Uso de Linfcitos B em Terapia Gnica Contra TumoresPs-Graduao em Imunologia Bsica e Aplicada

M.Sc. William Roberto SchluchtingProf. Dra Arlete A.M. Coelho-CasteloFaculdade de Medicina de Ribeiro Preto FMRP - USP

O QUE TERAPIA GNICA?Transferncia de genes nas clulas do paciente:Recuperar a funo;Atribuir uma nova atividade gnica;Aumentar a atividade de genes ativos.

Doenas genticas ou adquiridas.

COMO FUNCIONA A TERAPIA GNICA?Genes introduzidos nas clulas;Sistema independente de expresso;Recuperar a funo gnica;

Histrico da Terapia Gnica- Pr-Terapia Gnica Clnica

1970 Stanfield Rogers: vrus Shope papilloma - Crianas com arginemia;

1983 1989 Inicio da era de pesquisa clnica da TG Vetores retrovirais;

1989 W.F. Anderson, M. Blease, S. Rosenberg: 1 transferncia gnica p/ Humanos gene neoR em TIL (Tumor Inflitrating Lymphocytes)Gene arginase ArgininaMorales M.M. TERAPIAS-AVANADAS: CLULAS-TRONCO, TERAPIA GNICA E NANOTECNOLOGIA APLICADA SADE. 2007

Ps-Terapia Gnica

1990 W.F. Anderson: 1 estudo clnico de TG criana com imunodeficincia grave combinada (SCID Severe Combined Immunodeficiency) Introduzido gene da adenosina deaminase (ADA) resultado publicado em 1995;

1992 James Wilson: 1 experimento de TG para rgo interno, hepatcitos modificados com vetor retroviral com o gene do receptor LDL;

1993 Ronald Crystal: 1 TG em Fibrose Cstica usando adenovirus ;

1996 Inicio da ASGT: American Society of Gene Therapy;

2003 China: 1 droga de TG Adenovirus/p53 para tratamento de cancer;

2006: + de mil protocolos clnicos aprovados , envolvendo cerca de 5000 paciente em todo o mundo.

Morales M.M. TERAPIAS-AVANADAS: CLULAS-TRONCO, TERAPIA GNICA E NANOTECNOLOGIA APLICADA SADE. 2007

1997 - UNESCO adopts Universal Declaration on the Human Genome and Human Rights, prohibiting germline interventions. http://portal.unesco.org/shs/en/ev.php-URL_ID=1881 &URL_DO=DO_TOPIC&URL_SECTION=201.html

Biotecnologia _ CiasRegulamentao AmericanaRegulamentao EuropiaW.F. AndersonUso Material Gentico

Terapia Gnica x Sistema Imune

Terapia Gnica no BrasilEm 2004 foi criada a Rede de Terapia Gnica

27 institutos ou Departamentos de 6 estados (Rio de Janeiro, So Paulo e Rio Grande do Sul), financiados pelo Institutos do Milnio do CNPq/MCT.

Pesquisas: introduo de genes com efeito teraputicoQual o alvo do Brasil?- terapia gnica em cncer- doenas graves do metabolismo- doenas degenerativas e cardiovasculares- vacinas de DNA profilticas para doenas infecciosas e vacinas de DNA teraputicas para HPV

Terapia Gnica no BrasilRede composta por:Rio de Janeiro: o Instituto de Biofsica da UFRJ, o Instituto Oswaldo Cruz e o Instituto Nacional do Cncer (INCA);

So Paulo: os Departamentos de Microbiologia e Biologia Celular e Desenvolvimento da USP, o CINTERGEN da UNIFESP, o InCor e o Instituto Butant;

Rio Grande do Sul: os Departamentos de Gentica e de Biofsica e o Hospital de Clnicas da UFRGS, bem como o Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul.

Terapia Gnica no Brasil1o. Estudo Clnico em pacientes cardacos (isquemia) fases 1 e 2 (segurana e eficcia)Coordenado pelo Dr. Renato Karan Kalil Inst. Cardiologia do Rio Grande do Sul

Grupo de 10 pacientes tratados com injeo de DNA (plasmdeo c/gene VEGF-165) diretamente no corao estimula angiognese

8 pacientes apresentaram bons resultados:-aumento na capacidade de bombear sangue-desempenho em testes de esforo fsico

Freqncia dos Vetores Utilizados na Terapia Gnica

1. Insero de um gene em um vetor 2. Contato Vetor / Clula 3. Entrada e transporte do gene at o ncleo da clula 4. Transcrio do RNAm a partir do gene 5. Traduo do RNAm em protena 6. Secreo, fixao na membrana ou expresso citoplasmtica da protena

Terapia gnica germinativa

Terapia gnica somtica

FORMAS POTENCIAIS DE TERAPIA GNICA

Terapia gnica para a mutao little(lit): hormnio do crescimentoRegulador-Promotor da Metalotionena: remover metais pesados

VIAS DE TERAPIA GNICA Terapia Gnica in vivo

Terapia Gnica ex vivo

TERAPIA GNICA DE CLULAS SOMTICASTerapia ex vivo: as clulas do paciente so retiradas e manipuladas fora do corpoTerapia in vivo: as clulas so tratadas dentro do corpo

http://www.smartplanet.es/articulos.php?pageNum_ctapag=6&totalRows_ctapag=11&id=9-4-3Terapia gnica in vivo

Terapia Gnica in vivoIsquemiaDoenas vasculares cardacas ou de membros- Genes que promovem a angiognese

Vacinao GnicaGenes que codificam antgenos Induo RI- Adenovirus, Vaccinia e plasmdeoInjeo direta, eletroporao ou gene gun

Vacinas de DNA Tang et al., 1992 Nature 356, 1992

Fynan et al., 1993 PNAS 90, 1993

Ulmer et al., 1993. Science 259, 1993 Gene = vacinaExpresso protena heterloga in vivoInduo RI }Anticorpos

Fcil produo escala industrial e estocagem

Baixo custo produo

RI

Ledwith, B et al., 2000; Manam S., et al., 2000Pizetsky DS, 2000; Prudhomme, GJ et al., 2001Vantagens das Vacinas de DNA

Endocitose/receptor ?MicroambienteEndossomo-lisossomo

DNAsespHAdenovrus 2 e 5integrinaHNcleoTrfego dos vetores in vivoMecanismos desconhecidos

MicroesferasLipossomasGene gun

TERAPIA GNICA NO VACINAL1- REINTRODUO ex vivo gene transfectado in vitro

2- TRANSFECO CLULA ALVO in vivo

2.1 Sistmica

2.2 LocalTransferncia dos genes mediada por vetor

Terapia Gnica ex vivoCultura de clulas;Transferncia Gnica;Seleo de clulas modificadas.

Terapia gnica ex vivo

Clulas transfectadas- Queratincitos;- Clulas musculares;- Clulas dendrticas e macrfagos alvo tumoral

- So utilizadas no mtodo ex vivo, clulas do organismo so retiradas e tratadas com o vetor; Novas alternativas Terapia Gnica

Reintroduo da clula modificadaAlgumas circunstncias : Reinfuso Local

Vantagem: Procedimento nico

DesvantagensProcesso caro e trabalhosoManuteno in vitro das clulas alteraesComplexidade da terapia ex vivo

Diferentes abordagens Terapia Gnica

Uso de Linfcitos B em Terapia GnicaLinfcitos B, clulas classicamente envolvida RI humoral,

1- Maquinaria de produo proteica altamente eficiente promotor para produo IgPor que usar linfcito B? Favorecer expresso heterlogaBaixo custo X CD

Uso de Linfcitos B em Terapia Gnica2- Transfeco Intra-esplnica de camundongos sucesso!

- Invasivo, direto bao (Zanetti M, et al. Int. Rev. Immunol. 2006)

3- Clulas B capturam plasmideo in vivo, aps Imunizao IM e Expressa protena heterloga.(Coelho-Castelo, et al. Human gene Therapy 2003)

CD11b FITC

CD19 - FITCDeteco Plasmdeo em CD11b e CD19Coelho-Castelo et al.,2003ConfocalpcDNA-3hsp65Alexa-fluor 594Uso de Linfcitos B em Terapia Gnica

Clulas B Capturam Plasmdeo e ExpressamProtena Recombinante Coelho-Castelo et al., Human gene Therapy, 2003

Analisar o papel de linfcitos B na produo de protenas heterlogas aps transfeco in vitro, in vivo e ex vivo usando plasmdio codificando para GFP e IL-12.

Determinar a cintica de produo da protena ex vivo e in vitro;Avaliar possveis alteraes fenotpicas nos linfcitos B aps a eletroporao; Avaliar a eficincia do uso de linfcitos B-transfectados com IL-12, em imunoterapia gnica usando modelo de melanoma experimental.

OBJETIVOS

Resultados 12Kb

A B C DA: Padro 1KbB: pIRES vetor +/- 4,7KbC: pIRES-IL12 +/- 5,2KbD: pEGFP-C2 +/- 4,7Kb5,2 Kb4,7 Kb

Delineamento Experimental in vitro

Expresso GFP In vitro

Delineamento Experimental ex vivoAnimais BKO

Expresso de GFP in vivo

Delineamento Experimental in vitro

Expresso in vitro IL-12

Delineamento Experimental in vitro

Expresso de IL-12 em Linfcitos B in vitro

Delineamento Experimental in vitro GFPIL12KO

Expresso de GFP em Linfcitos B de IL-12KO in vitro

Avaliao do processo de transfeco no fentipo ou atividade de linfcitos B/GFP - Transferncia Adotiva

Sete Dias Aps a Transferncia Adotiva

Quinze Dias Aps a Transferncia Adotiva

Deteco de plasmdeo em outras subpopulaes de clulas aps a transferncia adotiva.DNA marcado com Alexa 488

Deteco de plasmdeo em outras subpopulaes de clulas aps a transferncia adotiva.

Avaliao da eficincia dos linfcitos B transfectados em terapia gnica

Sobrevida

Massa Tumoral

Bao

Histologia do Melanoma B16F10A: WT 400xB: WT 200xC: IL12KO 200xD: IL12KO Trat. 200xE: IL12KO Trat. 400x

Concluses Foram capazes de levar a produo in vivo e in vitro de uma protena heterloga tanto GFP como interleucina 12;

A transferncia adotiva de Linfcitos B para animais WT, ou IL-12 KO diminuiu a massa tumoral, aumentou a sobrevida e aumentou recrutamento de linfcitos intra-tumorais do tipo CD4, CD8 e NK.

Linfcitos B transfectados podem leva a produo in vivo de protenas heterlogas biologicamente ativas, podendo ser uma nova ferramenta em Terapia Gnica.

OBRIGADO!