 24 jam.

Fertilisasi In Vitro

Untuk tahap fertilisasi pertama straw semen beku di thawing pada suhu 37o

C selama 20 detik, selanjutnya dimasukkan ke dalam mediafertilisasi yang telah

disiapkan kemudian disentrifuge selama 5 menit pada kecepatan 1800 rpm.

Setelah disentrifuge, supernatant dibuang. Selanjutnya semen yang mengendap

ditambahkan lagi dengan media ferilisasi yang kedua kemudian disentrifuge

kembali dengan waktu dan kecepatan yang sama. Setelah disentrifuge,

Page 39: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

24

supernatant dibuang dan selanjutnya semen diencerkan dengan media fertilisasi

dan dibuat dalam bentuk drop pada dish fertilisasi. Lapisi menggunakan mineral

oil ± 3 ml hingga menutupi seluruh permukaan media fertilisasi tersebut. Oosit

yang telah dimaturasi dikeluarkan dari incubator, selanjutnya diambil dan

diletakkan pada media pencuci, kemudian dicuci sebanyak 2 kali. Oosit yang telah

dicuci menggunakan media fertilisasi selanjutnya di masukkan ke dalam dish

fertilisasi yang telah berisi drop sperma. Selanjutnya dimasukkan ke dalam

incubator selama 5-6 jam.

Fiksasi dan Pewarnaan Sel

Mengambil oosit yang telah difertilisasi dan diletakkan pada preparat

kemudian ditutup dengan cover glass menggunakan vaselin (perekat) lalu

direndam pada cairan etanol + asam asetat selama 3 hari kemudian dibilas dengan

etanol absolut selama 1 jam lalu dilakukan pewarnaan, Sebelum diwarnai,

preparat dikeringkan menggunakan tissue. Lalu warnai menggunakan aseto orcein

2% kemudian bilas kembali dengan asam asetat 25%.Oosit diperiksa di bawah

Evaluasi tingkat kematangan inti dan tingkat fertilisasi

Pengamatan tingkat pematangan oosit dilakukan dengan menghitung jumlah oosit

pada setiap tahap perkembangan oosit.

1. Meliputi fase germinal vesicle (GV) ditandai dengan adanya membrane

inti dan nucleus terlihat jelas ditepi.

2. Fase germinal vesicle breaking down (GVBD) ditandai dengan robeknya

membrane inti sehingga nukleus tidak terlihat jelas)

Page 40: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

25

3. Fase methapase – I (M-I) ditandai dengan adanya kromosom homolog

yang berpasangan dan berderet dibidang aquator

4. Fase Methapase – II(M-II) ditandai adanya badan kutub I dan susunan

kromosom yang sama dengan tahapan M-I.

Tingkat fertilisasi terbagi menjadi tiga tahap yaitu :

1. pronukleus-0 (PN-0), ditandai dengan tidak adanya pembentukan

pronukleus

2. pronukleus-1 (PN-1), ditandai dengan terbentuknya satu pronukleus

3. pronukleus-2 (PN-2),ditandai dengan terbentuknya dua pronukleus atau

diploid dan fertilisasi.

Page 41: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

26

c. Analisis data

Tingkat kematangan dan fertilisasi oosit dianalisis dengan Chi-Square2x2

Contingency Tabledengan rumus sebagai berikut:

𝑿𝟐 =[(𝑩𝒙𝑪) − (𝑨𝒙𝑫)]² 𝑬

(𝑨 + 𝑪)(𝑩 + 𝑫)(𝑨 + 𝑩)(𝑪 + 𝑫)

PERLAKUAN X Y

DMSO 1 A B A+B

DMSO 2 C D C+D

A+C A+C B+D A+B+C+D = E

Sumber : Steel R.G. Torrie J.H (1991).

Page 42: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

27

HASIL DAN PEMBAHASAN

Tingkat Maturasi Oosit Sapi Bali dengan Penambahan DMSO

(Dhymethilsulfoxide) Berbeda

Hasilpengamatanpada osit sapi bali mulai dari oosit yang belum dimaturasi

hingga oosit setelah pewarnaan dengan berbagai tingkat pematangan inti

dapatdilihat pada Gambar 2 dan Gambar 3.

A : Oosit ssebelum kriopreservasi

B : Oosit setelah kriopreservasi

C : Oosit setelah maturasi

D : Oosit setelah fertilisasi

Gambar 2. menunjukan kondisi oosit sebelum dikriopreservasi (A) pada

gambar (B) menunjukan oosit dengan sel kumulus yang gelap hal ini dipengaruhi

pada saat proses kriopreservasi, pada gambar (C) terlihat oosit dengan sel cumulus

terekspansi sempurna dan pada gambar (D) terlihat oosit setelah fertilisasi yang

sudah bersih dari sel cumulus hal dikarenakan oosit terlebih dahulu sudah

dibersihkan dari sel cumulus dengan cara pemipetan berulang-ulang. Martino

(1993) mengatakan bahwa untuk mengetahui tingkat maturasi inti dilakukan

pewarnaan aseto-orcein 1% sebelumnya dilakukan pembersihan tingkat ekspansi

A B

C D

Page 43: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

28

kumulus dengan cara mekanik atau denudasi (pemipetan berulang-ulang).Hasil

pematangan oosit disajikan pada Gambar 3.

Gambar 3. Tahapan Maturasi Oosit setelah dikriopreservasi dan dimatangkan

Kembali

A :OosittahapGV

B :OosittahapGVBD

C :OosittahapM-I

D :Oositmatangtahap M-II

Gambar 3. menunjukkan adanya tingkat perkembangan oosit yang

berbeda-beda pada setiap tahapan. Tahap GV menunjukan adanya membrane inti

dan nucleus terlihat jelas ditepi, tahap GVBDdicirikan dengan robeknya

membrane inti sehingga nukleus tidak terlihat jelas, tahap M-1terlihat dengan

adanya kromosom homolog yang berpasangan dan berderet dibidang

aquator,tahapM-2adanya badan kutub I dan susunan kromosom yang sama dengan

tahapan M-I kriteria ini sesuai dengan Wahjuningsih (2013) yang menyatakan

bahwa tingkat maturasi inti didasarkan atas fase-fase pembelahan meiosis yang

dialami oosit yang meliputi :

D

A B

C

Page 44: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

29

GV (Germinal Vesicle) : membran inti dan nukleus tampak jelas, benang-benang

kromatin berkondensasi dan menyebar merata mengelilingi nukleus

GVBD (Germinal Vesicle Breaking Down) : membran inti dan nukleus

menghilang serta setahap demi setahap bahan-bahan kromatin mengalami

kondensasi menjadi bentukan kromosom yang dapat dibedakan.

M-I (Metafase I) : pembentukan individu bivalen dengan siasmata, berikutnya

penyelesaian siasmata, pembentukan tetrad, pemisahan dua kumpulan kromosom

kearah kutub-kutub yang berlawanan (anafase I, pemisahan sempurna dari dua

kumpulan kromosom (tolefase I)

M-II (Metafase II) : kromosom pada masing-masing kutub mengumpul pada

masing-masing bidang equator (metafase II plate). Pada saat ini mulai terbentuk

polar bodi I. Kromosom polar bodi satu melakukan pembelahan kembali seperti

pada saat metafse I oosit primer, sedangkan kromosom pada oosit sekunder

mengumpul secara sempurna di kutub.

Data hasil perhitungantingkat maturasi oosit Sapi Bali pada berbagai tahap

dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit Sapi Bali

terhadap rata-rata persentase tingkat maturasi oosit

Perlakuan Ʃ oosit Tingkat Pematangan Inti (%)

GV GVBD M-I M-II

A 36 2 (5.6) 0 (0.0) 11 (30.5) 23 (63.8)

B 36 2 (5.6) 4 (11.1) 9 (25.0) 21 (58.3)

C 36 1 (2.8) 0 (0.0) 6 (16.7) 29 (80.6)

D 36 0 (0.0) 1 (2.8) 14 (38.9) 21 (58.3)

Keterangan : A : (DMSO 0%), B : (DMSO 5%), C (DMSO 10%), D (DMSO

15%). GV: germinal vesicle, GVBD: germinal vesicle breakdown,

M–I: metaphase I, M–II: metaphase II

Page 45: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

30

Hasil analisis Chi-Square 2X2 Contingency table menunjukkan bahwa

pengaruh penambahan krioprotektan DMSO pada saat kriopreservasi oosit tidak

berpengaruh nyata (P>0.05) terhadap tingkat maturasi oosit.

Pada tahap Germinal Vesicle (GV) persentase tingkat kematangan oosit

yang tertinggi pada oosit perlakuan A yaitu 5.5% kemudian oosit perlakuan C

yaitu 5.5% dan perlakuan C 2.7% sedangkan pada perlakuan D tidak tidak terlihat

pada tahap Germinal Vesicle (GV). Pada tingkat Germinal Vesicle Dreak Down

(GVBD) hanya oosit perlakuan B dan D saja yang terlihat yaitu 11.1% dan 2.7%.

pada tahap M-1 (methapase-I) persentase tingkat kematangan oosit tertinggi

terlihat pada oosit perlakuan D 38.8% kemudian perlakuan A 30.5%, lalu

perlakuan B 25% dan perlakuan C 16.6% . pada tahap M-II (methapase-II) tingkat

kematangan tertinggi terlihat pada oosit perlakuan A yaitu mencapai 346.1%

kemudian oosit perlakuan D 27.7%, B 25% dan C 11.1%.

Tingkat maturasi atau tingkat pematangan inti ditandai dengan

terekspansinya sel kumulus hal ini disebabkan karena sel kumulus membantu

sintesis protein untuk pembentukan zona pelusida dan sebagai penyedia nutrisi

bagi oosit melalui zat metabolit yang dihasilkan. Menurut Setiadi (2002)

menyatakan bahwa sel-sel kumulus berperan penting dalam proses pematangan

oosit secara in vitro, yang selanjutnya juga akan mempengaruhi kualitas embrio

yang dihasilkan. Saat pematangan, sel-sel kumulus berperan dalam menyediakan

nutrisi bagi oosit serta membantu sintesis protein untuk pembentukan zona

pelusida (Mayes, 2002). Apabila sel-sel kumulus dilepaskan sebelum pematangan,

maka akan terjadi keterlambatan dalam proses pematangan oosit atau bahkan

tidak terjadi pematangan.

Page 46: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

31

Pada proses pematangan sel telur secarain vitro dipengaruhi oleh beberapa

faktor diantaranya medium pematangan dan lingkungan penyimpanan (Incubator).

Medium standar untuk pematangan in vitro sel telur sapi adalah TCM-199. Agar

menunjang keberhasilan proses maturasi in vitro dilakukan inovasi komposisi dan

penambahan suplemen untuk mendapatkan kondisi medium yang optimsl.

Suplemen seperti serum, hormon estradiol, hormon gonadotropin (FSH dan LH),

mineral, glukosa, piruvat dan asam amino ditambahkan untuk membantu

transformasi inti (Sirard dan Blondin 1996).

Ada dua sisi yang berlawanan dari penggunan krioprotektan, yaitu selain

dapat melindungi sel, krioprotektan dapat menimbulkan kerusakan pada sel akibat

toksitasnya (Fahry et al., 1990). Konsentrasi krioprotetkan yang rendah dalam

medium krioprotektanakan menyebabkan kerusakan oosit akibat terbentuknya

kristal-kristal es intraseluler, akan tetapi konsentrasi krioprotektan yang tinggi

dapatbersifat toksik dan menyebabkan kerusakan osmotik pada oosit (Arav et al,.

1993).

Tingkat Fertilisasi Oosit Sapi Bali dengan Penambahan DMSO

(Dhymethilsulfoxide) Berbeda

Oosit yang telah melalui proses maturasi selama 24 jam kemudian

difertilisasi selama 18 jam di dalaminkubator dengan CO2 dan suhu yang sama

saat dimaturasi. Sebelum proses fertilisasi, sperma beku terlebih dahulu di

thawing dan diencerkan pada media fertilisasi. Adapun hasilpengamatan tingkat

pembentukan pronukleus pada oosit sapi bali yang di fertilisasisecara in vitro

setelah pewarnaan dapat dilihat pada Gambar 4.

Page 47: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

32

Gambar 4. Tingkat pembentukan pronukleus

A :Oosit tahap 1 PN

B :Oosit fertil tahap 2 PN

Gambar 4. menunjukan adanya perubahan bentuk oosit yang terlihat

pembentukan pronukleus I (A) dan pembentukan pronukleus II (B). Menurut

Wahjuningsih 2013 oosit terfertilisasi dapat dapat diamati melalui pewarnaan

aceto orcein 1% dan dapat diketahui oosit terfertilisasi normal (mempunyai 2

pronukleus) dan oosit yang mengalami polispermi (mempunyai lebih dari 2

pronukleus). Penentuan tingkat fertilisasi pada oosit dilakukan berdasarkan

terbentuknya pronukleus jantan dan betina. Keadaan 2 pronukleus atau lebih dari

dua pronukleus menunjukan bahwa keadaan masing-masing oosit adalah diploid

dan poliploidi.

Pada saat fertilisasi in vitro dan perkembangan embrio, sel cumulus

memberikan pengaruh positif. Tingkat pembelahan dan perkembangan embrio

lebih rendah ketika oosit dibebaskan dari sel kumulus, namun tidak diikuti oleh

tingginya tingkat pembelahan dan perkembangan selanjutnya (Nandi et al., 1998).

Sel-sel kumulus mampu meningkatkan area kontak antara spermatozoa dan oosit

(Cox et al., 1993) dan dengan memilih subpopulasi sperma yang mampu

berinteraksi dengan oosit.

B A

Page 48: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

33

Data hasil perhitungantingkat fertilisasi oosit Sapi Bali pada berbagai tahap

dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit Sapi Bali

terhadappersentase tingkat fertilisasi oosit

Perlakuan Ʃ oosit Tingkat fertilisasi (%)

PN-0 PN-1 PN-2

A 36 26 (72.2) 7 (19.4) 3 (8.3) a

B 36 24 (66.6) 6 (16.6) 6 (16.6) a

C 36 11 (30.5) 3 (8.3) 22 (61.1) b

D 36 25 (69.4) 10 (27.7) 1 (2.7) a

Keterangan : Huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan

perbedaan yang sangat nyata (P<0.01). A : (DMSO 0%), B :

(DMSO 5%), C (DMSO 10%), D (DMSO 15%). PN-0 :

Pronukleous-0, PN-1 : Pronukleus-1, PN-2 : Pronukleus-2.

Hasil analisis 2x2 Contingency Table menunjukkan bahwa tingkat PN-2

(Pronukleus-2) peda perlakuan Csangat berbeda nyata (P<0.01) dengan tingkat

fertilitas perlakuan A, B dan D, sedangkan antara perlakuan A, B dan D tidak

berbeda nyata.Tidak ada perbedaan yang nyata pada setiap perlakuan pada tingkat

fertilitas PN-0 dan PN-1.

Pada tahap PN-0 (Pronukleus-0) presentase tingkat fertilisasi tertinggi

pada oosit perlakuan A yaitu 72.2% dan tingkat fertilitas terendah pada perlakuan

C yaitu 30.5%. pada tingkat PN-1 (Pronukleus-1) persentase tertinggi pada

perlakuan D yaitu 27.7% dan tingkat fertilisasi terendah pada perlakuan C yaitu

8.3%. Pada tahap PN-2 (Pronukleus-2) persentase tertinggi yaitu pada perlakuan

C 61.1% dan terendah pada perlakuan D yaitu 2.7%.

Tingginya persentase tingkat fertilitas (PN-2) pada perlakuan C

menunjukan bahwa penggunaan DMSO membantu mengurangi kerusakan

dibanding dengan control, perlakuan B dan perlakuan D. Konsentrasi

Page 49: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

34

krioprotektan yang (control dan perlakuan B) rendah dalam medium krioprotektan

akan menyebabkan kerusakan oosit akibat terbentuknya kristal-kristal es

intraseluler, akan tetapi konsentrasi krioprotektan yang tinggi (perlakuan D)

dapat bersifat toksik dan menyebabkan kerusakan osmotik pada oosit. ( Arav,

1993). Oleh karena itu sangat penting usaha untuk mengurangi kerusakan sel,

karena stress osmotik ataupun kecaman kimiawi yang disebabkan tingginya

konsentrasi krioprotektan yang digunakan. Ada dua sisi yang berlawanan dari

penggunaan krioprotektan, yaitu selain dapat melindungi sel, krioprotektan dapat

menimbulkan kerusakan pada sel akibat pengaruh toksitasnya (Fahry et al., 1990).

Keberhasilan pelaksanaan program fertilissi in vitro sangat ditentukan oleh

kualitas dan tingkat oosit yang berhasil dibuahi dan berkembangnya sampai pada

tahap blastosis. Oosit yang telah mencapai tahap methapase-II, yang ditandai

dengan adanya ekspansi sel kumulus akan dibuahi oleh satu spermatozoa yang

sudah mengalami kapasitasi dan membentuk zigot. Proses fertilisasi diawali oleh

spermatozoa melewati sel-sel kumulus, lalu melekat pada zona pelusida dengan

perantaraan ikatan enzim reseptor, kemudian menembus zona pellusida dan

selaput vitelin (viteline membrane) masuk kedalam sitoplasma oosit (Gordon,

1994).

Kriopreservasi oosit diduga dapat mengakibatkan menurunnya tingkat

fertilisasi dan perkembangan embrio sebagai akibat terjadinya kerusakan struktur

dan morfologi serta menurunnyabahkan hilangnya viabilitas oosit (Arav et al,

1993; Hyttel et al,. 2000). Kerusakan morfologi yang terjadi dapat berbentuk

pecahnya zona pelucida, disintegrasi membran plasma, kerusakan bahan serta

Page 50: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

35

organel sitoplasma seperti sitoskeleton, kromosom, butir-butir korteks dan butir-

butir lemak (Fuku et al, 1995; Zhu et al,. 1998).

Prinsip dari kriopreservasi adalah pengeluaran sebagaian besar air dari sel-

sel sebelum membeku intraseluler, sehingga terjadi penurunan volume air di

dalam sel. Untuk menghindari terjadinya kristal es intraseluler, harus diinduksi

terbentuknya kristal es ekstraseluler sehingga terjadi proses dehidrasi karena

osmolaritas cairan diluar sel lebih tinggi dibanding cairan didalam sel, maka

cairan intraseluler akan tertarik keluar. Jika dehidrasi tidak terjadi akan terbentuk

kristal-kristal es besar intraseluler yang dapat merusak sel dengan hebat. Pada

keadaan tertentu pengeluaran air terlalu banyak merusak dan letal karena sel-sel

mengalami pengeringan (Wahjuningsih, 2013).

Kerusakan sel dapat terjadi akibat dari peningkatan osmolaritas media

kriopreservasi sehingga krioprotektan menjadi bersifat racun, kerusakan fisik

karena terbentuknya kristal es ekstraseluler atau terjadinya osmotic swelling

(Kazai, 1996; Wetzels,1996).

Page 51: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

36

PENUTUP

Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa

penambahan krioprotektan DMSO kedalam media kriopreservasi optimum pada

level 10% dengan tingkat maturasi (M-II) dan fertilisasi (PN-II) masing-masing

sebesar 80.6% dan 61.1%.

Saran

Untuk mencapai tingkat maturasi dan fertilisasi yang tinggi dengan

penambahan krioprotektan DMSO sebagai media krioprotektan disarankan

menggunakan DMSO dengan konsentrasi 10%.

Page 52: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

37

DAFTAR PUSTAKA

Amstrong, M and Webh 1997, A Handbook of Human Resource Management,

Elex Media Komputindo, Jakarta.

Arav, A., D. Shebu, and Mattioli, M. 1993. Osmotic and Cytotoxic Study Of

Vitrification Of Immature Bovine Oocytes.J. repord and Fert. 99:353-

358

Austin, C.R. and R. V. Short. 1982. Reproduction in Mammals. Book I.University

Press. Cambridge. 103.

Ball, G.D, M.L. Leibfreid, R.W.A.X. Lenz, B.D. Bavister and N.L. First.

1984.Factors affecting succcesfull in vitro fertilization of Bovine

FollicularOocyte. Biol. Reprod.28;717-725.

Bilodeau-Goeseels, S. and P. Panich 2002.Effects of oocyte quality

ondevelopment and transcriptional activity in early bovine

embryos.Anim.Reprod. Sci. 71 (3-4): 143-155.

Blanco,J.M.,G. Gee, D.E. Wildtand A.M. Donoghue. 2000. Species variation in

osmotic, cryoprotectant and Cooling rate tolerance in poultry, eagle

and pregrine Falcon spermatozoa. Bio.Reprod. 63: 1164-1171.

Boediono A, Rusiyantono Y, Mohamad K, Djuwita I, Harliatien. 2000.

Developmental competence of caprine oocyte after in vitro maturation,

fertilization and culture. Media Veteriner.7 (4): 11-17.

Chao, N. H and I. C, Liao. 2001. Cryopreservation o finfish ad selfish gametes

and embryos. Aquaculture, 197 : 161 – 189

Cox JF, Hormazabal J, Santa Maria A. 1993. Effect of cumulus on in vitro

fertilization of bovine matured oocytes.Theriogenology 40:1259-1267.

De Wit, A.A., Y.A. Wurth, T.A. Kruip. 2000. Effect of ovarian phase

andfolliclequality on morphology and developmental capacity of the

bovinecumulus- oocyte complex. J. Anim. Sci. 78(5): 1277-1283.

Down, S. M. 1993.Factors Effecting The Resumption of meiotic Maturation

inMammals Oocytes.Theriogenol.39;65-79.

Ernawati, Y. 1999. Efisiensi implantasi LH-RH dan 17a-Metil testosteron serta

pembekuan sperma dalam upaya peningkatan produksi benih ikan

jambal siam. Disertasi. Program pascasarjana, institut pertanian bogor.

Fahry, G.M,. Lilley, T.H Linsdel, Douglas, M.S and Meryman,H.T. 1990.

Cryoprotectans Toxicity and Cryoprotectans reduction. Cryobiology

27:247-268.

Page 53: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

38

Fortune, J.E., G.M. Rivera, A.C.O.Evans, A.M. Turzillo. 2001. Differentiation

ofdominant versus subordinate follicles in cattle. Biol. Reprod. 65:

648-654.

Frandson, R.D., W.L. Wilke,dan A.D. Fails. 2003. Anatomy of The Female

Reproductive System. In. Anatomy and Physiology of Farms

Animals.6th ed. Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore-Maryland,

USA.

Fuku, E.J., Xia, L. and Downey, B.R., 1995. Ultrastructural changes in Bovine

oocyte cryopreservaced by vitrification. Crybiologi 32(2):139156

Gazali, M. dan Tambing.2001.KriopreservasiSelSpermatozoa.Hayati 9 (1) : 27-

32.

Gordon, I. 1993. Controlled reproduction in sheep and goats. Cambridge: CAB

International. pp 53-85.

Gordon, I. 2003. Laboratory production of cattle embryos. Dublin: CAB

International. pp 30-142; 277-290.

Hafez, B. dan E.S.E. Hafez. 2000. Anatomy of Female Reproduction. In

Reproduction in Farm Animals.Hafez, B. and E.S.E. Hafez (Eds.).7rd

ed. Lippincott Williams & Wilkins, USA.

Hamny. 2006. StudiMorfologi Organ ReproduksiKancil (Tragulusjavanicus)

denganTinjauanKhususpadaOvarium, PerkembanganFolikel,

danPematanganOositIn Vitro. Tesis.SekolahPascasarjana,

InstitutPertanian Bogor. Bogor. Kiernan.

Hyttle, P., Vajta, G. and Callasen, H. 2000. Vitrification Of bovine oocytes with

the open pulled straw method : ultra-Structural consequences. Mol.

Reprod and Dev 58:80-88

IkaRoostikaTambunandanIka

Mariska.2003. PemanfaatanTeknikKriopreservasidalam

Penyimpanan Plasma

NutfahTanaman. BalaiPenelitianBioteknologidanSumberdaya

GenetikPertanian. Bogor

Im KS, Kim HJ, Chung KM, Kim HS, Park KW.1995. Effects of ovary type,

oocyte grade, hormone, sperm concentration and fertilization medium

on in vitro maturation, fertilization, and development of bovine

follicular oocytes. AJAS. 8: 123-127.

Jalaluddin M. 2014. Morfometridankarakteristikhistologiovariumsapiaceh

(BosIndicus) selamasiklus estrus.JurnalMedikaVeterinaria. ISSN :

0853-1943.

Kaiin EM, Said S, Tappa B. 2008. Kelahirananaksapihasilfertilisasisecarain vitro

denganspermahasilpemisahan.Media Peternakan.31(1): 22-

Page 54: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

39

28.Labetubun J, Siwa IP. 2011. Kualitas spermatozoa

kaudaepididimissapibalidenganpenambahanlaktosaataumaltosa yang

dipreservasipadasuhu 3–5oC. JurnalVeteriner. 12(3): 200-207.

Kasai, M., 1996 simple and efficient method for vitrification of mammalian

embryos.Anim. Reprod.Sci 42:67-75

Khurana, N.K. and H. Niemann. 2000. Effects of oocyte quality,

oxygentension,embryo density, cumulus cells and energy substrates

oncleavageandmorula/blastocyst formation of bovine

embryos.Theriogenology 54 (5): 741-756.

Kimura, Y., N. Manabe, S. Nishihara, H. Matsushita, C. Tajima, S. Wada, and H.

Miyamoto. 1999. Up-Regulation of the α2,6- sialyltransferase

messenger ribonucleic acid increases glycoconjugates containing

α2,6-linked sialic acid residues in granulose cells during follicular

atresia of porcine ovaries. Biol. of Repro. 60:1475-1482.

Lequaere AS, Marchandase J, Moreau B, Massip A, Donay I. 2003.Cell cycle at

the time of maternal zygotic.J BiolReprod. 69: 1707-1713.

Margawati ET. 1999. The effective of growth factor on in vitro embryo

development. J Med Vet. 6 (3) : 27 – 34.

Martino, A,. Mogas, T,. Palomo, M.J. and Paramio, M.T. 1993. Effect Of Method

of Recovery on the in vitro Maturation and Fertilization of prepubertal

goat Oocytes, 9th scientific meeting. European embryo transfer

association. Paris.

Mayes. 2002. Ovary. http://www.theses.ulayal.ca/2002/20201.html.

McGee E.A.A.J.W.Hsue, 2000 Initial and recruitment of ovarium follicles,

Endocrinol Rev 21:200-214

Nandi S. Chauhan MS, Palta P. 1998. Effect of cumulus cells and sperm

concentration on cleavage rate and subsequent embryonic

development of buffalo (BubalusBubalis) oocytes matured and

fertilized in vitro. Theriogenology 50(8):1251-1262.

Novalina, Hasugian. 2009. Transfer EmbrioBalaiEmbrioTernakCipelang Bogor.

Pisastyani, Herwin, 2003.Kompetensi tingkatkematanganoositdomba

yangdimatangkanpada TCM 199 danmem eagle in vitro.FKH.IPB.

Priedkalns, J. 1989. SistemReproduksiBetina. Dalam:

BukuTeksHistologiVeteriner II. Brown, D. (Ed.). EdisiKetiga. UI

Press, Jakarta.

Page 55: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

40

Prochaska, R.,R. Durnford, P.S. Fiser And G.J. Marcus. 1993.

PaerthenogeneticDevelopment Of Activated in vitro Mtured Bovine

Oocytes,Theriogenol.39;103-105.

Pujo M, Bejar ML, Paramio T. 2004. Depelopmental competence of heifer

oocytes selected using briliantcrsyl blue (BCB) tes. Theriogenology.

61: 35-44.

Rahman, N.U., M. Sarwar, H.A. Samad. 2001. In vitro production of

bovineembryos -a review. Asian-Aust. J. Anim. Sci. 14: 1342-1351.

Rosenkrans CF, First NL. 1994. Effects of free amino acids and vitamins on

cleavage and development rate of bovine zygotes in vitro. J Anim Sci.

72: 434-437.

Rosenkrans CF, Zeng QG, Mcnamara GT, Schoff PK, First NL. 1993.

Development of bovine embryos in vitro as affected by energy

substrates. JBiolReprod. 49: 459-462.

Sagi, M. 1999. Embriologi perbandingan pada vertebrata. Fajar Offset.

Yogyakarta.

Sagirkaya H, Yagmur M, Nur Z, Soylu MK. 2004. Replacement of fetal calf

serum with synthetic serum substitute in the in vitro maturation

medium: Effects on maturation, fertilization and subsequent

development of cattle oocytes in vitro. Turk.J Vet Anim Sci. 28 : 779-

784.

Salisbury, G.W. dan N.L. Van Demark.1985. Fisiologi Reproduksi dan Inseminasi

Buatan pada Sapi. (Diterjemahkan oleh Djanuar, R.).Gadjah Mada

University Press.Yogyakarta.

Setiadi, M.A., 2002. Effect of co-cultur with follicle shell on cumulus expansion

and nuclear maturation porcine oocytes in vitro.Reprotech. I:87-91.

Shamsuddin, M.B., Larsson and H.R. Martinez. 1993. Maturation-related

changesin Bovine Oocytes Under Different Culture

Conditions.J.Anim.Reprod.Scl.31;49-58.

Shaw, J.M., A. Oranratnachai, and A.O.Tr o u n s o n . 2 0 0 0 . F u n d ame n t

alcryobiology of mammalian oocytes andovarian tissue.

Theriogenology.53:59 72.

Sirard MA, Blodin P. 1996. Oocyte maturation and in vitro fertilization in cattle.J

Anim Reprod Sci. 42 : 417-426.

Sirard, M.A., and P. Blondin. 1996. Oocytes maturation and IVF cattle. Anim.

Reprod. Sci. 42:417-426.

Page 56: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

41

Steel R.G. dan Torrie J.H. 1991. Prinsip dan prosedur Statistika. Edisi 2.

Gramedia. Jakarta.

Stoos, J. 1983. Fish gametes preservation and spermatozoan physiology. In fish

physiology Vol. IX part B. Academis press Inc.london. p : 305- 350

Supriatna, I., dan F.H. Pasaribu. 1992. In vitro

Fertilisasi,TransferEmbriodanpembekuanembrio.Bogor;PAUBiotekno

gi IPB.pp;1-56.

Takahashi Y, Hishinuma M, Matsui M, Tanaka H, Kanagawa H. 1996.

Development of in vitro matured/fertilized bovine embryos in a

chemically defined medium: influence of oxygen concentration in the

gas atmosphere. JVet Med Sci. 58(9): 897-902.

Valerdi, M.R., P. Eftekhari-Yazdi, L. Karimian, F.HassaniAnd B. Movaghar.

2009. Vitrificationversus slow freezing gives excellent survival,

postwarming embryo morphology and pregnancyoutcomes for human

cleaved embryos. J. Assist.Reprod. Genet. 26: 347 – 354.

Van den Hurk, R.M. Bevers and J.F.Beckers. 1997. In vivo and in

vitrodevelopment of pre antral follicles, Theriogenology,47:73-82.

Vicanco, Mackie HW. 2001. Embrio transfer in ovine and caprineIn :

Biotechnology of reproduction. Palma G, editor. Buenos Aires

(AGT):EdicionesInta.

Vieira, A.D., A. Mezzalira, D.P. Barbieri, R.C.Lehmkuhl, M.I.B. Rubin, and G.

Vajta.2002.Calves born after open pulled strawvitrification of

immature bovine oocytes.Cryobiology. 45:91-94.

Wahjuningsih, S. 2013. Kriopreservasi Oosit Sapi. UB Press. Malang.

Watson, P.F. 2000.The causes of reduced fertility with cryopreserved

semen.Anim. Reprod. Sci. 60 – 61:481 – 492.

Wetzels, A.M.M 1996. Cryopreservasionstheory .in : M. bras (editor) IVF

Laboratory aspects of in vitro fertilisasi. N.V. organon, Netherland

Zhang, L., E.G. Blakewood, R.S. Denniston and R.A. Goolke. 1990. The effect

ofovary temperature on oocyte maturation in vitro fertilization

andembryo development in cattle.Proc.So. Section

Amer.DairySci.Assoc.p:16

Zheng, Y.S., and M.A. Sirard.1992.The Effect of Sera, Bovine Serum

Albuminand Follicular Cell on In Vitro Maturation and Fertilization of

PorcineOocyte.3 Theriogenology.

Zhu, S., yoshizawa, M. and muramatsu, S. 1998.Analysis of fertilizability of

bovine Oocytes Cryopreservasi in various cryoptectans after in vitro

Page 57: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

42

maturasi and their chromosomes as the first cleavage division. J.

Mamm Ova Research 15:37-42

Page 58: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

43

RIWAYAT HIDUP

Hilma Utami Putri (I111 13 073), lahir di Kabupaten Mejene,

Sulawesi Barat, pada tanggal 7 Desember 1995, merupakan

anak dari pasangan Bapak Abd. Hattas S. Dan Ibu

Kusumawati I. Mengenyam Pendidikan Tingkat Dasar Pada

Sekolah Dasar 33 Majene (2007), kemudian melanjutkan

pendidikan lanjutan pertama pada SMP 3 Pallangga (2010) kemudian melanjutkan

pendidikan menengah pada SMA 1 Pallangga (2013), sekarang kuliah pada salah

satu Perguruan Tinggi Negeri, Fakultas Peternakan, Universitas Hasanuddin

Makassar Dengan Program Srtata Satu (S1) (2013-2017).

Page 59: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

44

Lampiran 1.KomposisiMedia MaturasiOositSecaraIn Vitro

No NamaBahan Volume

1 TCM-199 1800 µl

2 Serum FBS (fetal bovine serum) 200µl

3 PMSG (pregnant mare serum gonadotropin) 20µl

4 hCG(human chorionic gonadotropin) 20µl

5 Gentamycin 4µl

Lampiran 2.KomposisiMedia FertilisasiSecaraIn Vitro

No NamaBahan Volume

1 Ultra pure water 50 ml

2 NaCl (natrium/sodium chloride) 0,2629 gram

3 KCL (kalium chloride) 0,0447 gram

4 NaHCo3 (natrium bicarbonate) 0,1050 gram

5 NaH2PO4 (natriumdihydrogenphosphate monohydrate) 0,0030 gram

6 MgSO47H2O (magnesium sulfat-heptahydrate) 0,0061 gram

7 Sodium lactate 60% syrup 0,095 ml

8 Hepes 0,1191 gram

9 CaCl22H2O (calcium chloride_dihydrate) 0,0588 gram

10 Sodium pyruvate 0,0110 gram

11 Caffeine anhydrous 0,0194 gram

12 BSA (fatty acid free) fraksi V 0,2500 gram

13 Gentamycin 10 µl

Lampiran 3.KomposisiMedia Krioprotektan DMSO (Dhymethilsulfoxide)

% DMSO µl DMSO µl PBS ml

0 % - 5000 5000

5 % 250 4.750 5000

10 % 500 4.500 5000

15 % 750 4.250 5000

Page 60: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

45

LAMPIRAN 4. DATA TINGKAT MATURASI PENAMBAHAN DMSO

DENGAN KONSENTRASI BERBEDA (%)

Perlakuan Ulangan Jumlah

Oosit

GV GVBD M-1 M-2

A

(0%

DMSO)

1 9 2 (22.2) 0 3 (33.3) 4 (44.4)

2 9 0 0 3 (33.3) 6 (66.60

3 9 0 0 2 (22.2) 7 (77.7)

4 9 0 0 3 (33.3) 6 (66.6)

Total 36 2 (5.5) 0 11 (30.5) 23 (63.8)

B

(5 %

DMSO)

1 9 0 3 (33.3) 2 (22.2) 7 (77.7)

2 9 1 (11.1) 0 2 (22.2) 5 (55.5)

3 9 0 0 2 (22.2) 5 (55.5)

4 9 1 (11.1) 1 (11.1) 3 (33.3) 7 (77.7)

Total 36 2 (5.5) 4 (11.1) 9 (25) 21 (58.3)

C

(10%

DMSO)

1 9 1 (11.1) 0 2 (22.2) 6 (66.6)

2 9 0 0 2 (22.2) 7 (77.7)

3 9 0 0 1 (11.1) 8 (88.8)

4 9 0 0 1 (11.1) 8 (88.8)

Total 36 1 (2.7) 0 6 (16.6) 29 (80.5)

D

(15%

DMSO)

1 9 0 0 4 (44.4) 5 (55.5)

2 9 0 0 4 (44.4) 5 (55.5)

3 9 0 0 3 (33.3) 6 (66.6)

4 9 0 1 (11.1) 3 (33.3) 5 (55.5)

Total 36 0 1 (2.7) 14 (38.8) 21 (58.3)

Page 61: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

46

LAMPIRAN 5. DATA TINGKAT FERTILISASI PENAMBAHAN DMSO

DENGAN KONSENTRASI BERBEDA (%)

Perlakuan Ulangan Jumlah

Oosit

PN-0 PN-1 PN-2

A

(0% DMSO)

1 9 8 (88.8) 1 (11.1) 0

2 9 6 (66.6) 0 3 (33.3)

3 9 6 (88.8) 3 (33.3) 0

4 9 6 (66.6) 3 (33.3) 0

Total 36 26 (72.2) 7 (19.4) 3 (8.3)

B

(5 % DMSO)

1 9 7 (77.7) 0 2 (22.2)

2 9 5 (55.5) 2 (22.2) 2 (22.2)

3 9 5 (55.5) 2 (22.2) 2 (22.2)

4 9 7 (77.7) 2 (22.2) 0

Total 36 24 (66.7) 6 (16.7) 6 (16.6)

C

(10%

DMSO)

1 9 3 (33.3) 1 (11.1) 5 (55.5)

2 9 3 (33.3) 1 (11.1) 5 (55.5)

3 9 2 (22.2) 1 (11.1) 6 (66.6)

4 9 3 (33.3) 0 6 (66.6)

Total 36 11 (30.5) 3 (8.3) 22 (61.1)

D

(15%

DMSO)

1 9 6 (66.6) 3 (33.3) 0

2 9 6 (66.6) 3 (33.3) 0

3 9 7 (77.7) 1 (11.1) 1(11.1)

4 9 6 (66.6) 3 (33.3) 0

Total 36 25 (69.4) 10 (27.7) 1 (2.7)

Page 62: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

47

Lampiran 7. Dokumentasi Penelitian

Ovarium sapi bali Oosit setelah di fertilisasi

Oosit setelah direkatkan dengan vaselin Preparat oosit kualitas A, B dan C

Preparat yang difiksasi Proses pengamatan oosit

Bahan untuk medium maturasi Bahan untuk medium fertilisasi

Page 63: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

48

Bahanuntukfiksasi Bahanuntukpewarnaan

Tissudanalkohol 70% untuksterilisasi Disk maturasidanfertilisasi

Media transport NaCl 0.9% Syringefilter

Page 64: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

49

Scalpel, pinsetdanguntingbedah Minitube

Oven untuksterilisasikering Inkubator

Timbangananalitik Stirrer

Centrifuge Kontainerpenyimpananspermabeku

Page 65: PENGARUH KRIOPROTEKTAN DMSO (DIMETHYL … · Pengaruh penambahan DMSO pada saat kriopreservasi oosit sapi bali ... bentuk, dan ukuran ovarium ... Proses pertumbuhan folikel,

50

Pipet yang dimodifikasi Bunsen untukmemodifikasi pipet

Mikropipetdan tip Pipetvolumentrik

DMSO