Andrea Baccarelli, MD, PhD, MPHLaboratory of Environmental Epigenetics

Mitochondrial Genetics and Epigenetics

Powerful ideas for a healthier world

Novel paths linking air pollution and human disease

Mitochondrial DNA (mtDNA)

• Extranuclear genome– not part of the genetic code in the nucleus of your cells

• Small DNA molecule– 16,569 bp

• 37 genes– 13 for proteins (phosphorilationenzymes)[N.B., all other proteins coded in nuclear DNA]

– 22 for tRNAs– 2 for rRNAs (12S, 16S)

7

Unique characteristics of mtDNA

• All the mtDNA in your body came from your mother (sperm has almost no mitochondria)

• Oxidative damage 5 to 10 times higher than nuclear DNA:– direct exposure to endogenous ROS – lacks protective histones – diminished DNA repair capacity

• Damaged mitochondria burn fat and other energy substrates more inefficiently:– less energy– more ROS

Presentation Outline

investigating environmental mitochondriomics

Mitochondrial damage &dysfunction

MitochondrialEpigenetics

Mitochondria & 

Environmental Disease

Mitochondrialdamage & dysfunction

mitochondrial DNA copy number as an environmental biosensor

High copy number of mtDNA genomes

• Hundreds to thousands mitochondria per cell

• 2‐10 mtDNA copies per mitochodrion

Mitochondrial damage and copy number

Exposure

Oxidative stressmtDNA damage

Mitochondrial number increases

Increased ROS 

production

Damage to nuclear DNA, RNA, proteins, 

and lipids 

Air Pollution – health effects & sources

• Epidemiology investigations:– air pollution exposure is associated with increased hospitalization and early death

– Both acute and long‐term effects on cardiorespiratory disease, lung cancer, neurological effects

• Traffic is primary source – traced by air benzene, black carbon 

• Proxidant exposure• Exposed individuals → high levels of oxida ve markers

Italy benzene multicity studymedian personal air benzene, by city and exposure group

0

20

40

60

80

100

120

140

Genoa Milan Cagliari

P<0.001

P<0.001

P<0.001

Carugno et al., Environ Health Perspect 2012

Med

ian air b

enzene

 (µg/m

3 )

Relative mtDNA copy number (RmtDNAcn) analysis

• qPCR analysis on 384‐well plate format:– Mitochondrial gene (Mt reaction)– Single copy nuclear gene (S reaction)– Mt/S ration reflects MtDNAcn

• Relative mtDNAcn– To avoid plate effects, MtDNAcn is calculated as relative difference to a standard DNA (run in each plate)

– E.g. RmtDNAcn=1.24: the sample’s mtDNAcn is 24% longer than the standard DNA

– CVs of 3‐5% on duplicate samples run on different days• Key features

– Easy to measure– Reflects both damage and dysfunction

City Group N RMtDNAcn (Unadjusted) RMtDNAcn (Adjusted*)

Mean (95% CI) p Mean (95% CI) p

Genoa Referents 48 0.75 (0.65‐0.86) 0.75 (0.66‐0.85)

Bus Drivers 151 0.90 (0.84‐0.97) 0.013 0.90 (0.84‐0.97) 0.019

Milan Referents 56 0.76 (0.68‐0.84) 0.75 (0.69‐0.82)

Police Officers 77 1.14 (1.07‐1.22) <0.001 1.10 (1.01‐1.19) <0.001

Gas Attendants 76 0.86 (0.79‐0.94) 0.037 0.90 (0.83‐0.98) 0.005

Cagliari Distant 10 0.94 (0.59‐1.48) 0.90 (0.60‐1.41)

Close 47 1.24 (1.01‐1.52) 0.215 1.25 (1.03‐1.51) 0.206

Petrochemical 24 1.64 (1.30‐2.07) 0.024  1.63 (1.22‐2.18) 0.041 *Geometric mean adjusted for age, sex, smoking habit, number of cigarettes/day

Blood RmtDNAcn, by city and exposure group

Carugno et al., Environ Health Perspect 2012

Blood RmtDNAcn vs. personal air benzene by city and in all subjects

Carugno et al., Environ Health Perspect 2012

Mitochondrial epigenetics

mtDNA methylation as environmental target

Environmental exposures on nuclear DNA methylation Results from our lab• Air pollution (PM, foundry PM)

– Baccarelli, AJRCCM 2009;  – Tarantini, EHP 2009; – Dioni, EHP 2010; – Madrigano, EHP 2011; – Hou, Part Fibre Tox 2011; – Bind, Epidemiol 2012; – Madrigano, AJE 2012– Sofer, Epigenomics, in press

• Metals– Wright, EHP 2010; – Kile, EHP 2012; – Lambrou, Epidemiology 2012– Byun, Part Fibre Tox, in press– Guo, under review – Seow, in preparation

• Benzene– Bollati, Cancer Res 2007; – Seow, WH PlosONE 2012; – Fustinoni, Med Lav 2012

• PAHs– Pavanello, Int J Cancer 2009; – Pavanello, Carcinogenesis 2010; – Peluso, Int J Epidemiol; – Alegria, Torres Chemosphere 2012

• POPs and Pesticides– Rusiecki, EHP 2008; – Zhang, Environ Mol Mutagen 2012; – Zhang, Environ Tox Pharmacol 2012;– Villahur, in preparation.

• Phsychosocial stress– Bollati, Chronobiol Int 2010; – Rusiecki, Epigenomics 2012

• Smoking and allergens– Sordillo, Int Arch Aller Immun 2012– Wan, Hum Mol Gen 2012– Baccarelli, Epigenomics 2012

Epigenetics of mitochondria

• Methylation of mtDNA has been widely overlooked– total absence of methylation reported in 1973 (Dawid et al, Science)

– subsequent reports showed low methylation levels• Schock et al., PNAS 2010

– previous studies underestimated the level of cytosine modification in the mtDNA. 

– DNMT1 translocates to the mitochondria• driven by a mitochondrial targeting sequence immediately upstream of the commonly accepted translational start site. 

– mitochondrial DNMT1 • is upregulated in response to hypoxia • affects mtDNA gene expression

mtDNA methylation in foundry workers

• Foundry workers are exposed to metal‐rich air particles (PM)

• mtDNA methylation analysis of a sequence ajdjacent two genes key to mitochondrial protein translation– MT‐RNR1 : protein that facilitates formation of RNA secondary structures, assembly of the mitochondrial ribosome, and mitochondrial translation 

– MT‐TF gene: a mitochondrion‐specific transfer RNA• Blood DNA from 20 foundry workers with high PM exposure vs. 20 controls

CpG sites in mtDNA

The outer ring (in black)shows the relative position of each of the 435 predicted CpGs

Chinnery et al, Int J Epidemiol 2012

MT-

TF &

MT-

RN

R1

Met

hyla

tion

(%) P=0.002

Controls(n=20)

High-exposed steel workers

(n=20)

mtDNA methylationin steel workers exposed to metal‐rich air particles (PM1)

Byun et al, under review

MT-

TF &

MT-

RN

R1

% M

ethy

latio

n

0.5

Log (PM1 exposure level)1.0 1.5 2.0 2.5

1

0

-1

-2

mtDNA methylationmodeled dose‐response with PM1

Byun et al, under review

Change in

 MT‐TF & M

T‐RN

R1 

Methylatio

n (%

)

P=0.02 for linear effect

mtDNAcn copy number and mtDNA methylation

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0

Rel

ativ

e m

itoch

ondr

ial c

opy

num

ber

MT-TF & MT-RNR1 % Methylation

r=0.36P=0.02

Byun et al, under review

mitochondria & environmental disease

Mitochondrial haplogroup clusters and cognitive aging

Air pollution and age‐related cognitive decline

• >10% of individuals >65 years and 50% of those ≥85 years have some form of cognitive impairment

• Environmental exposures that augment systemic oxidative stress have been shown to hasten cognitive aging by as much as 5 years– PM from vehicular traffic associated with lower mini–mental state examination (MMSE) in the Normative Aging Study (Powers, EHP 2012)

– Results consistent with data from the NHANES (Chen, Neurotoxicology 2009), China (Zheng AJPH 2010) and Germany (Rantf Environ Res 2008)

• Rare mitochondrial DNA mutations/deletion produce neurocognitive phenotypes

Air pollution, age related cognitive lossand mitochondria in the NAS

• The Normative Aging Study– ongoing longitudinal cohort study of ~700 elderly men– followed up every 3‐5 years from 1996 to date– mean age 73 years (range 55‐100)

• Haplogroups measured for most of the individuas.

• Exposure to Black Carbon– a tracer of particulate air pollution from traffic– validated spatio‐temporal land‐use regression model– 1‐year average the participant’s address prior to the date of the first cognitive assessment

31

Super‐haplogroup clusters in the Normative Aging Study (n=616)

Haplotypes N %

Cluster 1 (J or T) 111 18.0haplogroup J 52 8.4haplogroup T 59 9.6

Cluster 2 (H or V) 314 51.0haplogroup H 53 8.6haplogroup V 261 42.4

Cluster 3 (K or U) 126 20.5haplogroup K 60 9.7haplogroup U 66 10.7

Cluster 4 (I, W or X) 65 10.6haplogroup I 32 5.2haplogroup W 10 1.6haplogroup X 23 3.7

Cluster 1

Cluster 2

Cluster 3

Cluster 4

Clusters of haplogroups created using phylogenetic network and evolutionary tree

AD

Fronto‐temporal degeneration

Mini‐mental state examination (MMSE)

Category Possible points Description

Orientation to time 5 From broadest to most narrow. Orientation to time has been 

correlated with future decline.Orientation to 

place 5 From broadest to most narrow. This is sometimes narrowed down to streets, and sometimes to floor.

Registration 3 Repeating named prompts

Attention and calculation 5

Serial sevens, or spelling "world" backwards It has been suggested that serial sevens may be more appropriate in a 

population where English is not the first language.Recall 3 Registration recall

Language 2 Naming a pencil and a watchRepetition 1 Speaking back a phraseComplex commands 6 Varies. Can involve drawing figure shown.

• 30‐point questionnaire test of cognitive function• Commonly used to screen for dementia.• Score<25 → low MMSE

Estimated Risk of low MMSE due to traffic PM

0.5

1

2

4

Cluster 1 Cluster 2 Cluster 3 Cluster 4

Odd

s Ra

tio

Colicino et al., in preparation

P=0.01 for interaction between exposure and clusters

Adjusted for education,  alcohol, physical activity, diabetes, dark fish consumption, computer experience, first language, non‐white census tract percentage, college degree census tract percentage, first cognitive assessment, part time residents.

Risk for a doubling in 1‐yr black carbon at baseline

Summary

• Effects of air pollution exposure on:– mtDNA copy number– mtDNA methylation– nDNA methylation of genes encoding for mitochondrial proteins

• Age‐related cognitive loss– Hastened by traffic related air pollution– Stronger effects in superhaplogroup clusters 1 & 4

• Questions and future directions– Relevance of mtDNA copy numbers and mtDNA/nDNA 

methylation to human disease?– Relationships with mtDNA haplogroups?– Need for longitudinal prospective studies linking past 

exposures→mtDNA markers →phenotypes

Acknowledgments

Harvard Environmental Epigenetics lab• Andrea Riganti• Cheng Peng• Elena Colicino• Francesco Nordio• Giulia Giuliano• Katy Monaco• Jia Zhong• Jitendra Barupal• Juan Carmona• Ivan Pantic• Hyang‐Min Byun• Liqiong Guo• Maria Chiara Frisardi• Marco Guerra Sanchez• Nadia Villahur• Rodos Rodostensis• Octavio Jimenez Garza• Valeria Motta

Normative Aging Study Team• Melinda Power• Marc Weisskopf• Lifang Hou• Neil Sondheimer• Avron Spiro• Pantel Vokonas• Joel Schwartz

Multicity Benzene Study• Michele Carugno• Angela Pesatori• Silvia Fustinoni• Pierluigi Cocco• Franco Merlo

Additional funding from the NIH Epigenomics Roadmap, NIEHS, NINR, NHLBI, HSPH‐NIEHS center, and Harvard Catalyst.

NIEHS R01 ES021733Molecular and Epigenetic Mitochondriomics of Air Particles, Lead and Cognition

Environmental Epigenetics Lab

abaccare@hsph.harvard.edu