PARATUBERKULOSEPARATUBERKULOSEBEIM RINDBEIM RINDNachweis von AntikörpernNachweis von Antikörpern in in

der Tankmilchder Tankmilch

KristineKristine Klewer Klewer / Philippe / PhilippePourquierPourquier

DieDie Krankheit Krankheit

•• Chronische DarmerkrankungChronische Darmerkrankung

Mycobacterium avium ssp paratuberculosis(M. paratuberculosis)

(Scanning electron micrographof M. paratuberculosis)

(Guernsey cow with clinicalsigns of Johne's disease)

•• Klinische AusprägungKlinische Ausprägung

DurchfallAbmagerung

UnheilbarUnheilbar

•• KrankheitserregerKrankheitserreger

Tödlicher AusgangTödlicher Ausgang

HauptkontaminationsquellenHauptkontaminationsquellen

• MilchMilch

• KolostrumKolostrum

•• Durch infizierten Kot verunreinigtes Futter oder Wasser Durch infizierten Kot verunreinigtes Futter oder Wasser

•• Kot infizierter Tiere Kot infizierter Tiere AusscheiderAusscheider

• TiergesundheitsproblemTiergesundheitsproblem

- Produktivität Milchleistung, Unfruchtbarkeit

Warum ist eine Kontrolle nötigWarum ist eine Kontrolle nötig ? ?

• Direkte wirtschaftliche VerlusteDirekte wirtschaftliche Verluste

Handelsbeschränkungen

- Vorzeitiger Abgang

• Einfluss aufEinfluss auf den den Handel Handel

• Öffentliche GesundheitÖffentliche Gesundheit ??? ??? Morbus Crohn

Aktuelle diagnostische MethodenAktuelle diagnostische Methoden

• ErregernachweisErregernachweis

• Nachweis von AntikörpernNachweis von Antikörpern

• Kultur (“Gold standard”)• PCR (Kot oder Milch)

• ELISA (Serum oder Milch)• KBR (Serum)

Komplemenäre Methoden mit unterschiedlichen Sensitivitäten Nachweis unterschiedlicher positiver Tiere

Milch undMilch und Serum ELISA Serum ELISA

Identisches Protokoll für beide Anwendungen

Vorinkubation mit M. phlei (1:2 Verd.)è Vermeidung

unspezifischer Reaktionen

(Entsprechend OIE-Empfehlung)

Indirekter ELISA

M. paratb. Antigen

TMB-Substrat

Milch / Sérum AK

Anti-Rinder IgGAK / PO-Konjugat

ValidationValidation der Tankmilchanwendung der Tankmilchanwendung

ValidationValidation

• Interne Validation : Institut Pourquier

• Externe Validation : Hinrich Voges Livestock Improvement

Hamilton, Neuseeland (laufende unabhängige Studie)

1 : 1 : InterneInterneValidationValidation

42 Milchherden (Bretagne) :

ð 1000 Einzelmilchproben

ð 42 Tankmilchproben

Spezifität

SpezifitätSpezifität in in Einzel Einzel-- und undTankmilchprobenTankmilchproben

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0-5 5-10 10-15 15-20 20-25 2 5 - 3 0 30-35 35-40 4 0 - 4 5 4 5 - 5 0 5 0 - 5 5 5 5 - 6 0 6 0 - 6 5 65-70 70-75 7 5 - 8 0 80-85 85-90 90-95 9 5 -100

>100

S/P-Klasse

% a

n P

rob

en

Einzelmilch

Tankmilch

NEGATIV POSITIV

Negative KontrollePositive KontrolleF

raglich

1 : 1 : InterneInterneValidationValidation

Die Sensitivität für Tankmilchanalysen wird normalerweise als dieFähigkeit angegeben, eine positive Probe in der Tankmilch einerbestimmten Anzahl von Tieren nachzuweisen.

Grenzen :

Schwierigkeiten, eine ausreichende Anzahl von klar definierten Serum/ Tankmilch-Paaren zu finden.

ð Prävalenzdaten unzuverlässig (begrenzte Sensitivität der Vergleichstests (Serum-ELISA: ≈ 50 %)

ð Kein Standardserum verfügbar (≠ Brucellose / Leukose …) Evaluierung ist immer relativ.

Im Moment ist die direkte Bewertung der Sensitivität auf 10 Herdenbegrenzt.

FIGURE 2 CORRELATION BETWEEN S/P AND SEROPREVALENCE IN FIELD BULK MILK

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 25 30 35

PREVALENCE

S/P

CUT OFF LIGNE

NEGATIVEZONE

POSITIVEZONE

1 : 1 : InterneInterneValidationValidationIndirekte Bewertung der Sensitivität :

Milch enthält ca. 25x weniger AK als Serum

ð Herstellung von «künstlichen Milchproben » ist möglich :

1. «Künstliche stark-positive Milch» :

- Serumpool aus 30 «eher stark positiven» Feldseren

- Verdünnung dieses Pools in negativer Milch (1:25 )

2. «Künstliche schwach-positive Milch»

Verdünnung des Kit-internen Kontrollserums (≅ cut-off) in negativer Milch (1:25)

ð Analyse dieser Milchproben in « log2-Verdünnungen.

DETECTION OF A " MEDIUM " AND A " WEAK " POSITIVE MILK IN A BULK

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

140%

160%

180%

200%

PUR 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128

S/P

*100

Dilution of a " médium " positive milk in a bulk

Dilution of a "weak " positive milk in a bulk

FIGURE 3

NEGATIVEZONE

POSITIVE ZONE

BULK SIZE

CUT OFF LIGNE

1 : 1 : InterneInterneValidationValidation

Indirekte Bewertung der Sensitivität :

Die «künstliche mittelstark-positive Milch» wird bis zu einerVerdünnung von 1:50 nachgewiesen.

Aber : Hängt von dem Antikörpergehalt des gewählten Serumsab. ð Standardserum wäre nötig zum Vergleich derverschiedenen Techniken!

Die «künstliche schwach-positive Milch » wird bis zu einerVerdünnung von 1: 3 nachgewiesen.

ð Zur Qualifizierung von gesunden Herden ungeeignet, abererlaubt eine Überwachung der Prävalenz

2 :2 : ExterneExterne Validation Validation (LivestockImprovement)

• 11 Herden

• 1664 Serum / Einzelmilch - Paare

• Analyse im Serum- und Milch-ELISA

2 :2 : ExterneExterne Validation Validation (LivestockImprovement)

Zusammensetzung der Herden

Herd Herd sizeSample size(% of herd)

of theherd

of tested cows

A 287 cows 150 cows (52%) 83% Jersey (56%); Friesian (32%) 4.8 years 6.2 years

B 399 cows 112 cows (28%) 84% Friesian (75%); Jersey (21%) 4.8 years 6.2 years(About 1/2 the herd was newly purchased - thus excluded from trial.)

C 254 cows 141 cows (56%) 87% Jersey (72%); Ayrshire (20%) 4.8 years 5.9 years

D 682 cows 324 cows (48%) 93% Jersey (99%) 5.1 years 7.3 years

E 534 cows 181 cows (34%) 60% Jersey (86%); Friesian (9%) 5.4 years 6.6 years

F 341 cows 188 cows (55%) 89% Jersey (94%) 5.2 years 6.8 years

G 340 cows 162 cows (48%) 85% Friesian (90%) 4.8 years 6.5 years

H 206 cows 113 cows (55%) 90% Jersey (86%); Friesian (14%) 5.0 years 6.5 years

I 453 cows 124 cows (27%) 62% Friesian (79%); Other (13%) 5.4 years 7.6 years

J 220 cows 130 cows (59%) 92% Jersey (70%); Friesian (25%) 5.0 years 6.5 years

K 209 cows 95 cows (45%) 73% Jersey (89%) 4.8 years 6.0 years

Min age: 4 yearsOverall 3 925 cows 1720 cows (44%) 81% Jersey (62%); Friesian (31%) 5.1 years 6.7 yearsMax age: 19 years

4 years (3rd)

4 years (3rd)

4 years (3rd)

4 years (3rd)

4 years (3rd)

5 years (4th)

4 years (3rd)

4 years (3rd)

5 years (4th)

4 years (3rd)

Predominant breeds(cows classed by breed if >80% ancestry = 1 breed)

Average age

Minimum age of tested cows (lactation)

4 years (3rd)

% of elegible

cows tested

2 :2 : ExterneExterne Validation Validation (LivestockImprovement)

Ergebnise pro Herde

HerdCows

sampledSerum ELISA Milk ELISA Both tests

Either test p o s

Serum ELISA

Milk ELISA

serum ELISAresults if

milk ELISAresults if

SE = 25.00% SE = 20.00% SP = 99.50% SP = 99.50%

A 150 cows 5 cows 8 cows 5 cows 8 cows 3.33% 5.33% 11.56% 24.79%

B 112 cows 4 cows 1 cows 1 cows 4 cows 3.57% 0.89% 12.54% 2.01%

C 138 cows 1 cows 4 cows 1 cows 4 cows 0.72% 2.90% 0.92% 12.30%

D 279 cows 19 cows 14 cows 14 cows 19 cows 6.81% 5.02% 25.76% 23.17%

E 175 cows 15 cows 12 cows 11 cows 16 cows 8.57% 6.86% 32.94% 32.60%

F 187 cows 6 cows 5 cows 5 cows 6 cows 3.21% 2.67% 11.06% 11.15%

G 162 cows 3 cows 4 cows 2 cows 5 cows 1.85% 2.47% 5.52% 10.10%

H 113 cows 5 cows 2 cows 2 cows 5 cows 4.42% 1.77% 16.02% 6.51%

I 124 cows 6 cows 4 cows 2 cows 8 cows 4.84% 3.23% 17.71% 13.98%

J 130 cows 2 cows 2 cows 1 cows 3 cows 1.54% 1.54% 4.24% 5.33%

K 94 cows 2 cows 1 cows 1 cows 2 cows 2.13% 1.06% 6.64% 2.89%

Overall 1 664 cows 68 cows 57 cows 45 cows 80 cows 4.09% 3.43% 14.64% 15.00%

Number of positive cows (on biwell test) Prevalence Presumed ' t rue ' prevalence based on

2 :2 : ExterneExterne Validation Validation (LivestockImprovement)

Zusammenfassung

Sensitivität (Milch): 67.9%Sensitivität (Serum): 85.7%Relative Spezifität Milch // Serum : 99.2%Korrelation: 78.5%

Serum

Milch POS NEG Total

POS 45 12 57

NEG 27 1580 1607

Total 72 1592 1664

Vorläufige SchlussfolgerungenVorläufige Schlussfolgerungen• ELISA funktionniert mit Milchproben

• Einzelmilchproben: Sensitivität etwas geringer als fürSerumproben (67,9% // 85,7%)

• Widersprüchlichkeiten zwischen Serum und Milchprobendesselben Tieres : Korrelation 78%(è klassisch in der Serologie, cf IBR )

• Sehr gute Spezifität (100% bzw. 99,2%)

• Tankmilch: Nicht geeignet zur Qualifikation von gesundenHerden, aber eine Überwachung der Prävalenz scheintmöglich

• Hinweis, dass eine Prävalenz von 5-30% (Pools von 3bis 50 Tieren) mittels Tankmilchanalysen nachgewiesenwerden kann.

Korrelation MilchKorrelation Milch / Serum (IBR) / Serum (IBR)

Letzte positiv gefundene Verdünnungin Milch / Serum - Paaren (n=)