Osnove bioorganometalne

kemije

Izv. prof. dr. sc. Lidija Barišić

Literatura:

1. G. Jaouen (Editor), Bioorganometallics: Biomolecules, Labeling, Medicine, John Wiley &

Sons, Weinheim, 2006.

2. G. Simonneaux (Editor), Bioorganometallic Chemistry (Topics in Organometallic

Chemistry), Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2006.

3. P. Štepnička (Editor), Ferrocenes: Ligands, Materials and Biomolecules, John Wiley &

Sons, Chichester, 2008.Sons, Chichester, 2008.

4. D. R. van Staveren, N. Metzler-Nolte, Bioorganometallic Chemistry of Ferrocene, Chem.

Rev. 104 (2004) 5931-5985.

5. V. Rapić, M. Čakić Semenčić I. Organometalna i bioorganometalna kemija, Kem. Ind. 60

(2011) 61-79.

6. E. A. Hillard, G. Jaouen, Bioorganometallics: Future Trends in Drug Discovery, Analytical

Chemistry and Catalysis, Organometallics 30 (2011) 20-27.

I. Bioorganometalna kemija – uvod

(G. Jaouen, W. Beck, M. J. Glinchey)1

* ”Po opće prihvaćenoj definiciji organometalni spoj sadrži bar jednu vezu metal-ugljik

koja potječe iz organske molekule.”7

• BioBioorganoorganometalnametalna kemija: sinteza i

studij konjugata organometalnih spojeva* i

biomolekula (steroida, šećera, aminokiselina,

peptida, DNA, vitamina i enzima).

koja potječe iz organske molekule.”7

7 Popović, Z. Osnove kemije organometalnih spojeva, Prirodoslovno-matematički fakultet Sveučilišta u Zagrebu, 2012.

C Xδ δ

Nu

C Mδ δ

• Nukleofilni ugljikov atom iz organometalnog spoja u reakciji s elektrofilnim ugljikovim

atomom (iz alkil-halogenida, estera, aldehida, ketona) stvara novu C−C vezu ⇒ mogućnost

sinteze kompleksnih molekula iz manjih polaznih molekula.

ORGANOMETAL

R−−−−M−−−−X

R−−−−M CH3−Li

CH3−Mg−Br

Tip veze Primjeri

LNI

SPOJEVI

R−−−−M−−−−R C5H5−Fe−C5H5

• Polarne organometalne veze (veze ugljik−metal)

mogu se predstaviti rezonancijskim hibridom

kovalentne i ionske strukture,

• veća razlika u elektronegativnosti metala u odnosu na ugljik pridonosi porastu ionskog

karaktera veze te većoj reaktivnosti organometalnog spoja,8

C Mδ δ

C M

veza C−Li C−Mg C−Al C−Zn C−Sn C−Cu C−Hg

razlika u

Ionski karakterIonski karakter

EC - EM

ECx 100• najčešće se klasificiraju prema indeksu postotnog udjela ionskog karaktera:

razlika u elektronegativnosti

1,5 1,3 1,0 0,9 0,7 0,6 0,6

postotni udio ionskog karaktera

60 52 40 36 28 24 24

8 W. H. Brown et al, Organic Chemistry, Seventh Edition, Brooks/ Cole, Belmont, USA, 2013.

NukleofilnostNukleofilnost

• osim elektronegativnosti metala, na karakter C−M veze utječe i struktura organskog dijela

molekule; ionski karakter raste ukoliko se karbanion može stabilizirati rezonancijskom

delokalizacijom ili utjecajem elektron-odvlačećih supstituenata,

• većina organometalnih spojeva sadrži polarnu kovalentnu C−M vezu.

o primjeri bioorganometalnih spojeva sintetiziranih

u Laboratoriju za organsku kemiju PBF-a9

FFFFeeeeNH

HN

O

ONH

HN

ONH

O

O

OHOHO

OH

O

OH

O

O

Me

FFFFeeeeR

n

OOH OOH

(a) (b)

(c) (d)O

HOO

OH

NHAc

HN

NH

O

O

Fe

O

MeO

9(a) L. Barišić et al, Helically Chiral Ferrocene Peptides Containing 1'-Aminoferrocene-1-Carboxylic Acid Subunit as Turn Inducers, Chemistry A European

Journal 12 (2006) 4965.

(b) L. Barišić et al, Ferrocene conjugates with mannose: synthesis and influence of ferrocene aglycon on mannose-mediated adhesion of E. coli, Applied

Organometallic Chemistry 26 (2012) 74

(c) L. Barišić et al, The first ferrocene analogues of muramyldipeptide, Carbohydrate Research 346 (2011) 678.

(d) L. Barišić et al, Ferrocenyl-Labeled Sugar Amino Acids: Conformation and Properties, Organometallics 31 (2012) 3683.

HOO

OH

NHAc

HN

O FFFFeeee

R

Uloga metala?

• As, Cd, Co, Cr, Cu, Ni i V predstavljaju karcinogene

agense,10

• metal-inducirana karcinogeneza uključena je u sve

faze razvoja karcinoma,

• metali i metalni spojevi prisutni su u svim staničnim

strukturama uključujući membrane, mitohondrije,

endoplazmatski retikulum, jezgru i lizosome,

• sudjeluju u staničnim procesima (proizvodnji energije

10 S. S. Leonard et al, Metal-induced toxicity, carcinogenesis, mechanisms and cellular responses, Molecular and Cellular Biochemistry 255 (2004) 3.

• sudjeluju u staničnim procesima (proizvodnji energije

kroz elektronski transport, detoksifikaciju),

• metalni se ioni na stanične komponente vežu

koordiniranjem ili ionskim vezama, čime mogu

mijenjaju strukturu veznog mjesta,

• vezivanjem metala na DNA i proteine dolazi do lezija, kidanja lanaca i modifikacije baza čime

metal utječe na stanični odgovor.

o koordinirani kompleksi: neutralne molekule ili anioni

(ligandi) vezani su na centralni metalni atom ili ion koordiniranom kovalentnom vezom,

• tetraedarski atom ugljika može se javiti u

dva enantiomerna oblika, dok atom

metala sa svojih 6 supstituenata može

imati i do 30 različitih stereoizomera

(strukturna raznolikost!) ⇒ prednost

organometalnih kompleksa u odnosu na

čiste organske spojeve!,

• u kinetički inertnim kompleksima prijelaznih metala (Ru, Os i Ir) ne opaža se racemizacija, što

znači da su njihovi kompleksi stereokemijski stabilni te se najčešće koriste u medicinskim

istraživanjima,

• metalni ioni igraju važnu ulogu u vitalnim

biokemijskim reakcijama proteina, enzima,

nukleinskih kiselina,...11-13

• smatra se da je trećini proteina neophodan

metalni kofaktor (Cu, Fe, Zn ili Mo),

11 E. J. New, Tools to study distinct metal pools in biology, Dalton Trans. 2013, Advance Article

12 Pandya, N. Et al., DNA Binding, Antioxidant Activity and DNA Damage Protection of Chiral Macrocyclic Mn(III) Salen Complexes, Chirality 2012 (early view)

13 T. V. O’Halloran et al, Metallochaperones, an Intracellular Shuttle Service for Metal Ions, The Journal of Biological Chemistry 33 (2000) 25057.

o metalotionein, ključan za tjelesnu ravnotežu i

detoksifikaciju,

o metalošaperoni, “intracellular shuttle service for

metal ions”12,

o albumin i transferin, esencijalni za transport metala

u krvi,

• C−M veza izvor je različitih elektronskih i steričkih

METALS IN MEDICINE AND THE ENVIRONMENT

• C−M veza izvor je različitih elektronskih i steričkih

efekata kojima se može kontrolirati biološka

aktivnost,

• smatra se da je citotoksičnost posljedica direktnog

vezivanja fragmenta metalnog kompleksa na

biološku metu pri čemu se jedan ili više metalnih

liganada supstituira s biomolekulom,

o pojednostavljeni prikazi supstitucije liganda Ru-kompleksâ s biomolekulama

(DNA, proteinima); rezultirajući bioorganometalni kompleksi ostvaruju antikancerogeni

učinak!14

14 N. Metzler-Nolte et al, A Ruthenocene-PNA bioconjugate – synthesis, characterization, cytotoxicity and AAS-detected cellular uptake, BioconjugateChem. 23 (2012) 1764.

• Kemoterapeutski mehanizam rutenijskih kompleksa uključuje razaranje mitohondrija,15

• mitohondriji kanceroznih stanica strukturno i funkcionalno razlikuju se od mitohondrija

normalnih stanica (u zdravim se stanicama ATP stvara oksidativnom fosforilacijom, dok ga

tumorske stanice generiraju glikolizom, tumorske stanice imaju viši mitohondrijski

membranski potencijal),

• razaranjem mitohondrija oslobađaju se proapoptotični proteini i aktiviraju mehanizmi

programirane stanične smrti.

15 J.-Q. Wang et al, Mitochondria are the primary target in the induction of apoptosis by chiral ruthenium(II) polypyridyl complexesin cancer cells, J. Biol. Inorg. Chem. 2013 (Epub ahead of print).

U čemu je značaj bioorganometalnih spojeva?

• Funkcija našeg organizma zasniva se na transportu tvari i energije u čemu krucijalnu ulogu

imaju metali zahvaljujući svojoj sposobnosti apsorpcije naboja,

• bioorganometalni spojevi mogu apsorbirati naboj i stvarati ionske veze što omogućava

odvijanje reakcija koje su bez njihovog sudjelovanja teško izvedive ili neizvedive,16

• primjenjuju se kao receptori za bio-

loški važne molekule te kao kalupi

za stvaranje foldamera, osjetljivihza stvaranje foldamera, osjetljivih

sondi, kromofora, redoks-aktivnih

spojeva i kemosenzora,

• istražuju se kao potencijalni terape-

utici za kancerogena oboljenja te

gljivične, bakterijske i parazitske

infekcije.

16 A. L. Laine, C. Passirani, Novel metal-based anticancer drugs: a new challenge in drug delivery, Current Opinion in Pharmacology 12 (2012) 420.

Podjela metalnih antikancerogenih spojeva prema načinu djelovanja

I. Metal ima funkcionalnu ulogu (vezuje se na biološku metu)

II. Metal ima strukturnu ulogu

• Pri dizajnu i sintezi organometalnih lijekova mora se znati koji je dio bioaktivne molekule

esencijalan za biološku aktivnost; takva razmatranja dovode do podjele metalnih

antikancerogenih lijekova u 5 glavnih skupina:17

17 T. Gianferrara, A categorization of metal anticancer compounds based on their mode of action, Dalton Trans. (2009) 7588.

II. Metal ima strukturnu ulogu

(vezuje se na biološku metu nekovalentnim interakcijama)

III. Metal je prijenosnik aktivnih liganada koji se dopremaju in vivo

IV. Metal je katalizator

V. Metalni spoj je fotoaktivan

I. Funkcionalni spojevi čija je aktivnost posljedica direktnog vezivanja metalnog fragmenta na

biološku metu

• Funkcionalni spojevi su najčešće prolijekovi koji se aktiviraju hidratacijom,

• moraju imati bar jedan ligand koji podliježe supstituciji, odnosno bar jedno mjesto pogodno za

vezivanje s biološkom metom,

• prvi, a ujedno i najefikasniji antikancerogeni

lijek je cisplatin; u kliničkoj su primjeni i

karboplatin i oksaliplatin, njegovi analozi druge i

treće generacije,

• nakon intravenoznog unosa, neutralni cisplatin se otapa u vodi iz krvožilnog sustava te• nakon intravenoznog unosa, neutralni cisplatin se otapa u vodi iz krvožilnog sustava te

pasivnom difuzijom dospijeva u stanice,

• antitumorska aktivnost posljedica je

vezivanja kationskog hidratiranog

kompleksa s jezgrinom DNA; takvi

adukti uzrokuju distorziju DNA što

rezultira inhibicijom replikacije i

transkripcije, a čak može uzrokovati i

apoptozu.

II. Strukturni spojevi

• U strukturnim metalnim antikancerogenim lijekovima metalni ion nije direktno vezan za biološku

metu,

• mehanizam njihova djelovanja sličan je organskim lijekovima, s tim da se strukturni spojevi ne

mijenjaju in vivo,

• manje su toksični od funkcionalnih spojeva,

• u najjednostavnijim primjerima strukturnih spojeva metalna se skupina ugrađuje u organsku

okosnicu etabliranih lijekova,

• ferokin, ferocenski analog klorokina, jedan je

od napoznatijih i nauspješnijih primjera

strukturnih lijekova; aktivan je i prema

klorokin-rezistentnim sojevima,

• umetanje metalnog fragmenta u organsku

molekulu može dovesti i do neočekivanih

rezultata; za razliku od izvornog tamoksifena

koji se koristi u liječenju ER+ tumora

dojke, ferocenski analog ferocifen citotoksičan

je prema ER+ i ER- staničnim linijama.

III. Metalni ioni kao prenosioci aktivnih liganada

• takav kompleks mora biti stabilan i inertan da bi se izbjeglo

prebrzo otpuštanje nakon unosa,

• Cu(II)-kompleksi nesteroidnih antiinflamatornih lijekova (aspirina i

ibuprofena) često pokazuju poboljšanu aktivnost, pri čemu se

smanjuju gastrointestinalne nuspojave,

• Fizikalno-kemijska i farmakološka svojstva etabliranih organskih lijekova

moguće je poboljšati njihovim koordiniranjem se metalnim ionima,

IV. Metalni kompleksi kao katalizatoriIV. Metalni kompleksi kao katalizatori

• Organometalni polu-sendvič Ru(II)-kompleks premda vrlo inertan (ne

može se aktivirati hidratiranjem), ostvaruje visoku citotoksičnost

prema nekim humanim tumorskim staničnim linijama,

• citotoksičnost je posljedica porasta reaktivnih kisikovih spojeva (ROS)

generiranih tijekom oksidacije glutationa (GSH) u GSSG, procesa

kataliziranog organometalnim kompleksom,• organometalni ligand sam ne može oksidirati glutation, ali nakon koordiniranja s N,N-

dimetilfenil-azopiridinom dolazi do promjene njegovih elektronskih svojstava (dušikov atom

postaje dovoljno pozitivan) tako da se može reducirati djelovanjem glutationa.

Organometalni spojevi

i terapija

Organometalni spojevi

i terapija

Toksikologija

Okoliš

Toksikologija

OkolišMolekulsko prepoznavanje

u vodenom mediju

Molekulsko prepoznavanje

u vodenom mediju

Bioanaliza i senzoriBioanaliza i senzori

Enzimi

Peptidi, proteini

Enzimi

Peptidi, proteini

• Pet glavnih područja koja objedinjuje bioorganometalna kemija:

Bioorganometalna

kemija

Bioorganometalna

kemija

• Broj znanstvenih publikacija objavljenih u području bioorganometalne kemije bilježi stalan porast:

0

50

100

150

200

250

300

1986-1990

1990-1995

1995-2000

2000-2005

2005-2010

2010-2012

II.1. Organometalni spojevi kao terapeutici

1. Početkom 20. stoljeća suradnja kemičara i biologa iznjedrila je

zaključak da su organski arsenovi spojevi manje toksični od

svojih anorganskih analoga. Za medicinsku primjenu

organo-arsenovih spojeva kao antiparazitika dodijeljena je

Nobelova nagrada 1908.,

• salvarsan, lijek koji se koristio u liječenju

Science Museum, London

II. Povijesni pregled razvoja bioorganometalne kemije1

• salvarsan, lijek koji se koristio u liječenju

sifilisa, u tijelu oksidira u stabilni mafarsen,

koji je tijekom 30-ih godina prošloga

stoljeća preuzeo primat u terapeutskoj

primjeni,

• s obzirom da enzimi s pomoću kojih bakterije cijepaju šećere iz stanične stijenke mogu biti

blokirani djelovanjem spojeva koji sadrže arsen, prikazani se spojevi mogu koristiti kao

antibiotici,

Salvarsan Mafarsen

2. Nakon Rosenbergova otkrića antitumorskog djelovanja kompleksâ platine (1965.), o njima

je objavljeno preko 20.000 članaka,

• atom platine iz cisplatina kovalentno se veže na purinski N7 tvoreći 1,2- ili 1,3-unakrsne

veze; adukti cisplatin-DNA uzrokuju različite stanične odgovore (sprečavanje

replikacije, inhibicija transkripcije, obnavaljanje DNA, apoptoza),

3. Kompleksi rutenija pokazuju zanimljiva

antimetastatička svojstva, ali i nisku toksičnost in

vivo. Među njima posebno mjesto zauzima NAMI-A

[ImH][trans-RuCl4(dmso-S)(Im)] (Im = imidazol) koji

se od 1999. godine primjenjuje na Netherland Cancer

Institute of Amsterdam.

• DFT-studija vezivanja NAMI-A na integrin ⇒ antikancerogena aktivnost.• DFT-studija vezivanja NAMI-A na integrin ⇒ antikancerogena aktivnost.

II.2. Toksikologija i okoliš

• Minimata bolest: 1953. trovanje stanovnika u japanskom zaljevu Minimata

organo-živinim spojevima (CH3-Hg+X-; X=SCH3),18,19

• trovanje dietil-kositar-dijodidom (Sn(I)2(C2H5)2): u Francuskoj je zbog posljedica korištenja

lijeka stalinona u liječenju stafilokoknih infekcija umrlo 102 ljudi, a mnogi su trajno oboljeli od

neuroloških poremećaja. Fatalne posljedice korištenja ovoga lijeka pripisuju se dietil-kositar-

dijodidu, snažnom neurotoksičnom agensu.

18 T. Tsubaki, K. Irukayama, in Minamata Disease: Methylmercury Poisoning in Minamata and Niigata Japan, Kodansha, Tokyo, 1977.19 G. Pavlović, S. Siketić Sigurnost 53 (2011) 17.

Mehanizmi trovanja metalima

Inhibicija enzima

(najčešće vezivanjem za sulfhidrilne

skupine u aktivnim mjestima)

Porast reaktivnih kisikovih spojeva ROS Porast reaktivnih kisikovih spojeva ROS

(oksido/redukcijom metalnih iona,

inhibicijom antioksidacijskih enzima)

Karcinogeneza

(oksidacija DNA baza,

inhibicija enzima za popravak DNA)

II.3. Bioanalitičke metode bazirane na svojstvima organometalnih kompleksa

• 1977. uveden je pojam metalo-imunotest [(MIA, metallo immuno assay); imunotest u kojem se

kao obilježivač koristi metalni kompleks],

• najraniji metalo-imunotestovi bazirali su se na trima različitim analitičkim tehnikama:

atomskoj apsorpciji (nedovoljno osjetljiva zbog kontaminacije otapala metalima u

tragovima), elektrokemijskim mjerenjima (visokoosjetljiva i jeftina) i FT-IR-spektroskopiji,

o elektrokemijska detekcija lidokaina

(lijeka za srčanu aritmiju) obilježenoga

ferocenom,

o ferocenski kompleks za elektrokemijsko

praćenje glukoze u krvi: enzim uklanja

dva elektrona iz glukoze, preuzima ih

molekula-posrednik (ferocen) i prenosi

na radnu elektrodu,

o razvoj IR-spektroskopije (1980. godina) označava tehnološku revoluciju u području analitičkih

tehnika, zahvaljujući jedinstvenom svojstvu karbonilnih organometalnih spojeva: pokazuju

rastezne vibracije M−CO veze pri ∼ 1800-2000 cm-1 (u području u kojemu nisu vidljive druge

organske funkcionalne skupine!),

o bez obzira na male količine estradiola u tkivima (uterus, određeni estrogen-ovisni tumori),

nakon obilježavanja organometalnim spojem [Cr(CO)3] moguće ga je detektirati zahvaljujući

karakterističnim signalima pri ∼ 2000 cm-1.

II.4. Prirodni organometalni spojevi

• 1965.: Povijesni primat u istraživanjima ugljik-metal veze u prirodnim sustavima pripada

vitaminu B12, njegovom koenzimu i metil-kobalaminu, za koje se dugo smatralo da su

jedini prirodni spojevi s metal-ugljik vezom,

• vitamin B12 ima ključnu ulogu u funkciji mozga i

živčanog sustava, te tvorbi eritrocita,

• nužan je za odvijanje triju važnih reakcija: (i)

izomerizacije, (ii) metiliranja (npr. konverzija

homocisteina u metionin) i (iii) pretvorbu riboze uhomocisteina u metionin) i (iii) pretvorbu riboze u

deoksiribozu (nukleotidi),

R = CN (vitamin B12)

R = CH3 (metilkobalamin)homocistein metionin R = 5’-deoksiadenozil (koenzim B12)

III. Rutenijsko-arenski antikancerogeni kompleksi (M. Melchart, P. J. Sadler)1

• Priroda metalnog iona, njegovo oksidacijsko stanje, tip i broj vezanih liganada određuju

njegovu biološku aktivnost,

o prikazani Pt(II)-kompleksi imaju kliničku

primjenu u liječenju karcinoma (cisplatin,

• otkrićem antikancerogene aktivnosti

kompleksa platine 1969. započela su

istraživanja drugih metalnih kompleksa kao

potencijalnih lijekova:20

primjenu u liječenju karcinoma (cisplatin,

prvi metalofarmaceutik, jedan je od

naprodavanijih citostatika); nedostatak je

visoka toksičnost,

o titanoceni: vjerovalo se da mogu reagirati

s DNA slično kao cisplatin te uzrokovati

apoptozu stanica raka; nedostatak je brza

hidroliza zbog čega se odustalo od daljnjih

istraživanja,20 A. M. Pizarro et al, Activation Mechanism for organometallic Anticancer

Complexes, Top. Organomet. Chem. 32 (2010) 21.

• potencijalni biološki značaj rutenijskih kompleksa21: inhibitori apsorpcije Ca2+, antikancerogeni

agensi, imunosupresanti, radiofarmaceutici,

• u vodi topljivi arensko-rutenijski kompleksi pogodni su za dizajn antikancerogenih lijekova zbog

svoje niske toksičnosti, ali i povoljne kombinacije hidrofilnih i lipofilnih svojstava što utječe na

transport u biološkom mediju,

o staurosporin, [inhibira kinazu (aktivnu u stanicama karcinoma prostate) zahvaljujući

kompeticijskom vezivanju za ATP-vezno mjesto], poslužio je kao strukturna inspiracija za

dizajn rutenijskih organometalnih inhibitora koji za biološku metu imaju jednu od 518

različitih kinaza enkodiranih u ljudskom genomu,različitih kinaza enkodiranih u ljudskom genomu,

21 G. Süss-Fink, Arene ruthenium complexes as anticancer agents, Dalton Transactions 39 (2010) 1673.

o antibakterijska aktivnost: RAPTA-C [niska

aktivnost in vitro (inaktivan prema

primarnim tumorima), vrlo aktivan in vivo

(inhibitor metastaza sekundarnih tumora),

o antikancerogena aktivnost: kationski

arensko- rutenijski kompleksi pokazuju

visoku citotoksičnost prema A2780

stanicama karcinoma jajnika i in vitro i in

vivo

o citotoksični arenski rutenijski

kompleksi s N,N-, N,O- ili O,O-

kelirajućim ligandima

• DNA i proteini su najvjerojatnije mete rutenijsko-arenskih

kompleksa,

• kristalografskom analizom i 2D NMR-spektroskopijom

potvrđena je veza između rutenijskog kompleksa i N7 iz

gvanozina odn. N3 iz timidina; vezivanje s N3 iz citidina je vrlo

slabo, dok veza s adenozinom nije opažena,

• s povećanjem koordiniranog arena povećava se i aktivnost u

staničnim linijama karcinoma jajnika,

• promjena kelirajućih liganada značajno utječe na kinetiku i• promjena kelirajućih liganada značajno utječe na kinetiku i

selektivnost arenskih rutenijskih kompleksa prema bazi,

IV. Organometalni terapeutici (G. Jaouen, S. Top, A. Vessières)1, 22

• Primjena organometalnih spojeva u liječenju bolesti bazira se na

korištenju poznatog vektora (“trojanskog konja”) koji doprema

organometalni lijek do ciljne stanice,

• uporabom takvih vektora može se prevladati problem rezistencije

na lijek, lakše ciljati stanice karcinoma i regulirati otpuštanje lijeka,

• sustavi za prijenos lijekova trebaju biti visoko selektivni, biorazgra-

divi te moraju osigurati vremenski kontrolirano otpuštanje lijeka,

(Nat

iona

lRes

earc

hC

ounc

ilC

anad

a)

IV.1. Uvod

• krvno-moždana barijera sprječava

prijenos lijeka D do ciljne stanice,

prin

cip

“tro

jans

kog

konj

a”(N

atio

nal

22 N. Metzler-Nolte et al, Organometallic Anticancer Compounds, J. Med. Chem. 54 (2011) 3.

• kompleks lijek-antitijelo DA

komplementaran je receptoru R1

na površini krvno-moždane

barijere,

• kompleks lijek-antitijelo-receptor

transportira se poput trojanskog

konja.23 B. Therrien, Drug Delivery by Water-Soluble Organometallic Cages, Top. Curr. Chem 319 (2012) 35.

o Pt(acac)2 (inducira apoptozu u stanicama raka dojke)

doprema se do ciljnih stanica zatvoren u organometalni

kavez, 23

o ferocen (M = Fe) sastoji se iz dvaju aniona (C5H5-) i jednog kationa Fe2+ (4s23d4),

• najranije terapeutski korišteni organometalni spojevi su metaloceni (male, rigidne, redoks-

aktivne, aromatske i lipofilne molekule koje lako prolaze kroz staničnu membranu),

Mo metaloceni, “sendvič-molekule”: atom metala (M = Fe, Co, Cr, Ni, V,...) smješten

je između dvaju ciklopentadienilnih (C5H5) prstena,

o svoju veliku stabilnost duguje prisutnosti 18 valentnih elektrona [Fe(0) = 8 valentnih

elektrona (4s23d6) + 2 Cp⋅ = 2 × 5 valentnih elektrona] što mu daje konfiguraciju plemenitog

plina,o 1973. Nobelova nagrada G. Wilkinsonu i E. O. Fischeru za utvrđivanje strukture ferocena

i rezultate na području organometalnih sendvič-spojeva,

H

H

B

H2 2 + Fe2+ Fe

• zamjenom aromatske podjedinice iz penicilina i cefalosporina s ferocenom pripravljena je

serija potencijalnih organometalnih inhibitora β-laktamaze,

• primjenom metalocena nastojao se prevladati problem rastuće rezistencije nekih bakterija

na antibiotike (za rezistenciju je odgovorna β-laktamaza koja razgrađuju antibiotike iz

skupine penicilina i cefalosporina),

HOOC H

β-laktamaza

o u direktno vezanim analozima

nije opažena aktivnost!

o umetanjem metilenskih razmaknica

obnavlja se antimikrobna aktivnost!

o unatoč pokazanoj antimikrobnoj aktivnosti,

ferocenski analozi penicilina i cefalosporina

nisu komercijalizirani,

• obećavajući rezultati u liječenju

anemije i bolesti zubnog mesa

postignuti su s feroceronom,

COONa × 4H2O

IV.2. Metalni kompleksi selektivnih modulatora estrogenskih receptora (SERMs)1,24,25

• Rast ⅔ stanica karcinoma dojke stimuliran je estrogenom,

su locirane blizu gena i kontrolirane

• tkiva koja su pod utjecajem estrogena sadrže estrogenske receptore

koji su, uz molekule DNA, smješteni u staničnoj jezgri,

• u odsutnosti estrogena, njihovi su receptori inaktivni i ne utječu na

DNA,

• nakon vezivanja estrogena na receptor, mijenja se oblik receptora te se nastali kompleks

estrogen-receptor veže na specifične DNA-sekvence ERE (estrogen response element) koje

su locirane blizu gena i kontrolirane

estrogenom. Potom se kompleks estrogen-

receptor vezuje na koaktivator proteina te bliži

geni postaju aktivni. Aktivni geni proizvode

mRNA koja upravlja sintezom proteina,

• nastali proteini mogu utjecati na stanice (npr.

uzrokovati proliferaciju epitela),

24 M. Kvasnica et al, Synthesis and cytotoxic activities of estrone and estradiol

cis-dichloroplatinum(II) complexes, Bioorg. Med. Chem.20 (2012) 6969.25 http://www.cancer.gov/cancertopics/understandingcancer/estrogenreceptors/AllPages

• antiestrogeni: lijekovi koji vezivanjem na estrogenske receptore blokiraju aktivnost estrogena

(aktivaciju gena odgovornih za sintezu proteina koji mogu uzrokovati nekontroliran rast

stanica) i preveniraju proliferaciju kanceroznih stanica u dojci i uterusu,

• neke molekule mogu istovremeno blokirati aktivnost estrogena u jednoj vrsti tkiva i oponašati

njegovu aktivnost u drugom tkivu,

• takva je selektivnost uzrokovana razlikama u kemijskoj strukturi estrogenskih receptora u

različitim tkivima,

TUMOR

• estrogenski se receptori u različitim tkivima razlikuju po svojoj kemijskoj strukturi uslijed čega

ih SERMs (selective estrogen receptor modulators) selektivno inhibiraju ili stimuliraju [npr.

inhibiraju estrogenski receptor u dojci (inhibiraju proliferaciju) i istovremeno aktiviraju

estrogenski receptor u maternici (aktiviraju proliferaciju)],

estrogenestrogen

• istraživanja antikancerogenih svojstava SERMs-a započela su s

tamoksifenom (blokira estrogen vezujući se na njegove receptore u

stanicama dojke; pri tom ne mijenja oblik receptora što

onemogućuje vezivanje koaktivatora te se geni koji stimuliraju

proliferaciju stanica ne mogu aktivirati),

• aktivno se radi na razvoju novih SERMs-a s kojima bi se ostvarili povoljni i izbjegli štetni

učinci,

IV.2.1. Anorganski kompleksi platine26,27

• Cisplatin, učinkovit u liječenju karcinoma jajnika i

pluća; njegovo otkriće potaknulo je brojna

istraživanja u cilju pronalaska derivatâ platine s

unaprijeđenom biološkom aktivnošću, smanjenom

toksičnošću i bez moguće kemorezistencije stanica

karcinoma,

• povećanje selektivnost Pt-lijekova prema

stanicama tumora postiže se njihovimstanicama tumora postiže se njihovim

konjugiranjem s vektorima (folatom, porfirinom,

adeninom, terpenoidima, peptidima,...) nakon

čega slijedi vezivanje na ciljna estrogen-ovisna

tkiva (dojka, jajnici, maternica),

• priroda Pt-podjedinice u vektorskim kompleksima utječe na antiproliferativnu aktivnost i

selektivnost za ERα (estrogenski receptor α),

27 J.R.W. Masters, B. Köberle, Curing metastatic cancer lessons from testicular germ-cell tumours, Nature Reviews Cancer 3 (2003) 517.

26 P. Saha et al, Synthesis, antiproliferative activity and estrogen receptor affinity of novel estradiol-linked platinum(II) complex analogs to carboplatin and

oxaliplatin. Potential vector complexes to target estrogen-dependent tissues, European Journal of Medicinal Chemistry 48 (2012) 385.

• kompleski estradiola i cisplatina

ostvaruju značajnu citotoksičnost in

vitro i in vivo,

• zamjena cisplatinske podjedinice

s oksaliplatinom doprinosi odličnoj

selektivnosti konjugata za ERα,selektivnosti konjugata za ERα,

• supstitucija s karboplatinom rezultira

gubitkom selektivnosti za ERα,

IV.2.2. Karboranski derivati s estrogenskim svojstvima28

• Terapija karcinoma zračenjem u prisutnosti

bora (BNCT, boron neutron capture therapy):

kad se stanice tumora u koje je ugrađen veliki

broj atoma bora izlože zračenju neutronima

dolazi do njihovog uništenja, bez negativnih

posljedica na okolno zdravo tkivo,

• kompleks u kojem hidrofobni karboran oponaša • novi tip karboranskog SERM za

C2B10H12

• kompleks u kojem hidrofobni karboran oponaša

C i D prstene estradiola ima jači estrogenski

učinak zahvaljujući jačoj hidrofobnoj interakciji

sferne karboranske rešetke s receptorom,

A B

C D

• novi tip karboranskog SERM za

liječenje osteoporoze (sprječava

smanjenje gustoće kostiju),

28 T. Ogawa et al, Synthesis and biological evaluation of p-carborane bisphenols and their derivatives: Structure–activity relationship for estrogenic

activity, Bioorganic & Medicinal Chemistry 17 (2009) 1109.

IV.2.3. Titanocen-dikloridni analozi tamoksifena29

• Titanocen-diklorid, jaki antiproliferativni učinak čak i pri

vrlo niskim koncentracijama (10 µM),

o supstitucija jedne aromatske podjedinice tamoksifena s

titanocen-dikloridom pridonosi neočekivano jakom

antiproliferativnom učinku rezultirajućeg titanocen-tamoksifena,

o titanocen K ostvaruje 55-80% antiprolifera-

tivnog učinka titanocen-diklorida; dodatak

o titanocenu Y, koji ne ostvaruje citoto-

ksičnu aktivnost, dodatkom albumina

BSA (bovine serum albumin) ne inducira

značajne promjene u aktivnosti,

inducira se antiproliferativni efekt,

29 A. Vessières et al, Proliferative and anti-proliferative effects of titanium-and iron-based metallocene anti-cancer drugs, J. Organomet. Chem. 694 (2009) 874.

IV.2.4. Ciklopentadienil-renij-trikarbonilni derivati tamoksifena

• Supstitucijom fenilne skupine iz tamoksifena s CpRe(CO)3 te uvođenjem metilenskih

razmaknica različitih duljina (n = 2 - 5) pripravljeni su kompleksi čiji antiestrogenski učinak

odgovara tamoksifenu,

• duljina dimetilaminskog bočnog ogranka (koji je odgovoran za antiestrogeni efekt) nema

utjecaja na ukupnu djelotvornost,

O(CHO(CH22))nnNMeNMe22O(CHO(CH22))nnNMeNMe22

IV.2.5. Ferocenski derivati tamoksifena – ferocifeni30

OH• Očekivalo se da će zamjena β-fenilnog

prstena iz tamoksifena s aromatskom

ferocenskom podjedinicom uroditi

SERM-om povećane citotoksičnosti,

• u tu su svrhu pripravljeni su i testirani ferocenski derivati• u tu su svrhu pripravljeni su i testirani ferocenski derivati

tamoksifena s različitim duljinama metilenskih razmaknica,

o antiestrogena svojstva na hormonski ovisne tumorske

stanice MCF7 ovise o duljini ugljikova lanca: za n = 2 i 8

antiproliferativni učinak manji je u odnosu na tamoksifen, dok

su rezultati za n = 3 - 5 usporedivi s tamoksifenom ili čak i

bolji; sam ferocen nema nikakav učinak ,

30 G. Jaouen et al, The first Organometallic Selective Estrogen Receptor Modulators (SERMs) and Their

Relevance to Breast Cancer, Current Medicinal Chemistry 11 (2004) 2505.

o za razliku od tamoksifena koji ne utječe na hormonski neovisne tumorske stanice MDA-

MB231, ferocenski SERMs-i s 3 - 5 metilenskih razmaknica ostvaruju jak citotoksični

učinak,

• prikazani ferocenski SERMs-i predstavljaju po prvi

puta opisane SERMs-e koji su istodobno aktivni i

prema ER(+) i ER(-) tumorskim staničnim linijama!

• mehanizam antiproliferativnog utjecaja ferocenskih

SERMs-a nije poznat; na temelju molekulskog

modeliranja može se pretpostaviti da se ferocifeni

vežu u aktivno mjesto receptora estrogena,

• aktivno mjesto estrogenskog receptora svojom

veličinom više odgovara ferocenilnoj (572Å) nego

fenilnoj skupini (413Å),

• interakcija His524 i ferocenilne grupe, te Asp351 i

dušika iz bočnog ogranka (odgovornog za

antiestrogeni učinak) osigurava povoljno vezivanje,

• genotoksičnost ferocifena posljedica

je oksidacije ferocena (Fe2+) u

fericenijev ion (Fe3+):

Fentonova reakcija

• nastali superoksid radikal slabo je

reaktivan prema DNA, ali dovodi do

nastanka vrlo reaktivnog

hidroksidnog radikala koji može

uzrokovati leziju DNA (oštećenje

baze) i apoptozu.

IV.3. Ferokin – moćno oružje u borbi protiv malarije

• Malarija, najraširenija parazitska bolest na svijetu (odnosi

preko milijun života godišnje),

• svake se godine evidentira preko 300 milijuna kliničkih

slučajeva malarije (5 puta više u odnosu na ukupni broj

oboljelih od tuberkuloze, AIDS-a, rubeole i leproze),

• modifikacijom klorokina s ferocenom

pripravljen je ferokin, lijek poboljšane

učinkovitosti,

• parazit Plasmodium falciparum, odgovoran

za malariju, rezistentan je na poznate

lijekove, uključujući i klorokin, učinkovitosti,lijekove, uključujući i klorokin,

• studijama ovisnosti strukture i aktivnosti (SAR, structural-activity relationship study) utvrđeni su

strukturni elementi koji osiguravaju visoku biološku aktivnost derivata ferokina:

o 4-aminokinolinski fragment omogućuje nakupljanje u vakuolama,

o amino-skupina u bočnom ogranku osigurava jaku antiplazmodijsku aktivnost,

o ferocenska skupina odgovorna za lipofilna i redoks-svojstva.

IV.4. Bioorganometalni derivat aspirina31

• Heksakarbonil-dikobaltni [Co2(CO)6] kompleksi s fruktopiranozom, nukleozidima i

neuropeptidima pokazuju zanimljivu biološku aktivnost,

• modifikacijom aspirina (ASS, o-acetilsalicilna kiselina) s organometalnim derivatom

dolazi do značajnog unapređenja njegove antitumorske aktivnosti,

31 I. Ott, et al, Modulation of the Biological Properties of Aspirin by Formation of a Bioorganometallic Derivative, Angew. Chem. Int. Ed. 48 (2009) 1160.

• obećavajući rezultati kliničkih ispitivanja ferocifena i ferokina potaknuli su pripravu

različitih organometalnih derivata poznatih biološki aktivnih spojeva.

IV.4. Primjeri bioativnih organometalnih kompleksa

IV.4.1. Ferocenski derivati purinskih i pirimidinskih baza

• Testovi na HIV-1, HBV (virus hepatitisa B), YFV (virus

žute groznice) nisu pokazali značajnu antiviralnu ili

citotoksičnu aktivnost.

• Inhibiraju proliferaciju stanica karcinoma dojke.

IV.4.2. Ferocenski derivati etorfina

Cr

ONNO

ClMo

ONNO

Cl

• Uzrokuju širenje krvnih žila stvaranjem NO koji prodire u

tkivo, koriste se u liječenju infarkta miokarda i angine

pectoris.

IV.4.3. Organometalni derivati nitrovazodilatatora

• Dihidropirazol, mala bioaktivna molekula koja je kao strukturni motiv prisutna u brojnim

farmaceutski aktivnim spojevima,

IV.4.5. Ferrocenski derivati dihidropirazola

IV.4.6. Ferocenski derivati herbicida

O

HO

HO

OH

OH

R1 R2

IV.4.7. Ferocenski konjugati s manozom kao inhibitori hemaglutinacije E. coli9b

• Infekcija E. coli posljedica je hemaglutinacije uzrokovane prepoznavanjem bakterijskih

proteina (lektina, lat. legere, birati) i manoze iz stanične stijenke,

• vezno mjesto bakterijskog lektina ograđeno je dvama tirozinskim ostacima (“tyrosine gate”),

• uvođenjem aromatskog aglikona induciraju se π−π interakcije čime se afinitet aromatskog

manozida za bakterijski lektin povećava i do 600 puta,

OHO

HO

OH

O

OH

O

O

Me

O R3

R4

• ferocenom modificirani konjugati s manozom

ostvaruju inhibicijski učinak na hemaglutinaciju!

10, n=1, R=COOMe

12, n=1, R=NHBoc

14, n=2, R=H

Me

Fe

R

n

9b L. Barišić et al, Ferrocene conjugates with mannose: synthesis and influence of

ferrocene aglycon on mannose-mediated adhesion of E. coli, Applied Organometallic

Chemistry 26 (2012) 74.

VI. Konjugati peptida i PNA (peptidnih nukleinskih kiselina) s organometalnim

kompleksima (N. Metzler-Nolte)1

• Uvjeti koje moraju zadovoljavati organometalni spojevi:

1. stabilnost na zraku i u vodi (fiziološki uvjeti),

2. metalni fragment mora biti kompatibilan uvjetima standarne peptidne kemije

(uvođenje zaštittnih skupina, deprotekcija, cijepanje s nosača),

3. stabilnost pri različitim metodama pročišćavanja.

• Mogući načini vezivanja organometalne skupine za aminokiseline ili peptide:

1. metal može biti direktno vezan za peptidnu okosnicu,

2. metal može biti koordiniran s funkcijskom skupinom iz bočnog ogranka,

3. funkcionalizirani metalni fragment je preko organske spojnice vezan za peptid.

VI.1. Konjugati organometalnih spojeva s malim peptidima

VI.1.1. Organometalni spojevi kao kalupi za indukciju elemenata peptidne

sekundarne strukture

NHN

O

No disupstituirani peptidi III izvedeni iz 1’-amino-ferocen-1-

o disupstituirani peptidi I izvedeni iz ferocen-1,1’-dikarboksilne

kiseline stabilizirani su dvjema 10-članim interlančanim

vodikovim vezama – β-okret (Herrickova konformacija),

FFFFeeee

IIIIIIII

HN

NHO

O HN

NH

HN

O

ONH

o disupstituirani peptidi II izvedeni iz ferocen-1,1’-diamina

stabilizirani su dvjema 10-članim interlančanim

vodikovim vezama – β-okret,

FFFFeeee

IIII

O

O

NH

HN

O

O

HN

NH

O

O

FFFFeeee

IIIIIIIIIIII

NH

N

ONH

HN

ONH

O

O

o disupstituirani peptidi III izvedeni iz 1’-amino-ferocen-1-

karboksilne kiseline stabilizirani su 9- i 11-članim

interlančanim vodikovim vezama – P-uzvojnica,32

32 L. Barišić et al, The first oligopeptide derivative of 1’-aminoferrocene-1-carboxylic acid shows helical chirality with antiparallel strands, Chem. Commun.

17 (2004) 2004.

• peptid III, pripravljen u Laboratoriju za

Organsku kemiju PBF-a, predstavlja prvi

organometalni mimetik okreta,

Fe

VI.2. Organometalni konjugati s prirodnim peptidima

• obilježavanje prirodnih peptida s organometalnim spojem provodi se na dva načina:

o jedna ili više aminokiselina iz peptidne sekvencije supstituira se organometalnim derivatom,

o organometalni fragment ugrađuje se na C- ili N-terminus peptida ili u bočni ogranak,

• neuropeptid koji djeluje slično kao morfin (visok afinitet za

opoidne receptore),

• uslijed svoje polarnosti, enkefalin teško svladava krvno-

moždanu barijeru,

VI.2.1. Organometalni konjugati s prirodnim peptidima

• Enkefalin, pentapeptid prisutan u različitim tkivima, uglavnom u mozgu i CNS, najkorišteniji

prirodni peptid za derivatizaciju s organometalnim spojevima,

• njegova se lipofilnost postiže umetanjem organometalne podjedinice,

VI.2.2. Organometalni derivati peptidnih hormona

• Supstanca P: undekapeptid, neurotransmiter

koji sudjeluje u kontrakciji mišića, prijenosu boli

i aktivaciji imunosustava,

• supstuitucijom jednog ili oba Phe-ostatka s Fer

(ferocenilalanin) opada biološka aktivnost,

• biološki učinak N-aciliranih derivata

odgovara aktivnosti nativneodgovara aktivnosti nativne

supstance P,

VI.2.3. Organometalni derivati drugih peptida

• Jezgrin lokalizacijski signal (NLS, nuclear localization signal): ciljna aminokiselinska

sekvencija koju sadrže proteini neophodni za transport u jezgru,

• u okviru studije uporabe staničnih

• Bradikinin: nonapeptid koji je odgovoran za zgrušavanje krvi, njegovim se otpuštanjem snižava

krvni tlak uslijed proširenja krvnih žila,

• zamjenom fenilne podjedinice s ferocenskom

pripravljeno je nekoliko derivata sa smanjenom

biološkom aktivnošću.

• u okviru studije uporabe staničnih

signalnih peptida za direktni unos

organometalnog fragmenta u stanicu

pripravljeni su metalocenski derivati NLS

čiji je ulazak i lokalizacija u različitim

staničnim linijama praćen fluorescentnom

mikroskopijom,

• za razliku od slobodnog NLS koji nije mogao proći kroz staničnu membranu, metalocenski

analozi su se akumulirali unutar stanice čime je potrđena važnost organometalnih spojeva u

procesima endocitoze.

VI.3. Organometalni konjugati s PNA

• Peptidne nukleinske kiseline (PNA): oligonukleotidni analozi

DNA s obećavajućim svojstvima za primjenu u molekularnoj

biotehnologiji i medicini,

• riboza-fosfatni ester iz okosnice zamijenjen je

pseudopeptidnom podjedinicom,

• za razliku od DNA, ne sadrže šećerne i fosfatne podjedinice,

a ipak oponašaju DNA, nerijetko pokazujući i superiorna

svojstva,

• PNA se vezuje za komplementarnu DNA ili RNA, dajući

konjugate povećane stabilnosti,

• N-terminalno obilježeni organo-

metalni derivati PNA: konstante

asocijacije PNA monomera

odgovaraju literaturnim podacima

za DNA!

o Pseudopeptid: peptidomimetik koji sadržava pseudopeptidnu vezu kao surogat amidne veze.

H2N

NN

N

O

O

O

O

OHH

H H

O N

O OH

H2N N

N

O

O

O

OHH

H

N

O OH

H2NN

NN

O

O

O

OHH

H H

• Uvođenjem pseudopeptidnih veza povećava se otpornost prema enzimskoj degradaciji,

ostvaruju se konformacijske izmjene koje se odražavaju na karakter vodikovih veza i

fleksibilnost, te se povećavaju specifičnost , potencijal i biološka aktivnost receptora!

H2NS

N

N

O

O

O

OHH

H

H2NO

N

N

O

OHH

H2N N

N

O

O

O

O

OHH

H

H2N N

N

O

OHH

OH

VII. Obilježavanje proteina organometalnim kompleksima (M. Salmain)1

• Glutation (GSH), intracelularni nukleofil i antioksidans,

ima zaštitnu i detoksifikacijsku ulogu u organizmu („hvata”

slobodne radikale i reaktivne kisikove spojeve),

• glutation S-transferaza (GST), katalizator pretvorbe GSH u različite elektrofilne

spojeve, smatra se dijagnostičkim indikatorom kemijske karcinogeneze,

• rezistencija kanceroznih stanica na brojne antikancerogene terapeutike direktno je povezana

GSH

• rezistencija kanceroznih stanica na brojne antikancerogene terapeutike direktno je povezana

s povećanom razinom GST u malignim stanicama u odnosu na njegovu koncentraciju u

zdravom tkivu ⇒ GST se koristi kao biomarker,33

• razvojem inhibitora i senzora GST moguće je smanjiti rastuću kemorezistenciju tumorskih

stanica,

• u literaturi su opisani brojni inhibitori GST, uključujući analoge GSH, GSH-konjugate, male

organske molekule i prirodne produkte,

33 D.M. Townsend et al, Novel Role for Glutathione S-Transferase, The Journal of biological chemistry 284 (2009) 436.

• organometalni senzori i inhibitori GST-a pripravljeni su umetanjem razmaknica različite duljine

i strukture između ferocenske i peptidne glutationske jedinice,34,35

• takvi su konjugati vrlo efikasni inhibitori GST

(inhibitorni učinak raste s povećanjem duljine

• s obzirom da je moguće primjenom

voltametrije pratiti njihovo vezivanje

razmaknice što se objašnjava porastom

entropije uslijed vezanja),

za ciljne proteine, koriste se kao

elektrokemijski senzori GST-a,

34 M. C. Martos-Maldonado et al, Ferrocene labelings as inhibitors and dual electrochemical sensors of human glutathione S-transferase P1-1, Bioorg. Med.Chem. Lett. 22 (2012) 7256.

35 M. C. Martos-Maldonado et al, Binding properties of ferrocene–glutathione conjugates as inhibitors and sensors for glutathione S-transferases, Biochimie94 (2012) 541.

VII.3. Redoks-sonde

VII.3.1. Amperometrijski biosenzori

• Biosenzor je uređaj koji omogućuje identifikaciju i

kvantifikaciju nekog analita ( , , , , )

VII. 2. Radioaktivno obilježavanje

• Oktreotid (mimetik somatostatina) obilježen radioaktivnim

organometalnim fragmentom služi kao ligand za receptore u

stanicama pankreasa i nadbubrežne žlijezde kod miševa.

kvantifikaciju nekog analita ( , , , , )

u uzorku (vodi, hrani, krvi, urinu,...)

• ključno svojstvo svakog biosenzora je prisutnost

elementa molekulskog prepoznavanja koji selek-

tivno reagira s analitom ,

• element molekulskog prepoznavanja integriran je

u prijetvornik (ili je smješten u njegovoj blizini) koji

molekulsko prepoznavanje u kojem sudjeluje analit

pretvara u mjerljiv signal (npr. struja u ampero-

metrijskom biosenzoru),

i. ET (electron-transfer) između enzimskog redoks-centra i elektrode

omogućen je dodatkom difuzijskog elektronskog medijatora M

• kod većine redoks-enzima redoks-centar (kofaktor) je elektronski nedo-

stupan i elektrokemijski neupotrebljiv − lociran je predaleko od površine

proteina („ukopan” u unutrašnjosti proteinske molekule) što onemogućava

izravni prijenos elektrona između enzima i elektrode,

• obilježavanje “redox-silent” proteina elektroaktivnom komponentom

[redoks-medijatorom (posrednikom) koji brzo izmjenjuje elektrone s

elektrodom] čini ih pogodnima za elektrokemijske analize:

(medijator difundira u protein) koji ubrzava protok elektrona prema

elektrodi i od elektrode,

ii. redoks-medijatori su kovalentno vezani

za površinu enzima te usmjeravaju

elektrone prema elektrodi i od elektrode,

iii. enzim je imobiliziran na umreženom

redoks-polimeru adsorbiranom na

površini elektrode,

VII.3.1.1. Organometalni difuzijski medijatori

• posredovanje u prijenosu naboja između redoks-enzima GOx i elektrode postiže se

korištenjem difuzijskog posrednika, redoks-para ferocen/ fericenijev ion,36,37

• Glukoza-oksidaza (GOx) oksidira glukozu pri čemu se FAD reducira u

FADH2; direktno mjerenje prijenosa elektrona s FAD na elektrodu ote-

žava njegova lokacija u GOx (protein zasjenjuje FAD čineći ga gotovo

nedostupnim),

36 M.F. Burritt, Current analytical approaches to measuring blood analytes, Clin. Chem. 36 (1990) 1562.

37 D. Ross et al, Short-term evaluation of an electro-chemical system (ExacTech) for blood glucose monitoring, Diabetes. Res. Clin. Pract. 10 (1990) 281.

• 1987., ExacTech trake za mjerenje razine glukoze u krvi:

nakon oksidacije glukoze GOx preuzima dva e- i predaje

ih fericenijevu kationu koji se reducira u ferocen, potom se

ferocen oksidira i elektrone predaje elektrodi; uređaj mjeri

struju elektrona i pretvara signal u µmol glukoze/ litri krvi.

• Prema IUPAC-u, biosenzori su uređaji koji koriste biokemijske reakcije enzima, imunosustava,

tkiva, organela ili cijelih stanica za detekciju kemijskih spojeva pomoću električnih, termičkih ili

optičkih signala,38

• sastoje se iz dva glavna elementa:

1. bioreceptor: imobilizirani osjetljivi biološki element (npr. enzim, DNA, protutijelo) koji

specifično prepoznaje analit (npr. enzimski supstrat, komplementarna DNA, antigen),

2. prijetvornik: biokemijski signal proistekao iz reakcije analita i bioreceptora pretvara u

mjerljivi signal; intenzitet tako generiranog signala proporcionalan je koncentraciji analita,

VIII. Organometalne biosonde (G. R. Stephenson)1

mjerljivi signal; intenzitet tako generiranog signala proporcionalan je koncentraciji analita,

38 PAC 64 (1992) 143 (Glossary for chemists of terms used in biotechnology (IUPAC Recommendations 1992))

• prepoznavanje, prijenos i odgovor, nužni za funkcioniranje sonde, limitirani su

selektivnošću receptora,

• s obzirom da se često slični analiti natječu za isti receptor, potrebno je dizajnirati i

sintetizirati optimizirani receptor za svaki pojedini analit,

IX. Organometalni kompleksi kao “obilježivači” u imunotestovima (M. Salmain, A. Vessières)1

o analit: komponenta u uzorku za koju se traži analitička informacija,

o antigen: molekula koja potiče stvaranje protutijela, odnosno imunoodgovor,

o protutijelo: globularni protein koji se stvara kao reakcija na prisutnost stranih tijela (antigena)

• Imunotest: analitička metoda kojom se na temelju vezivanja analita (antigena) s poznatim

komplementarnim antitijelom određuje količina ispitivanog analita u uzorku,

• imunotest se bazira se na specifičnoj interakciji između triju komponenti: analita (antigena) koji

će biti detektiran, protutijela specifičnog za ispitivani analit te obilježivača (tracer) kojeg

sadrži ili analit ili protutijelo, a koji je podložan detekciji nekom od analitičkih metoda,

u organizmu; obrambena uloga,

obilježeno protutijelo

obilježeni analit

• princip metaloimunotesta: nakon priprave

specifičnog protutijela (P), koje ima jednaki

afinitet za antigen (A, analit) i antigen

obilježen organometalnim spojem (A*),

P

A A*

• metaloimunotestovi (engl. metalloimmuno-

assay, MIA): metalni atomi iz organometalnih

kompleksa koriste se za obilježavanje

antigena u imunotestovima,

nastupa kompetitivna reakcija tih analita za

vezna mjesta na protutijelu uz tvorbu

kompleksâ P-A i P-A*. Budući da je

koncentracija protutijela P i obilježenog

antigena A* poznata, iz izmjerenog se

analitičkog signala P-A* (FT-IR, elektrosignal)

indirektno određuje količina imuno-kompleksa

P-A, odn. analita A.

A A*

P-A*P-A

• dva su glavna tipa imunotestova:

o kompetitivni imunotest: neobilježe-

ni analit iz uzorka određuje se na

temelju njegove sposobnosti da se

s obilježenim analitom (poznate

koncentracije) natječe za vezno

mjesto na antitijelu (poznate

koncentracije); pri tomu neobi-

1. inkubacija

koncentracije); pri tomu neobi-

lježeni analit zauzima vezno mjesto

na antitijelu onemogućujući

vezivanje obilježenog analita,

o izmjerena količina vezane frakcije

obilježenog analita obrnuto je

proporcionalna koncentraciji neobi-

lježenog analita iz uzorka,

2. separacija vezane i slobodne

frakcije obilježivača

3. kvantifikacija vezane ili slobodne

frakcije obilježivača

o nekompetitivni imunotest: suvišak specifi-

čnoga antitijela vezan je na čvrstu fazu npr.

(stijenka pločice za mikrotitraciju), nakon čega

se doda otopina analita. Nakon inkubacije

doda se drugo, obilježeno antitijelo poznate

koncentracije; slijedi druga inkubacija, te se

slobodna frakcija antitijela ukloni, a vezana se

dodatak obilježenog antitijela

frakcija kvantificira – direktno je

proporcionalna količini prisutnoga analita

(obilježeno antitijelo neće se vezati ukoliko

nije prisutan analit); ELISA (Enzyme Linked

Immunosorbent Assay) ubraja se u ovu

kategoriju,eliminacija slobodne frakcije antitijela

i kvantifikacija vezane frakcije

• ferocenom obilježeni lidokain (lijek za

srčanu aritmiju) među prvima je

korištenima u MIA; detekcija cikličkom

voltametrijom,

• cimantrienilom obilježeni antidepresiv

nortriptilin; detekcija atomskom

apsorpcijskom spektroskopijom,

• kobaltocenom obilježeni amfetamin;

detekcija pravokutnovalnom voltametrijom,

IX.1. FT-IR detekcija

o karbamazepin, antiepileptik

o fenobarbital, antikonvulziv

bez

apso

rpci

je!

o difenilhidantoin, antiepileptik

Pod

ručj

e21

00–

1800

cm-1

bez

IX.2. Elektrokemijska detekcija

• jeftina analitička metoda,

• nakon obilježavanja redoks-aktivnim ferocenom,

moguće je elektrokemijski detektirati enzime

koji su redoks-inaktivni,39

39 C. Baier et al, In-situ Electrochemical Detection of Enzymes using Ferrocene Affinity Label (abstract), 216th Electrochemical Society Meeting, Vienna,

Austria, 2009.

• elektrokemijsko određivanje HIV-1 reverzne transkriptaze (HIV-1 RT),40 katalizatora konverzije

viralnog genoma iz jednostruke RNA u dvostruku DNA, koristi se u detekciji infekcije HIV-om,

(III) “hvatanje” HIV-1 RT pomoću RT-specifičnog peptida imobiliziranog

na površini elektrode:

• (I) ferocenom obilježena lipoična kiselina imobilizira se na zlatnoj elektrodi,

(II) kratki RT-specifični peptid VEAIIRILQQLLFIH kovalentno se veže na C-terminus

ferocenom obilježene lipoične kiseline,

40 H.-B. Kraatz et al, A bioorganometallic approachf orr apid electrochemicala nalysis of huma immunodeficiency virust ype-1r everset ranscriptase in serum

Electrochimica Acta 56 (2011) 5122.

X. Genosenzori bazirani na metalnim kompleksima (S. Takenaka)1,41

• DNA-senzori ili genosenzori posebno su važni biosenzori s obzirom

na potrebu za analizom gena povezanih s različitim bolestima,

• DNA je elektrokemijski inaktivna molekula, ali se nakon

• Genosenzori koriste imobiliziranu DNA-sondu kao element

prepoznavanja pri hibridizaciji (tvorba DNA-DNA i DNA-RNA

hibrida) kao i u interakcijama s različitim proteinima,42

obilježavanja elektrokemijski aktivnom molekulom može detektirati

elektrokemijskim metodama,

• metalni kompleksi pokazuju reverzibilni redoks-odgovor što ih čini

izuzetno pogodnima za obilježavanje DNA,

41 Y. Xiang et al, A reagentless and disposable electronic genosensor: from multiplexed analysis to molecular logic gates , Chem. Commun. 47 (2011) 2080.

42 S. Alerget, A. Merkoçi, Comprehensive analytical chemistry, Elsevier, Amsterdam, London, 2007.

• elektrokemijski genosenzori: u vodi topljivi metalni kompleksi s afinitetom za dvostruku

uzvojnicu DNA ili elektrokemijski aktivne DNA-sonde kovalentno vezane za metalni kompleks,

X.1. Metalni kompleksi kao DNA sonde

• Mnogi se kationski metalni kompleksi [Co(phen)33+,

[Ru (/bpy)32+, FND] mogu kao ligandi vezivati s DNA;

ukoliko postoji korelacija između količine vezanog liganda i

DNA, DNA se može kvantificirati na temelju magnitude

elektrokemijskog odgovora liganda,

X.1.1. Kationski metalni kompleksi43

43 S. Sato et al, Electrochemical detection of aberrant methylated gene using naphthalene diimide derivative carrying four ferrocene moieties, J. Organometal.

Chem. 695 (2010) 1858.

X.1.2. Metalni kompleksi konjugirani s DNA-fragmentom ili DNA-veznim ligandom

• DNA-sonde koriste se za detekciju ciljne DNA ili gena,

o DNA tvori dvostruku uzvojnicu zahvaljujući uspostavljanju vodikovih veza između

komplementarnih baza,

o zagrijavanjem dolazi do disocijacije, odn. denaturacije, a hlađenjem se ponovno

uspostavlja dupleks (hibridizacija),

• za detekciju nekog gena potrebno je (i) pripraviti DNA-sekvenciju (DNA-sondu)

komplementarnu ciljnoj DNA, (ii) obilježiti DNA-sondu (fluorescentnim ili elektrokemijskimkomplementarnu ciljnoj DNA, (ii) obilježiti DNA-sondu (fluorescentnim ili elektrokemijskim

obilježivačem) i (iii) hibridizirati s DNA iz ispitivanog uzorka,

• kod elektrokemijske detekcije

metalni se kompleks konjugira s

kratkim fragmentom DNA ili

oligonukleotidom čime se dobiva

elektroaktivna DNA-sonda,

• elektrokemijski indikatori hibridizacije: DNA-sonda imobilizira se na površini zlatne elektrode

nakon čega slijedi hibridizacija s DNA ispitivanog uzorka; nakon hibridizacije elektroda se uroni

u otopinu elektrolita koji sadrži DNA-vezujući metalni kompleks te se provede elektrokemijsko

mjerenje,

• metalni kompleks mora razlikovati jednolančanu DNA (ssDNA, single-strand) i dvostruku

uzvojnicu DNA (dsDNA, double-strand); nakon vezivanja za dsDNA dolazi do koncentriranja

metala na površini elektrode uslijed čega se stvara elektrokemijski signal iz čije se magnitude

može odrediti ispitivani gen,

X.1.3. Ferocenski genosenzori

• Postoje brojne laboratorijske metode za identifikaciju patogena koje zahtijevaju veliki oprez

pri rukovanju uzorcima i podrazumijevaju uporabu skupih kemikalija i opreme,

• s druge strane, idealni sustavi za identifikaciju patogena zamišljen je tako da omogući

istovremeno procesuiranje uzorka i njegovu karakterizaciju korištenjem jedinstvenog

automatiziranog uređaja,

• bioelektronska detekcija nukleinskih kiselina na

Genmark eSensor

minijaturnom čvrstom nosaču prvi je korak u

razvoju integriranih detekcijskih uređaja,

• bioelektronska detekcija DNA uključuje stvaranje

elektroničkog sklopa posredstvom hibridizacije

nukleinskih kiselina te predstavlja bazu za DNA-

detekcijske sustave (eSensorTM),

1) Ispitivana DNA (target DNA) izmiješa 2) Otopina koja sadrži hibridizirani kompleks1) Ispitivana DNA (target DNA) izmiješa

se s otopinom signalne sonde (signal

probe) obilježene elektroaktivnim

ferocenom; ukoliko je ispitivana DNA

prikladna (sadrži komplementarne

baze) odmah će doći do hibridizacije

ispitivane DNA s obilježenom

signalnom sondom,

2) Otopina koja sadrži hibridizirani kompleks

ispitivane i obilježene signalne DNA pumpa se

kroz uređaj koji sadrži elektrode s vezanom DNA

sondom (DNA capture probe); dolazi do

hibridizacije ispitivane DNA i vezanom

DNA, odnosno do uspostavljanja kontakta

između DNA vezane za elektrodu i ferocena –

stvara se strujni tok,

• elektrokemijski signal generira

se nakon što DNA iz HPV

hibridizira s ferocenom

obilježenom signalnom sondom i

o elektrokemijska detekcija humanog papiloma

virusa (HPV)44

sondom vezanom za elektrodu,

• u slučaju da u uzorku nema HPV

ne registrira se signal!44 S. D. Vernon et al, Bioelectronic DNA detection of human papillomaviruses using eSensor™:

a model system for detection of multiple pathogen, BMC Infectious Diseases 3 (2003) 1.

XI. Supramolekulske interakcije organometalnih spojeva (R. H. Fish)1

• J.-M. Lehn, Nobel lecture, 1987: “Supramolecular chemistry is the chemistry of the

intermolecular bond, covering the structures and functions of the entities formed by

association of two or more chemical species”.

• supramolekulske interakcije (prepoznavanje, reaktivnost, transport...) predstavljaju

fundamentalne fenomene u biološkim sustavima uključene u brojne procese između biološki

važnih molekula (DNA, RNA) s proteinima, lijekovima, sondama koje sadrže metalni ion,...

• organski kemičari pripravljaju brojne supramolekulske domaćine koji sudjeluju u

molekulskom prepoznavanju s molekulama gostima (nukleozidi, nukleotidi, aminokiseline,

peptidi i male organske molekule) i to putem nekovalentnih vodikovih veza, π-π- i hidrofobnih

interakcija,

XI.1. Bioorganometalne supramolekule kao domaćini

• Opisane su bioorganometalne molekule koje

kao domaćini prepoznaju molekule goste

(aromatske i alifatske amino- i karboksilne

kiseline) u vodenom mediju pri pH 7,

• takvo prepoznavanje u vodenom mediju

može se smatrati jednostavnim modelom za

proučavanje interakcija između DNA i RNA i

njihovih veznih proteina (npr. onih proteinanjihovih veznih proteina (npr. onih proteina

koji reguliraju gene).

XI.1.1. Molekulsko prepoznavanje aromatskih

i alifatskih aminokiselina s bioorgano-

metalnim domaćinom 1

• Procesi molekulskog prepoznavanja proučavani su 1H NMR spektroskopskim metodama,

• kompleksiranje molekula domaćina i gosta inducira kemijski pomak molekula gosta u više

polje,

• ciklički trimer [Cp*Rh(µ-η1(N1):η2

(N6,N7)-9-metiladenin]3(OTf)3 (1) odlikuje

se stabilnošću u vodi te velikim

promjerom šupljine što su osnovni

parametri “host-guest” kemije,

• utvrđeno je da variranjem koncentracije

molekule domaćina 1 (0-1 eq.) u

prisutnosti odgovarajuće molekule

gosta (L-Phe, L-Trp, L-Leu, L-Ile; konst.

konc. 1 eq.) nakon kompleksiranja dola-

zi do pomaka NMR signala molekula

gosta u više polje (CICS, complexation

induced chemical shift),

• 1 prepoznaje aromatske aminokiseline

kao i aminokiseline s duljim hidrofobnim

bočnim ograncima zahvaljujući steri-

čkim, elektronskim i hidrofobnim

utjecajima,

XI.1.2. Molekulsko prepoznavanje supstituiranih aromatskih

karboksilnih kiselina s bioorganometalnim domaćinom 1

• Ciklički trimer 1 korišten je u studijama molekulskog prepoznavanja s

neproteinogenom o-, m- i p-aminobenzojevom kiselinom,

o o-Aminobenzojeva kiselina (vitamin L) prekursor je Trp, a rabi se kao

intermedijar u sintezi bojila te u proizvodnji parfema i farmaceutika; m-amino-

benzojeva kiselina umetanjem u ciklo(peptide) potiče tvorbu β-plohe i β-

okreta, p-aminobenzojeva kiselina (vitamin Bx) intermedijar je u bakterijskoj

sintezi folatâ koji sprječavaju kardiovaskularne bolesti i neke tipove karcinoma.

o-

sintezi folatâ koji sprječavaju kardiovaskularne bolesti i neke tipove karcinoma.

• pozicija supstituenata značajno utječe na molekulsko prepoznavanje;

najviše vrijednosti CICS za o- (Hc) i m- (Hc) su 14 odn 7 puta veće nego

za p- (Ha) što se pripisuje steričkim utjecajima: m-

p-

o hidrofobni dijelovi molekula gostiju trebaju se smjestiti u hidrofobnu

šupljinu domaćina; udaljenost između hidrofilnih skupina i sterička

ometanja rastu od o- prema p-gostu; time se izloženost hidrofobnih

skupina smanjuje što rezultira slabijim prepoznavanjem,

• Molekulsko prepoznavanje temeljeno na selektivnim vodikovim vezama između domaćina

trans-[Cp*Rh(η1(N3)-1-metilcitozin)(µ-OH)]2(OTf)2 (2) i Trp ispitano je korištenjem CICS-

metode,

XI.1.2. Molekulsko prepoznavanje aromatskih aminokiselina s bioorganometalnim

domaćinom 2

• kompleksiranjem domaćina 2 s Trp dolazi do njegove desimetrizacije što se očituje

prisutnošću dvaju setova signala; pri tomu jedan set signala kompleksa odgovara signalima

slobodnog domaćina, dok su u drugom setu signala zabilježeni značajni pomaci u više polje,

• CICS izmjereni za jedan metil-citozinski ligand tumače se njegovim nekovalentnim

2

Slobodni domaćin 2 S gostom L-Trp

• CICS izmjereni za jedan metil-citozinski ligand tumače se njegovim nekovalentnim

interakcijama s L-Trp,

Slobodni gost L-Trp Kompleks gost-domaćin

• nadalje, kompleksiranje Trp s bioorganometalnim domaćinom 2 indicirano je i pomacima Trp-

protona u više polje,

• bioorganometalno prepoznavanje temelji se na• bioorganometalno prepoznavanje temelji se na

vodikovim vezama NH3+ skupine iz Trp s atomom

kisika iz jednog od dvaju Rh(µ-OH) liganada te s CO

skupinom iz jednog od dvaju metil-citozinskih

liganada; COO- skupina iz Trp tvori vodikovu vezu s

NH2 skupinom drugog metil-citozinskog liganda,

• opisani domaćin-gost proces razmatra se kao

model za povezivanje biološki značajnih

molekula gostiju s metalo-enzimima i DNA/ RNA.

XII. Aktivna mjesta u metaloenzimima (J. C. Fontecilla-Camps)1

• Trećina poznatih enzima sadrži metalni ion koji sudjeluje u reakcijama prijenosa elektrona i malih

molekula, cijepanja i tvorbe veza, nabiranju proteina, itd.

XII.1. Bakar

• Esencijalna uloga u mnogim staničnim procesima: antioksi-

dacija, pigmentacija, disanje, sinteza neurotransmitera, tvorba

vezivnog tkiva, metabolizam željeza itd.

• njegova je toksičnost posljedica vezivanja s kisikom uslijed

čega nastaju ROS (patološka stanja),

• nalazi se u aktivnim mjestima brojnih enzima [posebno mjesto

zauzima tirozinaza (sudjeluje u tvorbi melanina, zacjeljivanju

rana i imunoodgovoru)],

o oksidacija tirozina u dopakinon uslijed

čega dolazi do posmeđivanja voća,

• enzimska aktivna mjesta koja sadrže Cu razlikuju se po svojim spektroskopskim svojstvima:45

45 Yi Lu, “Cupredoxins”, in “Comprehensive Coordination Chemistry II: From Biology to Nanotechnology”, Jon McCleverty and Tom J. Meyer, Eds., Vol 8

(Biocoordination Chemistry, Lawrence Que, Jr. and William B. Tolman, Eds.) pp 91‐122 (2003).

XII.1.1. Amin-oksidaza

• Prisutna u prokariotskim i eukariotskim organizmima; sadrži

Cu-ion i redoks-aktivni kofaktor topakinon (2,4,5-trihidroksi-

fenilalanin),

• Cu(II) ion koordiniran je s tri histidinska ostatka i tri molekule

vode (W),

• katalizira oksidativno deaminiranje primarnih amina u (i) odgovarajuće aldehide uz (ii)

popratnu redukciju kisika u vodikov peroksid:

46 E. Agostinelli et al, Potential anticancer application of polyamine oxidation products formed by amine oxidase: a new therapeutic approach, Amino Acids 38

(2010) 353.

• amin-oksidaze reguliraju nivo mono-i poliamina (spojeva čija je koncentracija povećana u

tumorskim tkivima) tvorbom citotoksičnih metabolita (aldehida i vodikova-peroksida),

• novi terapeutski pristup u liječenju karcinoma zasniva se na dopremi amin-oksidaze u stanicu

raka nakon čega bi uslijedila intracelularna tvorba toksičnih oksidacijskih produkata koji bi

selektivno ubijali samo stanicu u kojoj su nastali, tj. malignu stanicu,46

XII.1.2. Lakaza

• Široko rasprostranjena među biljkama, insektima i

fungima,

• sadrži četiri atoma bakra u aktivnom mjestu (ubraja se u

plave oksidaze),

• katalizira oksidaciju različitih fenolnih spojeva, diamina i

aromatskih amina uz popratnu redukciju kisika u vodu,

• oksidira supstrat zahvaljujući elektron-akceptorskim

svojstvima bakra; u potpuno reduciranom stanju sadrži 4

elektrona kojima kisik reducira u vodu,

• primjena u prehrambenoj industriji: aditiv u preradi hrane i

pića, stabiliziranje vina i piva, pekarstvo,... 47

47 J. F. Osma, Uses of Laccases in the Food Industry, Enzyme Res. (2010) 1.

• lakaza katalizira oksidativnu dimerizaciju 17β-estradiola ⇒ na takvoj bi se kopulaciji mogla

temeljiti strategija kontrole steroidnih estrogena,48

kontrola bez lakaze

48 Q. XIA et al, Removal of 17β-estradiol in laccase catalyzed treatment processes, Front. Environ. Sci. Eng. 2013.

nakon tretiranja s enzimom

XII.2. Željezo

• najzastupljeniji metal u tragovima,

• u reducirajućem okruženju stanice, željezo katalizira

jedno-elektronsku redukciju vodikova peroksida

stvarajući visokoreaktivni oksidant – hidroksidni radikal,

• takva se nepoželjna reakcija može spriječiti vezivanjem željeza za proteine,

• Željezo igra ključnu ulogu u metabolizmu svih stanica (replikacija DNA, fotosinteza,

proliferacija, itd.),49

XII.2.1. Citokrom c oksidaza (COX)

49 A.M. Thomson et al, Iron-regulatory proteins, iron-responsive elements and ferritin mRNA translation, The International Journal of Biochemistry & Cell

Biology 31 (1999) 1139.

XII.2.1. Citokrom c oksidaza (COX)

• Terminalni enzim u respiratornim lancima mitohondrija i aerobnih

bakterija te u oksidaciji hrane; katalizira prijenos elektrona s

reduciranog citokroma c na kisik reducirajući ga u vodu:

• sadrži dvije hem skupine i tri iona bakra; jedna hem skupina i

jedan ion bakra izgrađuju katalitički centar (hem a3/CuB ),

XII.2.2. Oksigenaze

• Dvije vrste enzima koji kataliziraju reakciju kisika s organskim

supstratima:

o dioksigenaze: ugrađuju oba atoma kisika produkt,

o monooksigenaze: jedan atom kisika ugrađuju u produkt, dok se

drugi atom eliminira redukcijom u vodu;

• metabolička konverzija aromatskih spojeva u

alifatske od fundamentalnog je značaja u

biologiji,biologiji,

• katehol-dioksigenaza: katalizira oksigenaciju

katehola u alifatske kiseline uz cijepanje

aromatskog prstena,50

• važna uloga u razgradnji lignina i

terpena, kao i u katabolizmu Trp i Tyr,

50 R. Yamahara et al, (Catecholato)iron(III) complexes: structural and functional models for the catechol-bound iron(III) form of catechol

dioxygenases, Journal of Inorganic Biochemistry 88 (2002) 284.

XII.2.3. Ribonukleotid-reduktaza (RR)

• katalizira ključni korak u sintezi DNA – redukciju ribonukleotida,

• reakcija uključuje supstituciju hidroksilne skupine na C2’ iz riboze s vodikom,

XII.3. Mangan

• Prisutan u biljnim i životinjskim tkivima,

• kofaktor enzima uključenih u fosforilaciju, hidrolizu, dekarboksilaciju i transaminiranje,

• komponenta antioksidativnog enzima superoksid-dismutaze (SOD), neutralizatora slobodnih

radikala,

XII.3.1. Superoksid-dismutaza51

• Krucijalni enzim; katalizira dismutaciju (disproporcioniranje) superoksid-radikala u vodikov

peroksid i kisik,

• superoksid-radikal nastaje u

stanici kao posljedica enzimske i

spontane oksidacije; toksičan je

za stanicu i razgrađuje biološke

molekule (lipide i proteine),

X = Fe ili Mn

51 A. F. Miller, Superoxide dismutases: active sites that save, but a protein that kills, Current Opinion in Chemical Biology 8 (2004) 162.

XII.3.2. Arginaza

• Katalizira hidrolizu Arg u Orn i ureu,

• arginaza I može se koristiti kao marker za

koronarne srčane bolesti (snižava razinu

• aktivno mjesto sadrži dva iona Mn (na

udaljenosti 3,3 Å) koordinirana s jednim

His- i trima Asp-ostatcima,

• ioni Mn polariziraju i usmjeravaju

premošteni hidroksilini ion u nukleofilni

napad na gvanidinijev C atom (iz

supstrata),

52 T. Eleftheriadis et al, Arginase type I as a marker of coronary

heart disease in hemodialysis patients, Int. Urol. Nephrol. 43

(2011) 1187.

vazodilatatora NO te direktno pridonosi

razvoju ateroskleroze),52

XII.4. Molibden i volfram

• Mo je prisutan u katalitičkom centru nitrogenaza, te

kao Mo-kofaktor u brojnim enzimima,

• Mo- ili W-kofaktori sastoje se iz mononuklearnog

metalnog iona i organskog dijela molibdopterina

(MPT),

• MPT-enzimi se dijele u dvije grupe:

MPT

o medijatori prijenosa kisika (DMSO-

reduktaze i SO-oksidaze),

o katalizatori hidroksiliranja aromatskih

heterocikličkih spojeva (ksantin-

oksidoreduktaze) i aldehida

XII.4.1. DMSO-reduktaza

• katalizira prijenos kisika s DMSO na Mo nakon čega slijedi izdvajanje vode:

• tijekom ishemijskog napada (sma-

njenog dotoka kisika u tkivo) aktivi-

raju se proteaze koje kataliziraju

XII.4.2. Ksantin-oksidoreduktaza (XOR)

• Uloga u katabolizmu purina, detoksifikaciji i regulaciji staničnog redoks-potencijala; javlja se u

dva oblika:

o ksantin-dehidrogenaza (XD): dovodi do nastanka antioksidansa - mokraćne kiseline,

o ksantin-oksidaza (XO): sinteza velikih količina reaktivnih kisikovih (ROS, reactive oxygen

species) i dušikovih čestica (RNS, reactive nitrogen species),

raju se proteaze koje kataliziraju

brzu konverziju XD u XO pri čemu

se generira super-oksid radikal koji

uzrokuje vazodilataciju,53

• mogućnost brze konverzije XD u

XO uslijed različitih ozljeda i ošte-

ćenja tkiva čini XOR idealnom

komponentom imunosustava,

53 H.A. Kontos, Oxygen Radicals in Cerebral Ischemia: The 2001 Willis Lecture, Stroke 32 (2001) 2712.

XII.4.3. Sulfit-oksidaza (SO)54

• katalizira biološki esencijalnu oksidaciju sulfita u sulfate (terminalnu reakciju u oksidativnoj

razgradnji Met i Cys),

• aktivno mjesto sadrži Mo=O skupinu i Cys-ostatak,

54 R. Hille, Molybdenum enzymes in higher organisms, Coordination Chemistry

Reviews 255 (2011) 1179.

• manjak izaziva neurološke poremećaje i mentalnu

retardaciju,

XII.5. Cink55

• Esencijalan za rast svih živih organizama,

• prisutan u više od 300 različitih enzima u kojima ima

ulogu Lewisove kiseline (vezuje vodu koja deprotoni-

ranjem prelazi u nukleofilni OH¯ ion); u proteinima je

najčešće vezan za dušik iz His, kisik iz Asp i Glu te

sumpor iz Cys,

• doprinosi katalitičkoj moći i stabilnosti pripadajućih proteina.

55 K. A. McCall et al, Function and Mechanism of Zinc Metalloenzymes, J. Nutr. 130 ( 2000) 1437S.

XII.5.1. Ugljična anhidraza (CA, carbonic anhydrase)

• Sudjeluje u disanju, fotosintezi i transportu iona,

• katalizira reverzibilno hidratiranje CO2 iz eritrocita u

ugljičnu kiselinu, odnosno hidrogenkarbonatni ion,

• terapeutska primjena (diuretik, liječenje

glaukoma, infekcija i karcinoma).

56 C.T. Supuran, Carbonic anhydrases: novel therapeutic applications for inhibitors and activators, Nat. Rev. Drug. Discov. 7 (2008) 168.

XII.5.2. Alkohol-dehidrogenaza (ADH)57

• Oksidacijom alkohola u acetaldehid (koji se

djelovanjem aldehid-dehidrogenaze prevodi u

acetat), ADH razgrađuje toksične spojeve na

molekule koje stanice mogu koristiti,

• kao koenzime koristi NAD(H) ili NADP(H),

• jetrena ADH (LADH, liver alcohol

dehydrogenase) u aktivnom mjestu

o katalitički ciklus LADH

dehydrogenase) u aktivnom mjestu

sadrži Zn(II)-ion koji koordinira s

alkoholom, dvama Cys- i jednim His-

ostatkom:

57 L. M. Berreau et a., Kinetic and mechanistic studies of the reactivity of Zn–OHn (n=1

or 2) species in small molecule analogs of zinc-containing metallo-

enzymes, Advances in Physical Organic Chemistry 41 (2006) 79.

XII.5.2. Metalo-ββββ-laktamaza58-62

• β-Laktami čine više od polovine antibiotika

prisutnih na tržištu,

• nakon prolaska kroz staničnu membranu

inaktiviraju bakterijske transpeptidaze uključe-

ne u biosintezu stanične stijenke,

• gram-negativne bakterije se protiv ovih

antibiotika bore pomoću β-laktamaza, enzima

koji cijepaju laktamski prsten hidrolizom C−N

veze,

• laktamaze se dijele u 4 skupine; skupine A, C i

D koriste aktivni Ser kao nukleofil, dok skupina

B (koju čine metalo-β-laktamaze) koristi jedan

ili dva Zn-iona za hidrolitički učinak,

• metalo-β-laktamaze doprinose porastu rezistencije na postojeće antibiotike, zbog čega se

provode brojna istraživanja čiji je cilj što bolje shvatiti njihovu strukturu i mehanizam

djelovanja:

o 3D-struktura metalo-β-laktamaze iz B. cereus (Zn-ioni)

• binuklearni Zn-centar smješten je na dnu lako dostupne plitke, široke brazde između dviju β-

plohi,

• sadrži tetraedarski koordinirani Zn1-ion, te trigonalno bipiramidalno koordinirani Zn2-ion

međusobno premoštene H2O/OH¯ ionom,

• Zn1-ion polarizira karbonilnu skupinu β-laktamskog prstena iz supstrata tvoreći oksianionsku

šupljinu čime se olakšava hidroliza; Zn2-ion lociran je u neposrednoj blizini β-laktamskog

dušikova atoma čime se dodatno polarizira amidna veza i stabilizira odlazeća skupina:

58 Z.Wang et al, Metallo-β−lactamase: structure and mechanism, Current Opinion in Chemical Biology 3 (1999) 614.

59 T.R. Walsh et al, Metallo--Lactamases: the Quiet before the Storm? Clin. Microbiol. Rev. 18 (2005) 306.

60 V. Gupta, Metallo beta lactamases in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter species, Expert Opn Investig Drugs 17 (2008) 131.

61 F. Kaleem et al, Frequency and susceptibility pattern of metallo-beta-lactamase producers in a hospital in Pakistan J Infect Dev Ctries 4 (2010) 810.

62 C. R. Bethel et al, Exploring the Inhibition of CTX-M-9 by β-Lactamase Inhibitors and Carbapenems, Antimicrob Agents Chemother. 55 (2011) 3465.

XIII. Redoks-aktivacija metalnih prolijekova1,12,63-65

• Najvažnija prednost lijekova baziranih na metalima u odnosu na lijekove izvedene iz organskih

molekula leži u njihovoj sposobnosti variranja koordinacijskog broja, geometrije i redoks-stanja;

metali mogu koordinirati s organskim lijekovima stvarajući komplekse izmijenjenih

farmakoloških svojstava,

3. metali koji pojačavaju zračenje,

• metalni farmaceutici svrstavaju se u sedam kategorija ovisno o funkciji metala i liganda:

1. metalni kompleksi aktivni u inertnoj formi,

2. metalni kompleksi aktivni u svom reaktivnom stanju,

4. spojevi koji sadrže radioaktivni metal,

5. aktivni metali ili njihovi biotransformacijski produkti,

6. biološki aktivni ligandi,

7. aktivan je samo dio kompleksa,

• dvije su strategije u dizajnu metalnih lijekova:

o strategija ciljanja: bazira se na selektivnom transportu funkcionaliziranih molekula lijeka

prepoznatih od strane receptora na površini stanica karcinoma,

o strategija prolijekova: prijenos citotoksičnog spoja koji se aktivira u uvjetima prisutnima u

ciljnom tkivu ili stanici,

• okidači za aktivaciju prolijeka su pH, svjetlost ili redoks-reaktivnost,

• tumori imaju nisku koncentraciju kisika – reduktivno mikrookruženje u odnosu na zdravo tkivo

uslijed nedostatnog stvaranja novih krvnih žila tokom rasta,

• smanjena razina kisika u tumorima (hipoksija)

predstavlja ozbiljan problem u terapiji karcinoma;

mogući izlaz predstavljaju bioreduktivni lijekovi

• reduktivnosti tumora pridonosi i visoka koncentracija

staničnih reducirajućih agenasa,

(kinoni, nitroimidazoli, aromatski N-oksidi, te neki

metalni spojevi),

• metalni prolijekovi do ciljnih se stanica dopremaju u inertnom oksidiranom stanju, bez

prethodne redukcije, i metaboliziraju kad dospiju u reduktivno okruženje tumorskih

stanica,

64 N. Graf et al, Redox activation of metal-based prodrugs as a strategy for drug delivery, Advanced Drug Delivery Reviews 64 (2012) 993.

63 W. Kandioller, et al, Tuning the anticancer activity of maltol-derived ruthenium complexes by derivatization of the 3-hydroxy-4-pyrone moiety, Journal of

Organometallic Chemistry 694 (2009) 922.

65 N- Metzler-Nolte et al, The potential of organometallic complexes in medicinal Chemistry Current Opinion in Chemical Biology 16 (2012) 84.

• Potencijalni reducirajući agensi za Pt(IV)-spojeve u stanici su glutation, vitamin C i proteini koji

sadrže Cys (metalotionein, serum-albumin),

• sposobnost vezivanja Pt(IV)-kompleksa s DNA proporcionalna je njegovoj podložnosti

redukciji; čak i baze iz DNA mogu reducirati Pt(IV)-spojeve

XIII.1. Kompleksi platine

• podesiva redoks-svojstva metalnog iona i modifikacija liganda omogućuju kontrolu biološke

aktivnosti; gubitak liganda L tokom reakcije u hipoksičnim tumorskim tkivima može aktivirati

metalni kompleks za vezivanje na ciljni receptor.66

66 Y. Shi, Pt(IV) complexes as prodrugs for cisplatin, Journal of Inorganic Biochemistry 107 (2012) 6.

• Antitumorska aktivnost Ru(III)-spojeva ovisi o njihovoj redukciji u Ru(II) (antimetastatska

aktivnost opaža se u prisutnosti bioloških reducensa),

XIII.2. Kompleksi rutenija

• redoks-potencijal podešava se modifikacijom liganada, a njegove se vrijednosti mogu

reducirati pri fiziološkim uvjetima, u prisutnosti glutationa i vitamina C,

• povećanje razine Ru-DNA adukta opaža se pri niskom parcijalnom tlaku kisika, što je

indikacija porasta udjela reduciranog Ru(II)-oblika,

XIII.3. Nanomaterijali u terapiji67

• Nanomaterijali, objekti nanometarskih

dimenzija, od ogromne su strukturne i

funkcionalne važnosti u biotehnologiji i

medicini,

• nanotehnologija omogućuje ranu detekciju

bolesti, dijagnozu, liječenje i prevenciju,bolesti, dijagnozu, liječenje i prevenciju,

• primjena: kirurgija, onkološka stanja,

biodetekcija markera, molekulsko oslikava-

nje, implantati, tkivno inženjerstvo,...

67 A. Pandey et al, Nanoscience and their biological omportance: human

health and disease, Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures

3 (2008) 141.

• sustavi za dopremanje mogu

upravljati transportom molekula

lijeka do željene stanične populacije

zahvaljujući EPR (enhanced

permeability and retention) – efekt

selektivnog ciljanja karcinoma,

• krvne žile u tumoru propusnije su• krvne žile u tumoru propusnije su

nego u zdravom tkivu; nanočestice

lijeka selektivno prolaze u bolesno

tkivo,

• selektivno dopremanje metalnih prolijekova do stanica raka ostvarivo je pomoću nanočestica,

• kombiniranjem Pt(IV)-prolijekova s nanočesticama otvara se mogućnost njihovog transporta

kao i prevencije preuranjene redukcije u krvotoku,

• ugljikove nanocijevi68,69 (CNT, carbon

nanotubes):

velike molekule sačinjene

iz ugljika, cjevastog oblika,

promjera 1- 3 nm,

• istražuje se njihova potencijalna uloga u

biologiji i medicini; veličina, velika dodirna

površina, inertni kemijski sastav i jedinstvena

fizikalna svojstva omogućuju njihovu uporabu u

68 P. N. Yaron et al, Single wall carbon nanotubes enter cells by endocytosis and not membrane penetration, Journal of Nanobiotechnology 9 (2011) 45

fizikalna svojstva omogućuju njihovu uporabu u

transportu DNA, nukleinskih kiselina, lijekova i

različitih proteinskih terapeutika,

• CNT u stanicu ulaze

endocitozom (proces u

kojem stanica apsorbira

(“proguta”) molekulu),

69 T. E. Mallouk, Chemistry at the Nano-Bio Interface, J. Am. Chem. Soc., 131 (2009) 7937.

• nakon vezivanja Pt(IV) za CNT slijedi unos u stanicu procesom

endocitoze; rezultira povećana citotoksičnost CNT-funkcionaliziranih

Pt(IV)-lijekova u usporedbi s cisplatinom,70

• kemoterapija uništava i bolesne i zdrave stanice,

• većina stanica raka sadrži folatne receptore; molekule folata vezane za kompleks Pt(IV)-CNT

procesom endocitoze ciljano ulaze u stanice karcinoma,

70 S. Dar et al, Targeted Single-Wall Carbon Nanotube-Mediated Pt(IV) Prodrug Delivery Using Folate as a Homing Device, J. Am. Chem. Soc. 130 (2008)

11467.