รายงานวจยฉบบสมบรณ

การศกษาเทคนคทเหมาะสมตอการเกบรกษาเอมบรโอยางพาราพนธพนเมองในไนโตรเจนเหลว

Optimization of Cryopreservation Technique of Early Introduced Rubber Tree’s Embryo

คณะนกวจย ดร.กรกช นาคคนอง

รศ.ดร.จรสศร นวลศร

โครงการวจยนไดรบทนสนบสนนจากเงนรายไดมหาวทยาลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร

รายงานวจยฉบบสมบรณ

การศกษาเทคนคทเหมาะสมตอการเกบรกษาเอมบรโอยางพาราพนธพนเมองในไนโตรเจนเหลว

Optimization of Cryopreservation Technique of Early Introduced Rubber Tree’s Embryo

คณะนกวจย ดร.กรกช นาคคนอง

รศ.ดร.จรสศร นวลศร

โครงการวจยนไดรบทนสนบสนนจากเงนรายไดมหาวทยาลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร

ก

บทคดยอ ยางพาราเปนพชเศรษฐกจทมความส าคญส าหรบประเทศไทย เมลดยางพาราเปนเมลดจ าพวก recalcitrant จงไมสามารถเกบรกษาไวไดนาน จงไดท าการศกษาเทคนคทเหมาะสมในการเกบรกษาเอมบร โอยางพาราในไนโตรเจนเหลวเ พอการอนรกษ โดยเทคนค vitrification, encapsulation-vitrification, dehydration และ encapsulation-dehydration ผลจากการศกษาพบวา เอมบรโอของยางพาราทผานการแชไนโตรเจนเหลวสามารถพฒนาเปนตนทสมบรณได โดยมการท า preculture เอมบรโอยางพาราในอาหาร MS ทเตม sucrose ความเขมขน 0.3 M เปนเวลา 3 วน กอนน าไปศกษาดวยเทคนค cryopreservation ส าหรบเทคนค vitrification ศกษาระยะเวลาในการแช loading solution (0.8 M sucrose + 1M glycerol) และ plant vitrification solution (PVS2 และ PVS3) พบวา อตราการรอดชวตและการเจรญเปนตนใหมสงสด ท 88.87% และ 66.33% ตามล าดบ สามารถท าไดโดยการแชเอมบรโอใน loading solution เปนเวลา 20 นาท หลงจากนนน ามาแชในสารละลาย PVS2 (30% (w/v) glycerol, 15% (w/v) ethylene glycol and 15% (w/v) dimethyl sulfoxide) เปนเวลา 120 นาท ทอณหภม 0 องศาเซลเซยส แลวจงแชในไนโตรเจนเหลว 24 ชวโมง ละลายน าแขงโดยแชในอางควบคมอณหภม 40 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 นาท ลางชนสวนดวย อาหารเหลว MS เตมซโครส 1.2 M เปนเวลา 20 นาท และวางเลยงในอาหาร MS ทเตม 0.6-0.7 µM kinetin, 1.0 µM NAA, 1.4 µM GA and ผงถาน 4 g/l สวนการท า dehydration พบวาการลดความชนดวยการวางเอมบรโอทไมหม alginate ภายใต laminar flow (air drying dehydration) เปนเวลา 3 ชวโมง แลวน าไปแชในไนโตรเจน ใหเปอรเซนตการรอดชวต และเปอรเซนตการพฒนาเปนตนใหมสงทสด คอ 80.72% และ 69.72% ตามล าดบ สวนการลดความชนดวยการวางเอมบรโอทหมดวย alginate (encapsulation-dehydration) ภายใต laminar flow (air drying dehydration) เปนเวลา 4 ชวโมง แลวน าไปแชในไนโตรเจน ใหเปอรเซนตการรอดชวต และเปอรเซนตการพฒนาเปนตนใหมสงทสด คอ 37.50% และ 27.98% ตามล าดบ โดยความชนของเอมบรโอจะถกลดใหอยในระดบประมาณ 15% สวนการลดความชนดวย silica gel ไมพบอตราการรอดชวต ค าหลก: ยางพารา, การเกบรกษาพนธพชแบบแชแขง, เมลดเทยม, encapsulation-dehydration, encapsulation-vitrification

ข

Abstract Rubber tree (Hevea brasiliensis) is an important commercial crop, especially in Thailand. Rubber seeds are recalcitrant; therefore, they cannot be stored for long time. Cryopreservation technique of rubber tree embryo was studied as it could be used as a guideline for genetic conservation. Four methods of cryopreservation; vitrification, encapsulation-vitrification, dehydration and encapsulation-dehydration were studied. The results found that the cryopreserved embryonic axes were able to develop into the whole plants. The optimal conditions were precultured embryonic axes for 3 days in MS medium supplemented with 0.3 M sucrose before used for cryopreservation technique. For vitrification, the effect of dehydration time in loading solution (0.8 M sucrose + 1M glycerol) and plant vitrification solutions (PVS2 and PVS3) were studied. The highest survival rate (88.87%) and regrowth (66.33%) were achieved when the precultured zygotic embryos were loaded with loading solution for 20 min and exposed to PVS2 which consisted of 30% (w/v) glycerol, 15% (w/v) ethylene glycol and 15% (w/v) dimethyl sulfoxide in MS liquid medium for 120 min at 0 ˚C. Then the embryonic axes were plunged into liquid nitrogen (LN) for 24 h. After thawing at about 40˚C for 2 min, embryonic axes were washed with MS liquid medium containing 1.2 M sucrose for 20 min and cultured on recovery medium (MS agar medium with 0.6-0.7 µM kinetin, 1.0 µM NAA, 1.4 µM GA and 4 g/l activated charcoal) For dehydration, precultured zygotic embryos were dehydrated by sterile airflow in a laminar flow cabinet for 3 h. Survival rate and regrowth after freezing was 80.72% and 69.72%, respectively for naked zygotic embryos. The cryopreservation by encapsulation-dehydration method was successfully done by leaving encapsulated embryonic axes in a laminar flow for 4 h. before plunging into LN. The survival rate and regrowth of encapsulated zygotic embryos were 37.50% and 27.98%, respectively. Moisture content of naked embryonic axes was about 15%. However, embryonic axes dehydrated by silica gel did not survive at all. Keywords: rubber tree, cryopreservation, encapsulation, encapsulation-dehydration, encapsulation-vitrification

ค

สารบญ เรอง หนา บทคดยอ ก Abstract ข สารบญ ค สารบญตาราง ง สารบญภาพ จ 1. บทน า 1

วตถประสงค 2 2. การตรวจเอกสาร 3 3. วธด าเนนการวจย 14 4. ผลการทดลองและวจารณผลการทดลอง 20 5. สรปและขอเสนอแนะ 38 เอกสารอางอง 40 ภาคผนวก 46

ง

สารบญตาราง

ตารางท หนา ตารางท 1 สวนประกอบของสารละลาย vitrification 8

ตารางท 2 ผลของระยะเวลาในการแชสาร loading solution และ PVS2 24

ตออตราการรอดชวต และการพฒนาเปนตนใหมของเอมบรโอยางพารา

ทไมหมวนอลจเนทหลงผานการแชไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 24 ชวโมง

ตารางท 3 ผลของระยะเวลาในการแชสาร loading solution และ PVS3 25

ตออตราการรอดชวต และการพฒนาเปนตนใหมของเอมบรโอยางพารา

ทไมหมวนอลจเนทหลงผานการแชไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 24 ชวโมง

ตารางท 4 ผลของระยะเวลาในการแชสาร loading solution และ PVS2 29

ตออตราการรอดชวต และการพฒนาเปนตนใหมของเอมบรโอยางพารา

ทหมวนอลจเนทหลงผานการแชไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 24 ชวโมง

ตารางท 5 ผลของระยะเวลาในการแชสาร loading solution และ PVS3 30

ตออตราการรอดชวต และการพฒนาเปนตนใหมของเอมบรโอยางพารา

ทหมวนอลจเนทหลงผานการแชไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 24 ชวโมง

ตารางท 6 ผลของวธการลดความชนตออตราการรอดชวตและการพฒนาเปนตนใหม 33

ของเอมบรโอยางพาราทหมวนอลจเนท (encapsulation-dehydration)

หลงผานการแชไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 24 ชวโมง

ตารางท 7 ผลของวธการลดความชนตออตราการรอดชวตและการพฒนาเปนตนใหม 33

ของเอมบรโอยางพาราทไมหมวนอลจเนท (dehydration)

หลงผานการแชไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 24 ชวโมง

จ

สารบญภาพ

ภาพท หนา ภาพท 1 เมลดยางพารา และเอมบรโอยางพาราทใชในการทดลอง 15

ภาพท 2 การเตรยมเมลดเทยม (encapsulation) เอมบรโอยางพาราทใชในการทดลอง 16

ภาพท 3 ขนตอนการเกบรกษาเอมบรโอยางพาราในไนโตรเจนเหลว โดยวธ 17

vitrification และ encapsulation-vitrification

ภาพท 4 ขนตอนการเกบรกษาเอมบรโอยางพาราในไนโตรเจนเหลว โดยวธ 19

dehydration และ encapsulation-dehydration

ภาพท 5 ผลของระยะเวลาในการท า preculture บนอาหารสตร MS ทเตม 0.3 M 21

ตออตราการรอดชวตและการพฒนาเปนตนใหมของเอมบรโอยางพารา

ทผานการลดความชนภายใต larminar flow เปนเวลา 3 ชวโมง

และแชในไนโตรเจนเหลว

ภาพท 6 การพฒนาของเอมบรโอยางพาราอาย 4 สปดาห ทผานการปรบสภาพโดยการท า 26

vitrification โดยแชใน loading solution เปนเวลา 20 นาท

หลงจากนนจงแชในสารละลาย PVS2 ท 0, 30, 60, 90 และ 120 นาท

และแชไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 24 ชวโมง

ภาพท 7 การพฒนาของเอมบรโอยางพาราอาย 4 สปดาห ทผานการปรบสภาพโดยการท า 27

vitrification โดยแชใน loading solution เปนเวลา 20 นาท

หลงจากนนจงแชในสารละลาย PVS3 ท 0, 30, 60, 90 และ 120 นาท

และแชไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 24 ชวโมง

ภาพท 8 เอมบรโอยางพาราทหมดวยวนอลจเนทอาย 3 สปดาห ทผานการปรบสภาพ 31

โดยการท า vitrification โดยแชใน loading solution เปนเวลา 20 นาท

หลงจากนนจงแชในสารละลาย PVS2 (A) และ PVS3 (B) ท 120 นาท

และแชไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 24 ชวโมง

ภาพท 9 การพฒนาเปนตนใหมของเอมบรโอยางพาราทหมวนอลจเนทและลดความชน 34

ภายใต laminar air-flow เปนเวลา 4 ชวโมง หลงผานการแชไนโตรเจนเหลว

เปนเวลา 24 ชวโมง

ภาพท 10 การพฒนาเปนตนใหมของเอมบรโอยางพาราทไมหมวนอลจเนททผานการท า 35

dehydration ในระยะเวลาทตางกน ไดแก A: 0 ชวโมง, B: 2 ชวโมง, C: 3 ชวโมง,

D: 4 ชวโมง และ E: 5 ชวโมง

1

บทท 1

บทน า

ยางพาราเปนพชทมความส าคญตอเศรษฐกจของประเทศไทย ปจจบนไทยเปนประเทศผผลต

ยางพารามากทสดในโลก รวมทงมความส าคญกบชวตความเปนอยของประชากรไทยในหลายจงหวด

ทประกอบอาชพการท าสวนยางพารา โดยทวไปการขยายพนธยางพาราท าไดโดยการน าตนพนธดมา

ตดตาบนตนตอ ซงตนตอไดมาจากการน าเมลดยางพาราพนธพนเมองมาเพาะ เนองจากยางพนธ

พนเมองมระบบรากทแขงแรง เจรญเตบโตไดด และทส าคญคอมความสามารถทนทานตอการเขา

ท าลายของโรครากตางๆได เนองจากในอดตมการสงเสรมการปลกยางพนธดทใหผลผลตสง เชน

พนธ RRIM600 หรอ BPM24 ทดแทนยางพนธพนเมองทใหผลผลตนอย ท าใหยางพาราพนธพนเมอง

ถกโคนท าลายไปเปนจ านวนมาก ในปจจบนตนตอทใชสวนใหญจงไดมาจากเมลดพนธด คอ RRIM600

ซงระบบรากมความแขงแรงนอย และออนแอตอการเขาท าลายของโรครากหลายชนด โดยเฉพาะโรค

รากขาวทก าลงมการระบาดรนแรงในหลายจงหวดทางภาคใต ไดแก ชมพร, สราษฎรธาน, ระนอง,

นครศรธรรมราช, สงขลา, กระบ และสตล (อยทธ และเสมอใจ , 2554) ดงนนการเกบรกษาเชอ

พนธกรรมของยางพาราพนธพนเมองจงมความส าคญ เพอใชเปนแหลงของตนตอในการปลกสรางสวน

ยางพารา หรอใชประโยชนในการศกษาวจยตอไป แตเนองจากยางพาราพนธพนเมองใหผลผลตน า

ยางคอนขางต า จงถกละเลยจากเกษตรกรสวนใหญ การปลกสรางสวนยางพาราพนธพนเมองทมพนท

ขนาดใหญเพอใชเปนแหลงผลตตนตอยางพาราทเพยงพอตอความตองการจงท าไดยาก นอกจากน

ปญหาทส าคญในการเกบรกษาเมลดยางพาราคอ เมลดยางพาราจะสญเสยความงอกไดอยางรวดเรว

ภายใน 20 วนหลงจากรวงจากตน โดยเมลดยางพาราจะเสอมสภาพอยางรวดเรว เนองจากอาหาร

สะสมสวนใหญในเมลดยางพารามองคประกอบจ าพวกไขมน นอกจากขอจ ากดของการเกบรกษา

เมลดพนธยางพาราดงกลาวแลว ยงมปญหาในเรองการตดเมลดนอยและไมแนนอน หรอในบางปไม

สามารถตดเมลดได เนองจากอทธพลของสภาพอากาศทแปรปรวนไปในปจจบน การเกบรกษาเชอ

พนธกรรมพชในระยะยาว สามารถท าไดทงในและนอกหลอดทดลอง ซงการเกบรกษาในสภาพนอก

หลอดทดลองมขอจ ากดในเรองคาใชจาย การดแลรกษา การเปลยนแปลงสภาพภมอากาศ และพนท

การเกบรกษาตองมขนาดใหญ ดงนนการน าเทคนคในการเกบรกษาเชอพนธกรรมพชดวยการแชเยอก

แขงในไนโตรเจนเหลว หรอ Cryopreservation ซงเปนวธทสามารถท าการเกบรกษาเนอเยอพชไดใน

ระยะยาว ไมมขอจ ากดในเรองดงกลาว โดยจะตองมการเตรยมความพรอมใหกบชนสวนพชใหทนทาน

ตอการเกบรกษาทอณหภมต าประมาณ -196 องศาเซลเซยส ไดแก วธการปรบสภาพ (Preculture)

การดงน าออกจากเซลล (Dehydration) หรอการใชสารปองกนความเยนเพอปรบสภาพน าและ

ออสโมตคของเซลล (Cryoprotectant หรอ Vitrification) และในปจจบนมการใชเทคนคการหอหม

2

ชนสวน (encapsulation) ทจะเกบรกษาในวนอลจเนท เพอปองกนอนตรายใหแกเนอเยอพชทอย

ภายใน โดยประยกตเทคนคตางๆ เขาดวยกน ไดแก การรกษาพนธพชแบบแชเยอกแขง โดยวธการ

หม และดงน าออก (encapsulation-dehydration method) หรอ การเกบรกษาพนธพชแบบแช

เยอกแขง โดยวธการหม และปองกนไมใหเกดผลกน าแขงดวยสารเคมบางชนด (encapsulation-

vitrification method) ซงเปนเทคนคทมประสทธภาพในการเกบรกษาเชอพนธกรรมพชหลายชนด

แตยงตองมการศกษาถงวธการทเหมาะสมในแตละพช โดยเทคนคทงสองประเภทยงไมมการศกษาใน

ยางพารา ดงนนการศกษาถงวธการทเหมาะสม และปจจยตางๆ ทมผลตอการเกบรกษาเชอพนธกรรม

ยางพาราพนธพนเมองดวยวธการแชเยอกแขง จงอาจน าไปสการผลตตนกลายางพาราทสามารถใช

เปนตนตอทด เพอการปลกสรางสวนยางพาราอยางยงยน

วตถประสงคของโครงการ

1. เพอศกษาปจจยตางๆ ทมผลในการเตรยมชนสวนพชตอการเกบรกษาเอมบรโอยางพารา

ในไนโตรเจนเหลว

2. เพอศกษาเปรยบเทยบวธการทเหมาะสมในการเกบรกษาเชอพนธกรรมยางพาราโดย

เทคนค dehydration, encapsulation-dehydration, vitrification และ encapsulation-

vitrification

3

บทท 2

การตรวจเอกสาร

ยางพารา (Hevea brasiliensis Muell Arg.) เปนพชเศรษฐกจทส าคญของ

ประเทศไทย โดยประเทศไทยมพนทปลกยางพารา ในป 2556 ทงสน ประมาณ 22.2 ลานไร โดย

ผลผลตยางพาราสวนใหญอยทภาคใต ซงมพนทปลก 13.9 ลานไร คดเปนรอยละ 62.8 ของประเทศ

และปจจบนมการขยายพนทการปลกสภมภาคอนๆ มากขน โดยเฉพาะภาคตะวนออกเฉยงเหนอม

พนทปลก 4.4 ลานไร คดเปนรอยละ 19.8 ซงเปนอนดบ 2 ของประเทศ รองลงมาไดแก ภาคกลาง

และภาคเหนอ ม พนทปลก 2.6 และ 1.2 ลานไร คดเปนรอยละ 11.8 และ 5.5 ของประเทศ

ตามล าดบ (ส านกพฒนาเศรษฐกจและสงคมภาคตะวนออกเฉยงเหนอ, 2558)

ในอดตการคดเลอกและปรบปรงพนธยางพาราจะใหความส าคญกบเรองของพนธด

ทจะน ามาตดตาบนตนตอ ไมวาจะเปนการคดเลอกพนธทใหผลผลตน ายางหรอเนอไมสง รวมไปถง

ลกษณะอนๆ ทเปนเปาหมายของนกปรบปรงพนธเชน ตานทานตอการเขาท าลายของโรคส าคญของ

ยางพารา การปรบตวตอสภาพแวดลอมทแตกตางกน เปนตน แตในระยะหลงทประเทศไทยมนโยบาย

ขยายพนทปลกยางพารา จากเดมทปลกกนมากทางภาคใตและสามจงหวดในภาคตะวนออก ไปยง

ภมภาคอนๆ ของประเทศ เชน ภาคเหนอและภาคตะวนออกเฉยงเหนอ รวมทงการปลกทดแทน

สวนยางเกาและขยายพนทในภาคใตเอง เนองจากแรงจงใจในเรองของราคายางทคอนขางสง ท าให

ความตองการวสดปลกยางพาราซงไดแกตนตอตายาง หรอยางช าถงสงขนอยางมาก ในทางกลบกน

ตนยางพนธ พนเมองหรอพนธด ง เดมท เคยใช เปนตน ตอคอยๆ หายไปเพราะถกโคนเกอบ

หมด เหลออยบางเฉพาะในบางพนทเทานน ประโยชนทชดเจนของการใชยางพนเมองเปนตนตอ

เนองจากพนธเหลานนเปนพนธผสมเปด มฐานพนธกรรมกวาง ระบบรากมความแขงแรง ทนทานตอ

โรครากไดด ในปจจบนคาดกนวายางทปลกในประเทศไทยขณะน ประมาณ 75 % เปน

พนธ RRIM600 ทเหลอเปนพนธดชนดอนเชน RRIT251 BPM24 และGT1 เปนตน ดงนนตนตอสวน

ใหญในปจจบนจงไดมาจากเมลดของตนยางพนธดคอ RRIM600 ท าใหเกดปญหาเนองจากระบบราก

ของยางพนธดจะมความแขงแรงนอยกวาพนธพนเมองมาก (จรสศร และคณะ, 2557) มกมปญหาเมอ

ปลกในสภาพดนทมธาตอาหารต า และในอนาคตสงทควรระมดระวงเปนอยางยงคอ หากเกดมการ

ระบาดของโรคราก ตนตอพนธดทงหมดอาจถกท าลายไดเนองจากมพนธกรรมทใกลเคยงกน เพราะ

จากการศกษาเกยวกบการเขาท าลายของโรคราก เชน โรครากขาว (white root rot disease) พบวา

ไมมยางพนธดหรอพนธแนะน าใดทตานทานตอการเขาท าลายของเชอสาเหต โดยเฉพาะอยางยงพนธ

RRIM600 มความออนแอมาก ซงจะเกดผลเสยหายรายแรงส าหรบการปลกยางในประเทศ ในหลาย

ปทผานมา สวนยางเรมไดรบความเสยหายจากโรครากขาวมากขน จากการศกษาของอยทธ และ

4

เสมอใจ (2554) ทประเมนความเสยหายทางเศรษฐกจของชาวสวนยางในภาคใต เนองจากการเขา

ท าลายของโรครากขาว พบการระบาดของโรคในสวนยางทกจงหวด จากเหตผลดงกลาวขางตนท าให

เราตองหนมาใหความส าคญกบยางพาราพนธพนเมองหรอพนธใดๆ ทมความเหมาะสมส าหรบเปนตน

ตอทด เพอใหการปลกสรางสวนยางเปนไปอยางยงยน แตเนองจากการปลกสรางสวนยางพนธ

พนเมองขนาดใหญเพอผลตเมลดส าหรบใชผลตตนตอเปนไปไดยาก เนองจากไมมแรงจงใจในเรองของ

ผลตอบแทน และการเกบรกษาเมลดยางพาราในระยะยาวไมสามารถท าได การเกบรกษาเชอ

พนธกรรมในไนโตรเจนเหลวจงอาจเปนอกทางเลอกหนงในการเกบรกษาเชอพนธกรรมยางพนธ

พนเมองเพอการใชประโยชนในอนาคต

การเกบรกษาพนธหรอสายพนธพช มความส าคญตองานดานการปรบปรงพนธพชและการ

วจยอนๆ เปนอยางมาก ซงสวนใหญจะท าการเกบรกษาดวยเมลด โดยทวไปเมลดพนธพชจะเกบรกษา

ในสภาพทมอณหภมและความชนต า เพอทจะชะลอการเสอมสภาพของเมลดพนธพช โดยเมลดพนธ

พชตางชนดกนมอตราการเสอมสภาพทแตกตางกน เนองจากเมลดพนธมลกษณะทางสญฐานวทยา

และการปรบตวเพอความอยรอดทแตกตางกน จงสงผลใหอายการเกบรกษาแตกตางกนดวย โดย

เมลดพนธพชบางชนดมการเสอมสภาพชา จงมอายการเกบรกษาทยาวนาน สวนเมลดพนธพชบาง

ชนดมการเสอมสภาพของเมลดเรวกวา สงผลใหระยะเวลาการเกบรกษาสนลงดวย เมลดพนธพชจะม

อตราการเสอมสภาพตางกน เนองจากพฤตกรรมการตอบสนองของเมลดพนธตอการลดความชนและ

อณหภม ซงโดยทวไปสามารถแบงออกไดเปน 2 กลมคอ 1) เมลดพนธกลมออรโธดอกซ (orthodox)

เปนพวกททนตอสภาพความชนต าได อาจจะถง 4 % และสามารถเกบรกษาไวทอณหภมต าถง -20

องศาเซลเซยส โดยเมลดพนธในกลมนจะมอายการเกบรกษาหลายเดอนจนถงหลายป และ 2) เมลด

พนธรคลซแตรนท (recalcitrant) เปนเมลดทมการสญเสยความมชวตงายเมอความชนต าลง และ

ความชนวกฤตทท าใหเมลดพนธตายจะแตกตางกนไปตามชนดของพช ซงอยในชวง 12-31% เมลด

พนธพชในกลมนจะไมทนทานตออณหภมทต ากวาจดเยอกแขง ท าใหเมลดพนธในกลมนมอายการเกบ

รกษาสน ซงเมลดยางพาราจดอยในเมลดพนธแบบรคลซแตรนท นอกจากนอาหารเลยงตนออน สวน

ใหญในเมลดยางพารามไขมนเปนองคประกอบหลก ซงเปนอกหนงปจจยทสงผลท าใหเกดการ

เสอมสภาพไดเรวขน เพราะโดยทวไปแลวเมลดพนธทมไขมนเปนองคประกอบหลกจะเสอมสภาพเรว

กวาพวกทมแปงเปนองคประกอบหลก เนองจากเมอเกดการยอยสลายไขมนทเกบสะสมโดยเอนไซม

ในเมลดแลว จะท าใหเกดกรดไขมนอสระ กรดไขมนอสระทเพมขนจะเปนพษตอเซลล โดยไปมผลตอ

การงอก ท าใหการงอกของเมลดพนธลดลงดวย โดยพบวาเมลดยางพาราทหลนจากตนจะเสอมความ

งอกอยางรวดเรว โดยมความมชวตประมาณ 20 วนเทานน (อดม, 2541)

5

นอกจากขอจ ากดของการเกบรกษาเมลดพนธยางพาราดงกลาวแลว ยงมปญหาในเรองการ

ตดเมลดนอยและไมแนนอน หรอในบางปไมสามารถตดเมลดได เนองจากอทธพลของสภาพอากาศท

แปรปรวนไปในปจจบน ซงขอจ ากดดงกลาวเปนปญหาส าคญในการท าการศกษาเปรยบเทยบ

ศกยภาพยางพนธพนเมองทมระบบรากทแขงแรงและสามารถทนทานตอโรคราก เพอน ามาใชเปนตน

ตอทด เนองจากในการทดลองจะตองท าการเกบรวบรวมเมลดยางพาราพนธพนเมองจากหลายแหลง

มาเปรยบเทยบกน เมอมการตดผลทไมพรอมกนของยางพาราพนธพนเมองในพนทตางๆ จงเปนการ

ยากทจะท าการเปรยบเทยบยางพาราพนธตางๆ ในเวลาเดยวกนได เนองจากเมอเกบเมลดยางพารา

มาแลว กจะตองท าการเพาะเมลดทนท เพราะเมลดยางจะสญเสยความงอกอยางรวดเรว ดวยเหตน

วธการเกบรกษาพนธพชในสภาพการเพาะเลยงในหลอดทดลองจงเปนอกทางเลอกหนง เพอลด

ขอจ ากดของวธการใชเมลดในการเกบรกษาพนธยางพารา โดยสามารถเกบรกษาไดในหลายลกษณะ

ของชนสวนพช ไมวาจะเปนยอด, คพภะ หรอแคลลส และสามารถคงความมชวตไดในระยะเวลา

ยาวนาน โดยเกบตวอยางพชดวยเทคนค cryopreservation คอเกบรกษาเนอเยอพชใน

ไนโตรเจนเหลวทมอณหภมต าประมาณ -79 ถง -196 องศาเซลเซยส (ทศน, 2555) เมอตองการน า

เนอเยอมาใช กละลายผลกน าแขงโดยแชในน าอนอณหภม 37-40 องศาเซลเซยส จากนนจงชกน าให

เนอเยอพฒนา และเจรญเตบโตดงเดม การเกบในไนโตรเจนเหลวทอณหภม -196 องศาเซลเซยส เปน

วธการทไดรบความนยม เพราะชวยแกปญหาในเรองแรงงาน พนท คาใชจาย และเวลาทใชในการเกบ

ตลอดจนลดปญหาความเสยงตอสภาพแวดลอมทไมเหมาะสม การเกบโดยวธนเปนการเกบทอาศย

หลกการหยดกระบวนการทางชวเคมตางๆ ภายในเซลลของพช โดยอาศยขนตอนตางๆ ในการท าให

เซลลสามารถทนทานตอการเกบรกษาภายใตอณหภมทต ามากๆ และสามารถน ามาชกน าใหตนพช

กลบมามชวตไดภายหลง

1. การเกบรกษาพนธพชในไนโตรเจนเหลว

การเกบรกษาพชในไนโตรเจนเหลว หรอ cryopreservation เปนเทคนคการเกบรกษา

ชนสวนพชในระยะยาวส าหรบอนรกษแหลงพนธกรรมของพช สามารถแกไขปญหาพชบางชนด ทไม

สามารถเกบรกษาในรปของเมลด (vegetative-propagated species) ในพชทมเมลดแบบ

recalcitrant และพชทใกลสญพนธ (Engelmann, 2000) โดยการเกบรกษาชนสวนพชใน

ไนโตรเจนเหลว ทอณหภมประมาณ -196 องศาเซลเซยส ทอณหภมนเซลลจะหยดการเจรญเตบโต

(Bhojwani and Razdan, 1996) ซงการเกบรกษาพนธพชแบบแชแขงเปนวธทหยดกระบวนการทาง

ชวเคมภายในเซลลของพช เมแทบอลซมภายในเซลลจะหยดนง ท าใหสามารถขยายเวลาในการเกบ

รกษาไว (Kartha, 1985) ในทางทฤษฎนนเนอเยอของพชจะคงสภาพนนไปตลอดกาล และเมอน า

ออกสสภาวะปกตเซลลตางๆ จะยงคงมชวต สามารถแบงเซลลมการเจรญเตบโตและมการพฒนาเปน

6

ตนพชไดตามปกต (อารย, 2541) การเกบรกษาในสภาพเยอกแขงน หลกเลยงไมไดทจะเกดอนตราย

จากการขยายตวของผลกน าแขง และจะเปนสาเหตการตายของเนอเยอ ถาเกดขนภายใน (Wolfe

and Bryant, 1999) ระหวางการท าใหเยนอยางรวดเรวในไนโตรเจนเหลว ซงการท าใหเกดสภาพ

vitrification เปนกระบวนการทางกายภาพ ท าใหสามารถหลกเลยงการเกดผลกน าแขง โดยการ

เปลยนแปลงของสารละลายจากสภาพทเปนของเหลวใหเปนของแขงทมสภาพคลายกระจกขน หรอ

กระจกใสในชวงอณหภมประมาณ -110 องศาเซลเซยส รวมถงมการดงน าออกจากเซลล ซงมผลให

ความเขมขนของสารละลายเพมขน และคาความเปนกรดดางเปลยนแปลงไป เปนการปองกนการ

เสอมของเนอเยอ นอกจากนคาดวาจะมความดนน าต ากวาผลกทเปนน าแขง เปนการปองกนการเสย

น า และเนองจากภายในเซลลมความหนดสง มผลในการหยดปฏกรยาเคมทตองการการเคลอนยาย

ของโมเลกล ท าใหเกดสภาพพกตวและมเสถยรภาพเปนเวลานาน (Sakai, 2000)

2. ขนตอนการเกบรกษาเชอพนธพชในไนโตรเจนเหลว

ความส าเรจในการเกบรกษาชนสวนพชในไนโตรเจนเหลวจ าเปนตองมขนตอนการ เตรยม

ชนสวนพชทเหมาะสม เนองจากการเกบรกษาในไนโตรเจนเหลวใชอณหภมทต ามาก ซงอาจสงผลท า

ใหเซลลพชไดรบความเสยหาย และอาจตายในทสด เนองจากการเกดผลกน าแขงทงภายในและ

ภายนอกเซลล และการเปลยนแปลงทางชวเคมทจะน าไปสการเกดสารพษจ าพวกสารอนมลอสระท

เปนอนตรายกบเซลล ทงนสถานะของน าและความสมดลของออสโมตกคม สมพนธกบการเคลอนท

ของน าเขาออกเซลลเปนตวแปรส าคญ ดงนนการพฒนาวธตางๆ มาใชเพอปรบสภาพเซลลใหม

ปรมาณน าทเหมาะสม และสามารถทนตอสภาพเยนได (สพตร, 2550) โดยเซลลสามารถมชวตรอด

และพฒนาเปนพชตนใหมได โดยตองค านงถงความแตกตางในเรองชนสวนและชนดพชทตองการเกบ

รกษา โดยทวไปประกอบดวยขนตอนตางๆ ดงน

1) การปรบสภาพกอนการใหความเยน (pre-cool conditions) เนอเยอพชทจะน ามาเกบ

รกษา โดยวธนจะตองน ามาผานกระบวนการพเศษบางอยาง หรอเรยกไดอกอยางวาพรโกรต

(pregrowth) แมขนตอนนไมเกยวของโดยตรงกบกระบวนการแชแขง แตการปรบสภาพของเซลล

หรอเนอเยอใหเหมาะสมสามารถชวยเพมอตราการอยรอดของเซลล หลงผานกระบวนการแชแขงแลว

ไดดขน ขนตอนนอาจเปนการเตมสารเคมบางชนดใหแกเซลลเพอใหทนทานตอสภาวะเครยดตางๆ

(อารย, 2541) ไดแก การเพาะเลยงในอาหารทมสวนผสมของสารเคมบางชนด เชน การวางเลยงใน

หรอบนอาหารทมการเตมน าตาล (ซโครส กลโคส) หรอน าตาลแอลกอฮอล (แมนทอล ซอรบทอล) ทม

ความเขมขนสง เนองจากน าตาลความเขมขนสงสงผลตอแรงดนออสโมตก ท าใหปรมาณน าในเซลล

พชลดลง โดยน าตาลทนยมมากทสด คอ ซโครส โดยความเขมขนและระยะเวลาในการปรบสภาพท

7

เหมาะสมนน แตกตางกนขนอยกบชนดพช ขนาดชนสวน และพนธกรรมพชดวย เชนการศกษาผล

ของการท า preculture ชนสวนปลายยอดสตรอเบอร โดยการวางเลยงบนอาหารทมน าตาลซโครส

ความเขมขน 0.1, 0.25, 0.5, 0.75 และ 1.0 M เปนเวลา 24 และ 48 ชวโมง พบวา การวางเลยงบน

อาหารทมน าตาลซโครสความเขมขน 0.25 M เปนเวลา 24 ชวโมง ตามดวยการท า droplet-

vitrification ใหอตราการพฒนาเปนตนใหมสงทสด (Pinker et al., 2009) สวนการท า preculture

ชนสวนปลายยอดสม โดยการวางเลยงบนอาหารทมน าตาลซโครสความเขมขน 0.1 M เปนเวลา 3 วน

ตามดวยการท า vitrification ใหอตราการรอดชวตสงสด (Cho et al., 2001) หรอปลายยอดมน

ส าปะหลง โดยการวางเลยงบนอาหารทมน าตาลซโครสความเขมขน 0.3 M เปนเวลา 16 ชวโมง ตาม

ดวยการท า encapsulation-vitrification ใหอตราการรอดชวตสงสด (Charoensub et al., 2004)

นอกจากนอาจใชการเพาะเลยงในอณหภมทต ากวาปกต เพอกระตนเนอเยอใหมการปรบตว สามารถ

ทนตอสภาพการเยนจนแขงตวในขณะการเกบรกษา (แสงจนทร, 2547)

2) การใชสารปองกนอนตรายจากการเกดผลกน าแขง (cryoprotectant) เปนวธการทท าให

เนอเยอมความตานทานตอสภาวะเยอกแขงมากยงขน โดยใชสารปองกนอนตรายจากความเยนจดจน

เกดผลกน าแขง (แสงจนทร, 2547) กอนการเกบรกษาในสภาพทมอณหภมต ามากๆอยางนอย 1

ชวโมง จะตองเตมสารพวก cryoprotectant ลงในอาหารทเพาะเลยงเพอใหเชลลหรอเนอเยอปรบ

สภาพ permeability และจดเยอกแขง ซงจะท าใหทนทานตอการแขงตว และการละลายตว หลงการ

เกบรกษาไดโดยไมมผลกระทบตอการพฒนาของเซลลหรอเนอเยอ (รงสฤษฏ , 2541) ซงสารปองกน

ความเยนสามารถแบงได 2 ประเภท คอสารเคมประเภทออกฤทธภายในเซลล สารกลมนสามารถซม

ผานเขาภายในเซลลท าหนาทปองกนอนตรายในระหวางการแชแขงและการละลาย ไดแก glycerol,

dimethyl sulfoxide (DMSO) และแอลกอฮอลหลายชนด เชน methanol ethanol propanediol

เปนตน ซงสารประเภทนจะปองกนอนตรายไดด เมอใชในระดบความเขมขนคอนขางสง (1-4 M) โดย

ทแอลกอฮอลมอตราการแพรเขาสเซลลสงสด รองลงมาคอ DMSO และ glycerol ซงสารประเภทน

จะมพษตอเซลล สารปองกนความเยนอกประเภท คอสารเคมประเภทออกฤทธภายนอกเซลล จะให

ผลไดดทความเขมขนต า (0.01-0.2 M) และเปนพษนอยกวา ไดแก polyvinylpyrrolidon (PVP)

และน าตาลชนดตางๆ เชน sucrose, glucose และ mannitol เปนตน

สารปองกนความเยนมประสทธภาพสงมากในการหลกเลยงการเกดน าแขงภายในเซลล ซง

สาร vitrification เปนสารปองกนความเยนทมประสทธภาพในการรกษาชนสวนพชในระหวางการแช

แขงแสดงในตารางท 1

8

ตารางท 1 สวนประกอบของสารละลาย vitrification

สารละลาย สวนประกอบ อางอง

PVS1 22% glycerol+15% EG+15% PEG+

7% DMSO+0.5 M sorbitol

Uragami และคณะ (1990)

PVS2 30% glycerol + 15% DMSO + 15% EG

+ 13.7% sucrose

Sakai และคณะ (1990)

PVS3 50% glycerol + 50% sucrose Nishizawa และคณะ (1993)

PVS4 35% glycerol + 20% EG +

20.5% sucrose

Sakai และคณะ (2000)

ทมา: ก าไล (2554)

หมายเหต: ethylene glycol (EG), polyethylene glycol (PEG), dimethyl sulfoxide (DMSO)

3) การท าใหเนอเยอแขงตวอยางชาๆ (slow freezing) เมออณหภมของการเกบรกษาลด

ต าลงกวา 0 องศาเซลเซยส จนถงประมาณ -100 องศาเซลเซยส จะมการเปลยนแปลงอยางมากเกด

เปนผลกน าแขงทงภายในและภายนอกเซลล โดยเฉพาะอยางยงไซโตพลาสซมภายในเซลลจะแขงตว

และเพมปรมาตรขน ดงนน การลดอณหภมลงอยางชาๆ เปนการชวยไมใหเซลลไดรบอนตรายจากการ

เกดผลกน าแขง ขณะเดยวกนกชวยดงน าออกจากเซลลไปในตว ในกรณทมการแขงตวอยางรวดเรวจะ

ท าใหสญเสยน าออกมาไดนอย เมอเกดผลกน าแขงและมปรมาตรเพมขนจะท าใหเซลลไดรบความ

เสยหาย อยางไรกตามถาเซลลสญเสยน ามากเกนไปอาจเกดความเสยหายไดเชนกน ดงนนอตราการ

อยรอดของเซลลจงขนกบสมดลระหวางอตราการลดลงของอณหภมอยางชาๆ กบอตราการสญเสยน า

ออกไปจากเซลลดวย และอตราการอยรอดดงกลาวนขนกบชนดของเนอเยอทเกบรกษา (รงสฤษฏ ,

2540)

4) การเกบรกษาไวในทเยนจด (freeze storage) หลงจากท าใหเซลลแขงตวอยางชาๆ แลว

ตองยายไปเกบไวทเยนจด (ต ากวา -100 องศาเซลเซยส) เพอปองกนการเกดผลกน าแขงภายในเซลล

อกครงหนง ในทางปฏบตเพอความสะดวกจงนยมเกบไวในไนโตรเจนเหลวท -196 องศาเซลเซยส

หรอในไอของไนโตรเจนเหลว (liquid nitrogen vapour) ท -150 องศาเซลเซยส (รงสฤษฏ, 2540)

5) การละลายผลกน าแขง (thawing) เมอตองการน าเนอเยอทเกบรกษาไวในไนโตรเจนเหลว

มาใช ตองน าเนอเยอทเกบแชแขงมาละลาย ซงปกตท าโดยการจมภาชนะเกบ ลงในน าสะอาดปลอด

เชอทอณหภม 40-45 องศาเซลเซยส กอนทจะน าเนอเยอไปเลยงบนอาหารปกตตอไป ส าหรบเนอเยอ

9

ทเกบแชแขงโดยการ encapsulation กเพยงน าออกวางในอณหภมหองธรรมดา เมอน าแขงละลาย

หมด กน าเนอเยอไปเลยงในอาหารปกตและชกน าใหเกดตนตอไป (อารย, 2541)

6) การท าใหเนอเยอสามารถเจรญเตบโตไดอก (recovery) เนอเยอทผานขนตอนตางๆ

ขางตนมาแลว อาจมการเปลยนแปลงทางสรรวทยาของเซลลและมกจะออนแออยางยงตอความ

เสยหายทเกดขนตามมา จงตองปรบสภาพการเพาะเลยงใหเหมาะสม โดยเฉพาะอยางยงตองการ

อาหารเพาะเลยงพเศษทแตกตางจากสตรทใชเพาะเลยงกอนเกบรกษา (รงสฤษฏ, 2540) ความมชวต

ของเนอเยอหลงการแชแขง เปนขอบงชถงความส าเรจของวธการ ดงนนการวดความมชวต (viability)

จงเปนวธทงายและสะดวก ซงสามารถท าไดโดยการยอมสดวย FDA (fluorescein diacetate) เซลล

พชมเอนไซม esterase จะยอยโมเลกลของ FDA แลวใหสารเรองแสงสเขยวเมอดดวยกลอง UV (อา

รย, 2541)

3. การพฒนาเทคนค cryopreservation

การพฒนาเทคนค cryopreservation สมยกอนจะอาศยความเยน เพอชกน าใหเกดการดง

น าออกจากเซลล แตเทคนคสมยใหมจะเนนการเกดสภาพ vitrification (Engelmann, 2000) วธการ

นเกยวของกบการแชชนสวนพชในสารละลายของสารปองกนผลก (cryoprotectant) ทมความ

เขมขนสง ปองกนการท าลายของเนอเยอ เนองจากผลกน าทงทเกดในเซลล (intracellular

crystallization) และนอกเซลล (extracellular crystallization) ซงการเกด vitrification จะม

ลกษณะคลายกระจก ไมเกดผลกน าแขงทจดเยอกแขงของน า (freezing point) (Bajaj, 1995)แต

พบวาสารละลายทใชจะมอนตรายตอพช และระยะเวลาทแชมความส าคญตอการฟนคนสภาพของพช

(Reed et al., 2000) สวนวธ encapsulation-dehydration มการพฒนาขนโดย Fabre and

Dereuddre (1990) เปนวธการทประยกตมาจากการผลตเมลดเทยม (artificial seed) น าชนสวนพช

มาหมใน alginate bead แลวเตรยมสภาพเนอเยอในสารละลายทมซโครส ประมาณ 1 ถง 7 วน

จากนนท าการดงน าออกจากเซลลโดยการเปาลมดวย lamina flow หรอใชซลกาเจลใหน าลดลงเหลอ

ประมาณ 20% ของน าหนกสด แลวท าการแชไนโตรเจนเหลว (Engelmann, 2000) โดยชนสวนทถก

หมดวย alginate bead จะชวยปองกนการสญเสยน าออกไป และงายตอการหยบจบขณะเคลอนยาย

(Takagi, 2000) อยางไรกตามกพบวาจะมอตราการรอดต ากวาวธ vitrification (Matsumoto et

al., 1995) ซงท าใหเกดการพฒนาวธ encapsulation-vitrification เปนวธการผสมผสานระหวางวธ

vitrification และ encapsulation โดยชนสวนพชน ามาหมดวย alginate bead แลวดงน าออกโดย

แชสารละลาย cryoprotectant เหมอนวธ vitrification (Engelmann, 2000) โดย alginate bead

10

จะมสวนในการปองกนการสญเสยน า และปองกนออสโมตก เมอแชในสารละลายของ vitrification

(Hirai and Sakai, 2000)

ขอด การเกบรกษาแบบแชแขง คอ ใชพนทนอย รวมทงเกบรกษาไดเปนเวลานาน (ในทาง

ทฤษฎเกบไวโดยไมจ ากดเวลา) และเนอเยออยในสภาพทถกยบยงการเจรญ จงเกดการแปรผนทาง

พนธกรรมไดต า ขอเสย คอ ตองใชอปกรณในการลดอณหภม เนอเยอตองมการเรมเจรญใหม กอน

การขยายพนธ นอกจากนยงใชกบเนอเยอทมการจดเรยงโครงสรางของเซลลทแนนอนแลวไมคอย

ไดผล และยงตองมการพฒนาวธการทใชเฉพาะส าหรบแตละพช (สมยศ, 2541)

3.1 การรกษาพนธพชแบบเกบแชแขงโดยวธ dehydration

การเกบรกษาดวยวธการนเปนการลดปรมาณน าในเซลล เพอการปองกนไมใหน าใน

เซลลของเนอเยอพชนนเกดการแขงตวในขณะทท าการเกบรกษาในไนโตรเจนเหลว สามารถท าได

หลายวธ เชน การวางชนสวนพชในตยายเลยง และเปาดวยลมความเรว 80-90 ฟตตอนาท หรอวาง

ในโถปรบความชน (desiccator) ทบรรจซลกาเจล ทระยะเวลาทเหมาะสม โดยตองค านงถงปรมาณ

น าทมอยในเนอเยอพช หากเนอเยอสญเสยน ามากเกนไป อาจสงผลตอการรอดชวต และการพฒนา

เปนพชตนใหมหลงจากการเกบรกษา ดงนนจงตองพจารณาทงชนดของพช ขนาดของชนสวนของพช

กอนทจะน ามาท าการทดลอง (อารย , 2541) เชน การเกบรกษาเอมบรโอ Handroanthus

serratifolius โดยการวางชนสวนพชในตยายเลยง เปนเวลา 0-300 นาท หลงจากแชในไนโตรเจน

แลว พบวา ชวงเวลาในการลดความชนเปนปจจยส าคญตออตราการรอดชวต โดยจะตองลดความชน

ใหอยในระดบ 10% กอนทจะท าการเกบรกษาไนไนโตรเจนเหลว (Souza et al., 2014)

3.2 การรกษาพนธพชแบบเกบแชแขงโดยวธ vitrification

เปนเทคนคการปรบปรมาณน าโดยใชสารเคม และสารละลายทปกปองเนอเยอจากความเยน

ในขณะแชไนโตรเจนเหลว เพอปองกนอนตรายจากความเยนจนเกดผลกน าแขง (แสงจนทร, 2547)

โดยสารละลายทใชมผลในการดงน าออกจากเซลล ซงจะชวยลดความเสยหายทเกดขนจาก osmotic

stress ซงเปนผลท าใหเกด chemical toxicity (นวลทพย และคณะ, 2553) ซงสารเคมทใชนมทงท

สามารถซมผานเขาไปในเนอเยอหมเซลลหรออาจหอหมอยภายนอก สารเคมทใชเ พอปองกนไมใหน า

ในเซลลตกผลกแขงตวจะมความเขมขนสง จงปองกนไมใหเกดการแขงตวของน าในเซลล เซลลจงไมได

รบความเสยหาย (อารย, 2541) สารทใชปองกนอนตรายจากการเกดผลกน าแขงมหลายชนด เชน ได

เมทลซลฟอกไซด ซโครส กลโครส เอทลนไกลคอล โพลเอทลนไกลคอล กลเซอรอล โพรลน และ

สารประกอบไฮครอกไซลกบางชนด เปนตน สวนการใชสารเคมนนจะแตกตางกนไปตามแตละสตร

เชน สารละลาย PVS2 จะประกอบไปดวย กลเซอรอล (glycerol) 30% ไดเมทลซลฟอกไซด

11

(DMSO) 15% เอทลนไกลคอล (ethylene glycol) 15% และ PVS3 ซงประกอบดวย กลเซอรอล

50% และ ซโครส 50% เชน ในการเกบรกษาเมลดของกลวยไมดนพนธ Bletilla striata Rchb.f.

โดยน ามาเลยงในอาหารสตร New Dogashima (ND) เปนระยะเวลา 10 วน หลงจากนนท าการ

เตรยมเนอเยอโดยการเลยงบนอาหารสตร ND ทมน าตาลซโครส 0.3 M ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส

ในทมด เปนระยะเวลา 3 วน จากนนเตมสารกลเซอรอล 2 M และซโครส 0.4 M (loading

solution) เปนระยะเวลา 15 นาท ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส แลวเตมสารละลาย PVS2 ความ

เขมขนสง เปนระยะเวลา 3 ชวโมง ทอณหภม 0 องศาเซลเซยส หลงจากนนน าไปเกบใน

ไนโตรเจนเหลว 30 นาท และน าเอมบรโอมาท าการละลายอยางรวดเรว น ามาลางดวยอาหารเหลว

สงเคราะหสตร ND รวมกบซโครส 0.2 M (unloading solution) เปนระยะเวลา 20 นาท แลวน าไป

เลยงบนอาหารสงเคราะหสตร ND พบวาการพฒนาของเอมบรโอไปเปนตนปกต โดยมอตราสวนการ

รอดชวต 60% (Ishikawa et al., 1997) หรอในการเกบรกษาเซลลของกลวยไมพนธ Doritaenpsis

cv. New Toyohashi โดยท าการเตรยมเซลลในอาหารสตร ND ทมซโครส 0.1 M และ abscisic

acid (ABA) 1.0 มลลกรมตอลตร เปนระยะเวลา 1 สปดาห ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส หลงจาก

นนเตมสารทมสวนประกอบของ กลเซอรอล 2 M และซโครส 4 M เปนระยะเวลา 15 นาท ท

อณหภมหอง และท าการเตมสารละลาย PVS2 เปนระยะเวลา 1-3 ชวโมง (Tsukazaki et al., 2000)

3.3 การรกษาพนธพชแบบเกบแชแขงโดยวธ encapsulation-dehydration

การเกบโดยวธการนท าโดยการน าเมลดเทยมทไดจากการเคลอบชนสวนของพชดวยสารอล

จเนท จากนนน าไปท าใหสญเสยน าดวยวธการตางๆ เชน การใชสารซลลกาเจล การใชน าตาลซโครสท

มความเขมขนสง กอนการเกบรกษาไวในไนโตรเจนเหลว (สมยศ, 2541) เชน การเกบรกษาชนสวน

ปลายยอดของตนฮอบ หลงจากตดชนสวนปลายยอดแลว หมดวยสารอลจเนททมน าตาลซโครส 0.5

โมล ท าการเพาะเลยงกอนเปนเวลา 2 วน บนอาหารแขงทประกอบดวย ซโครส 0.75 M ท าการดงน า

ออกดวยซลกาเจลภายในต laminar air-flow เปนระยะเวลา 4 ชวโมง ตามดวยการท าใหแขงตว

อยางรวดเรวในไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 60 นาท และเมอท าการละลายอยางชาๆ พบวาปลายยอดม

เปอรเซนตความรอดชวต 80% (Martinez et al., 1999) นอกจากนยงมการใชเทคนค

encapsulation-dehydration มาใชในการเกบรกษา ovule และ somatic embryo ของสม โดย

การท า preculture บนอาหารเหลวทเตมน าตาลซโครสความเขมขน 0.75 M เปนเวลา 1 วน ลด

ความชนภายใต laminar air-flow ใหเหลอ 20-25% หลงแชในไนโตรเจนเหลวใหอตราการรอดชวต

สงถง 75% (Gonzalez-Arnao et al., 2003)

12

3.4 การรกษาพนธพชแบบเกบแชแขงโดยวธ encapsulation-vitrification

การเกบรกษาดวยวธนมพนฐานมาจากการเกบแชแขงโดยการปองกนไมใหเกดผลกน าแขง

แตมการน าวธการเขามาเพม คอการเคลอบชนสวนของพชดวยสารอลจเนทกอน ซงการเคลอบ

ชนสวนพชดวยสารอลจเนทกอนท าการเกบแชแขงนน จะชวยลดความเปนพษทชนสวนของพชจะตอง

สมผสสารเคมโดยตรงได (สมยศ, 2541) เชน ในการเกบรกษาชนสวนปลายยอดทไดจากการเลยงตน

ตอของ horseradish ท าการเคลอบชนสวนปลายยอดดวยวนอลจเนททมน าตาลซโครส 0.5 M แลว

น าไปเลยงบนอาหารสตร MS ทมน าตาลซโครส 0.5 M ในทมแสงนาน 1 วน จากนนเตมสารละลาย

สตร PVS2 ทมน าตาลซโครส 0.5 M ทอณหภม 0 หรอ 25 องศาเซลเซยส เปนเวลานานตางๆกน

กอนจมลงในไนโตรเจนเหลว หลงจากท าละลายอยางรวดเรวในน าอนทอณหภม 40 องศาเซลเซยส

แลวน ากอนอลจเนทไปลางในอาหารเหลวสตร MS ทมน าตาลซโครส 1.2 M เปนเวลา 40 นาท น าไป

เลยงบนอาหารสตร MS นาน 1 คน แลวยายลงเลยงบนอาหารใหมอก 2 ครง พบวาการใชสารละลาย

สตร PVS2 ทอณหภม 0 องศาเซลเซยส นาน 4 ชวโมง ปลายยอดมอตราการรอดชวต 69% สวนการ

ใชสารละลาย PVS2 ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส นาน 2 ชวโมง มอตราการรอดชวต 40%

(Phunchindawan et al., 1997) นอกจากนยงมการศกษาการใชเทคนค encapsulation-

vitrification ในการเกบรกษาปลายยอดมนส าปะหลง พบวา การเลยงปลายยอดในอาหารทมน าตาล

ซโครส 0.3 M เปนเวลา 16 ชวโมง หลงจากนนน าปลายยอดมาหมดวยวนอลจเนท แลวแชในสาร 2

M glycerol ผสมกบ 0.6 M sucrose เปนเวลา 90 นาท ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส หลงจากนน

จงน าไปแชในสาร PVS2 เปนเวลา 4 ชวโมง ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส หลงแชในไนโตรเจนเหลวให

อตราการรอดชวต 80% (Charoensub et al., 2004)

4. การเกบรกษาเชอพนธกรรมยางพารา

การศกษาการเกบรกษาเอมบรโอยางพาราพนธพนเมองในสภาพอณหภมต าในหลอดทดลอง

(short term storage) โดยอรณ และ สมปอง (2535) ไดท าการเกบรกษาเอมบรโอยางพาราพนธ

พนเมองในอาหารสตร MS ทเตมน าตาลซโครส 3% และสาร cryoprotectant 2 ชนด ไดแก แมนน

ทอล หรอ ซอรบทอล ทระดบความเขมขนตางๆ และวางเลยงทอณหภม 10 องศาเซลเซยส พบวา

สามารถเกบรกษาเอมบรโอไดเปนเวลา 6 สปดาห เอมบรโอทเกบรกษาในอาหารทเตมแมนนทอล

เขมขน 0.05 M ใหความมชวตสงสด 72.96% รองลงมาคอ การเกบรกษาในอาหารทเตมซอรบทอล

เขมขน 0.05 M ใหความมชวตหลงการเกบรกษา 57.00%

นอกจากน ย ง ม ก า รศ กษากา ร เก บ ร กษา เ ช อ พนธ ก ร รมย า งพา ร า ด ว ย เทคน ค

cryopreservation เพอเกบรกษาชนสวนตางๆ ไดแก เอมบรโอ, embryogenic callus และแคลลส

13

ทชกน ามาจากอบละอองเกสร (anther) โดย Normah และ Chin (1995) ไดท าการศกษาการลด

ความชนเอมบรโอยางพาราดวยเทคนค dehydration ตอมา Engelmann et al (1997) ศกษาการ

เกบรกษา embryogenic callus ของยางพาราพนธ PB260 และ PR107 โดยการน าชนสวนมาท า

preculture ในอาหารเหลว MS ทเตมซโครส 1.0 M และ DMSO 10% เปนเวลา 1 ชวโมงท 0 องศา

เซลเซยส หลงจากนนแชแขงดวยการลดอณหภมทอตราเรว 0.2 ˚C•min-1 จนถงอณหภม -40 องศา

เซลเซยส หลงจากนนจงท าการแชไนโตรเจนเหลว พบวาใหความมชวต (viability) 49% (Yap et

al., 1998) ศกษาผลของการท า preculture ดวยการวางเลยงเอมบรโอยางพาราบนอาหารสตร MS

ทเตมซโครสความเขมขน 0.3, 0.5, 0.7 และ 0.9 M แลวท าการหมดวยอลจเนท หลงผานการแช

ไนโตรเจนเหลว พบวา ทความเขมขน 0.3 และ 0.5 M สงผลใหความมชวตสงขน โดยมความชวต

ประมาณ 30% แตทความเขมขน 0.7 และ 0.9 M สงผลใหความมชวตลดลง (Sam, 1999) ได

ท าการศกษาเทคนคการเกบรกษาเอมบรโอยางพาราโดยวธ vitrification โดยแชในสาร PVS2 เปน

เวลา 80 นาท พบวามอตราการรอดชวตเพยง 13.4% นอกจากน Zhou et al. (2012) ไดศกษาการ

เกบรกษาแคลลสทชกน ามาจากอบละอองเกสร ของยางพาราโดยวธ vitrification พบวาการท า

preculture บนอาหาร MS ทเตมซโครส 5% (w/v) และ DMSO 5% (v/v) เปนเวลา 3 วน แชสาร

loading solution (60% PVS2) เปนเวลา 20 นาท ทอณหภม 0 องศาเซลเซยส และดงน าออกดวย

การแชใน PVS2 40 นาท หลงแชในไนโตรเจนเหลวแลวมความมชวต 71.7%

14

บทท 3

วธด าเนนการวจย

3.1 วสดอปกรณ

3.1.1 พชทดลอง

เมลดพนธยางพาราพนเมองทไดจากพนทจงหวดสงขลา คดเลอกเมลดทมลกษณะ

สมบรณ และเพงตกใหม น ามาฟอกฆาเชอและแกะเอาเฉพาะสวนของเอมบรโอ

3.1.2 เครองมอและอปกรณส าหรบเพาะเลยงเนอเยอ

- เครองวดความเปนกรด-ดาง

- เครองชงทศนยม 2 และ 4 ต าแหนง

- เตาแกส

- อปกรณเครองแกว เชน บกเกอร กระบอกตวง จานเพาะเลยง ปเปต หลอด

ทดลอง ขวดเพาะเลยงขนาด 8 ออนซ

- อปกรณโลหะ เชน ปากคบ ดามมด และใบมดผาตด

- ชอนตกสาร

- หมอนงความดนไอน า

- เตาอบความรอนแหง

- ตยายเลยง

- ถงเกบไนโตรเจน

- อางน าควบคมอณหภม

3.1.3 สารเคม

- สารเคมในการฟอกฆาเชอ เชน คลอรอกซ แอลกอฮอล โซเดยมไฮโปคลอไรท และ

สารลดแรงตงผว tween20

- สารเคมส าหรบเตรยมอาหารสตร MS

- สารเคมทใชปรบความเปนกรด-ดางของอาหารเพาะเลยงเนอเยอ ไดแก โซเดยวไฮ

ดรอกไซด (NaOH) และ กรดไฮโดรคลอรก (HCl)

- สารควบคมการเจรญเตบโต ไดแก kinetin, NAA (α-naphthaleneacetic acid),

GA (gibberellic acid)

- สารเคมทใชในการเตรยมชนสวนดวยเทคนคตางๆ ในการเกบในไนโตรเจนเหลว

15

- สาร PVS2 ซงประกอบดวย glycerol 30%, DMSO 15%, ethylene glycol

15% และ sucrose 13.7%

- สาร PVS3 ซงประกอบดวย glycerol 50% และ sucrose 50%

- ผงถาน

- โซเดยมอลจเนท

- แคลเซยมคลอไรด (CaCl22H2O)

3.2 วธการทดลอง

3.2.1 การเตรยมชนสวนพช

น าเมลดยางพารามาเตรยมชนสวนพชโดยท าการฟอกฆาเชอตามวธของ Ighere และคณะ

(2011) แยกเอาสวนเปลอกหมเมลดออก ท าความสะอาดผวภายนอกของเมลดสวนในดวยการปลอย

ใหน าประปาไหลผานประมาณ 2 นาท แลวจงท าการลางน าทผสม tween 20 หลงจากนนจงแชใน เอ

ทานอล 70% เปนเวลา 5 นาท ลางดวยน ากลนนงฆาเชอ จากนนฟอกฆาเชอดวยโซเดยมไฮโปคลอ

ไรท ความเขมขน 2% เปนเวลา 15 นาท ในตปลอดเชอ และฟอกอกครงดวยโซเดยมไฮโปคลอไรท

ความเขมขน 1% เปนเวลา 10 นาท แลวลางเมลดดวยน ากลนนงฆาเชอ 5 ครง หลงจากนนจงตดเอา

เฉพาะชนสวนเอมบรโอ (embryo) จากเมลดยางพารา (ภาพท 1)

ภาพท 1 เมลดยางพารา และเอมบรโอยางพาราทใชในการทดลอง

3.2.2 การศกษาชวงเวลาทเหมาะสมในการปรบสภาพ (preculture) ใหกบเซลลพช

น าเอมบรโอยางพาราทไดมาปรบสภาพเซลลโดยวางเลยงในอาหารกงแขงสตร MS ทเตม

น าตาลซโครสระดบความเขมขนตางๆ ไดแก 0.3 M เปนเวลา 0, 1, 2, 3, 4 และ 5 วน เปรยบเทยบ

กบชดควบคมทไมผานการปรบสภาพเซลล

3.2.3. การท าเมลดเทยม (encapsulation)

น าตวอยางเอมบรโอมาหมดวยวนอลจเนท โดยน าเอมบรโอมาผสมในอาหารสตร MS ท

ปราศจากแคลเซยมคลอไรด (calcium-free medium) ทเตมสารละลายโซเดยมอลจเนทความ

Rubber seeds Mature zygotic embryos

16

เขมขน 3% (w/v) แลวหยดลงในสารละลายแคลเซยมคลอไรด ความเขมขน 100 mM โดยการเขยา

ขวดเปนระยะๆ ทงไวประมาณ 30 นาท เพอใหโซเดยมอลจเนทกอตวขนเปนเมลดเทยม หลงจากนน

ลางเมลดเทยมดวยน ากลนนงฆาเชอ 3 ครง ครงละ 3-5 นาท จงน าไปใชในการทดลอง

ภาพท 2 การเตรยมเมลดเทยม (encapsulation) เอมบรโอยางพาราทใชในการทดลอง

3.2.4 การศกษาสารเคม และระยะเวลาทเหมาะสมในการท า vitrification และ

encapsulation-vitrification

- น าเอมบรโอทผานการท า preculture มาแบงเปนสองกลมคอ กลมท 1 หมดวยวนอล

จเนท และกลมท 2 เอมบรโอยางพาราทไมผานการหมดวยวนอลจเนท แชในอาหารเหลวสตร MS

เตมกลเซอรอล 2.0 M และน าตาลซโครส 0.4 M (loading solution หรอ osmoprotective

solution) เปรยบเทยบระยะเวลาในการแชท 0, 20, และ 40 นาท ทอณหภม 0 องศาเซลเซยส

- ยายเอมบรโอทผานการแช loading solution มาแชในสารละลาย vitrification PVS2 (ซง

ประกอบดวย glycerol 30%, DMSO 15%, ethylene glycol 15% และ sucrose 13.7%) และ

PVS3 ซงประกอบดวย (glycerol 50% และ sucrose 50%) ทอณหภม 0 องศาเซลเซยส

เปรยบเทยบระยะเวลาในการแชท 0, 30, 60, 90 และ 120 นาท

- น าเมลดเทยมทไดมาบรรจใน cryotube ท าการทดลองอยางนอย 3 ซ า ซ าละ 9 เอมบรโอ

แลวน าไปแชในไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 24 ชวโมง น าเมลดเทยมทผานการแชเยอกแขงมาละลาย

ผลกน าแขงดวยการแชในน าอน อณหภม 40 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 นาท เทสารละลาย

vitrification ทง แลวแชเมลดเทยมในอาหารเหลวสตร MS ทเตมสารละลายซโครส 1.2 M เปนเวลา

20 นาท และวางเลยงในอาหารสตร MS ทเตม kinetin 0.6-0.7 µM, NAA 1.0 µM, GA 1.4 µM

และ ผงถาน 4 g/l ดงแสดงในภาพท 3 ตรวจสอบเปอรเซนตการรอดชวต และการพฒนาไปเปนพช

ตนใหม วางแผนการทดลองแบบ CRD (Completely randomized design) เปรยบเทยบคาเฉลย

ดวยวธ DMRT (Duncan’s multiple range tests)

17

ภาพท 3 ขนตอนการเกบรกษาเอมบรโอยางพาราในไนโตรเจนเหลว โดยวธ vitrification และ

encapsulation-vitrification

วางเลยงในอาหาร regrowth (อาหารสตร MS ทเตม kinetin 0.6-0.7 µM, NAA 1.0 µM, GA

1.4 µM และ ผงถาน 4 g/l)

เกบรกษาใน LN 24 ชม.

Thawing 40˚C, 2 นาท

Preculture ในอาหารสตร MS + 0.3M Sucrose

เปนเวลา 3 วน

Encapsulation

Vitrification Encapsulation-vitrification

แชในสาร loading solution เปนเวลา 0, 20 และ 40 นาท

แชในสาร PVS2 เปนเวลา 0, 30, 60, 90 และ 120 นาท แชในสาร PVS3 เปนเวลา 0, 30, 60, 90 และ 120 นาท

แชในสาร unloading solution 20นาท

18

3.2.5 การศกษาวธการ และระยะเวลาทเหมาะสมในการท า dehydration และ

encapsulation-dehydration

น าเอมบรโอทผานการท า preculture มาแบงเปนสองกลมคอ กลมท 1 หมดวยวนอลจเนท

และกลมท 2 เอมบรโอยางพาราทไมผานการหมดวยวนอลจเนท ท าการเปรยบเทยบวธการดงน าออก

2 วธ ไดแก การผงลมในตยายเลยงในสภาพปลอดเชอ ทมลมเปาดวยความเรว 80-90 ฟตตอนาท ท

ระยะเวลาตางๆ ตงแต 0, 2, 3, 4 และ 5 ชวโมง เปรยบเทยบกบการลดความชนในภาชนะปดทมซล

กาเจล โดยน าซลกาเจลมาอบทอณหภม 180 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง แลวน าเอมบรโอ

ยางพารามาวางเพอลดปรมาณน าในเซลลทระยะเวลาตางๆ ตงแต 0, 3, 5, 7 และ 9 ชวโมง บรรจ

ชนสวนพชในอลมเนยมฟอยล กอนท าการเกบรกษาในสภาวะต ากวาจดเยอกแขงในไนโตรเจนเหลว

เปนเวลา 24 ชวโมง น าเมลดเทยมทผานการแชเยอกแขงมาละลายผลกน าแขงดวยการแชในน าอนใน

อางควบคมอณหภม 40 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 นาท และวางเลยงในอาหารสตร MS ทเตม

kinetin 0.6-0.7 µM, NAA 1.0 µM, GA 1.4 µM และ ผงถาน 4 g/l ดงแสดงในภาพท 4 ตรวจสอบ

เปอรเซนตการรอดชวต จ านวนวนทเรมงอก และการพฒนาไปเปนพชตนใหม วางแผนการทดลอง

แบบ CRD จ านวน 3 ซ า ซ าละ 10 เอมบรโอ เปรยบเทยบคาเฉลยดวยวธ DMRT

19

ภาพท 4 ขนตอนการเกบรกษาเอมบรโอยางพาราในไนโตรเจนเหลว โดยวธ dehydration และ

encapsulation-dehydration

วธการ dehydration 1. วางในภาชนะปดทม silica gel เปนเวลา0, 3, 5, 7 และ 9 ชม. 2. วางใน laminar air-flow เปนเวลา 0, 2, 3, 4 และ 5 ชม.

วางเลยงในอาหาร regrowth (อาหารสตร MS ทเตม kinetin 0.6-0.7 µM, NAA 1.0 µM, GA 1.4 µM

และ ผงถาน 4 g/l)

เกบรกษาใน LN 24 ชม.

Thawing 40˚C, 2 นาท

หมดวยอลมเนยมฟลอยด

Preculture ในอาหารสตร MS + 0.3M Sucrose

เปนเวลา 3 วน

Encapsulation

Dehydration Encapsulation-dehydration

20

บทท 4

ผลการทดลองและวจารณผลการทดลอง

1. ผลของระดบความเขมขนของน าตาลซโครส และระยะเวลา ทใชในการปรบสภาพใหกบเซลล

พช

เนอเยอพชทกแบบและทกชนดสามารถจะเกบแชแขงได แลวสามารถน ามาชกน าใหเกดเปน

ตนทสมบรณ เซลลทเหมาะสมตอการเกบแชแขงควรเปนเซลลขนาดเลกทก าลงเจรญอยางรวดเรวม

ชองวางในเซลลนอย ซงจะมน าในเซลลนอยดวย เชน เนอเยอเอมบรโอภายในเมลดซงเซลลมขนาด

เลก ก าลงเจรญเตบโตและมน านอย จงเหมาะทจะเกบรกษาโดยการแชแขง นอกจากนเอมบรโอยงม

ความพรอมทจะเจรญเปนตนทสมบรณไดงาย โดยไมตองผานการชกน ายอดหรอราก ในการทดลองน

จงไดเลอกชนสวนจากเอมบรโอภายในเมลดยางพารามาใชในการทดลอง การปรบสภาพเพอให

ชนสวนพชทนตอสภาพอณหภมต ากอนการท า cryopreservation โดยการเตมสาร cryoprotectant

ลงในอาหารเพาะเลยงกอน เพอใหเซลลและเนอเยอไดปรบสภาพ สงผลใหเนอเยอทนตอการแขงตว

และการละลายหลงการเกบรกษา โดยทไมมผลกระทบตอการพฒนาของเนอเยอ โดยสารเคมทใชเปน

cryoprotectant ในกลมทมความเปนพษนอย และมการใชกนอยางแพรหลายคอ น าตาลชนดตางๆ

เชน ซโครส กลโคส แมนนทอล เปนตน สารในกลมน ซโครสเปนน าตาลตวหนงทนยมใช เพราะหา

งายและราคาไมแพง จากการศกษา พบวา ระดบความเขมขนของน าตาลซโครสทความเขมขน 0.3 M

ในอาหารสตร MS ทเตมซโครสทความเขมขน 0.3 M เปนเวลา 3 วน แลวน าไปลดความชนใน

laminar air-flow เปนเวลา 3 ชวโมง แลวแชในไนโตรเจนเหลว ใหผลการทดลองดทสด โดยม

เปอรเซนตการรอดชวต และเปอรเซนตการพฒนาเปนตนใหมสงทสด คอ 55% และ 42% ตามล าดบ

(ภาพท 4) สอดคลองกบการทดลองของ Yap และคณะ (1998) ทไดเปรยบเทยบการปรบสภาพ

เอมบรโอยางพาราดวยน าตาลซโครส พบวาการท า preculture โดยการวางเลยงเอมบรโอในอาหาร

MS ทเตมซโครส 0.3 M ใหความมชวตสงทสดใกลเคยงกบทความเขมขน 0.5 M นอกจากน Yap

และคณะ (2011) ไดท าการศกษาผลของการท า preculture ปลายยอดชะมวง (Garcinia cowa)

ดวยการวางเลยงในอาหารสตร MS ทเตมซโครสความเขมขน 0.3 M เปนเวลา 0-3 วน พบวาการวาง

เลยงปลายยอดสมแขกในอาหารสตร MS ทเตมซโครสความเขมขน 0.3 M เปนเวลา 3 วน ใหการ

รอดชวตสงถง 30.0% เมอเปรยบเทยบกบการไมท า preculture ทไมพบการรอดชวตหลงผานการแช

ไนโตรเจนเหลว

การน าชนสวนพชมาเพาะเลยงในททอณหภมต ากวาปกตในทมด รวมกบการเพาะเลยงใน

อาหารทมความเขมขนของน าตาลสง เพอกระตนการปรบตวใหทนตอสภาพการแชแข ง อาหารทม

21

ความเขมขนของน าตาลสงชวยในการลดปรมาณน าภายในเซลล ท าใหมการสะสมน าตาลภายในเซลล

เพอปองกนความเสยหายของโปรตนและเยอหมเซลลทไดรบความเสยหายในระหวางการสญเสยน า

และการแชแขงในไนโตรเจนเหลว (Panis et al., 1996; Miao et al., 2005) โดยปรมาณน าตาลท

เหมาะสมอยประมาณ 0.1-1 M เปนเวลา 1-5 วน ขนอยกบระบบการเพาะเลยงและชนดของพช แต

น าตาลทมความเขมขนสงจะเปนพษตอพช (Wu et al., 2003)

ภาพท 5 ผลของระยะเวลาในการท า preculture บนอาหารสตร MS ทเตม 0.3 M ตออตราการรอด

ชวตและการพฒนาเปนตนใหมของเอมบรโอยางพาราทผานการลดความชนใน larminar flow เปน

เวลา 3 ชวโมง และแชในไนโตรเจนเหลว

Preculture time (Days)

Perc

enta

ge re

spon

se (%

)

Preculture time (Days)

22

2. ผลของวธการและระยะเวลาทเหมาะสมในการท า vitrification และ encapsulation-

vitrification

จากการศกษาวธการดงน าออกจากเอมบรโอยางพาราทผานการหม alginate และ

เอมบรโอยางพาราทไมผานการหม alginate ดวยวธ vitrification เมอน าเอมบรโอยางพาราทผาน

การปรบสภาพเซลลโดยการวางเลยงในอาหารสตร MS ทเตมซโครสทความเขมขน 0.3 M มาท าการ

แชในสาร loading solution โดยน าเอมบรโอแชในอาหารเหลวสตร MS ทเตมกลเซอรอล 2 M และ

น าตาลซโครส 0.4 M เปรยบเทยบระยะเวลาในการแชท 0, 20 และ 40 นาท ทอณหภม 0 องศา

เซลเซยส หลงจากนนน าเอมบรโอทผานการท า loading treatment ทระยะเวลาตางๆ มาแชใน

สารละลาย vitrification ไดแก PVS2 และ PVS3 ทอณหภม 0 องศาเซลเซยส เปรยบเทยบระยะเวลา

ในการแชท 0, 30, 60, 90 และ 120 นาท น าเอมบรโอทไดมาบรรจใน cryotube ท าการทดลอง

อยางนอย 3 ซ า ซ าละ 9 ชน แลวน าไปแชในไนโตรเจนเหลว น าเอมบรโอทผานการแชเยอกแขงมา

ละลายผลกน าแขงดวยการแชในน าอนในอางควบคมอณหภม 40 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 นาท เท

สารละลาย vitrification ทง แลวแชเอมบรโอในอาหารเหลวสตร MS ทเตมสารละลายซโครส 1.2 M

เปนเวลา 20 นาท และวางเลยงในอาหารสตร MS ทเตม kinetin 0.6-0.7 µM, NAA 1.0 µM, GA

1.4 µM และผงถาน 4 g/l ตรวจสอบเปอรเซนตการรอดชวต และการพฒนาไปเปนพชตนใหม ในการ

ทดลองครงแรกไดท า vitrification ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส พบวาเอมบรโอยางพาราสญเสย

ความมชวต เนองจากสาร PVS2 มคาโมลาลต (molarity) ทความเขมขน 7.8 M และมความเปนพษ

สง มผลท าใหชนสวนพชไดรบความเสยหายระหวางขนตอนการดงออก ในการทดลองสามารถลด

ระดบความเปนพษ โดยการลดเวลาในการแชในสารละลาย PVS2 (Mandal and Sharma, 2007)

และการดงน าออกท 0 องศาเซลเซยส แทนอณหภมหองจะชวยลดระดบความเปนพษของสารละลาย

ตอชนสวนพชในระหวางการเกดสภาพแกว (vitrification) และการเพมชวงเวลาในการแชสารปองกน

ความเยนจะท าใหสารละลายเขาไปภายในเซลลไดดยงขน (Sakai et al., 2000) ในการทดลองครงน

จงเลอกท า vitrification ท 0 องศาเซลเซยส

จากการศกษาระยะเวลาในการแชสาร loading solution ท 0, 20 และ 40 นาท และ

ศกษาระยะเวลาในการแชสาร PVS2 ทระยะเวลา 0, 30, 60, 90 และ 120 นาท พบวาระยะเวลาใน

การแชสาร loading solution ทเหมาะสมคอ 20 นาท และการแชสาร PVS2 ท 120 นาท ใหอตรา

การรอดชวตและความสามารถในการพฒนาเปนตนใหมสงสด 88.87% และ 66.33% ตามล าดบ

(ตารางท 2) ทสปดาหท 4 หลงการแชไนโตรเจนเหลว ซงสอดคลองกบการทดลองในพชลมลกหลาย

ชนดเชน วาซาบ (Matsumoto et al., 1994) เผอก (Takagi et al., 1997) กลวย กลวยไมและ

สบปะรด (Thinh, 1997) โดยสาร loading solution มผลอยางมากในการเกดความทนทานตอการ

23

สญเสยน า ในชวงอณหภมต า (Nishizawa et al., 1993) อยางไรกตามชวงการแชสาร loading

solution ทระยะเวลา 20 นาท สาร glycerol มโอกาสนอยทจะเขาไปยง cytosol เนองจากสาร

ซโครส ในสาร loading solution จะท าใหเกดการสะสมของสารปองกนอณหภมต าใน cytosol และ

ปองกนการเกด plasmolysis (Matsumoto et al., 1998) นอกจากนการแชชนสวนพชใน

สารละลาย PVS2 โดยตรงจะสงผลใหความดน osmotic เปลยนแปลงอยางรวดเรว และชนสวนพช

เกดการสญเสยน ามากเกนไป ท าใหชนสวนพชเกดภาวะแหง การใช loading solution (2 M

glycerol และ 0.4 M sucrose) แชชนสวนพชกอน สามารถท าใหชนสวนพชมความทนทานตอภาวะ

แหงได (Schoenweiss et al., 2005) โดยในระหวางการแชชนสวนพชใน loading solution เซลล

จะสญเสยน าเกด plasmolyse และเกดการแพรกระจายของ glycerol ใน cytosol ซงจะเพมความ

ทนทานตอการสญเสยน า โดยการเปลยนแปลงโครงสรางของเซลล และความเสถยรของเยอหมเซลล

การแชเนอเยอพชในสารละลายทมองคประกอบและความเขมขนเหมาะสม ซงเมอถกท าให

เยนลงอยางรวดเรวในไนโตรเจนเหลว สารละลายจะเปลยนสภาพจากของเหลวไปเปนแกว โดยไมเกด

ผลกน าแขง ทจะท าใหเซลลไดรบอนตราย โดยสาร vitrification solution ทนยมใชในพชคอ PVS2

และ PVS3 จากการศกษาเปรยบเทยบสาร vitrification 2 ชนด ไดแก PVS2 และ PVS3 (ภาพท 6-

8) พบวาการใชสารละลาย PVS2 ใหอตราการรอดชวตมากกวาการใชสารละลาย PVS3 โดยการแช

สารละลาย PVS2 ทอณหภม 0 องศาเซลเซยส เปนเวลา 120 นาทใหอตราการรอดชวตสงทสด คอ

88.87% รองลงมาคอ การแชสารละลาย PVS2 เปนเวลา 90 นาท และ 60 นาท ใหอตราการรอด

ชวต 66.67 และ 55.55% ตามล าดบ (ตารางท 2) สวนการแช PVS3 เปนเวลา 120 นาท ใหอตรา

การรอดชวตสงทสด คอ 33.33% รองลงมาคอ การแชสารละลาย PVS3 เปนเวลา 90 นาท ใหอตรา

การรอดชวต 22.22% (ตารางท 3) แตกตางจากการศกษาของ Sajini และคณะ (2011) เปรยบเทยบ

การท า vitrification โดยการใช PVS1, PVS2 และ PVS3 ในการเกบรกษาเอมบรโอมะพราว พบวา

การวางเลยงเอมบรโอมะพราวในอาหาร Y3 ทเตมน าตาลซโครส 0.6 M เปนเวลา 3 วน และแชใน

สารละลาย PVS3 เปนเวลา 16 ชวโมง หลงจากนนน าไปแชในไนโตรเจนเหลว แลวน าออกมาละลาย

อยางรวดเรว ใช unloading ในอาหารเหลวทเตมน าตาลซโครส 1.2 M เปนเวลา 1.5 ชวโมง ให

อตราการรอดชวต 70-80% ขนอยกบขนาดและน าหนกของเอมบรโอนน และมอตราการเจรญเปน

ตนทสมบรณ 20-25% สวนสาร PVS1 และ PVS2 ไมพบการรอดชวตของเอมบรโอมะพราว

24

ตารางท 2 ผลของระยะเวลาในการแชสาร loading solution และ PVS2 ตออตราการรอดชวต และ

การพฒนาเปนตนใหมของเอมบรโอยางพาราทไมหมวนอลจเนท หลงผานการแชไนโตรเจนเหลวเปน

เวลา 24 ชวโมง

PVS2

(mins)

Loading

solution

(mins)

LN+ LN-

Survival

rate (%)

Regrowth

(%)

Survival

rate (%)

Regrowth

(%)

0 0 0 0 100.00 100.00

20 0 0 93.33 93.33

40 0 0 90.00 90.00

30 0 0 0 96.67 96.67

20 0 0 93.33 93.33

40 0 0 93.33 93.33

60 0 0 0 96.67 93.33

20 55.55 33.37 96.67 96.67

40 0 0 93.33 90.00

90 0 0 0 96.67 96.67

20 66.67 53.33 93.33 90.00

40 0 0 90.00 90.00

120 0 0 0 96.67 96.67

20 88.87 66.33 96.67 93.33

40 0 0 90.00 90.00

25

ตารางท 3 ผลของระยะเวลาในการแชสาร loading solution และ PVS3 ตออตราการรอดชวต และ

การพฒนาเปนตนใหมของเอมบรโอยางพาราทไมหมวนอลจเนท หลงผานการแชไนโตรเจนเหลวเปน

เวลา 24 ชวโมง

PVS3

(mins)

Loading

solution

(mins)

LN+ LN-

Survival

rate (%)

Regrowth

(%)

Survival

rate (%)

Regrowth

(%)

0 0 0 0 100.00 100.00

20 0 0 93.33 93.33

40 0 0 90.00 90.00

30 0 0 0 96.67 96.67

20 0 0 83.33 83.33

40 0 0 83.33 83.33

60 0 0 0 86.67 83.33

20 0 0 86.67 86.67

40 0 0 83.33 80.00

90 0 0 0 80.00 80.00

20 23.33 16.67 83.33 80.00

40 0 0 80.00 80.00

120 0 0 0 86.67 86.67

20 33.33 30.00 86.67 86.67

40 0 0 83.33 80.00

26

ภาพท 6 การพฒนาของเอมบรโอยางพาราอาย 4 สปดาห ทผานการปรบสภาพโดยการท า

vitrification โดยแชใน loading solution เปนเวลา 20 นาท หลงจากนนจงแชในสารละลาย PVS2

ท 0, 30, 60, 90 และ 120 นาท และแชไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 24 ชวโมง

27

ภาพท 7 การพฒนาของเอมบรโอยางพาราอาย 4 สปดาห ทผานการปรบสภาพโดยการท า

vitrification โดยแชใน loading solution เปนเวลา 20 นาท หลงจากนนจงแชในสารละลาย PVS3

ท 0, 30, 60, 90 และ 120 นาท และแชไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 24 ชวโมง

28

จากการทดลองแสดงใหเหนวาสาร PVS2 มผลตออตราการรอดชวตของเอมบรโอยางพารา

ทผานการแชไนโตรเจนเหลวมากกวาไมแชสาร PVS2 โดยเอมบรโอยางพาราทไมแชสาร PVS2 ม

ลกษณะสขาวซด และสญเสยความมชวต (ภาพท 6) สาร PVS2 มสวนส าคญในการปองกนผลก

น าแขงในไนโตรเจนเหลว จากการมความเขมขนของซโครสสง มผลใหมการดงน าบางสวนออกจาก

เซลลแลวสารประกอบ PVS2 จะเขาไปแทนน าภายในเซลลพช และลอมรอบผนงเซลลพช ท าใหเมอ

อณหภมลดต าลงสารประกอบภายในกลายสภาพเปน vitrification ไมเกดผลกทมแทงเซลล แตสาร

PVS2 จะมความเปนพษตอเซลลทสภาพอณหภมปกต (Wolfe and Bryant, 1999) ดงนน เมอออก

จากการแชไนโตรเจนเหลว ตองท าการแชสาร unloading solution เพอดงสาร PVS2 ออกจากเซลล

ไมใหเกดอนตรายกบเซลลพช จากการทดลองพบวา เอมบรโอยางพาราสามารถมชวตอยได 3 สปดาห

แตการพฒนาเปนตนใหมเกดขนอยางชาๆ ดงนนอาจตองมการพฒนาเทคนคในการเกบรกษาหาสตร

อาหารทเหมาะสมหลงผานไนโตรเจนเหลว

สวนเทคนค encapsulation-vitrification เมอเปรยบเทยบกบ vitrification แลวไมพบการ

รอดชวตของเอมบรโอยางพารา (ตารางท 4-5) และคอนขางจะซบซอนในการท างานกวาเลกนอย แต

เปนวธการทเหมาะสมส าหรบชนสวนพช ทเปราะบางเพอใชอปกรณเสรมในการเคลอนยายชนสวน

แตทงนตองขนอยกบชนสวนพชและความเหมาะสมของงานดวย จากการทดลองพบวา เอมบรโอทไม

ผานการแชไนโตรเจนเหลว มอตราการรอดชวตอยในชวง 76.67-95.55% ทกชวงเวลาในการแชสาร

loading solution สงเกตไดจากเอมบรโอของยางพารามสขาวอมเหลอง มการขยายตวใหญขน

พรอมทจะพฒนาและเจรญเตบโต สวนเอมบรโอยางพาราทผานการหมดวยอลจเนทเมอผานการแช

ไนโตรเจนเหลวไมพบการรอดชวต ทกชวงเวลาในการแชสาร loading solution และทกระยะเวลา

การแชสาร PVS2 และ PVS3 โดยเอมบรโอจะมสขาวซดและกลายเปนสน าตาลในทสด อาจเปน

เพราะชวงเวลาในการแชสาร loading solution และ PVS2/PVS3 นอยเกนไป เนองจากตองผานชน

ของอลจเนท ท าใหสาร cryoprotectants ประเภทออกฤทธภายในเซลล ไดแก DMSO และ

glycerol ไมสามารถซมผานเขาไปภายในเซลล ท าใหการปองกนการยดตวของเซลลและปกปองการ

เปลยนแปลงของระบบเยอหมเซลลบกพรอง สวนสารประเภทออกฤทธภายนอกเซลล เชน น าตาล

ซโครสทใชดงน าออกจากเซลลมประสทธภาพลดลงท าใหน าภายในเซลลเปลยนเปนผลกน าแขงทม

แทงเซลลจนเสยหาย (Engelmann, 2000) ตางกบการท า vitrification โดยใชเอมบรโอยางพาราท

ไมหมอลจเนททยงพบเปอรเซนตความส าเรจในการเกบรกษาหลงผานการแชในไนโตรเจนเหลว ผล

การทดลองทไดแตกตางจากการทดลองของ (Tanaka et al., 2004) ศกษาเปรยบเทยบวธการเกบ

รกษา vitrification และ encapsulation-vitrification ในพช Gentian พบวาวธ encapsulation-

vitrification ใหผลความมชวตสงกวา และฟนคนสภาพเรวกวา โดยเทคนค vitrification ใหอตราการ

รอดชวต 49% สวนเทคนค encapsulation-vitrification ใหอตราการรอดชวต 73.7% โดยชวงเวลา

29

ในการแช PVS2 ทเหมาะสม มความส าคญตอการอตราการรอดชวต โดยเทคนค vitrification ม

ชวงเวลาทเหมาะสมในการแชสาร PVS2 ท 30-40 นาท สวนเทคนค encapsulation-vitrification

ตองใชเวลามากกวา โดยมชวงเวลาทเหมาะสมในการแชสาร PVS2 ท 100-140 นาท

ตารางท 4 ผลของระยะเวลาในการแชสาร loading solution และ PVS2 ตออตราการรอดชวต และ

การพฒนาเปนตนใหมของเอมบรโอยางพาราทหมวนอลจเนทหลงผานการแชไนโตรเจนเหลวเปนเวลา

24 ชวโมง

PVS2

(mins)

Loading

solution

(mins)

LN+ LN-

Survival

rate (%)

Regrowth

(%)

Survival

rate (%)

Regrowth

(%)

0 0 0 0 95.55 92.22

20 0 0 91.11 90.00

40 0 0 90.00 86.67

30 0 0 0 96.67 93.33

20 0 0 90.00 87.77

40 0 0 95.55 91.11

60 0 0 0 93.33 89.67

20 0 0 96.67 90.00

40 0 0 93.37 83.33

90 0 0 0 91.11 81.11

20 0 0 90.00 81.11

40 0 0 89.67 83.33

120 0 0 0 91.11 86.67

20 0 0 90.00 83.33

40 0 0 86.67 81.11

30

ตารางท 5 ผลระยะเวลาในการแชสาร loading solution และ PVS3 ตออตราการรอดชวต และการ

พฒนาเปนตนใหมของเอมบรโอยางพาราทหมวนอลจเนทหลงผานการแชไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 24

ชวโมง

PVS3

(mins)

Loading

solution

(mins)

LN+ LN-

Survival

rate (%)

Regrowth

(%)

Survival

rate (%)

Regrowth

(%)

0 0 0 0 93.33 93.33

20 0 0 91.37 86.67

40 0 0 92.22 86.67

30 0 0 0 91.11 86.67

20 0 0 93.33 83.33

40 0 0 90.00 83.33

60 0 0 0 93.33 89.67

20 0 0 89.67 81.11

40 0 0 83.33 80.00

90 0 0 0 90.00 86.67

20 0 0 86.67 81.11

40 0 0 86.67 80.00

120 0 0 0 89.67 86.67

20 0 0 86.67 83.33

40 0 0 80.00 76.67

31

ภาพท 8 เอมบรโอยางพาราทหมดวยวนอลจเนทอาย 3 สปดาห ทผานการท า vitrification โดยแช

ใน loading solution เปนเวลา 20 นาท หลงจากนนจงแชในสารละลาย PVS2 (A) และ PVS3 (B) ท

120 นาท และแชไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 24 ชวโมง

3. ผลของวธการและระยะเวลาทเหมาะสมในการท า dehydration และ encapsulation-

dehydration

จากการศกษาวธการลดความชนเอมบรโอยางพาราทผานการหมอลจเนท และเอมบรโอ

ยางพาราทไมผานการหมอลจเนท เมอน าเอมบรโอทผานการปรบสภาพเซลลโดยการวางเลยงใน

อาหารสตร MS ทเตมซโครสทความเขมขน 0.3 M มาท าการผงลมในตยายเลยงในสภาพปลอดเชอท

มลมเปาดวยความเรว 80-90 ฟตตอนาท ทระยะเวลาตางๆ ตงแต 0, 2, 3, 4 และ 5 ชวโมง

เปรยบเทยบกบการลดความชนในภาชนะปดทมซลกาเจล เพอลดปรมาณน าในเซลลทระยะเวลาตางๆ

ตงแต 0, 3, 5, 7 และ 9 ชวโมง บรรจชนสวนพชในอลมเนยมฟลอยลกอนท าการเกบรกษาในสภาวะ

ต ากวาจดเยอกแขงในไนโตรเจนเหลว จากการศกษาพบวา การท า dehydration ดวยการลด

ความชนโดยการวางเอมบรโอทหมดวยวนอลจเนทภายใต laminar air-flow เปนเวลา 4 ชวโมง แลว

น าไปแชในไนโตรเจน ใหอตราการรอดชวต และการพฒนาเปนตนใหมสงทสด คอ 37.50% และ

27.98% ตามล าดบ (ตารางท 6) และสามารถพฒนาเปนตนยางพาราทสมบรณได (ภาพท 9) สวน

การลดความชนดวยการวางเอมบรโอทไมหมวนอลจเนท ภายใต laminar air-flow เปนเวลา 3

ชวโมง แลวน าไปแชในไนโตรเจน ใหเปอรเซนตการรอดชวต และเปอรเซนตการพฒนาเปนตนใหมสง

ทสด คอ 80.72% และ 69.72% ตามล าดบ (ตารางท 7) และมการพฒนาเปนตนยางพาราทสมบรณ

A B

32

เชนเดยวกน (ภาพท 9) โดยความชนของเอมบรโอจะถกลดใหอยในระดบประมาณ 15% สวนการลด

ความชนดวยซลกาเจล ไมพบอตราการรอดชวต ซงเปนไปในทศทางเดยวกบการเปรยบเทยบวธลด

ความชนในเอมบรโอสม ดวยการวางภายใต laminar air-flow และการลดความชนดวยซลกาเจล

พบวา การลดความชนภายใต laminar air-flow ใหอตราการรอดชวตสงกวาการลดความชนดวยซล

กาเจล (Al Zoubi and Normah, 2012) จากการทดลองการท า encapsulation-dehydration ให

อตราการรอดชวตคอนขางต า เพยง 37.50% และการพฒนาเปนตนใหม 27.98% เมอเทยบกบ

เอมบรโอทไมหมวนอลจเนท ซงสอดคลองกบการศกษาของ Peran และคณะ (2006) ทท าการเกบ

รกษาเอมบรโอ Ekebergia capensis, Sparrm. ซงเปนเมลดจ าพวก recalcitrant พบวาการดงน า

ออกโดยวธ fast drying เปนเวลา 20 นาท ใหอตราการรอดชวต 80% เมอเทยบกบการน าเอมบรโอ

มาหมดวยวนอลจเนท แลวดงน าออกดวยวธเดยวกน แตตองใชเวลาถง 3 ชวโมง เพอดงน าออกใหอย

ในระดบเดยวกน แตหลงจากแชในไนโตรเจนเหลวแลวไมพบการรอดชวตของเอมบรโอเลย

เทคนคการท าใหแหงมขนตอนทงายมาก โดยการท าใหชนสวนพชแหงโดยการเปาลมดวย

laminar air-flow หรอใชซลกาเจลซงเทคนคนจะขนอยกบระดบความชนของชนสวนทเกบรกษา

ความชนเปนปจจยทส าคญตอการรอดชวต โดยทวไปความชนของชนสวนทเกบรกษาจะอยทประมาณ

10-20% ของน าหนกสด เชน การเกบรกษาเอมบรโอของขาวโพดดวยการลดความชนไดต ากวา 13%

กอนการแชในไนโตรเจนเหลว (Wen and Song, 2007) Lambardi และคณะ (2004) รายงานวา

เอมบรโอสมสามารถรอดชวตไดทระดบความชนนอยกวา 20% การศกษาการเกบรกษาปลายยอด

ของ Paeonia lactiflora พบวาสามารถเจรญเตบโตไดด โดยการผงลมใน laminar air-flow เปน

เวลา 5 ชวโมง (Seo et al., 2007) นอกจากน Wang และคณะ (2000) เปรยบเทยบผลระหวางการ

ใชซลกาเจลและการวางภายใตตยายเลยง เพอลดความชนปลายยอดขององน (Vitis vinifera) เพอ

เกบรกษาในไนโตรเจนเหลว พบวา อตราการรอดชวตขนอยกบปรมาณน าภายในเซลล ไมไดขนกบ

วธการทท าใหเนอเยอสญเสยน า โดยปรมาณน าทท าใหชนสวนพชรอดชวตในการเกบรกษาแบบ

encapsulation-dehydration คอตงแต 15-25% นอกจากน Kaviani (2010) ศกษาการท า

encapsulation-dehydration ในเอมบรโอของ Melia azedarach L. พบวา การลดความชนใน

ระดบทเหมาะสมทประมาณ 15-20% เปนปจจยส าคญทจะท าใหการเกบรกษาชนส วนใน

ไนโตรเจนเหลวประสบความส าเรจ

33

ตารางท 6 ผลของวธการลดความชนตออตราการรอดชวตและการพฒนาเปนตนใหมของเอมบรโอ

ยางพาราทหมวนอลจเนท (encapsulation-dehydration) หลงผานการแชไนโตรเจนเหลวเปนเวลา

24 ชวโมง

Dehydration method

Dehydration time (h)

Moisture content (%)

Survival rate (%)

Regrowth (%)

silica gel 0 62.50 0 0 3 33.00 0 0 6 19.12 0 0 9 15.74 0 0 12 12.32 0 0

air dying 0 62.32 0 0 2 35.03 12.32 7.08 3 25.12 27.05 16.85 4 15.54 37.50 27.98 5 12.05 32.03 15.05

ตารางท 7 ผลของวธการลดความชนตออตราการรอดชวตและการพฒนาเปนตนใหมของเอมบรโอ

ยางพาราทไมหมวนอลจเนท (dehydration) หลงผานการแชไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 24 ชวโมง

Dehydration method

Dehydration time (h)

Moisture content (%)

Survival rate (%)

Regrowth (%)

silica gel 0 62.50 0 0 3 28.17 0 0 6 17.05 0 0 9 12.75 0 0 12 11.05 0 0

air dying 0 62.32 0 0 2 25.23 33.03 7.08 3 15.32 80.72 69.72 4 13.25 67.50 57.05 5 12.05 60.05 42.37

34

ภาพท 9 การพฒนาเปนตนใหมของเอมบรโอยางพาราทหมวนอลจเนทและลดความชนภายใต

laminar air-flow เปนเวลา 4 ชวโมง หลงผานการแชไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 24 ชวโมง

35

ภาพท 10 การพฒนาเปนตนใหมของเอมบรโอยางพาราทไมหมวนอลจเนททผานการท า

dehydration ในระยะเวลาทตางกน ไดแก A: 0 ชวโมง, B: 2 ชวโมง, C: 3 ชวโมง, D: 4 ชวโมง และ

E: 5 ชวโมง

จากผลการศกษาเกยวกบการเกบรกษาชนสวนพชชนดตางๆ ในไนโตรเจนเหลว พบวาใหผล

การทดลองทแตกตางกนในแตละพชและชนสวนทใชในการทดลอง ดงนนจงมความจ าเปนทจะตอง

ท าการศกษาหาวธการทเหมาะสมทสดส าหรบพชทตองการเกบรกษา จากรายงานความส าเรจในการ

เกบรกษาเชอพนธกรรมพชแตละชนด พบวา โดยทวไปปจจยทสงเสรมความมชวตรอดหลงผาน

กระบวนการเกบรกษาในไนโตรเจนเหลว ประกอบดวย 1) ชนสวนทน ามาใช (ชนด ขนาด โครงสราง

และลกษณะทางกายภาพของชนสวน) โดยชนสวนทน ามาใชจะตองมขนาดเลก (Panis et al., 2005)

2) เทคนคทน ามาใชในการปรบสภาพชนสวนกอนการลดความชน เพอใหมความทนทานตอสภาพ

อณหภมต าเมอมการแชในไนโตรเจนเหลว เชน การทดลองของ ก าไล (2554) เปรยบเทยบการเกบ

A B

C D E

36

รกษาเอมบรโอหวายน าผง หวายก าพวน และหวายขไก ในไนโตรเจนเหลว ทง 3 วธการ คอ

vitrification, encapsulation-dehydration และ encapsulation-vitrification พบวา วธการ

vitrification และ encapsulation-vitrification ไมพบการรอดชวต โดยวธทเหมาะสมทสดในการ

เกบรกษาเอมบรโอหวายในไนโตรเจนเหลว คอ encapsulation-dehydration ท าไดโดยการปรบ

สภาพเอมบรโอดวยการท า preculture บนอาหาร MS ทเตมน าตาลซโครส 0.3 M เปนเวลา 7 วน ท

อณหภม 25 องศาเซลเซยส จากนนน าเอมบรโอมาท า encapsulation และแชใน loading

solution ในระยะเวลาตางๆ กน ตามดวยการลดความชนดวยซลกาเจลหนก 50 กรม/เอมบรโอ 20

ชน ในระยะเวลาตางๆ กน เพอลดปรมาณน าในเซลล แลวจงน าไปแชในไนโตรเจนเหลว ซงระยะเวลา

ในการแช loading solution การดงน าออกจากเซลลดวยซลกาเจลจะแตกตางออกไปตามชนดของ

เอมบรโอหวายทน ามาเกบรกษา นอกจากน Pornchuti และ Thammasiri (2008) ศกษาการเกบ

รกษากลวยไมเอองเงนแดง (Dendrobium cariniferum Rchb. F.) ในไนโตรเจนเหลวโดยวธ

encapsulation-vitrification และ encapsulation-dehydration พบวา เมอน าโพรโตคอรม มา

ผานกระบวนการ encapsulation-vitrification ดวยการแชเมลดเทยมในสารละลาย PVS2 เปนเวลา

0-180 นาท เปรยบเทยบกบการท า encapsulation-dehydration โดยวางเมลดเทยมในต laminar

air-flow นาน 0-5 ชวโมง แลวเกบในไนโตรเจนเหลวเปนเวลา 1 วน เมอน าออกมาละลายน าแขงและ

วางเลยงบนอาหารแขง พบวา วธ encapsulation-vitrification โดยการแชเมลดเทยม ใน PVS2

นาน 60 นาท ใหอตราการรอดชวตสงสด 80 เปอรเซนต เมอตรวจสอบดวย triphenyl tetrazolium

chloride (TTC) สวนวธ encapsulation-dehydration ไมพบการรอดชวต ในขณะท การศกษา

เทคนคการเกบรกษาชนสวนปลายยอดของ wild shih (Artemisia herba-alba Asso.) ดวยเทคนค

encapsulation-dehydration ใหอตราการรอดชวต 40% และ การพฒนาเปนตนใหม 6% หลงแช

ในไนโตรเจนเหลว โดยชนสวนปลายยอดดงกลาวผานการท า preculture ในอาหาร MS ทเตมซโครส

0.1 M เปนเวลา 3 วน ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส สวนเทคนค encapsulation-vitrification ดวย

การแช PVS2 เปนเวลา 30 นาท ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส ใหอตราการรอดชวต 68% และการ

พฒนาเปนตนใหม 12% โดยชนสวนปลายยอดผานการท า preculture ในอาหาร MS ทเตมซโครส

0.3 M เปนเวลา 7 วน ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส (Sharaf et al., 2011) นอกจากนการเกบรกษา

ปลายยอดราสเบอรร (Rubus idaeus L.) ดวยเทคนค encapsulation-vitrification ใหอตราการ

รอดชวต 85% และการพฒนาเปนตนใหม 75% มากกวาการใชเทคนค encapsulation-

dehydration ซงใหอตราการรอดชวต 65% และการพฒนาเปนตนใหม 50% (Wang et al., 2005)

การเกบรกษาปลายยอดแอปเปล (Malus X domestica Borkh.) ดวยเทคนค encapsulation-

dehydration ใหอตราการพฒนาเปนตนใหมสงถง 83.7% หลงแชในไนโตรเจนเหลว โดยชนสวน

ปลายยอดดงกลาวผานการท า preculture ในอาหาร MS ทเตมซโครส 0.75 M เปนเวลา 3 วน ท

37

อณหภม 25 องศาเซลเซยส และผานการท า dehydration ภายใต laminar air-flow เปนเวลา 6

ชวโมง สวนการท า encapsulation-vitrification ปลายยอดแอปเปลโดยใชสาร cryoprotective

mixture ซงประกอบดวย 180% (w/v) sucrose และ ethylene glycol 120% (w/v) ใหอตราการ

พฒนาเปนตนใหมสงถง 64-77% หลงแชในไนโตรเจนเหลว ทงนขนอยกบสายพนธแอปเปล (Paul et

al., 2000) ดงนนกญแจส าคญทจะท าใหการเกบรกษาชนสวนพชในไนโตรเจนเหลวประสบ

ความส าเรจ คอ การระมดระวงในกระบวนการปรบลดปรมาณน าใหเหมาะสม ในขณะเดยวกนตอง

ปองกนผลกระทบจากความเปนพษของสารและการเปลยนแปลงออสโมตกดวยในกรณของการท า

vitrification

ในการเกบรกษาเอมบรโอยางพาราในคร งน ถงแมวาวธการเกบรกษาดวยเทคนค

encapsulation-dehydration และ encapsulation-vitrification อาจใหผลการรอดชวตทต า

หรอไมรอดชวตเลย และไมสามารถชชดไดวาเกดจากปจจยหรอขนตอนใด ทงนเนองจากแตละปจจย

หรอแตละขนตอนมผลตอเนองกน ซงลวนสงผลตอความส าเรจในการเกบรกษาในไนโตรเจนเหลว

อยางไรกตามพบวา การเกบรกษาเอมบรโอยางพาราดวยวธ vitrification ใหอตราการรอดชวตทด ซง

เปนเทคนคทงาย ไมยงยากซบซอนเมอเปรยบเทยบกบเทคนค encapsulation-dehydration และ

encapsulation-vitrification นอกจากนยงพบวาในการทดลองจะตองคดเลอกใชเมลดยางพาราท

เพงตกใหม และท าการทดลองทนท เนองจากเมลดยางพาราสญเสยความงอกเรวมาก หากใชเมลดท

ตกมานานแลว เอมบรโอภายในทน ามาใชอาจสญเสยความมชวตตงแตเรมท าการทดลองท าใหผลการ

ทดลองผดพลาดได นอกจากนยงตองระวงในขนตอนการตดเอาเอมบรโอออกจากเมลด เนองจากอาจ

ท าใหเอมบรโอฉกขาด เมอน ามาวางเลยงบนอาหารเพอใหพฒนาเปนตนใหมอาจไดตนทไมสมบรณ

38

บทท 5

สรปและขอเสนอแนะ

การศกษาการเกบรกษาเอมบรโอยางพาราในไนโตรเจนเหลว (cryopreservation) ทง 4 วธ

คอ vitrification, encapsulation-vitrification, dehydration และ encapsulation-

dehydration พบวาวธทสามารถเกบรกษาเอมบรโอยางพาราไดด คอ vitrification และ

dehydration โดยการปรบสภาพเอมบรโอยางพาราดวยการท า preculture บนอาหาร MS ทเตม

น าตาลซโครส 0.3 M เปนเวลา 3 วน ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส

ส าหรบการท า vitrification ไดทดลองเปรยบเทยบระหวาง PVS2 และ PVS3 พบวาการใช

PVS2 ใหอตราการรอดชวตมากกวาการใช PVS3 และจากการศกษาระยะเวลาในการแชสาร loading

solution และ plant vitrification solution (PVS2/PSV3) พบวา การน าเอมบรโอมาผาน

กระบวนการ vitrification ดวยการแชใน loading solution เปนเวลา 20 นาท ตามดวยการแชสาร

PVS2 เปนเวลา 120 นาท ทอณหภม 0 องศาเซลเซยส แลวจงน าไปแชไนโตรเจนเหลว หลงจากนน

ละลายน าแขงโดยแชในอางควบคมอณหภม 40 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 นาท ลางชนสวนดวย

อาหารเหลว MS ทเตมซโครสความเขมขน 1.2 M เปนเวลา 20 นาท และวางเลยงในอาหาร MS ท

เตม kinetin 0.6-0.7 µM, NAA 1.0 µM, GA 1.4 µM และ ผงถาน 4 g/l ใหการรอดชวต และการ

พฒนาเปนตนใหมสงทสด คอ 88.87% และ 66.33% ตามล าดบ หลงจากวางเลยงเปนเวลา 1 เดอน

จากการสงเกตพบวาเอมบรโอทผานการท า vitrification จะมการพฒนาเปนตนใหมคอนขางชาเมอ

เปรยบเทยบกบการท า dehydration

ในสวนของการท า encapsulation-dehydration พบวาการลดความชนดวยการวาง

เอมบรโอทหมดวยอลจเนท ภายใต laminar air-flow เปนเวลา 4 ชวโมง แลวน าไปแชในไนโตรเจน

ใหการรอดชวต และการพฒนาเปนตนใหมสงทสด คอ 37.50% และ 27.98% ตามล าดบ สวนการลด

ความชนดวยการวางเอมบรโอทไมหมอลจเนทภายใต laminar air-flow เปนเวลา 3 ชวโมง แลว

น าไปแชในไนโตรเจน ใหการรอดชวต และการพฒนาเปนตนใหมสงทสด คอ 80.72% และ 69.72%

ตามล าดบ โดยความชนของเอมบรโอจะถกลดใหอยในระดบประมาณ 15% สวนการลดความชนดวย

ซลกาเจลไมพบอตราการรอดชวต

นอกจากนยงพบวาเมลดยางพาราทน ามาใชในการเตรยม เอมบรโอยางพารามผลตอ

เปอรเซนตการรอดชวต และเปอรเซนตการพฒนาเปนตนใหมอยางมาก ในการทดลองจะตองคดเลอก

เมลดทเพงตกใหม โดยสงเกตไดจากน าหนกของเมลด เนองจากเมลดทตกแลวเปนเวลานานจะสงผล

39

ใหเปอรเซนตการรอดชวต และเปอรเซนตการพฒนาเปนตนใหมลดลงอยางมาก ในการศกษาตอไป

ควรท าการศกษาในยางพาราพนธตางๆ เนองจากยางพาราในแตละพนธอาจใหผลส าเรจแตกตางกน

และอาจใชสารยบยงการเกดสารอนมลอสระ (antioxidant) ซงสารดงกลาวสามารถท าปฏกรยากบ

สารอนมลอสระไมใหเกดสารพษทเปนอนตรายตอเซลลได เชน วตามนซ หรอ สาร glutathione ซงม

ผลตอการยบยงการเกด acyl peroxides ในปฏกรยา lipid peroxides reaction บรเวณเยอหม

เซลล โดยมผลการทดลองการเกบรกษาในไนโตรเจนเหลว โดยใชสาร glutathione ในการลด

oxidative stress เรมแรกนยมใชในการเกบรกษาเชอพนธกรรมของสตว ตอมา Wang (2004)

ประสบความส าเรจในการใชสาร glutathione เกบรกษาในสภาพเยอกแขงปลายยอดของสม ดวยวธ

vitrification โดยคาเฉลยของการรอดชวต และการฟนคนสภาพ อยระดบท 83.9% และ 77.8% จง

อาจน าสารเคมดงกลาวมาใชในการพฒนาเทคนคการเกบรกษาชนสวนยางพาราในไนโตรเจนเหลว

ตอไป

40

เอกสารอางอง

ก าไล เรยนหตถกรรม. 2554. การศกษาเทคนคทเหมาะสมตอการเกบรกษาคพภะหวายในสภาพเยนยงยวด. วทยาศาสตรมหาบณฑต (วจยและพฒนาการเกษตร) สาขาวจยและพฒนาเกษตร คณะเกษตร ก าแพงแสน.

จรสศร นวลศร, อมรอเฮม ยด า, สายณห สดด และ รชนกร แกวจลกาญจน. 2557. การศกษาอทธพลของตนตอยางพาราพนธพนเมองทตานทานโรครากขาวกบกงตายางพนธด. รายงานวจยฉบบสมบรณ คณะทรพยากรธรรมชาต. มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

นวลทพย ชยลนฟา, เบญจา บ ารงเมอง และจระนนท ตาค า. 2553. การเกบรกษาเชอพนธกลวยไมเมองไทย. รายงานวจยฉบบสมบรณ คณะผลตกรรมการเกษตร. มหาวทยาลยแมโจ.

ทศน ขาวเนยม. การเกบรกษาพนธปาลมน ามนลกผสมเทเนอราในไนโตรเจนเหลว และการตรวจสอบความแปรปรวนทางพนธกรรม. วทยานพนธปรชญาดษฎบณฑต คณะทรพยากรธรรมชาต. มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

รงสฤษด กาวตะ. 2540. การเพาะเลยงเนอเยอพช : หลกการและเทคนค. ภาควชาพชไรนา คณะเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. กรงเทพฯ.

สมยศ มสข. 2541. การเกบรกษาเชอพนธกลวยไมไทยพนธแทบางชนดโดยเทคนคเมลดเทยม. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม.

แสงจนทร เอยมธรรมชาต. 2547. การเพาะเลยงเนอเยอพช. คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยเชยงใหม. เชยงใหม.

ส านกพฒนาเศรษฐกจและสงคมภาคตะวนออกเฉยงเหนอ. 2558. สถานการณยางพาราและการปรบตวของเกษตรกรในภาคตะวนออกเฉยงเหนอ. ส านกงานคณะกรรมการพฒนาการเศรษฐกจและสงคมแหงชาต.

อยทธ นสสภา, เสมอใจ ชนจตต. 2554. การประเมนความสญเสยทางเศรษฐกจจากโรครากขาวในยางพาราในพนทภาคใตของประเทศไทย. รายงานวจยฉบบสมบรณ คณะทรพยากรธรรมชาต. มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

อรณ มวงแกวงาม และ สมปอง เตชะโต. 2535. การเกบรกษาคพภะยางพาราในสภาพอณหภมต าในหลอดทดลอง. วารสารเกษตร. 8: 273-280.

อดม พลเกษ. 2541. ยางพารา. ใน พฤกษศาสตรพชเศรษฐกจ หนา 196-202. กรงเทพฯ: ส านกพมพมหาวทยาลยเกษตรศาสตร.

41

อารย วรญญวฒก. 2541. การเพาะเลยงเนอเยอเพอการปรบปรงพนธพช. กรงเทพฯ. โรงพมพอตสรรค. 133 หนา.

Al Zoubi, O. M. and Normah, M. N. 2012. Desiccation sensitivity and cryopreservation of excised embryonic axes of Citrus Suhuiensis cv. Limau Madu, Citrumelo [Citrus Paradisi Macf. x Poncirus trifoliata (l.) Raf.] and Fortunella polyandra. Cryoletters 33: 240-250.

Bajaj, Y. P. S. 1995. Cryopreservation of Plant Cell, Tissue and Organ Culture for the Conservation of Germplasm and Biodiversity. In: Cryopreservation of Plant Germplasm I. Springer. p. 3-28.

Bhojwani, S. S. and Razdan, M. K. 1996. Plant Tissue Culture: Theory and Practice. New York: Elsevier Science Publishing Company Inc.

Charoensub, R., Hirai, D. and Sakai, A. 2004. Cryopreservation of in vitro-grown shoot tips of cassava by encapsulation-vitrification method. Cryoletters 25: 51-58.

Cho, E. G., Hor, Y. L., Kim, H. H., Rao, V. R. and Engelmann, F. 2001. Cryopreservation of Citrus madurensis zygotic embryonic axes by vitrification: importance of pregrowth and preculture conditions. Cryoletters 22: 391-396.

Engelmann, F. 2000. Importance of Cryopreservation for the Conservation of Plant Genetic. In: Cryopreservation of Tropical Plant Germplasm: Current Progress and Applications. Rome: Japanese International Research Centre for Agricultural Sciences and IPGRI, IPGRI. p. 8-20.

Engelmann, F., Lartaud, M., Chabrillange, M. P., Carron, M. P. and Etienne, H. 1997. Cryopreservation of embryogenic calluses of two commercial clones of Hevea brasiliensis. Cryoletters 18: 107-116.

Fabre, J. and Dereuddre, J. 1990. Encapsulation-dehydration: a new approach to cryopreservation of Solanum shoot-tips. Cryoletters 11: 413-426.

Gonzalez-Arnao, M. T., Juarez, J., Ortega, C., Navarro, L. and Duran-Vila, N. 2003. Cryopreservation of ovules and somatic embryos of citrus using the encapsulation-dehydration technique. Cryoletters 24: 85-94.

Hirai, D. and Sakai, A. 2000. Cryopreservation of in vitro-grown meristems of potato (Solanum tuberosum l.) by Encapsulation-vitrification. In: Cryopreservation of tropical plant germplasm: current progress and applications Rome: Japanese International Research Centre for Agricultural Sciences and IPGRI, IPGRI. p. 205-211.

Ighere, A. D., Okere, A., Elizabeth, J., Mary, O., Olatunde, F. and Abiodun, S. 2011. In vitro culture of Hevea brasiliensis (rubber tree) embryo. Journal of Plant Breeding and Crop Science 9: 185-189.

42

Ishikawa, K., Harata, K., Mii, M., Sakai, A., Yoshimatsu, K. and Shimomura, K. 1997. Cryopreservation of zygotic embryos of a Japanese terrestrial orchid (Bletilla striata) by vitrification. Plant Cell Reports 16: 754-757.

Kartha, K. K. 1985. Meristem Culture and Germplasm Preservation. In: Cryopreservation of Plant Cell and Organs. Boca Raton, Florida: CRC Press. p. 115-134.

Kaviani, B. 2010. Cryopreservation by encapsulation-dehydration for long-term storage of some important germplasm: seed of Lily (Lilium ledebourii (Baker) Bioss.), embryonic axe of Persian lilac (Melia azedarach L.), and tea (Camellia sinensis L.). Plant Omics 3: 177-182.

Lambardi, M., De Carlo, A., Biricolti, S., Puglia, A. M., Lombardo, G., Siragusa, M. and De Pasquale, F. 2004. Zygotic and nucellar embryo survival following dehydration/cryopreservation of Citrus intact seeds. Cryoletters 25: 81-90.

Mandal, B. B. and Sharma, S. D. 2007. Cryopreservation of In vitro Shoot Tips of Dioscorea deltoidea Wall., an endangered medicinal plant: Effect of cryogenic procedure and storage duration. Cryoletters 28: 461-470.

Martinez, D., Tames, R. S. and Angeles Revilla, M. 1999. Cryopreservation of in vitro-grown shoot-tips of hop (Humulus lupulus L.) using encapsulation/dehydration. Plant Cell Reports 19: 59-63.

Matsumoto, T., Sakai, A. and Yamada, K. 1994. Cryopreservation of in vitro-grown apical meristems of wasabi (Wasabia japonica) by vitrification and subsequent high plant regeneration. Plant Cell Reports 13: 442-446.

Matsumoto, T., Sakai, A., Takahashi, C. and Yamada, K. 1995. Cryopreservation of in vitro grown apical meristems of wasabi (Wasabia japonica) by encapsulation-vitrification method. Cryoletters. 16: 189-196.

Matsumoto, T., Takahashi, C., Sakai, A. and Nako, Y. 1998. Cryopreservation of in vitro-grown apical meristems of hybrid statice by three different procedures. Scientia Horticulturae 76: 105-114.

Miao, N.-H., Kaneko, Y. and Sugawara, Y. 2005. Ultrastructural implications of pretreatment for successful cryopreservation of oncidium protocorm-like body. Cryoletters 26: 333-340.

Nishizawa, S., Sakai, A., Amano, Y. and Matsuzawa, T. 1993. Cryopreservation of asparagus (Asparagus officinalis L.) embryogenic suspension cells and subsequent plant regeneration by vitrification. Plant Science 91: 67-73.

Normah, M. N. and Chin, H. F. 1995. Cryopreservation of Germplasm of Rubber (Hevea brasiliensis). In: Cryopreservation of Plant Germplasm I. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg. p. 180-190.

43

Panis, B., Piette, B. and Swennen, R. 2005. Droplet vitrification of apical meristems: a cryopreservation protocol applicable to all Musaceae. Plant Science 168: 45-55.

Panis, B., Totte, N., Van Nimmen, K., Withers, L. A. and Swennen, R. 1996. Cryopreservation of banana (Musa spp.) meristem cultures after preculture on sucrose. Plant Science 121: 95-106.

Paul, H., Daigny, G. and Sangwan-Norreel, B. S. 2000. Cryopreservation of apple (Malus x domestica Borkh.) shoot tips following encapsulation-dehydration or encapsulation-vitrification. Plant Cell Reports 19: 768-774.

Peran, R., Berjak, P., Pammenter, N. W. and Kioko, J. I. 2006. Cryopreservation, encapsulation and promotion of shoot production of embryonic axes of a recalcitrant species Ekebergia capensis, Sparrm. Cryoletters 27: 5-16.

Phunchindawan, M., Hirata, K., Sakai, A. and Miyamoto, K. 1997. Cryopreservation of encapsulated shoot primordia induced in horseradish (Armoracia rusticana) hairy root cultures. Plant Cell Reports 16: 469-473.

Pinker, I., Halmagyi, A. and Olbricht, K. 2009. Effects of sucrose preculture on cryopreservation by droplet-vitrification of strawberry cultivars and morphological stability of cryopreserved plants. Cryoletters 30: 202-211.

Pornchuti, W. and Thammasiri, K. Cryopreservation of protocorms of Dendrobium cariniferum Rchb. F. Proceedings of the Acta Horticulturae; 2008: International Society for Horticultural Science (ISHS), Leuven, Belgium.

Reed, B. M., DeNoma, J. and Chang, Y. 2000. Application of cryopreservation protocols at a clonal genebank. In: Cryopreservation of tropical plant germplasm: current progress and applications. Rome: Japanese International Research Centre for Agricultural Sciences and IPGRI, IPGRI. p. 246-249.

Sajini, K. K., Karun, A., Amarnath, C. H. and Engelmann, F. 2011. Cryopreservation of coconut (Cocos Nucifera L.) zygotic embryos by vitrification. Cryoletters 32: 317-328.

Sakai, A. 2000. Development of cryopreservation technology. In: Cryopreservation of tropical plant germplasm: Current progress and applications. Rome: Japanese International Research Centre for Agricultural Sciences and IPGRI, IPGRI. p. 1-7.

Sakai, A., Kobayashi, S. and Oiyama, I. 1990. Cryopreservation of nucellar cells of navel orange (Citrus sinensis Osb. var. brasiliensis Tanaka) by vitrification. Plant Cell Reports 9: 30-33.

Sakai, A., Matsumoto, T., Hirai, D. and Niino, T. 2000. Newly developed encapsulation-dehydration protocol for plant cryopreservation. Cryoletters 21: 53-62.

Sam, Y. Y. 1999. Cryopreservation of rubber (Hevea brasiliensis) zygotic embryos using vitrification technique. Putra Malaysia University.

44

Schoenweiss, K., Meier-Dinkel, A. and Grotha, R. 2005. Comparison of cryopreservation techniques for long-term storage of ash (fraxinus excelsior L.). Cryoletters 26: 201-212.

Seo, M. J., Shin, J. H. and Sohn, J. K. 2007. Cryopreservation of dormant herbaceous peony (Paeonia lactiflora Pall.) shoot-tips by desiccation. Cryoletters 28: 207-213.

Sharaf, S. A., Shibli, R. A., Kasrawi, M. A. and Baghdadi, S. H. 2011. Cryopreservation of wild Shih (Artemisia herba-alba Asso.) shoot-tips by encapsulation-dehydration and encapsulation-vitrification. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 108: 437-444.

Souza, A. C., Paiva, R., Silva, L. C., Gallo, C. M., Santos, P. A. A., Pinto, M. C. C. and Paiva, P. D. O. Dehydration and cryopreservation of Haddroanthus serratifolius embryos. Proceedings of the Acta Horticulturae; 2014: International Society for Horticultural Science (ISHS), Leuven, Belgium.

Takagi, H. 2000. Recent development in cryopreservation of shoot apices of tropical species. In: Cryopreservation of Tropical Plant Germplasm: Current Progress and Applications. Rome: Japanese International Research Centre for Agricultural Sciences and IPGRI, IPGRI. p. 178-193.

Takagi, H., Tien Thinh, N., Islam, O. M., Senboku, T. and Sakai, A. 1997. Cryopreservation of in vitro-grown shoot tips of taro (Colocasia esculenta (L.) Schott) by vitrification. 1. Investigation of basic conditions of the vitrification procedure. Plant Cell Reports 16: 594-599.

Tanaka, D., Niino, T., Isuzugawa, K., Hikage, T. and Uemura, M. 2004. Cryopreservation of shoot apices of in-vitro grown gentian plants: Comparison of vitrification and encapsulation-vitrification Protocols. Cryoletters 25: 167-176.

Thinh, N. T. 1997. Cryopreservation of Germplasm of Vegetatively Propagated Tropical Monocots by Vitrification. Kobe University.

Tsukazaki, H., Mii, M., Tokuhara, K. and Ishikawa, K. 2000. Cryopreservation of Doritaenopsis suspension culture by vitrification. Plant Cell Reports 19: 1160-1164.

Uragami, A., Sakai, A. and Nagai, M. 1990. Cryopreservation of dried axillary buds from plantlets of Asparagus officinalis L. grown in vitro. Plant Cell Reports 9: 328-331.

Wang, Q., Tanne, E., Arav, A. and Gafny, R. 2000. Cryopreservation of in vitro-grown shoot tips of grapevine by encapsulation-dehydration. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 63: 41-46.

Wang, Z-C. and Deng, X-X. 2004. Cryopreservation of shoot-tips of Citrus using vitrification: effect of reduced form of glutathione. Cryoletters 25: 43-50.

45

Wang, Q., Laamanen, J., Uosukainen, M. and Valkonen, J. P. T. 2005. Cryopreservation of in vitro-grown shoot tips of raspberry (Rubus idaeus L.) by encapsulation-vitrification and encapsulation-dehydration. Plant Cell Reports 24: 280-288.

Wen, B. and Song, S. 2007. Acquisition of cryotolerance in maize embryos during seed development. Cryoletters 28: 109-118.

Wolfe, J. and Bryant, G. 1999. Freezing, drying, and/or vitrification of membrane-solute-water systems. Cryobiology 39: 103-129.

Wu, Y. J., Huang, X. L., Xiao, J. N., Li, X. J., Zhou, M. D. and Engelmann, F. 2003. Cryopreservation of mango (Mangifera indica L.) embryogenic cultures. Cryoletters 24: 303-314.

Yap, L. V., Hor, Y. L. and Normah, M. N. 1998. Effect of sucrose preculture and subsequent desiccation on cryopreservation of alginate-encapsulated Hevea brasiliensis embryo. Proceedings of the IUFRO Seed Symposium 1998 "Recalcitrant seeds" Proceeding of the Conference; 1998 12-15 October 1998; Kuala Lumpur, Malaysia.

Yap, L. V., Noor, N. M., Clyde, M. M. and Chin, H. F. 2011. Cryopreservation of Garcinia Cowa shoot tips by vitrification: the effects of sucrose preculture and loading treatment on ultrastructural changes in meristematic cells. Cryoletters 32: 188-196.

Zhou, Q. N., Sun, A. H., Li, Z., Hua, Y. W., Jiang, Z. H., Huang, T. D., Dai, X. M. and Huang, H. S. 2012. Cryopreservation and plant regeneration of anther callus in Hevea by vitrification. African Journal of Biotechnology 11: 7212-7217.

46

ภาคผนวก

ตารางภาคผนวกท 1 องคประกอบของอาหารสงเคราะหสตร Murashige and Skoog (1962)

Stock สารเคม ปรมาณสารทใช (มลลกรมตอลตร)

Stock1

NH4NO3 1,650

KNO3 1,900

CaCl2.2H2O 440

MgSo4.7H2O 370

KH2PO4 170

Stock 2

H3BO3 6.2

MnSO4.4H2O 22.3

ZnSO4.7H2O 1.093

KI 0.83

Na2.MoO4.2H2O 0.25

CuSO4.5H2O 0.025

CoCl2.6H2O 0.025

Stock 3 Na2-EDTA 37.25

FeSO4.7H2O 27.85

Stock 4

Glycine 2

Nicotinic acid 0.5

Pyridoxine-HCl 0.5

Thiamine-HCl 0.1

Myoinocitol 100

47

วธการเตรยมสารละลาย cryopreservation

1. อาหารสตร MS (Stock1, 2, 3, 4) Sucrose 0.3 M 51.34 กรม

2. Plant Vitrification Solution Formula 2 (PVS2) Glycerol 30% (w/v) Ethylene glycol 15% (w/v) Dimethyl sulphoxide (DMSO) 15% (w/v) Sucrose 0.4 M pH 5.7 ปรบปรมาตรดวย MS basal medium (Stock 1, 2, 3)

3. Plant Vitrification Solution Formula 3 (PVS3) Glycerol 50% Sucrose 50% pH 5.7 ปรบปรมาตรดวย MS basal medium (Stock 1, 2, 3)

4. Loading Solution (LS) ปรมาตร 100 มลลลตร Glycerol 1 M Sucrose 0.8 M pH 5.7 ปรบปรมาตรดวย MS basal medium (Stock 1, 2, 3)

5. 3% Na-alginate ปรมาตร 100 มลลลตร Na-alginate 3%(v/w) Sucrose 0.4 M Ca-free MS basal medium (Stock 1-No CaCl2, 2, 3) pH 5.7

48

6. 0.1M CaCl2 ปรมาตร 100 มลลลตร MS basal medium Sucrose 0.4 M 13.69 กรม CaCl2 0.1 M 1.47 กรม pH 5.7

7. Unloading solution Sucrose 1.2 M pH 5.7 ปรบปรมาตรดวย MS basal medium (Stock 1, 2, 3)