4. GatingProcesul de gating (termen intraductibil n romn ~ cele mai apropiate aproximaii ar fi activare sau comand) reprezint probabil cel mai important grup de proprieti ale canalelor ionice, care asigur extraordinara diversitate a funciilor modularea cii de permeaie lor. Gatingul se refer la prin modificri (porul hidrofil)

conformaionale ale subunitilor constituente, asemntor deschiderii i nchiderii unor pori. Ideea este formulat iniial de Hodgkin i Huxley, pornind de la constatarea c, la variaii brute de potenial, conductanele Na+ i K+ au o reacie instantanee linear, ns sunt modulate de o serie de procese cu cinetic lent (ms) declanate de variaii de potenial, numite activare i inactivare. n funcie de stimulul care determin activarea se poate realiza o clasificare funcional a canalelor ionice. Distingem dou categorii principale: canale activate de voltaj (voltage-gated) i activate de ligand (ligand-gated). n plus, n structura diferiilor receptori ntlnim i canale activate de ali stimuli: mecanici, termici, chimici (de exemplu, variaii ale pH extracelular).

4.1 Tehnica patch-clamp Pe parcursul ultimilor 60 ani asistm n biofizic la o dezvoltare inimaginabil a metodelor de evideniere i studiere a proprietilor canalelor ionice la nivel microscopic. Problema se nscrie ntr-o categorie mai larg, i anume determinarea corelaiilor ntre proprietile macroscopice, la nivelul unui ansamblu statistic, i cele microscopice, obinute prin msurtori directe pe o singur molecul, n condiii staionare sau non-staionare. Prima evideniere a caracterului discret, discontinuu, al fluxurilor ionice transmembranare pasive a fost realizat n anii 60-70 printr-o metod statistic foarte elegant numit analiza fluctuaiilor. Metoda a fost

iniiat de Verveen i Derksen, continuat de Katz i Miledi, Stevens, DeFelice, Neumcke, pe curenii de plac motorie activai de ACh, i pe canalele de Na+ sensibile la amilorid din epitelii de Lindemann, Van Driessche, Helman i Baxendale. Ea se bazeaz pe calcularea varianei curentului printr-un ansamblu statistic de canale meninute n voltageclamp, pentru n eantioane:

i2 =

1 n ( xi x ) = n i =1

2

xn

2 i

2 x xi n

1 + x 2 = xi2 x 2 n

Considernd c fiecare din cele N canale ale ansamblului are aceeai probabilitate a strii deschise, p, i acelai curent unitar, i, obinem urmtoarele expresii pentru variana curentului i pentru curentul i2 = Npi 2 Np 2 i 2 = Np (1 p )i 2 macroscopic mediu I:I = Npi

Din aceste expresii se poate calcula valoarea curentului unitar i i a densitii de canale N, dac se estimeaz corect probabilitatea strilor de non-conductan. n plus, dac relaxrile din fluctuaii sunt monoexponeniale, spectrul de putere al transformatelor n frecven ale nregistrrilor are o formS( f ) = S ( 0) 1 + ( 2f ) 2

Lorentzian:

unde

reprezint constanta de timp a relaxrii, la fel ca n modelul

Hodgkin-Huxley:

=

1 1 = + 2f c

Fig. 4.1 Fluctuaii de curent induse de ACh la nivelul plcii motorii meninute n voltage clamp, prin deschiderea aleatoare a receptorilor nicotinici. n dreapta, densitatea spectral de putere obinut prin transformarea Fourier a semnalului de curent, fitat cu funcii Lorentz. Se observ creterea corner frequency (fc) la creterea temperaturii sau la depolarizare.

Fig 4.2 Curenii de gating ai canalelor de Na+ nregistrai la nivelul axonului gigant de calmar. n timp ce curentul de gating de tip ON are o cinetic mai rapid dect curentul ionic, cel de tip OFF are exact aceeai cinetic, ceea ce demonstreaz efectul de imobilizare a sarcinii de gating prin inactivare.

O alt tehnic de studiu rafinat a proceselor de gating dezvoltat n anii 70 se bazeaz pe ipoteza lui Hodgkin i Huxley, i anume existena unor sezori de voltaj, a cror deplasare n cmpul electric transmembranar intens (estimat la 80 mV/40 = 20,000,000 V/m) trebuie s genereze un minuscul curent electric, numit curent de gating. Considernd valoarea sarcinii echivalente de gating, calculat de Hodgkin & Huxley, de aproximativ 6 sarcini elementare/canal, putem estima din intensitatea curenilor de gating densitatea de canale. nregistrarea acestor cureni este dificil, deoarece au o cinetic rapid i o intensitate cu cteva ordine de mrime mai mic dect a curenilor ionici, deci este necesar nlturarea acestora din urm cu ajutorul unor blocani peptidici puternici (neurotoxine, precum TTX sau STX), care s nu afecteze ns modificrile conformaionale

induse de variaiile de voltaj. n plus, curenii de leakage prin conductane de background i tranzienii capacitivi pot fi eliminai prin aplicarea a dou pulsuri de voltaj egale i de sens contrar, pornind de la aceeai valoare de holding, i sumarea ulterioar a celor dou nregistrri, ce duce la anularea acestor componente datorit proprietilor lor de simetrie. De aceea, curenii de gating au fost denumii i asymmetry (nonlinear) capacitive transients. Pentru decelarea lor este necesar n plus medierea coerent a mai multor nregistrri, ceea ce duce la anularea zgomotului din diferite surse, a crui distribuie este aleatoare, deci valoarea medie n fiecare moment tinde la 0, n timp ce semnalul util este amplificat cu fiecare nregistrare adugat. Metoda a fost dezvoltat pe sisteme cu o densitate mare de canale: pe receptorii dihidropiridinici din tubulii transversali ai muchilor scheletici de Schneider & Chandler, i pe de acum clasicul axon gigant de calmar de Keynes & Rojas i Armstrong & Bezanilla. Un exemplu de aplicaie l reprezint descoperirea efectului de imobilizare a sarcinii de gating de tip OFF: n timp ce curentul de gating de tip ON are o cinetic mai rapid dect curentul ionic de Na+, cel de tip OFF are aceeai constant de timp de relaxare ca i curentul ionic, deci trecerea canalelor de Na+ ntr-o stare de non-conductant dup activare duce la blocarea senzorilor de voltaj. O alt categorie de metode sunt cele de evideniere direct a fluctuaiilor unitare de conductan obinute prin activitatea canalelor ionice. Primele salturi de conductan au fost observate n 1969 de Bean et al. prin ncorporarea unei proteine bacteriene, purificat de Mller et al. (1962), numit EIM (excitability-inducing material), n bistraturi lipidice. Un progres a fost trecerea la gramicidin, un antibiotic polipeptidic de origine microbian (Hladky & Haydon, 1972), a crei importan ca model molecular de permeaie a fost discutat n

capitolul precedent. Ulterior i alte canale ionice izolate n lipozomi au fost ncorporate n bistraturi artificiale. ns cea mai important modernizare a metodelor electrofiziologice a fost adus de tehnica patch clamp (n traducere ad literam petic fixat), iniiat de un grup de biofizicieni germani: B. Sakmann, E. Neher, F. Sigworth, O. Hamill, i continuat de un grup din ce n ce mai larg de entuziati. Primele experimente relevante (1976) au constat n nregistrarea curenilor uni-canal (aceast variant poart numele de single-channel recording) prin receptorii nicotinici de ACh de pe placa motorie de broasc prin presarea unei pipete cu vrful polizat termic coninnd suberyldicholin, un analog sintetic al ACh. n 1980 metoda este mbuntit substanial prin aplicarea unei presiuni negative (suciune) n pipet, ceea ce duce la realizarea unui contact intim ntre bistratul lipidic i sticl n zona vrfului (gigaseal), ducnd la creterea rezistenei de izolaie de la cteva zeci de M la peste 1 G, ceea ce duce la o rezoluie foarte bun a fluctuaiilor unitare de conductan ale canalului/canalelor active din peticul de membran astfel delimitat.

Fig. 4.3 Circuitele electronice folosite n metoda patch-clamp. n stnga, principiul de funcionare al convertorului I-V: putem fixa potenialul la nivelul pipetei aplicnd o tensiune variabil pe o rezisten de feedback (Rfeedback) i msurnd eroarea cu un instrument foarte sensibil. Aceasta aciune este realizat de un amplificator diferenial cu tranzistoare FET n etajul de intrare, cu cureni de poart extrem de mici, deci curentul prin pipet este egal cu curentul de feedback. Astfel, tensiunea la ieire este IpipetteRfeedback. n dreapta, circuitul electric echivalent al membranei i convertorului I-V.

Aceast incredibil realizare este un rezultat al apariiei unei noi generaii de amplificatoare operaionale, avnd n etajul de intrare tranzistoare cu efect de cmp, al cror curent de poart este redus la doar 0.5-10 pA. O analiz a surselor de zgomot din etajul de intrare (headstage) identific 3 tipuri diferite:-

zgomotul

termic

(thermal

noise)

datorat

agitaiei

termice

a

purttorilor mobili de sarcin, descris n anii 1920 de Johnson i Nyquist. Acesta este independent de frecven (zgomot alb) i Gaussian, avnd o densitate de putere proporional cu

S (2Hz ) = ( 4k BT ) / R

temperatura absolut a mediului: Valorile medii ptratice (rms(BW)) pentru o band de 10 KHz sunt 0.4 pA pentru 1 G, 0.13 pA pentru 10 G, 0.04 pA pentru 100 G; astfel se explic avantajul adus de mbuntirea rezistenei de izolaie (Rseal sau Rshunt) i de reducerea suprafeei de membran a patchului (crete Rm i scade Cm)-

zgomotul

"de

mpucturi

(shot

noise)

datorat

caracterului

discontinuu al micrii purttorilor individuali de sarcin. El este tot independent de frecven i Gaussian, avnd o densitate spectral de putere:S(2Hz ) = 2 Iq

unde q este sarcina electric elementar (1.610-19 C). Sursa este curentul de leakage al porilor tranzistoarelor cu efect de cmp, de aceea amplificatorul de headstage trebuie ales cu grij, astfel nct

biasul intrrilor s fie minim. Un curent de poart de 5 pA genereaz o densitate spectral a zgomotului de mpucturi echivalent cu zgomotul termic al unui rezistor de 10 G-

zgomotul de voltaj al amplificatorului poate fi modelat introducnd dou surse de eroare de voltaj (Ver(+) i Ver(-)) n serie cu voltajele de intrare (V+ i V-). Astfel, voltajul de ieire:Vout = G{[ V+ +Ver ( +) ] [V +Ver ( ) ]}

va conine fluctuaii proporionale cu Ver(+) i Ver(-), care se vor reflecta n ifeedback. Dac feedbackul ar fi pur rezistiv, zgomotul if ar fi redus. ns datorit prezenei unor capaciti n paralel pe intrare i pe Rf, impedana scade la frecvene nalte, amplificnd zgomotul de voltaj la ieire. Densitatea spectral de putere a zgomotului de voltaj alS (2BW ) = ( 2Cinput Ver BW ) 2

amplificatorului este:

Fig. 4.4 Contribuia diferitelor surse de zgomot la zgomotul total. n cazul bistraturilor, datorit capacitii mai mari, zgomotul de voltaj crete la frecvene nalte, ceea ce limiteaz lrgimea de band, deci metoda poate fi aplicat doar la studiul canalelor cu cinetic mai lent. n dreapta, etapele procesrii semnalului de curent n metoda patch clamp: datorit benzii de trecere limitate a convertorului I-V, este necesar un high frequency boost stage care s corecteze atenuarea frecvenelor nalte, urmat de un low-pass filter.

ceea ce limiteaz lrgimea de band a nregistrrilor, n special la valori mari ale Cinput. Capacitatea de intrare poate fi redus tot prin reducerea suprafeei patchului. n plus, acoperirea pipetei n regiunea vrfului cu un elastomer (Sylgard) reduce capacitatea prin creterea grosimii dielectricului i prin suprafaa exterioar hidrofob. Valoarea mare a rezistenei de feedback limiteaz banda de ieire a primului etaj, de aceea este nevoie de un circuit activ care s compenseze atenuarea la frecvene nalte (boost stage), pentru a nu pierde evenimentele rapide. n plus, sunt necesare dou circuite suplimentare de compensare, unul pentru anularea tranzienilor capacitivi i altul pentru compensarea cderii de tensiune pe rezistena serie. Semnalul refcut de boost stage trebuie filtrat nainte de conversie i stocare, pentru a reduce zgomotul de frecven nalt, care altfel ar masca deschiderile reale ale canalelor. Majoritatea amplificatoarelor

comerciale au ncorporate filtre active a cror frecven de tiere (fcut = frecvena la care puterea este redus la 1/2, echivalent cu -3 dB) este ajustabil. Se folosesc de obicei filtre Bessel, care au un timp de cretere (trise) mai scurt i nu dau overshoot. Datorit caracteristicii de rspuns a filtrelor, evenimentele scurte sunt pierdute sau distorsionate. tdead definete durata unui eveniment pentru care semnalul filtrat atinge 1/2 din amplitudinea real, deci este omis de protocoalele de detecie uzuale (50% threshold crossing). El poate fi corelat cu timpul de cretere trise (definit ca reciproca pantei rspunsului la un semnal treapt la jumtatea amplitudinii). Pentru un filtru Gaussian (modelul teoretic de filtru cel mai folosit datorit proprietilor matematice speciale ale funciilor sale de rspuns):t dead = 0.538 t rise = 0.179 / f cut

O alt constant de timp important legat de intervalul de eantionare tsamp este durata unui semnal de intrare pentru care valoarea de ieire depete pragul de 50% pentru un interval de timp egal cu tsamp. Aceasta poart denumirea de tall, deoarece evenimentele avnd o durat mai mare sau egal cu ea sunt ntotdeauna detectate

Fig. 4.5 Distorsionarea duratei evenimentelor elementare n funcie de rspunsul treapt al filtrului i frecvena de eantionare. A, evenimentele cu durata real < tdead nu ating pragul de detecie de 50 %. B-D, evenimentele mai lungi dect tdead pot fi detectate, dar durata lor va fi msurat distorsionat dac sunt mai scurte dect timpul de cretere al filtrului, trise. E- F, evenimentele > trise sunt msurate corect.

prin algoritmul descris. Dac se alege tsamp = tdead, evenimentele cu durata ntre 1-2 tdead vor fi msurate distorsionat dup eantionare (durata msurat mai mic dect cea real), n timp ce evenimentele cu durata mai mare de 2 tdead vor fi msurate corect. Aceste considerente sunt importante n alegerea adecvat a frecvenei de eantionare i a caracteristicii filtrului n funcie de cinetica evenimentelor pe care dorim s le nregistrm, precum i pentru eventuala corecie pentru evenimente reale pierdute. O alt corecie ce poate fi aplicat atunci cnd raportul semnal/zgomot este semnificativ este nlturarea evenimentelor false. Se poate defini o rat a evenimentelor false (= false threshold crossings FTC) n funcie de frecvena de tiere a filtrului i valoarea medie ptratic n banda de filtrare a zgomotului de curent:2 FTC = 2kf cut exp( ithresh / 2rms (2BW ) )

unde parametrul k variaz n funcie de tipul de zgomot, de la 0.849 pentru zgomotul alb la 1.25 pentru zgomotul de tip f2. O estimare simpl a frecvenei evenimentelor false se poate obine alegnd un prag de 50% de partea opus a liniei de baz fa de evenimentele reale. Este dificil s trecem n revist n spaiul restrns al acestei prezentri larga varietate de aplicaii ale metodei patch clamp. Ne vom limita la a prezenta pe scurt principalele configuraii de nregistrare, aa cum au fost descrise de Erwin Neher. Configuraia de pornire se numete cellattached. De aici se poate fie retrage pipeta, exciznd un patch insideout (dei adeseori se formeaz vezicule ce pot fi sparte prin scoaterea pipetei n aer i reintroducerea ei n baie), fie se poate perfora peticul de membran (prin suciune, electroporare sau aplicarea unui ionofor, de exemplu nystatin sau amfotericin), intrnd astfel n configuraia whole cell. Aceasta este echivalent cu o abordare folosind microelectrozi intracelulari, ns prezint un numr de avantaje, ntre

care: rezistena de shunt este foarte mare, egal cu rezistena sealului, rezistena serie este redus deoarece se folosesc pipete largi (~ 3 M), se pot controla concentraiile ionice intracelulare i se pot aplica n pipet diveri ageni farmacologici cu aciune asupra cilor de semnalizare intracelular sau markeri. Prin retragerea pipetei din whole cell se formeaz un nou patch, cu faa extern a membranei expus la exterior, numit outside-out, configuraie ideal pentru studii farmacologice ale compuilor ce acioneaz din exterior.

Fig. 4.6 Variante de experimente utiliznd tehnica patch-clamp (dup E. Neher).

Merit semnalate i dezvoltrile tehnologice recente metoda patch on a chip n care pipeta este nlocuit de o serie de perforaii cu geometrie controlat pe suprafaa unei plcue de cuar. Pe faa superioar a plcuei se depune o suspensie de celule, care vor sedimenta acoperind orificiile. Ulterior se aplic o suciune de pe faa interioar i se scaneaz reeaua de electrozi corespunztori fiecrui orificiu, identificnd sealurile adecvate penru nregistrri. Aceast procedur simplific extrem de mult etapele de preparare, oferind un randament foarte nalt (high throughput) necesar n studiile de screening ntreprinse de companiile farmaceutice n dezvoltarea de noi compui bioactivi.

4.2 Modele cinetice de gating: Markov i fractale O problem matematic incitant deschis de realizarea nregistrrii fluctuaiilor unitare de conductan prin canale ionice este determinarea unui model cinetic adecvat care s descrie corect comportamentul sistemului real ntr-o varietate ct mai larg de condiii experimentale. Frumuseea i, n acelai timp, dificultatea subiectului constau n faptul c nu exist soluii unice, de aceea trebuie definite criterii precise de comparare a diferitelor modele i alegere a modelului optim. O prim etap n analiza unei nregistrri single-channel (n afar de corectarea liniei de baz, stabilirea numrului de canale i de stri de conductan i evaluarea stabilitii) este detectarea evenimentelor reale, determinarea duratei lor stocat ntr-un fiier numit list de evenimente urmat de generarea unei histograme a densitii de probabilitate de tranziie n funcie de timpul de via petrecut n starea respectiv. De fapt histogramele nu reprezint direct funcia de densitate de probabilitate de tranziie (pdf), ci o aproximare a ei, i anume numrul de evenimente care au duratele n limitele unui scurt interval de valori de timp numit bin. Nu ntmpltor, pentru bini de durate egale histograma are o alur mono- sau multiexponenial, corespunztoare unei singure stri sau unor stri multiple cu timpi de via diferii corespunztoare nivelului de conductan reprezentat. Se poate demonstra c duratele medii de via ale strilor respective sunt proporionale histogram. cu constantele de timp pdf ale ale exponenialelor timpilor de din via Frecvent, distribuiile

corespunztori nivelurilor de conductan sunt monoexponeniale, iar a celor corespunztori nivelului de nonconductan multiexponeniale, ceea ce corespunde unei singure stri deschise i mai multor stri nchise. Pentru o identificare mai uoar a diferitelor constante de timp dintr-o distribuie multiexponenial se folosesc bini de durate inegale,

Fig. 4.7 Diferite tipuri de reprezentare a histogramelor densitii de probabilitate a tranziiilor. A, reprezentarea clasic, cu scale lineare pentru timp i numrul de evenimente pe bin: componentele exponenaile cu pondere mai mic sunt greu de observat. B, reprezentare logaritmic-linear, n care cele dou componente exponeniale se disting clar, dar erorile (reprezentate n graficul de sus) sunt neuniform distribuite. C, reprezentare logaritmic-radical, ce duce la uniformizarea erorilor pe toat lungimea scalei de timp, este varianta utilizat n mod curent pentru histogramele pdf.

reprezentnd o scal de timp logaritmic. n plus, scala vertical a histogramelor pdf poate fi transformat printr-o funcie rdcin ptrat, ceea ce asigur o distribuie uniform a erorilor pe ntreaga scal de timp, deci o distorsionare redus a reprezentrii. Cel mai folosit model statistic pentru descrierea cineticii de gating a canalelor ionice este lanul de evenimente discrete aleatoare descris de matematicianul rus Andrey Markov, bazat pe urmtoarele reguli: exist un numr redus de stri distincte ale sistemului ntr-o anumit stare, probabilitile de tranziie sunt independente de strile prin care a trecut sistemul anterior (sistemul nu are o memorie a strilor anterioare) probabilitatea de tranziie de la o stare la alta este independent de timpul de via petrecut n starea respectiv. Cu ajutorul acestui set de restricii se poate demonstra c timpul de via al unei stri are o distribuie exponenial. Considernd probabilitatea ca sistemul s se afle ntr-o anumit stare la momentul t, R(t), i rata de tranziie (independent de timp), putem calcula probabilitatea ca sistemul s rmn n aceeai stare dup un interval de timp t:

R (t + t ) = R (t )[1 t o(t )]

unde o( t) este probabilitatea unor tranziii multiple cu revenire n starea iniial. Prin mprire la t cnd t 0 obinem:dR (t ) / dt = R (t )[ o( dt ) / dt 0] R (t ) = exp( t )

Spre deosebire de modelul Markov, modelul fractal consider rate de tranziie dependente de timp:k (t ) = At 1D

unde D este un numr ntre 1 i 2 denumit dimensiune fractal (evident, pentru D = 1 se revine la modelul Markov). Modelul fractal pornete de la presupunerea unui numr foarte mare de conformaii ale proteinei-canal, sistemul circulnd n permanen de la una la alta. Astfel, pe msur ce trece timpul dup o modificare conformaional, sistemul se ndeprteaz din ce n ce mai mult de conformaia iniial, favorabil tranziiei, deci probabilitatea de revenire n aceast conformaie urmat de tranziie scade. Pe lng problema unor rate de tranziie infinite la t = 0, s-a constatat c n multe cazuri modelele de tip Markov fiteaz mai bine distribiile pdf dect cele fractale. Un test suplimentar al independenei strilor este analiza corelaiilor, n care se poate reprezenta densitatea de probabilitate a duratei unei stri n funcie de durata strii/strilor precedente. Prin aplicarea metodei s-a demonstrat c strile lungi de non-conductan sunt precedate de deschideri scurte. O modalitate diferit de abordare a inferrii unui model cinetic superpozabil unei nregistrri sau unui ntreg set de nregistrri singlechannel este calcularea matricilor Q. Pornind de la un model cu n stri, se poate construi o matrice ai crei coeficieni kij definesc ratele de tranziie ntre stri. Cu ajutorul ei se poate calcula probabilitatea

L(t1...t n ) = 0 ...Gij (tl )... 1l =1

n

(likelihood) realizrii ntregii succesiuni de evenimente observate experimental sau generate de un model computerizat: n care termenii Gij sunt matrici ale cror elemente ij reprezint densitatea de probabilitate a meninerii strii i pentru un interval de timp ti (R(ti)),urmat de tranziia n starea j:Gij (ti ) = R (ti )Qij exp( Qij )

reprezint intervalul standard de tranziie, definit de Ball & Sansom(1988). Maximizarea probabilitii se realizeaz prin metodele variaionale uzuale (de exemplu algoritmul simplex). O implementare eficient a metodei a fost realizat de un grup din Departamentul de Fiziologie i Biofizic al Universitii de Stat din New York la Buffalo, condus de F. Sachs i A. Auerbach, sub forma pachetului software QuB. Acesta introduce segmentarea nregistrrilor i un algoritm recursiv de reestimare a parametrilor. Tot pe matrici Q se bazeaz i metoda modelelor Markov ascunse (hidden Markov models HMM). Aceasta consider o matrice A a probabilitilor de tranziie la intervale de timp discrete, egale cu intervalul de eantionare, aij=exp(kij t) , i calculeaz probabilitatea modelului pentru toate secvenele de evenimente posibile Si (secvena real este incert datorit suprapunerii unei surse de zgomot alb, Gaussian):L = P ( data , Si A) = P ( data Si ) P ( Si A)all S all S

4.3 Activarea dependent de voltaj i dependent de ligand Existena a dou forme fundamentale de manifestare a materiei, substana i cmpul electromagnetic, a generat de-a lugul secolelor i n biologie discuii aprinse asupra naturii propagrii informaiei n organismele vii. Att n domeniul propagrii influxului nervos ct i n transmiterea sinaptic au aprut grupuri de susinere fie a ipotezei

electrice fie a celei chimice. Faimoasele studii ale lui Hodgkin, Huxley i Katz din anii 40 au clarificat prima dintre probleme, artnd c potenialul de aciune al nervului reprezint o succesiune de reacii chimice (modificri de permeabilitate prin deschiderea unor pori) ale cror rate de reacie sunt controlate de potenialul transmembranar dup o distribuie Boltzmann cu dou niveluri de energie. Dei la vremea respectiv nu au putut furniza un mecanism molecular exact al activrii conductanelor de Na+ i K+, Hodgkin i Huxley au calculat aa-numita sarcin echivalent de gating, definit drept sarcina care sar deplasa pe ntreaga ntindere a cmpului electric transmembranar (de pe o fa a membranei pe cealalt) pentru a deschide o poart. Din faptul c fraciunea de conductan activat n funcie de amplitudinea depolarizrii atinge o pant maxim de 3.9 mV/cretere de e ori a gNa i 4.8 mV/cretere de e ori a gK, folosind distribuia:O 1 = O +C 1 + exp[( w z g eE ) / k BT ]

deducem c zg = 24 mV/3.9 mV = 6.15 sarcini elementare pentru gNa+ i 5 sarcini elementare pentru gK. Determinri ulterioare au plasat zg pentru Na+ la aproximativ 12 sarcini elementare. O alt predicie extrem de important a modelului Hodgkin-Huxley este necesitatea deschiderii independente a 4 pori pentru activarea gK, ce prefigureaz arhitectura homotetrameric a canalelor de K+ dependente de voltaj. Existena senzorilor de voltaj a fost pus n eviden direct prin nregistrarea curenilor de gating, descris anterior. Dup secvenierea urmat de clonarea canalelor de Na+ dependente de voltaj, i realizarea faptului c fiecare din cele patru subuniti are ase domenii transmembranare (S1-S6), au fost ntreprinse studii de mutagenez pentru a dovedi c reziduurile pozitive nalt conservate din S4 (arginin i lizin, repetate la fiecare a treia poziie) reprezint senzorul de voltaj. innd seama de multiplicitatea strilor nchise, Almers (1978) a postulat c panta maxim a activrii, numit de el sensibilitate

Fig. 4.8 Studiu comparativ de aliniere a secvenelor segmentului S4, cu evidenierea reziduurile pozitive R i K conservate, ce constituie senzorul de voltaj. n dreapta, experimentele de mutagenez punctiform cu neutralizarea sarcinii scad sarcina echivalent de gating (zg), iar cele cu conservarea sarcinii menin sau cresc zg.

logaritmic la potenial, nu poate fi msurat corect dect la poteniale foarte negative, pentru c odat cu depolarizarea apare o acumulare a sarcinii n stri nchise intermediare. Folosirea acestor poteniale implic msurarea unor probabiliti ale strii deschise foarte mici (103

10-4), sau folosirea unor modele de gating multistare care s poat fi

extinse dincolo de limita observaiilor experimentale. O alt dificultate, evideniat tot de Almers, este distorsionarea msurtorilor prin inactivare rapid aceasta poate fi ns nlturat. n fine, exist o metod direct de determinare a sarcinii de gating, independent de model: evaluarea sacinii totale obinut prin integrarea curentului de gating de tip ON i mprirea la numrul de canale, estimat prin diverse metode. Primele studii de mutagenez ale reziduurilor pozitive din S4, ntreprinse de echipa lui Walter Sthmer, au stabilit c neutralizarea primelor patru poziii externe reduce corespunztor zg. Transformarea unei arginine n histidin (R1448H) face ca gatingul s devin dependent de pH, datorit tranziiei ntre forma protonat, ncrcat pozitiv, la pH 6.2, i forma neutr la pH 7.8. Transformarea aceluiai reziduu n cistein face ca el s fie accesibil pentru reactivi MTS aplicai fie pe faa intracelular, la hiperpolarizare, fie pe faa

extracelular, la depolarizare. Deci reziduul respectiv strbate complet membrana. Studii ulterioare ale lui F. Bezanilla prin metode optice (FRET fluorescence resonance energy transfer = transferul unui foton de la un fluorofor la altul, a crui eficien depinde de distana ntre cele dou molecule) au stabilit c domeniul S4 sufer de fapt o rotaie

la activare, transfernd reziduurile pozitive de la interstiiul format deFig. 4.9 Activarea senzorilor de potenial ai canalelor voltage-gated const ntr-o micare de rotaie a domeniului S4, cu translocaia reziduurilor ncrcate pozitiv din crevasa intern, in contact cu mediul intracelular, n crevasa extern, n contact cu mediul extracelular (din Hille 2001).

S1 i S5 (crevasa intern) la cel format de S2 i S3 (crevasa extern). O alt dovad a acestui mecanism este apariia unui carrier de protoni prin mutarea reziduurilor de pe S4 n histidin i blocarea curentului ionic protonii circul n sensul gradientului de concentraie. Coeficientul termic al acestui curent de protoni (Q10) este mai aproape de cel al proceselor de gating dect de cel al difuziei libere. Spre deosebire de gatingul prin voltaj, gatingul prin ligand folosete un mecanism diferit pentru a declana modificrile conformaionale premergtoare deschiderii cii de conductan: interaciunea cu un compus chimic. Exist o larg categorie de canale ionice ligand-gated, care ndeplinesc roluri eseniale n comunicarea inter- i intracelular. Ele realizeaz transmiterea i modularea sinaptic, recepia unor semnale chimice, sau intervin n ci ale mesagerilor secunzi. O categorie aparte o reprezint gatingul prin Ca2+ intracelular i prin pH, care vor fi tratate separat. La originea studiilor biofizice asupra transmiterii sinaptice se afl lucrrille lui Fatt & Katz (1951), care au studiat proprietile potenialelor de plac terminal miniaturale (MEPPs) de la nivelul plcii motorii musculare, dovedind c sunt produse prin eliberarea spontan i individual n fanta sinaptic a veziculelor de mediator (acetilcolina ACh), i c procesul respectiv necesit prezena Ca2+. Din faptul c exist o dependen de voltaj a constantei de timp de relaxare a curenilor de plac motorie (nregistrai n voltage clamp) care nu poate fi atribuit direct aciunii ACh, Magleby & Stevens (1971) au emis ipoteza c acest fenomen reflect mai degrab cinetica de deschidere i nchidere a receptorilor colinergici nicotinici (NAChR), A .. ... R A R A R* clo sed clo sed ) o pen (E

sensibilizai

prin

legarea

ACh. Folosind

modelul

de

activare

a

complexului agonist-receptor (AR) (del Castillo & Katz 1957):

ei au presupus c rata de nchidere a receptorului, , este cea care confer dependena de voltaj, ceea ce ar explica coeficientul de variaie cu temperatura al constantei de timp de relaxare, Q10 = 2.8, prea mare pentru un proces de difuzie. Experimentele prin metoda analizei fluctuaiilor (Katz & Miledi 1970 1971) au confirmat aceast ipotez, ns o serie de studii (Katz & Thesleff 1957, Adams 1975) indicau un fenomen de cooperativitate pozitiv la legarea ACh de receptor, exprimat printr-un coeficient Hill ntre 1.52.2. Dup apariia i perfecionarea metodei patch clamp, ale crei nceputuri sunt legate chiar de acest receptor, Bert Sakmann i David Colquhoun (1981, 1985) au reuit s pun n eviden nchideriA A k1 k2 R AR A2 R 1 closed closed kk 2 closed

1 1

2 2* 2

A k * 2 AR A2 R * open open k*

foarte scurte (gaps), cu durate de cteva zeci de s, care nu pot fi explicate prin desfacerea ligandului, ci prin nchiderea canalului. Aceast serie de deschideri succesive punctate de scurte nchideri a primit denumirea de burst, durata sa per ansamblu fiind egal cu timpul de via al complexului receptor-ligand. innd seama de noile date, modelul cinetic al NAChR devine: n plus, prezena prelungit a ACh duce la apariia fenomenului de desenzitizare, n care canalele nu mai rspund prin activare la agonist. Desenzitizarea poate explica mecanismul de aciune al curarizantelor depolarizante (leptocurare) folosite n interveniile chirurgicale pentru miorelaxare. Cele dou situsuri de legare a ACh au fost puse n eviden cu ajutorul

-bungarotoxinei, o neurotoxin peptidic extras din veninul dearpe. Ea a fost folosit pentru purificarea NAChR din organul electric al torpilei electrice. Canalul are o arhitectur pentameric, 2

(Weill et al. 1974, Raftery et al. 1980), pe subunitile fiind localizate situsurile de legare a ACh. Fiecare subunitate conine 4 -helixuri transmembranare. Studii ulterioare au artat c arhitectura pentameric este comun mai multor canale ligand-gated, incluznd receptorii GABAA i de glicin, cu rol inhibitor la nivelul sistemului nervos central. Aceste canale anionice, activate de barbiturice, benzodiazepine i alcool, hiperpolarizeaz membrana neuronal, ceea ce explic efectele sedative ale compuilor menionai. Principalul neurotransmitor excitator central, glutamatul, acioneaz pe diverse tipuri de receptori, dintre care o parte sunt canale ionice. Ele sunt numite receptori NMDA (N-methyl-D-aspartate, un analog al glutamatului), prezint o selectivitate pentru Ca2+, iar prin blocarea de ctre Mg2+ intracelular dobndesc proprietatea de inward rectification, participnd la fenomenul de long-term potentiation, implicat n memorie (vezi capitolul 2). n fine, receptorii purinergici P2X, activai de ATP extracelular, au fost implicai n nocicepie. La nevertebrate (melcul Helix aspersa) a fost descris un canal din familia canalelor epiteliale de Na+ (Deg/ENaC) activat de neurotransmitorul peptidic FMRFamid, numit FaNaCh (Lingueglia et al. 1995).

4.4 Inactivarea de tip N i de tip C Inactivarea a fost definit de Hodgkin i Huxley ca un proces cu cinetic monoexponenial care reduce conductana de Na +, dup activarea ei printr-o treapt de potenial. Ei au modelat acest proces prin nchiderea unei pori de inactivare a crei probabilitate de a fi deschis este h; ratele de deschidere i de nchidere, negative (hiperpolarizare) iar nchiderea lah

i h, sunt pozitive

dependente de voltaj, deschiderea fiind favorizat la poteniale poteniale (depolarizare). Hodgkin i Huxley au tratat activarea i inactivarea ca dou procese independente, deci probabilitatea strii deschise a

canalelor de Na+ este egal n modelul lor cu produsul probabilitilor strii deschise a porilor de activare i inactivare, m3h. Inadvertena acestui model a fost dovedit n anii 60 de Chandler i Meves, prin faptul c n axonul gigant de calmar inactivarea curenilor de Na+ este incomplet, chiar la poteniale pozitive mari. Ei au sugerat existena a dou stri deschise ale porii de inactivare, una dintre ele fiind favorizat de depolarizare. nregistrarea curenilor de gating n anii 70 a adus noi surprize: Armstrong i Bezanilla au demonstrat imobilizarea sarcinii de gating pentru curenii de tip OFF. Cu ct pulsul de depolarizare era mai prelungit cu att scdea sarcina aparent de gating, obinut prin integrarea curentului, astfel nct raportul ntre

Fig. 4.10 Studiile lui Aldrich, Corey i Stevens pe canalele de Na+ dintr-o linie de neuroblastom au relevat faptul c, dei constanta de timp macroscopic de inactivare este dependent de voltaj, timpul mediu de via al strii deschise este independent. Astfel, aceeai cinetic macroscopic poate fi descris prin modele microscopice diferite. Prin nregistrri single-channel ei au dovedit c deschiderea este lent i inactivarea rapid i independent de voltaj (modelul ABACS).

sarcina de gating OFF i cea ON (Qoff/Qon) urma o cinetic similar celei a inactivrii curentului macroscopic de Na+ n acelai preparat. Acest rezultat sugereaz un cuplaj ntre cele dou procese: inactivarea imobilizeaz senzorii de voltaj n poziia activat iar revenirea lor la

poziia iniial are loc numai dup ieirea din inactivare, deci foarte lent. Pe baza modelului cuplat, Armstrong i Bezanilla au dedus c inactivarea nu trebuie neaprat s prezinte o dependen de voltaj intrinsec, i, mai mult, c rata de inactivare a curentului macroscopic nu reflect n mod real ratele proceselor microscopice de activare i inactivare. O confirmare strlucit a acestei ipoteze a fost adus n 1983 de Aldrich, Corey i Stevens, prin nregistrri de tip singlechannel ale canalelor de Na+ voltaj-dependente dintr-o linie de neuroblastom de mamifere, utiliznd tehnica patch clamp. Astfel, dei constanta de timp aparent de inactivare ( h) a curentului macroscopic elicitat de un puls de depolarizare (obinut prin sumarea coerent a unui mare numr de nregistrri single-channel) era de 3 ms, durata medie de deschidere a canalelor pe nregistrrile individuale era de doar 0.95 ms. Latena primei deschideri prezenta variaii largi, iar majoritatea nregistrrilor (85%) conineau o singur deschidere. Concluzia logic este c, n acest caz, activarea este un proces lent i inactivarea unul rapid (constanta de timp microscopic 0.95 ms), canalele fiind absorbite n starea inactivat la scurt timp dup deschidere. Mai mult, aceast constant microscopic de inactivare este independent de voltaj. n plus, dependena de voltaj a conductanei de vrf de Na+ este distorsionat de aceast inactivare rapid. Celebrele studii ale lui Clay M. Armstrong (71-75) cu derivai cuaternari de amoniu (analogi ai TEA precum tetrapentylamoniul TPeA, sau nonyltriethylamoniul C9) au artat c aplicarea intracelular a acestor compui modific cinetica clasic a canalelor de K+ voltaj-dependente (delayed rectifiers) introducnd o inactivare dependent de concentraie ce le face asemntoare canalelor de Na+. n plus, curba IV se modific prin apariia unei rectificri de tip inward. Armstrong a sintetizat aceste date ntr-un model cinetic numit open channel block: aminele cuaternare exercit efectul blocant numai dup

deschiderea canalelor, deci trebuie s treac de o poart de activare situat pe endodomeniul canalului, ptrunznd ntr-un vestibul intern de dimensiuni suficient de mari pentru a le acomoda, i producnd astfel procesul asemntor inactivrii. Ele pot fi nlturate din acest situs intern numai de ctre ionii care ptrund dinspre exterior (curenii de inward), ceea ce explic rectificarea. Studii similare au artat c anestezicele locale ptrund n vestibulul intern, mimnd inactivarea i imobiliznd sarcinile de gating (Yeh & Armstrong 1978, Cahalan &Fig. 4.11 Modelul de inactivare de tip N (ball and chain). Dup activarea canalelor, captul N-terminal (bila) obtureaz orificiul intern, ducnd la inactivare. ndeprtarea acestei particule prin tratament enzimatic duce la dispariia inactivrii (din Armstrong & Bezanilla 1977).

Almers 1979). Urmnd aceast linie de raionament, Armstrong & Bezanilla au imaginat inactivarea ca ptrunderea unui ghem proteic n orificiul intern al porului, atunci cnd acesta este deschis, ceea ce explic cuplajul cu activarea. S-a artat c tratamentul cu enzime proteolitice (papain, pronaz, etc.) aplicate pe faa intern a membranei nltur inactivarea, ceea ce duce i la dispariia imobilizrii sarcinii de gating, iar aplicarea peptidelor solubile rezultate prin acest tratament reinstaureaz componenta de inactivare. Un model foarte frumos de studiu al acestui tip de inactivare a aprut dup clonarea canalelor de K+ de tip Shaker din Drosophila (Hoshi, Zagotta, Aldrich 1990), canale ce produc aa-numiii cureni tranzieni de K+ de tip A (pentru c au forma literei A). Studii de mutagenez deleional au artat c nlturarea primelor 20 de reziduuri din

captul N-terminal al unei subuniti (canalele sunt homotetrameri) nltur inactivarea, iar adugarea lor sub forma unei peptide sintetice solubile o restaureaz. ndeprtarea unei pri din urmtoarele 60 de reziduuri accelereaz inactivarea, n timp ce alungirea secvenei respective o ncetinete. Aceste rezultate contureaz modelul numit inactivare de tip N sau modelul bil-lan, n care, evident, primele 20 reziduuri formeaz bila iar urmtoarele 60 lanul. n plus, studiile cu peptide sintetice ball-like arat c rata inactivrii este proporional cu concentraia de peptid, n timp ce rata revenirii din inactivare este independent de ea. Pentru canalele de Na+ voltage-gated s-a descoperit prin studii de mutagenez un mecansim asemntor de inactivare, ce implic linkerul dintre subunitile III i IV. Un alt tip de inactivare a canalelor de Na+ este cel numit inactivare lent, care este favorizat de depolarizri prelungite (secunde sau minute) i are un timp de revenire de acelai ordin de mrime, dup repolarizare. Acesta a fost denumit inactivare de tip C (Hoshi et al. 1991) deoarece variantele naturale de splicing ale genei Shaker prezint modificri ale acestui proces atunci cnd sunt afectate reziduurile din treimea C-terminal a secvenei. Inactivarea de tip C este ncetinit de TEA aplicat extracelular i nu intracelular (Grissmer & Cahalan 1989), i de cationii extracelulari permeani, n special K+ i Rb+), ceea ce sugereaz o modificare conformaional a filtrului de selectivitate al porului (Lpez-Barneo et al. 1993). n absena K+ extracelular, canalele inactivate devin permeabile pentru Na+. Astfel, inactivarea de tip C reflect importana cationilor extracelulari n stabilizarea conformaiei funcionale a canalelor ionice.

4.5 Alte tipuri de gating cu implicaii n transducia senzorial: mecanosenzitivitatea i termosenzitivitatea

n afara tipurilor clasice de gating discutate anterior, a cror importan n funcionarea sistemului neuromuscular este evident, canalele ionice sunt implicate, ntr-un fel sau altul, n diferitele etape ale transduciei senzoriale, procesul biofizic prin care energia diferiilor stimuli din mediul intern sau din lumea nconjurtoare declaneaz serii de poteniale de aciune repetitive pe cile nervoase aferente. Funcionarea unui sistem senzorial poate fi sistematizat i generalizat ntr-o diagram simpl, reprezentnd o nlnuire de trei procese: detecie, amplificare i semnalizare. Detecia reprezint o modificare conformaional a unei molecule receptoare sub aciunea stimulului (de exemplu izomerizarea trans-cis a retinalului sub aciunea unui foton din spectrul vizibil). Amplificarea folosete cascadele enzimatice ale cilor de semnalizare intracelular (de exemplu, sistemul proteinelor G) al cror rezultat este variaia potenialului

Fig. 4.12 Schema de principiu a unui receptor, cu ilustrarea celor trei procese nlnuite: detecia, amplificarea i semnalizarea, i a cilor de feed-back ce le controleaz (Steven Block 1991).

transmembranar al celulei receptoare (potenialul de receptor), n sensul depolarizrii sau al hiperpolarizrii. A treia etap, semnalizarea, reprezint corelarea variaiilor potenialului de receptor cu frecvena de declanare a potenialelor de aciune ce vor fi propagate pe cile sensibilitii respective, cu alte cuvinte o modulare n frecven, care reduce efectul factorilor perturbatori ce acioneaz de-a lugul cii de comunicaie (se tie c semnalele modulate n frecven sunt mai rezistente la perturbaii dect cele modulate n amplitudine un exemplu banal este diferena de calitate ntre o transmisie radio modulat AM i una modulat FM). ntr-o discuie teoretic a principiilor fizice ale transduciei sensoriale, biofizicianul Steven Block remarca faptul c, dintre cele patru tipuri fundamentale de interaciuni (fore), numai dou sunt detectate n lumea vie: interaciunea electromagnetic i cea gravitaional, ale cror distane de aciune includ intervalul de dimensiuni ale fiinelor vii. Nu s-a descoperit nc (i este improbabil s se descopere n viitor) un receptor biologic pentru interaciunea nuclear (tare), care asigur legturile ntre nucleoni, avnd o raz de aciune de 10-12 m, sau pentru interaciunea slab (rspunztoare, de exemplu, de dezintegrarea ). Comparnd nivelul elementar de energie al diferiilor stimuli cu valoarea kBT, aa-numita cuant de energie termic (dublul energiei cinetice pe grad de libertate al unei molecule ~ cu o valoare de 1/40 eV sau 0.58 kcal/mol la temperatura camerei ~ 300 K) distingem dou tipuri de traductori: cei limitai cuantic, pentru care cuanta de energie este mai mare dect kBT, i cei limitai clasic, pentru care este mai mic, uneori cu multe ordine de mrime. Un exemplu din prima grup este, din nou, fotorecepia: energia unui foton vizibil cu

= 500 nm, care corespunde culorii verde-albstrui, este hc/ (unde h = 6.62 10-34 J s este constanta lui Planck) egal cu 57 kcal/mol, deci cu dou ordine de mrime deasupra cuantei termice. Experiene psihofizice efectuate la nceputul secolului 20 au artat c ochiul uman adaptat la ntuneric poate distinge fotoni individuali sub forma unor scurte strfulgerri. i chemorecepia intr tot n categoria limitat cuantic: considernd constanta de disociere KD n intervalul 10-110-11 M, i utiliznd expresia KD exp(- E/kBT), obinem un interval de energii ntre 2 kBT i 25 kBT. O situaie complet diferit o reprezint auzul, pentru care energia cuantei de sunet (fonon) n spectrul de frecven 10100,000 Hz este de 108 1011 ori mai mic dect cuanta termic. Aceasta face ca deplasrile membranei bazilare din urechea intern, la pragul audibil, s fie cu cteva ordine de mrime mai mici dect amplitudinea medie a fluctuaiilor termice ale cililor celulelor auditive (0.11 comparativ cu 2 nm). Aceast diferen poate fi surmontat prin limitarea temporal a benzii de trecere a detectorului, tiut fiind c zgomotul termic are o distribuie spectral uniform a densitii de putere, cu alte cuvinte este alb. Totui, limitarea lrgimii de band nu funcioneaz dect pentru un circuit rezonant activ, pentru un sistem pasiv ntreaga putere de zgomot termic fiind deplasat n vrful de rezonan, conform teoremei de fluctuaiedisipaie a lui Landau & Lifshitz (1977). nregistrri electrofiziologice la nivelul celulelor ciliate din cohlee (Corey & Hudspeth 1983) au evideniat cureni cationici activai de deplasarea lateral a cililor, cu o laten de activare mai mic de 10 s i un timp mediu de deschidere sub 40 s. Ei au presupus c activarea acestor canale este produs direct de un stimul mecanic (o for de ntindere transmis prin filamente extracelulare ce leag cilii nvecinai), energia de activare fiind similar celei a senzorilor de voltaj din canalele voltage-gated. Adaptarea la deschideri prelungite este

datorat influxului de Ca2+ prin aceste canale, care sunt cuplate cu un motor intracelular reprezentat o de molecule mecanic de miozin ce interacioneaz cu citoscheletul de filamente de actin asociat membranei, meninnd tensiune constant asupra canalelor. Amplificarea activ a oscilaiilor mecanice, stipulat teoretic, este realizat de celulele ciliate externe, dispuse n mai multe rnduri. Depolarizarea lor activeaz un alt motor molecular numit prestin, identificat (Zheng et al 2000) printr-o metod genetic original, amplificarea diferenial. Dou biblioteci de cDNA, obinute prin RTPCR din extractele mRNA ale celulelor ciliate externe i interne au fost amestecate n exces de cDNA din celulele ciliate interne, deci secvenele comune au hibridizat; restul secvenelor libere, specifice celulelor ciliate externe, au fost amplificate n continuare i exprimate ntr-un sistem heterolog. Studii anterioare asupra celulelor ciliate externe (Ashmore 1987, Santos-Sacchi 1991) artaser c electromotilitatea i curenii capacitivi neliniari sunt inhibai reversibil de salicilatul de Na (Shehata et al 1991). Aceast proprietate a fost regsit n sistemele celulare n care a fost exprimat prestina. Din punct de vedere molecular, ea prezint similariti cu transportorii de sulfat, ns i dou clustere de reziduuri pozitive n regiunea Cterminal (reziduurile 557-580 i 596-613, lungimea total a secvenei fiind 744).

Fig. 4.13 Diferite canale ionice cu rol presupus sau cert n mecanosenzitivitate i/sau termosenzitivitate. Ele aparin unor familii diferite: TRP (transient receptor potential) i CNG (cyclic nucleotide gated), cu 6 domenii TM pe subunitate, provin din canalele de K+ voltage-gated, Deg/ENaC (degenerine/canale epiteliale de Na) i receptorii purinergici P2X, cu 2 domenii TM pe subunitate.

Studii la nivelul procariotelor au dus la identificarea unui canal ionic mecanosenzitiv (MscL Sukharev et al. 1994, 1997) a crui structur 3D a fost rezolvat prin difracie de raze X. Canalul este un homopentamer format din subuniti 2TM, neselectiv i cu o conductan enorm (3000 pS). O alt linie de studii a identificat la

nematodul C. elegans mutaii ale unor gene din familia Deg/ENaC care altereaz sensibilitatea la atingere. ntruct membri ai acestei familii sunt exprimai n neuronii senzitivi ai mamiferelor (genele ASIC1ASIC4), se presupune c ei ar fi implicai n mecanosenzitivitate. Dovezi suplimentare n acest sens sunt furnizate prin aplicarea stimulilor mecanici de deformare asupra neuronilor izolai din ganglionii spinali. La subpopulaia care rspunde prin creteri ale activitii Ca2+ intracelular, Ni2+ i verapamilul inhib acest rspuns (Gotoh & Takahashi 1999). O alt categorie de mecanosenzori candidai sunt membri ai familiei TRP (transient receptor potential fotoreceptorul din Drosophila), de exemplu nompC sau SIC (stretchinhibitable channel), a crui secven este nrudit cu receptorul vaniloid (VR1). Termosenzitivitatea este alt domeniu care a reprezentat o terra incognita pn recent, datorit dificultii de abordare electrofiziologic direct a receptorilor subcutanai, de dimensiuni minuscule. n prezent au fost identificate i clonate cteva canale ionice din familia TRP responsabile de detecia temperaturilor extreme: cldura nociv i frigul. Astfel, n 1996, P. Cesare i P. McNaughton identific n neuronii spinali nociceptivi un curent cationic cu un prag de activare ridicat (~ 42 C), senzitizat de bradikinin prin activarea proteinkinazei C (isoforma ). n 1997, o echip de la Departamentele de Anesteziologie i Farmacologie ale Universitii din California la San Francisco (M. Caterina, D. Julius, M. Tominaga, etc.) reuete s cloneze un canal ionic (VR1) , activat de multipli stimuli nocivi: cldur, pH sczut i compui vaniloizi. Dup numai civa ani este identificat, tot ntr-un grup de neuroni spinali, un curent activat de frig (prag de activare ~ 15 C) i de D-menthol (Reid & Flonta 2001). Recent, canalul ionic candidat pentru acest efect a fost clonat tot de echipa lui D. Julius, fiind numit CMR1 (cold and menthol receptor 1). Este interesant faptul c VR1 i CMR1 sunt nrudite, ambele aparinnd

familiei TRP. Graficul de hidrofobicitate al celor dou secvene arat existena la CMR1 a dou regiuni hidrofobe suplimentare, n afara celor ase domenii transmembranare cunoscute. Acest fapt poate ajuta la explicarea activrii sale prin frig. Se presupune c activarea termic este o reacie controlat entropic. ntruct G = H - T S, reaciile cu variaie pozitiv de entropie vor fi favorizate la temperaturi crescute, iar cele cu variaie negativ de entropie la temperaturi sczute. Variaia negativ de entropie n CMR1 ar putea fi reprezentat de detaarea acestor dou domenii hidrofobe la temperaturi sczute,Fig. 4.14 Analiza comparativ a hidrofobicitii secvenelor receptorului vaniloid VR1 i receptorului de rece i menthol CMR1. n afara regiunilor hidrofobe corespunztoare celor 6 -helixuri transmembranare, CMR1 prezint dou zone hidrofobe suplimentare, cu rol presupus n activarea la rece.

ntruct entropia lor n soluie este mai mic dect ntr-un mediu hidrofob (efectul imobilizrii moleculelor de ap din cuca de hidratare). Referine

Aldrich RW, Corey DP, Stevens CF. 1983. A reinterpretation of mammalian sodium channel gating based on single channel recording. Nature 306(5942):436-41. Almers W. 1978. Gating currents and charge movements in excitable membranes. Rev Physiol Biochem Pharmacol 82:96-190. Armstrong CM. 1971. Interaction of tetraethylammonium ion derivatives with the potassium channels of giant axons. J Gen Physiol 58(4):413-37. Armstrong CM, Bezanilla F. 1973. Currents related to movement of the gating particles of the sodium channels. Nature 242(5398):45961. Armstrong CM, Bezanilla F. 1977. Inactivation of the sodium channel. II. Gating current experiments. J Gen Physiol 70(5):567-90. Ashmore JF. 1987. A fast motile response in guinea-pig outer hair cells: the cellular basis of the cochlear amplifier. J Physiol 388:323-47. Ball FG, Sansom MS. 1988. Single-channel autocorrelation functions: the effects of time interval omission. Biophys J 53(5):819-32. Bean RC, Shepherd WC, Chan H, Eichner J. 1969. Discrete conductance fluctuations in lipid bilayer protein membranes. J Gen Physiol 53(6):741-57. Bezanilla F. 2002. Voltage sensor movements. J Gen Physiol 120(4):465-73. Block SM. 1991. Biophysical principles of sensory transduction. In: Corey DP, Roper SD, editors. Sensory Transduction. New York: Rockefeller University Press. p 1-17. Cahalan MD, Almers W. 1979. Interactions between quaternary lidocaine, the sodium channel gates, and tetrodotoxin. Biophys J 27(1):39-55. Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D. 1997. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature 389(6653):816-24. Cesare P, McNaughton P. 1996. A novel heat-activated current in nociceptive neurons and its sensitization by bradykinin. Proc Natl Acad Sci U S A 93(26):15435-9. Chahine M, George AL, Jr., Zhou M, Ji S, Sun W, Barchi RL, Horn R. 1994. Sodium channel mutations in paramyotonia congenita uncouple inactivation from activation. Neuron 12(2):281-94. Chandler WK, Meves H. 1970. Rate constants associated with changes in sodium conductance in axons perfused with sodium fluoride. J Physiol 211(3):679-705. Colquhoun D, Hawkes AG. 1995. The Principles of the Stochastic Interpretation of Ion-Channel Mechanism. In: Neher BSaE, editor. Single-Channel recording. 2 ed. New York: Plenum Press. p 397482.

Colquhoun D, Sakmann B. 1981. Fluctuations in the microsecond time range of the current through single acetylcholine receptor ion channels. Nature 294(5840):464-6. Corey DP, Hudspeth AJ. 1983. Kinetics of the receptor current in bullfrog saccular hair cells. J Neurosci 3(5):962-76. DeFelice LJ. 1981. Introduction to Membrane Noise. New York: Plenum. 500 p. del Castillo J, Katz B. 1957. Interaction at endplate receptors between different choline derivatives. Proc R Soc Lond B 146:369-381. Fatt P, Katz B. 1951. An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode. J Physiol 115:320-370. Fertig N, Blick RH, Behrends JC. 2002. Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip. Biophys J 82(6):3056-62. Gotoh H, Takahashi A. 1999. Mechanical stimuli induce intracellular calcium response in a subpopulation of cultured rat sensory neurons. Neuroscience 92(4):1323-9. Grissmer S, Cahalan M. 1989. TEA prevents inactivation while blocking open K+ channels in human T lymphocytes. Biophys J 55(1):2036. Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth FJ. 1981. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch 391(2):85-100. Helman SI, Baxendale LM. 1988. Open channel probability of apical Na channels in epithelial frog skin. FASEB J 2:A750. Hladky SB, Haydon DA. 1970. Discreteness of conductance change in bimolecular lipid membranes in the presence of certain antibiotics. Nature 5231(231):451-3. Hodgkin AL, Huxley AF. 1952. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J Physiol 117:500-544. Hoshi T, Zagotta WN, Aldrich RW. 1991. Two types of inactivation in Shaker K+ channels: effects of alterations in the carboxyterminal region. Neuron 7(4):547-56. Katz B, Miledi R. 1970. Membrane noise produced by acetylcholine. Nature 226(249):962-3. Keynes RD, Rojas E. 1974. Kinetics and steady-state properties of the charged system controlling sodium conductance in the squid giant axon. J Physiol 239(2):393-434. Lindemann B, Van Driessche W. 1977. Sodium-specific membrane channels of frog skin are pores: current fluctuations reveal high turnover. Science 195(4275):292-4. Lingueglia E, Champigny G, Lazdunski M, Barbry P. 1995. Cloning of the amiloride-sensitive FMRFamide peptide-gated sodium channel. Nature 378(6558):730-3.

Lpez-Barneo J, Hoshi T, Heinemann SH, Aldrich RW. 1993. Effects of external cations and mutations in the pore region on C-type inactivation of Shaker potassium channels. Receptors Channels 1(1):61-71. McKemy DD, Neuhausser WM, Julius D. 2002. Identification of a cold receptor reveals a general role for TRP channels in thermosensation. Nature 416(6876):52-8. Mller P, Rudin DO, Tien HT, Wescott WC. 1962. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature 194:979-980. Neher E, Sakmann B. 1976. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature 260(5554):799-802. Neumcke B. 1982. Fluctuation of Na and K currents in excitable membranes. Int Rev Neurobiol 23:35-67. Reid G, Flonta M. 2001a. Cold transduction by inhibition of a background potassium conductance in rat primary sensory neurones. Neurosci Lett 297(3):171-4. Reid G, Flonta ML. 2001b. Physiology. Cold current in thermoreceptive neurons. Nature 413(6855):480. Santos-Sacchi J. 1991. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J Neurosci 11(10):3096-110. Schneider MF, Chandler WK. 1973. Voltage dependent charge movement of skeletal muscle: a possible step in excitationcontraction coupling. Nature 242(5395):244-6. Shehata WE, Brownell WE, Dieler R. 1991. Effects of salicylate on shape, electromotility and membrane characteristics of isolated outer hair cells from guinea pig cochlea. Acta Otolaryngol 111(4):707-18. Sigworth FJ, Klemic KG. 2002. Patch clamp on a chip. Biophys J 82(6):2831-2. Starace DM, Stefani E, Bezanilla F. 1997. Voltage-dependent proton transport by the voltage sensor of the Shaker K+ channel. Neuron 19(6):1319-27. Stevens CF. 1972. Inferences about membrane properties from electrical noise measurements. Biophys J 12(8):1028-47. Sthmer W, Conti F, Suzuki H, Wang XD, Noda M, Yahagi N, Kubo H, Numa S. 1989. Structural parts involved in activation and inactivation of the sodium channel. Nature 339(6226):597-603. Sukharev SI, Blount P, Martinac B, Blattner FR, Kung C. 1994. A largeconductance mechanosensitive channel in E. coli encoded by mscL alone. Nature 368(6468):265-8. Venkataramanan L, Sigworth FJ. 2002. Applying hidden Markov models to the analysis of single ion channel activity. Biophys J 82(4):1930-42.

Verveen AA, Derksen HE. 1969. Amplitude distribution of axon membrane noise voltage. Acta Physiol Pharmacol Neerl 15(3):353-79. Wonderlin WF, French RJ, Arispe NJ. 1990. Recording and Analysis of Currents from Single Ion Channels. In: A. A. Boulton GBB, C. H. Vanderwolf, editor. Neurophysiological Techniques: Basic methods and Concepts. Clifton, NJ: The Humana Press Inc. Yang N, Horn R. 1995. Evidence for voltage-dependent S4 movement in sodium channels. Neuron 15(1):213-8. Zagotta WN, Hoshi T, Aldrich RW. 1990. Restoration of inactivation in mutants of Shaker potassium channels by a peptide derived from ShB. Science 250(4980):568-71. Zheng J, Shen W, He DZ, Long KB, Madison LD, Dallos P. 2000. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature 405(6783):149-55.