orotsäure – ein wuchsfaktor für pasteurella multocida
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I Zeitschrift fur Allgemeine Mikrobiologie I 21 I 2
(Institut fiir bakterielle Tierseuchenforschung Jena-Zwatzen der Akademie der Landwirtschafts- wissenschaften der DDR, Direktor: OVR Prof. Dr. sc. TH. HURRIG)
1981 85 - 93
Orotsaure - ein Wuchsfaktor fur Pasteurella multocida
K.-D. FLOSSMANN. M. H ~ F E R , W. ERLER und H. FEIST
(E'ingegangen a m 23. 6.1980)
Orotsaure stellt einen Wuchsfaktor fur die Vermehrung von Pasteurella multocida dar. Sie ist mit abnehmender Wirksamkeit durch andere Pyrimidine ersetzbar (Uracil > Cytosin > Thymin). Untersuchungen mit 2-, 6-, 7-, U-14C- bzw. 5-3H-Orots&ure beweisen, daB die Wirkung der Orot- saiire in ihrer zentralen Stellung im Pyrimidinstoffwechsel zu sehen ist. Die Radioaktivitat des Pyrimidinringes wird in den Pyrimidinbasen der Bakterienzelle wiedergefunden, wahrend die Aktivitat der Carboxylgruppe ( 7-"C-Orotsaure) hauptsachlich in Bernsteinsaure, einem im Kul- turfiltrat auftretenden Metaboliten des Kohlenhydrat- und Aminosaure-Stoffwechsels, auftritt. Die Untersuchungen sprechen dafur, dall die Pyrimidinbiosynthese bei P. multocida in den An- fangsschritten, vermutlich infolge ungenugender C0,-Bereitstellung, gestort ist. Fur eine Ver- mehrung in vitro genugen etwa 0,l mMol Orotsaure pro 1 Nahrmedium.
Auf Grund des Einbaus des Pyrimidinskeletts in die Bakterienzelle eignet sich am Pyrimidin- kern markierte Orotsaure bestens aIs radioaktives Material zur Markierung von P. multocida- Zellen.
Orotsaure, ein zentrales Glied der Pyrimidinbiosynthese, stellt fur eine Reihe von Bakterien einen Wuchsfaktor dar bzw. wird als Nahrsubstrat verwertet (Beispiele : NAGLE et al. 1960, BAUGH et al. 1964, O'DONOVAN 11. NEUHARD 1970). Wie wir bei Nahrstoffuntersuchungen zur Entwicklung chemisch definierter Medien ftir die Kulti- vierung von Pasteurella multocida feststellten, ist Orotsaure auch ein Wuchsfaktor fur die Vermehrung dieser Species (FLOSSMANN et al. 1976). In der vorliegenden Arbeit sol1 anhand von Untersuchungen mit radiomarkierten Pyrimidinen die Bedeutung der Orotsaure fur P. multocida untermaixert werden.
Material und Methoden
Bakterienstamme (Serotyp in Klammern, nach CARTER 1955 und NAMIOKA 1970): P. multocida 35 (A), 55 (A), 383 (6:B), 383 ts (6:B), 1297 S, 5345 (A) - Institut fur bakterielle Tierseuchen- forschung, Jena; P. multocida P 8 (3:A), PM (7:A), Kobe 5 (l:A), Kobe 6 (2:D) - National Institute of Animal Health, Tokyo; P. multocida B 850 (2:B) - Institut Pasteur, Bukarest; RO- BERT'S type I1 NCTC 10201 (9:A), CARTER'S group A NCTC 10322 ( l l :A) , CARTER'S group D NCTC 10325 (9:D), CARTER'S group E NCTC 10326 (6:E) - Central Public Health Laboratory, London.
Die Kultivierung erfolgte bei 35 (383 ts) bzw. 37 "C in chemisch dcfinierten Medien (PM-CDM, nach FLOSSWANN et al. 1977) unter Zusatz verschiedener Mengen radiomarkierter Orotsaurc (5-3H- Orotsaure, spez. Aktivitat 11-28,5 Ci/mMol, U-14C-Orotsaure, NH,-Salz, 0,286 Ci/mMol, 7-I4C- Orotsiiure, 48 mCi/mMol, alle Inst. Radioisotop., Prag; 2-14CC-Orotsaure 26-34 mCi/mMol, 6-14C-Orotsaure 8-15 mCi/mMol, Inst. Isotop. Budapest) sowie verschiedener Mengen Orotsaure (Endkonzentration Orotsaure, gegeben als Na- bzw. K-orotat his 5 mMol/l). Das Wachstum der Bakterien wurde durch Bestimmung der Lebendkeimzahl bzw. durch Messung der E,,, (SPEKOL, VEB C.4RL ZEISS, Jena) nach unterschiedlichen Zeiten verfolgt.
Fur spezielle Untersuchungen wurden Orotsaure-freie Medien eingesetzt, denen iiquivalente Mengen radiomarkiertes Uracil (U-14C-Uracil, 161 mCi/mMol, Inst. Radioisotop., Prag), Cytosin (U- 14C-Cytosin, 220 mCi/mMol, Inst. Radioisotop., Prag) bzw. Thymin (U-14CC-Thymin, 205 mCi/m Mol Inst. Radioisotop., Prag) zugesetzt worden naren. Am Ende der log-Phase wurde die Kultivierung unterbrochen, die Radioaktivitat der Bakterien bzw. des Kulturfiltrates durch Fliissigszintillations- messung (Aquasol, Fa. NEX, @-Counter LKB-mTALLA4C 81 000) bestimmt. Die Identifizierung der
86 K.-D. FLOSSMANN, AT. HOFER, M7. ERLER ~ 1 1 d H. FEIST
Produkte im Kulturfiltrat gescheh diirinsrliic.htchroniato~raphisch (Kucleobasen nach FLOSSR~ANN 1978, Rernsteinsaure: ERLER et cxl. 1979), der Einbau der Aktivitat in die Kucleobasen der Bak- terienzelle nachHydrolyse der Zellen niit 7000iger HC10, bei 100 ‘C iiber 1 h und Basentrennung saulenchromatographisch mit DOWEX 50 nach Busca (1968) bzw. dunnschichtchromatogra- phisch (Radioaktivitatsbestimmung in den Fraktionen mittels LSC). Zur Konfrontation der radiomnrkierten Substrat.e bzw. best.immter ZusBtze mit Ruhezell-
Suspensionen wurden diese in 0,1 nr Phosphatpuffer, p H 7,5, mit den Substraten bei 37 “C be- brutet (1 bis 24 h, je nach Fragestellung) und wie oben beschrieben, aufgearbeitet.
Bei in nivo-Versuchen erhielten Mausekollektive bis zu 1 mg Na-orotat in 0,5 ml physiol. NaCl- Liisung intraperitoneal und h danach verschiedene Dosen von P. multocidu-Kulturen verab- reirht. Die letale Dosis zu 50% (LDS0) der Kulturen wurde nach REED 11. NIJENCH (1938) bestimmt.
Ergebnisse und Dislcussion
Die vermehrringsfordernde Wirkiing von Orotsaure auf 1’. multocida-Stamme wurde vor allem in vitro, bei ausgewahlten Stammen auch i l l vivo, nachgewiesen. Alle 15 gctesteten Stamme unterschiedlicher Herkunft rind verschiedener Serotypen wurden bei Kultivierung in chemisch-definierten Medien durch Zusatz von Orotsaure in ihrer Verniehrung stark gefordert. Der Orotsaure-Bedarf ist von den Kultivieriingsbedin- gungen abhangig und variiert von Stanim zu Stamm, im allgeineinen reicht jedoch eine Konzentration von etwa 0,l inMol Orotat in einem Liter Nahrlosung aus, urn eine optimale Vermehrung zu gewahrleisten. Orotsaure ist nicht durch Purine, abet durch Pyrimidine, in abnehmender Wirksamkeit in der Reihenfolge Uracil > Cytosin > Thymin, ersetzbar. Daraus folgt hereits, dafi die Wirkung der Orotsaure irn Pyrimi- dinstoffwechsel z u sehen ist und znmindest nicht nur in ihrer Bedeutung fiir die Aufrechterhnlt ung eines mctabolisch wichtigen C0,-Spiegels (Decwboxylieriing). Rei
Tabbelle 1 Einban markierter Orotsaure in P. multocidrc-Zellen
_. ~. .~ ~.
mgi”)
0 1,5
15 150
5,7 7,2
20,7 155,7
9,9 11,4 24,9
159,9
3,2 497
18,2 153,2
2 15,5
150,O
0,5
Sktivitat der Kultur nach Bebriitung
(A usgangsaktivitat 100%)
Sktivitat der Kultur nach Bebriitung
(A usgangsaktivitkt Hakterien
100%) I
Aktivitat der Hakterien
-. ’ ;: 100 100 97 33 95
82 83 89 98 79 !)2 94 99 75 81 89
100 100
84 91
100
3,5 88 79 75 4.G
84 7!) 79 7,5 3,s 3,5 3,4 0,7
72 70 65 4,7
I ) Gesamt-Oro-Konzentration (resultierend a m untersrhiedlichen Oro-Zusatzen zum Medium sowie ails den unterschiedlichen spezifischen Aktivitdten der radioaktiv zugesetzten Oro-Derivate bci ciner AktivitLt von 1 mCi)
Orotsiiurc - ein Wuchsfnktor fiir Pnsteurella 87
den i i ~ vivo-Versnchen konnte niit dem Stanim 55 nach i. p.-Qabe von 1 nig Orotsaure an Mause eine Erniedrigiing der LD,, nni eine Zehnerpotenz (von 3 x lo3 auf 3 x lo2) nachgewiesen werden. Kine Beeinflussung der Viriilenz von Pasteurella pestis-St.animen dnrch Orotsaure hatten auch BAUGH et al. (lCIG4) festgestellt.
80- 100% der eingesetzten Radioaktivitat, zugeset’zt als 5-3H-, 2-14C-, 6-14C- und U-14C-Orotsaure wurden in den Bakterienkuhren wiedergefunden (Tab. 1). Je nach Orotsaurekonzentration in1 Nahrmediurn liegt der Einbau in die Bakterienzelle zwi- schen 3 und go:/,. Hohe Einbauraten bei der iihlichen Konzentration von 15mg (ca. 0, l mMol) Orotsaure pro 1 Medium empfehlen Orotsaure als hestens geeignetes radioaktives Substrat (3H, 14C-Derivate) fur die Markierung von Pasteurellen. Die Einbaiiraten von 2- und 6-14C der Orotsaure sind sehr hoch (bis 9O”,b) und etwa gleich, wahrend die 7-14C-Aktivit.at. niir in sehr geringem Mal3e (his 7:4) eingebaut wird. Denientsprechend ist die Einbaurate von U-14C-Orotsaure niedriger als die von 2- bzw. 6-14C-Orotsaure. Diese Ergebnisse weisen nach, daB der I’yriniidinring int’akt in die Bakterien eingebaut wird, wahrend die Carboxylgruppe abgespalten und ihre Akt.ivitat zum grijBten Teil nicht, in der Zelle wiedergefunden wird. Die Bedeutung der Orot- shire als Wuchsfaktor bei I’asteurellen ist somit in ihrer Wirkiing fiir die I’yrimidin- biosynthese zu suchen.
Da die Kulturen vor und nach Bebriitung etwa die gleiche Radioaktivitat’ zeigen, kann die Bildung gasformiger radioakt’iver Abbauprodukte (WO,) nahezu ausge- schlossen werden. Eine Decarboxylierung miiljte aher besonders bei 7-14C-Orot.saiire zu radioaktiveni CO, fiihren. ,Jedoch weisen alle Ergebnisse darauf hin, daB das abge- spaltene CO, weiter metaholisiert wird. Darauf werden wir noch eingehen.
Wie wir bei den Nahrstoffuntersuchungen fest,st.ellten, ist Orotsaure drirch anderc Pyrimidinbasen (Uracil, Cytosin, Thymin) ersetzbar, jedoch ist Orotsaure selbst an1 wirksamsten, wahrend Thymin das ungeeignetste Substrat darstellt. Analoges stellten BAUGFI et aZ. (1964) bei P. pestis fiir Orotsaure, Uracil und Cytosin fest. Exogenes Thymin wird durch 1’. rnultocida nicht weiter nietabolisiert, sondern direkt eingebaut. Die Einbauraten liegen relativ niedrig, wenn man radioaktives Thymin (U-14C- oder G3H-niarkiert,) anbietet (meist unt,er 1 ”,). Thymin-Aktivitiit taucht. in den Bakterien- hydrolysaten nur im Thyniin selbst, wieder auf, das spezifisch in die DNA eingebaut> wird. Im Kulturfiltrat sind keine weiteren Abbanprodukte nachweisbar, sondern niir das nicht umgeset,zte Thymin.
Anders als bei Thymin ist das Bild bei Uracil, Cytosin und Orotsaure. l4C-U-Cytl) (Angebot 15 mg/l) wird bis 8501; in die Zellen eingebaut’, die Radioaktivitat wird in den I’yrimidinbasen wiedergef nnden, in? Kulturfiltrat t.aucht 14C-Ura auf. Uracil wird ebenfalls mit hoher Ausheute (50--90% bei U-14C-Ura, 20-60% bei 5-3H bzw. Ib3H-Ura) in die Pyrimidinbasen der Bakterien eingebaut. Im Krilturfiltrat ist niir Uracil nachweisbar .
Die Orotsaure-Radioaktivitat befindet sich zum groljten Teil in den 3 Pyrimidin- hasen (Tab. 2 ) , ohne wesent’liche Unt’erschiede bei den 14C-markierten Orotsanrc- Derivaten (aufier 7-1%).
Trotz des bei 3H beobachteten Isotopenaiistauschs findet man auch bei den 3H-
Derivaten den groBten Teil der Aktivitat in den Pyriniidinen wieder. So konnten wir bei Nucleinsaure-Markierungen feststellen, dalj 3H-Thy spezifisch in die DNA, 3H- Ura-Akt)ivitat aber sowohl in DNA (Rktivitat in Cytosin und Thymin) als auch RNA eingebaut wird (FLOSSMANN et al. 1979). BOIIMER 11. GRKTTTICR (1965) stellten dxs gleiche bei Bacillus subtilis fest,.
’) Abkurzungen: Ade = Adenin, Asp = L-Asparaginsaure, Cyt = Cytosin, Gun = Gunnin, Oro = Orotsaurr, Soc = Succinat, Thy = Thymin, Urn = Uracil
Tabelle 2 Einbau der Orotsaure-Radioaktivitat in die Kiicleobasen von P. rnultocida
Stamm
Radioaktivitat (in yo der eingebauten Gesamtaktivitat)
Thy 1 Ura ~ Cyt ~ Ade Gua Siihstrat
383 383 ts 383 383 ts 384
Der groBte Teil der Orotsaure wird fur die Pyrimidinbiosynthese verwendet, wie durch dam bisher Gesagte dargelegt wurde. Trotzdem verbleibt ein Teil der Radio- aktivitat im Kulturniedium. JXinnschicht- und sairlenchrornatographisch lassen sich
1 1
U-IY-Oro l5,5 4 5 3 U-"C-Oro 20,4 41 ,0 G-'T-Oro 15,O ~ 42,5 6-I4C-0ro 19,o 47,0 2-I1C-Oro 1 13,6 1 45,l
suc
x
I
Abb. 1. Radiochromatogramme der Kulturfiltrate von P. multocida 383 nach Kultivieriing mit markierter Orotsaiure (Laufmittel2, Tab. 3)
Orotscirrre - ein IVuclisf'aktor fiii I'trsfeurdla 89
Tabelle 3 Chromatogrnphische IdenLifizierung der nach Umsetzung radioaktiver Orotsaure (0,l mRilol Oro/l)
im Kulturfiltrat anftretenden Suhstanzen I, 11, 111
Srihstnnx
_ _ -
1
111 Oro S U C Ura Thy CVt
Asp
i r
Dihydro-Oro Ureido-Siic
I - - I 1
0,41 0,88 0,67 0,41 0,853 0,67
R!;.-\Verte im 1,aufmittel')
2
0 3 0 3 2 0,73
0,92 0,3
3
0.73
0,73 0,73 i 0,81 0,13
i 0,37
4 1
0,18 i 0,93
0,68 0.18 0,93
0,78 0,06
I 0,68
I
0 0,42 0,3B 0,2 0 0,42 0.36 I 0,2 0,4
0 0,45
' 033 0 1
1 ) Laufmittel: 1 n-BuOH/AcOH/H,O 4/1/1; 2 Essigester/AcOH/H,O 8/2/l; 3 (PhOH-H,O, 75/25)/ AcOH 9/1; 4 Essigester/AcOH 4/1; 5 Benzol/EtOH/85% HCOOH 5/3/2, obere Phase; 6 n-BuOH/ EtOH/H,O/HCOOH 5/3/1/2
Tabelle 4 Rndioaktivit5tsverteilung nach Einsatz markierter Orotsaure in P. multocida-Kulturen mit einer
Ausgangskonzentration von 15 mg Oro/l Nahrmedium ~ ~~- ~~
Kulturfiltrat') Bskterienzel len') Ges. Kul- ~ -~ Suhstrxt 1 KP') 1 I(Oro) 1 II(Sur) 1 III(Ura)
~ ~ _ _
5-3H-0ro 2-14C-Oro 6 - I 'C-Oro 7-l'C-Oro U-' 'C-Oro
Sanlenrhromatographie (Dowex 50 \.V x 4) I ~ 9 ~ 7 5 1 1 0 1 3 6 33
0,l ~ 3 0 0 4 0,2 I 10 79 12 I 35
1 2 6 1 6 1 1 4 , 4 65 , 10 , 29 Ddnnschichtchromatographie (Laiifmittel 2 der Tab. 3)
, 52 10 2 I 15 40
1 30 1 11 1 0 17 40 1 8 0 28
79 5 72 0 ti
97 1 28 1 89 30 I 94 0 89
1) Angaben in yo der Gesamt-Radioaktivitat, die eingesetzt wurde. B=Rakterien, KF=Kultur- f i l t n t
hei Vcrwendung U-l4C-nlarkicrter Orotsaure 3 Fraktionen (T, IT rind TTT) nachweisen, die radioalitiv sind (Abb. 1). Durch Einsatz von Vergleichssubstanzen konnte I als Orotsanre (nicht umgesetztes Produkt), I1 als Bernsteinsaiure und IIZ als Uracil identifiziert werden (Tab. 3). Exkretion von Pyrimidinen, besonders Uracil, ist ein I'hiinoiiien, das bei Pro- i d Eukaryoten in sehnellen Wachstumsphasen oft regi- striert wird (WOMACK 11. DONOVAN 1978). Das Riiftreten von Uracil in1 Kiilturmediarn stellt also keine Aul3ergewdhnlichkeit dar.
Andere radioaktive l'rodukte, anch 14C02, waren nicht nachweisbar. Bei Einsatz von -, 2-14C- und 6J4C-Oro ist die Radioaktivitat des Kulturiiherstandes niir in der Orotsaiire iind in1 t-racil lokalisicrt, wahrcnd bei 7-14C-Oro lediglich Orotsaiire iind
90 J<.-D. FLOYSRIANN, $1. H ~ P E R , W. EI~LER und H. FIXST
0 5 10 15
- Rdoakft'vit6t U V - Absorption -
0 5 70 I5 Frakfion
Abh. 2. SBlllenchromntogrnmme der Killtinfiltrate von P. multocirln nach Killtivierung mit mar- kierter Orotsaure
Bernsteinsaure radioaktiv sind. Daraus folgt, da13 nur das 7-C-Atom der Orotsarire in1 Succinat auftaucht. Die Radioaktivitatsverteilung in den Fraktionen bei Verwendung verschieden markierter Orotsaure zeigt Tabelle 4. Anfangs hatten wir angenommen, da13 Orotsaure durch Dihydroorotat-Dehydrogenase ziir Dihydroorotsaure reduziert wird, diese sich im Kulturfiltrat ansammelt bzw. uber Ureidobernsteinsaure ZU Asparaginsaure abgebaut wird (Riickweg der Biosynthese). Das Auftreten von Succi- nat ware nun leicht erklarbar, denn Asparaginsanre wiederum wird z u Bernsteinsanre unigesetzt (ERLER et nZ. 1979). Uieser Abbaiiweg konnte jedoch nicht bestatigt wer- den, denn es kommt zii keiner Spaltung des Pyrimidinringes und die bei 6-14C- und 5-3H-Oro nach Kingspaltung zu erwartende 14C- und 5-3H-Asparaginsanre und deren Folgeprodukt 14C- bzw. 3H-Succinat sind nicht nachweisbar.
Jtingspaltung riiiifite bei 2-14C-0ro zum Auftauchen der 2-14C-Aktivitat in 14C0, hzw. einem Folgeprodukt fiihren. Auch das ist nicht der Fall. Lediglich das 7J4C-Atom wird durch Decarboxylierung tinter Uracilbildung abgespalten. Das CO, wird in den Metabolisnius derart eingebunden, da13 ein Aufbaii zum Succinat er- folgt und zwar linter Beteiligiing von Brenztraubensaare nus der Glucose-Spaltung.
Orotsiiiure - ein LVuchsfaktor ftir Pueteurella 91
Front Start Suc Ura Oro 4 4 4
Or0
Kobe 5
9 pM
7 p35
7 383fs
4 383
10201
1297s
f 55
8850
53 45
P8
Abb. 3. Batlioclirorriat,o~ranilrlc! dcr Filtrate versuliiede~ier 2'. ?)LU/1Ocid~/-S:tilniiiie nacli l iult i- vierung init U-"C-rnarkierter OrotsBore
Das ist der glciche Weg, wie er bei cler SucciriiLtbildung aus Glucose nachweisbar ist, (FLOSSMANN et al. 1980). Belegen lalSt cr sicli dadrrrch, daB direkter Kontakt von ltuhezellsuspensionen rnit 7-14C-markierter Orotsaure wegen des Pehlens entspre- chender Metabolite nicht zu Sriccinat fuhrt. Erst bei Anwesenheit von Glucose hzw. l'yruvat sowie NADH, wird 14C-Sr~ccinat nachweisbar - ein wiuhtiges Ergebnis fu r die Bildung von C,-Sauren ini Stoffwechsel von 1'. multocida. Interessant ist', claa praktisch die gesainte ltadioaktivitat des 7-14C-Atoins in der Bernsteinsaure wie- dergef unden w i d Bei Berucksicht,igung des a u s L-Asparaginsaure und ~ - G l i i c ~ s e gebildeten Succinates (EHLER et a,Z. 1979) niufite init Einsatz von 15 mg 7-14C-Oro (spezifische Aktivitat 3,2 mCi/mMol) die spezifische Succinat-Aktivitat etwa 13 pCi betragen. Tatsachlich wurden 12,3pCi gefunden und dainit bewiesen, dalJ das 7-C- Atom der Orotsaiure nahezu kompletk in das Succinat iibernomnien wird.
T;17enn der Gehalt an inaktiver Orotsaure irn Nahrtnediutn gcsteigert wird (150 mg/l), andern sich die beobachteten ltadiochroniatograniuie erheblich - Succinat und
92 K.-D. FLOSSXANN, 31. HOFER, !V. ESLER imd H. Fisrs~
Uracil tretcri zuriick, Peak I taucht vermehrt auf - eine Tatsache, die eincn anfangs angenommenen adaptiven enzyniatischen Abbau der Orotsaure widerlegt und Orot- saure, da sie in relativ geringer Konzentrntion wirksain ist, als echten Wuchsfakt,or ausweist. Trotzdern ist ein Defekt in der Pyriiiiidinbiosynt’hese unwahrscheinlich. I k n n sowohl der Einbau von Asparaginsaure-Aktivitat in Pj-riniidinbasen, wenn auch in geringein MaBe (ERLER et al. 1979), als auch die Tatsache, dall Orotsarrre bei vielen Starninen zwar wachstunisfiirdernd wirlit, cine Vermehrung jedoch nuch ohne Orotsaure stat’tfindet, sprechen gegen eine Blockierung der Biosynthesc. Wie sich durch die beobachteten Ergebnisse niit radioaktivcr Orotsaure experinientell belegen laBt, werden je nach Redingungen 5 bis 20 nig Orotsaurell uingesetzt. Bas cnt’spricht gut den enipirisch eririittelten Werten niit giinstigen Ergebnissen bei deni Orot’saurc- gehalt von 15 nig/l. BACGH et ul. (1‘364) erklarteri den gleichen Effckt bci Yersiniu pestis anhand ungenugender CO,- und daniit Carbariiylphosphatbereitstellung, vor alleni bei belufteten Kulturen. Ahnliches kiinrite auch fur P. multocidu zutreffen, wobei die generelle, von uns in allen Fallen der Orotsaure und auch der Glucose, fest- gestellte Fixierung des CO, irii Succinat cine der Ursachcn fur die geringe Bereit- stellung von CO, sein kann. Orotsaure-Metabolisnius und Orotsairre-Uediirftigl~eit wurden fur alle getestetcn 1’. m,uZtocidu-Staiiiiiie bestatigt (Abb. 3).
Es ist wahrscheinlich, daB Orotsaure als Wuchsfaktor fur P. multocidu in der Weise wirkt, daB eine - offenbar durch niangelnde CO,-Bereitstellung - auftretende Ver- niinderung der Pyriniidinbiosynthese ausgeglichen wird. Der griil3tc Teil des ange- botenen Orotats (15 nig/l) wird bei norrnaler Verrnehrung in die Pyriniidinbasen der Nucleinsauren eingebaut,. 1111 Kulturfiltrat taucht nebcn Uracil Succinat anf, das aus deni durch Decarboxylierung der Orotsaiure-Carboxylgruppe freiwerdenden CO, und der Brenztraubensaure des Glucose-Met,abolisnins gebildet wird. Die Orot,saure- bediirftigkeit von P. multocida kann nach unser.cn Erfahrungen fur tnxonomischc Fragestellungen genutzt wcrden, da sic ein typisches Phanonien darstellt, das bei allcn bisher untersuchten Staninien unterschiedlicher Herkunft arrftritt.
F u r gcwissenhafte expcrinimtelle Mitarbcit bedanken wir uns bei Frau CHRISTINE GRAJETZKI. fiir die Messung der Kadioaktivitat im /l’-Counter bei Herrn Dip].-Ing. L. FINSTEHBUSCH.
IJ i t e r a t u I’
BAUCH, C. L., ANUREWS, A. W. and SUTHGALLA, M. J., 1964. Effect of bicarbonatc on growth of Pasteurella pestis. 111. Replacement of bicarbonate by pyrimidines. J. Bacteriol., 88, 1394-1398.
BODMER, W. F. and GRETHER, S., 1965. Uptake and incorporation of thymine, thymidinc, uracil, iiridine and 5-fluorouracil into the nucleic acids of Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 8!), 1011 -1014.
BUSCK, E.W., 1968. Trennung von Basen, Kucleosidcn und Nucleotiden aitf KationenanstaIischerii. J. Chrom., 37, 518-526.
CARTER, G. R., 1955. Studies on Pasteurella multocidrr. I. A haemagglutination test for the identi- fication of serological types. J. Vet,. Res., 16, 481-484.
O’DONOVAN, G. A. and NEUHARD, J., 1970. Pyrimidinic metabolisni in microorganisms. Backriol. Rev., 34, 278-343.
ERLER, W., FEIST, H. und Fmssxa~ N , K.-D., 1979. Kiocheniische Untersachnngen an ticrpatlzo- genen Mikroorganismen unter besonderer Berucksichtiguiig von Pasteurella nLultocida. Die Entwicklung von Nahrmedien, die Aufklarung besondcrer Stoffwechselleistungen, die Rhrkie- rung mit Radionukliden und die Beschreibung der chemischen Zusammensetzung, Struktor und biologischen Eigenschaften von Inhaltsstoffen. Dissertation, Promotion R, Akadeniie dcr Landwirtschaftswissensrhaften der DDR 211 Berlin.
YLOSSNANN, K.-D., FEIST, H., HOFER, M. und ERLER, W. 1976. Untcrsuchungen iiber cheniiach definierte NIhrmedien fur Pasteurella multocida und P. haernolytica. Z. Allg. Mikrobiol., 14, 29-38.
FLOSSMANN, K.-D., Ro imnra~~ ; , B., PEIST, H., H ~ F E R , AT. ~ i n d ERLEK, lV., 1977. Cheniisch de- finierte und teildefinierte Nahrmedien fiir Pasteurella multocida und l’asteurella haemolytica. Arch. exper. Vet. med., 31, 61-69.
Orotsaure - ein Wuchsfaktor fiir Pasteurella 93
FLOYSICIANN, K.-D., 1978. Einfache dunnschichtchromatographische Trennung von l’yrimidin-
FLOSSMANN, K.-D., ROHRMANN, B., FEIST, H. und ERLER. W., 1979. Desosyribonukleinssuren ai ls
FLOYSMANN, K.-D., FEIST, H. und ERLER, W., 1980. Untersnchungen zum Kohlenhydratstoff-
XAGLE, S. C., ANDERSON, R . E. andGARY, N. D., 1960. Chemically defined medium for the growth
NAMIOKA, S., 1970. Antigenic analysis of Pasteurella multocida. Xat. lnst. Anim. Health, 10, 97 to
REED, L. J. and MUENCH, A. H.. 1938. A simple method of estimating 50% endpoints. Amer. J.
WORIACK, J. E. and O’DONOVAN, G. A., 1978. Orotic acid excretlon in home v ild type strains of
und Purin-Basen und -Nukleosiden. Z. med. Labor-Diagn., l!), 107-110.
Pasteurella wmltocida und Pasteurella haemolytica. Arch. exper. Vet. med., 33, 393-402.
wechsel von Pasteurella multocida. Z. Allg. Mikrobiol., 20, 553-561.
of Pasteurella tularensis. J. Bacteriol., i!), 566-571.
108.
Hyg., ‘Li, 493-495.
Escherzchia coli K-12. J. Bacteriol., 13ti, 825-827.
Anschrift: Dr. sc. nat. K.-D. PLOSYMANN Institut fur bakterielle Tierseuchenforschung DDR 6900 Jena, Naumburger Str. 96a