Strana1

ÚVOD Rutinní práce v mikrobiologické laboratoři je často podceňována. Nejenže

nejsou respektovány specifické nároky při vybavování mikrobiologického pracoviště,

ale dochází i k tomu, že vedoucí pracovníci nejsou dostatečně vyškoleni a nejsou

dodržovány předepsané zásady bezpečnosti práce. Tato fakta pak vedou k celé řadě

nedostatků, které mohou snižovat serioznost výsledků. Při práci s patogenními

mikroorganismy může dojít i k potencionálnímu zdravotnímu riziku.

Z těchto důvodů je nutné klást vysoké požadavky na dodržování pracovní kázně

a pracovního řádu a řídit se následujícími pravidly bezpečnosti práce.

PRAVIDLA PRÁCE V MIKROBIOLOGICKÉ LABORATOŘI : 1. Vstup do mikrobiologické laboratoře je dovolen pouze osobám, které tam

pracují. Svrchní oděv je nutné před vstupem do laboratoře odložit do skříněk na chodbě a převléknout se do čistého laboratorního pláště. Pracovní plášť je určen výhradně k práci v mikrobiologické laboratoři a není dovoleno ho používat mimo předem určené prostory.

2. V laboratoři není dovoleno jíst, pít a kouřit. 3. Je nutné zvýšenou měrou dodržovat bezpečnost práce a hygienu, neboť se

pracuje s podmíněně pathogenními a pathogenními mikroorganismy. Po ukončení práce se musí ruce důkladně umýt mýdlem, popř. vydezinfikovat 0,1% roztokem Ajatinu.

4. Pracovní stůl se musí před i po práci vydezinfikovat 0,1% roztokem Ajatinu

nebo jiným účinným dezinfekčním prostředkem (70% ethanol). Během práce nesmí být na pracovním stole nesterilní předměty a je nutné udržovat maximální pořádek. Prostory a ovzduší v laboratoři je třeba desinfikovat UV zářením. Provádí se v nočních hodinách po odchodu pracovníků z pracoviště a po důkladném mechanickém ošetření, omytí a chemické desinfekci.

5. Každý úraz a zranění je nutno ihned hlásit asistentovi. I nejmenší oděrky

musí být pečlivě vydezinfikovány a ošetřeny, neboť hrozí infekce rány.

Strana2

6. Dostane-li se při práci infekční materiál do úst, je nutno ústa důkladně vypláchnout a vykloktat 1% roztokem KMnO4 nebo zředěným Lugolovým

roztokem. 7. Dostane-li se infekční materiál do oka , musí se oko ihned vypláchnout

borovou vodou. 8. Kontaminovanou pokožku nebo předmět (pracovní stůl, oděv) je nutné ihned

otřít 0,1% roztokem Ajatinu. 9. Po ukončení pokusů před likvidací a mytím nádobí musí být mikrobiální

kultury ve zkumavkách, Petriho miskách a ostatních kultivačních nádobách usmrceny autoklávováním nejméně 30. minut při 121oC. V žádném případě se nesmí kultury bez předešlého usmrcení vylévat do vodovodní výlevky nebo jiného odpadu.

10. Rozbité sklo se odkládá pouze do určené nádoby. Je-li znečištěno

mikrobiální kulturou musí se nejdříve vydezinfikovat ponořením do dezinfekčního prostředku za použití pinzety nebo kleští. Střepy se nikdy nesmějí sbírat rukou.

11. Před odchodem z laboratoře je nutno uklidit pracovní stůl i pomocné

prostory, uložit potřebné kultury do chladničky, očistit objektivy mikroskopu a uschovat jej na příslušné místo, zkontrolovat, zda jsou uzavřeny plynové a vodovodní kohoutky a vypnuty všechny elektrické spotřebiče kromě nepřetržitě pracujících termostatů, třepaček a chladniček.

Strana3

1. PRINCIPY MIKROBIOLOGICKÉ PRÁCE

Práce v mikrobiologické laboratoři se musí stejně tak jako v laboratoři chemické

řídit pravidly ”Správné laboratorní praxe (SLP)”. Tato skutečnost je obzvláště důležitá

v dnešní době zavedením mezinárodních norem ISO a norem platných v EU.

Mikrobiologická práce musí vždy vycházet z vědomí, že:

a) v prostředí kolem nás se vyskytuje velké množství mikroorganismů, které mohou

znečistit a tím úplně znehodnotit používané mikrobiální kultury nebo živné půdy

nebo úplně zkreslit výsledky mikrobiologických analýz,

b) že některé z používaných kultur nebo kolonií, jež vyrostly při rozboru

potravinářských surovin jsou podmíněně patogenní nebo dokonce patogenní, takže

bychom neopatrnou prací s nimi mohli ohrozit své zdraví i zdraví svých

spolupracovníků. Základním požadavkem při všech mikrobiologických postupech je

to tzv. aseptická práce, spočívající v tom, že zabraňuje rozptýlení buněk z kultur do

prostředí a vniknutí mikroorganismů z prostředí do kultur do prostředí a vniknutí

mikroorganismů z prostředí do kultur nebo živných půd, což by vedlo k rychlému

pomnožení těchto ”cizích” mikroorganismů.

Proto je nutno pracovat se sterilními pomůckami a pokud možno ve sterilním tj.

vydezinfikovaném prostředí, a to co nejrychleji, třeba i na úkor objemové nebo

hmotností přesnosti.

Je třeba mít na paměti, že pracujeme s živými objekty, které potřebují určitou

dobu k pomnožení, avšak velmi rychle stárnou a poměrně snadno podléhají genetickým

změnám. Všechny tyto skutečnosti kladou velké nároky na plánování pokusů a

organizaci práce, udržování kultur v živém stavu, jejich kontrolu z hlediska čistoty a

stability genetických i fyziologických vlastností.

Většina používaných postupů vyžaduje určitou zručnost a zkušenost, a proto je

třeba je opakovat několikrát než se dosáhne žádaného výsledku. Ovšem i při

uspokojivém výsledku je vhodné pokus opakovat, aby se zjistilo, že původní výsledek

nebyl dosažen náhodně.

Strana4

V každém výzkumu jsou velmi důležité kontrolní pokusy, a to jak pozitivní

kontrola, která nám ukazuje, jak má příslušná reakce probíhat a zda použité živné půdy,

činidla i pracovní postup jsou správné, tak i negativní kontrola, která je mezí, podle níž

hodnotíme pozitivní reakci. Někdy lze pro negativní kontrolu použít nezaočkovanou

živnou půdu, avšak přesnější a v některých případech nezbytné je provést celý postup

s mikroorganismem, který poskytuje negativní reakci.

Jelikož pracujeme s živým materiálem, který poměrně snadno podléhá změnám,

ať už v důsledku stárnutí, genetických změn a jejich selekce nebo znečištění cizími

mikroorganismy, musíme při neuspokojivém výsledku pozitivní kontroly hledat příčinu

nejen v chybně připravených půdách nebo činidlech, v chybné kultivaci nebo

pracovním postupu, ale také ve vlastnostech použitého kmene. Z těchto důvodů také

kontrolujeme identitu a čistotu všech používaných kultur, a to jak makroskopicky, tak i

mikroskopicky a pomocí biochemických testů. O čistotě a současně i homogenitě

kultury se přesvědčujeme použitím některé z isolačních metod a testováním

jednotlivých kolonií. Přitom je nutné, aby každý student prováděl všechny pokusy sám

a získal jistotu, že příslušnou metodiku dobře zvládl, nikoliv tedy aby si preparáty a jiné

částečné výsledky vyměňoval s kolegy.

1.1 Plánování mikrobiologické práce, její organizace, vedení protokolů

Mikrobiologická práce je časově velmi náročná, vzhledem k tomu, že již

v přípravě pokusů je nutné vysterilovat všechny potřebné pomůcky včetně živných půd

a fermentačních medií, časově zdlouhavé může být i oživování a testování použitých

mikroorganismů spojené s jejich kultivací. Jelikož mikrobiální buňky používané

v pokusu musí být většinou určitého stáří (8h, 24h, 48h), je třeba věnovat velkou

pozornost přesnému naplánování průběhu celé práce včetně přípravných prací, nasazení

pokusu a jeho další zpracování. Během laboratoří plánují pracovní program a přípravu

pomůcek vyučující, takže studenti včas dostávají vhodný materiál a pomůcky.

Při plánování pokusu si experimentátor musí dobře uvědomit účel a cíl pokusu a

všechna úskalí, která by mohla zkreslit vyhodnocení. Musí se seznámit se současným

stavem problematiky prostudováním literatury, získat a otestovat biologický materiál,

vyzkoušet si vhodnost a přesnost potřebných analytických metod. Teprve poté může

přistoupit k podrobnému rozpisu pokusu včetně přípravných prací a naplánovat vše

Strana5

podle jednotlivých dnů. Při plánování práce je vždy nutné počítat s určitou rezervou

živných půd a sterilních pomůcek, aby rozbití nebo rozlití jediné nádoby nezabránilo

v úspěšném pokračování práce. Jestliže začínáme pracovat na nové problematice,

plánujeme první pokus poměrně jednoduchý, neboť při něm bychom měli především

zjistit, zda celý pokus lze našimi prostředky úspěšně zvládnout. Teprve poté, když

metodika pokusu je dobře propracována, lze plánovat komplikovaný pokus, sledující

různé varianty a sledující seriovou práci, jež je vždy ekonomičtější než individuální

stanovení. Při všech pokusech nesmíme zapomínat na vhodné kontroly a na dostatečné

opakování pokusů, pokud je to možné, také na jejich statistické vyhodnocení.

O pokusu a všech analysách, které jsou prováděny vedeme stručný, ale

přehledný protokol, kde vedle účelu a cíle práce je uveden rozpis pokusu, použitý

materiál a jeho původ (u mikroorganismů se vedle názvu druhu uvádí také označení

kmene a jeho zdroj), stáří kultury, medium na němž byl mikroorganismus pěstován,

způsob kultivace (povrchový, submerzní, za třepání, nebo staticky atd.), složení a

postup přípravy roztoků, činidel, a půd, údaje o kultivačních podmínkách (teplota, pH,

doba) i průběh pokusů včetně případných drobných závad, abnormalit a jiných

podrobností. U každého protokolu musí být uvedeno datum, je-li to nutné i hodina

provedení daného měření. Každý pokus je vyhodnocen graficky nebo tabulkou, u

mikroskopických prací i obrázkem. Na závěr je ukončen diskusí výsledků a závěrem,

který hodnotí dosažené výsledky i použité metody a případně uvádí náměty pro

ověřovací a rozšiřující pokusy. Celý protokol musí být veden tak, že popsaný pokus

může být kdykoli kýmkoli přesně zopakován. Současně dobře zapsaný pokus by měl

experimentátorovi umožnit zjistit, kde eventuelně došlo k chybě při realizaci plánu

(např. chybná navážka, chyba v přípravě půdy apod.). Z tohoto důvodu jsou pro

experimentátora důležité protokoly z nezdařených nebo nedokončených pokusů.

1.2 Získávání mikrobiálních kultur

Každé mikrobiologické pracoviště, ať už jde o pracoviště pedagogické,

výzkumné, analytické nebo technologické, má obyčejně menší pracovní sbírku

mikroorganismů, v níž udržuje používané případně i srovnávací kmeny.

Kromě toho existují větší sbírky mikroorganismů, které jsou organizovány

z hlediska průmyslových, zemědělských, zdravotnických nebo vědeckých potřeb,

mikroorganismů a zasílají je na objednávku žadatelů. Protože udržování a kontrola

Strana6

čistoty eventuelně stabilita vlastností mikrobiálních kultur jsou poměrně nákladné,

účtují sbírky za každý dodaný kmen určitý poplatek.

Největší sbírkou mikroorganismů v České republice je sbírka mikroorganismů

v Brně (zkratka CCM – Czech Collection of Microorganisms), která řádově obsahuje

několik tisíc kmenů bakterií a stovek kmenů plísní. Ročně rozesílá řadu z nich do

tuzemska i zahraničí. Tímto způsobem sbírka získává i určité prostředky pro

objednávání kmenů ze zahraničních sbírek. Z potravinářského hlediska je důležitá

sbírka mléčných kultur mlékárenského průmyslu, umístěná ve výzkumném a

vývojovém závodě v Praze 6, která udržuje kolem 800 mikrobiálních kmenů, většinou

bakterií.

1.3 Zařízení, přístrojové vybavení a pracovní pomůcky na mikrobiologickém pracovišti

Jak již bylo uvedeno, práce v mikrobiologické laboratoři se v mnoha aspektech

značně liší od práce v běžné chemické laboratoři. Tyto rozdíly vyplývají hlavně z toho,

že mikrobiolog pracuje s živými organismy a jejich požadavkům musí podřídit nejen

metodiku, ale i vybavení laboratoře. V mikrobiologické laboratoři proto používáme

některé méně běžné pomůcky.

Laboratorní nábytek musí vyhovovat charakteru práce v mikrobiologické

laboratoři a požadavkům časté desinfekce.

Přístroje určené pro mikrobiologické pracoviště slouží výhradně pro provádění

mikrobiologických rozborů :

Mikroskop – Patří do základního vybavení každé mokrobiologické laboratoře.

Tím, že umožňuje studovat předměty pouhým okem neviditelné, stává se nezbytnou

pomůckou při studiu morfologie mikroorganismů. Podrobně viz mikrobiologické

metody.

Chladnička – Slouží k uchovávání vzorků určených k rozboru, sterilních

kultivačních medií v kultivačních nádobách, nebo kultur mikroorganismů. Chladnička

by měla spolehlivě udržovat teplotu v rozmezí 1-4oC a neměla by být užívána k jiným

než výše uvedenmým účelům. Je též výhodné pokud kultury mikroorganismů a čistá

kultivační media jsou uchovávány oděleně, ve dvou odělených chladničkách.

Mrazící box - Přístroj se používá k uchovávání lyofilizovaných kultur

mikroorganismů (-20oC), skladování některých antibiotik (složky speciálních medií),

Strana7

enzymů (restrikční enzymy), mikrobiálních, zásobních kultur v glycerolu (-80oC) a

některých chemikálií.

Očkovací box - Očkování provádíme v očkovacích boxech (tzv. laminární box

nebo flow-box). Tato zařízení jsou vybavena filtry, které umožňují sterilaci vzduchu, jež

laminárně proudí uvnitř zařízení, a tím je zajištěno sterilní prostředí uvnitř očkovacího

boxu. Pracovník může do vnitřního prostoru vsunovat pouze ruce, jinak je od vnitřní,

sterilní části zařízení oddělen sklem. Toto sklo nejen zabraňuje kontaminaci jež by

mohla přijít zvenčí, současně však chrání pracovníka např. před případným vdechnutím

mikroorganismů s nimiž pracuje. Laminární box je vybaven přívodem plynu, vody,

elektřiny měl by být vybaven i germicidní zářivkou.

Inkubátory - Tato zařízení se používají pro kultivaci mikroorganismů při

konkrétních teplotách odpovídajících optimální teplotě růstu, v případě rozborů při

teplotách daných příslušnou normou. Tato zařízení jsou vybavena termostaty, u nichž je

možné teplotu regulovat. Nejvýhodnější jsou inkubátory vodní, méně pak inkubátoey

teplovzdušné, které neudrží nastavenou teplotu při krátkodobých výpadcích elektrické

energie.

Vodní lázeň – Především slouží k provádění pasterizace vzorků pro stanovení

sporulujících mikroorganismů, ve zvláštních případech k rozvařování ztuhlých

kultivačních medií nebo nových medií, které obsahují složky, jež není možno sterilovat

v autoklávu.

Homogenizátor- Toto zařízení se používá při přípravě vzorků s jinou než

tekutou konzistencí, pro rozmělnění vzorků tuhé konzistence před jejich očkováním

případně zřeďováním. V zásadě existují dva typy homogenizátorů, rotační a

peristaltický. Rotační homogenizátor musí být vybaven skleněnými nebo kovovými

uzavíratelnými nádobkami, které snesou sterilaci. Součástí poeristaltického

homogenizátoru jsou sterilní sáčky, v nichž je vzorek homogenizován ve zřeďovacím

roztoku. Obecně platí, že velikost sáčku by měla být dvojnásobná oproti objemu vzorku.

Použití homogenizátoru je upraveno ČSN ISO 6887 (56 0102).

Vývěva – Používá se pro membránovou filtraci. Nejvýhodnější je olejová,

pokud ta není k dispozici, lze použít i vodní.

UV lampa – Toto zařízení se obecně používá k různým účelům.

K vyhodnocování fluorescence se užívají UV lampy o vlnové délce 360 nm. Při

mutačních pokusech, kdy jsou suspenze mikroorganismů ozařovány po určitou dobu

Strana8

UV světlem z určité vzdálenosti. Výsledkem je získání čistých kmenů s odlišným

genotypem a fenotypem.

UV (germicidní) lampa se používá ke sterilaci kontaminovaného prostředí,

nebo obecně prostor a ploch mikrobiologického pracoviště, kde se pracuje

s mikroorganismy, a k likvidaci aerosolů. Tento způsob sterilace prostředí se užívá

v noci, v případě nepřítomnosti pracovníků. Nejvyšší účinnosti je dosaženo při 200-280

nm, optimum je 260 nm. Komerčně vyráběné germicidní lampy emitují UV záření o

vlnové délce 253,7 nm a nelze je zaměňovat s UV lampami užívanými k vyhodnocování

fluorescence (360nm).

Váhy – Pro větší navážky se používají váhy s přesností minimálně 0,1 g a

možností navážky do 200 g. Na navážky nižší než 2 g se používají analytické váhy

s citlivostí 0,1 mg a navážkou do 10 g.

pH metr – slouží ke stanovení pH kultivačních medií a roztoků. Vhodné jsou pH

metry schopné měřit s přesností 0,1 pH jednotky.

Odstředivka – je přístroj, který patří k základnímu vybavení mikrobiologické

laboratoře, přestože většina metod mikrobiologického rozboru toto zařízení nevyžaduje.

Je určena k separaci suspendovaných částic hmoty v kapalině, nebo oddělení

mikrobiálních buněk od kultivačního media. Odstředivka je v současnosti též hodně

využívána u metod molekulární biologie (isolace plasmidové, chromosomální DNA).

Třepačka – je přístroj používaný pro kultivaci mikroorganismů, při inkubaci

některých roztoků a suspenzí, přípravě vzorků určených k rozboru. Pohyb je

horizontální, krouživý, a u většiny třepaček lze regulovat rychlost i poloměr otáček.

V současné době se vyrábí i termostatované modely (vodní i se vzdušnou atmosferou)

s možností regulace teploty. Některé uzavřené přístroje jsou vybaveny i umělým

osvětlením.

Laboratorní sklo

Mikrobiologické sklo se liší od chemického nejen tvarem nádob, ale i jakostí.

Základním požadavkem je odolnost vůči vysokým teplotám, kterých se používá při

horkovzdušné sterilaci. Sklo sloužící k déle trvajícímu uskladňování živných půd má

být I. hydrolytické třídy, tzn. vodě dokonale odolné sklo, u kterého nedochází

k vyluhování chemikálií do media během skladování.

Kultivační nádoby

Mikrobiologické zkumavky - mají na rozdíl od chemických silnější stěny a

rovné okraje. Užívají se pro tekuté, ztužené i tuhé půdy při kultivaci, udržování kultur a

Strana9

biochemických testech. Zkumavky uzavíráme zátkami z obyčejné nebo buničité vaty,

druhá je mnohem levnější, a proto jí dáváme přednost. Zátky musí zasahovat dvěma

třetinami své délky dovnitř zkumavky a musí být dostatečně pevné, aby zabránily

přístupu kontaminující mikroflory. Příliš tvrdé zátky jsou však během sterilace nebo

vývoje plynu vytlačovány. Postup výroby zátek je znázorněn na obr. 1. Místo vatových

zátek se též používají hliníkové uzávěry, nebo patentní kovové zátky.

Vedle skleněných zkumavek se používají i umělohmotné zkumavky na jedno použití,

které výrobce dodává již sterilní v zatavených polyethylenových sáčcích. Tyto

zkumavky však nejsou odolné vůči vysokým teplotám. Jejich použití je výhodné,

protože šetří čas a energii obzvláště v servisních mikrobiologických laboratořích, kde se

provádí velké množství rozborů denně.

Baňky – používají se většinou kónické (Erlenmayerovy) nebo obyčejné varné.

Zátkujeme je podobně jako zkumavky. Používají se hlavně k přípravě živných půd a

kultivace v tekutých půdách. Dříve se často používaly speciální kultivační baňky se

zabroušenou skleněnou čepičkou na ochranu vatové zátky před zvlhnutím (obr. xxx) a

popřípadě ještě s očko-vacím tubusem (obr. xxx). Pro získání většího povrchu substrátu

se používaly Fernbachovy baňky (s tubusem a bez tubusu) a Houleovy baňky apod.

(obr. xxx).

Misky – používají se pro ztužené půdy nebo sklíčkové kultury. Nejběžnější jsou

Petriho misky o průměru 50 mm, 90 mm, 100 mm. Misky s děleným dnem jsou vhodné

pro současné použití různých substrátů a pro společné pěstování aerobů a anaerobů.

Vedle skleněných misek se stejně jako v případě zkumavek používají misky z umělé

hmoty na jedno použití, které výrobce dodává již sterilní v zatavených

polyethylenových sáčcích.

Plynovky − Pro sledování vývoje plynu (např. zkvašování cukru kvasinkami) se

používají Durhamovy plynovky (obr. xxx), což jsou malé zkumavky vkládané dnem

vzhůru do bakteriologických zkumavek.

Mikroskopická sklíčka − K přípravě preparátů používáme podložní sklíčka

velikosti cca 76 mm x 26 mm a krycí sklíčka velikosti 20 x 20 mm o tloušťce 0,16 nebo

0,17 mm. Čistá sklíčka uchováváme v Petriho miskách, použitá je nutné vkládat ihned

do kyselého alkoholu (ethanol + 3% HCl) nebo do 95% ethanolu, aby nezaschla a

neslepila se. Nová podložní a krycí sklíčka dáváme na několik hodin do alkoholu s

3%HCl, oplachujeme nejdříve vodovodní, poté destilovanou vodou, osušíme filtračním

papírem a vyleštíme suchým hadříkem.

Strana10

Použitá sklíčka shromažďujeme v kyselém alkoholu, tuk odstraňujeme xylenem

nebo chromsírovou kyselinou. Po několikerém opláchnutí je vkládáme na několik hodin

do 50% alkoholu. Další postup je stejný jako u nových. Čistotu sklíček zkoušíme

kapkou destilované vody, která musí tvořit souvislý film.

Podložní sklíčka − K přípravě visutých kapek a vlhkých komůrek používáme

podložní sklíčka s kruhovou prohloubeninou uprostřed. Vlhké komůrky jsou vhodné

k přímému pozorování vzniku pseudomycelia u kvasinkových mikroorganismů.

Thomova nebo Bürkerova komůrka − Slouží k počítání mikroorganismů.

Pipety - Pro pipetování roztoků nebo sterilních kultivačních medií používáme

stejně jako v chemické laboratoři dělené pipety. Nové skleněné pipety vkládáme do

oxidační směsi (chromsírová kyselin), aby se zbavily mastnoty. Po vyjmutí ze směsi je

pipety nutné řádně omýt vodou. Pro odměřování medií obsahujících mikroorganismy

se podle SLP (správná laboratorní praxe), jejíž pravidla jsou zavedena do nových norem

pro práci v mikrobiologické laboratoři, se nesmí používat pipetování ústy. Z tohoto

důvodu se pro dávkování a odměřování různých objemů používají sterilní odměrné

válce, nebo v případě malých objemů mikropipety s vyměňovatelnými sterilními

špičkami na jedno použití, které jsou vyrobeny z umělé hmoty. Tyto špičky jsou buď

výrobcem dodávány nesterilní nebo ve speciálních krabičkách již sterilní. Nesterilní

špičky lze sterilovat autoklávováním, nikoli suchým teplem v hor-kovzdušném

sterilátoru.

Nádobky na barviva a jiné kapaliny – Jde o běžné indikátorové lahvičky

s kapátky. Pro alkoholické vzorky se doporučuje kapátka uzavřít gumičkou, aby barviva

neměnila vysycháním koncentraci. Pro imerzní olej a xylen používáme lahvičky se

zátkami s tyčinkou.

Použité skleněné nádobí (i s kulturou) je nutné nejdříve autoklávovat (1/2

hodiny při přetlaku 0,1 Mpa), potom ještě za horka obsah nádob vylít a mýt obvyklým

způsobem. Polyethylenové nádobí na jedno použití se i s obsahem vkládá do speciálních

pytlů z umělé hmoty, které jsou odolné vůči vysokým teplotám v autoklávu. Celý pytel i

s obsahem se po zautoklávování odnáší do předem vyhrazeného odpadu.

Preparační a očkovací pomůcky − Pro očkování a přípravu preparátů

používáme očkovací jehly chromniklové, zřídka platinové (obr. xxx), o průměru očka

cca 2 mm. Pro čárkování je vhodné očko odchýlit asi o 30o od přímého směru. Dále se

používají tvrdé ocelové preparační jehly (obr. xx), tyčinky, pinzety, lancety (obr.x),

Strana11

skalpely. Pasteurova pipeta (obr. xx) je do kapiláry vytažená trubička, uzavřená na

širším konci vatou.

Sterilizační zařízení

Autokláv – Jedná se o speciální zařízení, v němž při zahřívání dochází ke

vzniku zvýšeného tlaku páry, a tak k přehřátí vnitřního prostoru na vyšší teplotu než

100oC. Většinou se užívá tlak 0,1 Mpa, kterému odpovídá teplota 121oC. Autokláv

musí být vybaven regulačním zařízením pro regulaci teploty i doby sterilace. Běžně

slouží pro mikrobiologické účely, k bezpečné sterilaci většiny kultivačních medií a

roztoků, některých umělohmotných pomůcek (kyvety, špičky, mikrozkumavky atd.) a

k likvidaci jakéhokoli infikovaného nebo kontaminovaného materiálu. Pro sterilaci

čistých medií a pomůcek by měl být určen jiný autokláv než je užíván pro likvidaci.

Autoklávy se nepoužívají ke sterilaci skleněného nádobí. Použití Papinova hrnce je

nevhodné, vzhledem k tomu, že v tlakovém hrnci lze dosáhnout přetlaku pouze 0,05

MPa, což odpovídá teplotě 112oC.

V dnešní době jsou autoklávy vybaveny tak, že lze nastavit i režim sterilace

v proudící páře při teplotě maximálně 100oC. Tento způsob se používá pro

frakcionovanou sterilaci látek choulostivých na teplotu a medií, které tyto látky

obsahují. Toto vybavení nahrazuje tzv. Kochův parní hrnec.

Horkovzdušný sterilizátor – Existuje mnoho typů horkovzdušných

sterilizátorů, které udržují teplotu 160-180oC po dobu 1 až 3 hodin (počínaje dobou,

kdy teplota dosáhla 160oC). Kromě teploty lze regulovat většinou i dobu sterilace a

registrovat teplotu. Horkovzdušné sterilizátory se výhradně používají ke sterilaci

laboratorního skla a některých pomůcek.

Sterilizační filtry – Používají se pro sterilaci čirých kapalin, které nesnášejí

zahřívání. Je to buď asbestocelulosový filtr (tzv.Seitzův filtr), nebo nyní častěji

membránový filtr, který má velikost pórů 0,1-0,2 μ, případně 0,3-0,5 μm. Pro

laboratorní mikrobiální filtraci se také používají skleněné sintrové kelímky nebo nuče

(např. kelímek G5).

1.4 Popis mikroskopu

Mikroskop se skládá z mechanické a optické části :

1.4.1 Mechanická část mikroskopu

Strana12

Mechanickou část tvoří stativ (noha mikroskopu), tubus a stolek. Noha mikroskopu je spojena s nosičem kloubem, který umožňuje tubus naklánět. Na nosiči jsou dále umístěny 2 šrouby – makrometrický a mikrometrický. Tyto šrouby umožňují hrubý a jemný posuv tubusu ve směru optické osy mikroskopu, a tím plynulé zaostřování pozorovaného objektu. Tubus udržuje optické systémy mikroskopu (okulár, objektiv) v konstantní vzdálenosti. Na spodním konci tubusu je umístěn objektiv a shora je zasunut okulár. Vzdálenost mezi horním a dolním okrajem tubusu je mechanická délka tubusu. Tato délka bývá obvykle 160 mm nebo 170 mm. Optická délka tubusu, což je vzdálenost ohnisek okuláru a objektivu, se mění podle použitých okulárů a objektivů. Okuláry se vyměňují prostým vyjmutím a zasunutím, bez dalšího upevňování. Pro rychlou výměnu objektivů slouží tzv. revolverový měnič, umístěný na tubusu. Výměna se provádí otáčením nosného kotouče, ve kterém jsou jednotlivé objektivy našroubovány. Preparát, který se pokládá na stolek mikroskopu se přichycuje pérovými svorkami nebo křížovým vodičem preparátu. Stolky bez křížového vodiče jsou obyčejně otáčivé a kromě toho posuvné.

1.4.2 Optická část mikroskopu

Optická část se skládá ze dvou soustav čoček, jež vytváří obraz předmětu

(objektiv, okulár) a z osvětlovacího zařízení. Objektiv vytváří obraz objektu reálný,

převrácený a zvětšený. Tento obraz je zvětšen okulárem tak, aby detaily zobrazené

objektivem bylo možno pozorovat okem. To jaké detaily je objektiv schopen rozlišit, je

dáno hodnotou jeho tzv. numerické apertury A :

A = n . sin α Kde n = index lomu prostředí mezi čelní čočkou objektivu a preparátu

sin α = polovina otvorového úhlu objektivu (tj. úhlu mezi optickou osou a

krajními paprsky vcházejícími do objektivu).

Na numerické apertuře A a vlnové délce použitého světla λ závisí rozlišovací schopnost objektivu a : a = λ/A a = nejmenší rozměr struktury, který lze rozlišit (rozlišovací schopnost mikroskopu)

λ= vlnová délka použitého světla

Při konstantní vlnové délce pro bílé světlo (500-550 nm) lze dosáhnout

maximální rozlišovací schopnost tím, že použijeme objektiv s vysokou numerickou

aperturou. Toto čísloje na na objektivu vyraženo pod číslem udávajícím lineární

zvětšení. Protože otvorový úhel může mít pouze hodnoty nižší než 180o , maximální

dosažitelná hodnota sin α je kolem 0,95. Index lomu vzduchu je přibližně roven 1.

Strana13

V tomto případě může numerická apertura nabývat pouze hodnot od 0 – 1. Vyšších

hodnot lze dosáhnout změnou prostředí mezi preparátem a objektivem. Mluvíme o tzv.

imerzních objektivech, z nichž nejpoužívanější jsou olejové imerze, kde mezi preparát a

čelní čočku objektivu kápneme cedrový olej, který má index lomu přibližně stejný jako

sklo (n=1,33). Znamená to, že paprsky procházejí opticky homogenním prostředím,

nelámou se a vstupuje jich do objektivu více než u ostatních tzv. suchých objektivů.

Nejlepší imerzní objektivy mají n = 1,3 – 1,4.

Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu dosahuje hodnot kolem 2×10-7m.

Celkové zvětšení mikroskopu vypočteme, násobímeli zvětšení objektivu zvětšením

okuláru. Toto celkové zvětšení je nutné stanovit předem, aby nedošlo k překročení

užitečného zvětšení . To je omezeno numerickou aperturou tak, že dosahuje jejího 500 –

1000 násobku. Z toho vyplývá, že že u objektivu s A – 0,65 může být celkové zvětšení

mikroskopu 325 až 650 násobné. Větší zvětšení je bezvýznmané, a proto je nazýváme

prázdným. Nedává žádné další detaily.

Osvětlovací zařízení se skládá ze zrcátka a kondenzoru, jenž je na spodu opatřen

irisovou clonnkou. Zrcátko má jednu stranu plochou a druhou vypouklou. Ploché

zrcátko se nastavuje při použití objektivů s malým zvětšením (do 45×), u všech

ostatních je nutno pracovat s vydutým zrcátkem. Kondenzor je optická soustava čoček

s velkou aperturou A= 1,2-1,4, jejímž úkolem je soustředit širší svazek světelných

paprsků odražených zrcátkem na pozorovaný preparát. Irisovou clonkou kondenzoru je

možné regulovat míru osvětlení preparátu a tím současně měnit numerickou aperturu

kondenzoru. Kondenzor je umístěn pod mikroskopickým stolkem a je posunovatelný ve

svislém směru. Jako zdroje světla používáme elektrické lampy pro mikroskopování, u

novějších mikroskopů je světlo umístěné přímo v noze stativu.

1.4.3 Základní postup při mikroskopování

1. Mikroskop se drží vždy za stativ.

2. Do revolverového měniče se našroubuje objektiv od nejslabšího do nejsilnějšího po

směru hodinových ručiček. Do tubusu se vsune okulár střední síly (10×). Zrcátko se

nastaví tak, aby celé zorné pole bylo osvětleno.

3. Preparát se umístí na mikroskopický stolek tak, aby ležel v optické ose mikroskopu.

4. Otáčením makrometrického šroubu se pomalu snižuje objektiv ke krycímu sklíčku a

ze strany se pozuruje vzdálenost, aby objektiv nenarazil do sklíčka a nepoškodila se

Strana14

čelní čočka. Osvětlení se upraví pomocí zrcátka, clony a svislého posuvu

kondenzoru.

5. Makrošroubem se tubus pomalu zdvihá tak dlouho, dokud se hledaný obraz neobjeví

v zorném poli. Doostří se mikrometrickým šroubem a preparát se nastaví do středu

zorného pole. U monookulárního typu mikroskopu se preparát pozoruje levým okem

a pravé se nechá otevřené.

6. Po prohlédnutí preparátu malým zvětšením se objektiv vymění za silnější pomocí

revolverového měniče. Barevné preparáty se pozorují při otevřené clonce.

7. Při mikroskopování s imerzním objektivem se kápne kapka cedrového oleje na čelní

stranu čočky kondensoru, který se předem sniží.

8. Na stolek se vloží preparát a kondensor se pomalu zdvihá až olej spojí čočku

s podložním sklíčkem. Stáhne se clonka kondenzoru, poté se kápne kapka

cedrového oleje na fixovaný preparát nebo krycí sklíčko a objektiv se pomalu

snižuje, až se čelní čočka ponoří do oleje.

9. Tubus se dále pomalu zvedá, aby nedošlo k přerušení spojení čočky s olejem a

pozuruje se, kdy se v zorném poli kmitne obraz objektu. Poté se tubus opatrně

snižuje, až se obraz znovu objeví. Mikrometrickým šroubem se obraz zaostří a

upraví se osvětlení.

1.4.4 Péče o mikroskop 1. Mikroskop má být uložen tak, aby byl chráněn před prachem, výpary kyselin a

přímým slunečním světlem.

2. Horní konec tubusu nesmí zůstat otevřen, aby prach nevnikl do mikroskopu a

neusadil se na vnitřní straně mikroskopu a zadní čočce. Do tubusu se proto vkládá

okulár nebo speciální krycí destička.

3. Čocky se nejlépe čistí lněným pláténkem ovlhčeným xylenem nebo benzenem a

ihned se osuší. U moderních mikroskopů výrobce dodává speciální roztoky pro

čištění čoček. Objektivy se nikdy nesmí rozšroubovávat, jelikož by se porušilo

přesné nastavení a centrace čoček. U okuláru můžeme naopak obě čočky

rozšroubovat.

4. Mechanické části se nejlépe čistí kůží.

5. Po delší době používání je nutné předat mikroskop odborné kontrole.

1.4.5 Fázová kontrastní mikroskopie

Strana15

Tento způsob mikroskopování je zvláště vhodný pro studium struktury živých

buněk. Je založen na rozdílném chování světla při průchodu zbarveným, čili částečně

absorbujícím objektem, nebo nezbarveným, zcela transparentním objektem. V prvém

případě dochází k částečnému absorbování určité vlnové délky procházejícího světla.

Dochází přitom ke změně amplitudy světelného vlnění, které naše oko zachytí jako

změnu barvy (Obr. XXX). Výsledná vlna vzniká interferencí původní vlny a vlny po

difrakci, která je posunuta oproti původní o 180o.

V případě zcela transparentního objektu se amplituda nemění, ale vzhledem

k různým refraktivním vlastnostem objektu bude procházející vlna buď zpožděna nebo

v předstihu proti původní vlně, tzn. bude mezi nimi fázový posun (Obr. XXZ). U

transparentních objektů je difrakcí vzniklá vlna posunuta oproti původní o různý úhel.

Pro slabě lámavé objekty, často sledované v mikroskopu, je fázový posun 90o, tj. 1/4

délky vlny. Použitím optického zařízení je rozdíl ve fázi mezi původní světelnou vlnou

a vlnou po difrakci zvýšen z asi 90o na 180o, takže se obě vlny při interferenci co

nejvíce „ruší“. Nastane obdobná situace jako na obr. XXX, tzn. jako by světelná vlna

prošla barevným objektem. Lidské oko a fotografický materiál bude tento zcela

transparentní materiál vnímat jako by částečně absorboval světlo. Většina živých buněk

je ve světelném mikroskopu téměř transparentní. Různé části buněk a organely se liší

indexem lomu a tloušťkou. Tyto rozdíly jsou fázovým kontrastem převedeny na změny

intenzity světla, přičemž neklesá rozlišovací schopnost ani kvalita obrazu.

Živé bakterie se při fázové kontrastní mikroskopii jeví jako zbarvené. U

kvasinek a plísní jsou patrné jednotlivé části buněk.

Praktické provedení : 1. Vyměň normální objektivy za fázové a kondenzor za kondenzor s fázovými

clonami. 2. Fázový kondenzor nastav na normální osvětlení ve světelném poli, tj. bez fázové

destičky (označeno na okraji měniče fázových destiček jako 0). 3. Zaostři preparát při značně zúžené cloně kondenzoru a nulové poloze měniče

destiček. 4. Otevři úplně irisovou clonku kondenzoru a měničem nastav příslušnou fázovou

destičku (např. pro 10x zvětšující objektiv destičku č. 10, apod.). Vyměň okulár za pomocný mikroskop a zaostři na fázovou destičku, která je v zorném poli zobrazena

Strana16

jako prstenec. Mimo to je v zorném poli vidět prstenčitá clona kondenzátoru, která jasně září.

5. Centračním zařízením pod kondenzátorem, tj. dvěma klíči zasunutými do příslušných otvorů měniče pohybuj tak, aby obrazy obou prstenců byly koncentrické. Světlo procházející prstenčitou clonou kondenzoru nesmí prosvítat na okraji fázové destičky objektivu.

6. Nasaď okulár a pozoruj fázově kontrastní objekt. Poznámka: Objekt pozorujeme ve žlutozeleném světle, které dostaneme použitím filtru, jenž je součástí vybavení fázového kontrastu.

Strana17

2. KULTIVACE MIKROORGANISMŮ

Abychom udrželi mikroorganismy v životném stavu, musíme je pravidelně

pomnožovat, tj. kultivovat za optimálních podmínek s následujícím uchováním za

takových podmínek, kdy stárnou a tudíž i odumírají co nejpomaleji (viz kap.

).Pomnožování mikroorganismů je nutné také pro získání většího množství jejich

buněčné hmoty potřebné k biotechnologickým účelům (pak hovoříme o propagaci

mikroorganismů) nebo pro mikrobiologické, biochemické či genetické studie. Pro

kultivaci potřebujeme vhodné sterilní živné půdy v kultivačních nádobách, očkovací

pomůcky, inkubátor (tj. termostat) nebo temperovaný box a někdy ještě zařízení pro

regulaci přístupu vzduchu ke kulturám.

2.1 Živné půdy

Živné půdy neboli media, používané pro kultivaci mikroorganismů musí

vyhovovat všem nárokům příslušného mikroorganismu na výživu , na pH, osmotický

tlak a další fyzikálně–chemické podmínky.

Základní vlastnosti všech živých půd jsou:

1. Dostatek vody, neboť životní pochody probíhají jen ve vodném prostředí.

2. Přítomnost potřebných živin ve vhodných koncentracích ,a to :

a) zdroje energie (u fototrofních je nahražen světlem, u heterotrofních

organismů je stejný se zdrojem uhlíku),

b) zdroje uhlíku (cukry, bílkoviny, organické kyseleny nebo alkoholy, pro

autotrofní bakterie CO2),

c) zdroje dusíku (NH4+, NO3

-, aminokyseliny, bílkoviny a jejich částečné

hydrolyzáty, jako jsou proteosy a peptony; jen poměrně malým skupinám

mikroorganismů stačí jako zdroj dusíku plynný N2),

d) ostatní biogenní prvky a prvky oligogenní,nejčastěji ve formě anorganických

solí.

Některé živné půdy obsahují ještě specifické faktory, např. nadbytek SO4- pro

bakterie redukující sírany, růstové faktory (vitamíny, aminokyseliny) nutné pro

auxotrofní mikroorganismy aj.

Strana18

Jako živné půdy slouží některé přírodní látky (např. mléko, plátky mrkve nebo

brambor). U tzv. umělých půd, kam patří i sladina a bujon, jsou zdrojem vitamínů a

aminokyselin výtažky přírodních látek. Jako zdroj vitamínů slouží hlavně sladový

výtažek, výluh ze sladových klíčků, kvasniční autolyzát, zahuštěné máčecí vody

z výroby kukuřičného škrobu, masový výtažek apod. Zdrojem aminokyselin je hlavně

hydrolyzát kaseinu. U tzv. syntetických půd je přesně udáno chemické složení, takže

používá čistých vitamínů, aminokyselin a stopových prvků atd. K rozpouštění všech

složek syntetických půd se používá destilovaná voda.

Podle konzistence rozdělujeme půdy na tekuté (mléko,masopeptonový bujon,

sladina), ztužené agarem nebo želatinou a tuhé (mrkev,brambor). Podle účelu

rozlišujeme půdy všeobecné, na nichž se rozmnožují velké skupiny mikroorganismů

(masopeptonový bujon pro bakterie, sladina pro kvasinky a plísně), selektivní,

zvýhodňující růst určité skupiny mikroorganismů, nebo diagnostické půdy, na nichž

roste jen velmi uzká skupina mikroorganismů.

2.1.1 Příprava živných půd

K přípravě živných půd z přírodního materiálu se používá většinou vodovodní

voda, která však nesmí být tvrdá a nesmí obsahovat větší množství železa a chloridů.

Také silné chlorování je na závadu. K přípravě syntetických a speciálních živných půd

používáme destilovanou vodu, pro analytické stanovení vitamínů a aminokyselin

pomocí mikroorganismů nutno použít redestilovanou nebo deionizovanou vodu. Živná

půda se připravuje rozpuštěním jejich součástí ve vodě za případného zahřátí a

neustálého míchání. Pak se upraví pH, půda se zfiltruje, rozplní do vhodných nádob

(baněk nebo zkumavek) a ihned steriluje. Pro ztužení půd se před sterilací přidává

příslušné množství agaru. Komerčně dodávané tzv.sušené živné půdy (např. od firmy

Oxoid) mají již upravené pH a jsou z hlediska přípravy velmi jednoduché.

PH živných půd se upravuje pomocí 1n NaOH nebo 1n H2SO4. Půdy připravené

z pří-rodních materiálů mají reakci obyčejně kyselou. Pro bakterie je nutno upravit pH

7,0–7,3, kdežto kvasinky a plísně vyžadují kyselou reakci (pH 4,5–6,0). Sterilací půd

klesne jejich pH o 0,1 –0,3.

Filtrace půd se provádí skládaným filtrem, u silně vyvločkovaných půd se místo

filtračního papíru použije vrstva obyčejné vaty. První podíl filtrátu se vrátí na filtr.

Strana19

Ztužování živných půd se nejčastěji provádí pomocí agaru v množství 1,5-3,0%.

Agar je polysacharid, získaný z mořských řas. Rozvaření agaru v půdě se provádí na

vodní lázni nebo v autoklávu. Bod tání agarových půd je 96°C, bod tuhnutí 37-42°C.

Příprava jednotlivých půd je uvedena v seznamu živných půd na konci tohoto

skripta.

2.1.2 Rozlévání půd a jejich uchovávání

Tekuté nebo ztekucené živné půdy plníme ihned po přípravě do sterilních baněk

nebo zkumavek, opatřených vatovými zátkami nebo patentními uzávěry. Pro plnění

zkumavek používáme nálevek uzavřených tlačkou na napojené hadičce (obr. ), u

neztužených půd můžeme použít také byrety. Při rozlévání se nesmí půdou potřísnit

okraje nádob ani zátky, neboť by zde došlo k pomnožení mikroorganismů ze vzduchu a

k jejich prorůstání zátkou do nádoby. Půdy musí být sterilovány ihned po jejich rozlití.

Šikmé agary se přepravují tak, že se zkumavky naplní roztavenou půdou asi do

1/3 objemu, vysterilizují a pak nechají ztuhnout v šikmé poloze (nejlépe opřenyo ležící

tyčinku nebo pipetu). Horní okraj šikmého agaru se nesmí dotýkat zátky zkumavky

(obr. ).Sešikmení se provádí krátce před použitím, neboť šikmý agar rychle vysychá.

Lití desek (ploten) do Petriho misek se provádí asepticky až po sterilaci půd.

Agarovou půdu v baňce nebo ve zkumavce roztavíme na vroucí vodní lázni nebo

v autoklávu, okraj nádoby ožehneme a nádobku otevřeme tak, že zátku uchopíme dlaní

a malíkem levé ruky nebo mezi malíkem prsteníkem levé ruky, jež je obrácena dlaní

vzhůru, pak znovu ožehneme hrdlo nádoby, palcem a ukazováčkem levé ruky poněkud

nadzdvihneme víčko sterilní Petriho misky, vlijeme takové množství půdy, aby vznikla

vrstva 3–4 mm vysoká (tj. 15–20 ml půdy na Petriho misku o průměru 10 cm), víčko

ihned přiklopíme a naléváme další desky. Zátku nádobky během lití desek

nepokládáme. Okraje a víčka misek nesmí být potřísněny rozlévanou půdou. Po

ukončení rozlévání hrdlo nádobky i vnitřní část zátky, kterou držíme stále v ruce,

ožehneme a nádobu uzavřeme. Rozlévání provádíme na vydezinfikovaném stole blízko

plamene. Bubliny na povrchu půdy odstraníme ještě v tekutém stavu přímým plamenem

kahanu. Desky necháme ztuhnout ve vodorovné poloze. Po utuhnutí je obyčejně

inkubujeme 2–3 dny v obrácené poloze (zavěšený agar) při teplotě, jež bude používána

Strana20

pro kultivaci mikroorganismů. Tím dojde k vhodnému předsušení půdy, jež je nutné pro

povrchové očkování. Kromě toho se během této inkubace také projeví případná

kontaminace desek tvorbou zřetelných kolonií, takže tyto nevhodné desky mohou být

vyřazeny a neznehodnotí další práci. Pro rychlé předsušení desek používáme sušárnu o

teplotě 50–70°C; doba sušení otevřených misek, položených dnem vzhůru, je pak 5–30

minut, tj. do vytvoření nepravidelných hran na povrchu desky. Při používání misek

z umělé hmoty nesmí teplota při sušení přesáhnout 60°C, neboť by došlo k měknutí

misek a jejich deformaci.

1) Sterilace půd

Živné půdy se sterilují nejčastěji autoklávováním při přetlaku 0,1–0,15 MPa.

Sterilační doba je závislá na objemu a viskozitě půdy (20 min. pro zkumavky, 30 min.

až 1 hod pro objemy 3 litrů).

2) Uchovávání živných půd

Živné půda se uchovávají na temném, bezprašném, suchém a pokud možno

chladném místě. Pro dlouhodobé uchovávání se doporučuje chladnička o 5-6°C.

2.2 Sterilace nádobí, živných půd a ostatních pomůcek

Každá mikrobiologická práce vyžaduje sterilní pomůcky, tj. pomůcky prosté

všech živých mikroorganismů. Výkon, kterým materiál nebo předměty zbavujeme

živých mikroorganismů, nazýváme sterilací. Sterilace spočívá buď v usmrcení

přítomných mikroorganismů nebo v jejich odstranění.

2.2.1 Fyzikální prostředky sterilace

Z fyzikálních prostředků se v mikrobiologické laboratoři nejčastěji používá

tepelná sterilace, jež se provádí několika způsoby. Volba způsobu závisí na materiálu,

který sterilizujeme.

1) Sterilace ožeháváním

Se používá pro hrdla zkumavek baněk, pro očkování tubusu nádob a skleněné

tyčinky k jejich uzavírání, pro očkovací a preparační jehly, pinzety, podložní skla a jiné

kovové nebo skleněné předměty.

Strana21

Očkovací jehly ožehujeme v oxidačním plameni kahanu (viz obr.v kap. ), a to

po celé délce jehly až do žhnutí drátku a krátce ožehneme i tu část držáku, která bude

při očkování zasahovat do kultivační nádoby. Ožehujeme těsně před očkováním a jehlu

pak zchlazujeme na nezaočkované půdě, ve sterilní vodě nebo na okraji kultury. Po

použití nutno jehlu ihned znovu ožehnout, abychom mikroorganismy z kultury

neznečistily prostředí laboratoře. U chromniklové jehly vypalujeme zbytky kultury

v redukční části plamene, aby se nerozptýlily po o-kolí (důležité hlavně při rozočkování

kultur pod parafínovým olejem!) a pak teprve jehlu ožehujeme v oxidačním plameni.

Redukční plamen nemůžeme použít pro platinové jehly (vznik křehkého karbidu

platiny!).

2) Sterilace suchým teplem v horkovzdušném sterilizátoru

Tato sterilace se používá pro prázdné kultivační nádoby (tj. zkumavky nebo

baňky uzavřené vatovými zátkami nebo patentními uzávěry, skleněné Petriho misky

zabalené do papírů nebo v kovových pouzdrech), pipety, vatové filtry, papírové,

skleněné nebo kovové pomůcky, jež vesměs sterilizujeme zabalené do papíru. Suché

teplo má nižší sterilační účinky než teplo vlhké, a proto je nutno použít poměrně

vysokých teplot, tj.160oC–180°C po dobu dvou hodin (počítá se od dosažení

sterilačních teploty). Tato vysoká teplota by již poškodila živné půdy, gumové rukavice,

tkaniny apod. Sterilované předměty vkládáme do chladného sterilizátoru, přičemž

sterilátor nesmí být předměty přeplněn, aby se nebránilo cirkulaci vzduchu a pronikání

tepla. Papírové obaly nebo vatové zátky se nesmějí dotýkat stěn sterilizátoru, aby

nedošlo k zuhelnění. Po ukončení sterilace necháme zavřený sterilizátor pomalu

vychladnout a teprve chladné sterilní předměty z něj vyjímáme. Parafín a parafínový

olej sterilujeme suchým teplem při 150°C po dobu 1 hodiny ve sterilních baňkách

uzavřených vatovými zátkami.

3) Sterilace vlhkým teplem

Sterilace vlhkým teplem se používá pro živné půdy, vodu a roztoky přidávané do

kultur mikroorganismů, dále pro tkaniny, gumové hadice, pro likvidaci nepotřebných

kultur apod. Nejpoužívanější je sterilace tlakovou parou. Používá se přetlaku 0,1–0,15

Strana22

MPa, což odpovídá teplotě 121–128°C (viz tab. ). K této sterilaci se používají tlakové

nádoby, tzv. autoklávy, které jsou vytápěny plynem, elektřinou nebo tlakovou parou.

Každý autokláv musí být opatřen manometrem, pojistným ventilem, výpustným

kohoutem pro páru a vodoznak. Podle bezpečnostních předpisů musí být autoklávy

v pravidelných intervalech podrobeny tlakové zkoušce. Rozlišujeme autoklávy

jednoplášťové (obr. ), u nichž je vyvíječ páry spojen otvory se sterilačním prostorem, a

dvouplášťové (obr. ), kde páru z vyvíječe přepouštíme pomocí ventilu do sterilačního

prostoru.

Dnes se většinou vyrábějí elektrické autoklávy s automatickou regulací, u nichž

se pouze nastaví zvolený sterilační program.

4) Frakcionovaná (přerušovaná) sterilace

Sterilace proudící parou používá teploty 99o–100°C, která však nemůže usmrtit

bakteriální spory. Proto je možno používat tuto sterilaci pouze u živných půd, v nichž

bakteriální spory po 24 h uchovávání při laboratorní teplotě vyklíčí a přemění se

v rozmnožující se vegetativní buňky, jež se dalším zahřátím proudící parou usmrtí. Pro

jistotu postup opakujeme ještě třetí den, u některých půd ještě i čtvrtý den. Jednotlivé

záhřevy trvají 20–30 min a celý postup se pro to nazývá frakcionovaná (přerušovaná)

sterilace. Pro časovou náročnost a ne vždy 100%ní účinnost se používá této sterilace

pouze u půd, které by byly tlakovou sterilací poškozeny.

5) Tyndalizace

Pro živné půdy a roztoky, které nesnášejí zahřívání na 100°C, používáme tzv.

tyndalizaci, což je zahřívání na teplotu 57°C po dobu 1 h, opakované osmkrát v 24

hodinových intervalech, během nichž jsou roztoky uchovávány při laboratorní teplotě.

Tento postup není příliš účinný, neboť neusmrcuje termofilní bakterie, a proto je

v poslední době u čirých roztoků nahrazován filtrací.

6) Sterilace ultrafialovým zářením

Sterilace UV světlem se používá k usmrcení mikroorganismů ve vzduchu a na

povrchu pracovních ploch (v očkovacích boxech a laboratořích). Používáme tzv.

germicidní lampy, které vydávají záření o vlnové délce 240–280 nm. Lampy jsou

zapnuty přes noc nebo před započetím práce. Při obsluze UV světla je nutné si chránit

zrak.

7) Sterilace filtrací

Strana23

Tento způsob sterilace se používá pro plyny a dále pro čiré kapaliny, které by

byly zahříváním poškozeny. Pro sterilaci vzduchu používáme vatové filtry (skleněné

nebo kovové trubice naplněné vzdušným filtrem nebo skelnou vatou a sterilované

suchým teplem). Nejjednodušším vzdušným filtrem je vatová zátka kultivačních nádob.

Pro sterilaci čirých kapalin, které nesnášejí zahřívání, se používá filtrace přes

asbesto-celulosové vrstvy (tzv. Seitzův filtr viz. obr. ) nebo přes membránové fitltry.

Tyto filtry se sterilují v autoklávu.

2.2.2 Sterilace chemickými prostředky

Chemické prostředky se používají v mikrobiologické laboratoři nejčastěji pro

sterilaci (případně dezinfekci) povrchu předmětů a pracovních ploch, dále do nádob pro

ukládání použitých pipet a k rychlé likvidaci zbytků kultur, např. náhodně rozlitých na

pracovní ploše. Vzácněji se používají ke sterilaci roztoků barviv a jiných látek, jež

nemohou být sterilovány tepelně ani filtrací, a pro konzervaci kultur před jejich

chemickým zpracováním.

Nejpoužívanější prostředky pro povrchovou sterilaci jsou:povrchově aktivní

prostředky, jako např. Ajatin (10%ní roztok dimethyllaurylbenzylamoniumchloridu

nebo bromidu), používaný ve zředění 1 : 100 až 1 : 200. Jsou to bezbarvé. nejedovaté,

nekorozivní sloučeniny povahy kationtových povrchově aktivních látek, a proto se její

účinnost snižuje v přítomnosti aniontových povrchově aktivních látek, tj.mýdel a

pracích prostředků.Další povrchově aktivní látkou je Persteril (cca 40%ní roztok

peroctové kyseliny). Používá se ve zředění 1 : 80.Je vel-mi účinný i na kvasinky a

plísně, ale i poměrně zředěný je silně korozivní. Ethanol má poměrně malý dezinfekční

účinek. Nejúčinnější je v koncentraci 50- 70%. Formaldehyd se používá pro usmrcení

mikrobiálních kultur před jejich dalším zpracováním. Pro zastavení rozmnožování se

přidává 0,1°ml 40%ního formaldehydu do 10 ml kultury.

Chemické prostředky se používají k zastavení růstu rychle se rozrůstajících

kolonií na Petriho misce. Dosahuje se toho vložením krystalku KmnO4 do středu

kolonie. Podobného účinku se dosáhne kapkou 10%ního roztoku AgNO3, který je však

účinný hlavně pro bakterie. Pro zastavení činnosti kvasinek a plísní v kulturách před

jejich chemickou analýzou se používá allylisothiokyanatan v množství 1–2 kapky/10 ml

kultury.

Strana24

2.3 Očkování mikroorganismů

Při pěstování nebo-li kultivaci mikroorganismů je zapotřebí přenést do sterilní

živné půdy živé buňky žádaného druhu, což se označuje jako očkování (inokulace) a

přenesené buňky se nazývají inokulum. Je samozřejmé, že při kultivaci mikroorganismů

musíme postupovat přísně asepticky, tzn. že do kultury ani do používané půdy nesmí

vniknout žádné cizí mikroorganismy ze vzduchu nebo z pracovních pomůcek.

Aseptická práce vyžaduje řadu zvláštních opatření i značnou zručnost.

Hlavní zásady aseptické práce jsou :

1. Pracovat v co nejčistším prostředí,tj.v místnosti,kde se nevíří prach,není průvan a je

dokonalá čistota.

2. Ruce si omýt před prací mýdlem a otřít dezinfekčním prostředkem.

3. Povrch pracovní plochy před prací vydezinfikovat, pracovat blízko plamene a

plamen ještě před prací několikrát protáhnout pracovním prostorem.

4. Pracovat sice opatrně, ale co nejrychleji.

5. Hrdla nádob i zátky před a po práci ožehnout plamenem.

6. Zátky nikdy nepokládat, ale držet je během celé práce dlaní a malíkem, malíkem a

prostředníkem ap. pravé ruky. Při pipetování je vhodné držet zátky mezi ukazovákem

a prostředníkem (dlaň je obrácená vzhůru) nebo malíkem a dlaní levé ruky. Nikdy se

nedotýkat rukou nebo jiným nesterilním předmětem té části zátky, jež se zasunuje do

kultivační nádoby.

7. Nádoby s kulturou nebo sterilní roztoky nechávat otevřené jen po skutečně

nezbytnou dobu a otevřené držet hrdlem blízko plamene v silně nakloněné (téměř

vodorovné)poloze.

2.3.1 Očkování kultury ve zkumavce na šikmý agar

Uchop zkumavku s kulturou a zkumavku s nezaočkovaným šikmým agarem

paralelně do levé ruky obrácené dlaní vzhůru tak, abys měl nezakrytý povrch šikmého

agaru a aby zkumavky byly téměř vodorovně. Do pravé ruky vezmi očkovací kličku a

ožehni ji pomalým protahováním oxidační částí plamene (viz obr.22). Pak ožehni okraje

zkumavky, sejmi pomocí dlaně a malíku, malíku a prsteníku pravé ruky zátky ze

zkumavek (obr.14), znovu ožehni okraje zkumavek, ochlaď kličku na nezaočkované

půdě, naber malé množství kultury a lehkým klikatým pohybem, vycházejícím ze

Strana25

zápěstí, je přenes na celý povrch šikmého agaru. Potom opět ožehni okraje zkumavek a

dolní část jejich zátek, zazátkuj zkumavky, ožehni očkovací kličku a ulož vše do

stojánku. Po zaočkování nebo raději ještě před ním označ novou kulturu štítkem,

nalepeným na hořejší část zkumavky (asi 1cm od okraje zkumavky) tak, aby nezakryl

agar a při ožehávání nebyl opálen. Na štítku uveď název, případně číslo

mikroorganismu, zkratku použité půdy a datum očkování. Po dosažení určité zručnosti

je možno současně očkovat na dva nové agary (viz obr.14).

2.3.2 Očkování ze zkumavky do zkumavky tekuté nebo ztekucené živné půdy

Zachováváme stejný postup jako při očkování na šikmý agar (kap.3.1) jen s tím

rozdílem, že buňky uvolňujeme do půdy otíráním kličky o stěnu pod hladinou kapaliny

a pak dobře rozmícháme poklepem zkumavky o dlaň nebo válivým pohybem mezi

dlaněmi. Ztekucená živná půda musí být před očkováním vytemperováno ve vodní lázni

na vhodnou teplotu (30°C u želatiny, 42°C u agaru) a po zaočkování buď ihned rozlita

do Petriho misky (nutno před tím ožehnout okraj zkumavky!) nebo ihned zchlazena ve

svislé poloze pod tekoucí vodou.

2.3.3 Očkování z Petriho misky do zkumavek a naopak

Zkumavku držíme v levé ruce ohnutým ukazovákem. Očkovací kličku,

umístěnou v pravé ruce ožehneme plamenem, pak ožehneme okraj zkumavky, malíkem

a dlaní pravé ruky vyjmeme její zátku, okraj zkumavky znovu ožehneme, palcem a

prostředníkem levé ruky nadzdvihneme víčko Petriho misky (obr.15), nabereme kulturu,

zavřeme misku a kulturu přeneseme známým způsobem do zkumavky. Pak ožehneme

okraj zkumavky i vnitřní konec zátky, zkumavku zazátkujeme, ožehneme očkovací

kličkou a označíme zkumavku štítkem.

Pro očkování ze zkumavky na Petriho misku je postup obdobný. V tomto

případě je vhodné použít očkovací jehlu s očkem odchýleným cca 30 stupňů od přímého

směru, aby se mohlo očkovat celou plochou očka. U plísní se doporučuje očkovat misky

ze spodu, přičemž se drží spodek misky dnem vzhůru. Tím se zabrání rozprášení spor

po celé ploše desky

Strana26

Zaočkovanou misku označujeme tužkou na sklo, neboť papírový štítek by se v

důsledku rozdílné tepelné roztažnosti skla a papíru při přenosu do termostatu nebo z

termostatu do lednice odlepil.

2.3.4 Očkování vpichem

Vpichu do ztužené půdy používáme pro pěstování anaerobních nebo

mikroaerofilních mikroorganismů, pro sledování nároků na kyslík, typu ztekucení

želatiny apod. Vpich se provádí rovnou očkovací jehlou (tj. bez koncové kličky) do

svislého agaru nebo želatiny. Postup je podobný jako při nátěru na šikmý agar (kap.3.1).

Jelikož je třeba se vyhnout tvorbě kráterů v půdě, musí se rovná jehla táhnout dovnitř i

ven stejnou stopou. Proto je vhodné držet očkovanou zkumavku ve vodorovné poloze

(nebo ve svislé poloze dnem vzhůru) a ruce opírat lokty o stůl. Vpich má zasahovat asi

0.5 cm nad dno zkumavky.

2.3.5 Očkování pomocí pipety

Při převádění většího objemu tekutého inokula používáme sterilní pipety. Pipetu

vyjmeme z obalu až těsně před použitím, a to vždy blízko plamene a rukou nebo jinými

nesterilními předměty se jí dotýkáme pouze na hořejším konci, který nebude zasahovat

do kultivační nádoby. Po vyjmutí pipety z obalu vyjmeme z nádob s kulturou a s

nezaočkovanou půdou dlaní a malíkem, malíkem a prsteníkem levé ruky zátky (nádoby

přidržujeme dlaní a malíkem pravé ruky, v níž je pipeta). Pipetujeme-li ze zkumavek, je

lépe si zkumavku po vyjmutí jejich zátek přendat do levé ruky a při pipetování je

naklánět hrdlem k plameni. Pipetujeme co nejrychleji a použitou pipetu odložíme do

válce s dezinfekčním prostředkem. Pak ožehneme hrdla nádobek i dolní část zátek a

nádoby rychle uzavřeme. Inokulum rozmícháme v půdě krouživým pohybem. Pro

začátečníky je vhodnější pracovat ve dvojici, z niž jeden pracuje s pipe-tou, druhý

otevírá nádoby za příslušného ožehávání..

2.4 Inkubace

Po zaočkování půdy musíme nechat mikroorganismy růst při jejich optimální

teplotě, což je pro kvasinky většinou 26°-30°C (rody Rhodotorula, Sporobolomyces a

Strana27

Nadsonia mají optimální teplotu 18°-20°C, pro plísně 20°-28°C, pro mezofilní bakterie

30°-37°C, psychrofilní 20°C a termofilní 50°-55°C. Agarové desky kultivujeme

převrácené, tj.s víčkem na podložce (tzv. zavěšený agar), abychom se vyhnuli stékání

zkondenzovaných par s víčka na kulturu. Při teplotách nad 37°C je nutno misky vkládat

do vlhkých komůrek, aby půdy nevyschly. Vlhká komůrka je uzavřená nádoba, na

jejímž dně je kádinka s vodou. Během inkubace je nutno zajistit vhodné podmínky,

pokud jde o přístup vzduchu.

Při optimálních podmínkách je doba potřebná pro dostatečný nárůst kultury (tzv.

inkubační doba) různá (u bakterií a kvasinek 24-48 hodin, u plísní 2-5 dnů). K dosažení

maximální růstové rychlosti (tj.log-fáze růstu viz ) je od zaočkování buněk do nové

půdy u bakterií třeba 1,5-2,5 h., u kvasinek 3-5 h.

Mikroorganismy se značně liší svými nároky na přítomnost nebo nepřítomnost

kyslíku, k čemuž musíme přihlížet, chceme-li určitý organismus udržet v dobrém stavu.

Při kultivaci v malých objemech se většinou přístup kyslíku reguluje tvarem nádoby a

velikostí styčné plochy mezi povrchem půdy a vzduchem. Tak např. aerobní organismy

(plísně,některé bakterie a kvasinky) pěstujeme na nátěrech (desky, šikmé agary), nebo

v nízkých vrstvách kapalin. Anaerobní nebo mikroaerobní organismy očkujeme

vpichem nebo rozmícháním do svislých agarů nebo do vysokých vrstev kapaliny o

malém povrchu, případně ještě snížením oxidoredukčního potenciálu živného prostředí

přidáním redukujících látek jako je thioglykolát sodný, kyselina askorbová, siřičitan,

thiosíran, pyrosiřišitan apod. Pro aerobní kultivaci ve větších objemech a při kultivaci

přísně anaerobních mikroorganismů však toto uspořádání nestačí.

2.4.1 Aerobní kultivace ve větším objemu

Pro rychlé pomnožení aerobních mikroorganismů v tekuté půdě je třeba sycení

kyslíkem, a to buď třepáním na automatických třepačkách (způsobuje současně lepší

rozptyl buněk a spor) nebo aerací. Aerace spočívá v přivádění stlačeného vzduchu

trubkou ke dnu nádoby a jeho protlačení porézní destičkou. Pro vetší objemy se

používají Kluyverovy větrací nádoby nebo skleněné čí nerezové fermentory s aeračním

míchacím systémem. U menších fermentorů se pro aeraci používá také turbinové

míchadlo, které nasává vzduch těsně nad hladinou fermentační kapaliny a rozmíchává

ho do této kapaliny. Není-li po ruce stlačený vzduch, stačí u malých kultivačních nádob

Strana28

odsávat z prostoru nad kapalinou vzduch pomocí vývěvy a trubicí sahající ke dnu

nasávat vnější vzduch do kapaliny.

Vzduch přiváděný do kultury nutno vždy sterilizovat, což se dějě vatovými nebo

porézními filtry (viz ) nebo proháněním vzduchu plynovou promývačkou s roztokem

germicidního prostředku. Za germicidní roztok vkládáme ještě další promývačku se

sterilní vodou jako pojistku. Při tomto způsobu se vzduch současně sytí vodou, takže

nenastávají objemové ztráty kultury.

Při aeraci dochází kromě sycení kyslíkem také k odvádění těžkých

metabolických zplodin, které by ve vyšších koncentracích brzdily rozvoj

mikroorganismů. Máme-li zjistit množství vznikajících těkavých látek, je třeba nádobku

vzduchotěsně uzavřít a vypuzený vzduch vést karborafinovým nebo jiným uzávěrem,

kde se těkavé látky zachycují.

2.4.2 Anaerobní kultivace

Anaerobní mikroorganismy jsou organismy schopné růstu za nepřítomnosti

kyslíku, tj. v anoxických podmínkách. V závislosti na stupni tolerance vůči

molekulárnímu kyslíku je možno klasifikovat z tohoto hlediska anaerobní

mikroorganismy na následující skupiny :

a) Striktně anaerobní mikroorganismy vyžadují dokonalou absenci kyslíku v prostředí.

Větší koncentrace O2 než 0,5% na ně působí toxicky a odumírají.

b) Obligátně anaerobní mikroorganismy nemají schopnost tolerovat vyšší koncentraci

kyslíku než 2-3%.

c) Aerotolerantní mikroorganismy mají schopnost tolerovat malou koncentraci

kyslíku.

d) Fakultativně anaerobní mikroorganismy mohou růst v aerobních i anaerobních

podmínkách.

e) Mikroaerofilní mikroorganismy nerostou dobře za přítomnosti vzdušného kyslíku

při normálním tlaku.

f) Obligátně aerobní mikroorganismy vyžadují jako konečný akceptor elektronů

kyslík pro jejich metabolismus.

2.4.2.1 Příprava anoxického prostředí

Strana29

Anaerobních podmínek dosáhneme vypuzením kyslíku z půdy varem a

zabráněním dalšího přístupu vzduchu ke kultuře nebo vzduchotěsným uzavřením

nádoby s kulturou a odstraněním kyslíku fyzikálními nebo chemickými metodami, dále

vakuem, výměnnou vzduchu v kultinačním zařízení za inertní atmosféru, vysokou

vrstvou agaru, přídavkem redukčních činidel do média aj.

1) Odstranění kyslíku vyvářením a omezení dalšího přístupu vzduchu ke

kultuře

U všech těchto metod půdu ve zkumavce nejdříve zahříváme 20 min. ve vroucí

vodní lázni, pak ochladíme na žádanou teplotu (u agarových půd na 42°C, u ostatních

na 30°C), zaočkujeme, ihned převrstvíme půdu sterilním rozehřátým agarem nebo

parafínem nebo sterilním parafínovým olejem a ochladíme ve svislé poloze na vodní

lázni. Očkujeme-li sporotvorné bakterie, není třeba vyvařenou půdu před zaočkováním

zchlazovat, ale zchlazujeme ji po ukončení celého postupu.

Uvedené metody se používají pro udržování sbírkových kmenů některých

anaerobních bakterií (hlavně pro rod Clostridium). Agarová nebo parafínová zátka se

používá také při kva-litativním zjišťování přítomnosti anaerobních sporotvorných

bakterií produkující plyn.

2) Vzduchotěsné uzavření nádob a odstranění kyslíku

Tento způsob je pracovně i vybavením poněkud náročnější než předchozí, avšak

má také mnohem širší upotřebení. Umožňuje např. také anaerobní kultivaci na deskách

při kvantitativním stanovování anaerobů a při jejich izolaci. Kyslík může být odstraněn

několika způsoby. K fyzikálním metodám odstranění kyslíku patří odsávání vzduchu

nebo jeho nahrazení inertním plynem, nejčastěji dusíkem. Chemické metody používají

snadno oxidovatelných látek, které velmi rychle spotřebují přítomný kyslík. Nejčastěji

se používá zalkalizovaný roztok pyrogallolu. K odstranění O2 z 1dm3 je zapotřebí 7 g

pyrogallolu a 50 ml 20%ního KOH. Často se používá kombinace fyzikálních a

chemických metod, kdy se případné zbylé stopy kyslíku odstraní alkalickým roztokem

pyrogallolu.

Zřeďování a další manipulace se provádí ve speciální očkovací skříni (obr. ),

která má otvory pro ruce uzavřené neprodyšnými gumovými rukavicemi a je zařízena

na výměnu vzduchu v jejím prostoru oxidem uhličitým nebo vodíkem. Pro

vysterilizování celého prostoru je zde instalováno UV světlo.

Strana30

Důkaz,že jsme dosáhly trvalého odstranění kyslíku, provádíme roztoky

oxidoreduktačních indikátorů (např. čínské modře, methylenové modře, 2,6-

dichlorfenolindofenolu nebo resazurinu) odbarvených redukčním činidlem

(hydrosiřičitanem, askorbovou kyselinou ap.), které umisťujeme do prostoru zbaveného

kyslíku a necháme tam během celé anaerobní kultivace.

3) Kultivace za přítomnosti aerobního mikroorganismu

Rouxova metoda

U této metody, po ztuhnutí prvé vrstvy média, se provede naočkování

anaerobního mikroorganismu. Pak se tato vrstva přelije novou vrstvou agaru a po jeho

ztuhnutí se povrch této druhé vrstvy naočkuje kulturou aerobního mikroba. Používá se

Bacillus subtilis.

Metoda tzv.“Fotnerovy plotny“

Princip metody spočívá v tom, že do Petriho misky s nízkým okrajem se

naočkuje na dosti vysokou vrstvu agarového média na jednu polovinu kultura striktně

aerobního mikroorganismu (původně Serratia marcescens) a na zbývající plochu

anaerobní mikroorganismus.

Po naočkování se miska překlopí dnem vzhůru bez víčka na sterilní sklo a okraje

se dokonale utěsní plastelínou. Během kultivace aerobní Serratia marcescens vytvoří

svou metabolickou činností anoxické prostředí a umožní tak pozdější růst anaerobního

mikroorganismu.

4) Kultivace v anaerobním hrnci

Jedno z prvých zařízení tohoto typu navrhl Nowy. Je to skleněná válcovitá

nádoba se zabroušeným okrajem a s víkem, kde je zabudována přípojka, která slouží na

evakuaci nebo na připouštění inertního plynu. Tyto přístroje obsahují směsi chemikálií,

jež po ovlhčení poskytují plynný vodík, který v přítomnosti katalyzátoru (Pt nebo Pd)

reaguje se vzdušným kyslíkem.

Cv.2.1 Kombinace fyzikálních a chemických prostředků

Potřeby : Kultury aerobních a anaerobních mikroorganismů, živné půdy ve

zkumavkách nebo na Petriho miskách, vakuový exsikátor nebo Nowyho zvon(obr. ),

nízká kádinka 250- -400 ml, zkumavka nebo kyveta délky maximálně 90% průměru

Strana31

kádinky, práškový pyrogallol, nasycený roztok Na2CO3, vývěva nebo tlaková nádoba

s N2, série promývaček, zkumavka s odbarveným oxidoredukčním indikátorem.

Provedení :

1. Zaočkuj půdy ve zkumavkách a v Petriho miskách danými mikroorganismy a ulož

do exikátoru nebo Nowyho zvonu (Petriho misky jsou opět dnem vzhůru!).

Současně tam ulož kádinku s cca 4g pyrogallolu, do níž je umístěna zkumavka

naplněná roztokem Na2CO3 (pozor, aby se zkumavka nepřevrátila!) a dále

zkumavka s odbarvevým redox indikátorem.

2. Uzavři exikátor a odsaj z něho vzduch, až tlak v exikátoru klesne na několik mm

Hg. Pak uzavři kohout, opatrným nakláněním exikátoru převrať zkumavku

s Na2CO3 do kádinky s pyrogallolem a exikátor dej do termostatu o optimální

teplotě pro zaočkované mikroorganismy. V případě,že používáš dusík k vytěsnění

vzduchu z exikátoru, promývej dusík z bomby průchodem alespoň dvěma

promývačkami naplněnými čerstvým pyrogallolem se 40%ním louhem. Přečištěný

dusík přiváděj pomocí gumové hadičky až ke dnu exikátoru, v němž jsou umístěny

zaočkované půdy a všechny předměty jako u postupu s odsáváním, a druhým

kohoutem odváděj vzduch a přebytečný dusík z hořejší části (obr. ). Asi po 10 min.

průchodu N2 uzavři nejdříve kohoutek přivádějící N2 do exikátoru, pak ihned také

kohoutek pro odvod plynu z exikátoru a uzavři ventily bomby. Opatrným

nakláněním pak převrať zkumavku s Na2CO3 do pyrogallolu a dále postupuj, jak

uvedeno výše.

3. Po inkubaci otevři oba kohouty, pak uvolni víko Nowyho zvonu a prohlédni narostlé

kultury a zmikroskopuj je.

2.5 Uchovávání a oživování mikrobiálních kultur

Pro běžnou potřebu uchováváme mikroorganismy na šikmých agarech, bakterie

na MPA (půda č ), kvasinky a plísně na SA(půda č. ), které ukládáme ve stojáncích na

tmavých, chladných a bezprašných místech, nejlépe v chladničkách při 4°C až 6°C. U

anaerobních nebo mikroaerobních bakterií používáme místo šikmého agaru vpichu do

souvislé vrstvy agarové půdy ve zkumavce. Agarovým půdám dáváme většinou

přednost před kapalnými, neboť jedovaté zplodiny metabolismu difundují do agaru,

kdežto v kapalném prostředí jsou neustále ve styku s buňkami. Přesto však je nutné

Strana32

agarové kultury po 2-6 měsících přeočkovávat, neboť při vysychání půdy dochází

k odumírání mikroorganismů.

Trvanlivost kultur na agarových půdách se prodlouží, jestliže se jejich zátky

zalijí parafínem nebo pokryjí hliníkovou folií. Podstatnějšího prodloužení trvanlivosti

(1-2 roky) se dosáhne přelitím kultury, narostlé na šikmém agaru, sterilním parafínovým

olejem tak, aby olej o 1 cm převyšoval hořejší okraj agaru. Některé druhy

mikroorganismů (např.octové bakterie a některé mléčné bakterie) výjimečně rychle

odumírají, a proto je musíme přeočkovávat v týdenních intervalech na speciálních

půdách.

Při dlouhodobém uchovávání mikroorganismů je třeba občas měnit živnou půdu

co do složení i konzistence, aby nedošlo k selekci nežádoucích typů. Uchováváme vždy

mladé kultury, které ještě nedosáhly maximálního nárůstu, a před použitím je několikrát

přeočkujeme do vhodné tekuté půdy a kultivujeme vždy 24 hod. za optimálních

podmínek. Jestliže takto připravená kultura nesplňuje dané požadavky vlastnosti

(např.pomalý růst, slabá tvorba kyselin apod.), pokusíme se jí získat z této kultury

izolací, doplněnou testováním fyziologických vlastností, vhodné buňky.

Kultury s prakticky neomezenou trvanlivostí získáme mražením suspenze buněk

a jejich sublimací vody ve vysokém vakuu (tzv.lyofilizace). Suspenze buněk nebo spor

v ochran-né kapalině bohaté na bílkoviny (bujon, krevní sérum, mléčná syrovátka

apod.) se přenese do sterilních ampulek, zmrazí se v lyofilizačním přístroji na –30 až –

80°C a vysuší za vysokého vakua (10-100 mHg). Při zachování vakua se ampulky

zataví. Během lyofilizace dochází k odumření určitého podílu buněk, avšak přežívající

buňky si ponechají všechny vlastnosti po řadu let. Před použitím je lyofilizované buňky

nutno oživit pasážováním v tekuté živné půdě za optimálních podmínek.

Jednodušším postupem je uchovávání mikroorganismů v uzavřených nádobkách

ve zmraženém stavu v prostředí tekutého dusíku (tj.-150o až –200°C). Nevýhodou však

je, že tekutý dusík je nutno pravidelně doplňovat.

Pro kvasinky a plísně se osvědčilo uchovávání suspenze buněk ve sterilním

silikagelu. Suspenze v ochranném roztoku (nejčastěji v odstředěném mléce) se za

chlazení ledem vlije na sterilní silikagel, kde dojde k rychlému vysušení buněk.

Životnost těchto buněk je několik let. Podrobnější postup viz.Brockman a de

Serres,Neurospora Newletter 1,8 (1962).

Při oživování lyofilizovaných kultur bakterií se za aseptických podmínek otevře

zatavená ampulka. K vysušené kultuře se přidá cca 0,3 ml vhodného tekutého media

Strana33

sterilní pipetou a promíchá. Papírový štítek s označením kultury se vloží na pevnou

živnou půdu a suspenze v ampulce přeneste do tuhého media. Inkubujeme při

optimálních podmínkách. U lyofilizovaných kultur hub se po otevření ampule přidává

cca 0,3 ml sterilní destilované vody a ponecháme stát 15-20 min stát. Pak přeneseme

suspenzi i s papírovým štítkem na vhodnou živnou půdu. Inkubujeme několik dnů při

optimální teplotě.

U pískové kultury se písek z ampulky sterilně nasype na živnou půdu.

Inkubujeme několik dnů při optimální teplotě.

Veškeré zbytky původní ampule vložte do dezinfekčního roztoku nebo klávujte.

2.6 Práce s bakteriofágem

Při práci s bakteriofáge, ať už jde o transdukci nebo přípravu lysogenních kmenů

bakterií, mutagenesi fágů, jejich křížení a nebo studium jejich vlastností, potřebujeme

suspenzi fágových partikulí, kterou nejsnáze získáme z fázových lyzátů mladých

bujonových kultur citlivých bakteriálních kmenů. Polýzi, která trvá 2-3 hodiny u

virulentních fágů a kolem 5 hodin u mírných (temperovaných) fágů, vysrážíme několika

kapkami chloroformu zbytky bakteriálních buněk a odstředíme je pomalou centrifugací.

Aby došlo k dobré lýzi, je zapotřebí, aby bakteriální kultura byla v počátku logaritmické

fáze růstu (nejvhodnější je inkubace bakteriálního inokula 2,5h za provzdušňování při

37°C) a aby složení media bylo vhodné pro adsorpci přidaných fágových částic na

bakteriální buňky. Obzvláště důležitá je koncentrace elektrolytů, jejíž optimum je různé

pro různé fágy. Pro lyzáty virulentních fágů bývá poměr koncentrace přidaných

fágových částic ke koncentraci bakterií 10:1,u mírných fágů 200:1.

Kontrolní otázky ke kap. 2 – KULTIVACE MIKROORGANISMŮ

1. Co slouží nejčastěji jako zdroj energie v živných půdách heterotrofních

organismů?

2. Které znáte přírodní zdroje vitamínů používané pro přípravu živných půd?

3. Jaké zdroje dusíku jsou v živných půdách?

4. Jaké znáte typy živných půd?

5. Které látky se používají pro ztužení živných půd a jaké mají přednosti a

nedostatky?

Strana34

6. Jaké pH vyžadují pro růst bakterie, kvasinky a plísně?

7. Jak upravujeme pH půd a) tekutých, b) agarových, c) želatinových?

8. Jak sterilujeme živné půdy?

9. Sterilují se živné půdy před rozlitím nebo po rozlití do kultivačních nádob?

10. Je po sterilaci účinnější vlhké nebo suché teplo?

11. Jak se steriluje nádobí, gumové hadice, tkaniny a proč,

12. Co je to přerušovaná sterilace a na čem je založena?

13. Můžeme použít přerušovanou sterilaci pro sterilaci fyziologického roztoku nebo

vody? Vysvětlete!

14. Jaké jsou nevýhody tyndalizace a čím ji nahražujeme?

15. Jaké jsou sterilační teploty a doby při a) suché b) vlhké sterilaci?

16. Jaké znáte netepelné sterilační prostředky?

17. Kdy můžeme použít sterilaci ultrafialovým světlem?

18. Kdy byste použil(a) Ajatin, Persteril, formaldehyd, ethanol?

19. Jak postupujeme při aseptické práci?

20. Jaké kultivační teploty a doby byste volil(a) pro kvasinky, plísně, bakterie?

21. Jak zjišťujeme dostatečný přísun kyslíku pro aerobní a fakultativně anaerobní

mikroorganismy při jejich kultivaci?

22. Jaký je nejjednodušší postup pro zajištění anaerobních podmínek při kultivaci?

23. Které znáte chemické metody pro zajištění anaerobních podmínek?

24. Jak postupujeme při dlouhodobém uchovávání mikrobiálních kultur?

25. Jak dosáhneme pomnožení fágů (tj. fágových partikulí) a čím je konzervujeme?

Strana35

3. MORFOLOGIE A CYTOLOGIE MIKROORGANISMŮ Morfologické a cytologické znaky mikroorganismů zjišťujeme při identifikaci

mikrobiálních rodů a druhů, při kontrole čistoty kultury, případně také při posouzení

fyziologického stavu buněk v kultuře. Morfologické znaky dělíme na makroskopické,

které jsou patrné již pouhým okem a týkají se způsobu růstu mikroorganismu v živných

půdách, a na mikroskopické znaky, které můžeme pozorovat světelným nebo

elektronickým mikroskopem, případně i lupou. Cytologické znaky, tj.vnitřní strukturu

jednotlivých buněk, můžeme pozorovat pouze světelným nebo elektronickým

mikroskopem a často si pomáháme ještě speciální preparací pozorovaného materiálu,

tj.různými typy fixace, barvení, stínování, pokovování apod.

3.1 Makroskopické morfologické znaky mikroorganismů

I když jsou makroskopické morfologické znaky silně ovlivněny použitou živnou

půdou a stářím kultury, přinášejí nám mimořádně cenné informace o povaze

mikroorganismu a o čistotě kultury. Jen v některých případech jsou tyto znaky také

důležitým vodítkem při iden-tifikaci rodů nebo dokonce druhů mikroorganismů (např. u

některých plísní, u zbarvených nebo barvivo redukujících rodů bakterií případně

kvasinek). Mezi makroskopické morfologické znaky náleží charakter růstu :

Strana36

a) po kultivaci mikroorganismu v tekuté půdě

b) po kultivaci nátěru na šikmém agaru

c) po kultivaci jednotlivých buněk na agarové půdě v Petriho misce

d) po kultivaci suspenze buněk nebo spor v jednom místě agarové nebo želatinové

půdy (tzv. obrovské kolonie)

e) po kultivaci svislých agarů zaočkovaných vpichem

Jako základní živné půdy se pro sledování makroskopických znaků bakterií

používá masopeptonový bujon (půda č ), případně ztužený agarem (půda č ) nebo

želatinou (půda č ), u kvasinek se používá sladina (půda ), případně ztužená agarem

(půda ) nebo želatinou (půda ), pro plísně je vhodná rovněž sladina nebo sladinový

agar, dále Sabouraudův agar (pů-da ) a pro rody Aspergillus a Penicillium nejčastěji

syntetická půda podle Czapka-Doxe, ztužená agarem (půda ). Sledování

makroskopických morfologických znaků má být vždy doplněno mikroskopickou

kontrolou pozorované kultury(viz. kap…).

3.1.1 Charakter růstu v tekuté půdě

Mikroorganismy rostou při statické, tj. klidové kultivaci v tekuté půdě nejčastěji

ve formě difusního zákalu (např. některé bakterie tvořící drobné tyčinky nebo koky)

nebo ve for-mě hrubých vznášejících se vloček (např. bakteriální rod Staphylococcus a

některé druhy rodu Bacillus) či sedliny, jež v konečných fázích růstu poměrně lpí na

dně nádoby (např. bakteriální rod Laktobacillus a většina kvasinek). Řada

mikroorganismů však za těchto podmínek roste na povrchu tekuté živné půdy. Tak např.

plísně tvoří kožovitý, na povrchu volně vláknitý nebo sametový povlak, kdežto

oxidativní typy kvasinek tvoří bílou suchou a silně zvrásněnou blanku zvanou křís, která

vzlíná po stěnách nádoby a snadno se rozpadá. Po delší kultivaci se křís propadá ve

formě hrubých volných vloček a tvoří se nový. Také některé kmeny druhů rodu Bacillus

a aerobních rodů Pseudomonas a Acetobacter tvoří na povrchu tekutých půd blan-ky

podobné křísu kvasinek, avšak většinou jemnější. Výjimkou je Acetobacter aceti subsp.

xylium, který tvoří silnou kožovitou blánu. Povrchový nárůst v kapalném prostředí je

způsoben poměrně špatnou smáčivostí buněk nebo mycelia a vzniklá vrstva je na

povrchu kapaliny udržována silou povrchového napětí této kapaliny. Přidají-li se do

tekuté živné půdy látky sni-žující povrchové napětí (tzv. povrchově aktivní látky neboli

Strana37

tenzidy), dojde k ponoření těchto blanek. Jestliže se použijí neionogenní povrchově

aktivní látky, které neinhibují rozmnožování mikroorganismů (např. Tween 80), již před

zaočkování kultury, rostou blankotvorné mikroorganismy difusně v prostředí a na

povrchu tekuté půdy se nevytvoří.

Růst v povrchových blanách na tekuté živné půdě se často vyskytuje jen u

některých kmenů určitých druhů mikroorganismů (např. u kvasinkového rodu

Hansenula nebo dokonce i Saccharomyces a u bakteriálního rodu Bacillus), kdežto u

jiných druhů převládá (např. u kvasinkového rodu Pichia). Je spojen také s morfologií

kolonií na agarových půdách, tj. s tvorbou drsných až zvrásněných kolonií (viz. kap. )

se změnou metabolismu v oxidativní typ na úkor fermentativního a se změnou

morfologie buněk a složení povrchových vrstev buněčné stěny, a tím i imunologických

vlastností oproti kmenům s růstem difusním nebo ve formě sedliny.

Některé sedlinotvorné kvasinky tvoří po delší inkubaci (1-4 týdny)

v sacharidovém prostředí na jeho povrchu vlhkou kašovitou vrstvu, nazývanou mázdra,

některé tvoří za těchto podmínek pouze kašovitý prstenec podél stěn nádoby. Tento

druhotný povrchový růst je výsledkem vyčerpání sacharidových živin ethanolovým

kvašením a nastupujícího aerobního využívání naprodukovaného ethanolu.

3.1.2 Charakter růstu na šikmém agaru

Pro sledování charakteru růstu na šikmém agaru používáme předsušený agar

(alespoň 24 h při 37°C), aby kondenzační voda nerozplývala buňky do souvislé vrstvy

po celém agaru. Na povrchu šikmého agaru očkujeme mikroorganismy k tomuto účelu

nejlépe pomocí očkovací jehly bez kličky, pomocí níž vedeme rovnou čáru od spodního

okraje povrchu agaru k hořejšímu okraji. Po inkubaci při optimální teplotě po dobu 24-

48 h u bakterií a 2-3 dny u kvasinek zjišťujeme :

a) rychlost růstu

b) tvar nátěru (rovný, plný, bodový, rozplývavý, ostnitý, kořínkovitý,

stromečkovitý (viz. obr. )

c) průřez nátěru (plochý, vyvýšený)

d) povrch nátěru (hladký lesklý, hladký bez lesku, drsný, zvrásněný, suchý, vlhký)

e) konzistence nátěru (kašovitá, slizovitá, moučná, kožovitá)

f) barvu nátěru (krémová, křídově bílá, citrónově žlutá, okrová, rumělkově červená

atd.)

Strana38

g) barvivo uvolňované do prostředí,případně jeho fluorescenci

U plísní pozorujeme nárůst v jednodenních intervalech počínaje druhým dnem inkubace

a zjišťujeme :

a) rychlost růstu

b) charakter růstu (volný, kompaktní, kožovitý)

c) povrch nárůstu (sametový, mechovitý, krátce nebo dlouze vláknitý, svazkovitý,

provazcovitý, chomáčkovitý)

d) barvu mycelia

e) barvu sporové vrstvy

f) barvu rubu nátěru

g) barvivo vylučované do živné půdy

h) přítomnost kapiček transpirované kapaliny na povrchu nárůstu a jejich barvu

i) vůni kultury

Všechny tyto znaky jsou důležité při identifikaci jednotlivých druhů nebo sekcí

rozsáhlých rodů plísní.

3.1.3. Kolonie vyrostlé z jednotlivých buněk

Typické tzv. jednobuňkové kolonie získáme rozetřením suspenze obsahující 30-

100 buněk (viz kap ) na předsušenou agarovou půdu v Petriho misce a inkubací za

optimální teploty po dobu 1-2 dnů u bakterií, 2-3 dnů u kvasinek a 2-5 dnů u plísní.

Vyhodnocování morfologie těchto kolonií je u plísní prakticky stejné jako u nátěru na

šikmém agaru (viz kap.3.1.2). U bakterií a kvasinek se zjišťuje (obr.. ) :

a) tvar kolonií (bodový, kruhový, kořínkovitý, nepravidelný, vláknitý),

b) povrch kolonií (hladký, hladký s jednotlivými papilami, drsný, zvrásněný,

radiálně nebo koncentricky rýhovaný, suchý, vlhký),

c) průřez (reliéf) kolonie (plochý, vyvýšený rovný nebo s vyvýšeným či propadlým

středem),

d) okraj kolonie (rovný, vlnitý, vroubkovaný, cípatý, laločnatý, vláknitý),

e) konzistence kolonie (kašovitá, slizovitá, moučná, kožovitá),

f) barva kolonie a jejího rubu,

Strana39

g) barvivo uvolňované do prostředí,

Vzhled kolonie je silně ovlivněn stářím kultury i kultivačními podmínkami.

Mladší kolonie jsou vždy hladší s rovnějšími okraji a teprve později se může objevit

rýhování, zdrsnění a různé nerovnosti. Určitý druh bakterií nebo kvasinek se může

vyskytovat v několika morfologických typech, z nichž nejdůležitější jsou :

M – (mukoidní), mající vlhké slizovité velmi lesklé kolonie, tvořené opouzdřenými

buňkami (viz kap. ),

S – (z angl.smooth = hladký), tvořící hladké kolonie s rovným okrajem a mírným

leskem nebo bez lesku , buňky netvoří pouzdra,

R – (z angl.rough = drsný), tvořící drsné až silně zvrásněné, suché, poměrně nízké

kolonie, které se většinou široce rozrůstají a mají nerovné okraje; obvykle se

vyskytuje několik R–−typů, které se liší výškou kolonie a hrubostí jejího zvrásnění.

Změny M-S-R nastávají v důsledku mutace a následující selekce. Při izolaci

mikroorganismů z infekčního materiálu získáváme většinou M-kmeny, u nichž se však

po několikerém pasážování na umělých půdách selektují S-kmeny. Z těchto S-kultur

můžeme většinou jen velmi obtížně získat opět M-formu.

Složení živné půdy silně ovlivňuje fenotypové vyjádření M, S a R genotypů.

Např. vysoké koncentrace (15-20%) zkvasitelných sacharidů podporují tvorbu slizu u

M-typů a také S-typy zde tvoří hladké poměrně lesklé kolonie, neboť silné kvašení

potlačuje fenotypové vyjádření některých drsných genů. Ještě výraznější účinky mají

tenzidy (viz kap. ), které vedou k tvorbě hladkých a často i lesklých kolonií i u R-typů.

Jak již bylo řečeno (kap. ), je výskyt drsných kolonií spojen s povrchovým růstem

v tekutém prostředí, a dále s tvorbou řetízků buněk u bakterií a pseudomycelia nebo

pravého mycelia u kvasinek (viz kap. ), se změnou složení buněčné stěny a často i

zintenzivněním aerobního metabolismu na úkor kvasných schopností. Z bakterií se R-

typy nejčastěji vyskytují u rodu Bacillus. Z kvasinek u oxidativních rodů

Pichia,Hansenula,Candida,Sporobolomyces, a těch rodů, které tvoří přechod mezi

kvasinkami a plísněmi (Endomyces,Eremothecium,Trichosporum). Vzácněji se R-typy

také vyskytují u typicky kvasných druhů kvasinek jako je např. Saccharomyces

cerevisiae.

3.1.4 Obrovské kolonie

Strana40

Charakter růstu v obrovských koloniích se sleduje u kvasinek a plísní. U

kvasinek se vyšší vrstva sladinového agaru (půda ) zaočkuje v jednom místě (nejlépe

ve středu) kapkou suspenze mladších buněk ve fyziologickém roztoku (o koncentraci

107-109 buněk/ml), jež se sem přenese očkovací kličkou. Inkubuje se za optimálních

podmínek a pozoruje v jednoden-ních intervalech po dobu 14 dnů. Vyhodnocení je

obdobné jako u jednobuňkových kolonií (kap ), navíc se zde však mohou vyskytovat

různé sektory, vzniklé v důsledku genetické nejednotnosti suspenze nebo mutací

vzniklých v průběhu růstu, případně i v důsledku sporulace během kultivace. Vznik a

pomnožení některých typů mutantů se projevuje jako drobné papily na povrchu kolonie,

které jsou v některých případech tak husté, že připomínají drsný typ kolonií.

U plísní připravujeme obrovské kolonie přenesením spor do středu sladinového

nebo Czapek-Doxova agaru v Petriho misce. Často se spory očkují na tyto půdy do tří

bodů odpovídajících vrcholům rovnostranného trojúhelníka vzdálených asi 3 cm od

kraje misky (obr ). K očkování se použije očkovací klička, jejíž okrajem se dotkneme

agarové půdy. Aby se spory při očkování nerozptýlily po celé živné půdě, je vhodné

očkovat desky zespoda, při čemž je Petriho miska dnem vzhůru.

Obrovské kolonie se vyhodnocují po kultivaci při optimální teplotě po dobu 2-5

dnů (případně i déle), postupuje se při tom stejně jako při vyhodnocování růstu plísní na

šikmém agaru (kap ).

3.1.5 Růst podél vpichu do agarové půdy

Typ růstu podél vpichu do svislé vrstvy agarové půdy určuje nejen morfologické

znaky, ale i nároky mikroorganismu na kyslík. Aerobní mikroorganismy rostou

v hořejší části vpichu, anaerobní ve spodní části a fakultativně anaerobní po celé délce

vpichu. Růst podél vpichu se sleduje pouze u bakterií. Používá se masopeptonový

agar(půda ) a jako inokulum slouží 24 h bujonová kultura. Postup očkování vpichem je

uveden v kap . Růst se vyhodnocuje v jednodenních intervalech při inkubaci za

optimální teplotě ( většinou 30-37°C). U fakultativně anaerobních bakterií rozlišujeme

tyto typy růstu ( obr. ) : spojitý, bodový (čočkovitý), kartáčovitý, kořínkovitý

(rhizoidní).

Strana41

3.2 Mikroskopické morfologické a cytologické znaky mikroorganismů

Důležitými mikroskopickými morfologickými znaky jsou tvar, velikost a

uspořádání buněk, způsob rozmnožování a přítomnost zvláštních orgánů.

Mikroskopické hodnocení doplňujeme vždy makroskopickým posouzením kultury.

3.2.1 Typy mikroskopických preparátů

Mikroskopická hodnocení provádíme nejčastěji v mikroskopickém preparátu.U

některých plísní a vzácněji u kvasinek jsou pro mikroskopování vhodné ještě tzv.

sklíčkové kultury nebo kultury na celofánu ( viz kap ). Pozorujeme-li suspenzi živých

nebarevných buněk na podložním sklíčku, hovoříme o nativním preparátu. Pro

diferenciované vybarvení určitých složek buňky nebo k rozlišení živých a mrtvých

buněk (viz mikroskopie kvasinek ) připravujeme vitálně barvený preparát. U bakterií se

nejčastěji používá preparát barvený po fixaci, neboť bakteriální buňky jsou většinou

bezbarvé a jejich tvar i struktura jsou bez barvení ve světelném mikroskopu málo

zřetelné.

3.2.2 Fixace preparátu

Účelem fixace je usmrcení buněk, neboť mrtvé buňky přijímají snáze barvivo, a

dále přilnutí buněk k podložnímu sklíčku, aby nebyly barvícím roztokem nebo při

oplachování odplaveny. Bakterie fixujeme nejčastěji plamenem, kvasinky a plísně

většinou chemikáliemi, (např. ethanolem, acetonem), neboť plamenem se již značně

mění jejich tvar. Fixace kvasinek a plísní se provádí pouze při speciálních typech

barvení a její postup bývá uváděn spolu s pří-slušným barvícím postupem.

Fixace plamenem. Odmaštěné podložní sklíčko protáhneme plamenem,

asepticky na ně přeneseme suspenzi bakterií, rozetřeme na plochu cca 2 cm2 a necháme

vyschnout na vzduchu. Pak sklíčko nátěrem vzhůru třikrát protáhneme nesvítivým

plamenem kahanu a po vychladnutí barvíme. Vyšetřujeme-li kulturu z tekutého

cukernatého prostředí, je nejlépe získat buňky odstředěním a suspendovat je vodě nebo

Strana42

ve fyziologickém roztoku, neboť sacharidy v plameni karamelizují a znesnadňují pak

barvení a mikroskopování.

3.2.3 Barvení mikroorganismů

Pro barvení mikroorganismu se nejčastěji používají zředěné vodné roztoky

organických barviv. Jde obvykle o sole, jejichž barevná složka je kationtem (tzv.bázická

barviva) nebo aniontem (tzv. kyselá barviva). Pro barvení bakterií nebo jádra

eukaryotních mikroorganismů se většinou používají bázická barviva (např. krystalová a

genciánová violeť, methylenová modř, safranin, zásaditý fuchsin, vesuvin a malachitová

zeleň). Kyselá barviva (např. kyselina pikrová, eosin), se používají pouze pro vybarvení

cytoplazmy eukaryotních mikroorganismů.

Intenzitu vybarvení zásaditými barvivy zvyšuje zásaditá reakce prostředí, u

kyselých barviv kyselá reakce. Při barvení se uplatňují jak fyzikální procesy (difuze,

adsorpce), tak procesy chemické. Některé chemické sloučeniny (např. fenol, anilin,

chromová kyselina, tanin) způsobují sytější vybarvení objektů a jejich aplikace se

označují jako moření. Účinek většiny mořidel spočívá v tom, že mají větší afinitu

k buňce i k barvivu, než je afinita mezi buňkou a barvivem, takže hrají úlohu jakéhosi

prostředníka. Podle účelu barvení rozlišujeme :

1) Jednoduché barvení, které slouží k dobrému rozlišení tvaru buněk.

2) Diferenciační barvení, jež slouží k rozlišení jednotlivých morfologických útvarů

(např. jádra, spor, buněčné stěny) nebo chemických složek buněk (volutinová zrna,

glykogen, škrob, tukové kapičky.

3) Diagnostické barvení, jež slouží jako pomůcka při identifikaci mikroorganismů.

Nejpoužívanější je Gramovo barvení a acidorezistenční barvení.

Cv.3.1 Aseptický postup při přípravě mikroskopického preparátu

Potřeby : Podložní sklíčka, očkovací jehla, krycí sklíčka, zkumavka s kulturou.

Provedení :

1. Ožehni podložní sklíčko a polož je na filtrační papír blízko plamene.

2. Do levé ruky uchop zkumavku, do pravé očkovací jehlu a vysterilizuj jehlu a zátku

v pla-meni (obr. ). Malíčkem a dlaní vyjmi zátku ze zkumavky a po ochlazení

Strana43

kličky na půdě naber malé množství kultury. Znovu ožehni okraj zkumavky i

vatovou zátku a uzavři zku-mavku. Pak přenes buňky s kličky doprostřed

podložního skla a očkovací jehlu ožehni v plameni. U kultury s povrchu agarové

půdy se lehce dotkni ochlazenou kličkou kolonie nebo nátěru, abys přenesl malé

množství buněk (asi jako špendlíková hlavička), rozmíchej buňky s kličky jejím

krouživým pohybem v kapce vodovodní vody nebo fyziologického roztoku na

podložním skle a pak jehlu ožehni.

3. Při přípravě nativního preparátu přikryj suspenzi buněk na podložním skle čistým

krycím sklíčkem tak, aby v preparátu nebyly vzduchové bublinky. Sklíčko

nepřikládej najednou celou plochou, ale nejdříve jednou hranou. K manipulaci

s krycím sklíčkem použij pinzetu nebo ber krycí sklíčko za hrany. Přebytečnou

kapalinu odsaj filtračním papírem, ale nepři-tlačuj, aby nedošlo k poškození buněk.

Nativní preparát je nutno ihned mikroskopovat, ne-boť ve vyschlém preparátě jsou

buňky nezřetelné. Jde –li o fixovaný preparát, nech suspenzi zaschnout na vzduchu

nebo vysoko nad plamenem a pak postupuj podle fixačního předpisu.

3.2.4 Světelná mikroskopie bakterií

U bakterií zjišťujeme :

1. Tvar a velikost buněk (koky nebo tyčinky, u tyčinek též jejich délku, charakter

konců a pří-padné zakřivení),

2. uspořádání buněk (jednotlivé, v řetězcích, ve shlucích nebo balíčcích),

3. přítomnost a charakter vláken (větvená, nevětvená),

4. přítomnost spor, jejich tvar, velikost (rozšiřuje či nerozšiřuje buňku) a umístění

(centrální, terminální, subterminální či excentrické),

5. přítomnost pouzder.

Všechny tyto znaky zjišťujeme v barevných preparátech. Přítomnost bočíků

zjišťujeme obyčejně nepřímo, tj. z pohybu buněk v nativním preparátu. Přímé zjištění

tvaru, počtu a uspořádání bičíků je možná pomocí elektronového mikroskopu (viz kap

). Mikroskopicky hodnotíme morfologické znaky makroskopické znaky (viz kap ).

Cv.3.2 Jednoduché barvení bakterií po fixaci a jeho hodnocení

Potřeby : Bakteriální kultura, roztok krystalové violeti (roztok č. ) nebo karbol-

fuchsin (roztok č. ), imerzní olej, podložní skla, očkovací jehla.

Strana44

Provedení :

1. Na odmaštěné ožehnuté podložní sklíčko asepticky (viz kap ) nanes kapku

vyšetřovaného materiálu a rozetři na co největší plochu. Vyšetřujeme-li kulturu

z tuhé půdy, přenes ožeh-nutou a ochlazenou očkovací jehlou malé množství buněk

do kapky vody na podložní plochu. Pak ihned kličku ožehni.

2. Nátěr nech zaschnout na vzduchu nebo vysoko nad plamenem (sklo nesmí pálit při

položení na hřbet ruky) .Pak uchop sklo pinzetou a třikrát je pomalu protáhni

oxidační částí plamene kahanu tak, aby nátěr byl nahoře.

3. Po vychladnutí sklíčka pokryj nátěr buď roztokem krystalové violeti (Gramem I) na

15–−20 vteřin nebo karbolfuksinem na 30 vteřin.

4. Opláchni sklíčko slabým proudem vody, při čemž sklíčko je téměř ve svislé poloze a

voda dopadá nikoliv na nátěr, nýbrž na místo nad ním. Osuš sklíčko přiložením

papíru a dosuš vysoko nad plamenem. Na usušený nátěr kápni imerzní olej a

mikroskopuj (bez krycího sklíčka!) za použití imerzního objektivu (zvětšení 10 x

100).

5. Pomocí měkké tužky zakresli do protokolu nejčastěji se vyskytující buňky a jejich

uspořádání. Zjisti také přítomnost spor (jeví se jako nezbarvená tělíska uvnitř buněk

nebo jako nezbarvené válcovité útvary s tmavým obrysem), jejich tvar, poměr šířky

k délce a umístění v buňce. Poznávej také, zda jsou spory širší než vegetativní

buňky či nikoliv.

6. Zorné pole znázorni kruhem o průměru 10 cm a ve stejném poměru zvětši také

zakreslené útvary. Stručně popiš veškeré mikroskopické morfologické znaky.

V protokolu uveď stáří kultury, živnou půdu, mikroskopické zvětšení a

makroskopické znaky mikroskopované kultury.

Poznámka :

Preparát nesmí být příliš hustý a nesmí obsahovat shluky buněk v důsledku

jejich špat-ného rozmíchání. Jednotlivé buňky nebo jejich řetízky musí být od sebe

dostatečně vzdálené, aby byl zřetelný jejich tvar a velikost.

3.2.5 Nativní preparát pro důkaz pohybu buněk

Bakteriální buňky, které mají na svém povrchu bičíky, jsou schopny aktivního

pohybu, který je přímočarý, vířivý, krouživý nebo nepravidelný a je způsoben rotací

Strana45

bičíků. Tento pohyb je nutno rozlišovat od pasivního pohybu způsobeného buď

proudem kapaliny nebo kinetickou energií molekul kapaliny, jež narážejí na bakteriální

buňky a způsobují její kmitavý pohyb, (tzv. Brownův pohyb). Aktivní pohyb bakterií

ustává po usmrcení buněk dezinfekčním prostředkem, čímž jej můžeme snadno rozlišit

od pasivního pohybu. Pohyb buněk nutno sledovat u malých, intenzivně se

rozmnožujících buněk z kapalné půdy a je nutno se vyhnout třepání nebo jinému

nešetrnému zásahu, neboť bičíky se velmi snadno lámou. Aktivní pohyb pozorujeme

v nativním preparátu nebo v tzv. visuté kapce, tj. v kapičce kultury na krycím sklíčku,

jež je obklopeno na prohlubeň ve zvláštním podložním skle (Kochova komůrka) nebo

na skleněný prstenec přilepený kanadským balzámem na podložní sklo (Böttcherova

komůrka, viz obr. ).

Cv.3.3 Důkaz pohybu buněk

Potřeby : 18 hodin stará kultura Bacillus subtilis, podložní sklo nebo Kochova

komůrka (případně Böttcherova komůrka (obr. ), krycí sklíčko, vazelína, stěteček,

dezinfekční roztok (0,5% ní roztok Ajatinu), pipeta.

Provedení :

A. Na podložním skle :

1. Na odmaštěné ožehnuté podložní sklo asepticky přenes kapku bujonové kultury,

překryj opatrně krycím sklíčkem (nepřitiskuj!) a mikroskopuj zvětšením 10×60.

Pozoruj, zda se buňky pohybují a popiš charakter pohybu.

2. Ze strany krycího sklíčka přidej pipetou kapku dezinfekčního prostředku a zjisti, zda

pohyb ustává.

Poznámka :

V případě, že chceš pohyb buněk pozorovat imerzí, je nutno přebytečnou

kapalinu preparátu opatrně odsát ze strany pomocí filtračního papíru a krycí sklíčko

přilepit k pod-ložnímu sklu jeho orámováním vazelínou. Pak na krycí sklíčko kápni

imerzní olej a pozoruj zvětšením 10×100 až 20×100.

B. Visutá kapka :

1. Na krycí sklíčko přenes asepticky kapku mladé bujonové kultury a překlop krycí

sklíčko kapkou dolů na prohlubeň Kochovy nebo Böttcherovy komůrky (obr. ), jež

má okraj prohlubně natřený vazelínou, a přitiskni. Pozoruj zvětšením 10×60 nebo

Strana46

kápni na krycí sklíčko imerzní olej a pozoruj zvětšením 10×100 až 20×100. Zjisti,

zda se buňky pohybují aktivním pohybem.

2. Paralelně připrav visutou kapku stejným způsobem jen s tím rozdílem, že do kapky

kultury na krycím sklíčku přidáš kapku dezinfekčního prostředku, a pozoruj, zda se

buňky ještě pohybují.

Poznámka :

Pozor na promáčknutí sklíčka imerzním objektivem!

3.2.6 Negativní barvení bakterií

Jestliže máme měřit velikost bakteriálních buněk, nemůžeme je fixovat ani

barvit, neboť tyto zásahy velikost buněk mění. V tomto případě barvíme pozadí, od

něhož se světlé buňky jasně odrážejí. Používáme zředěnou tuž, roztok nigrosinu nebo

roztok konžské červeně. Důležité je, aby buňky byly dostatečně zředěné a nevytvořily

shluky a aby vytvořily na podložním skle tenký rovnoměrný film, který není příliš

tmavý.

Cv.3.4 Negativní barvení bakterií

Potřeby : Kultura bakterií v tekutém živném prostředí, Dornerův roztok nigrosinu (

roztok č. ), 2,5%ní vodný roztok konžské červeně, 1%ní roztok HCl, roztok krystalové

violeti (roztok č ), podložní skla, imerzní olej, očkovací jehla.

Provedení :

A :

1. Aseptickým způsobem (viz kap. ) přenes 2-3 kličky mikrobiální suspenze z tekuté

půdy na důkladně odmaštěné podložní sklo, přidej kličku nigrosinového roztoku

nebo co nejmenší množství čerstvě přefiltrované tuše, důkladně rozmíchej a rozetři

na co největší plochu, pokud možno po celém podložním skle. K tomuto účelu

můžeš použít také druhého podložního skla, které se přiloží v úhlu cca 45°

k prvnímu sklu (obr. ) a zvolna se po něm táhne (případně i několikrát) ve směru

tupého úhlu. Toto pomocné sklo se ihned ožehne.

2. Preparát na prvním podložním skle nech oschnout na vzduchu. Nefixuj! Nátěr na

podložním skle se má pouhému oku jevit jako tmavě šedý. Příliš světlý preparát je

málo kontrastní, příliš tmavý vůbec nepropouští světlo a po vyschnutí na vzduchu se

v barvivu objevují světlé trhliny. Proto se doporučuje při použití pomocného

Strana47

podložního skla jeho postupným větším přitlačováním plynule měnit vrstvu barviva

a při mikroskopování najít jeho nejvhodnější koncentraci. Většinou je zapotřebí

přípravu preparátu několikrát opakovat, než se dosáhne vhodná koncentrace barviva.

3. Pozoruj olejovou imerzí zvětšením 10×100 a zakresli. Buňky jsou světlé na šedém

až namodralém pozadí.

4. Připrav na dalším podložním skle ještě preparát fixovaný plamenem a barvený

krystalovou violetí (viz kap. ), mikroskopuj s olejovou imerzí a srovnej

s preparátem barveným nativně.

B :

1. Ke kratší straně dobře odmaštěného podložního skla kápni roztok konžské červeně a

rozmíchej do ní 2-3 kličky asepticky odebrané bujónové kultury bakterií.

2. Druhé dobře odmaštěné podložní sklo přilož ke kapce v úhlu cca 45° ( obr. ) a

zvolna je táhni po prvním skle ve směru tupého úhlu, takže barvivo se hrne před

pohybujícím se sklem po celé ploše prvního skla, na níž vytvoří souvislý povlak.

Pak druhé sklo ožehni a první s negativně obarveným preparátem nech na vzduchu

oschnout. Nezahřívej!

3. Suchý preparát opláchni 1%ní HCl a ihned kapalinu ocákni ,ale neoplachuj. Po

usušení na vzduchu mikroskopuj s olejovou imerzí (zvětšení 10×100) a srovnej

s preparátem fixovaným teplem a barveným krystalovou violetí (viz kap. ).

3.2.7 Barvení spor rodů Bacillus a Clostridium

Spory rodu Bacillus a Clostridium se velmi těžko barví i po fixaci, což je

způsobeno jejich silným, špatně prostupným obalem. Při jednoduchém barvení po fixaci

plamenem(viz kap. ) zůstanou proto nezbarveny a vybarví se pouze jejich obal (tzv.

negativní barvení spor). Obarví-li se však spory po předchozím moření nebo za tepla

pomocí silných barviv, těžko se odbarvují kyselinami (tzv. acidorezistence) nebo jinými

sloučeninami. Pro zjištění tvorby spor jsou vhodné 2-3 dny staré kultury na tuhých

půdách, neboť v mladých intenzivně rostoucích kulturách se spory netvoří. Uvádíme

Möllerovu metodu barvení spor.

Cv.3.5 Barvení spor rodů Bacillus a Clostridium

Strana48

Potřeby : 2-3 dny stará kultura Bacillus subtilis na masopeptonovém agaru, 5%ní

kyselina chromová, karbofuchsin(roztok č. ), methylenová modř (roztok č. ), 5%ní

kyselina sírová.

Provedení :

1. Připrav aseptický nátěr na podložním skle, usuš a fixuj plamenem.

2. Moř kyselinou chromovou 10 min, opláchni vodou, pokryj nátěr karbofuchsinem a

zahřívej nad mírným plamenem 2 min (počítáno od výstupu par). Barvivo nesmí na

preparátu vyschnout.

3. Po zchladnutí opláchni vodou, odbarvuj kyselinou sírovou 10-20 s a opláchni

vodou, osuš a mikroskopuj s imerzí.

Poznámky :

1. Spory aktinomicet se barví stejně dobře jako vegetativní buňky, takže je od vláken

vegetativních buněk můžeme rozpoznat pouze z jejich kulovitého nebo

tyčinkovitého tvaru.

2. Některé kmeny sporotvorných bakterií ztratily v důsledku mutace některé z genů,

nutných pro sporulaci, schopnost tvořit spory, což činí značné potíže při identifikaci

těchto bakterií.

3.2.8 Gramovo barvení

Barvení podle Grama je jednou z nejdůležitějších diagnostických metod při

určování rodů a druhů bakterií. V podstatě jde o barvení fixovaného preparátu a

následující moření buněk jodovým roztokem, čímž vzniká komplex barvivo-jod-

buněčné složky. Tento komplex lze z buněk některých rodů nebo druhů

mikroorganismů vyplavit ethanolem nebo acetonem, takže se buňky odbarvují a

příslušné druhy jsou označovány jako gramnegativní (G-) na rozdíl od těch, jejichž

buňky si ponechávají zbarvení i po působení těchto rozpouštědel a jsou označovány

jako grampozitivní (G+). Stářím kultury se většinou grampozitivnost ztrácí, a proto

používáme 24 h staré kultury. Buňky některých druhů mikroorganismů jsou však i

v mladé kultuře někdy G+ a někdy G- a jsou proto označovány jako gramlabilní (G±).

Podstata rozdílného chování G+ a G- mikroorganismů při Gramově barvení nebyly

dosud s konečnou platností vysvětlena. Pravděpodobně se zde nejvíce uplatňují rozdíly

ve složení buněčné stěny obou skupin bakterií. Gramovo barvení má několik

Strana49

modifikací, z nichž nejrychlejší a proto nejčastěji používaná je modifikace Nowyho,

kterou uvádíme.

Cv. 3.6 Barvení podle Grama

Potřeby : 24 hodin staré kultury sledovaných bakterií a kontrolních mikroorbanismů

(Mi-crococcus roseus jako G+ a Serratia marcescens jako G-), Gram I, tj. roztok violeti

(roztok č.), Lugolův jodový roztok (roztok č. ), aceton, roztok safraninu (roztok č. ),

nesterilní pipeta 10 ml.

Provedení :

1. Na jedno podložní sklíčko připrav doprostřed nátěr zkoušené kultury a po stranách

nátěr kontrolních G+ a G- kultur, usuš a fixuj plamenem.

2. Barvi 15–20 vteřin čerstvě přefiltrovaným roztokem krystalové violeti, slij

přebytečné barvivo, ale neoplachuj vodou.

3. Překryj Lugolovým roztokem na 15–20 vteřin, kapalinu slij.

4. Opláchni rychle acetonem (pokud preparát pouští barvivo, maximálně však 15

vteřin), opláchni vodou a odcákni.

5. Dobarvuj safraninem 1 minutu, opláchni vodou, usuš a mikroskopuj s imerzí. G+

druhy jsou zbarveny fialově, G- červeně.

Poznámky:

1. Gramovo barvení vyžaduje přesnou práci, nepříliš hustý preparát, který se během

krátkého působení barviva může probarvit a pomocí acetonu pak okamžitě odbarvit.

Většinou se Gramovo barvení zdaří až po několikerém opakování. Z těchto důvodů

je nutné současně s ne-známou kulturou barvit vždy také buňky kontrolních G+ a G-

bakterií. Nejčastější chyby při barvení jsou :

a) hustý preparát,

b) sušení preparátu za tepla (tj.“uvaření buněk“),

c) příliš dlouhé odbarvování acetonem.

2. U jednotlivých jednobuňkových kolonií můžeme Gramovu reakci zjistit pomocí

rychlého testu s KOH, založeného na rozdílném složení buněčné stěny u G+ a G-

bakterií.

Postup kontrolního testu jednobuňkových kolonií :

Strana50

Na podložní sklo kápni 3%ní roztok KOH a do něho pomocí sterilní kličky

rozmíchej část bakteriální kolonie.

Při pomalém odtahování kličky směrem vzhůru pozoruj,zda se v průběhu 1 sekundy

tvoří viskózní hmota táhnoucí se ve formě nitky =G-.

U G + druh“ bakterií se tato viskózní hmota netvoří, neboť silná peptido-glykanová

vrstva jejich buněčné stěny je k účinkům louhů odolná.

Tento test ovšem nemůžeme používat při kontrole čistoty kultury ze šikmého

agaru nebo z tekuté půdy a při testován čistoty kolonií slizotvorných bakterií (viz kap.

).

3.2.9 Příprava trvalých preparátů bakterií

V některých případech je vhodné uchovat si obarvený preparát bakterií jako

srovnávací nebo dokumentační materiál. V těchto případech odstraníme po

mikroskopické prohlídce preparátu imerzní olej opláchnutím xylenem a vysušíme na

vzduchu. Pak na nátěr kápneme kanadský balzám, přikryjeme odmaštěným krycím

sklíčkem a jemně přitiskneme, aby balzám vyplnil celý prostor mezi podložním a

krycím sklíčkem. Tento tlak prsty musí trvat 2-3 min. Preparát necháme vyschnou na

temném místě (nejlépe v zásuvce) asi dva týdny a pak seškrábeme přebytek zaschlého

balzámu kolem okrajů krycího sklíčka a preparát uchováváme v su-chu a temnu. Tento

postup je vhodný pro barvené preparáty připravené podle kap. .

3.2.10 Světelná mikroskopie kvasinek

Při mikroskopování kvasinek sledujeme především morfologii buněk, tj. jejich

tvar (kulovitý, vejčitý, elipsoidní, obdélníkovitý, trojúhelníkovitý, válcovitý, apikulátní)

a velikost, způsob vegetativního rozmnožování, tj. dělení, pučení (polární, bipolární,

multilaterální) nebo pučení na široké základně. Dále zjišťujeme přítomnost

pseudomycelia nebo pravého mycélia s blastosporami, typ spájení (izogamní,

heterogamní), tvorbu askospor, jejich tvar, počet a u-spořádání v asku, tvorbu

balistospor, teliospor, sporidií nebo chlamydospor. Všechny tyto znaky mají prvořadý

význam při určování rodů kvasinek. V některých případech můžeme z tvaru a velikosti

buněk usuzovat i na fyziologické vlastnosti. Fyziologický stav buněk v kul-tuře je však

patrnější z mikroskopického sledování struktury buněčného obsahu a z množství

určitých chemických složek cytoplazmy, např.glykogenu a tuku.

Strana51

Při sledování tvaru a struktury buněk kvasinek připravujeme obyčejně nativní

preparát (kap. ) ve vodě nebo ve fyziologickém roztoku (roztok č. ). V tomto preparátu

je patrná buněčná stěna, protoplasma, vakuoly. Buněčné jádro má stejný index lomu

jako cytoplasma, a proto je zřetelné až po speciálním barvení (viz kap. ). V pučících

buňkách je jádro zřetelné v nativním mikroskopovaném preparátu pomocí fázového

kontrastu. Cytoplasma mladých bu-něk je obvykle homogenní bez zřetelné struktury.

Při stárnutí buněk se v ní objeví drobná zrníčka, jež se zvětšují a vytvářejí prstenec

uprostřed buňky. Později vzniká v místě prstence blána vakuoly. Vakuola se stářím

roste, až může vyplňovat celou buňku.

Současně s mikroskopickým sledováním morfologie daného kmene kvasinek

sledujeme i makroskopické morfologické znaky (viz kap. ), které zjišťujeme ve sladině

(půda č. ) a na sladinovém agaru (půda č. ), případně též na sladinové želatině (půda č.

).

Cv.3.7 Nativní preparát kvasinek

Potřeby : 24–48 h kultury kvasinek na sladině nebo sladinovém agaru, podložní

sklíčko a

krycí sklíčko, očkovací jehla.

Provedení :

1. Připrav asepticky nativní preparát kvasinek na podložní sklíčko podobně jako u

bakterií (viz kap. ), a pozoruj jej při zvětšení 10×45 nebo 10×60.

2. Zjisti tvar buněk a jejich vnitřní strukturu, způsob vegetativního rozmnožování,

přítomnost pseudomycelia nebo mycelia, blastospor a balistospor.

3. Poznávej také charakter růstu na tuhé půdě i v tekutém prostředí (pro jeho

hodnocení viz kap. ).

4. Povšimni si spojitosti tvaru buněk s charakterem nátěru i se způsobem růstu

v kapalině :kmeny s velmi protáhlými buňkami (např. rod Pichia, někteří příslušníci

rodu Hansenula a některé R mutanty rodu Saccharomyces) mají drsný až zvrásněný

povrch kolonií a v kapalině rostou ve formě křísu, tj. zvrásněné suché blanky na

jejím povrchu, kdežto krátce oválné buňky tvoří hladké kolonie a sedlinu v kapalině.

Poznámky :

1. Je-li preparát zakalen, přidej ze strany kapku asi 5%ního KOH nebo 1%ní HCl a

přebytečnou kapalinu na druhé straně odsaj. Lépe se však osvědčuje přidat louh

nebo kyselinu přímo ke kapce kultury na podložní sklo před pokrytím krycím

sklíčkem. Je-li v preparátě mnoho poškozených buněk, může to být způsobeno :

Strana52

a) přílišným přitlačením krycího skla k podložnímu, např. při vysávání

přebytečné kapaliny. Z buněk zůstávají jen prázdné buněčné stěny a

protoplasma je formě zrníček rozptýlena v kapalině;

b) jehla nebyla řádně ochlazena;protoplasma vějířkovitě vyhřezává z buněk.

2. Balistospory, tj. spory odmršťované ze zvláštních stopeček (sterigmat) a tvořené jen

u tří rodů kvasinek (Sporobolomyces, Bullera a Spiridiobolus) se v nativním

preparátu ze svých stopeček velmi snadno uvolňují a tyto stopky jsou dosti těžko

odlišitelné od normálních výběžků mycelia.

3. Bezpečně lze balistospory zjistit ze zrcadlového obrazu kolonií, který se vytvoří na

víčku Petriho misky nad zaočkovanou deskou sladinového agaru po inkubaci 4-10

dnů při 16−20° C. Někteří autoři doporučují na víčko Petriho misky nakapat před

inkubací sladinový agar, takže se místo vrstvy spor objeví přímo zrcadlové kolonie.

3.2.10.1 Sledování tvorby pseudomycelia, mycelia a blastospor kvasinek ve sklíčkové kultuře

Tvorba psedomycelia, tj. zaškrcovaných vláken tvořených protáhlými buňkami,

a pravého mycelia je charakteristické pro některé rody kvasinek (Candida,

Endomycopsis, Trichosporon, atd.), ale i pro některé drsné, tj. R mutanty rodů, jež

pseudomycelium obyčejně netvoří (např. Saccharomyces). Vývoj pseudomycelia je

podporován přítomností vzdušného kyslíku, nepřítomností zkvasitelných cukrů v živné

půdě, přítomností škrobu a některých dusíkatých sloučenin, např. asparaginu apod.

Všem těmto podmínkám vyhovuje bramborový agar ( půda č. ). Pro diagnostické účely

je důležitý tvar a uspořádání blastospor, tj. svazků buněk pučících z pseudomycelia

nebo mycelia. Blastospory se vyskytují v chomáčcích, přeslenech nebo

v nepravidelných větvích. Jelikož se svazky blastospor v nativním preparátu

v jednotlivé buňky, je vhodné sledovat jejich uspořádání přímo v sklíčkových kulturách

na bramborovém agaru.

Cv.3.8 Sledování tvorby pseudomycelia, mycelia a blastospor kvasinek

Potřeby : kultura sledovaných kvasinek (Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae

apod.), sterilní Petriho miska, podložní skla, sterilní voda, podložky pod sklíčka, tj.

skleněné tyčinky zahnuté do tvaru U ,skleněná tyčinka, bramborový agar (půda č. ),

kovová pinzeta.

Strana53

Provedení :

1. Vysterilizuj podložku v plameni a vlož (pomocí ožehnuté pinzety) do Petriho misky.

2. Na vysterilované podložní sklo, přenes kapku roztavené půdy a rozetři pomocí

pomocí ožehnuté tyčinky do tenké vrstvy (0,5–1 mm). Pak vlož sklíčko na

podložku.

3. Připrav řídkou suspenzi kultury ve sterilní vodě a jedním očkem udělej na ztuhlé

půdě na sklíčku několik teček. Na dno Petriho misky vlij několik ml sterilní vody.

4. Inkubuj misku se zaočkovaným podložním sklem při 28°C a každý den pozoruj

pouhým okem, zda se vytvářejí na povrchu agaru kolonie s výběžky pseudomycelia.

5. V pozitivním případě, většinou po 4-5 dnech, vyjmi sklíčkovou kulturu z Petriho

misky, pozoruj mikroskopem (bez přiložení krycího sklíčka) a zakresli do protokolu

charakter pseudomycelia a blastospor.

Poznámka :

Místo roztírání půdy po sklíčku se doporučuje ponořit sklíčko pomocí ožehnuté

pinzety do roztavené půdy v Petriho misce. V tomto případě je třeba agar se spodní

strany sklíčka před mikroskopováním očistit, nejlépe pomocí buničité vaty.

3.2.10.2 Sledování askospor kvasinek

Askospory se tvoří u některých rodú kvasinek (např. Saccharomyces,

Schizosaccharomyces, Hansenula, Pichia, Nadsonia atd.). Vznikají v diploidní nebo

polyploidní buňce (viz kap. ), jež se tím přeměňuje v askus a jsou výsledkem

pohlavního rozmnožování charakterizovaného spájením dvou haploidních buněk (viz

kap. ). Pro tvorbu askospor je nezbytný aerobní metabolismus, takže se tyto spory

většinou tvoří pouze za nepřítomnosti zkvasitelných cukrů (např. ve starých kulturách

na sladinovém agaru, na speciálních půdách obsahující octan draselný jako zdroj uhlíku

– půda č. ). Pouze rody, u nichž se nevyskytuje hexosová represe dýchání (např.

Schizosaccharomyces a Kluyveromyces) sporulují i v přítomnosti sacharidů. Některé

rody kvasinek sporulují dobře na půdách s výluhy z různých druhů zeleniny (půda č. )

nebo na půdě Gorodkové (půda č. ). Obyčejně je nutno použít několika sporulačních

půd, abychom mohli tvrdit, že studovaný kmen nesporuluje. Bližší o spoulačních

půdách, vhodných pro různé rody kvasinek (viz van der Walt v Lodder J. (ed.): The

Yasts.Ataxonomic Study, North-Holland, Amsterodam, 1970).

Důležitým požadavkem sporulace je dobrý fyziologický stav buněk, a proto je

nutno diploidní buňky těsně před sporulací kultivovat 48 h na bohaté živné půdě, např.

Strana54

na presporulačním agaru (půda č. ). U některých kmenů je doporučováno pasážování na

hroznovém moštu nebo jiných ovocných šťávách.

Průmyslově používané pivovarské a drožďárenské kmeny kvasinek většinou

sporulují jen vzácně a tvoří obyčejně jen 1-2 spory v asku, přestože charakteristický

počet spor pro dokonalý askus rodu Saccharomyces je příprava diploidních kmenů

z heterotalických haploidních kmenů S. cerevisiae i další postup při sporulaci těchto

kmenů je popsán v kap. .

Spory kvasinek sledujeme v nativním preparátu, neboť jejich silná stěna je dobře

patrná. Jejich cytoplasma láme světlo poněkud silněji než cytoplasma buněk,takže se

v mikro-skopu jeví poněkud světlejší. Důležitými diagnostickými znaky jsou tvar asku,

počet v asku (1, 1-4, 8, víc než 8) a jejich uspořádání, tvar spor a charakter jejich

povrchu.

Cv.3.9 Sledování askospor

Potřeby : 3 dny stará kultura diploidního kmene S.cerevisiae na desce sporulačního

agaru, 2-3 měsíce stará kultura tohoto kmene na šikmém agaru nebo 6 dnů stará kultura

diploidního kmene Schizosaccharomyces pombe na desce 4%ního sladinového agaru,

podložní sklíčka, krycí čka, očkovací jehla.

Provedení :

1. Z dodané kultury připrav nativní preparát do kapky vody a ihned mikroskopuj

zvětšením 10×45 nebo 10×60.

2. Zjisti tvar asků, počet a uspořádání spor v asku, jejich tvar (kulovitý, vejčitý,

ledvinovitý, kloboukovitý, jehlovitý, nepravidelný, hranatý) a povrch (hladký,

rýhovaný, bradavčitý) a zakresli do protokolu.

Poznámka :

Tvar asku a uspořádání spor v nich je závislý také na tvaru původní diploidní

buňky: velmi protáhlé buňky mají spory uspořádány lineárně, kdežto vejčité a krátké

buňky mají 4 spory v asku, jenž má průřez téměř kosočtvercový.

3.2.10.3 Rozlišování živých a mrtvých kvasinek vitálním barvením

Pro zjištění procenta mrtvých buněk v pekařském droždí, pivovarských

kvasnicích nebo během technologického procesu se používá barvení buněk

Strana55

methylenovou modří nebo jiným netoxickým barvivem. Při tomto postupu se vybarví

pouze mrtvé buňky a živé buňky zůstanou nezbarveny. Methylenová modř sama působí

slabě toxicky na kvasinky, zvláště v pří-tomnosti kyslíku, a proto je nutno zbarvený

preparát ihned mikroskopovat. Velmi důležité je dodržení žádaného pH barvícího

roztoku. Pro kontrolu vybarvení mrtvých buněk připravujeme vedle vitálně barveného

preparátu také preparát barvený po fixaci plamenem.

Cv.3.10 Rozlišení živých a mrtvých kvasinek

Potřeby : 24 h stará kultura ze sladiny, podložní a krycí sklo, roztok methylenové modře v pufru o pH 4,6 (roztok č. ). Provedení :

1. Do středu jedné poloviny podložního skla přenes kapku kultury, rozetři ji na větší

plochu a nech vysušit na vzduchu nebo nad mírným plamenem.

2. Suchý nátěr protáhni plamenem, abys usmrtil buňky, ale nepoškodil příliš jejich tvar

a strukturu.

3. Na fixovaný nátěr kápni roztok methylenové modře, druhou kapku barviva přenes

do středu druhé poloviny podložního skla a rozmíchej do ní očko kultury.

4. Přikryj obě kapky krycím sklem a pomocí zvětšení 10×45 pozoruj rozdíl ve zbarvení

buněk v obou preparátech. Mrtvé buňky se barví modře.

5. Spočítej zbarvené i nezbarvené buňky asi ve 20 zorných polích vitálního preparátu a

počet mrtvých buněk vyjádři v % celkového počtu buněk.

Poznámky :

1. Místo methylenové modře možno použít též 0,037mM roztok nilské modře.

2. Mrtvé buňky je možno zjistit také fluorescenční mikroskopií za použití akridinové

oranže (používá se roztok 1 : 5000 smíchaný s M/15 fosfátovým pufrem o pH 6,0

v poměru 1 díl barviva : 4 dílům pufru). Porušená plazma mrtvých buněk září

intenzivně červeně oproti matně zelené fluorescenci plazmy neporušených buněk.

Buňky žluté až oranžové již odumírají (zpravidla nejsou již schopny rozmnožování).

Buněčné stěny všech buněk září červeně, takže při rozostření dostávají živé buňky

červený nádech. Vakuoly bývají červené nebo tmavé. Při tomto postupu je nutný

dostatečný přebytek barvícího roztoku, jinak rozlišení poškozených buněk není

možné.

Strana56

3.3 Mikroskopické vláknité houby významné z potravinářského hlediska

Houby v širším pojetí (tj. houby a organismy houbového charakteru) náleží

celkem do tří různých říší (PROTOZOA, CHROMISTA a FUNGI). Houby v užším slova

smyslu (tj. vlastní houby – oddělení Eumycota), významné z potravinářského nebo

hygienického hlediska pro člověka, náleží do jediné říše – FUNGI.

Nadříše : PROKARYOTA

Nadříše : EUKARYOTA : říše Amalia

říše PLANTAE

říše FUNGI

říše PROTOZOA

říše CROMISTA

(Cavalier-Smith, 1986)

Ze systematického pohledu se do skupiny Fungi tradičně zařazují zygomycety

(pododdělení Zygomycotina), houby vřeckovýtrusé (pododdělení Ascomycotina),

houby konidiální (pododdělení Deuteromycotina) a houby stopkovýtrusé

(pododdělení Basidiomycotina).

Do říše hub patří jak mikroskopické houby, tak i houby makroskopické.

Aplikovaná mykologie a mikrobiologie často zjednodušuje botanický systém a

mikroskopické houby dělí na kvasinky a mikroskopické vláknité houby. Pro

mikroskopické vláknité houby častěji používá se termín PLÍSNĚ. Tento název byl

zaveden v 19.století botanikem J.S.Preslem. Jde o český ekvivalent anglického slova

moulds či německého Schimmelpilze.

Říše : HOUBY (Fungi)

Oddělení : VLASTNÍ HOUBY (Eumycota)

Pododdělení : ZYGOMYCETY (Zygomycotina)

VŘECKOVÝTRUSÉ HOUBY (Ascomycotina)

KONIDIÁLNÍ HOUBY (Deuteromycotina)

STOPKOVÝTRUSÉ HOUBY (Basidiomycotina)

3.3.1 Živné půdy pro izolaci mikroskopických hub z potravin

Strana57

Osvědčenou živnou půdou širokého použití je agar s půdním výluhem a

bengálskou červení obohacený streptomycinem (půda č. ). Tato půda potlačuje růst

některých bakterií a omezuje poněkud růst samotných hub, takže je lze lépe izolovat.

Použití agaru s půdním výluhem pro izolaci hub rozsevovou a zřeďovací

metodou se doporučuje kombinovat ještě s dalšími živnými půdami jako je :

Bramboromrkvový agar, sladinový agar, kukuřičný agar, Sabouradův agar a Czapek-

Doxův agar. Do všech těchto půd se přidává streptomycin (cca 3 mg/l). Rovněž lze

použít komerčně vyráběný DRBC agar s chloramfenikolem nebo O.G.Y.E agar

s oxytetracyklinem. Pro potravinářské vyšetření na přítomnost plísní ve vzorku se podle

ISO/ČN používají půdy obsahující kvasničný výtažek, glukosu a antibiotikum

(chloramfenikol nebo oxytetracyklin) pro potlačení růstu bakterií.

Pro izolaci xerofilních hub z potravin lze použít řadu živných medií s omezenou

dostupností vody, např. živnou půdu s glycerolem a dichloranem vyráběnou též

komerčně jako DG18.

3.3.2 Metody determinace

Na izolačních půdách je možné po mikroskopickém pozorování většinu

sporulujících hub určit do rodů, výjmečně i do druhů. Pro přesnou druhovou

diagnostiku se používají identifikační půdy. Diagnostika nadruhé úrovni však nepatří

mezi rutinní práce a vyžaduje určitou zkušenost a znalost.

V diagnostice mikroskopických vláknitých hub se uplatňují tři základní typy

metod :

1) Morfologické,

2) fyziologické, 3) biochemické.

Morfologické znaky mají primární význam pro identifikaci. Znaky fyziologické

a biochemické mají pouze doplňující charakter. Mezi fyziologické znaky patří např.

schopnost růstu při vyšší teplotě (37oC), schopnost využívat různé zdroje dusíku nebo

schopnost růstu na živných půdách s omezenou dostupností vody. Z biochemických

znaků mají význam sekundární metabolity, především mykotoxiny. Metody molekulární

biologie zatím nejsou pro běžnou identifikaci používané, dochází však k jejich

bouřlivému rozvoji.

Strana58

Získané poznatky molekulární taxonomie jsou zatím kusé, materiálově i časově

nákladné, a proto nedostupné pro řadu pracovišť. Ale ani morfologické metody, které

jsou nejdostupnější, neumožňují v řadě případů jednoznačnou druhovou identifikaci,

protože morfologické znaky nejsou zcela ostře vymezeny.

3.2.3 Preparáty mikroskopických vláknitých hub

1) Příprava mikroskopických preparátů

Mikroskopické morfologické znaky vláknitých hub se pozorují v nativním

preparátu. Jako pozorovací medium se většinou doporučuje voda. U konidiálních a

vřeckovýtrusných hub lze také použít laktofenol nebo samotnou kyselinu mléčnou

obarvenou např. methylenovou modří. Získáme polotrvalé preparáty, jejichž trvanlivost

lze prodloužit orámováním krycího skla nitrocelulosovým lakem nebo např. směsí

kalafuny a včelího vosku v poměru 7:2. Někteří autoři používají pro přípravu trvalých

preparátů komerčně dostupná zalévací media na bázi polyvinylalkoholu.

Příprava trvalých preparátů zygomycetů se nedoporučuje, neboť při jejich tvorbě

dochází k deformaci spor a k tvorbě různých artefaktů. V tomto případě je pozorovací

medium voda nebo 4% roztok genciánové violeti ve vodě.

2) Příprava sklíčkových kultur

Sklíčkové kultury jsou pro pozorování a diagnostice vláknitých hub často

využívány. Jejich výhodou je, že nedochází při jejich použití k porušení vnitřních

struktur hub, takže lze velmi dobře sledovat konidiogenezi a umístnění spor na hyfách.

Cv.3.11 Příprava sklíčkové kultury mikroskopické vláknité houby

Potřeby : sterilní podložní a krycí sklíčko, sterilní agarová půda, sterilní voda,

suspenze spor vláknité houby, očkovací jehla, sterilní Petriho miska, malá skleněná

zahnutá trubička,

Provedení :

1. Na sterilní podložní sklo kápneme rozehřátou agarovou půdu a lehkým

nakláněním rozlijeme kapku po povrchu.

2. Na ztuhlou agarovou vrstvu naočkujeme suspenzi spor.

3. Sklíčko umístníme do sterilní Petriho misky na sterilní kousek zahnuté skleněné

trubičky.

4. Přidáme na dno misky několik kapek sterilní vody a inkubujeme.

Strana59

5. Po několika dnech pozorujeme přímo vyrostlou mikrokulturu na podložním

sklíčku pod mikroskopem.

Poznámka :

Velmi dobré informace poskytuje i kultura narostlá mezi podložním a krycím

sklem.

3.3.5 Proměřování mikromorfologických struktur vláknitých hub

Pro měření velikosti buněk, spor, šířky hyf apod. používáme okulárové

mikrometrické měřítko, které vkládáme mezi očnici asběrnou čočku okuláru. Délka

stupnice okulárového měřítka je libovolná a je rozdělena na 100 dílků. Kalibraci

okulárového měřítka je nutno provést pro každý objektiv, okulár i pro mikroskop

s danou délkou tubusu.

Cv.3.12 Měření mikromorfologických struktur

A) Kalibrace okulárového mikrometru

Potřeby : Podložní sklo s vyrytou stupnicí (2 mm dělené na 200 dílků), okulárové

mikrometrické měřítko.

Provedení :

1. Obě měřítka nastavíme tak, že se jejich počátky stupnic shodují.

2. Pozorujeme, které další dílky (co nejvzdálenější) opět splývají.

Příklad : Nechť 55. dílek mikrometrického měřítka se shoduje s 36. dílkem objektivního

měřítka. Pak vypočteme pomocí trojčlenky :

55 dílků m.m. 36 dílků obj.m.

x dílek m.m. 2 000 μm/200 d.o.m.

55×x = 36×2 000/200

x = = 6,54 μm

B) Vlastní měření

Potřeby : 48 h stará kultura kvasinek na sladině

Provedení :

1. Připravit nativní preparát kvasinek (cvičný mikroorganismus).

2. Pro diagnostické účely změříme délku a šířklu nejmenší a největší dospělé buňky.

3. Výsledek uvádíme ve variačním rozpětí, např. (3-5)μm ×(5-7)μm.

Strana60

Poznámka :

Měření značně usnadní použití promítacího mikroskopu. Pak odpadá použití

okulárového mikrometrického měřítka, které je nahraženo kancelářským měřítkem..

3.3.6 Pododdělení Zygomycotina

Hyfy mycelia jsou většinou nepřehrádkované, přehrádky oddělují pouze

rozmnožovací struktury nebo jsou vytvořeny ve starších hyfách. U mnoha zástupců

dochází však k tvorbě přehrátek i v mladých kulturách. Buněčné stěny jsou tvořeny

většinou chitinem a chitosanem.

Nepohlavní rozmnožování se uskutečňuje pomocí endogenních sporangiospor,

které se tvoří uvnitř sporangií. U některých zástupců dochází v hyfách k tvorbě

tlustostěnných chlamydospor. Sporangia jsou většinou kulovitá, u některých zástupců

uvnitř se sterilní kolumelou. Po rozpadu stěny sporangia zůstává na bázi sporangia tzv.

límeček. Sporangia mohou být mnohosporová i jednosporová připomínající konidie.

Někteří zástupci vytvářejí válcovitá merosporangia. U některých rodů vyrůstají

sporangiofory ve svazcích ze zvláštních dlouhých šlahounovitých hyf – stolonů, které

tvoří v místech dotyku se substrátem rhizoidy – ůtvary podobné kořínkům.

Pohlavní rozmnožování je charakterizováno splýváním dvou gametangií, která

jsou od mycelia oddělena přehrádkou a jsou nesena rozšířeným koncem hyfy –

suspenzorem. Po splynutí gametangií vzniká diploidní zygospora v zygosporangiu.

3.3.6.1 Klíč k určení nejčastějších rodů Zygomycetů kontaminující potraviny

1a) Sporangiospory se tvoří v merosporangiích, které pokrývají rozšířený konec

sporangioforu SYNCEPHALASTRUM

1b) Sporangiospory se tvoří v kulovitých nebo hruškovitých sporangiích

s kolumelou viz 2

2a) Sporangia a sporangiofory obvykle tmavě pigmentované, sporangiofory většinou

nevětvené, často se vyskytují ve skupině. Velikost sporangií se pohybuje mezi 50-360

μm. Spory jsou často rýhované RHIZOPUS

Strana61

2b) Sporangia a sporangiofory nejsou pigmentované nebo jen slabě zbarvené,

sporangiofory často bohatě větvené. Sporangia nikdy nepřesahují 100 μm v průměru.

Spory nejsou rýhované viz 3

3a) Hruškovitá sporangia se zřetelnou apofysou, 10-40 μm v průměru (koncová

sporangia dosahují až 80 μm ABSIDIA

3b) Sporangia kulovitá bez apofysy, většinou větší než 40 μm v průměru

MUCOR

3.3.7 Pododdělení Ascomycotina a Deuteromycotina

Pododdělení Ascomycotina zahrnuje vřeckovýtrusé houby (Meiosporické

houby), v jejichž životním cyklu se vyskytuje pohlavní stadium, tzv. TELEOMORFA.

Pododělení Deuteromycotina je taxonomicky pomocné pododdělení. Zahrnuje

houby, které známe pouze ve stadiu ANAFORY, tj. chybí jim pohlavní rozmnožování.

Tyto houby se také označují jako konidiální nebo mitosporické houby. Dříve byly

označovány Fungi imperfecti.

Celý životní cyklus vřeckovýtrusé houby zahrnuje jak pohlavní, tak i nepohlavní

stadium rozmnožování. Houba procházející oběma stadii se nazývá HOLOMORFA. Hyfy

mycelia jsou přehrádkované, podstatnou složkou buněčných stěn je chitin a polyglutany.

Nepohlavní rozmnožování se uskutečňuje nejčastěji pomocí nejrůznějších typů

spor, také dělením a fragmentací stélky. Z hlediska morfologického mohou mít spory

rozličný tvar, velikost a barvu. Mohou být jedno i vícebuněčné a mohou vznikat

jednotlivě, ale i v menším či větším počtu. Nejčastěji vznikají spory endogenně.

Exogenně mohou vznikat na specializovaných hyfách, označovaných jako konidiofory.

Spory takto vzniklé nazýváme konidie.

Existují dva základní typy vzniku konidií (konidiogenese) :

1. Thalická nebo arthrická konidiogenese

Thalický (arthrický) typ je charakterizován vznikem konidií z předem vytvořené

existující buňky - hyfy, která se obvykle rozdělí přehrádkami a rozpadne se na

jednobuněčné části.

2. Blastická konidiogenese

Blastický typ je charakterizován vznikem konidií vypučením z konidiogenní

buňky. Z konidií vznikajících blastickým způsobem jsou nejznámější :

Strana62

a) Porospory, vznikají vyhřeznutím z póru a následným vytvořením buněčné

stěny.

b) Fialospory, vznikaji v tzv. fialidách, což jsou lahvicovité buňky s ústím

v apikální části, z níž se postupně uvolňují konidie.

c) Anelospory, při jejich vzniku je přepážka oddělující nově vzniklou konidii

protrhávána následně vznikající konidií. Zbytky protržených stěn vytvářejí

límečky u ústí konidiogenní buňky, zvané anelida.

Pohlavní rozmnožování je charakterizováno kontaktem a splynutím obsahů dvou

morfologicky diferencovaných gametangií. Pak dochází k plazmogamii a ke vzniku tzv.

askogenních hyf. Tyto hyfy představují dikaryotickou fázi a jejich výskyt je omezen na

vnitřní prostor plodnice. Koncové buňky askogenních hyf se přeměňují na askus

(vřecko). V asku dochází ke karyogamii a následné meioze a mitoze. Výsledkem je

vznik askospor.

Plodnice (askoma, askokarp) je tvořena haploidními hyfami, které uzavírají

askogenní hyfy a vřecka. Z hlediska systematiky je důležitý vývoj plodnice a její

morfologický tvar. Nejčastějším typem plodnice u potravinářsky významných hub je

kleistothecium a perithecium.

Kleistothecium je všestranně uzavřená plodnice, která se otvírá rozpadem nebo

rozpuštěním stěny. Vřecka jsou uvnitř neuspořádána.

Perithecium je kulovitá až hruškovitá plodnice s úzkým kanálkovým ústím

(ostiolem). Vřecka jsou v ní uspořádána.

3.3.7.1 Klíč k určení nejčastějších rodů Deuteromycotina kontaminujících

potraviny 1a) Konidie vznikají v pyknidě PHOMA

1b) Konidie nevznikají v pyknidě, alena hyfách, konidioforech, sporodochiích nebo

synnematech viz 2

2a) Konidie se tvoří na speciálních konidiogenních buňkách (fialidách, anelidách)

v řetízcích nebo kulovitých shlucích (bazipetálním způsobem)

2b) Konidie se netvoří na speciálních konidiogenníchbuňkách, ale akropetálně

(bazifugálně) nebo rozpadem plodných hyf nebo jednotlivě viz 13

3a) Konidie v suchých řetízcích (snadno rozpadavých) viz 4

3b) Konidie v slizovitých kulovitých shlucích viz 9

Strana63

4a) Konidie jsou většinou dvoubuněčné, vznikají z vláknitých konidiogenních

buněk, více či méně šikmo umístněné, uspořádané jako v klasu. Kolonie

narůžovělé

TRICHOTHECIUM

4b) Konidie vždy jednobuněčné, vznikající v lahvicovitých konidiogenních buňkách

v rovných řetízcích. Kolonie různých barev viz 5

5a) Konidie omezeného růstu, červenohnědé. Konidie se tvoří po čtyřech rozpadem

válcovité bradavčité plodné hyfy. Konidie jsou zprvu kostkovitého tvaru, později

se zaoblují (subglobozní tvar). Xerofilní WALLEMIA

5b) Kolonie obvykle nejsou omezeného růstu (vyjma xerofilní druhy rodu

Aspergillus). Konidie se netvoří dělením plodné hyfy viz 6

6a) Konidiofory jsou na konci typicky rozšířené ASPERGILLUS

6b) Konidie nejsou apikálně rozšířené viz 7

7a) Konidiogenní buňky anelidické. Konidie se širokou uťatou bazí

7b) Konidiogenní buňky fialidické. Konidie bez široké uťaté baze.

8a) Kolonie žluté až hnědé. Fialidy s dlouhým krčkem PAECILOMYCES

8b) Kolonie často do zelena (u některých druhů bělavé). Fialidy s krátkým krčkem

9a) Fialidy dlouhé, šidlovitého tvaru, polyfialidy chybí ACREMONIUM

9b) Fialidy více či méně lahvicovitého tvaru a/nebo jsou přítomny polyfialidy nebo

jsou fialidy redukovány viz 10

10a) Kolonie obvykle zelené (když rostou na světle) Trichoderma

10b) Kolonie bělavé, žluté, purpurově fialové, narůžovělé, hnědé nebo černavé

11a) Kolonie bílé, žlutavě růžové, purpurové, někdy zelenavé. Přehrádkované konidie

tvaru banánu obvykle přítomny FUSARIUM

11b) Kolonie černé, někdy růžové. Konidie nejsou septované viz 12

12a) Fialidy jednotlivě nebo v chudých přeslenech lahvicového tvaru se zřetelným

límečkem nebo jsou fialidy redukovány. Konidiofory nejsou zřetelné (výrazně

vytvořené) PHIALOPHORA nebo

LECYTHOPHORA

12b) Fialidy v hustých koncových svazcích, široce kyjovité, nejširší ve vrcholové

části. Bez nápadného límečku. Konidiofory jasně diferencované, se stopkou

13a) Kolonie rostou velmi rychle, pokrývají celou Petriho misku o ∅ 9 cm za několik

málo dnů. Řídce vláknité CHRYSONILIA

Strana64

13b) Kolonie nejsou oranžové a nepokrývají během několika dnů celou Petriho misku

o ∅ 9 cm viz 14

14a) Konidie pouze arthrické GEOTRICHUM

14b) Konidie jak arthrické, tak blastické nebo jen blastické viz 15

15a) Konidie se tvoří po čtyřech dělením válcovitého plodného vlákna

15b) Konidie se netvoří po čtyřech viz 16

16a) Konidiogenní struktury se skládají jak z arthrokonidií, tak z blastických konidií

(podobně jako Trichosporon u kvasinek a tlustostěnné hnědé arthrokonidiím

podobné hyfové u Aureobasidium) MONILIELLA

16b) Konidiogenní struktury se skládají pouze z blastických konidií

17a) Blastické konidie vznikají synchronně na hyfách nebo zvětšených buňkách či

větvích viz 18

17b) Blastické konidie se netvoří synchronně na hyfě nebo na zvětšených buňkách či

větvích viz 19

18a) Konidie vznikají na zoubcích terminálně zduřelých konidiogenních buněk.

Konidiofory vzpřímené, na konci stromečkovitě větvené. Kolonie řídce vláknité,

šedohnědé BOTRYTIS

18b) Konidie vznikají na vláknech nebo na zcela zduřelých větvích. Kolonie

připomínají kvasinky, smetanově žluté až světle hnědé, růžovooranžové nebo

černozelené AUR

19a) Konidie se tvoří jednotlivě na málo patrných konidioforech, v hroznech

viditelných jako černé body (sporodochia) EPICOCCUM

19b) Konidie se tvoří jednotlivě nebo v řetízcích, konidiofory zřetelné,neshlukují se

20a) Konidie jsou v řetízcích, mají hladkou stěnu. Kolonie obvykle zprvu krémově

zelené, později tmavnou MONILIELLA

20b) Konidie v řetízcích nebo jednotlivě, obvykle bradavčité. Kolonie zelenočerného

nebo zelenohnědého odstínu viz 21

21a) Konidie spíše tenkostěnné, většinou jednobuněčné. Bazální konidie často

septované, ale jen s příčnými septy CLADOSPORIUM

21b) Konidie jak s příčnými, tak podélnými septy (zďovité) viz 22

22a) Mladé konidie zaoblené na bázi, zralé konidie v řetízcích a/nebo jsou opatřené

zobáčkem ALTERNARIA

22b) Mladé konidie zašpičatělé na bázi, zralé konidie jednotlivě nebo v krátkých

falešných řetízcích ULOCLADIUM

Strana65

3.3.7.2 Klíč k určení nejčastějších rodů Ascomycotina kontaminujících

potraviny 1a) Askomata se zřetelnou vyvinutou stopkou. Stopka je tvořena jednoduchou

hyfou. Anamorfou je Basipetospora MONASCUS

1b) Ascomata bez stopky. Anamorfa je Penicillium, Paecilomyces nebo Aspergillus

viz 2

2a) Ascomata bez zřetelné stěny.Anamorfa je Paecilomyces BYSSOCHLAMYS

2b) Ascomata mají stěnu. Anamorfa je Aspergillus nebo Penicillium

3a) Anamorfa je Penicillium, askomata se zřetelným obalem, žlutá někdy

přecházející do načervenalé barvy TALAROMYCES

3b) Anamorfa je Aspergillus, askomata s „Hülle cells“ nebo s jedno- až s

vícevrstevnou stěnou viz 4

4a) Stěna askomatu obklopená silnostěnnými „Hülle cells“. Anamorfa je ze skupiny

Aspergillus nidulans EMERICELLA

4b) Stěna askomatu není obklopena vrstvou „Hülle cells“ viz 5

5a) Askomata žlutá, stěna seskládá z jedné vrstvy zploštělých buněk. Anamorfa je ze

skupiny Aspergillus glaucus EUROTIUM

5b) omata bílá až krémová, stěna se skládá z několika vrstev zploštělých buněk.

Anamorfa je ze skupiny Aspergillus fumigatus NEOSARTORYA

3.3.8 Pododdělení Bazidiomycotina

Karyogamie i meiosa probíhá v buňce zvané bazidie, haploidní bazidiospory se

tvoří exogenně na sterigmatech. Toto pododdělení se dělí na dvě třídy :

1. Heterobazidiomycetes

2. Homobazidiomycetes

Do prvé z těchto tříd patří tzv. bazidiomycetní kvasinky (kap.3.2.10). Jiné

mikroskopické houby významné z potravinářského hlediska do tohoto pododdělení řazeny

nejsou. Z tohoto důvodu toto pododdělení nebude blíže morfologicky probírané.

3.3.9 Slovník hlavních pojmů

ACERVULUS myceliální polštářek se seskupenými, poměrně

krát- kými konidiofory

Strana66

AKROPETÁLNÍ vývoj nastává na vrcholu (= BAZIFUGÁLNÍ)

ANAMORFA fáze nepohlavního rozmnožování v životním

cyklu

ANELIDA konidiogenní buňka, dávající vznik

anelospoře, na jejím ústí jsou prsténcovité zbytky buněčných stěn

ANELOSPORA konidie vzniklá vypučením z anelidy

APOFYSA (řec apophyéo = vyrůstám) rozšířená nejhořejší část sporangioforu

ARTHROSPORA (řec.árthron = člen) spora vznikající z již předem vytvořené,

existující buňky hyfy, která se rozdělí přehrádkami a rozpadne se na jednotlivé

části

ASKOGENNÍ HYFA dikarystická hyfa vřeckovýtrusných hub, jejíž

kon- cová buňka se přemění ve vřecko

ASKOKARP plodnice vřeckovýtrusných hub

ASKOMA plodnice vřeckovýtrusných hub (= ASKOKARP)

ASKOSPORA spora vzniklá redukčním dělením ve vřecku

ASKUS (řec.askós = vřecko) buňka vřeckovýtrusých hub, v níž dochází ke

karyo- gamii a následné či časově oddálené meiozi

BLASTOSPORA pučením vzniklá buňka nebo konidie

BAZIFUGÁLNÍ (lat.fugio = prchám) akropetální vývoj nastává na vrcholu, apikální

část je nejmladší

BAZIPETÁLNÍ (lat.peto = směřuji) vývoj nastává od základu, tj.apikální část je

nejstarší

FIALIDA obvykle lahvicovitá buňka produkující

blastické ko- nidie

FIALOSPORA konidie vzniklá vypučením z fialidy

FUNGI IMPERFECTI nedokonalé houby – starší označení

konidiálních hud (= Deuteromycotina)

GAMETANGIUM rozšířený konec hyfy, vzniklý po dotyku

s druhou hyfou a oddělený od mateřské buňky přepážkou. Po splynutí dvou

gametan- gií vzniká zygospora.

HOLOMORFA celý životní cyklus houby (skládá se

z anamorfy a telemorfy)

HYFA (řec.hýphe = buněčné vlákno) vlákno mycelia

Strana67

CHLAMYDOSPORA (řec.chlamys = svrchní oděv) silnostěnná nepohlavní spora hub

vznika- jící v hyfách tak, že se obsah zahustí a obalí tlustou blanou. Je určena

k přežití, nikoliv k rozmnožování.

KARYOGAMIE splývání dvou buněčných jader

KLEISTOTHECIUM uzavřená plodnice vřechovýtrusých hub

otevírající se rozpadem nebo rozrušením stěny

KOLUMELA (lat.columella = sloupek) polokulovitá až kuželovitá část sporangioforu

zasa- hující do sporangia

KONIDIÁLNÍ HOUBY houby rozmnožující se pouze nepohlavně,

tj.pouze anamorficky (= Deuteromycotina)

KONIDIE nepohlavě vzniklá spora houby

KONIDIOFOR specializovaná hyfa nesoucí konidie

KONIDIOGENESE způsob vzniku konidií

KONIDIOGENNÍ BUŇKA buňka, ve které vzniká konidie

KONIDIOMA útvar podobný plodnici, ve kterém dochází ke

tvorbě konidií

KOREMIE svazek navzájem slepených konidioforů

(=SYNNEMA)

MEIOSPORICKÁ HOUBA houba rozmnožující se pohlavně (=

telemorfickou fází)

MEROSPORANGIUM válcovité sporangium se sporami

uspořádanými v řadě

METULA buňka na konidioforu nesoucí fialidy

MITOSPORICKÁ HOUBA houba rozmnožující se nepohlavně (=

anamorfickou fází)

MYCELIUM (řec.mýkos = houba) vegetativní forma hub, soubor houbových hyf

OSTIOLUM ústí askokarpu

PERITHECIUM askokarp většinou lahvicovitého tvaru

PLAZMOGAMIE cytoplazmatická fúze (splývání cytoplazmy)

PLODNICE obal uzavírající askogenní hyfy a vřecka

POROSPORA blasticky vzniklá spora

PYKNIDA (řec.pyknós = uzavřený) lahvicovitá konidioma

RHIZOIDY (řec.rhiza = kořen) vlákna vyrůstajícíz mycelia a připomínající

kořeny vyšších rostlin

Strana68

SPORANGIOFOR specializovaná hyfa nesoucí sporangium

SPORANGIOSPORA spora vznikající endogenně ve sporangiu

SPORANGIOLA sporangium s malým počtem spor

SPORANGIUM (řec.angeion = nádržka) útvar obsahující spory

SPORODOCHIUM ložisko, poduškovitý útvar hyf s hustě

palisádovitě uspořádanými konidiofory

STOLON(řec.stolónes = kořenovité výběžky) dlouhá hyfa tvořící při styku se

substrátem rhizoidy

SUSPENZOR rozšířenina hyfy nesoucí zygosporangium

SYNNEMA svazek navzájem spletených konidioforů

(=koremie)

TELEMORFA fáze pohlavního rozmnožování v životním

cyklu

VŘECKO = askus

XEROFILNÍ rozmnožující se v prostředí s nízkou vodní

aktivitou

ZYGOSPORA (řec.zygón = jařmo) tlustostěnná spora vzniklá po kopulaci

Kontrolní otázky ke kap. – 3. MORFOLOGIE A CYTOLOGIE MIKROORGANISMŮ 1. Které znáte makroskopické znaky?

2. Co je to křís a jak můžeme jeho tvorbu potlačit?

3. Jaký je rozdíl mezi křísem a mázdrou?

4. Co zjišťujeme při makroskopickém vyhodnocování růstu na šikmém agaru

5. u bakterií

6. u plísní

7. Existuje nějaký vztah mezi charakterem růstu na tuhém a tekutém prostředí?

8. Co jsou obrovské kolonie?

9. Jaké znáte typy mikroskopických preparátů?

10. Co je to fixace a proč se provádí?

11. Která barviva se používají v mikroskopii mikroorganismů, a jaké typy barvení

preparátů znáte?

12. Které morfologické znaky můžeme zjistit při světelném mikroskopii a na čem je

založen jejich průkaz?

Strana69

13. Kdy používáme negativní barvení bakterií?

14. Jak zjistíte tvorbu spor u a)bakterií b)kvasinek c)plísní?

15. Jak zjistíte pohyb mikroorganismů?

16. Na čem je založeno Gramovo barvení a k čemu je používáme?

17. Na čem je založeno mikroskopické zjištění živých a mrtvých buněk v pekařském

droždí?

18. Jak členíme oddělení Eumycota

19. Vyjmenujte charakteristické znaky zygomycet

20. Vyjmenujte charakteristické znaky askomycet

21. Vyjmenujte charakteristické znaky deuteromycet

22. Které z basidiomycet mají význam v potravinářské technologii?

Strana70

4. SLEDOVÁNÍ VLIVU VNĚJŠÍCH PODMÍNEK NA MIKROORGANISMY

Růst a metabolismus mikroorganismů je závislý na podmínkách životního

prostředí. Působení faktorů životního prostředí se dá rozdělit na následující skupiny:

1) fyzikální faktory (teplota, tlak, UV záření, γ záření),

2) chemické faktory (zdroje C, zdroje N a ostatní živiny, přítomnost

antimikrobiálních látek ),

3) biologické faktory (vliv ostatních mikroorganismů).

Každý mikroorganismus vyžaduje své specifické optimální vnější podmínky.

Mikroorganismy ve srovnání s vyššími organismy jsou obecně odolnější k nepříznivým

životním podmínkám a mají velikou adaptační schopnost regulovat svůj metabolismus

k proměnlivým podmínkám životního prostředí. V praxi se využívá různé citlivosti

mikroorganismů ke shora uvedeným faktorům k řízení aktivity mikroorganismů

žádaným směrem :

Buď k potlačení růstu nežádoucích mikroorganismů nebo

naopak k výběru odolných druhů, které lze použít v průmyslové praxi.

4.1 Vliv teploty na mikroorganismy

Teplota vnějšího prostředí je nejvýznamnějším faktorem, který ovlivňuje růst a

rozmnožování mikroorganismů. Teploty, které umožňují růst mikroorganismů jsou od

0oC do 85-90 oC , i když jsou popsané ještě vyšší teploty, při kterých některé druhy

bakterií rostou a žijí. Hodnotíme-li závislost růstu na teplotě, určuje tři základní teploty :

minimální, tj. nejnižší teplota, při které se mikroorganismus ještě rozmnožuje

měřitelnou rychlostí,

optimální, při které dosahuje nejvyšší růstové rychlosti (μmax),

maximální, tj. nejvyšší teplota při které ještě dochází k dělení buňky.

Optimální teploty pro jednotlivé fyziologické pochody v buňce (tvorba enzymů,

sporulace, transport živin) se liší i pro jeden druh. Účinek teploty je rovněž ovlivněn

velikostí kultivační nádoby, koncentrací buněk, obsahem vody v živném substrátu a pH.

Obvykle se stanovuje optimální teplota růstu a smrtící teplota, méně často teplotní

rozmezí růstu.

Strana71

Cv.4.1. Vliv teploty na růst mikroorganismů

Potřeby : Kultury Serratia marcescens, Bacillus stearothermophilus, Saccharomyces

cerevisiae, 8 zkumavek s našikmenou živnou půdou (půda č.XZ), 4 zkumavky se

sladinkovým agarem (půda č. XY) nebo OGYE agarem ( půda č. XZ).

Provedení :

1. Zaočkuj pomocí kličky 4 zkumavky se živnou půdou kulturou S. marcescens

2. Další 4 zkumavky kulturou B. stearothermophilus a 4 zkumavky se sladinkovou

půdou kulturou S. cerevisiae.

3. Dej po jedné zkumavce každé naočkované kultury inkubovat do teploty 4oC,

25oC, 37oC a 55 oC. Při kultivaci 55 oC je nutno dát zkumavky do tzv. vlhké

komůrky, což je skleněná vana, ve které je umístěna nádobka s vodou a která je

uzavřená skleněnou deskou. Aby deska dobře přiléhala, je nutné kraje vany

potřít tukem na zábrusy.

4. Za 48 až 72 hodin inkubace pozoruj intensitu nárůstu, porovnej ji.

5. Výsledky zapiš do tabulky. Intenzitu růstu označ následovně: žádný nárůst = 0,

slabý nárůst = +,

silnější nárůst = ++,

maximální nárůst = +++.

6. U S. marcescens sleduj také barvu vyrostlých kolonií.

4.1.1 Stanovení smrtící teploty

Smrtící (letální) teplota je nejnižší teplota, která během určité doby usmrcuje

mikroorganismus za přesně definovaných podmínek. Tuto teplotu stanovuje zásadně

v tekutých kulturách. Smrtící teplota se pro jednotlivé mikroorganismy liší a je

ovlivněná koncentrací buněk, fyziologickým stavem kultury (stáří), složením media a

pH. Obvykle se smrtící teplotou rozumí teplota, která za 10 minut usmrtí všechny buńky

v suspenzi. Z technologického hlediska má větší význam stanovení smrtící doby, která

udává nejkratšímdobu potřebnou k usmrcení mikroorganismů za dané teploty a

definovaných podmínek. Vztah mezi letální teplotou a dobou potřebnou k usmrcení

Strana72

mikroorganismu lze vyjádřit letalitní křivkou, která má mimořádný význam obzvláště

v konzervárenském průmyslu.

Velká většina mikroorganismů patří mezi mezofilní (optimum růstu mezi 25oC

až 40oC), které jsou usmrcovány teplotami kolem 60oC, působícími 10 až 15 minut. Pro

usmrcení thermofilních mikroorganismů (optimum růstu mezi 45oC až 65oC) je nutné

užívat vyšších teplot (více než 80oC). Spory většiny bakterií jsou značně

thermorezistentní a bývají usmrceny teplotou až 120oC a více, působící po dobu alespoň

15 minut (sterilisace autoklávem). Spory kvasinek a plísní jsou mnohem méně odolné,

vetšinou je usmrcují teploty mezi 60oC-70oC. Při pasterisaci jsou obvyklé teploty mezi

63oC-72oC od 15 sekund při horní teplotě až po dobu 30 minut pro dolní hranici.

Odolnost mikroorganismů k teplotě ovlivňuje obsah vody v prostředí i

v buňkách, pH prostředí a přítomnost některých látek (lipidy, bílkoviny, sacharidy) ve

vyšší koncentraci.

Cv.4.2 Orientační stanovení smrtící teploty kvasinek, plísní a bakterií

Potřeby : kultura mikroorganismů v tekuté půdě, 2 desky příslušné agarové půdy,

vhodné pro testovaný mikroorganismus, teploměr, pipeta 2 ml, 8 sterilních zkumavek,

termostatovaná vodní lázeň, termostat.

Provedení:

1. Pracovní skupiny nastaví postupně vodní lázeň na teploty: 45oC, 50oC, 55oC,

60oC, 65oC, 70oC, 75oC.

2. Do 7 zkumavek napipetuj 2 ml kultury testovaného mikroorganismu a označ je 1

až 7.

3. Dno Petriho misek s agarovou půdou rozděl fixem na 8 dílů a označ 1 až 8.

4. Z původní suspenze buněk naočkuj kličkou (velmi přesně) na díl označený

osmičkou, který bude sloužit jako kontrola.

5. Na dobu 11 minut vlož zkumavky do jednotlivých teplot vodní lázně, jedna

minuta se přidává na vytemperování kultury na teplotu vodní lázně.

6. Zkumavky po 11 minutách rychle ochlaď pod tekoucí vodou a postupně naočkuj

kličkou z každé zkumavky na jeden díl agarové půdy označené stejným číslem.

7. Dej zaočkované Petriho misky inkubovat do termostatu při teplotě vhodné pro

testovaný mikroorganismus na dobu potřebnou k jeho růstu.

Strana73

8. Odečti nejnižší teplotu, při které již buňky mikroorganismu nevyrostly, která se

rovná smrtící teplotě. Při odečítání nárůstu berte v úvahu možnost vzdušné

kontaminace způsobené opakovaným otevíráním misek.

Cv.4.3 Stanovení letalitní křivky u sporotvorných bakterií

Potřeby : Narostlá tekutá kultura Bacillus megaterium, olejová lázeň, živná půda

č.XY, 20 kusů skleněných ampulek obsahu 2–5 ml, sterilní špičky objemu 1 ml

(modré), pipetman nastavený na 1 ml, 12 zkumavek s živnou půdou, ochranný štít,

pilník na sklo.

Provedení :

1. Stanov mikroskopicky v barevném fixovaném preparátu (kap. ) relativní počet spor

vzhledem k počtu buněk.

2. Vzrostlou kulturu nařeď asepticky MPB 104×, čímž dosáhneš koncentrace buněk

asi 104 v 1 ml. K inaktivaci vegetativních buněk zahřej na 10 min na vodní lázni

teplé 90oC. Po ochlazení této suspenze napipeuj 1 ml na misku a přelij MPA

ochlazeným na 45oC a dobře rozmíchej. Po inkubaci při 37oC spočítej narostlé

kolonie. Jejich počet odpovídá počtu živých spor v původní ředěné suspenzi.

3. Nožem na sklo asepticky odstraň horní část skleněné ampulky a injekční stříkačkou

přenes do ní 1 ml ředěné suspenze. Naplň tak všech 20 ampulek. Ampulky ihned

zatav!

4. Vytemperuj olejovou lázeň na 110oC, vlož do ní 8 ampulek, které jsou absolutně

suché. Pracuj na vnější straně s nasazeným ochraným štítem, neboť ampulky často

praskají. Po 10, 15, 20, 25 a 30 min postupně vytáhni 2 ampulky a rychle ochlaď

vodou. Jednu ampulku dej kultivovat při 37oC neotevřenou, druhou vždy otevři

asepticky pilníkem, obsah přenes do Petriho misky a přelej MPA zchlazeným na

45oC a dobře rozmíchej. Po ztuhnutí dej inkubovat jako prvá ampulka.

5. Stejně pracuj při teplotě 115oC, a to po 5, 10, 15 min a při teplotě 120oC po 2, 3 a 5

min.

6. Po 24 až 48 h kultivace pozoruj růst mikroorganismů na Petriho miskách i

v ampulkách. Vzrostlé označ (+), nevzrostlé (−) a zanes do tabulky, vynes v grafu

Strana74

poslední pozitivní a první negativní zjištění při každé teplotě a prolož těmito body

přímku na semilogaritmickém papíru, čímž získáš letalitní křivku.

Poznámky :

1. K přesnému stanovení se užívá nejméně 5 paralelních ampulek pro každou teplotu a

čas.

2. Pro sledování vlivu substrátu na odolnost spor zřeď suspenzi buněk namísto do

MPB do 2% NaCl, 10% roztoku sacharosy a podobně. Porovnej získané křivky.

3. Podrobně se dočteš o latalitních křivkách, jejich konstrukci a použití v knize

V.Kyzlink : Základy konzervace potravin, Praha, 1980.

4.2 Vliv pH prostředí na růst mikroorganismů

Růst mikroorganismů je významně ovlivňován koncentrací vodíkových iontů

v pro-středí. Většina bakterií roste v neutrálním nebo slabě alkalickém prostředí. Pro

kvasinky je optimální kyselé prostředí (pH 4,8–5,5). Optimální pH pro většinu plísní je

poblíž neutrálních hodnot, ale obecně se plísně rozmnožují ve velmi širokém rozmezí

pH, tj. od 1,2 až po 11,0.

V mnoha případech mikroorganismy samy ovlivňují pH prostředí pomocí svého

metabolismu, např. kyselinotvorné bakterie, plísně i kvasinky snižují pH prostředí. Při

hodnotách pH vzdálených od optima, klesá odolnost mikroorganismu k teplotě.

Cv.4.4 Sledování vlivu pH prostředí na růst mikroorganismů

Potřeby : Čerstvé kultury Escherichia coli a Saccharomyces cerevisiae, 12 sterilních

zkumavek, bujon, sladina, zásobní sada roztoků pufrů :

roztok A – Na2HPO4.2 H2O (35,6 g/1000 ml),

roztok B – kyselina citronová (21,06 monohydrátu/1000 ml).

Pufry o potřebném pH získáme následujícím ředěním :

pufr (pH) roztok A (ml) roztok B (ml) 3.0 4,1 15,9 4,0 7,7 12,3 5,0 10,3 9,7 6,0 12,6 7,4 7,0 16,5 3,5 8,0 19,4 0,6

Provedení :

Strana75

1. Ze zásobních roztoků A a B namíchej pufry o uvedeném pH. Do 6 zkumavek

napipetuj 5 ml bujonu a do dalších 5 ml sladiny a od každého pufru napipetuj vždy

5 ml a přidej do obou typů půd. Takto připravené zkumavky uzavři kovovým

uzávěrem a vysteriluj v autoklávu.

2. Po zchladnutí obsahu zkumavek po sterilaci, zaočkuj zkumavky s bujonem bakterií

E. coli a zkumavky se sladinou kvasinkou S. cerevisiae.

3. Bakterije inkubuj při 37oC 24 hodin a kvasinky při 25oC 48 hodin.

4. Odečti nárůst mikroorganismů ve zkumavkách a zanes do tabulky . Žádný nárůst =

0, intensitu vyhodnoť počtem +. Rovněž je možné změřit optickou denzitu při 650

nm na spektrofotometru.

4.3 Vliv osmotického tlaku na růst mikroorganismů

Mikroorganismy rostou nejlépe v prostředí, které má stejné nebo jen o málo

nižší osmotický tlak, než jejich cytoplasma. Je-li prostředí silně hypotonické, dochází

k plasmoptýze, tj. procesu vyrovnávání osmotického tlaku buňky a prostředí, do buňky

přes cytoplasmatickou membránu vstupuje voda. Buńka bobtná a jejímu prasknutí brání

pouze silná buněčná stěna. V hypertonickém prostředí nastává naopak odvodnění

buněk, tj. plasmolýza, jež se u G- buněk projevuje odtržením cytoplasmatické

membrány od buněčné stěny. Zároveň se snižuje metabolická aktivita buněk, což se

využívá v konzervárenském průmyslu. Některé potraviny (maso, ryby) se nasolují 6 až

30% NaCl, jiné (džemy, marmelády, kandované ovoce) se konzervují přídavkem

sacharosy až do 80%. Jsou však také mikroorganismy, které jsou schopné růst při

vysokém osmotickém tlaku, osmofilní organismy, nebo vysoké koncentraci soli,

halofilní organismy. Tzv. osmotolerantní kvasinky rostou i v přítomnosti 60%

sacharosy, některé halofilní bakterie potřebují ke svému růstu koncentrace NaCl od 5–

20%, jiné tzv. extrémní halofily do 30%.

Cv.4.5 Vliv osmotického tlaku na růst mikroorganismů

Potřeby : Sterilní roztoky 30% NaCl, 60% roztok sacharosy, bujonová kultura

Escherichia coli nebo Staphylococcus aureus, Saccharomyces cerevisiae nebo

Zygosaccharomyces, 10 sterilních zkumavek, pipety dělené 1 ml a 10 ml,

masopeptonový bujon (půda č.XY) a sladina (půda č.XY).

Provedení:

Strana76

1. Připrav 5 zkumavek po 6 ml bujonu obsahujícího postupně 0, 5, 19, 25% NaCl.

Podobně připrav 5 zkumavek po 6 ml sladiny obsahující postupně 0, 10, 20, 30 a

40% sacharosy.

2. Zkumavky s bujonem zaočkuj 0,5 ml kultury E. coli a dej inkubovat 24 hodin při

37oC.

3. Zkumavky se sladinou zaočkuj 0,5 ml kultury S. cerevisiae a dej inkubovat při

25oC na 24–48 hodin.

4. Odečti, ve kterých zkumavkách mikroorganismy rostou a zapiš do tabulky. Zjisti

nejnižší koncentraci NaCl a sacharosy, která zabránila mikroorganismům v růstu.

4.4 Vliv ultrafialového světla na mikroorganismy

Záření přichází na zemský povrch ze slunce a ostatních mimozemských zdrojů a

rovněž vzniká na zemi z různých umělých zdrojů. Záření mají různou vlnovou délku a

energii, čím kratší je vlnová délka záření, tím vyšší má energii. Rentgenové záření (X

paprsky) a gama záření patří mezi ionizující záření. Toto záření ionizuje vodu a vytváří

vysoce aktivní volné radikály, které mají destruktivní účinek na DNA. Účinek záření je

závislý na stáří buněk, složení media a na teplotě.

Ultrafialové světlo (UV) světlo vlnové délky 240–300 nm má mutagenní a

letální účinky na mikroorganismy. Nejúčinnější je UV světlo o vlnové délce 265 nm,

které poškozuje DNA tvorbou pyrimidinových dimerů. UV světlo také vyvolává tvorbu

toxických peroxidů a ozonu. Vyšší dávky buňky usmrcují (letální účinek), při nižších

dávkách buňky přežívají, zvyšuje se však počet mutací. Normální sklo UV záření

pohlcuje a chrání tak mikroorganismy před jeho účinky. Přítomnost karotenoidních

barviv v buňkách některých kvasinek, bakterií a na povrchu plísňových spor zvyšuje

odolnost těchto mikroorganismů proti UV světlu, obzvláště proti UV složce slunečního

záření.

Cv.4.5 Vliv ultrafialového světla na mikroorganismy

Potřeby : UV lampa, 3 sterilní Petriho misky, živná půda č.XY, sterilní alobalové

masky, tekutá kultura Escherichia coli.

Provedení :

1. Do ztekucené agarové půdy, ochlazené na 45oC, přidej 1 ml kultury E. coli a rozlej

do Petriho misek.

Strana77

2. Připrav UV lampu tak, abys mohl ozařovat Petriho misky ze vzdálenosti 30 cm a

nech ji 5 minut nažhavit.

3. Na povrch agarové půdy polož sterilní pinzetou sterilní alobalovou masku a ozař

první misku 1 minutu, druhou misku 3 minuty a třetí misku 10 minut.

4. Inkubuj při 37oC a za 24 h odečti nárůst na jednotlivých miskách. Na ploše

agarových desek chráněných alobalovými maskami bakterie narostou, na ozářených

plochách dochází k částečné nebo úplné inhibici růstu bakterií. Zapiš výsledek do

tabulky : doba ozáření – intensita růstu a sestroj graf.

4.5 Bakteriostatické působení některých barviv

Některá organická barviva mají bakteriostatický účinek na grampozitivní

bakterie i v koncentracích, kdy gramnegativní bakterie ještě rostou. Tohoto jevu se

využívá pro přípravu selektivních půd užívaných, např. při stanovení koliformních

bakterií. Obvykle se přidává krystalová nebo gencianová violeť, malachitová zeleň,

methylenová modř, trypaflavin aj.

Cv.4.6 Bakteriostatické působení roztoku krystalové violeti

Potřeby : 1% vodný roztok krystalové violeti (nezaměňovat s roztokem označeným

Gram I), bujonové kultury Bacillus subtilis, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli a

Micrococcus luteus, 4 sterilní zkumavky, sterilní destilovaná voda, sterilní pipeta 10 ml,

4 sterilní pipety 1 ml, 4 sterilní Petriho misky, 4 zkumavky s 18 ml MPA (půda č.XY).

Provedení :

1. Nařeď roztok krystalové violeti postupně asepticky 10×, 100×, a 1000×.

2. Rozehřej 4 zkumavky s MPA ve vodní lázni. Do prvé přidej 1 ml neředěného

barviva, do druhé zkumavky 1 ml 10× ředěného, do třetí zkumavky 1 ml barviva

100× ředěného a do poslední přidej 1 ml barviva 1000× naředěného. Rozmíchej a

vylej do 4 sterilních Petriho misek.

3. Po ztuhnutí rozděl fixem dno misek na čtvrtiny, a na každou z nich naočkuj

čárkováním všechny 4 shora uvedené kmeny bakterií.

4. Dej inkubovat při 37oC na 24 hodin. Odečti růst bakterií a výsledky zapiš do

tabulky, srovnej růst gramnegativních bakterií s růstem bakterií grampozitivních.

4.6 Citlivost mikroorganismů k antimikrobiálním látkám

Strana78

V současnosti je známá celá řada chemických látek, jak anorganického, tak

organického původu, které působí toxicky na mikroorganismy. Jsou označovány jako

antimikrobiální látky a mohou se využívat jako desinfekční prostředky, léky (např.

antibiotika, sulfonamidy) nebo potravinářské konzervační prostředky. Podle jejich

účinku na mikroorganismy je dělíme na mikrobistatické, které pouze zastavují růst a

rozmnožování a na látky mikrobicidní, které působí na buňky letálně. Účinek

antimikrobiálních látek závisí na jejich koncentraci. Velmi nízké koncentrace naopak

stimulují životní pochody v buňce. Účinná koncentrace jednotlivých látek

s antimikrobiálním účinkem závisí na druhu použité látky i na mikroorganismu, na který

látky působí.

Cv.4.7 Stanovení účinnosti konzervačních prostředků difuzní metodou

Potřeby : 2 sterilní Petriho misky, sterilní korkovrt o průměru 8 mm, 2 baňky po 100

ml sladinového agaru, sterilní voda, sterilní skleněné perly, dobře osporovaná kultura

plísní na šikmém agaru, sterilní Erlenmayerovy baňky, sterilní pipety (1 ml),

konzervační prostředky.

Provedení :

1. Připrav sterilní roztoky konzervačních činidel ve sterilní destilované vodě v těchto

koncentracích : Benzoan sodný: 0,5; 1,0; 1,5; 10,0 %.

Kyselina mravenčí: 4,0; 6,0; 8,0; 10,0 %.

Kyselina sorbová: 0,25; 0,50; 0,75; 1,00 %.

2. Spory plísně smyj přídavkem 3–5 ml sterilní vody do sterilní baňky s perlami,

protřepej a pomocí Thomovy nebo Bürkerovy komůrky zjisti počet spor v 1 ml

suspenze a nařeď tak, aby výsledná koncentrace spor v 1 ml suspenze byla 105.

3. Připrav 3 misky se sladinovým agarem, po jeho ztuhnutí a vysušení napipetuj na

každou misku 0,2 ml suspenze spor, rozetři rovnoměrně po celém agaru a nech

zaschnout. Potom vyřízni sterilním korkovrtem v každé misce 5 otvorů a dbej, aby

byly dostatečně vzdáleny od kraje misky a od sebe navzájem. Otvory na dně misky

očísluj.

4. Do každé jamky napipetuj asepticky postupně 0,2 ml ředěných konzervačních

činidel. Do páté jamky napipetuj pro kontrolu 0,2 ml sterilní destilované vody,

použité k ředění konzervačních činidel.

5. Inkubuj při 28oC 48–72 hodin a sleduj nárůst plísně.

Strana79

6. Změř šířku mezikruží vzniklých inhibičních zón a zapiš výsledky do tabulky.

4.6.1 Fenolový koeficient mikrobicidních látek Účinnost mikrobicidních prostředků lze vyjádřit tzv. fenolovým koeficientem,

který udává, kolikrát je testovaná látka účinnější než fenol. Metoda je použitelná pro

všechny ve vodě rozpustné nebo s vodou mísitelné látky. Fenolový koeficient je podíl

nejvyššího zředění zkoušené látky a nejvyššího ředění fenolu, které usmrtí testovaný

mikroorganismus. Obvykle se volí doba působení látky 10 minut a teplota 20 oC. Jako

testovací mikroorganismy se většinou používají Staphylococcus aureus, Salmonella

typhi a také některé sporotvorné bakterie.

Fenolový koeficient stanovujeme buď podle původní metody Rideal-Walkerovy,

kde se mikroorganismy očkují ze zředěných desinfekčních prostředků do živného

media, nebo metodou podle Patočky, která používá nosiče testovacích mikroorganismů,

např. skleněné perly, které brání přenosu malých množství desinfekčních prostředků do

živného media.

Cv.4.8 Stanovení fenolového koeficientu mikrobicidních látek suspenzní

Rideal -Walkerovou metodou

Potřeby : 24 h stará bujonová kultura Staphylococcus aureus, 0,5 % roztok fenolu, 0,5

% roztok Septonexu, 14 sterilních zkumavek, 14 zkumavek s MPB (půda č.XY), sterilní

destilovaná voda, dělené pipety 1 ml a 20 ml.

Provedení :

1. Napipetuj do 6 zkumavek postupně 4, 5, 6, 7, 8 a 9 ml sterilní destilované vody. Do

každé zkumavky přidej 1 ml roztoku fenolu a dobře promíchej. Takto byl roztok

zředěn 5×, 6×, 7×, 8×, 9× a 10×.

2. Zkumavky označ a z každé odpipetuj tolik, aby v ní zůstalo jen 5 ml. Postupuj od

zkumavky ředěné 10× ke zkumavce ředěné 5×, abys mohl použít jediné pipety. Do

7. zkumavky napipetuj 5 ml sterilní destilované vody a oznař ji jako kontrolu.

3. Roztok Septonexu zřeď nejprve 50× sterilní destilovanou vodou. Do 6 zkumavek

napipetuj postupně 5,0 ml; 3,35 ml; 2,5 ml; 2,0 ml; 1,0 ml a 0,5 ml. Doplň sterilní

Strana80

destilovanou vodou do 5 ml. Tak byl roztok zředěn postupně 50×, 75×, 100×, 250×

a 500×.

4. Zkumavky s fenolem, Septonexem a kontrolní vytemperuj na 20 oC; v intervalu 30s

přidávej do každé zkumavky po 0,5 ml bujonové kultury Staphylococus aureus.

Každou zkumavku protřepej a inkubuj 10 min, a pak z ní vyočkuj jedno očko

kličkou do zkumavky s MPB stejně označené.

5. Naočkované zkumavky s MPB dej inkubovat při 37oC na 24 hodin nebo více.

6. Odečti a označ zkumavky, ve kterých bakterie vyrostly (jsou zakalené), a zjisti

nejvyšší zředění Septonexu a fenolu, které zabránilo vzrůstu kultury bakterií. Jejich

podíl se rovná fenolovému koeficientu pro Septonex.

Cv.4.9 Stanovení fenolového koeficientu mikrobicidních látek metodou se

skleněnými perlami

Potřeby : Bujonová kultura Staphylococcus aureus, 14 sterilních Petriho misek, 13

s MPB zkumavek (půda č.XY), sterilní destilovaná voda, pinzeta, skleněné perly

matové Ø 7 mm, pipety dělené, 0,5 % roztok fenolu a 0,5 % roztok Septonexu, sterilní

filtrační papír.

Provedení :

1. Skleněné perly vysteriluj v horkovzdušném sterilizátoru. Ve zkumavce převrstvi

perly bujonovou kulturou Staphylococcus aureus. Ulož do tmy při teplotě 20 oC na

2 hodiny.

2. Vysuš perly na sterilním filtračním papíru v exsikátoru. Takto připravené perly ulož

do sterilní Petriho misky, kde vydrží několik dní.

3. Do 6 Petriho misek připrav roztoky fenolu ve sterilní destilované vodě (vždy 30 ml

na misku) ředěné postupně 5×, 6×, 7×, 8×, 9× a 10×. Podobně připrav roztoky

Septonexu ředěné 50×, 75×, 100×, 125×, 250× a 1000×. Do 13. Petriho misky dej

30 ml sterilní destilované vody, která bude jako kontrola. Návod k ředění viz bod 1

a 2 minulé úlohy.

4. Sterilní pinzetou přenes po 3 perlách do každé Petriho misky, kde je ponechej 4

minuty. Pak přenes pinzetou perly do sterilní destilované vody připravené v další

Petriho misce, opláchni a vhoď vždy 3 perly do 1 zkumavky s MPB. Toto proveď

postupně se všemi koncentracemi fenolu a Septonexu a s kontrolou tak, abys

Strana81

dodržel přesně interval inkubace 4 minuty. Sterilní destilovanou vodu na

oplachování vyměňuj pro každé ředění.

5. Zkumavky inkubuj 24 hodin při 37 oC.

6. Další postup je stejný jako u předchozí metody.

4.6.2 Citlivost mikroorganismů k antibiotikům

V roce 1928 Alexander Fleming objevil antibiotické působení plísně Penicillium

na stafylokoky. Později definovaná účinná látka – penicilin inhiboval růst

grampozitivních bakterií. Další antibiotikum – streptomycin, které bylo účinné i proti

gramnegativním bakteriím objevil v roce 1940 Selman A. Waksman ve filtrátu kultury

aktinomycet. Od té doby bylo isolováno a charakterisováno několik tisíc antibiotik

produkovaných bakteriemi, plísněmi a vyššími houbami. Pouze malá část z nich se však

vyrábí průmyslově (asi 100 druhů) a používá se v humánní i veterinární medicině.

Antibiotika se vzájemně liší svou chemickou strukturou, spektrem účinnosti a

mechanismem účinku na mikroorganismy. Antibiotika se řadí mezi tzv.

chemotherapeutické prostředky. Korektní použití těchto látek předpokládá isolaci

pathogenu (bakterie vyvolávající onemocnění) a otestování jeho citlivosti na vhodná

antibiotika.

Disková difusní metoda je standardním postupem. Na povrch Petriho misky

s vhodnou živnou půdou se rovnoměrně naočkuje testovaný mikroorganismus. Papírové

disky napuštěné známými koncentracemi různých antibiotik se přiloží na povrch agaru..

Během následné inkubace antibiotika difundují z papíru do agaru a jejich koncentrace

ve směru os okraje disku postupně slábne. Účinné antibiotikum vytvoří kolem disku

průzračnou zónu bez nárůstu buněk. Koncentrace antibiotika na okraji zóny představuje

minimální inhibiční koncentraci (MIC). Pro vyhodnocení se udává průměr zóny v mm.

Jelikož rychlost difuse hodně závisí na typu půdy užívá se v klinické mikrobiologii

Müller-Hintonův agar, který umožňuje dobrou difusi a srovnání výsledků mezi

jednotlivými laboratořemi.

Cv.4.10 Zjištění citlivosti mikroorganismů k antibiotikům

Strana82

Potřeby : 2 sterilní Petriho misky, Müller-Hintonův agar (půda č.Xy), bujonové

kultury testovaných mikroorganismů (nejlépe vyrostlé přes noc), testovací disky

s antibiotiky, sterilní skleněná zahnutá tyčinka (hokejka).

Provedení :

1. Na povrch Müller-Hintonova agaru v Petriho miskách, zbaveného nadbytečné

vlhkosti (60 oC, 10–15 minut), pipetuj 0,1–0,2 bujonové kultury testovaného

mikroorganismu, rozetři skleněnou hokejkou a nech zaschnout.

2. Sterilní pinzetou přilož na povrch půdy standardní testovací disky s antibiotiky

(zpravidla 6 disků na 1 misku).

3. Inkubuj 24–36 h při 37oC a sleduj tvorbu zón kolem disků. Proměř jejich velikost

a zapiš do tabulky.

Poznámky :

1. Velikost zóny 5-10 mm odpovídá citlivému mikroorganismu.

Velikost zóny 12 a více mm velmi citlivému mikroorganismu.

2. Do půdy je možno přidat 1 ml 0,5% vodného roztoku TTC (trifenyl tetrazolium

chlorid) pro zvýraznění inhibiční zóny; růst se projeví červeným zabarvením

(redukovaná forma TTC).

Kontrolní otázky ke kap. 4 - SLEDOVÁNÍ VLIVU VNĚJŠÍCH PODMÍNEK NA

MIKROORGANISMY

1. Co je minimální, optimální a maximální teplota pro růst mikroorganismů ? 2. Definujte smrtící teplotu. 3. Proč stanovujeme letalitní křivku ? 4. Jaké je optimální pH pro růst kvasinek, bakterií a plísní ? 5. Jak ovlivňuje změna pH odolnost mikroorganismů vůči teplotě ? 6. Definujte plasmolysu a plasmoptyzu. 7. Co jsou halofilní bakterie a osmotolerantní kvasinky ? 8. Jaká je nejúčinnější vlnová délka UV světla ? 9. Proč musíme při ozařování UV světlem odstranit víčko skleněné Petriho misky ? 10. Které bakterie jsou citlivější vůči barvivům ? G+ nebo G- bakterie ? 11. Má rozdíl v citlivosti bakterií vůči barvivům nějaký praktický význam ? 12. Jmenujte alespoň 5 antibiotik, jejich mikrobiálního producenta, chemické složení

a spektrum účinnosti. 13. Co vyjadřuje fenolový koeficient ?

Strana83

Tabulka YX Velikosti inhibičních zón pro různá antibiotika

Označení antibiotikum množství průměr inhibiční zóny (mm) disku rezistentní citlivý AM ampicilinapro testy 10 μg 13 a méně 17 a více G- bakterií a enterokoků AM ampicilina pro testy stafylo- koků a mikrobů citlivých 10 μg 28 a méně 29 a více na penicilin G B bacitracin 10 j 8 a méně 13 a více CB carbenicilin pro testy 100 μg 19 a méně 23 a více Proteus a Escherichi coli CB carbenicilin pro testy 100 μg 13 a méně 17 a více Pseudomonas aeruginosa C chloramfenikol 30 μg 12 a méně 18 a více E erythromycin 15 μg 13 a méně 18 a více K kanamycin 30 μg 13 a méně 18 a více ME methicilinb 5 μg 9 a méně 14 a více P penicilin G pro testy 10 j 20 a méně 21 a více stafylokokůc P penicilin G pro testy 10 j 11 a méně 22 a více ostatních bakterií PB polymyxin Be 300 j 8 a méně 12 a více S streptomycin 10 μg 11 a méně 15 a více

Strana84

ST sulfonamidy 300 μg 12 a méně 17 a více T tetracyklin 30 μg 14 a méně 19 a více SXT trimethyloprim- 23 μg 10 a méně 16 a více -sulfomethoxazol a disk s ampicilinem se užívá pro testování citlivosti jak na ampicilin, tak na betacilin b disk s methicilinem se užívá pro testování penicilinasa resistentních penicilinů c disk s penicilinem G se užívá pro testování penicilinasa citlivých penicilinů, vyjma ampicilinu a carbenicilinu e polymyxin B a colistinmají slabou difuzi do agaru, přesnost určení je menší než u ostatních antibiotik

5. IZOLACE MIKROORGANISMŮ

Izolací rozumíme získávání čisté kultury určitého mikroorganismu z mikrobiální

směsi. Používáme jí:

1. k získání čistých kultur z přírodního materiálu,

2. k čistění infikovaných kultur,

3. k získání buněk vhodných vlastností z dané kultury určitého mikroorganismu

Princip izolace spočívá v dostatečném zředění mikrobiální směsi ve vhodné

půdě takovým způsobem, aby kolonie, které vzniknou rozmnožováním, vyrostly z jedné

buňky. Při metodách makroskopicky kontrolovatelných sledujeme vyvíjející se kolonie

na Petriho mikách pouhým okem a jejich čistotu zjišťujeme mikroskopicky až po jejich

dostatečném nárůstu. Metody mikroskopicky kontrolovatelné dovolují sledování celého

izolačního postupu pomocí mikroskopu a skýtají záruku, že narostlá kolonie vznikla

skutečně z jedné buňky.

Podle účelu práce volíme i metody. Při získávání nových kultur nejdříve žádaný

mikroorganismus pomnožíme za současného potlačení ostatní mikroflory vhodně

volenými podmínkami (tzv. nahromaďovací kultury) a rovněž během izolace se

snažíme o optimální rozvoj žádaného mikroorganismu za minimálního rozvoje

provázející mikroflory (pomocí selektivní půdy, pH, teploty apod.). Pro vlastní izolaci

používáme většinou metody makroskopicky kontrolovatelné. Také při čištění

infikovaných kultur používáme nejdříve fyzikální a chemické metody, jež doplňujeme

izolací makroskopicky kontrolovatelnou. Při selekci vodných kmenů, kdy jde o

Strana85

získávání buněk určitých vlastností z kultury, jež je sice druhově jednotná, ale

fyziologicky není homogenní, používáme někdy metody mikroskopicky

kontrolovatelné, doplněné sledováním žádaných fyziologických vlastností. Velmi často

se však používají i zde metody makroskopicky kontrolovatelné, u nichž jsou kultivační

podmínky voleny tak, aby hledané fyziologické rozdíly byly pokud možno snadno

rozlišitelné (viz kap. ). Řada izolačních metod je používána v genetických pracích pro

zjišťování různých typů mutantů (viz kap. ). Mikroskopicky kontrolovatelné metody se

používají při tetrádové analýze a při izolaci zygot.

5.1 Nahromaďovací kultury

Při získávání určitého mikrobiálního druhu z jeho přírodního zdroje nebo při

přečišťování silně kontaminovaných kultur musíme během kultivace zvýhodnit žádaný

mikroorganismus a všechny ostatní mikroorganismy, které jsou zpravidla v silném

nadbytku, co nejvíce potlačit nebo dokonce usmrtit. Teprve po této nahromaďovací

kultivaci můžeme s úspěchem použít některou z izolačních metod (viz kap. ), kterou

můžeme kombinovat ještě s použitím indikátorů určitých fyziologických vlastností

(např. zjišťování tvorby kyselin dle barvy, pH, indikátoru v živné půdě, tmavnutí

kolonií v důsledku reakce vznikajícího H2S s přítomným Fe2+, vznik hemolysy na

krevním agaru, štěpení lipidů nebo bílkovin, projevující se zonami kolem kolonií

vyrostlých na příslušných půdách apod.

Úspěšnost nahromaďovacích kultivací je podmíněna znalostí fyziologických

vlastností nejen žádaného mikrobiálního druhu, ala i většiny doprovázejících

mikroorganismů.

Nejvhodnějším zdrojem mikroorganismů při získávání nových kultur je

zemědělská nebo lesní půda, bahno a rybniční voda, což jsou přírodní rezervoáry nejen

aktinimycet, ale i většiny ostatních bakterií, kvasinek a plísní. U kvasinek jsou velmi

vhodným zdrojem ještě květní nektary a trávicí trakt opylujícího hmyzu a dále přezrálé

plody peckového a bobulového ovoce, u plísní ještě vzduch různých lokalit, plesnivé

potraviny a potravinářské suroviny (např. chléb, ovoce, kořenová zelenina). Speciální

zdroje můžeme použít také pro některé menší skupiny bakterií (např. nepasterované

mléko pro získání Streptoccocus lactis, ementálský sýr pro získávání propionových

bakterií, čerstvé fekálie pro získání koliformních bakterií (tj. Escherichia coli a

Enterobacker aerogenes) a enterokoků (tj. hlavně Streptococcus faecalis),zkysané víno

Strana86

pro získání octových bakterií, kysané zelí pro získání některých mléčných bakterií

apod.). Výhoda speciálních zdrojů spočívá v tom, že žádaný mikroorganismus zde

převládá a průvodní mikroflora je omezena jen na několik druhů, kdežto v obdělané

půdě je přítomna velmi široká paleta druhů a žádaný mikroorganismus se nemusí vždy

získat.

Po nahromaďovací kultuře musí vždy následovat izolační metoda, nejčastěji

čárkováním na utuhlý agar (viz kap. ). Jestliže tuto izolaci provádíme na selektivním

agaru, potlačujícím rozvoj doprovodných organismů, musíme získanou ještě znova

přečistit na neselektivním agaru, abychom se přesvědčili, že neobsahuje jednotlivé

buňky doprovodné mikroflory, jež by se při pěstování za neselektivních podmínek

mohly přehlédnout. Příslušnost získané čisté kultury k žádanému druhu zjistíme na

základě morfologických a biochemických identifikačních tabulek nebo klíčů (viz kap.

).

Jako příklad uvádíme nahromadění a získání těchto nejdůležitějších skupin

mikroorganismů :

1. Příslušníky rodu Bacillus získáme tím, že vzorek kultivujeme 3 dny v MPB (půda

č. ) ve zkumavce při 30°C a pak vyhříváme kulturu 3 min na vroucí vodní lázni,

čímž u-smrtíme vegetativní formy všech přítomných bakterií i všechny zárodky

kvasinek a plísní. Z této povařené kultury izolujeme jednotlivé druhy rodu

Bacillus na MPA(půda č. ).

2. Příslušníky rodu Clostridium získáme tím, že vzorek (např. obdělané půdy,

rozemletý neočištěný brambor apod.) kultivujeme ve zkumavce s MPB (půda č. )

s přídavkem 5% glukosy za anaerobních podmínek (např. vyvařením O2 a přelitím

sterilním parafínovým olejem) 3 dny při 30°C a pak pokračujeme obdobně jako u

rodu Bacillus, ale s tím rozdílem, že kultivujeme anaerobně (viz kap. ) na půdě

obsahující sacharidy, např. bramborový agar (tj. půda č. ) nebo na agarové půdě s

1% peptonu a 5% glukosy.

3. Mléčné bakterie z rodu Lactobacillus,Streptococcus,Pediococcus a Leuconostoc

pomnožujeme na bohaté tekuté sacharidové půdě (půda č. ) s přídavkem 0,02%

azidu sodného (přidává se až po sterilaci půdy!), který potlačí rozvoj všech

aerobních a fakultativně anaerobních mikroorganismů. Místo půdy č. můžeme

použít také roztok obsahující 1,5% peptonu, 0,45% masového výtažku, 0,75%

glukosy, 0,75% NaCl a 0,02% azidu sodného. Po inkubaci nahromaďovací

kultury při optimální teplotě pro žádaný druh izolujeme mléčné bakterie metodou

Strana87

lití desek (kap.č ) na agarové půdě č. s pří-davkem 2% sterilního CaCO3,

rozmíchaného do půdy. Po utuhnutí desku přelijeme ještě asi 1 mm silnou

vrstvičkou této půdy, abychom zajistili mikroaerofilní podmínky. Pro mléčné

bakterie jsou charakteristické jasné zóny kolem kolonií v důsledku přeměny

CaCO3 v rozpustný laktát vápenatý, dále nepřítomnost katalázy, grampozitivní

reakce, nepřítomnost spor. Vhodným zdrojem některých mléčných bakterií jsou

vedle mléčných výrobků také sladové klíčky, stěr z ústní dutiny, střídka ze střední

části většího bochníku chleba, různé traviny apod. Steptoctococcus faecalis

můžeme získat čárkováním suspenze fekálií na půdu obsahující 1% enzymově

natráveného kaseinu, 0,5% suchého kvasničního autolyzátu, 0,5% KH2PO4, 1%

glukosy, 0,02% azidu sodného a 1,5% agaru a inkubací při 37°C.

4. Běžné gramnegativní bakterie pomnožujeme v MPB (půda č. ) s přídavkem

některých barviv (např. 0,02% krystalové violeti) nebo aniontových povchově

aktivních látek (na př. 0,01% dodecyl sulfátu sodného nebo 0,15% žlučových

solí), jež potlačují rozvoj grampozitivních bakterií. Pak následuje izolace

čárkováním (viz. kap. ) na MPA (půda č. ). Pro získání Escherichia coli nebo

Enterobacter aerogenes čárkujeme izolační metodou přímo ze suspenze čerstvých

fekálií na selektivní diagnostický agar, např. Levinův (půda č. ) nebo Endův

(půda č. ). Po 48 h inkubace při 37°C E.coli tvoří tmavé ploché kolonie, často

s kovovým leskem, kdežto E. aerogenes tvoří větší vypouklé kolonie s tmavým,

případně červeným středem a širokým bílým okrajem. Příslušníky rodu

Pseudomonas získáme z povrchu zkaženého masa uchovávaného v chladničce, z

ryb, z kažených vajíček apod. Vzorek masa nebo vajec má být třepán ve

fosfátovém pufru o pH 7,0 s přídavkem 0,02% krystalové violeti 24 h při 20°C.

Odtud čárkujeme izolační metodou na agar s MgCl2 a K2SO4 (základní půda č. )

neboť tyto soli podporují tvorbu fluoreskujícího barviva u příslušníků rodu

Pseudomonas.Selektivity dosáhneme přídavkem (na 1000ml půdy): 44,9 mg (tj.

75 000 jednotek) penicilinu G k potlačení G+ bakterií, 45 mg novobiocinu

k potlačení G- bakterií a 75 mg cykloheximidu k potlačení kvasinek a plísní. Tato

antibiotika se rozpustí ve 3 ml ethanolu a naředí se 50 ml sterilní vody a přidají se

ke sterilní půdě. Selektivity pro rod Pseudomonas nebo dokonce pro druh Ps.

aeruginosa lze dosáhnout také kombinacemi antibiotik uvedenými u půdy č. .

Charakteristickými znaky rodu Pseudomonas jsou : pohyblivost pomocí polárního

Strana88

bičíku, nezkvašování cukrů, přítomnost lipas, proteinas, cytochromidas (viz kap.

).

5. Bakteriální kontaminaci z pekařského nebo krmného droždí nebo z plísňových

fermentací (např. při výrobě penicilinu, citronové, fumarové nebo itakonové

kyseliny) či z jiného materiálu, kde převládají plísně, izolujeme tak, že rozvoj

kvasinek a plísní potlačíme přídavkem cykloheximidu v množství 1 mg/ml živné

půdy. Cyhloheximid je termostabilní, takže se může přidávat do živné půdy před

její sterilací.

6. Kvasinky a plísně můžeme izolovat od bakterií na SA (půda č ) okyseleném po

sterilaci na pH 4,0–4,2, neboť růst většiny bakterií je při tomto pH inhibován.

V přítomnosti acidotolerantních bakterií, nebo nesnáší-li daný druh kvasinek nebo

plísní tak kyselé prostředí, inhibujeme rozvoj bakterií směsí antibiotik (např. 100

μg chloramfenikolu, 30 μg streptomycinu a 100μg tetracyklinu/ml mírně

okyseleného živného agaru). Vhodnou půdou pro izolaci plísní je také kompletní

agar (půda č. ) s přídavkem uvedených antibiotik nebo Sabouraudův agar ( půda

č. ). Nejbohatším zdrojem kvasinek a plísní je obdělaná půda, avšak plísně

můžeme získat také ze vzduchu (stačí exponovat na různých místech 10–20 min

otevřené Petriho misky se SA nebo KM, a z plesnivějícího materiálu

(ovoce,chléb), kvasinky pak z vinných hroznů, z povrchu zralého peckového

ovoce, z květních nektarů, z půdy vinic, třešňových nebo švestkových sadů apod.

7. Pomalu rostoucí plísně můžeme od rychle rostoucích izolovat na chudých živných

půdách (např. jen 2%ní agar ve vodovodní vodě nebo 2% ní sladina ztužená 2%

agaru) nebo růst částečně potlačíme přídavkem 0,01% bengálské červeně.

Jednotlivé velmi nízké kolonie pak přeočkujeme na sladinový nebo kompletní

agar (půdy č a ).

5.2 Základní izolační techniky

Základní izolační techniky rozdělujeme podle způsobu kontroly :

5.2.1 Makroskopicky kontrolovatelné metody

Strana89

Tyto metody dělíme takto :

1. Izolace litím desek spočívá v rozmíchávání mikrobiální směsi do roztavené

živné půdy a v postupném zřeďování do dalších půd, z nichž lijeme desky.

Používáme ji většinou pro kvasinky (použitá půda je sladinová želatina) a pro

bakterie (masopeptonový agar). Obsahuje-li směsná kultura vedle kvasinek ještě

bakterie, hustou suspenzi kvasinek přeneseme do Raulinova roztoku (roztok č.

) a necháme stát 24 h při laboratorní teplotě, čímž dojde k usmrcení většiny

bakterií. Vhodnější však je přidat do želatinové půdy směs antibiotik, jež

potlačuje rozvoj prakticky všech bakterií.(viz kap. ).

Cv.5.1 Izolace kvasinek litím desek

Potřeby : 3 zkumavky se sladinovou želatinou (půda č. ), 3 sterilní Petriho misky,

sterilní zkumavky, sterilní voda, teploměr, šikmé sladinové agary(půda č. ), směsná

kultura kvasinek.

Provedení :

1. Očkovací jehlou přenes očko ze vzorku (je-li směs v kapalné půdě, rozmíchej

nejdříve půdu mírným kroužením) do zkumavky se sterilní vodou. Promíchej

důkladně potřepem i rotací mezi dlaněmi. Přenes očkem kapku z takto vzniklé

suspenze do první zkumavky a rozehřátou půdou, vytemperovanou na 30°C, a opět

důkladně promíchej. Pak přenes jedno očko z této suspenze do další zkumavky

s půdou (II), promíchej a přenes další očko z posledního zředění (II) do třetí

zkumavky s půdou a opět důkladně promíchej.

2. Zaočkovanou půdu ze zkumavek rozlij asepticky do Petriho misek (nezapomeň na

ožehnutí okraje zkumavky před rozlitím!), roztírej rotačním i přímočarým pohybem

stejnoměrně po celé misce a nech ztuhnout ve vodorovné poloze.

3. Fixem označ misky I, II, III a datem a inkubuj při laboratorních teplotě, až vyrostou

dosti velké, dobře izolované kolonie.

4. Zjisti makroskopicky (případně lupou) přítomnost dvou typů kolonií. Z jedné dobře

izolované kolonie každého typu připrav nativní mikroskopické preparáty a zjisti, zda

každý obsahuje jen buňky jednoho druhu. V kladném případě odpíchni zbytek čisté

kolonie a přenes na půdu č. . Inkubuj při 28°C. V záporném případě proveď

zkoušku s jinými koloniemi. Nenajdeš-li žádnou čistou kolonii, proveď izolaci

znovu.

Strana90

5. Po 24 –48 h inkubaci zkontroluj mikroskopicky (tj. v nativním preparátu) čistotu

obou kultur na šikmých agarech.

Poznámka :

Stejný postup můžeme použít i při izolaci bakterií. Jako živná půda slouží

MPA(půda č. ) vytemperovaný na 45°C, kultivaci provádíme 1-2 dny při 30-37°C a pro

mikroskopickou kontrolu jednotlivých kolonií připravujeme fixovaný preparát barvený

podle Grama (viz kap. č. ), který pozorujeme zvětšením 10×100(s imerzním olejem).

2. Izolace roztěrem je modifikací předchozí metody. Spočívá ve žřeďování

suspenze buněk ve sterilní vodě nebo fyziologickém roztoku, pipetování 0,1 ml

zředěné suspenze na utuhlou předsušenou agarovou půdu a roztírání pomocí

zahnuté skleněné tyčinky po celém povrchu desky až do úplného vsáknutí.

Používá se hlavně pro kvasinky a plísně, neboť ji můžeme kombinovat s přímým

počítáním buněk Thomovou komůrkou (viz kap ) a naředěním tak, aby na desce

vyrostlo 10 – 200 kolonií.

Cv.5.2 Izolace roztěrem

Potřeby : Směsná suspenze kvasinek, 3 desky předsušeného SA(půda č. )

v Petriho miskách, 5 sterilních zkumavek, sterilní voda(cca100ml), Thomova nebo

Bürkerova komůrka, podložní a krycí skla, skleněná tyčinka, ethanol, sterilní pipeta

10 ml, sterilní pipety 1ml, dva šikmé SA.

Provedení :

1. Předsuš desky SA při 60o-70°C , až se na jejich povrchu vytvoří vyvýšené hrany.

2. Pomocí Thomovy nebo Bürkerovy počítací komůrky zjisti koncentraci buněk

v suspenzi (viz kap. )

3. Připrav si plán postupného desítkového až stovkového zřeďování této suspenze do

10 ml sterilní vody (tj. 1 ml + 9 ml H2O, 0,1 ml + 9,9 ml H2O apod.) tak, aby

v posledních třech zkumavkách byly koncentrace buněk (1–2 )×104/ml, (1–

2)×103/ml a 100–200/ml (viz obr. č. ). Podle tohoto plánu si připrav zkumavky a

příslušnými objemy sterilní vody.

4. Zřeď suspenzi asepticky podle zřeďovacího plánu tak, že pro každé zředění použiješ

novou sterilní pipetu. Pipetu používanou pro přípravu zředění D (obr. č ), avšak

použij současně pro vyočkování suspenze C na misku I (obr. č. ) atd. Použité pipety

Strana91

ihned odkládej do válce s dezinfekčním roztokem. Při každém zřeďování a těsně

před pipetováním suspenzi důkladně promíchej.

5. Suspenze na agarových deskách I, II, III ihned důkladně rozetři (do sucha)

přímočarým a krouživým pohybem sterilní skleněné tyčinky, zahnuté do tvaru

hokejky. Při roztírání otáčej misku levou rukou proti směru hodinových ručiček,

čímž dosáhneš rozetření suspenze po celém povrchu desky. Víčko misky přidržuj

nakloněné nad miskou pomocí levé ruky tak, aby se nedotýkalo skleněné tyčinky

používané při roztírání.

6. Inkubuj převrácené desky (zavěšený agar) při 28°C 2-3 dny. Zjisti počet vyrostlých

kolonií a srovnej s výsledkem přímého počítání buněk. Pak zjisti makroskopicky

přítomnost dvou typů kolonií. Z dobře izolovaných kolonií každého typu připrav

nativní preparát a mikroskopováním zjisti, zda každá kolonie obsahuje pouze jeden

typ buněk. V kladném případě přeočkuj zbytek téže kolonie na šikmý SA a inkubuj

jej 2 dny při 28°C. Totéž proveď s druhým typem kolonií. Šikmé agary označ

štítkem s datem očkování, jménem a označením kultury.

7. Mikroskopicky, tj. v nativním preparátu, zkontroluj čistotu obou vyizolovaných

kultur na šikmých agarech.

Poznámka :

Skleněnou tyčinku nejčastěji sterilujeme ponořením do ethanolu a pak

ožehnutím, po němž následuje ochlazení na vnitřní straně víčka skleněné Petriho misky

nebo nad povrchem agaru pootevřené umělohmotné Petriho misky.

3. Izolace čárkováním na desky záleží v postupném čárkování a tím zřeďování

mikrobiální směsi pomocí očkovací jehly na agarovou desku. Je to

nejuniverzálnější metoda, použitelná pro bakterie, kvasinky, plísně i pro směsi

těchto skupin, jestliže použijeme vhodnou půdu, případně určitou skupinu

mikroorganismů ještě potlačíme vhodným antibiotikem nebo pH (viz kap. ).

Izolace dosáhneme jen tehdy, jestliže použijeme velmi malé množství dobře

rozmíchané suspenze buněk (ve sterilní vodě nebo kapalné živné půdě). U plísní

dosáhneme dobré rozptýlení spor většinou pouze v roztoku neionogenní

povrchově aktivní látky (např.0,2% roztok Tweenu).

Cv.5.3 Izolace čárkováním desky

Strana92

Potřeby : Deska MPA (půda č. ) v Petriho miskách, Gramovy barvící roztoky

(rozto-

ky č ), aceton, 2 šikmé MPA, směs bakterií v MPB.

Provedení :

1. Sterilním očkem naber malé množství rozmíchané mikrobiální suspenze, odklop

poněkud víčko Petriho misky a táhni mnohonásobně očkem po povrchu ztuhlé půdy

v pruhu širokém asi 2 cm a dlouhém asi 3 cm.Vysterilizuj očko v plameni, ochlaď

na nezaočkovaném místě agaru a bez nabrání další kultury roztírej konec pruhu

v úhlu asi 120°. Tento postup opakuj po celém povrchu misky a případně poslední

pruh ukonči. (obr. ).

2. Označ misku datem a číslem a inkubuj v převrácené poloze 24-48 h při optimální

teplotě (pro většinu bakterií 37°C).

3. Pouhým okem zjisti přítomnost různých typů kolonií. Z dobře izolované (tj.

osamocené a pravidelné) kolonie každého typu z největšího zředění připrav preparát

fixovaný plamenem a obarvený podle Grama (viz. kap. ) a jeho mikroskopováním

při zvětšení 10×100 (s imerzním olejem! ) zjisti, zda příslušná kolonie obsahuje jen

jeden druh bakterií. V kladném případě přeočkuj zbytek téže kolonie na šikmý agar

a inkubuj 24 h při optimální teplotě. V negativním případě, (tj. po přezkoušení všech

kolonií stejného typu) opakuj izolaci na novou desku MPA. Stejný postup opakuj u

dalších typů kolonií.

4. Po inkubaci zkontroluj čistotu kultur na šikmých agarech makroskopicky i

mikroskopicky (po Gramově barvení).

Poznámka :

Tato metoda je vhodná také pro izolaci kvasinek a plísní za použití SA (půda č.

), kompletního agaru (půda č. ) a u plísní ještě Sabouraudova agaru (půda č. ) nebo

Czapek-Doxova agaru (půda č. ). Kultivační teplota je 22o-30°C, doba 2-4 dny. Pro

potlačení růstu bakterií zde můžeme použít také přídavek antibiotik (viz kap. ).

4. Izolace rozmícháním do vysoké vrstvy agaru (metoda Burriho) se používala

pro anaerobní mikroorganismy. Po vzrůstu kolonií valeček půdy z kultivační

trubičky asepticky vytlačíme, mechanicky rozdělíme a čisté kolonie

(mikroskopicky zkontrolované) přeneseme do vhodných půd. Dnes však

izolujeme anaerobní mikroorganismy obvyklými postupy a kultivujeme desky za

anaerobních podmínek (viz kap. )

Strana93

5.2.2 Mikroskopicky kontrolovatelné metody

Tyto metody spočívají ve zředění mikrobiální směsi do živné půdy, která se

nanese na krycí sklíčko, upravené do komůrky. Pomocí mikroskopu se pak zjistí nebo

vyizolují osamocené buňky, které se potom inkubují do vzniku kolonie. Nejpoužívanější

metody jsou:

1. Lindnerova kapičková metoda,používaná v kvasném průmyslu pro

kvasinky.Kvasinky se zřeďují do sladiny,jež se sterilním perem přenáší v podobě

kapiček na sterilní krycí sklíčko.Pomocí mikroskopu se vybírají ty kapičky,jež

obsahují pouze jednu buňku.

Cv.5.4 Lindnerova kapičková metoda

Potřeby : Několik zkumavek s čistou sterilní sladinou (půda č. ), sterilní voda ve

zkumavkách, psací pero s násadkou, komůrka (Böttcherova, Kochova), sterilní pipeta

(1ml), vazelína, sterilní proužky filtračního papíru, pinzeta, mladá předčištěná kultura

kvasinek, zkumavky se sterilní sladinou, 96%ní ethanol, skleněná tyčinka.

Provedení :

1. Do jedné zkumavky se sterilní vodou přenes ožehnutým očkem 2-4 kapky

kvasinkové suspenze a důkladně promíchej. 3 kapky takto vzniklé suspenze

přenes do zkumavky s čistou sladinou a dobře promíchej.

2. Připrav zkusmou komůrku : Otři sklo na pracovní ploše 96%ním ethanolem a

ožehni, ožehni komůrku a polož na ni dno vyšší sterilní Petriho misky, ožehnutou

tyčinkou přenes na dno komůrky kapku sterilní vody a okraje komůrky potři

vazelínou. Krycí sklíčko pozři po jedné straně vazelínou a stírej prstem až vrstva

vazelíny je velmi slabá. Protáhni sklíčko 3 x plamenem, nech zchladnout blízko

plamene a polož přes komůrku, mastnou stranou vzhůru. Sterilním psacím perem

nanes rychle a lehce 25–36 teček zředěné suspenze kvasinek do čtverce do středu

krycího sklíčka. Kapičky mají být maximálně jako špendlíkové hlavičky. Sklíčko

překlop ihned na komůrku (obr. ).

3. Prohlédni pod mikroskopem (pozor na proražení sklíčka objektivem při

zaostřování!). Nejdříve použij zvětšení 10×10, pak 10×45. Zorné pole má

obsáhnout celou kapičku. Zaostři na horní okraj a suň tubus opatrně dolů, až

Strana94

zaostříš na spodní okraj, kde bývají nahromaděny buňky i různá zrníčka.

Prohlédni ve všech výškách a zjisti, kolik buněk je průměrně v kapičce.

4. Zřeď suspenzi buněk ve sladině ještě tolikrát, kolik je buněk v kapičce a připrav

stejným způsobem komůrku k izolaci.

5. Prohlédni všechny kapičky popsaným způsobem a zakresli do plánku polohu

kapiček s jednou buňkou a bez nečistot ze sladiny nebo z pera. Je nutno získat

alespoň 5 kapiček s jednou buňkou, neboť všechny vyizolované buňky za daných

podmínek nevypučí.

6. Inkubuj při 20°C. Kontroluj mikroskopicky po několika hodinách a pak každý

příští den. Za 3-4 dny se kapičky zakalí rozrostlými svazky buněk (nenech

přestárnout!).

7. Ožehnutou pinzetou vyjmi jeden proužek sterilního filtračního papíru z misky,

levou rukou nadzdvihni krycí sklíčko s komůrky (ale neobracej kapičkami vzhůru

!), špičkou filtračního papíru vysaj vyhlédnutou kapičku s rozrostlou kolonií a

vhoď papírek asepticky do připravené sladiny. Sklíčko s kapičkami ihned zase

přendej na komůrku a přitiskni. Zjisti mikroskopicky,zda jsi odpíchl správnou

kapičku a pokračuj stejným způsobem s dalšími kapičkami a sladinou.

8. Inkubuj všechny sladiny 48 h při 26°C. Pak zjisti mikroskopicky čistotu kultury (v

nativním preparátu).

Poznámka:

Místo sterilního filtračního papírku možno pro odpíchnutí vhodné použít

platinové preparační jehly, ožehnuté a ochlazené ve sladinové želatině. Kvasinky ulpí

na želatině, odkud se rozmíchají do sterilní sladiny.

2. Izolace pomocí mikromanipulátoru, která nyní vytlačuje Lindnerovu metodu, je

nezbytná při genetické analýze kvasinek a jiných askomycet. Řídká suspenze buněk

se nanese na tenkou vrstvu agaru na krycím sklíčku, která se překlopí na zvláštní

komůrku, a pomocí jehly mikromanipulátoru se jednotlivé buňky přenesou na

vhodné místo tohoto agaru. Vrstva manipulačního agaru se pak inkubuje na desce

živného agaru do vzniku kolonií.

3. Izolace pomocí monoskopického izolátoru spočívá v rozprostření řídké suspenze

kvasinkových buněk nebo spor plísní na živný agar v Petriho misce a objektivem

10× zvětšujícím, který má nasazem izolátor, se najde osamocená buňka.

Zaostřovacím šroubem se trubička izolátoru spustí až na dno misky, čímž se vykrojí

Strana95

váleček agaru se sporou. Tlakem sterilního vzduchu (přes vatový filtr !) se tento

váleček převede do sterilní živné půdy. Podrobný popis viz Nečásek a spol., Preslia

26,105 (1954).

Cv.5.5 Izolace buněk nebo spor pomocí mikromanipulátoru

Popis : Mikromanipulátor je zařízení, které umožňuje sebrat pomocí kapilární tyčinky

nebo trubičky určitou buňku nebo sporu a přenést ji do vzdálenosti až 30 mm za

současné mikroskopické kontroly. Protože můžeme při mikromanipulování použít jen

objektivy 10× nebo 20× zvětšující, mohou být pomocí mikromanipulátoru izolovány

pouze buňky nebo spory kvasinek a plísní. Nejčastěji se používají klouzavé

mikromanipulátory (viz obr. ), i když jsou známy i pneumatické (např. francouzské).

Postup při mikromanipulování:

1. Připrav si několik mikromanipulačních jehel tím, že v plameni mikrokahanu, na

jehož konci je nasazena injekční jehla, roztavíš konce dvou tyčinek o takovém

průměru, aby mohly být upevněny v držáku jehly mikromanipulátoru (7 v obr. ),

pak tyčinky vysuň z plamene a spoj je roztavenými konci na vteřinu v úhlu 120o-

140° a prudkým tahen je od sebe odtrhni. Vzniklý skleněný vlas zkrať nůžkami na

1-2 mm u každé tyčinky. Tloušťka vlasu má být asi dvoj- až trojnásobek velikosti

objektu, který budeš mikromanipulovat, a jeho konec musí být výše než horní okraj

tyčinky při jejím vodorovném uložení (viz obr.).

2. Otři ethanolem skleněnou desku stolu, ožehni ji a připrav na ní sterilní krycí sklíčka

velikosti 25×25 mm až 25×50 mm a přikryj je polovinami sterilních Petriho misek.

3. Na tato sklíčka napipetuj mikromanipulační agar (půda č. 35) tak, aby se vytvořila

rovná vrstva tloušťky asi 1 mm. Po jejím utuhnutí odřízni a odstraň pomocí

sterilního nože asi dvoumilimetrové okraje tak, aby agarová vrstva byla užší, než je

šířka mikromanipulační komůrky (obr. ). Podél delší strany agarové vrstvy nanes

úzkou čáru zředěné suspenze buněk nebo asků, jež budeš mikromanipilovat.

Suspenze však nesmí být přímo na hraně agaru, aby nestekla na krycí sklíčko. Po

vsáknutí suspenze překlop sklíčko na sterilní mikromanipulační komůrku (obr. ),

jejíž horní hrany jsou lehce potřeny vazelínou, aby k ní krycí sklíčko dobře přilnulo.

Agar na krycím sklíčku je orientován dolů („zavěšený agar“) a nesmí se dotýkat stěn

Strana96

komůrky. Komůrka se steriluje opláchnutím neředěným ethanolem s následujícím

opláchnutím sterilní vodou.

4. Vysterilizuj mikromanipulační jehlu ponořením do ethanolu, dobře ji ocákni a

nasaď do držáku jehly (7 v obr. ). Opatrným posouváním pohyblivé části ( 3 v obr.

) pomocí ručky (3a) umísti jehlu do středu zorného pole mikroskopu (pozoruj

zvětšením 10×10) a pomocí hrubého svislého posuvu (šroub 4 v obr. ) a

klouzavého pohybu ručkou zaostři na vlasovou špičku jehly. Potom opatrně sniž

jehlu pomocí šroubu 4 tak, aby nevadila zasunutí komůrky. Při mikromanipulování

již pohybuj jehlou pouze ve svislém směru a všechny ostatní pohyby prováděj

pomocí křížového stolku mikroskopu.

5. Zasuň komůrku do zorného pole mikroskopu a zaostři na nanesenou suspenzi. Pak si

najdi pravý, levý i horní okraj agarové vrstvy a souřadnice jejich polohy, zjištěné na

křížovém stolku, nanes do plánku. Stejným způsobem zjisti a zaznamenej i horní

okraj nátěru suspenze.

6. Zvětšením 10×10 vyhledej v nanesené suspenzi vhodný objekt (buňku, sporu,

natrávený askus apod.), který je osamocen, umísti jej do středu zorného pole, zaostři

zvětšením 10(ok.)×20(obj.) a opatrným zvedáním jehly pomocí šroubů 4 a 5 v obr.

se jej jehlou ze strany dotkni a seber jej s agaru jemným klouzavým pohybem. Pak

jehlu stejným způsobem sniž (asi 1 mm pod agarovou vrstvu) a pomocí křížového

stolku nastav místo, kam chceš objekt přenést. Musí to být alespoň 8 mm od okraje

nátěru a alespoň 2 mm od okrajů agaru a od dalších zmikromanipulovaných objektů.

Pomocí šroubů 4 a 5 (obr. ) opatrně zdvihni jehlu téměř k povrchu agaru (pozoruj

v mikroskopu, aby se jehla nezabodla do agaru!) a lehkým poklepem na šroub 5

objekt shoď na agar za současné mikroskopické kontroly. Do plánku zapiš nynější

souřadnice polohy zmikromanipulovaného objektu. Pak jehlu opatrně sniž asi 1mm

pod agarovou vrstvu a posuvem křížového stolku a opatrným zaostřováním znovu

najdi (při zvětšení 10×10) nanesenou suspenzi a vyhledej další vhodný objekt.

7. Po ukončení mikromanipulace opatrně sniž jehlu, vysuň komůrku, odklop krycí

sklíčko s agarem a pomocí sterilního nože sejmi agarovou vrstvu se sklíčka a přenes

ji na živný agar v Petriho misce, např. kompletní agar (půda č. ). Inkubuj 2-3 dny

při optimální teplotě. Pak přeočkuj vyrostlé kolonie pomocí sterilních párátek nebo

pomocí preparační jehly k dalšímu pomnožení a uchování.

Poznámky :

Strana97

1. Mikromanipulátor musí být umístěn na konzole ve zdi nebo na těžkém laboratorním

stole, aby nepodléhal záchvěvům.

2. Kluzné plochy mikromanipulátoru se potírají jemnou vrstvou směsi speciálních

vazelín, jejichž poměr se volí podle plochy prostředí tak, aby pohyb nebyl příliš

lehký ani příliš obtížný. Tyto plochy nutno chránit před prachem a korozivním

prostředím, aby nedocházelo k drhnutí během pohybu.

3. Mikromanipulační komůrku si můžeš připravit nalepením vhodných skel na běžné

podložní sklo, používané pro přípravu preparátů.

4. Kapilární mikromanipulační jehla nesmí být příliž dlouhá, aby nevibrovala.

5. Centrovanou mikromanipulační jehlu můžeš ponechat v mikromanipulátoru a

vysterilizovat ji před prací pokapáním ethanolem, který stéká do podložené

mističky. Mikromanipulační postup vyžaduje několikadenního zácviku, než se

dosáhne běžné rychlosti.Při pomalé práci mikromanipulační agar vysychá a stává se

lepkavým, což ztěžuje sbírání pomocí jehly.

6. Jestliže vybraný objekt nemůžeme sebrat s agaru, můžeme jej pomocí

mikromanipulační jehly posunovat po povrchu agaru. Posun se provádí pomocí

křížového stolku mikroskopu a musí být neustále kontrolován mikroskopem.

Kontrolní otázky ke kap. 5 - IZOLACE MIKROORGANISMŮ

1. Co rozumíme izolací mikroorganismů a kdy ji provádíme?

2. Kdy připravujeme pomnožovací kultury a jaký je jejich princip?

3. Jaké znáš přírodní zdroje kvasinek,mléčných bakterií,koliformních

bakterií,octových bakterií,příslušníků rodu Pseudomonas,akcynomicet?

4. Jak získáš příslušníky rodu Bacillus nebo Clostridium? Jak možno zvýhodnit růst

kvasinek a plísní proti bakteriím,bakterií proti kvasinkám a plísním?

5. Uveď principy nejdůležitějších makroskopicky kontrolovaných izolačních metod.

Jmenuj alespoň čtyři znaky,které použiješ pro rozlišení kolonií při izolačních

metodách.

6. Které znáš mikroskopicky kontrolované izolační metody?

Strana98

6. ZJIŠŤOVÁNÍ POČTU MIKROBIÁLNÍCH BUNĚK V PROSTŘEDÍ

V mikrobiologii jsme často postaveni před úkol stanovit počet mikrobiálních

buněk v určitém prostředí. Tak je tomu např. při kontrole biotechnologických procesů,

při hledání optimálních růstových podmínek pro určitý kmen mikroorganismů, při

analytickém stanovení vitaminů, aminokyselin nebo stopových množství jiných

sloučenin pomocí mikroorganismů, při sledování účinnosti dezinfekčních nebo

konzervačních prostředků nebo při zjišťování mikroorganismů v potravinářských

surovinách i v hotových výrobcích na provozním zařízení, ve vzduchu, ve vodě apod.

V potravinářství je stanovení počtu mikrobů velmi důležité, neboť nás informuje o

kvalitě surovin i hotových výrobků a o jejich údržnosti. Sledováním počtu

mikroorganismů, případně i jejich druhů, se můžeme také přesvědčit o vhodnosti

technologických postupů v potravinářském průmyslu, o bezpečnosti sterilačních

zákroků a konečně o sanitačních a hygienických podmínkách na daném úseku výroby

nebo distribuce.

Strana99

Zjištění množství mikroorganismů je rovněž nutné při některých biochemických

a genetických pracech, pro něž jsou mikroorganismy velmi často voleny, neboť mají

řadu předností před ostatními organismy. Pro stanovení množství mikrobiálních buněk

v různých prostředích byla vypracována řada metod, takže pro každý účel je možno

zvolit metodu nejlépe vyhovující.

6.1 PŘEHLED METOD ZJIŠŤOVÁNÍ POČTU MIKROBIÁLNÍCH BUNĚK

Pro zjišťování počtu mikrobiálních buněk v určitém prostředí se používá jednak

přímé nebo nepřímé počítání buněk, jednak stanovení buněčné hmoty přítomných

mikroorganismů, jednak metody sledující intenzitu biochemické činnosti přítomných

mikrobů. Nejpřesnější a nejcitlivější jsou metody zjišťující počet buněk. Používají se

především při rozboru potravin, kontrole kvasných technologických procesů a při

kontrole hygienických a sanitačních podmínek potravinářských závodů nebo distribuce

potravin. Metody stanovující hmotu biomasy používáme pouze v kulturách

mikroorganismů,a to především při bilancování kvasných procesů, při biochemických

pracech apod. Sledování činnosti přítomných mikroorganismů se používá pro rychlé

posouzení mikrobiologické čistoty potravin.

6.1.1 Počítání buněk

1. Přímé mikroskopické počítání buněk v různě upravených preparátech

Tyto metody můžeme použít pouze tam, kde hustota mikroorganismů je aspoň

106 buněk/ml, u bakterií často teprve až od 107 buněk/ml (tj. v mikrobiálních kulturách,

zákvasech apod.). Předností těchto metod je poměrně rychlé získávání výsledků,

nevýhodou je, že u bakterií nelze rozlišit živé a mrtvé buňky.

Přímé mikroskopické počítání se provádí :

a) V počítacích komůrkách (Thomově, Bürkerově apod., viz kap. 7.2.1.1), které mají

určitou hloubku (0,02 – 0,1 mm, viz obr.43) a dno rozděleno na čtverečky o známé

velikosti, takže počítáme buňky ve známém objemu. Používá se pro kvasinky,

bakterie a spory plísní. Jelikož pracujeme s nativním preparátem, je třeba u bakterií

Strana100

použít mikroskopie ve fázovém kontrastu (viz kap.2.4.5.2), aby byly buňky

dostatečně zřetelné.

b) Ve fixovaném nátěru na podložním sklíčku (viz kap.7.2.1.2): Známý objem kapaliny

(většinou 0,01 ml) rozprostřeme na plochu 1 cm2 a po vysušení, fixaci a barvení

zjišťujeme počet buněk v jednotlivých zorných polích, jelikož velikost změřímě

(pomocí objektivového mikrometru). Úměrou pak vypočítáme množství zárodků

v jednotce objemu původní suspenze. Používá se pro susspenze bakterií.

2. Elektronické počítání buněk

je založeno na nasávání přesně definovaného objemu elektrolytu, v němž jsou

rozptýlené buňky, velmi malým otvorem do elektricky nevodivé (skleněné) trubice. Při

průchodu jednotlivých buněk otvorem dochází ke změně vodivosti, což se přístrojem

registruje jako impuls. Přístroje byly původně vyvinuty pro počítání krvinek, ale velmi

dobře se uplatňují i při počítání kvasničných buněk v suspenzi, v případě, že buňky jsou

od sebe oddělené (netvoří shluky nebo řetízky). U některých přístrojů (např.

Celloscopu) je možno zjistit i četnost různých velikostních skupin buněk zapojením

diskriminátoru, takže počítáme buňky přesahující určitou velikostní mez.

3. Nefelometrické stanovení počtu mikroorganismů

spočívá ve zjištění počtu buněk v čiré kapalině na základě intenzity světla

odraženého od jednotlivých buněk (viz obr ). Metoda je velmi rychlá a citlivá.

Umožňuje zjištění počtu buněk počínaje koncentrací 105 bakterií/ml do koncentrace 107

bakterií/ml. Nejvhodnější je pro krátké tyčinky nebo koky, při delších tyčinkách nebo

řetízcích může dojít k ne-pravidelnostem. Touto metodou zjišťujeme celkový počet

buněk na základě kalibrační křivky zhotovené pomocí přímého mikroskopického

počítání buněk.

4. Kultivační stanovení počtu mikrobů

spočívá na principu přenášení mikroorganismů na vhodnou půdu, kde jsou

schopny rozmnožování. Zjišťuje se tedy počet živých buněk, neboť kriteriem životnosti

mikrobiální buňky je schopnost autoreprodukce, tedy schopnost syntézy buněčného

materiálu a schopnost buněčného dělení. Těchto metod lze použít pro prakticky

libovolně hustou suspenzi mikroorganismů a ve směsích je často možno rozlišit

jednotlivé skupiny nebo rody. Nevýhodou je delší doba potřebná k získání výsledků

Strana101

(minimálně 24 hod.) a u směsí různých mikroorganismů fakt, že dostáváme většinou

poněkud nižší výsledky, než odpovídá skutečnosti, neboť nemúžeme zaručit vhodné

kultivační podmínky všem přítomným mikroorganismům.

Ke kultivačním metodám patří :

a) Stanovení nejpravděpodobnějšího počtu mikroorganismů (MPN z angl. most

propable number), spočívající v seriovém desítkovém zřeďování vzorku a ve

zjištění, ve kterých zředěních již došlo k vymizení mikroorganismů, takže nenastal

po inkubaci v tekuté půdě růst. Každé zředění se vyočkovává paralelně do 3 nebo 5

kultivačních nádobek s živnou půdou a výsledek se vyhodnocuje dle tabulek

sestavených na základě statistických výpočtů. Metoda nedává příliš přesné

výsledky, avšak umožňuje i rozbor tuhých nebo nefiltrovatelných vzorků s nízkým

obsahem mikroorganismů (<10 zárodků/g).

b) Desková čili plotnová metoda, založená na zjištění počtu kolonií vyrostlých na

ztužených půdách za předpokladu, že každá kolonie vznikla z jedné buňky. Tato

metoda je nejrozšířenější, neboť umožňuje zjištění počtu živých buněk mikrobů jak

v kapalných nebo v tuhých látkách, tak i na povrchu předmětů, ve vzduchu apod.

Používáme ji pro zjištění přežívajících buněk při dezinfekčních nebo sterilačních

zákrocích, v genetických studiích při sledování letálních účinků použitých mutagenů

apod., ale především při mikrobiologických rozborech potravin a potravinářských

surovin včetně vody, při sledování mikrobiologické čistoty provozního zařízení a

vzduchu v potravinářském průmyslu atd. Při těchto potravinářských rozborech

můžeme pomocí deskových metod zjistit celkový počet přítomných mikroorganismů

nebo počet buněk určité skupiny mikroorganismů, což je umožněno použitím

selektivních půd, na nichž se mohou rozmnožovat pouze ty druhy mikroorganismů,

jež chceme stanovit. U vzorků s poměrně nízkým počtem mikrobů zpracováváme

větší množství vzorku filtrační metody, u vzorků o značném mikrobiálním

znečištění používáme vhodného zředění. Základním postupem deskové metody je

pipetování určitého objemu připravené suspenze na Petriho misku a jeho přelití

rozehřátou živnou půdou, nebo roztírání suspenze po povrchu utuhlé půdy a

zjišťování počtu kolonií po inkubaci při optimální teplotě. Proto se výsledek

v poslední době udává jako počet kolonietvorných jednotek (angl.zkratka c.f.u.=

conoly forming unit), což zahrnuje i fakt, že některé kolonie nevznikly z jediné

buňky (např.u slizotvorných bakterií nebo plísní) a že při zjišťování tzv. „celkového

počtu mezofilních bakterií“ nevyhovuje použitý živný agar všem přítomným

Strana102

druhům bakterií, takže počet kolonií je nižší než skutečný počet buněk různých

druhů.

6.1.2 Stanovení buněčné hmoty mikroorganismů

Množství buněčné hmoty mikroorganismů zjišťujeme přímými nebo nepřímými

metodami. K přímým metodám patří vážkové stanovení sušiny buněk a dále stanovení

obsahu jednotlivých složek protoplasmy, které se v buňkách vyskytují v poměrně stálé

koncentraci (např. dusík, nukleové kyseliny apod.). Nepřímé metody (např. stanovení

objemu buněčné hmoty, stanovení intenzity zákalu buněčné suspenze)

vyhodnocujememna základě kalibrační křivky, připravené pomocí některé z přímých

metod. Množství buněčné hmoty nemusí být v přímém poměru k počtu buněk, neboť

v různých růstových fázích kultury mohou buňky dosahovat různé velikosti.

1. Přímé metody

a) Vážkové stanovení buněčné sušiny. Toto stanovení je nezbytné při provádění

růstové bilance mikroorganismů na určitých substrátech (tj.při zjišťování výtěžnosti

biomasy) nebo při bilančním hodnocení kvasných procesů, jež bývají doprovázeny

syntézou buněčné hmoty. Někdy se tato metoda používá ke zjišťování množství

buněčné hmoty v biochemických pokusech. Metoda spočívá v sušení promytých

buněk při 95-105oC do konstantní váhy.

b) Stanovení obsahu dusíku v buněčné hmotě. Při této metodě mineralizujeme

buněčnou hmotu spalováním v prostředí koncentrované kyseliny sírové a stanovíme

vzniklé amonné ionty. Tato metoda se může použít jen u dobře promytých buněk,

zbavených zbytků kultivačního prostředí. Používá se hlavně při bilancování

produkce biomasy v bio-technologiích a někdy také v biochemických pracech.

Násobíme-li zjištěný obsah dusíku faktorem 6,25 dostáváme přibližný obsah

bílkovin.

c) Stanovení obsahu bílkovin v promyté buněčné hmotě. Bílkoviny se v této metodě

stanovují většinou biuretovou reakcí nebo Lowryho metodou (viz B.Králová,J.Káš a

P.Rauch: Laboratoř z biochemie, skripta VŠChT,1983). Používá se hlavně při

stanovení enzymových aktivit buněčné hmoty a při jiných biochemických pracech.

2. Nepřímé metody

Strana103

a) Turbidimetrické stanovení buněčné hmoty je mnohem rychlejší a citlivější než

přímé metody a mnohem přesnější než další metoda.

b) Volumetrická metoda Nevýhodou obou těchto nepřímých metod je, že se musí

připravovat kalibrační křivka pro každý kmen mikroorganismu, a proto se používají

pouze pro seriová stanovení prováděná u jednoho kmene.

6.1.3 Zjištění přibližného množství mikroorganismů na základě jejich biochemické činnosti

Do této skupiny patří řada metod používaných pro zjištění hygienického stavu a

údržnosti (a tedy i kvality) potravin a potravinářských surovin. Většinou se zjišťuje

sumární aktivita všech přítomných druhů bakterií, která je úměrná počtu přítomných

buněk. Vyjádření výsledku počtem přítomných bakteriálních buněk je však přibližné,

neboť jednotlivé buňky se liší intenzitou sledované reakce a také jednotlivé buňky

určitého druhu se mohou v tomto ohledu značně lišit. Kromě této celkové aktivity

můžeme zjistit také aktivitu jednotlivých bakteriálních skupin (např.koliformních

bakterií, salmonel apod.). Výhodou těchto metod je poměrná jednoduchost provedení a

především to, že výsledek získáme velmi brzy (10 min až 4 h). Některé z těchto metod

se používají již desítky let (např.titrační zjištění produkce kyselin v mléce, sledování

redukční aktivity bakterií přítomných v mléce pomocí resazurinu nebo methylenové

modře). Získané hodnoty jsou ukazateli kvality potraviny a nejsou zde obvykle

převáděny v přibližné počty bakterií. (Bližší o provedení viz např. ČSN 570530 Metody

zkoušení mléka a mléčných výrobků.)

Z novějších metod je třeba uvést :

1. Radiometrické metody,

u nichž se nejčastěji zjišťuje tvorba 14CO2 ze značeného uhlíkatého substrátu.

Nejčastěji se používají v klinické diagnostice, neboť při použití antiser proti

jednotlivým patogenům umožňují určit tyto patogeny. V potravinářství se nejčastěji

používají tyto metody pro rozbor zmražených potravin a potravinářských surovin. Tato

analýza byla automatizována (např.přístroj Bactec, vyráběný firmou Johnston

Laboratories, USA). Výsledek se získá za 4–6h. (viz např.Journal of Food

Science,40,223,1977).

Strana104

2. Měření elektrické vodivosti,

které je založeno na faktu, že v důsledku metabolimu bakterií stoupá elektrická

vodivost kultivačních roztoků. Proto se během kultivacesleduje průchod slabého

elektrického proudu tekutou živnou půdou, zaočkovanou vzorkem. Zjistitelná změna

vodivosti se objeví, když koncentrace bakteriálních buněk dosáhne 106 v ml.Z doby, za

kterou se toho dosáhne, se pomocí kalibrační křivky zjistí počáteční koncentrace

mikroorganismů. Kalibrační křivky pro jednotlivé typy vzorků (např.mražená zelenina,

mléko, syrové maso apod.) se konstruují za použití kultivačního staniovení počtu

bakterií v příslušných vzorcích. Stanovení bylo plně zautomatizováno za použití

výpočetní techniky (např.přístroj firmy Malthus Instruments, Perth, Skotsko, analyzuje

120 vzorků současně). Výsledky se udávají jak graficky, tak i numericky. Metoda je

vhodná pro koncentrace 102-106 bakteriálních buněk/g vzorku (u vyšších koncentrací je

možné provádět zředění). Doba inkubace je 5-9 h. Dojde-li ke změně vodivosti za dobu

kratší než 5 h, má vzorek příliš vysoký obsah bakterií, a proto z hygienického hlediska

nevyhovuje. Vodivostní metodu můžeme požít také při hodnocení startovacích kultur

v mlékárenském průmyslu. Inkubační doba je pak 2-4 h a záleží také na použitém

zředění. Plísně se chovají opačně než bakterie, tzn., že snižují vodivost. Při stanovení

bakterií však jejich běžná přítomnost nevadí.

3. Limulus – test,

tj. použití lyzátu amoebocytů krabu Limulus polyphemus, který je připravován

americkou firmou Difco (Detroit), je založen na tom, že endotoxin přítomný ve stěně

gramnegativních střevních bakterií koaguluje tento lyzát za tvorby gelu nebo vloček.

Pozitivní reakci po 1 h inkubace při 37oC dáá 5×102 bakteriálních buněk/ml. Metoda je

tedy velmi rychlá a umožňuje zjišťování koliformních bakterií v syrovém mléce,

mletém mase, uzeninách apod. Např.v chlazeném mletém mase má být negativní 0,1 ml

za zředění 1:1000.

4. Chemoluminiscenční metody

jsou citlivé metody založené na stanovení porfyrinů nebo ATP mikrobiálních

buněk. Při stanovení porfyrinů pomocí luminolu (tj. 5-amino-2,3-dihydro-1,4-

aminoftalátu) v pří-tomnosti H2O2 je nutno odstranit rušivý účinek kovových iontů. Při

stanovení mikrobiální ATP je nutno nejdříve odstranit ATP analyzované potraviny nebo

potravinářské suroviny, pak uvolnit ATP z přítomných mikrobiálních buněk a stanovit ji

Strana105

pomocí enzymového systému luciferin-luciferasa. Holandská firma Lumac vyvinula

činidla pro tyto jednotlivé kroky i přístroj pro zjištění příslušné luminiscence. Používá

se pro zjištění bakterií v mase (nejnižší zjistitelná mez je 105 bakteriálních buněk/g),

kvasinek v ovocných šťávách (kombinuje se s odstředěním kvasinkových buněk) ap.

Podrobněji viz např. Food Technology,33,63 (1979) nebo Fleischwirtschaft,60,266

(1980).

Abychom dostali správný obraz o skutečné kvalitě mikrobů v okamžiku

odebrání vzorku, snažíme se omezit co nejvíce další pomnožení mikoorganismů ve

vzorku. Dosahujeme toho u kultivačních metod ochlazením vzorku na 5-6oC nebo jeho

rychlým zpracováním, u ostatních metod můžeme mikroorganismy usmrtit, nejčastěji

přídavkem formaldehydu (0,2 ml na 10 ml vzorku).

6.2 JEDNOTLIVÉ METODY STANOVENÍ POČTU MIKROORGANISMŮ

6.2.1 Mikroskopické počítání buněk

Cv.6.1 Stanovení počtu buněk počítací komůrkou

Popis : Počítací komůrka je v podstatě silné podložní sklíčko, jež má ve střední

části nižší, přesně vybroušené políčko (obr.42), které po přikrytí krycím sklíčkem tvoří

komůrku o přesné hloubce (např. 0,1 mm u Thomovy komůrky). Dno komůrky je

rozděleno čtvercovou sítí na čtverečky a obdélníčky o známých délkách stran (obr.43).

Po stranách vybroušeného pole jsou zářezy ve tvaru kanálků, kam přetéká přebytečná

kapalina (obr.42).

Potřeby : Počítací komůrka Thoma nebo Bürker, čerstvá kasničná kultura v tekutém

mediu, sterilní dělené pipety (1 ml, 5 ml), sterilní fyziologický roztok (roztok č.1), krycí

sklíčka.

Provedení :

1. Kulturu důkladně promíchej a pak sterilní pipetou přenes kapičku do středu počítací

komůrky.

2. Přiklop krycím sklíčkem tak aby nevznikly vzduchové bubliny a dobře přitiskni.

Ponech chvíli ve vodorovné poloze (na preparačním stolku mikroskopu), aby buňky

klesly ke dnu.

Strana106

3. Zvětšením 10×10 prohlédni komůrku, je-li v jednom čtverečku o straně 1/20 mm

maximálně 5 buněk kvasinek. V záporném případě proveď příslušné zředění tak, že

odpipetuješ určité množství suspenze do zkumavky a přidáš vypočtené množství

sterilního fyziologického roztoku a připravíš znovu komůrku s ředěnou kulturou.

4. Zjisti opět zvětšením10×10, zda je zředění dostatečné, a pak při zvětšení 450×

spočítej buňky asi ve 120 čtverečcích (tj. pouze ve čtverečcích, souvisejících spolu

svými rohy) po celém poli komůrky. Z buněk ležících na čarách počítej vždy jen ty,

které leží na dvou zvolených stranách, pučící buňky počítej jako jednu, mateřské a

dceřiné buňky (i ještě spojené) jako dvě.

5. Celkovou sumu děl počtem počítaných čtverečků, čímž dostaneš průměrný počet

buněk v jednom řtverečku.

6. Vypočti množství buněk v 1 ml původní suspenze (průměrný počet buněk v 1

čtverečku dělený objemem, který je vymezený čtverečkem a hloubkou komůrky,

násobený použitým zředěním).

Poznámky :

1. Bakterie možno počítat obdobným způsobem při zvětšení 45×15, avšak za použití

fázového konstrastu (viz kap.2.4.5.2). Někdy bývají pro bakterie používány

komůrky o hloubce 0,02 mm (např. Petroff-Hansenova komůrka), u nichž lze použít

většího zvětšení. I v tomto případě je však třeba použít fázový kontrast, neboť

nebarvené bakterie jsou špatně zřetelné.

2. Pro přibližné rozlišení mrtvých a živých buněk kvasinek je možno použít vitální

barvení (viz kap. 4.2.6.5), i když za skutečný důkaz životnosti mikrobiální buňky je

nutno považovat její schopnost autoreprodukce, a tedy tvorby kolonie.

3. Pro rozlišení cizích tj. kontaminujících kvasinek v drožďářských provozech

doporučuje Kunz a Klaushofer (Applied Mocrobiology,9,469 (1961) vybarvení

buněk provozního kmene antiserem označeným fluoresceinem a pozorování za

použití fluorescenční techniky ve fázovém kontrastu. Buňky provozního kmene jsou

pak zelené, kdežto kontaminující kvasinky jsou jasně červené. Obdobné

fluorescenční metody pro počítání buněk kvasinkové kontaminace v pivovarství

vypracoval Campbell a Brudzinski (Journal of the Instutute of Brewing,72,56

(1966)) a Richards aaa Cowland (J.Inst.of Brewing,73,552 (1967)).

Cv.6.2 Stanovení počtu buněk ve fixovaném obarveném preparátu

Strana107

Potřeby : Kultura Escheria coli v tekutém mediu, podložní sklíčka, šablonka

s narýsovanou plochou 1 cm2, roztok krystalové violeti (roztok č.2), sterilní

mikropipeta, objetivové měřítko.

Provedení :

1. Pipetuj 0,01 ml dobře rozmíchaného vzorku na odmaštěné podložní sklíčko, rozetři

na ploše 1 cm2 (podlož si pod sklíčko milimetrový papír jako šablonku), usuš

v přesně vodorovné poloze a fixuj plamenem.

2. Obarvi krystalovou violetí (15-20 s), opláchni vodou a usuš.

3. Zjisti imerzním objetivem počet buněk v 10 až 15 zorných polích a vypočítej

průměr.

4. Urči velikost zorného pole objetivovým mikrometrem.

5. Vypočítej celkový počet mikrobů v 1 ml, který se rovná

HS_CH2_CH_COOH

NH2

CH3_CH_COOH

NH2

+ H2S

kde a je průměrný počet mikrobů v jednom poli,

Z1 je plocha preparátu (100 mm2)

v je použitý objem vzorku (0,01 ml)

Z2 je plocha zorného pole v mm2

Je-li preparát příliš hustý, proveď zředění sterilním fyziologickým roztokem.

Poznámka :

Pro počítání bakterií ve fixovaném preparátu je vhodné použít okulár s mřížkou,

která umožňuje počítat buňky pouze uprostřed zorného pole. Tím se odstraní potíže,

způsobené neostrostí okrajů zorného pole. Mřížku možno nakreslit leptacím nebo

obyčejným inkoustem na upravené krycí sklíčko, které vkládáme mezo očnici a sběrnou

čočkou okuláru. Velikost čtverečku nakreslené mřížky stanovujeme objetivovým

měřítkem.

6.2.2 Nefelometrické stanovení počtu buněk

Nefelometrie je založena na rozptylu světla drobnými částečkami suspendovaným

v kapalině, tj. na tzv. Tyndallově efektu. Zakalená kapalina má totiž schopnost vychýlit

část světla, které ji ozařuje, z jeho původního směru a rozptýlit jej tak do všech směrů

(obr.X4). Způsob rozptylu světla je různý pro různé vlnové délky světla a proto

Strana108

používáme monochromatické světlo (viz obr.X4), a závisí také na optických

vlastnostech kapaliny i suspendovaných částeček a na velikosti a tvaru těchto částeček.

Je-li velikost suspendovaných částic menší než vlnová délka použitého světla, zákal se

vůbec neobjeví. V určitém rozmezí koncentrací suspendovaných částic stejné velikosti

platí mezi intenzitou rozptýleného světla a koncentrací suspendovaných částic vztah :

Is/Io = K×c,

kde Is …intenzita světla odraženého v určitém úhlu,

Io …intenzita dopadajícího světelného paprsku,

K …konstanta, kterou možno stanovit proměřením suspenze o známé

koncentraci,

c …koncentrace částic (v našem případě počet buněk v 1 ml).

Při vyšších koncentracích suspendovaných částic dochází k absorpci světla

v kapalině, takže měření by neposkytlo správné výsledky.

Při stanovení počtu buněk si připravíme suspenzi mikroorganismů v destilované vodě

přefiltrované přes sintrové sklo (kelímek S-4) nebo v čiré půdě. Přímým

mikroskopickým počítáním zjistíme její koncentraci a nefelometrickým proměřením

jejich několika zředění stanovíme kalibrační křivku, která v použitelné oblasti musí mít

tvar přímky. Její pomocí pak stanovujeme nefelometricky počet buněk téhož

mikroorganismu v suspenzích v destilované vodě nebo v čiré půdě. Meření je třeba

provádět za konstantní teploty. Aby se kyveta dopadajícím světlem neohřála, vkládáme

ji během měření do vodní komory, kterou proudí voda o konstatní teplotě.

Cv.6.3 Nefelometrické stanovení počtu buněk

Potřeby : Kultura E.coli v čirém MPB, počítací komůrka, mikroskop s fázovým

kontrastem, nefelometr s kyvetami, zkumavky, pipety, půda MPB přefiltrovaná

skleněným filtrem S-4.

Provedení :

1. Zjisti přímou mikroskopickou metodou (kap.7.2.1.1) pomocí fázového kontrastu

počet buněk v 1 ml kultury.

2. Pomocí čirého (tj.přefiltrovaného skleněným filtrem) bujonu připrav několik ředění

kultury tak, aby bylo v prvém ředění 1×107 buněk/ml a v posledním zředění

1×104buněk/ml.

Strana109

3. Změř jednotlivá zředění na nefelometru (za použití filtru odpovídajícího barvou

barvě použitého bujonu a za chlazení komory protékající vodou).

4. Ze získaných hodnot sestav kalibrační křivku : Na osu X nanes koncentrace buněk

podle mikroskopického měření, na osu Y hodnoty nefelometrických čtení. Získané

body propoj přímkou.

5. Proměř jednotlivé vzorky a z kalibrační křivky zjisti odpovídající koncentrace

buněk. Jsou-li vzorky příliš koncentrované, proveď ředění filtrovaným bujonem.

Poznámky :

1. Absorpce světla je ovlivněna mj.tloušťkou vrstvy kapaliny (tj.velikostí

nefelometrické kyvety): Čím je vrstva menší, tím lze měřit vyšší koncentrace buněk,

takže není třeba ředit vzorek, avšak je nutné pro každou tloušťku stanovit novou

křivku.

2. U zkumavkových kultur je možné zjišťovat počet buněk během růstu přímo v těchto

zkumavkách po jejich důkladném protřepání. Musí být použito přesně stejně

širokých zkumavek (kyvet) jak pro kultivaci, tak i při sestrojování kalibračních

křivek.

3. Nefelometrické stanovení se používá také pro kvantitativní sledování růstu bakterií

při mikrobiologickém stanovení některých vitaminů (např.thiaminu). Kalibrační

křivka se pak sestrojuje proměřením kultur narostlých za známých koncentrací

sledovaného vitanimu.

6.2.3 Kultivační stanovení počtu buněk

1. Stanovení nejpravděpodobnějšího počtu mikroorganismů (MPN)

Tato metoda je vhodná pro rozbor potravin a potravinářských surovin s nízkým

obsahem mikroorganismů (<10/g), neboť můžeme vyočkovat 10-100 g vzorku do

desetinásobného objemu tekuté živné půdy. Další výhodou je, že se kvantitativních

výsledků dosáhne bez použití agaru, který se v důsledku stále vyššího znečišťování

moří stává nedostatkovým zbožím. Nevýhodou je nižší přesnost než u deskových

kultivačních metod. Nejčastěji se zjištění MPN používá při stanovení koliformních

bakterií jako indikátorů fekálního znečištění a ukazatele hygienického stavu potraviny.

V tomto případě se používají selektivní media (např.půda P-X2) zabraňující

rozmnožování grampozitivních bakterií a umožňující identifikovat růst koliformních

bakterií na základě biochemických textů (tvorba plynů z laktosy). Pro celkový počet

Strana110

mezofilních bakterií se používá masopeptonový bujon (půda č.X) a inkubace 48±3 h při

32oC±1oC. Do paralelních zkumavek se vyočkovávají takové tři za sebou jdoucí

desítková zředění, u nichž v největším zředění je alespoň jedna zkumavka po kultivaci

bez nárustu (tj.negativní) a u menších zředějí dochází k nárůstu alespoň v podílu

zkumavek U vzorků s neznámým počtem mikroorganismů se připravuje více ředění a

pro vyhodnocení se použije největší zředění, jež má ještě všechny pozitivní kultury a

další dvě zředění.

Cv.6.4 Stanovení MPN

Potřeby : vzorek mléka, 15 zkumavek s 10 ml půdy P-X2 a s Durhamovými

plynovkami, sterilní zkumavky, sterilní fyziologický roztok, sterilní dělené pipety 10 ml

a 1 ml.

Provedení :

1. Zaočkuj 3 zkumavky půdy po 1 ml vzorku zředěného 1:10, 3 zkumavky po 1 ml

vzorku zředěného 1:100, 3 zkumavky po 1 ml vzorku zředěného 1:1000 a 3

zkumavky po 0,1 ml vzorku zředěného 1:1000. 3 zkumavky půdy nech

nezaočkované jako kontroly.

Tabulka č 2 Nejpravděpodobnější počet mikroorganismů (MPN) v 1 g vzorku a limity za

95%ní pravděpodobnosti při použití tří paralelních kultur Počet pozitivních kultur MPN Limity MPN 0,1 g 0,01 g 0,001 g /g dolní horní

0 0 0 < 3 . . 0 0 1 3 0,5 9 0 1 0 3 <0,5 13 1 0 0 4 <0,5 20 1 0 1 7 1 21 1 1 0 7 1 23 1 1 1 11 3 36 1 2 0 11 3 36 2 0 0 9 1 36 2 0 1 14 3 37 2 1 0 15 3 44 2 1 1 20 7 89 2 2 0 21 4 47 2 2 1 28 10 150 3 0 0 23 4 120 3 0 1 39 7 130 3 0 2 64 15 380

Strana111

3 1 0 43 7 210 3 1 1 75 14 230 3 1 2 120 30 380 3 2 0 93 15 380 3 2 1 150 30 440 3 2 2 210 35 470 3 3 0 240 36 1300 3 3 1 460 71 2400 3 3 2 1100 150 4800 3 3 3 >2400 . .

2. Inkubuj všechny zkumavky 48 h při 37oC a po inkubaci zjisti vznik zákalu a tvorbu

plynu v jednotlivých zkumavkách všech zředění i kontroly. (Všechny kontrolní

zkumavky musí být negativní).

3. Zapiš počet pozitivních zkumavek (zákal+plyn) z každého zředění (např.3,3,1,0) a

na základě získaného kódu (v našem příkladu 3,1,0) zjisti podle tabulky č.2 hodnotu

MPN. V našem případě 43×10 buněk/ml, jelikož největší vyhodnocené inokulum

bylo zředěno 1:100. Kdybychom použili kód 3,3,1, dostali bychom 460 buněk/ml.

Za přesnější nutno považovat výsledek 430 buněk/ml, neboť byl získán na principu

použití nejvyššího zředění obsahujícího všechny pozitivní kultury.

4. Zjisti, zda nalezený výsledek odpovídá normě jakosti pro mlékárensky ošetřené

mléko (ČSN 570599), jež povoluje ve spotřebitelském balení v době převzetí do

tržní sítě nejvýše 500 koliformních mikrobů v 1 ml.

Poznámky :

1. Jestliže se vdalším ředění objeví neočekávaná pozitivní kultura, přičítá se

k sousednímu nižšímu ředění. Např. výsledek 3,1,0,1 má kód 3,1,1.

2. Jestliže nemůžeme bezpečně rozlišit pozitivní a negativní kultury (např. při analýze

nerozpustných potravin, tvořících v kultuře zákal, nebo potravin měnících barvu pH

indikátoru kultury) přeneseme očko kultur na živný agar nebo do zkumavky půdy

pro MPN a inkubujeme 24 h při příslušné teplotě.

3. Zjištění MPN při stanovení koliformních bakterií bylo použito jako příklad, jelikož

podle ČSN se tato skupina zjišťuje v mléce za použití selektivních agarů.

2. Deskové (plotnové) kultivační metody počítání buněk

Desková metoda umožňuje zjištění počtu živých buněk v nejširším rozmezí

jejich koncentrací a na nejrůznějším materiálu. Za použití vhodných selektivních půd

umožňuje také rozlišení jednotlivých skupin rodů mikroorganismů. Z těchto důvodů je

Strana112

nejpoužívanější metodou při mikrobiologických rozborech potravin a potravinářských

surovin, vody, vzduchu a při sledování čistoty obalů, provozního zařízení aj.

Pro zásady kultivace mikroorganismů a způsob zpracování výsledků při

mikrobiologickém zkoušení potravinářských výrobků platí norma ČSN 560082 a

obdobnou platnost mají i normy pro způsob odběru vzorků pro mikrobiologické

zkoušení potravinářských výrobků (ČSN 560080) a pro přípravu vzorků

k mikrobiologickému zkoušení potravinářských výrobků (ČSN 560081) uvádějící také

postup zřeďování vzorků, neboť počet kolonií, vyrostlých na agarové půdě v Petriho

misce průměru kolrm 10 cm musí býtv rozmezí 30-300 u celkového počtu bakterií nebo

kvasinek a v rozmezí 15-150 při zjišťování určité skupiny mikroorganismů

(např.koliformních bakterií) a v rozmezí 5-50 při stanovení plísní. Vyšší hodnoty

kolonií, než je horní mez, dávají nižší výsledky, než je skutečnost, neboť se zde

uplatňuje již antagonismus mezi buňkami různých druhů z důvodu malé vzdálenosti

těchto buněk v půdě, při menších počtech kolonií, než je spodní mez, je výsledek

zatížen značnou chybou z důvodu nerovnoměrného rozptýlení buněk a náhodnosti jejich

přenosu na půdu. Kvantitativní vyhodnocení přítomnosti plísní je vždy zatíženo velkou

chybou jednak pro jejich tvorbu vláken, jejichž rozpad v menší úseky, schopné tvořit

samostatné kolonie, závisí na intenzitě třepání vzorku, jednak pro hydrofobní povahu

povrchu jejich spor, které proto často tvoří shluky. Nižší výsledky, než je skutečnost,

dávají bakterie tvořící slizovité obaly, spojující vždy několik buněk, takže kolonie

nevznikají z jednotlivých bunk. Abychom dosáhli požadovaného počtu kolonií na

Petriho misce, musíme většinou vzorek ředit postupným desítkovým způsobem (viz

kap. ) a z každého zředění pak očkujeme dvě misky, a to buď zaléváním pomocí

roztavené agarové půdy (viz kap. ) nebo roztěrem na povrch předsušených agarových

půd

(kap. ). Roztěrové metodě dáváme přednost, jelikož umožňuje lepší rozptýlení buněk

než přelivová metoda a nehrozí u ní nebezpečí usmrcení buněk příliš teplým agarem. Je

nezbytná u přísně aerobních mikroorganismů (např. plísní). Její nevýhodou je nutnost

malého inokula (0,1-0,3 ml oproti až 2 ml u hloukového očkování).

Roztěrová metoda má proti předchozí metodě výhodu v tvorbě zřetelnějších

kolonií a lepší reprodukovatelnosti výsledků. Dává také poněkud vyšší výsledky než

zalévání do pevných půd. Je nezbytný pro stanovení kvasinek a plísní (použitá půda je

sladinový agar s pH upraveným po sterilaci na 3,8-4,0 a kultivace 2-5 dnů při 25-30oC)

pro přísně aerobní povahu plísní a některých kvasinek. Nevýhodou roztěrové metody je

Strana113

široké rozrůstáníněkterých bakterií (např. Bacillus cereus var.mycoides, Proteus

vulgaris), které v krátké době pokryjí kořínkovitými výběžky svých kolonií značnou

část povrchu desky a znemožní rozvoj i spočítání ostatních kolonií. Z těchto důvodů se

někdy doporučuje vložit do středu počínajících mykoidních kolonií malý krystalek

manganistanu nebo se inkubuje při suboptimální teplotě.

Během práce je u kultivační metody třeba dodržovat přísně aseptické podmínky,

zvláště je-li požíváno několikanásobné zředění, neboť kontaminace ze vzduchu nebo

nesterilního náčiní by mohla způsobit úplné zkreslení výsledků.

Počet vyrostlých kolonií zjišťujeme po inkubaci při optimální teplotě po dobu

24-72 h (podle druhu zjišťovaných mikroorganismů – viz kap.). Podle uvedené normy

(ČSN 560082) musíme z výsledku dvou paralelních misek za zředění poskytujícího

vyhovující počet kolonií (tj.např.30-300 u celkového počtu bakterií nebo kvasinek)

vypočítat aritmetický průměr a zaokrouhlit jej při počtu nižším než 100 na nejbližší

násobek pěti, při počtu vyšším než 100, nekončícího na 5, na nejbližší násobekdeseti, a

u končícího na 5 na nejbližší násobek dvaceti (tedy 125 se zaokrouhluje na 120 a 135 na

140). Tento výsledek přepočteme na 1 g nebo 1 ml původního vzorku a vyjádříme

číslem 1,0-9,9×10n. Jestliže požadovanému rozmezí počtu kolonií na miskách vyhovují

dvě po sobě jdoucí zředění, vypočte se podle uvedené normy počet mikroorganismů v 1

g (nebo 1 ml) vzorku pro každé zředění zvlášť a neliší-li se získané hodnoty více než

dvakrát, je konečný výsledek jejich průměr. V opačném případě se pokládá za konečný

výsledek nižší z obou hodnot. Jestliže i při nejmenším použitém zředění vyroste na obou

miskách pouze nižší počet kolonií, než je požadovaná mez, je nutno podle citované

normy uvést, že počet mikroorganismů v 1 g (ml) je nižší než

,

kde M … je dolní mez požadovaného počtu kolonií

(tj. 30 pro celkový počet bakterií nebo kvasinek,

15 pro zjišťování jednotlivých skupin mikroorganismů,

5 pro plísně)

S … je použité zředění,

In… je velikost inokula.

Strana114

Cv.6.5 Zalévání do pevných půd

Potřeby : Vzorek mléka, 6 zkumavek s MPA (půda č.X), 6 sterilních Petriho misek, 3

sterilní dělené pipety (1 ml), 2 zkumavky sterilního fyziologického roztoku (roztok č.1)

nebo sterilní vodovodní vody (po 9 ml), válec s dezinfekčním prostředkem pro

odkládání použitých pipet.

Provedení :

1. Sterilní 1 ml pipetou odeber asepticky (viz kap.3.3.5) 1 ml dobře promíchaného

vzorku a přenes do zkumavky s 9 ml sterilního fyziologického roztoku (I) a dobře

promíchej.

2. Novou sterilní pipetou přenes 1 ml prvního zředění do misky označené I a 1 ml

dozkumavky označené II a ve zkumavce dobře promíchej.

3. Další sterilní pipetou přenes 1 ml druhého zředění do misky označené II a 0,1 ml

tohoto zředění do misky označené III.

4. Přelij každou misku cca 15 ml rozehřátého živného agaru, vytemperovaného ve

vodní lázni na 45o±0,5oC a dobře promíchej. Před vylévánímagaru nezapomeň

ožehnout okraj zkumavky!

5. Inkubuj misky (zavěšený agar!) 24-48 h. Vzhledem k přítomnosti mléčných

streptokoků, jejichž optimální teplota je poměrněnízká, inkubuje se při 30oC. U

ostatních potravin je inkubační teplota pro mezofilní bakterie 37oC.

6. Spočítej jednotlivé kolonie na miskách a přepočti výsledek na 1 ml původního

vzorku podle normy ČSN 570082. Uveď, zda mléko vyhovuje normě jakosti pro

mlékárensky ošetřené mléko (ČSN 570599), jež pro spotřebitelské balení v době

převzetí do tržní sítě povoluje nejvýše 5,0×105celkového počtu mikrobů/ml.

Poznámky :

1. Živná půda používaná k přelévání suspenzí na miskách nesmí mít větší teplotu než

45,5oC, jinak dojde k usmrcení buněk a dostaneme zkreslené výsledky. Proto

temperujeme rozehřátou agarovou půdu minimálně 5 minut (při objemu půdy do

100 ml, u větších objemů patřičně déle) za občasného míchání ve vodní lázni; avšak

i teplota 45oC způsobuje u některých mikrobiálních buněk teplotní šok, jenž může

poškodit jejich schopnost rozmnožování, takže metoda zalévání do pevných půd

dává vždy nižší výsledky než roztěr na povrch pevných půd (kap. ). Proto je

v protokolu nutno uvést, kterou metodou byl vzorek analyzován.

Strana115

2. Pro počítání kolonií na Petriho miskách byly zkonstruovány různé přístroje.

Plnoautomaticky vyhodnocují misky pomocí samočinných počítačů (viz kap.2.1).

Některé z nich pracují pomocí laseru. Celý postup analýzy metodou zalévání do

agarových půd byl zautomatizován.

Cv.6.6 Roztěr na povrchu pevných půd

Potřeby : Vzorek mléka, 6 zkumavek s MPA (půda č.X), 6 sterilních Petriho misek, 3

sterilní dělené pipety (1 ml), 2 zkumavky sterilního fyziologického roztoku (roztok č.1)

nebo sterilní vodovodní vody (po 9 ml), válec s dezinfekčním prostředkem pro

odkládání použitých pipet, skleněná tyčinka zahnutá ve tvaru hokejky, případně rovná

skleněná tyčinka, kádinka s ethanolem.

Provedení :

1. Připrav asepticky 2 desky živného agaru v Petriho miskách a předsuš je při teplotě

50oC po dobu 30 min nebo při 60o-70oC kratší dobu bez vzniku nepravidelných hran

na jejich povrchu. Pozor na přesušení, jež by vedlo k zabránění rozmnožování

mikroorganismů! Při předsoušení jsou misky otevřené a dnem vzhůru (zavěšený

agar) a podobně jsou položena i jejich víčka.

2. Sterilní pipetou přenes 1 ml vzorku do první zkumavky s fyziologickým roztokem a

dobře promíchej.

3. Další sterilní pipetou přenes 0,1 ml na povrch první desky živné půdy (I) a 1 ml do

další zkumavkys fyziologickým roztokem. Dobře promíchej a novou sterilní pipetou

přenes 0,1 ml na druhou desku živné půdy (II).

4. Skleněnou tyčinku ponoř do poloviny její délky do 96%ního ethanolu, pak ethanol

odcákni, ožehni tyčinku a ochlaď ji o vnitřní plochu víčka skleněné Petriho misky

s půdou nebo o nezaočkovaný agar v případě umělohmotné misky a vzorek

důkladně rozetři po povrchu agaru přímočarým i krouživým pohybem, až se všechna

kapalina vsákne (viz kap. ).

5. Inkubuj zavěšený agar 24-48 h při 30oC.

6. Spočítej vyrostlé kolonie a výsledek zpracuj podle požadavku normy ČSN 560082 a

zjisti, zda vzorek odpovídá normě jakosti (viz kap.7.2.3.2.1)

Poznámka :

Automatické lití desek pro tento postup umožňuje řada zařízení, např. firmy

New Brunswick Scientific, USA, která vyrábí také automatické počítače kolonií.

Automatické povrchové očkování na předsušené desky umožňuje např.přístroj, který

Strana116

pomocí mikropipety nanáší vzorek na rotující misku s agarem. Očkování začíná od

středu misky a v důsledku pomalého přímočarého pohybu pipety k okraji misky probíhá

po spirále.

3. Rozlišení jednotlivých skupin mikroorganismů

Jednou z výhod deskové kultivační metody je možnost rozlišení jednotlivých

skupin mikroorganismů použitím různých selektivních půd nebo kultivačních

podmínek. Pro celkový počet mezofilních bakterií používáme MPA (půda č. ) a

inkubujeme při 37oC. Pro kvasinky a plísně používáme sladinový agar o pH 3,8-4,0,

očkujeme roztěrem (kap. ) a inkubujeme při 25--30oC 2 až 5 dní. Selektivní půdy pro

rozlišení menších skupin mikroorganismů spočívají buď na použití sloučenin,

inhibujících rozmnožování doprovázející mikroflory, která je někdy ve značném

přebytku nad zjišťovanou skupinou mikroorganismů, nebo za použití zdrojů uhlíku

nebo dusíku, které jsou využívány pouze sledovanou skupinou mikrobů, takže

doprovázející mikroflora nemůže tvořit kolonie. První případ je hojnější a je používán

pro řadu skupin mikroorganismů. Jako inhibitory slouží např. některá barviva (při

zjišťování koliformních bakterií nebo samonel), azid sodný (při stanovení enterokoků),

chlorid sodný (při stanovení stafylokoků), kyselina jodoctová (při stanovení kvasinkové

kontaminace v pekařském droždí) apod. Na druhém způsobu (tj. na různých

asimilačních schopnostech mikroorganismů) je založena metoda stanovení kvasinkové

kontaminace droždí podle ČSN. Protože inhibice růstu doprovodné mikroflory není

v některých případech úplná, využívá se k odlišení jednotlivých skupin ještě dalších

fyziologických rozdílů, např.:

a) Zkvašování různých cukrů zjišťované přídavkem acidometrických indikátorů do

půdy.

b) Přítomnosti katalasy, zjišťované přelitím kolonií na Petriho misce 3%ním roztokem

H2O2 a pozorováním vzniku bublinek kyslíku (k rozlišení mléčných bakterií, které

katalasu nemají).

c) Tvorby sirovodíku zjišťované z tvorby černého FeS, štěpení různých sloučenin

apod.

Nejčastěji je v potravinách a v potravinářských surovinách stanovována skupina

koliformních bakterií, jakožto indikátor fekálního znečištění, a proto ukazatel

hygienických podmínek při výrobě a distribuci. V některých případech je důležitý také

obsah sporotvorných bakterií, především termofilních.

Strana117

.

3a. Stanovení koliformních bakterií

Jako koliformní bakterie označujeme gramnegativní tyčinky z čeledi

Enterobacteriaceae, zkvašující laktosu při 37oC do 48 h za současné tvorby kyselin a

plynu. Mají podobné morfologické a fyziologické vlastnosti jako Escherichia coli a

kromě tohoto druhu sem náleží příslušníci rodu Enterobacter, ale podobně se chovají i

někteří příslušníci podmíněně pathogenního rodu Citrobacter, pathogenního rodu

Klebsiella i podrodu Arizona, který byl vyštěpen z rodu Salmonella. Koliformní

bakterie netvoří spory a v důsledku hexosové represe dýchání mají na sacharidových

půdách negativní cytochromoxidasový test. Jejích přítomnost v potravině naznačuje, že

stejným způsobem by se do potraviny mohly dostat také velmi nebezpečné střevní

pathogeny, vylučované s výkaly, především příslušníci rodu Salmonella a Shigella.

Dříve byla skupina koliformních bakterií označována jako skupina Coli-aerogenes

podle nejvíce zastoupených druhů (Escherichia coli, Enterobacter aerogenes).

Selektivní diagnostické agarové půdy pro stanovení koliformních bakterií jsou

většinou založeny na schopnosti této skupiny zkvašovat laktosu za tvorby kyselin, což

se projeví změnou barvy přítomného acidimetrického indikátoru, a na potlačení činnosti

a růstu přítomných grampozitivních bakterií určitým barvivem. Pouze u Endovy půdy

(půda č.XY) je místo kyseliny zjišťován acetaldehyd vznikající z laktosy a vážící

přítomný siřičitan, takže se objeví zbarvení přítomného fuchsinu. Protože fuchsin je

silně kancerogenní, je nyní nejčastěji používanou půdou Levinův agar (půda č.XX),

který obsaaahuje barviva eosin a methylenovou modř. Escherichia coli, která je

typickým indikátorem fekálního znečištění, na ní tvoří tmavé kolonie, které mohou, ale

nemusí mít zelenavý kovový lesk a někdy mají úzký světlý okraj, kdežto druh

Enterobacter aerogenes, který je typickým půdním mikroorganismem, tvoří kolonie se

širokým bílým okrajem a malým tmavším středem. V současné době je u nás komerčně

vyráběn modifikovaný sušený Levinův agar, který místo methylenové modře obsahuje

bromkresolpurpur. Koliformní bakterie jsou na něm žlutočervené oproti modrofialovým

koloniím bakterií, které nezkašují laktosu. Na Endově agaru (půda č.XY) tvoří kolonie

E.coli tmavě karmínově červené, často se zeleným leskem a někdy s úzkým světlým

okrajem. Enterobacter aerogenes tvoří větší kolonie poněkud světlejšího karmínového

odstínu a s bílým okrajem. Oba rody tvoří tmavě karmínové zóny v půdě kolem kolonií

(nezaočkovaná Endova půda je jen slabě narůžovělá). Na agaru s trypaflavinem a

s bromthymolovou modří (půda č.YY), používaném v mlékárenském průmyslu, tvoří

Strana118

koliformní bakterie žluté až oranžové kolonie (kulovitě vypuklé) se žlutými zónami

v modré základní půdě. U Levinova a Endova agaru se očkuje na utuhlou předsušenou

půdu, aby bylo možno dobře rozlišit charakter kolonií a zón kolem nich, takže se

používá roztěrová metoda (kap. ) nebo filtrační metoda (kap. ). U půdy

s trypaflavinem, kde nelze rozlišit E.coli od ostatních koliformních bakterií, můžeme

použít i zalévání do pevné půdy (kap. ). Tato půda však dává nižší výsledky, neboť

inhibuje i růst některých kmenů koliformních bakterií.

Pro usnadnění těchto biochemických testů se v zahraničí prodávají speciální

testovací soubory, např. trubička rozdělená příčně na řadu oddělení s různými půdami a

reagenciemi, jež společně zaočkují jediným protáhnutím očkovacího drátku (viz kap. ).

Určité usnadnění práce přináší také mikrotesty Entero I a Entero II. Jsou to plastikové

destičky s osmi řadami dvanácti jamek naplněných speciálními půdami pro provedení

dvanácti různých biochemických testů u 8 izolátů střevních bakterií. Tyto mikrotesty

umožňují rozlišit 30 nejběžnějších druhů střevních bakterií včetně některých pathogenů

(např. Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Arizona a několik typů rodu Shigella).

Cv.6.7 Stanovení koliformních bakterií

Potřeby : vzorek mléka, 4 desky předsušeného Endova nebo Levinova agaru (půdy

č.XY a XX), sterilní dělené pipety 10 ml a 1 ml, sterilní fyziologický roztok (roztok

č.1), skleněná tyčinka ve tvaru hokejky, ethanol.

Provedení :

1. Na předsušené desky asepticky pipetuj po 0,1 ml neředěného vzorku a ředění 1:10

(dvě desky pro každé zředění) a rozetři do sucha (kap. ).

2. Inkubuj zavěšené agary 48 h při 37oC, spočítej kolonie charakteristické pro

koliformní bakterie a výsledek vypočítej podle principů uvedených v ČSN 560082.

Kvantitativně se mohou vyhodnotit pouze misky obsahující 15-150 kolonií.

3. Zapiš, zda analyzovaný vzorek odpovídá normě jakosti mlékárensky ošetřeného

mléka (ČSN 570599), tj. maximálně 5,0×102 koliformních bakterií/ml v době

převzetí do tržní sítě.

Poznámky :

1. Jako potvrzující test pro koliformní bakterie je doporučován cytochromoxidasový

test (viz ČSN 030521 pro mikrobiologický rozbor pitné vody), který je rozliší od

gramnegativních přísně aerobních bakterií (např.od příslušníků rodu Pseudomonas).

Strana119

2. Protože všechny koliformní bakterie nemají stejnou hodnotu při vyhodnocování

hygienických podmínek (např.rod Enterobacter se vyskytuje hojně také

v zemědělské půdě a Citrobacter je podmíněně patogenní), provádějí se někdy také

s typickými zástupci kolonií z diagnostické půdy doplňkové biochemické testy po

kultivaci ve zkumavkách speciálních půd. Nejčastěji jde o sledování tvorby indolu,

acetoinu, sirovodíku, silné produkce kyselin z glukosy (test na methylčerveň),

štěpení želatiny, růst na citrátu jako jediném zdroji uhlíku (viz tab.č.3).

Tabulka č.3 Biochemické testy koliformních bakterií a příbuzných rodů

Biochemický test E.coli Enterobacter Citrobacter Arizona Klebsiella

Produkce indolu + − D − + Produkce acetoinu − + − + D Produkce H2S − − D + − Štěpení želatiny − − − D d Využívání citrátu − + + + d Test s methylčervení + − + + D D = různé u různých druhů d = různé u různých kmenů

3b. Zjišťování sporotvorných bakterií

Zjišťování sporotvorných bakterií, tj. příslušníků rodů Bacillus, Clostridium a

Desulfotomaculum, je důležité hlavně z hlediska konzervárenské technologie. V teplem

sterilovaných nekyselých konzervách (tj. o pH vyšším než 4,0) nesmí přežívat spory

mezofilních druhů těchto rodů, neboť stejným způsobem by došlo k přežívání spor

nebezpečného druhu Clostridium botulinum. Mezofilní sporotvorné anaeroby slouží

tedy jako indikátorové mikroorganismy. Spory termofilních sporotvorných bakterií

většinou tepelný sterilační režim nekyselých konzerv přežívají a mohou být příčinou

kažení těchto konzerv při jejich uchovávání při teplotách 30oC a výše, kdy může dojít

k pomnožení těchto termofilů. Ztěchto důvodů nesmějí konzervárenské suroviny a

přídavné látky (cukr, škrob, koření, mouka apod.) obsaahovat příliš velké množství spor

těchto druhů (přípustné je maximálně 150 spor/10 g vzorku).

Přítomnost sporotvorných bakterií zjišťujeme většinou po odstranění

vegetativních bu-něk zahříváním na vodní lázni (u mezofilů většinou 30 min při 80oC,

případně 8 min při 88o-

-90oC, u termofilů 30 min na vroucí vodní lázni) a rychlém zchlazení vodou. Spory

některých druhů (např. Bac.stearothermophilus a některých klostridií) bez tohoto

Strana120

tepelného šoku velmi těžko klíčí, takže by v potravinářských surovinách unikly

stanovení. Přítomnost příslušníků rodu Clostridium tvořících plyn, a to mezofilních i

termofilních, zjišťujeme po teplotním šoku většinou pouze kvalitativně, tj. z vývinu

plynu pod agarovou nebo parafinovou zátkou v půdě obsaahující sacharidy

(např.játrový bujon viz půda č.YY), kdežto mezofilní i termofilní příslušníky rodu

Bacillus a termofilní Desulfomaculum nigrificans vyhodnocujeme kvantitativně.

Cv.6.8 Zjišťování sporotvorných bakterií

Potřeby : vzorek koření nebo cukru, sterilní Erlenmeyerva baňka obsahu 150 ml se

značkou na 100 ml, 4 sterilní Petriho misky, sterilní dělená pipeta 1 ml, sterilní parafin

nebo MPA (půda č.5), 3 zkumavky peptosiřičitanového agaru s proužkem železa (půda

č.??) pro stanovení Clostridium nigrificans, sterilní voda, 3 zkumavky játrového hujonu

(půda č.15), 4 zkumavky peptonglukosového agaru s bromkresolpurpurem (půda č.yx).

Provedení :

1. Do zvážené Erlenmeyerovy baňky přenes asepticky 1-2 g mletého nebo asi 10 g

nemletého koření nebo 10 g cukru a znovu zvaž (přesnost na 0,02 g).

2. Přelij 40 ml sterilní vody, třepej po dobu 5 min a pak vyhřívej na vodní lázni o

teplotě 88oC po dobu 8 min. Ochlaď pod vodovodem a doplň sterilní vodou po

značku (100 ml).

3. Po usazení kousků koření pipetuj 1 ml a 0,1 ml do Petriho misek. Po 1 ml napipetuj

do zkumavek s peptonsiřičitanovým mediem, vyhřívaným před tím 20 min na vroucí

lázni (pro vypuzení kyslíku), dobře rozmíchej a nech ztuhnout pod vodovodem ve

svislé poloze. Do zkumavek játrového bujonu, jež byly před tím vyhřívány 30 min

na vroucí lázni pro odstranění rozpuštěného kyslíku napipetuj (ke dnu zkumavky)

po 2 ml suspenze a bujon v každé zkumavce převrstvi cca 5 ml tuhnoucího MPA

nebo 1 ml sterilního parafinu a ochlaď pod tekoucí vodou. Vzorky v Petriho

miskách přelij rozehřátým peptonglukosovým agarem a dobře promíchej.

4. Inkubuj misky při 37oC, zkumavky při 55oC (ve vlhké komůrce!) 1-2 dny.

5. Označ tužkou na sklo a spočítej kolonie aerobních mezofilních sporotvorných

bakterií na Petriho miskách, a to zvlášť kyselinotvorné (tj. tvořící žluté zóny kolem

kolonií) a ostatní, tj. neměnící modrofislovou barvu půdy.

6. Misky dej inkubovat na 24 h do 55oC (vlhká komůrka!). Spočítej černé kolonie

anaerobního termofilního Cl.nigrificans ve zkumavkách, případně dej zkumavky

Strana121

ještě znova inkubovat na 55oC. Zjisti počet zkumavek játrového bujonu, v nichž je

zřetelný vývoj plynu.

7. Zjisti, kolik kolonií přibylo na miskách i ve zkumavkách po inkubaci při 55oC. U

misek opět rozliš kyselinotvorné od ostatních.

8. Všechny výsledky přepočítej na 10 g původního vzorku. U plynotvorných anaerobů

smí být pozitivní maximálně dvě zkumavky.

4. Filtrační metoda stanovení počtu mikroorganismů

Při mikrobiologickém rozboru kapalin s poměrně nízkým obsahem

mikroorganismů (např. pitná voda) je třeba zpracovat větší objemy vzorku, abychom

dosáhli směrodatných výsledků. K tomu účelu používáme stanovení MPN (viz kap. ),

nebo filtrační metodu. Filtrační metoda je přesnější, avšak lze ji použít pouze u naprosto

čirých vzorků. Princip této metody spočívá ve filtraci vzorku sterilním membránovým

filtrem, schopným zachytit mikrobiální buňky. Následné přenesení tohoto filtru na

desku živné půdy a inkubaci za optimální teploty pro vytvoření jednotlivých kolonií.

Této metody se používá pro rozbor pitné vody, sacharosy (připravuje se 5-10%ní roztok

ve sterilní vodě), kuchyňské soli a jiných rozpustných látek nebo pro rozbor kapalin,

obsahujících sloučeniny, inhibující růst zjišťovaných mikroorganismů (např. pro

hypertonické roztoky jako jsou sirupy nebo pro nápoje obsahující chemické konzervační

prostředky). Tato metoda však nemůže být použita pro rozbory suspenzí nebo

homogenátů vzorků ucpávající póry membrány. Tekutina obsahující malé množství

suspendovaných částic může být nejdříve filtrována přes sterilní filtr o průměru pórů

4μm a pak přes filtr zachycující zjišťované mikroorganismy, při čemž se kultivují oba

filtry za shodných podmínek (možnost adsorpce buněk na prvém filtru). Filtruje-li se

hypertonický roztok nebo roztok obsahující antimikrobiální látky, musí se po skončení

filtrace filtr důkladně promýt sterilní destilovanou vodou nebo zřeďovacím roztokem.

Pro zjišťování bakterií se používají membránové filtry o průměru pórů 0,3 μm.

Některé membránové filtry mají barevnou čtvercovou mřížku (tzv.rastrování) pro

usnadnění počítání kolonií po inkubaci (viz obr.XXX). Před použitím se membrány

vyvaří v destilované vodě, která se 3× vyměňuje, aby se zbavily zbytků rozpouštědel.

Pro stanovení koloformních bakterií se mohou použít již tyto vyvařené filtry, neboť

přežívající bakteriální spory nemohou na selektivních půdách dát vznik koloniím. Pro

Strana122

ostatní stanovení sterilujeme membránové filtry v 0,1%ní peptonové vodě

frakcionovaně v proudící páře v jednodenních intervalech po dobu 20 min (viz kap. ).

Cv.6.9 Stanovení počtu mikroorganismů filtrační metodou

Potřeby : ve vodě vyvařené membránové filtry, sterilní filtrační nálevka, sterilní

pipeta 25 ml, odsávačka, pinzeta bez vroubků, předsušené desky Levinova agaru (půda

č.XX), sterilní Petriho miska, sterilní destilovaná voda, vzorek pitné vody nebo nápoje.

Provedení :

1. Pomocí ožehnuté a ochlazené hladké pinzety uchop vyvařený membránový filtr.

Prohlédni jej, zda není mechanicky poškozen, a vlož jej (lesklou stranou nahoru) na

filtrační destičku sterilní filtrační nálevky. Nálevku sestav a nasaď na odsávačku.

Vše prováděj co nejrychleji, a to ve sterilním prostoru (např.blízko plamene).

2. Sterilní pipetou přenes do nálevky asepticky 100 ml vzorku a přikryj ji ihned

víčkem sterilní Petriho misky.

3. Pomocí vývěvy odsaj vzorek, malým množstvím sterilní vody opláchni vnitřní stěny

nálevky do výšky, kam sahal vzorek a znovu odsaj. Filtrace musí být skončena

ihned, jakmile je povrch filtru suchý, aby se filtrem neprosával vzduch místnosti

případně znečištěný mikroorganismy.

4. Ihned po filtraci vyjmi membránový filtr asepticky z přístroje, polož na příslušnou

předsušenou živnou půdu (opět lesklou stranou vzhůru) a dobře přitiskni. Inkubuj 48

h při 37oC. Živiny během inkubace difundují na povrch filtru, na kterém vyrostou

kolonie bakterií.

5. Spočítej typické kolonie koliformních bakterií a přepočti na 1 litr nebo 100 g

původního vzorku.

Poznámky :

1. Pro zamezení kontaminace filtrační membrány mikroorganismy ze vzduchu během

odsávání vzorku vyrábějí některé zahraniční firmy filtrační nálevku s víčkem, které

se po napipetování filtrovaného vzorku upevní na nálevku. Na víčku je trubička

vyplněná sterilní vatou, která slouží jako filtr vzduchu, přicházejícího při odsávání

nálevky.

2. Vyrábějí se také celulosové podložky obsahující suchou živnou půdu (pro

koliformní bakterie, pro celkový počet bakterií, pro kvasinky a plísně), které se

pouze ovlhčí sterilní vodou a na ně se položí membránový filtr po provedení filtrace.

Sterilní podložky jsou většinou v balíčcích spolu se sterilním membránovým filtrem.

Strana123

3. Pro usnadnění rozboru vody v terénu se vyrábí také zařízení pracující naaa principu

injekční stříkačky, do níž se nasaje zkoumaná voda. Po nasazení sterilního

membránového filtru se voda protlačí tímto filtrem a filtr se pak inkubuje na živné

agarové půdě nebo na podložce s půdou.

4. Místo odsávání nebo přetlaku (viz pozn.3) se pro filtraci může použít také

odstřeďování. K romuto účelu se vyrábí speciální nerezový prstenec, do něhož se

nasazuje membránový filtr s kovovou filtrační podložkou. Horní strana prstence se

našroubuje na nádabku s filtrovanou kapalinou, spodní strana na nádobku, do které

bude filtrovaná kapalina procházet při odstřeďování.

5. Stanovení počtu mikroorganismů v látkách tuhé konzistence

Při rozboru látek tuhé konzistence je třeba vzorek po navážení rozmělnit na

jemnou drť neboli homogenizovat. U látek měkčí konzistence (játrová paštika, šunka

s vejci apod.) stačí někdy důkladně třepat vzorek se sterilními skleněnými perlami a

sterilní vodou v zabroušené prachovnici. U ostatních látek roztíráme vzorek se sterilním

křemenným pískem a sterilní vodou v třecí misce nebo jej homogenizujeme se sterilní

vodou ve vrtulovém homogenizátoru. Obsah třecí misky chráníme před vzdušnou

kontaminací sterilní gumovou čepičkou (steriluje se v autoklávu), v níž je otvor pro

držadlo tloučku. Frekvence otáček vrtulového homogenizátoru nemá být menší než 8

000 otáček/min a vyšší než 45 000 otáček/min a doba homogenizace nemá přesáhnout

2,5 min. Při použití homogenizačního přístroje typu „Colworth Stomacher“ se navážený

vzorek přenese do sterilního sáčku z umělé hmoty a přidá se zřeďovací roztok pro

získání základního zředění. Pro kultivaci používáme (po případném zředění) přelivovou

nebo roztěrovou metodu (kap. a ).

Cv.6.10 Určení počtu mikroorganismů v látkách tuhé konzistence

Potřeby : vzorek masa, sterilní nůž nebo skalpel, vrtulový homogenizátor, sterilní

nádobka k homogenizátoru, sterilní voda (40 ml, 9 ml) nebo sterilní fyziologický roztok

(roztok č.1), sterilní dělené pipety s uříznutou špičkou nebo kalibrované trubičky, 6

zkumavek s MPA (půda č.5), elektrický kauter, 6 sterilních Petriho misek.

Provedení :

1. Zvaž sterilní homogenizační nádobku (i s vatovou zátkou, která ji uzavírá) na

technických vahách.

2. Povrch masa ožehni plamenem nebo vysteriluj vyhřátým elektrickým kauterem.

Ožehnutým nožem rozkroj maso asi do 2/3 hloubky. Ze středu krájej asepticky malé

Strana124

kousky, přenes je (asi 10 g) do homogenizační nádobky (vše prováděj blízko

plamene!), uzavři nádobku a opět zvaž.

3. Přelij maso v homogenizační nádobce 40 ml sterilní vody nebo fyziologického

roztoku a homogenizuj v jemnou suspenzi (po dobu asi 2,5 min).

4. Pipetou s uříznutou špičkou nebo kalibrovanou trubičkou přenes po 1 ml této

suspenze do dvou Petriho misek a 1 ml do zkumavky s 9 ml sterilní vody a dobře

promíchej. Novou pipetou s uříznutou špičkou přenes 1 ml zředěné suspenze do

další misky.

5. Přelij vzorky na Petriho miskách 45oC teplým MPA a dobře rozmíchej.

6. Po ztuhnutí inkubuj zavěšený agar 24-48 h při 37oC.

7. Po inkubaci spočítej vyrostlé kolonie a výsledek přepočítej na 1 g masa.

6. Stanovení počtu mikroorganismů na povrchu předmětů

Při stanovení počtu mikroorgamismů na povrchu pevných tšles záleží především na

povrchu a velikosti sledovaného tělesa :

a) Smývací metoda je vhodná pro drobné předměty různě vysokého mikrobiálního

znečištění, neboť se u ní může používat seriové zřeďování nebo kombinace

s filtrační metodou (kap. ).

b) Otisková metoda se používá pro poměrně čisté, rovné předměty (např.kontrola

sanitačních podmínek v provoze, kontrola mytí nádobí v hromadném stravování

apod.). Princip spočívá v otisknutí mikrobů na desku živné půdy. K přípravě desky

se používají speciální misky (Duchoslavova, Czizarova) nebo nepoužitá sterilní

víčka konzervových plechovek, která se při inkubaci vkládají do sterilních Petriho

misek.

c) Tamponové metody můžeme použít pro předměty nejrůznějšího stupně

mikrobiálního znečištění i pro předměty s nerovným povrchem, ať vnějším nebo

vnitřním, nebo nepravidelného tvaru.

Cv.6.11 Smývací metoda

Potřeby : Vzorek sušeného ovoce, 4 sterilní Petriho misky, sterilní prachovnice (250

ml) se skleněnými perlami, 100 ml sterilní vody, sterilní dělená pipeta 1 ml, 4

zkumavky s MPA (PŮDA Č.5), pinseta.

Provedení :

Strana125

1. Do odvážené sterilní prachovnice s perlami přenes asepticky pomocí ožehnuté a

ochlazené pinzety asi 5 plodů ovoce a zvaž na technických vahách.

2. Plody přelij 100 ml sterilní vody, nech stát 10-15 min a pak důkladně třepej po dobu

5 min. Do dvou Petriho misek pipetuj po 1 ml a do dalších svou po 0,1 ml.

3. Přelij známým způsobem 45oC teplým MPA (kap. ) a dobře promíchej.

4. Inkubuj při 30oC po 24-48 h.

5. Zjisti počet kolonií a výsledky z misek, které mají 15-150 kolonií, přepočti na 1

plod nebo na 1 g vzorku.

Poznámky :

1. Obdoby této metody můžeme použít pro stanovení čistoty malých nádob. Do

nádobky pipetujeme sterilní vodu a po důkladném protřepání pipetujeme do Petriho

misek 1 ml a 0,1 ml a přeléváne živnou půdou (kap. ). Výsledek přepočítáme na

velikost povrchu, případně na 100 ml obsaaaahu nádobky.

2. U těžko smáčitelných povrchů (některé druhy ovoce, obalový materiál ap.) je možné

do smývací vody přidat malé množství (0,02-0,2%) neionogenních povrchově

aktivních smáčedel (např.Tween 80).

Cv.6.12 Otisková metoda

Potřeby : 3 sterilní Duchoslavovy misky, 1 zkumavka s MPA (půda č.5).

Provedení :

1. Nalij asepticky na víčka Duchoslavových misek (až po jejich okraj) 45oC teplý

MPA, a to tak, aby jeho vrstva byla mírně vypouklá (po ochladnutí se objem agaru

zmenší).

2. Po utuhnutí otiskni vzniklou agarovou desku na určité místo ssledovaného

předmětu.

3. Inkubuj zavěšený agar 24-48 h při 37oC.

4. Spočítej vyrostlé kolonie a přepočti na jednotku plochy (plocha Duchoslavovy

misky bývá většinou 10 cm2).

Cv.6.13 Tamponová metoda

Potřeby : Sterilní kovová šablona s výřezem o známé ploše, sterilní vatové tampony

v Petriho misce, pinzeta, 100 ml sterilní vody v Erlenmeyerově baňce, sterilní gumová

zátka, 4 zkumaavkyy s MPA (půda č. ), 4 sterilní Petriho misky, sterilní dělená pipeta

1 ml.

Strana126

Provedení :

1. Přilož sterilní šablonu na povrch předmětu.

2. Pomocí ožehnuté pinzety otři tamponem namočeným ve sterilní vodě plochu

vymezenou šablonou (nebo celý předmět) a přenes tampon zpět do sterilní vody.

3. To opakuj ještě s dalšími tampony na dalších úsecích povrchu (stačí setřít 3-5

úseků).

4. Erlenmeyerovu baňku s tampony uzavři sterilní gumovou zátkou a tampony

důkladně roztřepej ve sterilní vodě. Pak pipetuj po 0,1 a 1 ml kapaliny do Petriho

misek (vždy paralelnědvě misky), přelij 45oC teplým MPA a dobře rozmíchej.

5. Po inkubaci při optimální teplotě 24-48 h.spočítej vyrostlé kolonie a přepočti na 1

cm2 povrchu.

Poznámky :

1. Velikost vyšetřované plochy a výše zředění se řídí stupněm mikrobiálního znečištění

povrchu sledovaného předmětu. U poměrně čistých předmětů se může tato metoda

kombinovat s filtrační metodou (kap. ).

2. U drobných předmětů nepravidelného tvaru (např. háky v odvěšovně masa, lžíce

apod.) stíráme mikroby z celého povrchu, jenž příjde do styku s potravinou a

výsledek vyjadřujeme počtem mikrobů na jednom předmětu.

7. Zjišťování počtu mikroorganismů v potravinách a v potravinářských

surovinách

Deskové metody slouží ke zjišťování počtu mikrobiálních buněk při

mikrobiologickém zkoušení potravinářských výrobků a pitné vody. Cílem rozborů je

kontrola kvality podle českých ISO norem, v nichž jsou uvedeny skupiny nebo druhy

zjiš´tovaných mikroorganismů, přesný postup pro jejich detekci i mez jejich počtu, jež

nesmí být překročena.

Nejběžnějším ukazatelem kvality i další údržnosti potravinářských výrobků je

celkový počet mezofilních bakterií, zjišťovaný na masopeptonovém agaru s 1 %

glukosy (půda č.YY) při 37 nebo 30oC. je také do jisté míry ukazatelem kvality

skladování a distribuce výroku.

Velmi cenným ukazatelem hygienických podmínek při výrobě i distribucije

obsah koliformních bakterií jakožto indikátoru fekálního znečištění, a proto u většiny

potravin jsou udány nejvyšší přípustná množství těchto bakterií. U potravin a

potravinářských surovin s nižší vlhkostí (obiloviny, mouka, škrob, sušené výrobky) je

Strana127

důležitý obsah plísní (zjišťuje se na půdě obsahují kvasničný extrakt, glukosu a vhodné

antibiotikum zamezující růst bakterií, o pH cca 4,0, při 22o–30oC. U kyselých výrobků

obsahujících sacharidy (hlavně slazené nealkoholické nápoje, kompoty apod) se zjišťují

také počty kvasinek a to na stejné půdě jako pro plísně. U některých výrobků bílkovinné

povahy se stanovují ještě proteolytické bakterie, sledováním rozkladu kaseinu nebo

želatiny v okolí jejich kolonií (viz kap. 11) anebo lipolytické bakterie a plísně

zjiš´tované na základě uvolňování volných mastných kyselin z neutrálních lipidů.

U surovin pro tepelně sterilované nekyselé potraviny se zjišťuje ještě počet

aerobních a anaerobních sporotvorných termofilních bakterií, neboť jejich velmi

thermorezistentní spory přežívají používaný sterilační režim a během skladování při

teplotách nad 30oC mohou způsobovat kažení těchto potravin.

Český zákon o potravinách (Zákon č.110/1997 a Vyhláška 298) uvádí, že

příslušný výrobek nesmí obsahovat pathogenní, podmíněně pathogenní a toxinogenní

mikroorganismy pro různé druhy potravin a rovněž uvádí tolerované hodnoty některých

mikroorganismů. Postup jejich stanovení je určen příslušnou ČSN ISO normou. Hlavní

dozor nad hygienou potravin má Česká zemědělská a potravinářská inspekce (ČZPI) a

orgány veterinární kontroly. Povinnosti výrobce při zpracování surovin určuje zákon o

potravinách, který ukládá všem výrobcům zavést do výroby systém kontrolních bodů

(HACCP –Hazard analysis of critical control points).

6.2.4 Stanovení buněčné hmoty mikroorganismů

Nejčastěji se v mikrobiologii používá stanovení sušiny buněčné hmoty, ať už

přímou vážkovou metodou nebo nepřímo spektrofotometrem, eventuálně též z objemu

buněčné hmoty. Ve všech těchto metodách dostáváme směrodatné výsledky pouze

z kultur narostlých na čirých půdách. U půd obsaaaahujících ssraženinu odečítáme od

zjištěné sušiny sušinu pevných částic nezaočkované živné půdy, oddělených od půdy

obdobným způsobem jako buňky (tj. centrifugací nebo filtrací).

1. Stanovení buněčné sušiny vážkovou metodou

Pro stanovení buněčné sušiny vážkově jsou vhodné dvě metody podle charakteru

vzorlu, a to :

a) Pipetování mikrobiální suspenze do váženek

Strana128

Používá se u suspenzí promytých (2×) a resuspendovaných v destilované vodě

nebo ve fyziologickém roztoku. V případě fyziologického roztoku je třeba od získané

hodnoty odečíst sušinu tohoto roztoku.

b) Filtrační metoda mikrobiální suspenze

Používá se většinou u buněk ve fermentované kapalině (zákvas, hlavní kvašeí), a

to jak pro kvasinky a bakterie, tak i pro plísně.

Cv.6.14 Stanovení buněčné sučiny suspenze vážkově

Potřeby : Promytá suspenze mikroorganismů, hliníková váženka, případně

s křemenným pískem a s krátkou skleněnou tyčinkou, pipeta, infra-lampa, sušárna.

Provedení :

1. Hliníkovou váženku s křemenným pískem a s krátkou tyčinkou vysuš při 105oC a po

vychladnutí v exsikátoru zvaž na analytických vahách.

2. Do zvážené misky pipetuj 2-5 ml zkoušené suspenze, odpař kapalinu pod infra-

lampou a pak dosuš při 105oC do konstantní váhy. Poprvé zvaž po 1 hodině sušení,

pak v půlhodinových intervalech. Při přesušení začne váha opět mírně stoupat.

3. Z rozdílu vah vypočítej sušinu a přepočti ji na 1 ml suspenze.

Poznámka :

U hustších suspenzí ve fyziologickém roztoku je třeba při výpočtu sušiny

uvažovat sušinu fyziologického roztoku.

Cv.6.15 Stanovení buněčné sučiny suspenze filtrací

Potřeby : Vzorek fermentovaného media, vzorek nezaočkovaného media, 2 filtrační

kelímky (S-4 pro kvasinky a plísně, G-5 pro bakterie), odsávačka, vývěva.

Provedení :

1. Do vysušeného zváženého filtru odpipetuj 5-20 ml fermentované kapaliny.

2. Odsaj kapalinu, třikrát promyj 3 ml destilované vody a suš do konstantní váhy při

105oC.

3. Totéž proveď i s nezaočkovaným mediem.

4. Vypočítej sušinu buněk a zkoriguj ji o sušinu nezaočkovaného media. Výsledek

přepočti na 1 ml fermentované suspenze.

Poznámka :

U stacionárních kultur plísní se většinou stanovuje sušina celé kožovité vrstvy

(deky), vyrostlé na povrchu tekutého media. Výpočet se provádí na 1 g plísně.

Strana129

2. Stanovení buněčné sušiny z objemu buněčné hmoty

Pro rychlé orientační stanovení přírůstků buněčné hmoty ve fermentované

kapalině je možné použít centrifugační stanovení objemu vzniklé buněčné hmoty.

K tomuto účelu používáme centrifugační kyvety dole zakončené úzkou kalibrovanou

trubičkou. Kalibrační křivka, tj. stanovení sušiny buněčné hmoty, se provádí paralelně

vážkovou metodou, a to filtrací fermentované kapaliny. Při stanovení objemu objemu

buněčné hmoty je třeba zachovávat stále stejné centrifugační podmínky (tj.počet

obrátek/min, vzdálenost od osy rotace a dobu centrifugace).

3. Turbidimetrické stanovení buněčné sušiny

Pro stanovení buněčné sušiny, případně počtu buněk, můžeme použít

spektrfotometrické stanovení zákalu. Při této metodězjišťujeme, kolik světla bylo

pohlceno (absorbováno) zakaleným roztokem. Mezi intenzitou dopadajícího světla

procházejícího suspenzí platí vztah, který je obdobou Lambert-Beerova zákona

v kolorimetrii :

log = k×d×c ,

kde I …intenzita světla po projití roztokem nebo suspenzí,

Io…intenzita světla po projití čirým mediem,

k …konstanta, která závisí na přístroji a turbidimetrických podmínkách,

d …tloušťka turbidimetrické kyvety ,

c …koncentrace suspendovaných částic

log ..absorbance A (dříve extinkce). Tuto hodnotu přímo poskytuje

spektrofotometr.

Měření se musí provádět při optimální vlnové délce, obvykle v rozmezí 640-650

nm. Uvedená rovnice platí pouze v určitém rozmezí absorbance, v případě turbidimetrie

0,05 až 0,25, kdy je A přímoúměrná koncentraci suspendovaných částic.

Strana130

Tuto metodu používáme pro suspenze mikroorganismů v destilované vodě nebo

v čirých světlých kapalných půdách. Vedle stanovení sušiny ji můžeme použít také pro

přibližné stanovení počtu mikrobiálních buněk. Metoda je méně citlivá než

nefelometrie. Minimální koncentrace zjistitelná turbidimetrií je 107 bakteriálních

buněk/ml.

Kalibrační křivku připravujeme na základě vážkového stanovení sušiny. Užívá

se pro rychlá měření seriových analys při biochemických pracech, při stanovení

růstových křivek ap.

Cv.6.16 Turbidimetrické stanovení buněčné sušiny

Potřeby : Suspenze mikroorganismů v destilované vodě, nezaočkované medium (pro

měření), pipety, zkumavky, spektrofotometr, potřeby pro stanovení sušiny (kap.7.2.4.2)

nebo pro přímé mikroskopické počítání, buněk.

Provedení :

1. Mikrobiální suspenzi nařeď destilovanou vodou nebo živnou půdou tak, aby

absorbance při optimální vlnové délce byla maximálně 0,30. Hodnota 0,30 je již

nevhodná!

2. V takto naředěné suspenzi stanov koncentraci, a to stanovením buněčné sušiny v 1

ml, připadně stanov počet buněk.

3. Mikrobiální suspenzi dále nařeďdestilovanou vodou (nebo čirým světlým mediem),

a to v poměrech 4:1,3:2,2:3 a 1:4.

4. U takto naředěných roztoků včetně nezaočkovaného media změř absorbance.

Kalibrační přímku sestroj tak, že na osu úseček naneseš množství buněčné hmoty

(nebo počty buněk) a na osu pořadnic příslušné absorbance..

5. Stanov absorbanci vzorku. Přesahuje-li hodnotu 0,30, zřeď vzorek příslušným medie

tak, aby hodnota absorbance byla nižší než 0,30.

6. Z kalibrační přímky zjisti koncentraci sušiny nebo počet buněk, příslušející

k nalezené absorbanci. Výsledek přepočti naa1 ml původního vzorku.

Kontrolní otázky ke kap.6 − ZJIŠŤOVÁNÍ POČTU MIKROBIÁLNÍCH BUNĚK V PROSTŘEDÍ

1. Jak můžete zjistit počet mikrobiálních buněk v prostředí ? Která z těchto metod je

nejrychlejší ? Která je nejuniverzálnělší ? Které metody jsou vhodné pro stanovení

počtu živých buněk ?

Strana131

2. Které metody se používají pro husté suspenze buněk a které pro mikrobiologicky

čiré roztoky ?

3. Jaké jsou rozdíly mezi nefelometrickou a turbidimetrickou metodou ?

4. Kdy a jak provádíme vážkové stanovení sušiny buněk ?

5. Které jsou výhody a nevýhody kultivačních metod ?

6. Proč při hloubkovém očkování do misek temperujeme agarové půdy na 45oC ?

7. Které faktory ovlivňují velikost kolonií u deskových metod ?

8. Proč u deskových metod vyhodnocujeme pouze desky živného agaru obsahující 30-

300 kolonií a diagnostických agarů obsahující pouze 15-150 kolonií ?

9. Jaký je počet mezofilních bakterií/ml, jestliže :

a) 0,5 ml vzorku poskytlo 425 a 460 kolonií a 0,05 ml poskytlo 73 a 78 kolonií na

deskách

b) 0,5 ml vzorku poskytlo 280 a 293 kolonií a 0,05 ml poskytlo 33 a 37 kolonií na

deskách ?

10) Jaké jsou principy stanovení koliformních bakterií ?

11) Jak zjišťujeme sporotvorné bakterie ?

12) Jak zjišťujeme počet mikroorganismů na povrchu předmětů ?

13) Kdy používáme filtrační metody a kdy stanovení MPN ?

14) Zjistěte z tabulky MPN (v 1 g vzorku) pro tři paralelní kultury při počtu pozitivních

kultur

a) 3,2,0 a inokulu 10 g, 1 g a 0,1 g vzorku nebo 10 mg, 1 mg a 0,1 mg vzorku

b) 3,3,2,0,1 a inokulu 10 g, 1 g, 0,1 g, 0,01 g a 0,001 g vzorku.

Strana132

7. SLEDOVÁNÍ RŮSTU MIKROORGANISMŮ

Směs mikroorganismů různých druhů, velikostí a tvarů, kterou nacházíme v jed-

notlivých typech životního prostředí představuje směsnou populaci, která je

adaptovaná na dané podmínky. Růst směsných populací je ovlivňován mnoha faktory a

jeho studium je znač-ně náročné.

Rozvoj mikrobiologie byl podmíněn studiem čistých kultur, tím rozumíme

populace vzniklé z jediné buňky. Tato technika umožňuje studium biochemických a

fysiologických vlastností sledovaného mikroorganismu. Tekutá kultura mikroorganismů

po přenosu do čerstvého tekutého media zahajuje svůj růst a dělení. Tento růst má své

zákonitosti a neprobíhá stále rovnoměrně. Je závislý na množství a dostupnosti živin

v kultivačním mediu, tvorbou metabolických zplodin (organické kyseliny). U aerobních

mikroorganismů k tomu přistupuje dostatečné provzdušnění media, neboť v nedostatku

kyslíku nerostou.

Růst bakteriální kultury lze rozčlenit do následujících růstových fází:

1. Přípravná fáze, neboli lag fáze, během této fáze se buňky nedělí a probíhá

adaptace na nové prostředí. Délka lag fáze je dána množstvím a velikostí změn,

kterým se buňky musí přizpůsobit (teplota, zdroj C, zdroj N apod.).

2. Dále následuje fáze zrychleného růstu, kdy se již buňky počínají dělit postupně

se zvyšující se rychlostí a se zkracující se generační dobou.

3. Exponenciální neboli logaritmická (log) fáze, je charakterizovaná

exponenciálním přírůstkem biomasy a nejkratší generační dobou.

4. Během fáze zpomaleného růstu klesá rychlost rozmnožování buněk.

5. Ve stacionární fázi je přírůstek a úbytek buněk v rovnováze, takže celkový počet

buněk během této fáze je stejný.

6. Ve fázi postupného umírání počet buněk klesá a buňky se již přestávají

rozmnožovat.

Grafické znázornění těchto procesů je růstová křivka. Přírůstek počtu buněk a

biomasy lze sledovat mnoha způsoby : Rostou-li bakterie v čirém mediu, pak je

Strana133

nejjednodušší měřit změnu optické density ( OD) na spektrofotometru obvykle

v rozmezí od 600 do 650 nm. Další způsob je měření přírůstku sušiny sledované

kultury, kdy standardní objem kultury se přefiltruje přes vhodný filtr, promyje a vysuší.

Rovněž je možné přímé počítání buněk (platí pro kvasinky) v počítací komůrce, nebo

kultivační des-

ková metoda. Pro suspenzní media se uplatňují alternativní postupy : Měření pH nebo přírůstek obsahu proteinů na jednotku objemu. Z uvedeného schématického grafu je zřejné, že z hlediska rychlosti růstu je optimální log-fáze, proto je této fázi věnována největší pozornost. Při sledování růstu mikroorganismů se ukázalo, že jsou velmi důležité tyto charakteristiky : Doba zdvojení T,

růstová rychlost μ. Pro jejich obecné odvození vyneseme si růstovou křivku až po začátek

stacionární fáze, jak ukazuje následující schéma, tj. osa Y je logaritmická a na osu X vynášíme ekvidistančně čas :

dtdx = μ × x

Růst populace bakteriálních buněk lze sledovat, je-li rostoucí kultura

buněk ve vyváženém stavu. Experimentálně bylo zjištěno, že je-li tato populace v

ustáleném stavu a v log-fázi, pak množství biomasy dané populace nebo průměrné

hodnoty všech buněk dobře splňují rovnici :

Schéma růstové křivky mikroorganismů

Čas

Mno

žstv

í bio

mas

y

Lag -- fáze

Zrychle-ný růst

Log - fáze

Zpoma-lený růst

Stacionární fáze

Degradační fáze -- postupné odumírání

Strana134

= μ× (1)

Konstanta úměrnosti μ je míra rychlosti růstu a je současně specifickou

rychlostí růstu, tj. rychlost růstu vztaženou na jednotkovou proměnnou x, jak plyne z

uvedenéhovztahu (1) :

μ = dtdx

x×

1

Řešením rovnice (1) je závislost proměnné x na čase, kdy x0 je koncentrace

v čase 0 a x je koncentrace v čase abychom :

= μ

×

ln x−ln x0 = μ × t (2)

Schéma růstové křivky mikroorganismů II

Čas

Mno

žstv

í bio

mas

y (lo

g)

Log - fáze

Strana135

ln = μ × t (3)

x = x0×eμ t (4) Ze vztahu (4) vidíme, že proměnná x je exponenciální funkcí času t. Podle

vztahu (3) je logaritmus podílu okamžité koncentrace x k počáteční koncentraci x0 je

lineární funkcí času, a proto bývá tato fáze růstu mikroorganismů označována log-fáze.

Míru rychlosti růstu můžeme lépe vyjádřit ze vztahu (2) :

μ = (5)

Dobu zdvojení T získáme ze vztahu (3) dosazením x = 2×x0 a t = T :

ln 2 = μ ×T

a odtud T = ln 2 /μ = 0,693/μ (6)

Jelikož v jedné generaci z každé mateřské buňky vznikají dvě buňky dceřiné,

můžeme také dobu zdvojení označit jako dobu generační. Pak můžeme vypočítat počet

průměrných rostoucích generací z doby zdvojení. Jelikož :

t = n × T

kde n značí počet průměrných rostoucích generací. Potom :

n =

(7) Tyto vztahy platí, když podmínky růstu mikroorganismů jsou dány chemicky

definovanými medii, v nichž každá fyziologická role každé sločeniny je definována a

naopak každá fyziologická role je zastoupena jednou sloučeninou. Tak např. je-li

jedním z cukrů glukosa, pak v případě přídavku laktosy nebo galaktosy, arabinosy,

maltosy aj. vzniká při měření růstu křivka složená ze dvou růstových křivek,

oddělených mezi sebou časovou prodlevou (diaxická lag-fáze). Tento jev se nazývá

diaxie. Poprvé byla diauxie popsána Monodem za podmínek, kdy v minerálním mediu

byly současně dva zdroje uhlíku a energie. Diauxie je vyjádřením regulačních

mechanismů zajišťujících economii buňky v přítomnosti dvou živin se stejnou funkcí.

Strana136

Cv.7.1 Stanovení růstové křivky u kvasinek přímým počítáním buněk

Potřeby : 48 h stará kultura Saccharomyces cerevisiae v tekuté sladině (půda č. XY),

500 ml baňky se 100 ml sladiny, sterilní 10 ml pipety, 1 % vodný roztok methylenové

modři.

Provedení :

1. Baňku se sladinou zaočkuj 10 ml čerstvé kultury S. cerevisiae, důkladně

promíchej, odeber asepticky vzorek a spočítej v něm pomocí Bürkerovy komůrky

počet mrtvých a živých buněk (po obarvení roztokem methylenové modře).

Inkubuj baňku při 28 oC na třepačce.

2. Odebírej vzorky po 1,5 h a počítej mrtvé a živé buňky v suspenzi.

3. Sestroj růstovou křivku : osa x = čas (v hodinách), osa y = logaritmy počtu živých

a mrtvých buněk.

4. Totéž proveď za statických podmínek, tj. baňka není třepaná, ale inkubovaná

v ter-mostatu.

5. Porovnej obě růstové křivky a spočítej v jednotlivých intervalech růstu generační

dobu

( t ), specifickou růstovou rychlost ( μ ), dobu lagu a růstový lag (τ1 ) a ( L ) za

použití rovnic uvedených výše (rovnice 1 až 7).

Cv.7.2 Stanovení růstové křivky u bakterií spektrofotometricky

Potřeby : kultura Escherichia coli v LB mediu (půda č. XY), Erlenmayerova baňka

objemu 250 nebo 300 ml se 100 ml bujonu ( možno i LB půda), sterilní pipety 10 a 1

ml, spektrofotometr.

Provedení :

1. Změř absorbanci narostlé kultury E. coli při 650 nm proti vodě. Před měřením

nařeď vzorek vodou 1 : 10 (aseptický odběr). Absorbance takto naředěného

roztoku by měla mít hodnotu v rozmezí 0,1 – 0,25 . Při hodnotách méně než 0,1

odeber další vzorek (asepticky) a nařeď 5x.

2. 100 ml živné půdy naočkuj pomocí pipety tak, aby počáteční absorbance byla

přibližně 0,1. Potřebné množství inokula jsi zjistil předchozím měřením. Např.

byla.li při ředění 1 : 10 absorbance 0,1, pak k naočkování 100 ml půdy použij 10

ml tekuté kultury; při jiných hodnotách absorbance si potřebné množství inokula

Strana137

vypočítej přímou úměrou, tak aby výchozí OD pokusné baňky nepřesahovalo

hodnotu 0,2.

3. Zkontroluj výchozí absorbanci v baňce, zapiš ji do sešitu jako hodnotu v čase 0 a

upevni baňku na třepačku a inkubuj při 37 oC.

4. Vzorky odebírej asepticky (vždy novou sterilní pipetou) v 30 minutových

intervalecha měř absorbanci při 650 nm. Dosáhne-li absorbance hodnot 0,5, při

následujícím měření začni vzorek ředit vodou. Do sešitu zapisuj hodnoty

absorbance vynásobené použitým ředěním.

5. Sestroj růstovou křivku osa x = čas (v hodinách), osa y = logaritmus absorbance

kultury. Vypočítej specifickou růstovou rychlost, podle rovnice 5, generační dobu

t v exponenciální fázi, dobu lagu a růstový lag (τ1 ) a ( L ) za použití rovnic

uvedených výše ( rovnice 1 až 7).

Cv.7.3 Stanovení diauxie u Escherichia coli

Potřebné: kultura Escherichia coli v LB mediu (půda č. XY), Erlenmayerova baňka

objemu 250 nebo 300 ml se 100 ml bujonu ( možno i LB půda), 2 % sterilní roztok

glukosy, 2 % sterilní roztok laktosy, sterilní pipety 10 a 1 ml, spektrofotometr.

Provedení:

1. Změř absorbanci narostlé kultury E. coli při 650 nm proti vodě. Před měřením

nařeď vzorek vodou 1 : 10 (aseptický odběr). Absorbance takto naředěného

roztoku by měla mít hodnotu v rozmezí 0,1 – 0,25 . Při hodnotách méně než 0,1

odeber další vzorek (asepticky) a nařeď 5x.

2. Do baňky se sterilní půdou přidej asepticky po 5 ml od každého roztoku cukru.

Takto se zvýší objem media na 110 ml. Přidej inokulum tak aby výsledná optická

densita dosahovala hodnoty cca 0,1 (OD 650 nm).

3. Zkontroluj výchozí absorbanci v baňce, zapiš ji do sešitu jako hodnotu v čase 0 a

upevni baňku na třepačku a inkubuj při 37 oC.

4. Vzorky odebírej asepticky (vždy novou sterilní pipetou) v 30 minutových

intervalecha měř absorbanci při 650 nm. Dosáhne-li absorbance hodnot 0,5, při

následujícím měření začni vzorek ředit vodou. Do sešitu zapisuj hodnoty

absorbance vynásobené použitým ředěním.

5. Sestroj růstovou křivku osa x = čas (v hodinách), osa y = logaritmus absorbance

kultury. Vypočítej specifickou růstovou rychlost, podle rovnice 5, generační dobu

t abychom v exponenciální fázi, dobu lagu a růstový lag (τ1 ) a ( L ) za použití

Strana138

rovnic uvedených výše ( rovnice 1 až 7). Rovněž odečti z grafu délku

diauxického lagu.

Kontrolní otázky ke kap.7 − SLEDOVÁNÍ RŮSTU MIKROORGANISMŮ

1. Které znáte růstové fáze ?

2. Čím je charakterizovaná exponenciální fáze ?

3. Jakými způsoby je možno stanovit růst mikrobiálních kultur ?

4. Definujte generační dobu, jakým způsobem ji určíte ?

5. Jak se mění generační doba mikroorganismů v průběhu růstu, v jaké fázi růstu je

nejkratší ?

6. Co je doba lagu a čím je její délka ovlivněna ?

Strana139

8. ZÁKLADNÍ GENETICKÉ PRÁCE

Genetika se zabývá mechanismy jimiž jsou předávány dědičné rysy jednoho

organismu na jiný. Těchto poznatků lze využít v medicíně, průmyslu a zemědělství.

Pochopení genetických mechanismů umožnilo manipulovat mikroorganismy a připravit

nové druhy. Byla připravena celá řada produkčních mikroorganismů, které jsou

využívány v biotechnologické výrobě různých organických látek. Aplikace výzkumů

vedly k možnosti kontroly některých nemocí. Důležitá je také aplikace genetických

metod v prenatální diagnostice. Následující úlohy se zabývají možnostmi změny

dědičného materiálu mikroorganismů.

Strana140

8.1 Mutace

Mutace je náhlá a trvalá změna genetického materiálu, která není vyvolána

rekombinací. V současné době existuje celá řada mutagenů jejichž mechanismus

působení je znám. Volbou vhodného mutagenu lze tedy regulovat typ mutace a tím i

rozsah působení. Mutageny působí na různých místech vzniká celá škála změněných

mikroorganismů. Pro získání jednotlivých geneticky změněných kmenů je tedy nutné

izolovat vhodné mutanty od původního standardního kmene. Je nutno poznamenat, že

mutagenní účinek bývá zpravidla nízký a standardní kmen představuje i po mutagenním

zásahu populaci o několik řádů četnější ve srovnání s mutanty. Obecně lze rozdělit

mutace na ty jejichž projev lze či nelze využít pro selekci. Příkladem mutantů které není

možné selektovat je změna morfologie nebo barvy buněk. To znamená, že mutant není

zvýhodněn oproti standardnímu kmeni a nelze tedy využít selektivních podmínek pro

jeho pomnožení na úkor původního nezmutovaného kmene. V tomto případě nezbývá

než testovat velké množství jednotlivých kolonie izolovaných z agarové půdy.

Příkladem mutace již lze selektovat, je získání resistence k látce toxické pro standardní

kmen (např. antibiotikum, těžký kov atd.). V půdě obsahující danou toxickou látku lze

zcela eliminovat původní kmen.

8.1.1 Stanovení rychlosti spontánních mutací

Pro posouzení stability používaných kmenů i pro indukce mutantů je užitečné

stanovit náchylnost příslušného kmene k mutacím. Při biotechnologických aplikacích se

jedná především o zjištění stability určité požadované vlastnosti a v tomto případě se

sleduje fenotypový projev kmene a změna fenotypu v důsledku mutací. V některých

případech lze použít selekce např. resistence k antibiotikům, toxickým analogům

metabolitů nebo meziproduktů metabolismu nebo ke zvýšené či snížené teplotě a

revertantů auxotrofních mutantů. V těchto případech lze očkovat řádově 107 buněk na

Petriho misku, z nichž zřetelné kolonie (obvykle řádu 101 na jednu misku) vytvoří

pouze buňky sledovaného, dominantního fenotypu. Ostatní buňky buď nerostou vůbec

nebo vytvářejí velmi malé kolonie což se při zmíněné masivní inokulaci projeví jako

slabě zřetelný zbytkový nárůst po celém povrchu misky. Zpravidla je však třeba

vyhodnotit změnu projevující se metabolickými odchylkami, změnou morfologie. Často

jsou používány diagnostické půdy.

Strana141

Mutace mohou vznikat i bez zjevného vnějšího zásahu. Takovéto tzv. spontánní

mutace nejsou časté a jejich výskyt se pohybuje v řádu 10-7 – 10-10 mutací na jednu

buňku a jedno buněčné dělení. Existují však nestálé geny, náchylné k mutacím, u nichž

může být účinnost těchto mutací až 10-2 mutací na jednu buňku a jedno buněčné dělení.

Frekvence spontánních mutací je závislá na povaze sledovaného genu i na celkové

genetické výbavě buňky tj. jejím genotypu.

Zjišťování revertantů k prototrofii je jednoduchá metoda založená na snadné

detekci mutantů. V případě bakterií se používá minimální agar s glukosou jako zdrojem

uhlíku u kvasinek se používá minimální agar obsahující vitaminy. Místo složité

přípravy živné půdy pro kvasinky se používají směsi růstových látek a živin v nichž

chybí sledovaná látka např. aminokyselina (např. Dicfo Yeast Nitrogen Base without

Amino Acids). Pro plísně rodů Penicillium a Aspregillus se jako minimální živná půda

většinou používá Czapek-Doxův agar. Pro zjištění mutantů resistentních k inhibitorům

se používají vedle minimální půd i bohatá živná media (např. masopeptonový agar (pro

bakterie) nebo kompletní agar pro kvasinky a plísně. U mutantů resistentních

k inhibitorům mitochondriální aktivity tj. resitence k chloramfenikolu, erythromycinu,

oligomycinu, mucidinu atd. se používá glycerolový agar. Důvodem je fakt, že glycerol

jakožto nezkvasitelný zdroj uhlíku indukuje aerobní respiraci.

Mezi mutanty detekovatelné bez selekce náleží např. zjišťování auxotrofních

mutantů, respiračně deficitních mutantů, mutantů se změnou morfologie kolonií (např.

R-mutanty, tvořící drsné kolonie nebo mutanty u nichž došlo ke změně barvy např.

některé mutanty S. cerevisiae s poškozenou syntézou adeninu, jež tvoří růžové kolonie).

8.1.2 Zjišťování auxotrofních mutantů

Auxotrofní (výživové, z lat. auxilium – pomoc) mutanty mají poškozen některý

z genů kontrolujících syntézu určité aminokyseliny, base nukleových kyselin (u

kvasinek adeninu či uracilu, u bakterií také thyminu) nebo vitaminu. Z těchto důvodů

auxotrofní mutanty nerostou na minimálních půdách, které tyto látky esenciální

postrádají. Výhodné je pomnožení populace auxotrofů na úkor prototrofů. K tomu lze

využít antibiotik působícíh pouze na rostoucí buňky (např. penicilin u bakterií a

nystatin, amfotericin nebo jiné polyenové antibiotikum u kvasinek a plísní). Tato

antibiotika se aplikují do minimálního media v němž rostou pouze původní tj.

prototrofní kmeny. Tyto jsou antibiotiky usmrcny a přežívají nerostoucí auxotrofní

Strana142

mutanty. Aby bylo zabráněno riziku poškození auxotrofů v důsledku zbytkového růstu

za využití energie z vnitrobuněčných reserv, je nutno buňky nejprve vyhladovět na

minimálním mediu bez antibiotika.

Metody pro zjištění frekvence spontánních mutací jsou založeny na několika

zjednodušujících předpokladech. Jedním z nich je předpoklad, že mutanty rostou

v použitém mediu stejnou růstovou rychlostí. Proto se zpravidla pro analýzu daného

kmene používá porovnání výsledků několika metod. V principu se jedná vždy o

statistické vyhodnocení frekvence výskytu mutantů daného typu. To znamená, že musí

být snadno zjistitelná změna fenotypu způsobená mutací.

Cv.8.1 Zjištění bakteriálních auxotrofů

Potřeby : Suspense buněk E. coli (např. po UV mutagenesi), 100 ml Erlenka s 15

ml sterilní minimální půdy (půda č. ) obsahující 100–300 jednotek penicilinu/ml, 5 ml

sterilní minimální půdy (půda č. ) pro vyhladovění na dusík.

Provedení :

1. Třikrát promyjte suspensi buněk fysiologickým roztokem.

2. Inkubujte 0,1 ml suspenze v 5 ml minimálního media bez dusíku za třepání při 37°C

po dobu 1–2 h.

3. Převeďte 0,1 ml takto vyhladovělé kultury do 15 ml stejné minimální půdy

s penicilinem a inkubujte za třepání při 37°C.

4. Po 12, 18 a 24 h odeberte asepticky po 4 ml kultury odstřeďte při 4 000 g a peletu

resuspendujte v 7 ml sterilního fysiologického roztoku a znovu odstřeďte. Promyjte

takto buňky ještě dvakrát a získané buňky resuspendujte ve 4 ml sterilního

fysiologického roztoku.

5. Připravte sérii ředění tak abyste na misky obsahující předsušený masopeptonový

agar očkovali cca 30–300 buněk.

6. Inkubujte 24–48 h při 37°C.

7. Misky obsahující 30– 100kolonií použijte pro otisk na předsušený minimální agar

v Pet-riho miskách. Nejprve je třeba přesně označit fixem na dně orientaci této

misky. Stejným způsobem označte i misky na něž budete otiskem přenášet kolonie.

8. Pak vatou ovlhčenou ethanolem otřete replikační blok (Obr ) a ožehněte jej.

Pomocí ožehnuté pinsety přeneste na blok sterilní samet a ethanolem otřený

prstenec pro fixaci sametu (Obr. ) případně sterilního filtračního papíru.

Strana143

9. Otevřenou misku s koloniemi překlopte na samet tak, aby označený bod na kraji dna

misky souhlasil s bodem na replikačním bloku. Misku lehce přitiskněte a mírným

poklepem na dno otiskněte kolonie na samet (Obr. ). Misku opatrně sejměte tak,

aby části agaru nezůstaly na sametu.

10. Stejným způsobem přitiskněte na samet obsahující kolonie označenou misku s mi-

nimálním agarem. Takto inokulovanou misku inkubujte 24h při 37°C.

11. Dobře izolované kulaté kolnie přeneste z misek obsahujících více než 100 kolonií

sterilními párátky na Petriho misky obsahující :

a) minimální agar

b) masopeptonový agar

12. Porovnáním nárůstu na miskách s minimálním a masopeptonovým agarem zjistěte,

které kolonie rostou pouze na masopeptonovém agaru a vyžadují tedy pomocnou

živinu.

13. Vybrané auxotrofní kolonie přeočkujte na šikmý MPA pro uchovávání a případné

další testování.

Obr. Replikační blok pro otisk kolonií

Strana144

Obr. Přichycení sterilního sametu do replikační-ho bloku

Obr.Otisk kolonií

Obr. Otištěné kolonie na sametu

Strana145

8.1.2.1 Zjištění průměrného počtu mutantů hledaného typu

Tato metoda je založena na stanovení průměrného počtu mutantů, přičemž se

k ana-lýze používají velké série paralelních kultur, v nichž jsou počítány kolonie se

změněným fenotypem. Mutační rychlost a se pak vypočte dle vzorce:

r = 2lnNa ×

×ln ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ ××

2lnCNa

kde r = průměrný počet mutantů v kultuře (nebo v jejím analyzovaném podílu)

N = průměrný počet buněk v kultuře (nebo v jejím analyzovaném podílu)

C = počet analyzovaných vzorků

Mutační rychlost a se řeší iteračním postupem (postupným dosazováním a).

Případně je možné odhadnout mutační rychlost a, pokud známe podíl kultur, které

neobsahují dané mutanty :

a = N

P2

ln 0

,

kde P0…podíl kultur, které neobsahují dané mutanty

N …průměrný počet buněk v kultuře na konci růstu

.

8.1.2.2 Zjištění počtu mutantů hledaného typu v jediné kultuře

V tomto případě je nutné použít dostatečné množství inokula tak, aby bylo

možné detegovat několik mutantů již po prvním buněčném dělení. Za těchto podmínek

je metoda velmi dobře reprodukovatelná. Velikost inokula závisí na hodnotě sledované

mutační rychlosti a pro mutační rychlost 10-8 mutací na jednu buňku a jedno buněčné

dělení je potřeba inokulum, alespoň 5 x 108 buněk. Odpovídající objem kultury by

v tomto případě mel být cca 300 ml. Pro inokulum je třeba volit kultury s co nejmenším

počtem sledovaných mutantů. Pro stanovení se používá zpravidla 5–10 paralelních

vzorků, které se inkubují za optimálních podmínek do stacionární fáze a poté se v každé

kultuře stanoví celkový počet buněk a počet mutantů. Pro každou kulturu se vypočte

mutační rychlost podle vzorce :

Strana146

a = nNr

Nr

2ln21

1

2

2 ×⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛−×

,

kde r1 …počet mutantů v inokulu

N1 …celkový počet buněk v inokulu

r2 …počet mutantů po ukončení růstu

N2…celkový počet po ukončení růstu

n … počet generací růstu a vzpočte se ye vytahu : n×ln2 = lnN2−lnN1

Konečným výsledkem je průměr mutačních rychlostí zjištěných v jednotlivých

kulturách.

8.1.3 Indukce mutací

Indukce mutantů s jejich následující selekcí představuje základní postup při

šlechtění mikroorganismů, neboť při ní získáváme nové znaky a vlastnosti, které pak

dalšími genetickými postupy (viz tab. x) můžeme přenášet do jiných jedinců a

kumulovat s jinými znaky.

Tabulka x

Přehled genetických postupů používaných při šlechtění průmyslových mikroorganismů

Genetický postup Použití u mikroorganismů Účel 1. indukce a selekce haploidních vzácněji vytvoření nových mutantů u diploidních znaků 2. křížení a rekombinace : a) hybridizace se sexuálním cyklem (tj. kumulace u askomycetních a bazidio- několika mycetních kvasinek a plísní) mutací b) parasexuální gramnegativních bakterií, do jediného křížení aktinomycet a plísní jedince c) fuze protoplastů všech kromě gramnegativních d) rekombinace virulentních fágů téhož bakteriofágů hostitele 3. přenos izolované DNA a) transformace grampozitivních bakterií a kvasinek přenos b) použití vektorů: určitých

I. transdukce a trans- gramnegativních kvasinek genů do fekce recipientní II. sex-dukce gramnegativních bakterií buňky

III. transformace bakterií (hlavně gramnega-

Strana147

umělými vektory tivních) a kvasinek

Většina mutagenů působí tak, že vyvolá tzv. primární poškození (neboli léze)

DNA, která podléhají vnitrobuněčným enzymovým opravným procesům, pracujících

s různým stupněm přesnosti. Pro zvýšení účinnosti mutagenu je nutno volit takové

experimentální podmínky, které zvýhodňují nepřesně pracující opravné procesy. Např.

alkylační činidla aplikujeme za růstových podmínek, neboť jsou nejúčinnější

v replikační vidličce DNA. UV světlo aplikujeme jen při slabém červeném světle a také

kultivaci po jeho aplikaci provádíme za tmy, aby nedošlo k fotoreparaci vzniklých

pyrimidinových dimerů. Při tom se snažíme zajistit co nejdříve maximální rychlost

rozmnožování buněk, aby byla zvýhodněna nepřesně pracující poreplikační oprava

úseků DNA, obsahujících dimery, oproti poměrně přesně pracující excisní opravě,

fungující jen u nereplikují se DNA.

Pro šlechtění průmyslových kmenů mikroorganismů volíme většinou mutageny

vyvolávající bodové mutace ( UV světlo, alkylační činidla, kyselina dusitá), pro získání

rozsáhlých změn na mimochromozomální DNA (až k jejímu úplnému odstranění)

volíme interkalační činidla (akridinová barviva, ethidiumbromid) za růstových

podmínek. Ionizační záření (γ−paprsky, X–paprsky) způsobující převážně

chromozomové mutace a mitotické rekombinace, takže jsou vhodná pouze k poškození

sexuálního rozmnožování.

Celková dávka mutagenu, jež se rovná součinu intenzity (u záření) nebo

koncentrace (u chemického prostředku) a doby působení, se má volit tak, aby počet

mutací dvou různých genů v jedné buňce byl co nejmenší. Tím se vyhneme tomu, že by

vedle mutace v žádoucím genu došlo ještě k mutaci v dalším genu nebo genech, čímž by

se vlastnosti buňky změnily nežádoucím způsobem. Při použití UV záření jsou z tohoto

hlediska u haploidních mikroorganismů nejvhodnější takové dávky, jež vedou

k přežívání 10–40% buněk, u velmi účinných alkylačních činidel (např.

nitrosomethylmočovina nebo nitrosoguanidin) používáme koncentrace snižující rychlost

rozmnožování o 10–20%. Většina mutací znamená ve své podstatě poškození

stávajícího genu, i když z biotechnologického hlediska může mít pozitivní význam.

Protože valná většina poškození genů je recesivní, je vhodné podrobit mutagenezi

haploidní jednojaderné buňky (haploidní heterothalické kmeny kvasinek, haploidní

jednojaderné spory plísní a aktinomycet ap.).

Strana148

Protože mutageny působí náhodně na různých místech DNA, musíme ve

zmutagenizované suspenzi nebo kultuře najít ty jedince, jež mají zmutovaný žádaný gen

a mají proto požadovaný fenotyp. I po působení nejúčinnějších mutagenů se žádaný

zmutovaný genotyp vyskytuje maximálně 10-3, a proto je nutno mít vhodnou selekční a

detekční metodu pro jeho získání. Před aplikací selektivních podmínek, které spočívají

v inhibici nebo dokonce usmrcení buněk původního fenotypu, je nutno umožnit

buňkám, aby proběhly poreplikační opravné procesy DNA, aby se také vytvořil nový

fenotyp na základě změněného genotypu. K tomu je zapotřebí alespoň 2–5 dělení buněk

za neselektivních podmínek. Doba potřebná ke vzniku no-vého fenotypu se nazývá

fenotypový (nebo fenomový) lag a většinou se u mikroorganismů pohybuje v rozmezí

1–4 buněčných dělení.

Mutanty získané po mutagenezi je nutno testovat na stabilitu. Přitom testujeme

alespoň 50 kolonií získaných některou makroskopickou kontrolovanou izolační

metodou (viz kap.). Tento izolační postup a testování je nutno v průběhu pasážování

mutantu na šikmém agaru několikrát opakovat. Vedle trvalé malé stability mutantů bez

smyslu se objevuje často ještě vysoká nestabilita nově získaných mutantů, takže většina

z nich ztratí úplně svou nově získanou vlastnost již po prvém přeočkování.

Z cvičných důvodů uvedeme indukci revertantů k prototrofii u bakterií a

kvasinek.

8.1.3.1 Indukce mutantů pomocí ultrafialového záření (UV-světla) Pro získání některých mutantů se někdy ozařují suspenze buněk až po jejich

přenesení na selektivní agarovou živnou půdu v Petriho misce. Nevýhodou tohoto

postupu je, že nemůžeme za stejných podmínek sledovat letální účinek použité dávky

UV-záření, a že na buňky působí během kultivace také sloučeniny vzniklé působením

UV-světla na živnou půdu. Proto dáváme přednost ozařování nízké vrstvy suspenze

buněk ve sterilním pufru nebo ve sterilní vodě. Protože UV-záření má malou

pronikavost, musí být suspenze během ozařování míchaná magnetickým míchadlem

nebo mírným pohybem podélné třepačky. Maximální koncentrace buněk v této suspenzi

je u kvasinek a spor plísní 2×107/ml a u bakterií 108/ml, aby si buňky vzájemně příliš

nestínily. Dávky vedoucí k přežívání 50% buněk činí u standardních haploidních kmenů

S.cerevisiae 30 Jm-2. U rodů Rhodotorula a Rhodosporidium se pro indukci mutantů

používá 200–600 Jm-2. U bakterií bývá při vzdálenosti 20–30cm doporučována

expozice 20–80s. Mutanty, které mají poškozený některý z opravných procesů,

Strana149

odstraňujících účinek UV-světla, jsou však k tomuto záření mnohem citlivější. Účinnost

UV klesá se čtvercem vzdálenosti buněk od zdroje záření.

Cv.8.2 Indukce mutantů pomocí ultrafialového záření

Potřeby : 4 dny stará třepaná kultura haploidního kmene Saccharomyces

cerevisiae, nesoucí super-supresibilní alelu ade2-1, cca 250 ml sterilního roztoku

KH2PO4, 13 přesušených desek kompletního agaru (půda č. ), 12 předsušených desek

minimálního agaru (půda č. ), obsahujícího 1% kompletního media (tj. 0,1 ml tekuté

půdy č. na misku) pro zajištění 2–3 dělení auxotrofních buněk, počítací komůrka,

mikroskop, zahnutá skleněná tyčinka, kádinka s 96%ním ethanolem, pouzdro na Petriho

misky, stopky, 2 sterilní centrifugační kyvety obsahu 200 ml, sterilní Erlenmeyerova

baňka obsahu 250 ml, sterilní zkumavky s patentním uzávěrem, sterilní dělené pipety

(25 ml, 10 ml, 1 ml), 4 sterilní vysoké Petriho misky.

Provedení :

1. Mikroskopisky zkontroluj kulturu, zda neobsahuje bakteriální kontaminaci nebo

vysoké procento pučících buněk.

2. Centrifugací za aseptických podmínek získej buňky z kultury a dvakrát je promyj

sterilním M/15 KH2PO4. Promyté buňky suspenduj v M/15 KH2PO4, aby se

vytvořila mléčně zakalená suspenze.

3. Pomocí počítací komůrky zjisti hustotu této suspenze (viz kap. ) a připrav 30 ml

ředění o koncentraci 2 x 107 buněk/ml.

4. Ke zdroji UV v temné komoře si přichystej všechny potřebné věci (tj. zkumavky s 9

ml a 9,9 ml sterilního fyziologického roztoku, pipety, označené Petriho misky

s půdami, vysoké Petriho misky, pouzdro na Petriho misky, stopky, skleněnou

tyčinku s alkoholem k roztírání atd.)

5. Do 4 sterilních vysokých Petriho misek asepticky pipetuj po 5 ml suspenze buněk o

koncentraci 2×107 buněk/ml a za třepání postupně ozařuj tyto suspenze příslušnou

dávkou záření. Doba ozařování je 5, 10, 20 a 40s. Přesnou dobu ozařování zajisti

odkrytím skleněného víčka z misky, v níž je suspenze, a opětným přikrytím po

uvedené době. Ozařování i další zpracování vzorku prováděj v zatemněné místnosti

při slabém červeném světle a během ozařování používej ochranné brýle.

6. Každou dávku suspenze zpracuj ihned po jejím ozáření. Roztoky napipetované na

předsušené desky ihned rozetři po povrchu desky zahnutou skleněnou tyčinkou,

dobře ožehnutou a ochlazenou na vnitřním víčku a na nezaočkované půdě.

Strana150

7. Z každé dávky suspenze (včetně neozářené!) pipetuj á 0,1 ml.na 4 desky

minimálního agaru se stopami kompletního media. Na kompletní agar používej tato

zředění :

Při ozáření 5 vteřin :

0,2 ml = miska 5, 0,1 ml →9,9 ml → 0,05 ml = miska 5a, 1 ml→ 9,00 ml→ 0,1 ml = miska 5b, 1,0 ml → 9,0 ml → 0,1 ml = miska 5c,

při ozáření 10 vteřin vyočkuj jen zředění pro misky a a b (označ. 10):

při ozáření 20 vteřin :

1 ml → 9 ml → 0,05 ml = miska 20a,

1 ml → 9,0 ml → 0,1 ml = miska 20b,

1,0 ml → 9,0 ml → 0,1 ml = miska 20s,

při ozáření 40 vteřin :

0,05 ml neředěného = miska 40a,

0,1 ml neředěného = miska 40b,

1 → 9 → 0,1 ml = miska 40c.

Z neozářené suspenze připrav stovkoným způsobem zředění 10-4 a pipetuj 0,1 a 0,05 ml

na přesušené desky. Označ 0a, 0b.

5. Vyočkované misky inkubuj v převrácené poloze za tmy (tj. v přivřeném pouzdru na

misky) při 28o–30°C 24 h, pak další 2–3 dny bez pouzdra. Denně prohlížej nárůst.

6. Spočítej kolonie kvasinek vyrostlé na kompletních agarech a zanes do tabulky

průměr ze směrodatných misek (tj. obsahujících 30–300 kolonií) každé dávky záření

a % přežíva-jících buněk. Do grafu vynes log procenta přežívajících buněk proti

době ozařování a zjisti tvar křivky přežívání.

7. Spočítej na minimálních agarech kolonie o průměru větším než 1 mm a výsledky

zanes do tabulky. Zjisti pro každou dávku záření počet revertantů na 106

přežívajících buněk a hod-noty zanes do grafu proti dávce záření (oboje v lineární

stupnici!).

Poznámky :

Strana151

1. U bakterií je postup obdobný, ale použité půdy jsou masopeptonový agar (půda č.

) pro zjištění přežívání a minimální agar (půda č. ) a 1% masopeptonového bujon

pro zjištění revertantů, a jako kultivační teplota se volí teplota optimální pro

uvedený druh (např.37°C pro E.coli). Ozařování se zde provádí v pufru o pH 7,0.

2. Letální účinek UV stoupá exponenciálně s dávkou záření, takže bychom při

semilogaritmickém vynesení procenta přežívání mikrobiálních buněk měli dostat

přímku. Protože však vyšší dávky záření poškozují opravné procesy, dochází

k odklonu od linearity a teprve při dalších dávkách nastupuje opět lineární průběh,

ale mnohem strmější (úplná inaktivace opravných procesů).

8.1.3.2 Indukce mutantů pomocí dusité kyseliny

Kyselina dusitá patří mezi velmi účinné a snadno dostupné chemické mutageny.

Mutagenně působí v silně kyselém prostředí (pH 3,8–4,4), a to i za nerůstových

podmínek. To je její velkou výhodou, neboť při tomto kyselém pH se již většina

mikroorganismů nemůže rozmnožovat. Protože je v roztoku nestálá, připravuje se

roztok alkalických dusitanů v destilované vodě těsně před použitím a působí se jím na

promyté buňky suspendované v acetátovém nebo citrátovém pufru o pH 4,0–4,5.

Používané dávky jsou: u Saccharomyces cerevisiae konečné koncentrace HNO2

0,2–0,4% a působení 20–30 min., u Schizosaccharomyces pombe 0,1–0,2% po dobu 3–5

min a u bakterií např. 0,08–0,1% po dobu 10–20 min.

Cv.8.3 Indukce mutantů pomocí dusité kyseliny

Potřeby : promytá suspenze bakterií E. coli (trp-) v 0,2 M citrátfosfátovém pufru o pH

4,4 obsahující 108 buněk/ml, dusitan sodný, sterilní 0,2 M fosfátový pufr o pH 7,2,

předsušené desky masopeptonového agaru (půda č. ) a minimálního agaru (půda č. ) s

1%MPB pro umožnění 2–3 buněčných dělení, zahrnutá skleněná tyčinka, ethanol,

sterilní centrifugační zkumavky objemu 200 ml, centrifuga, sterilní Erlenmeyerovy

baňky objemu 100 ml, sterilní fyziologický roztok, sterilní dělené pipety 10 ml a 1 ml.

Provedení:

1. Na analytických vahách navaž do sterilní Erlenmeyerovy baňky dusitan sodný a

těsně před jeho použitím k němu předej takové množství sterilní vody, aby vznikl

3,45% ní roztok (=0,5 mol/litr).

Strana152

2. Do sterilní Erlenmeyerovy baňky pipetuj asepticky 13 ml citrátfosfátového pufru,

1,5 ml suspenze buněk a 0,5 ml dusitanového roztoku a baňku třepej ve vodní lázni

při 37°C.

3. Po 5, 10 a 20 min odeber 4 ml třepané suspenze do centrifagační zkumavky, přidej

150 ml vychlazeného fosfátového pufru o pH 7,2 (=ukončení působení HNO2),

promíchej a buňky odstřeď.

4. Po slití čirého roztoku přelij buňky v kyvetě dalším podílem vyhlazeného pufru,

promíchej a odstřeďuj. Po slití čité kapaliny zbylé buňky sespenduj do 4 ml

fosfátového pufru a vyočkuj po 0,1 ml na přesušený minimální agar. Současně

proveď desítkovým způsobem 103– a 104-násobná zředění promyté suspenze a

vyočkuj po 0,3 a 0,05 ml na přesušené desky MPA.

5. Kromě toho vyočkuj podobným způsobem i původní suspenzi, používanou

k pokusu, jen s tím rozdílem, že na masopeptonový agar budeš očkovat 0,1 a 0,3 ml

zředění 105-násobného.

6. Inkubuj všechny misky 1–2 dny při 37°C. Zjisti počet kolonií na miskách MPA a

minimálního agaru a přepočítej na 1 ml neředěné suspenze.

7. Zjisti frekvenci revertantů nevyžadujících tryptofan (vztaženo na 106 přežívajících

buněk) v původní suspenzi a v sus-penzích získaných v jednotlivých časových

intervalech a zanes do grafu proti době působení dusité kyseliny.

8. Současně zakresli závislost log procenta přežívání buněk na době působení

mutagenu. Zjisti, která doba působení poskytuje nejvyšší frekvenci mutantů a která

poskytuje největší počet mutantů na miskách (tj. největší výtěžnost mutantů).

8.1.3.3 Indukce mutantů pomocí alkylačních činidel za růstových podmínek

Nejúčinnějšími mutageny mezi alkylačními činidly jsou nitrososloučeniny, např.

nitrosoguanidin (tj. N-methyl-N´-nitro-N-nitrosoguanidin) nebo

nitrosomethylmočovina, které jsou však silně kancerogenní, takže se s nimi musí

pracovat velmi opatrně (za používání automatických pipet a v prostorách s dobře

fungujícími odtahy, neboť účinná složka je těkavá). Méně účinný je např.

ethylmethansulfonát, který však není kancerogenní. Ale i zde je účinná složka těkavá,

takže se s ním musí pracovat opatrně. Protože alkylační prostředky jsou v roztoku

nestálé, připravují se jejich roztoky těsně před použitím, a to do sterilních pufrů o pH

v rozmezí 6,5-7,5, kdy jsou tyto sloučeniny nejstálejší a mají nejvyšší mutagenní

účinky. Nejčastěji se působí těmito činidly na buňky během jejich logaritmické fáze

Strana153

růstu v kom-pletním tekutém mediu, neboť jsou nejúčinnější v místě replikační vidličky

DNA.

Cv.8.4 Indukce mutantů pomocí alkylačních činidel za růstových podmínek

Potřeby : Třepaná kultura haploidního kmene kvasinek S. cerevisiae v log-fázi

růstu v kompletním mediu, N-nitroso-N-methylmočovina(NMU), 20 ml

koncentrovaného kompletního media (půda č. , avšak bez agaru a ve čtyřnásobné

koncentraci všech složek), sterilní fosfátový pufr (0,2 mol/litr) o pH 6,6, sterilní H2O, 6

sterilních Erlenmeyerových baněk, sterilní zkumavky, sterilní pipety (10 ml, 1 ml),

sterilní centrifugační kyvety objemu 200 ml, předsušené desky kompletního agaru (půda

č. ) a agaru selektivního pro žádané mutanty.

Provedení :

1. Do pěti Erlenmeyerových baněk pipetuj asepticky à 4 ml kompletního media a 5 ml

pufru, 0–0,5 ml čerstvě připraveného roztoku NMU (připravuje se asepticky do

sterilní Erlenmeyerovy baňky!) tak, aby jeho konečná koncentrace v pokuse byla

0μmol/ml, 0,1 μmol/ml, 0,2 μmol/ml, 0,5 μmol/ml a 1,0 μmol/ml, dále 0-0,5 ml

sterilní H2O (k doplnění celkového objemu na 10 ml) a 0,5 ml buněčné kultury.

2. Inkubuj za třepání 14–16 h (tj. přes noc) při 28°C. Pak z kultury obsahující NMU

pipetuj à 5 ml do sterilních centrifugačních kyvet, dolij sterilní vodou na objem cca

200 ml a po vy-vážení kyvet, odstřeď, supernatanty slij a buňky třikrát promyj cca

200 ml sterilní vody za použití opakovaného odstřeďování.

3. Promyté buňky resuspenduj v 5 ml sterilní vody a zjisti pomocí počítací komůrky

(viz kap, ) počet buněk/ml a pomocí vitálního barvení (viz kap. ) podíl mrtvých

buněk.

4. Současně zjisti stejným způsobem počet buněk/ml nepromyté kultury bez NMU. Na

základě těchto výsledků připrav taková postupná zředění (viz kap. ), abys na

neselektivní gar (např. kompletní agar) vyočkoval 100–300 živých buněk a na

selektivní agary 103–106 živých buněk (v tom případě se očkují ze tří po sobě

jsoucích desítkových zředění).

5. 0,1 a 0,3 ml vhodných zředění vyočkuj na přesušené desky kompletního agaru a

agaru pro zjištění žádoucích mutantů a inkubuj při 28°C.

Strana154

6. Po nárůstu kolonií zjisti jejich počet a přepočítej na ml promyté suspenze nebo

kultury. Vypočítej frekvenci hledaných mutantů na počet živých buněk pro každou

koncentraci NMU a zanes do grafu (proti koncentraci tohoto mutagenu v pokusu).

Zjisti také, při které koncentraci NMU byl největší výtěžek žádaných mutantů.

8.1.3.4 Indukce mitochondriálních mutací s S. cerevisiae U S.cerevisiae se vyskytují dva základní typy mutací mitochondriání DNA (mt

DNA) :

1) Deleční mutace, při nichž dochází ke ztrátě různě velkých úseků mt DNA až celé

mt DNA a které jsou označované (rho-) nebo (rho°). Vzniklé mutanty nejsou

schopny respirace (viz kap. ).

2) Bodové mutace, jež vznikají záměnou jediného páru bází mt DNA a fenotypově se

projevují např. rezistencí k inhibitorům syntézy mitochondriálních bílkovin (např.

rezistencí k erythromycinu, chloramfenikolu ap.) Deleční mutace mt DNA se

indukují se 100% účinností za růstu v přítomnosti interkalačních činidel (např.

ethidiumbromidu). Bodové mutace vznikají vzácněji. Nejlepší výsledky poskytuje

růst v přítomnosti Mn2+. Podrobný postup indukce obou těchto typů mutací viz

Šilhánková L. v knize „Kvasinky ve výzkumu a praxi“(ed. D.Vraná, Academia,

Praha,1985).

8.1.4 Testování mutagenity chemických látek mikroorganismy

Chemizace zemědělství a rozvoj farmaceutického průmyslu vedly k tomu, že

člověk přichází každodenně do styku s řadou chemických látek, z nichž některé mohou

mít mutagenní účinky a tím ohrožovat lidskou populaci.

8.1.4.1 Amesův test Nejčastějším testovacím systémem mutagenity chemických látek jsou určité

auxotrofní mutanty bakterie Salmonella typhimurium, které mají ještě rozsáhlou deleci

v oblasti DNA, zodpovědné za jejich patogenitu. Z těchto důvodů nejsou patogenní a

nehrozí ani nebezpeční, že by revertovaly v patogenní typ. Dále mají deleci v genu

zodpovědném za excizní opravu DNA (gen uvrB), takže jsou citlivější také

k mutagenním účinkům řady chemických látek. Tyto kmeny zavedl do testování Ames

(1971), který také vypracoval a dále zdokonalil celý postup testování, takže tento postup

Strana155

je označován jako Amesův test. V poslední době byl do původních Amesových kmenů

zaveden plasmid, který zvyšuje efektivnost opravného systému tvořícího chyby, a tím

zvyšuje citlivost těchto kmenů k mutagenním účinkům většiny chemických sloučenin.

Současně však zvyšuje tento plasmid i spontánní mutabilitu těchto kmenů. Jako

testovací systém se u těchto bakteriálních kmenů používají reverze k prototrofii u

mutantů auxotrofních pro histidin, a to jednak reverze vzniklé záměnou bází, tedy

tranzicí nebo travsverzí (kmen TA 100 obsahující plasmid a odvozený od původního

kmene TA 1535), jednak reverze vzniklé delecí basí tedy posunutím čtení (plasmidový

Ta 98 odvozený od kmene Ta 1538). Paletu testovacích kmenů doplňují ještě další dva

kmeny s plasmidy, z nichž jeden (TA 102) nemá poškozenou excizní opravu a může

proto detegovat mutageny, jež pro svůj mutagenní účinek naopak vyžadují tento

opravný proces. Tento soubor kmenů umožňuje zjistit mutagenitu látek s velmi

rozmanitým mechanismem mutagenního účinku. Protože všechny tyto kmeny mají

poměrně vysokou rychlost spontánních mutací a také snadno ztrácejí plasmid

zodpovědný za jejich snadnou mutabilitu, musí se uchovávat lyofilizací, aby nebylo

nutné jejich časté přeočkovávání. K testování zvolená kultura musí mít poměrně nízkou

hladinu mutací a současně musí být testována několika známými mutageny, zda svou

snadnou mutabilitu neztratila. Postup testování mutagenity spočívá v tom, že k 0,1 ml

rozehřátého a vytemperovaného tzv. měkkého agaru se přidávají stopy histidinu (pro

zajištění 2–3 dělení buněk), 0,1 ml 18 h bujonové kultury testovacího kmene, 0,1 ml

roztoku testované chemikálie (volí se vždy několik koncentrací) a po rozmíchání se tato

směs ihned vlévá na povrch se speciálním minimálním agarem. Pro zjištění, zda u

živočichů nedochází ke změně testované chemikálie v ještě účinnější mutagen (čili

k tzv. metabolické aktivaci chemikálie), se k některým podílům měkkého agaru přidává

ještě tzv. S9 mix (tj. směs kofaktorů s jaterním homogenátem, získaným z krys, jež před

smrtí byly vystaveny účinku vhodného mutagenu [v potravě nebo injekcí], čímž došlo

k indukci detoxikačního metabolismu v jejích játrech). Po 48 h inkubaci všech misek při

37°C se odečítá počet kolonií revetantů v kontrolách i při různých koncentracích

testované sloučeniny, a to v přítomnosti S9 mix (tj. s “metabolickou aktivací“) i bez ní a

současně se zjišťuje povaha růstu „pozadí“, tj. auxotrofních buněk, vytvářejících

mlhovitý povlak v důsledku využití přítomných stop histidinu. Nižší intenzita nebo

nepřítomnost tohoto pozadí prozrazuje inhibiční případně toxický účinek testované

látky na testovací mikroorganismus, což by mohlo vést k falešným negativním

výsledkům. Bližší nformace o pěstování a testování použitých kmenů i o provedení

Strana156

testů viz např. B.N.Ames a spol v knize Handbook of Mutagenicity Test Procedures.

Stanovení mutagenity pomocí bakterií, které se nyní vyžaduje u všech nových léků a

některých dalších chemických produktů, bylo v poslední době automatizováno firmou

Labsystems, Helsinky, jež nabízí přístroj Mutascreen, umožňující 200 analýz během 24

h.

8.1.4.2 Použití kvasinek pro testování mutagenity chemických látek Kvasinky mají při testování účinnosti chemických látek na DNA před bakteriemi

přednost v tom, že kromě indukce bodových mutací chromozomální DNA, jež může být

sledována u bakterií, umožňují sledovat také indukci mitotických rekombinací,

mitotických genových konverzí a v neposlední řadě také účinek na mitochondriální

DNA. Přesto se používání kvasinek k tomuto účelu dostává širšího upotřebení teprve

v posledních letech. Nejčastěji se k tomuto testování používá diploidní kmen

Saccharomyces cerevisiae D7, který umožňuje zjištění mitotických rekombinací (tj.

reciprokých výměn úseků nesesterských chromatid homologických chromosomů při

mitotickém dělení jádra) v alelách ade 2-40/ade 2-119 tím,že vznikají kolonie

s růžovým a červeným sektorem mezi bílými koloniemi původních buněk, a současně

umožňuje sledovat vznik mitotických genových konverzí (tj. nereciprokých výměn

úseků nesesterských chromatid homologických chromosomů při mitotickém dělení

jádra) v alelách trp 5-12/trp 5-27, projevujících se prototrofií pro tryptofan. Navíc kmen

D 7 umožňuje zjistit reverze auxotrofie pro isoleucin, neboť obsahuje v homozygotním

stavu alelu ilv 1-90. Protože fenotypový projev této alely může být potlačen činností

několika metabolických supresorů, jde při reverzi k prototrofii pro isoleucin nejen o

pravé zpětné mutace, ale i o supresorové mutace (tedy o mutace „dopředu“), a tudíž

citlivý testovací systém, který může detegovat širokou paletu mutagenních sloučenin

s nejrůznějším účinkem na DNA. Bližší o postupu při použití kvasinek pro testování

mutagenity viz např. Zimmermann F.K. a sp. Mutation Research, 28, 381-388 (1975).

Poznámka:

Pro orientační testování mutagenity chemických látek může být použit také tzv.

kapičkový test (angl. spot test), při němž se testovací mikroorganismus vyočkuje

roztěrovou metodou (kap. ) v množství 5×103 buněk na dvě předsušené desky

kompletního agaru (půda č. ) pro kvasinky a č. pro bakterie)a v množství 5×107 buněk

na dvě předsušené desky minimálního agaru (půda č. nebo s 1% kompletního media

pro zajištění růstu pozadí) a do středu jedné z misek obou půd se umístí krystalek

Strana157

testovací látky nebo kapka jejího roztoku. Po inkubaci (při optimální teplotě) se zjišťuje

inhibice růstu (srovnání kompletních agarů s testo-vanou látkou a bez ní) a srovnání

pozadí (na minimálním agaru s testovanou látkou a bez ní) a mutagenní účinek

testované látky (srovnání počtu prototrofních kolonií na minimálním agaru s testovanou

látkou a bez ní). Spot test je však málo přesný a negativní výsledek neznamená ještě, že

testovaná látka není mutagenní.

8.2 Křížení a rekombinace

Křížení a z něho pocházející rekombinace vloh umožňuje kumulovat při

šlechtění mikroorganismů vlastností rodičů od jediného jedince. Tento postup je

výhodný proto, že druhý stupeň mutageneze, který by vedl ke kvantitativní změně již

získaného fenotypu, lze realizovat jen velmi pracně, neboť většinou nemáme k dispozici

vhodný selekční postup ani rychlou detekční metodu pro registraci buněk s kvantitativní

změnou studované vlastnosti.

Křížení je také nezbytnou pomůckou pro řadu teoretických genetických prací,

jako je charakterizace mutovaného genu a zjištění jeho polohy na chromosomové mapě

daného mikroorganismu, zjištěného příslušnosti dvou jedinců k jednomu druhu apod.

Křížení můžeme dosáhnout (viz tab. č. 4) spájením vhodných haploidních

eukaryotních buněk druhů se sexuálním cyklem (tj. askomycetních a bazidiomycetních

kvasinek a plísní), konjugací u některých gramnegativních bakterií a u některých

streptomycet a anastomosou u vhodných kmenů plísní. Široké uplatnění má fúze

protoplastů, jež je možná u všech mikroorganismů kromě gramnegativních bakterií.

Podrobněji probereme křížení některých kvasinek a analýzy produktů těchto křížení a

fúzi protoplastů, neboť tyto dva postupy mají největší význam při šlechtění

mikroorganismů používaných v biotechnologiích.

8.2.1 Křížení kvasinek a analýza produktů křížení

Nejsnáze je proveditelné křížení u heterothalických kmenů, neboť u nich

můžeme udržet buňky v haploidním stavu při přeočkovávání po velmi dlouhou dobu.

Zde tedy provádíme křížení smícháním buněk opačných párovacích typů (tj. a×α u rodu

Saccharomyces nebo Rhodosporidium a h+×h- u rodu Schizosaccharomyces) a izolací

Strana158

získaných zygot (v případě rodů Saccharomyces a Schizosaccharomyces) nebo teliospor

(v případě rodu Rhodosporidium).

Naše pekařské kvasinky jsou však většinou homothalické a po jejich sporulaci

dochází velmi brzy ke spájení buněk, takže v populaci prakticky nemáme haploidní

buňky. Z těchto důvodů se zde musí křížit přímo vzniklé spory po natrávení asků

šnečími enzymy (viz

kap. ). Spory se izolují i kříží (tj. vzájemně přiblíží) na mikromanipulačním agaru

pomocí mikromanipulátoru (viz kap. ) a inkubují 24 h při 28oC, aby zygoty vytvořily

kolonie diploidních buněk. Pivovarské kmeny kvasinek jsou polyploidní nebo

aneuploidní a velmi špatně sporulují, takže křížení je zde obzvláště obtížné. Zde se

nejlépe osvědčilo křížení pomocí fúze protoplastů (viz kap. ).

Při křížení kvasinek se proto nejdříve snažíme zjistit, zda oba kmeny jsou

haploidní. Nejjednodušší postup je testování jejich schopnosti sporulace (viz kap. ), i

když negativní výsledek zde ještě není důkazem haploidity, neboť sporulace může být

poškozena v důsledku aneuploidie nebo mutace některého z kmenů, jejichž funkce je

nutná pro sporulaci. Jestliže kultura sporuluje, izolujeme pomocí mikromanipulátoru

(viz kap. ) spory několika asků a jejich vegetativní potomstvo opět testujeme na

sporulaci. V případě, že opět dochází ke sporulaci, šlo buď o polyploidní kulturu

(nejčastěji tetraploidní), jež poskytla diploidní spory nebo o homothalický kmen.

V každém případě vegetativní potomstvo (tj. klony) jednotlivých spor opět testujeme na

sporulaci. Jestliže u některých klonů nedošlo ke sporualci, zjistíme jejich schopnost

křížení s buňkami párovacího typu a i s buňkami párovacího α, čímž zjistíme, zda jsou

heterothalické a jaký mají v tomto případě párovací typ (viz kap. ). Jestliže všechny

monosporové klony však opět sporulují, jde o homothalický kmen a musíme ke křížení

použít přímo jednotlivé spory bezprostředně po jejich mikromanipulaci a celý proces

křížení kontrolovat mikroskopicky (viz výše), abychom měli jistotu, že nedošlo ke

vzájemnému spájení potomků téže spory.

Při křížení dvou haploidních jedinců, lišících se přítomností nebo nepřítomností

mutace určitého genu, se fenotypově projeví ta alela genu, jež je dominantní. Většinou

je to nezmutovaná alela, neboť zmutované alely představují poškození určitého genu,

jež je většinou recesivní. Jestliže se oba rodiče liší mutacemi různých genů, (např.

křížíme kmen lys- s kmenem ade-), pak získaný hybrid je v důsledku recesivity obou

mutací schopen růstu na minimálním agaru. Hovoříme o komplementaci (tj.

vzájemném doplňování) obou mutací. Této komplementace se používá při stanovení

Strana159

kopulačního typu kvasinek (kap. ), dále pro izolaci žádaných hybridů (kap. ), a pro

charakterizaci recesivních mutantů vyžadujících histidin dostáváme diploidy neschopné

růst na půdě bez histidinu, šlo o mutaci téhož genu. Jestliže získané diploidy rostou na

půdě bez histidinu, měl každý rodič zmutovaný jiný histidinový gen (neboli lokus) a

říkáme, že komplementační test byl pozitivní. U genů, jež kódují dvě bílkovinné

podjednotky (tedy dva různé polypeptidy) jednoho enzymu, může však dát

komplementační test pozitivní výsledek také tehdy, jestliže mutace u rodičů byla na

opačných koncích genu, tedy zasahovala různé podjednotky enzymu (tzv. intragenová

komplementace polárních mutací).

Pro zjišťování párovacího typu u auxotrofních mutantů můžeme použít

auxotrofní testovací kmeny vyžadující jiné růstové látky než testované kmeny. Pak

diploidy vzniklé křížením testovaného kmene (např. lys- ade-) s testovacím kmenem

(např. trp- his-) budou v důsledku komplementace přítomných recesivních mutací

prototrofní a porostu na minimálním agaru (půda č. ), kdežto testované ani testovací

kmeny na minimálním agaru nerostou. Tento postup může být použit pouze u mutantů

s velmi nízkou mutační rychlostí reverzí a pro jistotu je třeba použít kmeny, které mají

alespoň dvě mutace pro auxotrofii.

8.2.1.1 Stanovení kopulačního typu a izolace zygot u S. cerevisiae

Cv.8.5 Jednoduchý postup pro jeden testovaný kmen

Potřeby : 24–36 h stará kultura testovaného kmene z kompletního agaru (půda č.

), stejné kultury testovacího kmene párovacího typu a a párovacího typu α, předsušená

deska kopulačního agaru (půda č. ), podložní a krycí skla.

Provedení :

1. Na předsušenou desku kopulačního agaru přenes asepticky očko testované kultury a

rozetři na dvě kruhové plochy o průměru cca 1 cm.

2. Do další plochy stejné velikosti přenes asepticky očko testovací kultury párovacího

typu a a současně rozmíchej buňky této kultury s buňkami v jednom kruhu

testované kultury a dobře označ.

3. Do druhého kruhu buněk testované kultury přenes a dobře rozmíchej buňky

párovacího typu α a dobře rozmíchej. Pak očko ožehni a po novém nabrání buněk

Strana160

párovacího typu α je smíchej v kruhu obsahujícím buňky testovacího kmene a (=

kontrola testovacích kmenů).

4. Inkubuj desku 16–18 h při 28°C a pak připrav ze všech tří kruhů nativní preparáty.

Zygoty, tj. piškotovité útvary s jedním pupenem, by se měly objevit v kontrole (tj.

v křížení testovací kmen a × testovací kmen α) a v jednom z dalších kruhů.

Testovaný kmen má pak opačný párovací typ než testovací kmen, s nímž tvoří

zygoty.

Cv.8.6 Obtiskový (replikační) postup pro prototrofní kmeny

Potřeby : Testované a testovací kmeny S. cerevisiae na šikmých kompletních

agarech, 2 desky předsušeného kompletního agaru (půda č. ), 2 sterilní samety

15×15cm sterilované v autoklávu, replikační blok, podložní a krycí skla, 96%ní ethanol,

vata, mikroskop, sterilní zubní párátka.

Provedení :

1. Na misky předsušeného kompletního agaru vyočkuj paralelně pruhy testovaných

kmenů (maximálně 12 kmenů – viz obr. a) a dobře je označ na dně misky. Na

druhou předsušenou desku kompletního agaru vyočkuj v pruzích střídavě testovaní

kmen párovacího typu a a párovacího typu α (obr. b).

2. Inkubuj obě desky 36 h při 30°C.

3. Na dně obou misek si označ startovací bod (každý jinou značkou!) a pomocí

sterilního sametu obtiskni desku s testovanými kmeny na předsušenou desku

kopulačního agaru, na níž je již označen příslušný startovací dob. Postup obtisku viz

kap . Pak na tutéž desku obtiskni pomocí dalšího sametu desku s testovacími

kmeny, avšak kolmo na pruhy testovaných kmenů (obr. c). Nezapomeň opět

označit startovací bod!

4. Inkubuj misku s křížením 4 h při 28oC a pak další 2–4 h při 6°C.

5. Pomocí sterilních párátek připrav nativní preparáty z míst křížení dvou nátěrů a

mikroskopicky (při zvětšení 10×45) zjisti přítomnost zygot. Na základě přítomnosti

zygot urči kopulační typ testovaných kmenů.

Poznámka :

1. Vhodné je dva z testovaných kmenů nahradit testovacími kmeny, aby byla kontrola,

že spolu skutečně kopulují a jsou proto vhodné pro testování.

Strana161

2. Při křížení heterothalických kmenů S. Pombe se postupuje stejně jako v kap.

jenom s tím rozdílem, že se k replikaci používají 48 h staré nátěry na kompletním

agaru (půda č. ), replikjí se na 3–4,5% sladinový agar a inkubují 2–5 dnů při 30°C.

Po inkubaci se zjistí sporulace překlopením otevřené Petriho misky nad nádobku,

v níž se zahříváním vyvíjejí z krystalků jodu jodové páry. Osporované úseky nátěru

se jodovými parami zbarví světle fialově, kdežto neosporované zežloutnou. Parami

jodu se stejným způsobem testuje i haploidita kmenů určených ke křížení; kultivace

na sladinovém agaru se však prodlužuje až na 7 dnů, případně se ještě tento agar

uchovává dalších 7 dnů při 4°C.

Cv.8.7 Replikační postup využívající komplementaci

Potřeby : podobně jako ve cv.8.6 a navíc ještě jeden sterilní samet a předsušená

deska minimálního agaru.

Provedení:

1. Postupuj stejně jako je uvedeno v bodech 1) až 3) ve cv.8.6, ale inkubaci prováděj

24–36 h při 28°C. Pak misku s vyrostlým křížením (obr. c) otiskni pomocí

sterilního sametu na předsušenou desku minimálního agaru (nezapomeň označit

startovací body) a inkubuj 1–2 dny při 28–30°C.

2. Zjisti, v kterých místech křížení došlo na minimálním agaru v důsledku

komplementace k růstu (obr. d) a na základě toho urči kopulační typ

testovaných kmenů.

8.2.1.2 Postup při získávání hybridů kvasinek

Pro získání hybridů heterothalických kmenu S. cerevisiae vycházíme

z haploidních kmenů a postupujeme některou z metod popsaných pro stanovení

kopulačního typu (viz ). Jestliže alespoň jeden z rodičů je prototrof, nemůžeme při

křížení využít komplementace a zygoty musíme izolovat pomocí mikromanipulátoru

(viz kap. ). Na mikromanipulační agar nanášíme v úzké čáře pomocí kličky řídkou

suspenzi buněk z křížení a po vsáknutí vyizolujeme alespoň 4 zygoty tvaru trojlístku

(obr. a). U zygot pučících z některé rodičovské buňky (obr. b) je nebezpečí, že

pupen vznikl ještě před karyogamií, takže dostaneme směs haploidních a diploidních

buněk. Mikromanipulace zygot je nutná i při pracích, jejichž úkolem je analýza spor,

Strana162

neboť původní rodiče mohou obsahovat také diploidní buňky vzniklé kopulací se

sousední nezmutovanou buňkou. Použije-li se při křížení komplementace (kap. ) je

nutno buňky vyrostlé na minimálním agaru suspendovat ve sterilní vodě, přečistit

čárkovací metodou (viz kap. ) a na kompletním agaru se přesvědčit, že v nátěru nejsou

přítomny jednotlivé auxotrofní buňky, které by mohly zkreslit genetické analýzy.

Křížení různých auxotrofů S. cerevisiae se může časově urychlit při použití

tekutých půd. Smíchá se 107 buněk 24 h starých kultur opačných párovacích typů a

komplementačních markerů (tj. různých růstových požadavků) v 10 ml kompletního

tekutého media (půda č. ) a inkubuje za velmi mírného třepání 90 min při 30°C. Pak

se buňky sedimentují odstředěním a ponechají v klidu 30 min při 30°C. Supernatant se

slije a buňky a zygoty se odstředí, dvakrát promyjí sterilní vodou a po resuspendování v

10 ml vody ve se 0,1 ml přenese do 10 ml minimálního media (půda č. , ale bez

agaru) a inkubuje v klidu asi 1 h při 30°C. Z této kultury se pipetuje 50–300 diploidních

buněk na předsušený minimální agar (půda č. ) a inkubuje 2–3 dny při 30°C. Další

postupy křížení v tekuté půdě uvádí např. Weber H. (Zellbiologie und Genetik der

Hefen) nebo Kováčová V. (Genetická analýza mikroorganizmov. I. skriptum).

Auxotrofie jednoho z partnerů se při komplementačním testu může nahradit

mitochondriální mutací rho°, (jež se získá růstem v přítomnosti interkalačního činidla

viz kap. ). Selekce diploidů se pak provádí na minimální glycerolové půdě (půda č. ,

v níž je glukosa nahražena 20 g glycerolu).

8.2.1.3 Hybridizační postup získávání polyploidních kmenů S. cerevisiae

Pro získání polyploidních kmenů kvasinek se využívá spontánních mutací

párovacího typu v diploidních buňkách, takže původní buňka aα v aa se může křížit

s buňkou α případně s αα. Protože mutace párovacího typu jsou poměrně vzácné,

provádí se hybridizace většinou v tekuté půdě (viz kap. ) a pro získání polyploidů se

používá selekce, založené na komplementaci mutací.

8.2.1.4 Sporulace diploidních kmenů a analýza spor

Hybridní kmeny necháváme osporovat z těchto důvodů:

Strana163

1) pro získání rekombinačních spor (nutné pro kumulaci recesivních mutací do

jediného jedince).

2) pro provádění tetrádové analýzy, jež se používá pro charakterizaci nových

mutací(viz kap. ).

Sporulovat mohou pouze dobře živené diploidní buňky v dobrém fyziologickém

stavu a přenesené na vhodné sporulační prostředí.

Sporulací S. cerevisiae pro genetické účely provádíme vždy po pomnožení jediné

diploidní buňky (viz výše) při optimální teplotě na presporulačním agaru (půda č. )

bohatém na dusíkaté živiny a obsahujícím poměrně hodně zkvasitelného cukru (4–6%).

Z tohoto agaru přenášíme dobře narostlé kolonie (tj. po 48 h růstu) na sporulační agar

(půda č. ), který obsahuje octan draselný, malé množství dusíkatých látek a velmi

malé množství glukosy. PH tohoto agaru, které je v důsledku přítomného octanu velmi

vysoké, stimuluje tvorbu spor. Jednotlivé kolonie z presporulačního agaru nutno přenést

na sporulační agar ve formě hustého nátěru, neboť buňky se zde již prakticky

nerozmnožují. Inkubační teplota během tvorby spor smí být maximálně 25°C a doba

inkubace 2–3 dny. Stupeň osporování se zjistí ve vodném preparátu při zvětšení (45–

60)×10. U dobře sporulujících kmenů dojde ke sporulaci 50–75% buněk. Dlouhodobé

uchovávání spor na sporulačním agaru vede ke snížení životnosti spor.

Sporulace heterothalických kmenů Schizosaccharomyces pombe, jež se velmi

často používají ke genetickým studiím, probíhá po jejich křížení na sladinovém agaru

(viz kap. č. ).

8.2.1.5 Tetrádová analýza

Tetrádová analýza spočívá v rozštěpení buněčné stěny asků pmocí

mikrobiálních enzymů nebo enzymů trávícího traktu hlemýždě Helix pomatia a

v oddělení jednotlivých spor každého asku (tedy tetrády) a zjištění fenotypu jejich klonů

(tj. jejich vegetativního potomstva), z něhož se pak usuzuje na genotyp původních spor.

Zjišťuje se tedy poměr počtu spor určitého fenotypu k počtu spor dalších fenotypů

v jednotlivých tetrádách, a hovoříme o štěpných (čili segregačních) poměrech určitých

vlastností. Štěpné poměry mohou být 2:2, 1:3, 3:1, 4:0, 0:4 nebo 1:1:1:1

Význam tetrádové analýzy objasníme na těchto případech :

Strana164

1) křížením získaného auxotrofu s prototrofem můžeme zjistit, zda sledovaný

auxotrof má mutaci jen v jednom genu (štěpný poměr prototrofy : auxotrofy je

2:2) nebo ve více genech (převládají auxotrofní spory):

2) křížením dvou monogenních mutantů stejného fenotypu můžeme zjistit, zda jde o

mutace v tomtéž lokusu (všechny spory budou mít stejný fenotyp shodný

s použitými mutanty) nebo ve dvou různých lokusech (vyštěpují se také spory

standardního fenotypu), v tomto druhém případě pak z podílu standardních spor

určíme, zda tyto lokusy jsou umístěny na různých chromosomech (standardní

spory představují 1/4 všech spor).

3) křížením monogenních mutantů vyžadujících různé růstové látky můžeme z %

rekombinovaných spor zjistit vzájemnou vazbu příslušných lokusů.

4) křížením studovaného mutantu s mutanty o známé poloze zmutovaných genů na

chromosomové mapě můžeme lokalizovat mutovaný gen studovaného mutantu na

této mapě (viz kap. ).

5) křížením revertovaného auxotrofního kmene s prototrofem můžeme prokázat

přítomnost supresoru (vyštěpují se auxotrofní spory, ačkoliv oba rodiče byly

prototrofní).

To je jen několik příkladů nejjednodušších genetických analýz. Při těchto

pracích používáme jednak tetrádovou analýzu, jednak hromadnou izolaci spor a jejich

testování.

Cv.8.8 Tetrádová analýza

Potřeby : osporovaná kultura hybridního kmenu S. cerevisiae na acetátovém

sporulačním agaru, mikromanipulační agar (půda č. ), mikromanipulační komůrka,

mikromanipulátor napojený na mikroskop, mikromanipulační jehly, dvě přesušené

desky kompletního agaru (půda č. 30), předsušené desky minimálního agaru (půda č.

29) s doplňkovými živinami, replikační blok, sterilní samet, sterilní šťáva ze zažívacího

traktu Helix pomatia (např. komerční preparát firmy Koch-Light, Laboratories, Ltd.,

Anglie), sterilní voda, krycí sklíčka, sterilní Petriho misky, sterilní pipety, pinzeta, nůž.

Provedení :

1. Připrav nativní preparát osporované kultury a při zvětšení 10×45 nebo 10×60 zjisti

četnost asku se čtyřmi sporami. Představují-li alespoň 25% všech buněk, přenes

Strana165

očko této kultury do 0,1 ml trávicí šťávy (např. komerční preparát ředěný 10×) ve

sterilní zkumavce a inkubuj při 28°C.

2. Sleduj v nativních preparátech stupeň natrávení stěn asků (u komerčního preparátu

po 1 h a pak v 1/4 až 1/2 h intervalech). Správné natrávení je takové, kdy jsou

přítomny ještě malé zbytky stěny asků, takže se nemohou tvořit falešné tetrády

uvolněných spor.

3. Natrávenou suspenzi osporované kultury zřeď cca 1 ml sterilní vody, lehce

rozmíchej a nanes v úzkém pruhu na mikromanipulační agar na krycím sklíčku

podle pokynů (v kap. 6.2.2.2) a pomocí mikromanipulátoru odděl od sebe spory

jednotlivých tetrád tak, že spory každé tetrády jsou vždy v řadě nad sebou, vzdáleny

od sebe 1,5–2 mm a vzdálenost jednotlivých tetrád je minimálně 3 mm, takže po

jejich inkubaci dostaneš monosporové kolonie jako v obr. 54. Postup

mikromanipulování je uveden v kap. 6.2.2.2.

4. Inkubuj mikromanipulační agar s tetrádami na desce předsušeného kompletního

agaru při 28°C do vzniku zřetelných kolonií průměru cca 1 mm, jež se však nesmí

spolu dotýkat (viz obr. 54). Většinou je nutno inkubovat 2–3 dny.

5. Sterilními párátky přenes jednotlivé monosporové kolonie tetrád na desku

kompletního agaru podle šablony pro 52 kolonií (viz. obr. 51a) a inkubuj 1–2 dny

při 28°C.

6. Po nárůstu kolonií na desce jisti jednotlivých kolonií fenotypové projevy mutací

obsažených v původním hybridu. V případě auxotrofních mutací obtiskni desku

tohoto kompletního agaru na desky minimálního agaru s požadovanými růstovými

látkami kromě jedné. Např. obsahoval-li hybrid mutace trp-his-ade-leu-(všechny

v heterogenním stavu!), trp + ade +leu (tj. bez his), trp + his +leu (tj. bez ade), trp +

his +ade (tj. bez leu). Z jednoho sametu je možno natisknout až 6 replik, při čemž

jako poslední dáváme zase kompletní agar, jako kontrolu. Replikační postup (tj.

manipulace s replikačním blokem) je podrobně popsán v kap. 10.1.1.1.

7. Inkubuj repliky 24–48 h. při 28°C. Pak vyhodnoť růst jednotlivých spor na různých

agarech a výsledek zanes do tabulky podle vzoru v tab. č.xxx5. Zjisti z této tabulky,

zda se všechny mutace vyštěpují monofaktoriálním štěpným poměrem (tj. 2+ : 2-).

Jestliže se odchylka vyskytuje jen v jednom markeru, může jít také o meiotickou

genovou konverzi, jež však je poměrně vzácná (< 5% tetrád), je-li odchylka

v několika markerech (tj. lokusech) jediné tetrády (viz tetráda č. 3 v tab. 5) jde o

Strana166

falešnou tetrádu, vzniklou spojením dvou cizích dvojic sporu příliš natrávených

asků. Dále zjisti výskyt tetrád typu PD, NPD a TT pro jednotlivé kombinace

markerů a vyhodnoť.

Tabulka č xxx5

Fenotyp spor po tetrádové analyse hybridu trp− his− × ade− leu−

Kolonie Růst na půdě bez fenotyp typ tetrád u lokusů č. trp his ade leu spor trp-his ade-leu trp-ade trp-leu ade-his

1 − − + + trp− his−

2 + − − − his−ade−leu− TT PD PD PD TT

3 + + − − ade− leu−

4 − + + + trp−

5 − − + − trp−his−leu−

6 − − − − trp−his−ade−leu− PD TT TT NPD TT

7 + + + + +

8 + + − + ade−

9 − − + + trp− his−

10 − + + + trp− f a l e š n á t e t r á d a

11 − − − + trp−his−ade−

12 + − − − his−ade−leu−

2) Mapování genů u S. cerevisiae

Jestliže máme zjistit polohu určitého zmutovaného genu na chromozomové

mapě S. cerevisiae, musíme heterothalický kmen , který obsahuje tento zmutovaný gen,

křížit s kmeny obsahujícími mutace genů, jejichž poloha je známá, ale náš gen obsahují

ve standardní alele. Při těchto kříženích se musí fenotypový projev našeho genu

vyštěpovat pouze v poměru 2+ : 2-, což je důkaz, že jde o mutaci jediného genu a že

fenotypový projev této mutace není ovlivněn mutacemi mapovacího kmenu, použitého

v křížení. Z každého křížení je třeba mikromanipulovat spory alespoň 70 tetrád (v

případě nižší životnosti některých spor je třeba mikromanipulovat tolik asků, až

dosáhneme kolonie ze 70 úplných tetrád) a sledovat frekvenci rodičovských ditypů

(PD), nerodičovských ditypů (NPD) a tetratypů(TT) pro kombinace analyzované

mutace s jednotlivými mutacemi mapovacího kmenu (viz tab. č. xxx5). Jestliže oba

Strana167

geny sledované dvojice jsou na různých chromosomech a poměrně vzdáleny od svých

centromer je počet PD : NPD : TT = 1:1:4, jestliže jsou oba geny blízko svých

centromer, klesá frekvence TT. Jestliže však jsou obě mutace na homologických

chromosomech (tj. dané geny se vyskytují na tomtéž chromosomu), je frekvence PD >

NPD. Z těchto důvodů nejdříve zjistíme statistickými metodami (pomocí testu χ2), zda

je frekvence PD průkazně vyšší než frekvence NPD. V případě, že tomu tak je a jestliže

počet NPD je velmi nízký a jestliže také počet TT není vysoký, můžeme vzdálenost

mapovaného genu (v centimorganech čili cM) vypočítat podle Perkinsova vzorce:

Χ [cM] = 50×TTNPDPD

NPDTT++

×+ 6

Tento vzorec dává přesné výsledky pouze pro velmi malé mapovací vzdálenosti

(tj. 35–40 cM), neboť předpokládá, že ve zjištěném mapovém intervalu dochází pouze

k jed-noduchému nebo dvojitému překřížení chormatid (tj. crossing – overu). Při větších

vzdálenostech však dochází také k výraznému výskytu trojitých a vyšších výměn

chromatid, takže Pekrinsovým vzorcem bychom dostali nižší výsledek, než je

skutečnost. Proto je třeba v tomto případě křížit náš kmen s dalším kmenem, který

obsahuje mutaci takového genu, jež leží blíže našemu mapovanému genu. Obyčejně je

nutno analyzovat několik mutací na tomtéž rameni chromozomu, na němž leží náš gen.

Za tím účelem byly připraveny kmeny obsahující několik zmutovaných genů na

jediném chromosomu, tzv. multimarkerové kmeny, takže výsledek získáme analýzou 70

úplných tetrád jediného křížení. Protože však nevíme, na kterém chromosomu náš

zmutovaný gen leží, křížíme nejdříve kmen, který jej obsahuje, s multimarkerovými

kmeny obsahujícími mutace v genech, jež jsou ve vazbě s jednotlivými centromerami

(tzn. že jsou poměrně blízko centromery příslušného chromosomu).

Protože u haploidních kmenů S. cerevisiae je známo 17 chromozomů, je nutno

sledovat 17 zmutovaných genů, jež mohou být rozděleny do dvou kmenů. Křížíme náš

kmen s jedním z těchto mapovacích kmenů a v 70 úplných tetrádách analyzujeme

frekvence PD, NPD a TT v kombinacích mapovaného genu s jednotlivými

centromerovými marekry (viz tab. č. xxx5). Není-li v žádném případě průkazné PD >

NPD, zjišťujeme, zda je frekvence TT průkazně menší než 4/6 všech tetrád (tedy

odchylka od poměru 1:1:4). Jestliže tato frekvence není menší, leží náš gen daleko od

své centromery, případně na některém za čtyř známých fragmentů. o nichž se dosud

neví, ke které centromeře náleží. Jestliže je tato frekvence v kombinaci s jedním

centromerovým markerem průkazně vyšší než 4/6 (tj. 67%), pak mapovaný gen leží

Strana168

pravděpodobně na tomtéž chromozomu, ale velmi vzdálen od své centromery. Toto

zvýšení je způsobeno tzv. chiasmovou interferencí, jež se u S. cerevisiae vyskytuje ve

většině chromosomových oblastí. Je-li však frekvence TT průkazně nižší než 4/6 (tj.

67%), leží náš gen méně než 60 cM od své centromery a proto náš kmen křížíme

s kmenem nesoucím zbývající centromerové markery. Jeden z těchto markerů by měl s

naším genem poskytnout frekvence PD průkazně vyšší než frekvence NPD, takže

bychom mohli buď použít Perkinsův vzorec pro bližší lokalizaci našeho genu na tomtéž

chromosomu, nebo použít ještě křížení s dalšími makrery téhož chromosomu, nebo

použít ještě křížení s dalšími markery téhož chromosomu. Druhý postup je častější,

neboť je také nutno zjistit, na kterém rameni chromosomu náš gen leží, případně zda

leží mezi centromerovým markerem a centromerou nebo na opačné straně od

centromerového markeru. Opět zkoušíme použít Perkinsův vzorec. Kdyby však gen,

vázaný na centromeru, nevykazoval vazbu se žádným z genů vázaných na centromery

známých 17 chromosomů, musel by být na dosud neznámém chromosomu.

Pro mapování genů, jež jsou v těsné vazbě na svou centromeru, můžeme použít

také frekvence segregací při druhém meiotickém dělení při jejich křížení s kmenem

obsahujícím mutaci genu, jenž je rovněž ve velmi těsné vazbě se svou centromerou, ale

na jiném chromosomu, a jehož frekvence segregací při druhém meiotickém dělení je

známa (segregace alel při druhém meiotickém dělení je způsobena crossing-overem

v oblasti mezi centromerou a příslušným genem). Pro frekvenci tetratypu (tj. f (TT))

platí vztah:

f(TT) = x + y –3/2×x×y , kde x je frekvence segregací alel při druhém meiotickém dělení jádra pro gen z prvního

rodiče a y je totéž pro gen druhého rodiče. Centromerové markery trp 1, pet 8 a met 14

mají frekvenci segregace alel při druhém meiotickém dělení < 1%, takže při křížení

s kmenem o neznámém genu, který je blízko své centromery, se tyto hodnoty mohou

zanedbat a f(TT) = x. Vzdálenost tohoto genu se pak přibližně rovná polovině frekvence

segregací při druhém meiotickém dělení, a v tomto případě tedy polovině frekvencí TT.

3) Hromadná analýza spor

Hromadná analýza spor, která je méně pracná než tetrádová analýza, má několik

zdrojů chyb, a proto musí být při důkladné genetické analýze vždy doplněna analýzou

Strana169

alespoň několika mikromanipulovaných tetrád. V žádném případě nemůže být použita

pro mapování genů.

Prvním zdrojem chyb při hromadném získání spor je možnost, že diploidní

vegetativní buňky nebyly všechny odstraněny. K jejich odstranění se používá buď 10

minutového působení 50%ního ethanolu, nebo zahřívání po dobu 2–3 min na teplotu

56,5o–57 ,5°C nebo izolace spor do vrstvy sterilního parafinového oleje. Jelikož

odolnost spor a vegetativních buněk k fyzikálním a chemickým prostředkům není příliš

odlišná, je nutno tyto zákroky provádět velmi přesně a kontrolovat jejich účinnost u

jednotlivých kmenů. Dalším zdrojem chyb může být nedostatečné mechanické oddělení

jednotlivých spor od sebe. Složení povrchové vrstvy sporové stěny vede totiž ke

shlukování spor opačných párovacích typů, takže pak dojde ke spájení takových dvou

sousedních spor. Tomu lze zabránit důkladným rozetřením spor po povrchu živného

agaru, jež se ještě zlepší, jestliže se spory nejdříve dobře rozmíchají do kapky roztavené

želatiny (30o–33°C). Použití želatiny je nutné tehdy, jestliže k izolaci spor bylo použito

parafinového oleje. K chybným závěrům na základě výsledků z hromadně získaných

spor může dojít tehdy, jestliže jedna nebo několik kategorií segregantů má sníženou

životnost, takže vzniklé spory za daných podmínek nevyklíčí nebo jich vyklíčí jen

určitý podíl. Protože tento jev není ojedinělý, je nutno vždy analýzu hromadně

získaných spor doplnit analýzou alespoň několika tetrád. Snížená životnost se může

v hromadně získaných sporách prozradit tím,že určitá mutace je mezi sporami

v nedostatku (tj.nevyskytuje se u poloviny počtu spor). Analýza hromadně získaných

spor je však vhodná pro zjištění suprese mutací (tj. zda při křížení dvou standardních

kmenů se objeví zmutované spory), pro charakterizaci dominantních mutací (tj. zda při

křížení dvou mutantů stejného fenotypu se objeví spory standardního typu) apod.

Cv.8.9 Hromadná analýza spor

Potřeby : osporovaná kultura hybridního kmene S. cerevisiae na sporulačním agaru,

0,1 ml roztoku trávicích enzymů (koncentrace 10 mg suchého enzym.preparátu/ml),

předsušené desky kompletního agaru (půda č.xx30), sterilní 15%ní želatina (1 ml),

sterilní balotino, sterilní parafinový olej, sterilní voda, mikroskop, podložní a krycí

sklíčka, sterilní párátka, sterilní centrifugační kyvety, sterilní pipety (1ml), sterilní

zkumavka s těsnícím kovovým uzávěrem.

Provedení:

Strana170

1. Mikroskopicky zkontroluj stupeň sporulace na sporulačním agaru. V případě

dostatečného množství spor přenes očko z téhož nátěru do 0,1 ml roztoku enzymů

šnečího zažívacího traktu v patentní zkumavce a inkubuj při 28°C 2–3 hodiny.

2. Mikroskopicky zjisti, zda je blána asků dodatečně narušena a v kladném případě

připipetuj 1,0 ml sterilní vody a zahřívej suspenzi na vodní lázni o teplotě 56,5o–

57,5°C. za neustálé kontroly teploty lázně. Pak rychle ochlaď pod tekoucí vodou

nebo v kádince s vodou o teplotě 10o–15°C.

3. K suspenzi asepticky přidej sterilní balotino a intenzivně třepej po dobu 10 min.

Pak přidej 2 ml sterilního parafinového oleje a třepej intenzivně další 3 min.

4. Přelej směs asepticky do centrifugační kyvety, vypláchni zkumavku 1 ml sterilní

vody, přidej výplach do kyvety a vše odstřeď. Přenes očkem spory z parafinové

vrstvy do 1 ml sterilní rozehřáté želatiny (30o–32°C) a očkem v želatině důkladně

rozmíchej. Pak naber očkem suspenzi spor v želatině a roztírej izolační čárkovací

metodu (viz kap. 6.2.1.3) na předsušenou desku kompletního agaru. Tento postup

opakuj u několika desek.

5. Inkubuj zavěšený agar 2–3 dny při 28°C.

6. Vyrostlé kolonie přenes pomocí sterilních párátek na 2 desky kompletního agaru za

použití šablon pro 52 kolonií na desce (viz obr. a) a označ kolonie č. 1 na každé

desce. Použitá párátka vkládej ihned do kádinky s 96%ním ethanolem. Zaočkované

desky inkubuj 1–2 dny při 28°C. Vyrostlé kolonie na desce kompletního agaru pak

použij pro otisky (např. na minimální agary, v nichž chybí vždy pouze jedna

z požadovaných živin, nutných pro analýzu získaných sporových klonů).

8.2.2 Fúze protoplastů

Sexuální hybridizace i parasexuální křížení mohou být použity jen u některých

mikroorganismů (viz tab. x4). Tento nedostatek je odstraněn možností převést

mikrobiální buňku v protoplast, navodit umělou fúzi protoplastů a vzniklé fugáty (i

původní protoplasty) opět regenerovat v buňky. Fúze protoplastů lze provádět u

nejrůznějších typů mikroorganismů (s vyjímkou gramnegativních bakterií, u nichž se

zatím nepodařilo připravit pravé protolasty schopné fúze) a dokonce i u rostlinných a

živočišných buněk. Dokonce se podařila úspěšná fúze i u protoplastů získaných z velmi

vzdálených organismů (např. z živočišných buněk a kvasinek, rostlinných buněk a

Strana171

kvasinek apod.), které však neposkytly stabilní hybridní produkt, neboť vzniklá

hybridní buňka nemůže zvládnout tak obrovské rozdíly genetického vybavení obou

fuzujících rodičů. Také mezirodové a dokonce i mezidruhové hybridy jsou nestabilní. U

eukaryot téhož druhu však získáme z haploidních protoplastů protoplasty diploidní i

polyploidní, takže zde dochází také ke karyogamii, a to i tehdy, jestliže fuzují

heterothalické buňky téhož parovacího typu. Můžeme tak křížit také průmyslové kmeny

kvasinek. U grampozitivních bakterií dochází při fúzi nejdříve k přechodnému typu

dvouchromosomální buňky, avšak obě DNA rekombinují a po několika děleních

získáváme stálé jednochromosomové rekombinanty. Velmi vysoké frekvence

rekombinací (více než 1%) poskytují vnitrodruhové fúze protoplastů u streptomycet,

které se ještě výrazně zvýší (až na 10-20% regenerovaných spor, tj. na 104 násobek

frekvence rekombinací při parasexuální konjugaci streptomycet) přidáním

dimethylsulfoxidu (14% hm.).

Fúze protoplastů se navozuje přídavkem fusogenního činidla (např.

polyethylenglykolu, který odvodňuje protoplasty a v přítomnosti Ca2+ vyvolává

interakce membrán protoplastů) nebo nověji také elektrickým šokem. Fúze protoplastů,

podobně jako jejich příprava i regenerace v buňky, nastává pouze v osmoticky

stabilizovaném prostředí (tj. v prostředí o stejném osmotickém tlaku, jak panuje uvnitř

buňky), jež brání lysi protoplastů. Regenerace fúzovaných i normálních protoplastů v

buňky nastává pouze v polotuhé živné půdě (tj. agarové nebo želatinové), neboť se musí

zabránit odplavování vytvořených prekursorů (tj. “stavebních kamenů“) buněčné stěny

do živného prostředí. Syntéza buněčné stěny je poměrně zdlouhavá (u kvasinek trvá 10-

14h) a teprve po ní začíná rozmnožování buněk. První 2-3 buněčné cykly po regeneraci

jsou ještě nenormální, a s výraznými morfologickými odchylkami. Za velmi dobrý

výsledek se pokládá regenerace 5-50% protoplastů.

Protože fúze protoplastů je náhodná, je pro získání hybridních protoplastů nutno

použít vhodně označené kmeny a jejich selekci (např. komlementující auxotrofní kmeny

a selekci prototrofů na minimálním agaru). U kvasinek se jako marker může použít také

poškození dýchání (tj.nitochondriální mutace rhoo), jež se kombinuje s auxotrofií (např.

rhoo × ade-) a selektuje se na minimálním glycerolovém agaru, kde nemůže růst ani

jeden z rodičů, ale jejich fugát ano. V poslední době se při fúzi protoplastů

průmyslových kmenů kvasinek jako marker používá také produkce killer-toxinů (neboli

zymocinů) u kmenů obsahujících killer-faktory. Např. protoplasty rhoo kmenu

obsahujících killer-faktor se smísí s protoplasty normálního (rhoo) kmene, který je

Strana172

citlivý k příslušnému zymocinu. Na glycerolovém agaru může růst jen potomstvo

fúzovaných protoplastů. Bližší viz Vondrejs a sp.,Folia Biologica,29,373 (1983).

Fúzí vhodně značených jaderných kvasinkových protoplastů s bezjadernými

kvasinkovými protoplasty, získanými z pučících buněk k přenosu pouze

cytoplazmatických faktorů dědičnosti (např. k přenosu mitochondriální DNA nebo

killer-faktorů), což je označováno jako cytodukce.

Směs protoplastů vhodně značených tří haploidních kmenů kvasinek může být

použita také pro získání triploidních a více ploidních kmenů, neboť polyethylenglykol

navozuje také fúzi několika protoplastů současně. Např. při smíchání protoplastů arg-

leu- × leu- lys- × lys- arg- porostou na minimálním agaru pouze buňky, kterým první

kmen poskytl schopnost syntetizovat lysin, druhý kmen schopnost syntetizovat arginin a

třetí kmen schopnost syntetizovt leucin.

Principu fúze protoplastů se používá také při genovém inženýrství kvasinek,

neboť, abychom dosáhli transformace kvasinkové buňky plazmidovou DNA, musíme

kvasinkové buňky převést v protoplasty a plazmidovou DNA obalit umělou

fosfolipidovou membránou třepáním plasmidů s emulzí fosfolipidů. Transformace pak

probíhá za podmínek fúze protoplastů a musí být následována regenerací protoplastů

v buňky.

Cv.8.10 Příprava protoplastů u Saccharomyces cerevisiae

Potřeby : 100ml půdy č. xx34 v 500 ml baňce, sterilní voda, sterilní roztok KCl o

koncentraci 0,6 mol/litr, sterilní roztok enzymů trávicího traktu Helix pomatia („šnečí

enzym“), sterilní centrifugační kyvety, centrifuga, rotační třepačka, reciproká třepačka,

box o teplotě 28oC, mladá kultura S. cerevisiae na šikmém agaru, počítací komůrka.

Provedení :

1. Tekutou půdu v 500ml baňce naočkuj kličkou z mladé kultury S. cerevisiae na

šikmém agaru a inkubuj přes noc (10-12 h) při 28oC za třepání, aby koncentrace

buněk byla 107–108/ml (exponenciální fáze růstu).

2. Odcentrifuguj buňky (3–10 min při 1000 ×G) ve sterilní kyvetě, supernatant slij a

buňky resuspenduj ve sterilní vodě a znovu odcentrifuguj. Toto promytí opakuj jěště

jednou a pak buňky resuspenduj do roztoku KCl (0,6 mol/litr) a opět odcentrifuguj.

3. Rozmíchej buňky do roztoku enzymů trávicího traktu hlemýždě Helix pomatia tak,

aby koncentrace buněk byla 108/ml (zjisti počítací komůrkou, viz kap. xxx7.2.) a

mírně třepej na reciproké třepačce při 280C.

Strana173

4. Po 45 min a pak v 15 min intervalech sleduj mikroskopicky v nativním preparátu

v kapce 0,6 M KCL přítomnost protoplastů a v kapce H2O jejich lyzi (zvětšení je

v obou případech 45×10 nebo 60×10).

5. Když se většina buněk přeměnila v protoplasty, přidej asepticky 100 ml roztoku KCl

o koncentraci 0,6mol/litr, jemně promíchej a odstřeď (1000 ×G, 3 min).

6. Pak promyj stejným způsobem ještě jednou. Supernatant by měl být čirý; je-li,

zakalen, svědčí to buď o nedokonalé centrifugaci nebo o částečné lýzi protoplastů.

Poznámka : Pro urychlení rozkladu stěn „ šnečím“ enzymem se doporučuje susupendovat buňky

odstředěné z kultivačního média na 10 min do roztoku obsahujícího Tris-HCl

(10mmol/litr), sodnou sůl ethylediaminotetraoctové kyseliny (EDTA) v konečné

koncentraci 5 mmol/litr a 1% 2-merkaptoethanolu s pH upraveným na 9,0. Koncentrace

buněk má být 108/ml roztoku. Pak se buňky odstředí, resuspendují ve stejném objemu

0,6 M KCl, znovu odstředí a promyjí KCl. Na odstředěné buňky se aplikuje zředěný „

šnečí“ enzym a postupuje se, jak je uvedeno výše.

Cv.8.11 Fúze protoplastů u S. cerevisiae, jejich regenerace a izolace

hybridů.

Potřeby : jako ve cv.8.10 a jrště mladý kmen S.cerevisiae s komplementačními

markery s kmenem ze cv.8.10, sterilní roztok CaCl2 (0,3 mol/litr), sterilní 30%ní roztok

polyethylenglykolu (o mol hmotnosti 4 000 nebo 6 000) v 0,1 M CaCl2, osmoticky

stabilizovaný agar (půda č. xx36), 5 desek osmoticky stabilizovaného minimálního

agaru (tj. půda č. xx28 nebo č.yy29, u nichž je však destilovaná voda nahrazena

roztokem KCl (0,6 mol/litr).

Provedení :

1. Připrav protoplasty z mladých kultur uvedených kmenů kvasinek (odděleně pro

každý kmen) postupem uvedeným ve cv.8.10.

2. Když se většina buněk přeměnila v protoplasty, zbav je centrifugací (1000 ×G, 10

min) šnečího enzymu a zbytků buněk a promyj získané protoplasty nejdříve 0,6 M

KCl a pak 0,3 M CaCl2 za použití centrifugace.

3. Pomocí počítací komůrky spočítej hustotu protoplastů v obou suspenzích a suspenze

smíchej ve sterilní zkumavce tak, aby se z každého kmene použilo 108 protoplastů.

Strana174

4. Pak směs opět odstřeď, protoplasty resuspenduj ve 2 ml roztoku CaCl2, přidej k nim

2 ml 30%ního roztoku polyethylenglykolu v 0,1 M CaCl2, opatrně zamíchej a nech

stát 15 min.

5. Pozoruj agregaci protoplastů pouhým okem i mikroskopicky v nativním preparátu

(bez přídavku vody).

6. Připrav desetinásobné zředění této suspenze v roztoku polyethylenglykol-CaCl2 a

přidej 0,5 ml tohoto zředění k 9,5 ml osmoticky stabilizovaného agaru (půda č.xx36)

v 100 ml Erlenmeyerově baňce, který je vytemperovaný na 43o–44°C.

7. Rozmíchej směs opatrným krouživým pohybem a pipetuj á 2 ml na 5 desek

osmoticky stabilizovaného minimálního agaru a rozlij (opatrným nakláněním a

kroužením misky) tento povrchový agar po celém povrchu desek. Po utuhnutí

inkubuj desky 3–6 dnů při 28°C.

8. Spočítej vyrostlé kolonie a zjisti frekvenci komplementace (v % na původní počet

protplastů).

Poznámka :

Pro zjištění frekvence reverzí protoplastů se může suspenze protoplastů v osmoticky

stabilizovaném agaru zaočkovat také na stabilizovaný komletní agar a pokračovat pak

stejně jako u stabilizovaného minimálního agaru.

Kontrolní otázky ke kap.8 − Základní genetické práce

1. Jak zjišťujeme auxotrofní mutanty, respiračně deficitní mutanty a mutanty

rezistentní k určitému antibiotiku?

2. Na čem jsou založeny selektivní metody zjišťování mutantů určitého fenotypy a jak

citlivé jsou tyto metody? Uveďte příklady!

3. Můžeme použít selektivní metody také pro získání auxotrofů a jak bychom při tom

postupovali ?

4. Jaké znáte postupy šlechtění mikroorganismů a kdy který používáme.

5. Co je to fenotypový lag a kdy k němu musíme přihlížet?

6. Proč při mutagenezi ultrafialovým zářením pracujeme v zatemněné místnosti?

7. Jaký je vztah mezi účinností UV světla a vzdáleností od ozařovaného objektu?

8. Jaký má průběh křivka přežívání po působení UV světla?

9. Jaké znáte chemické mutageny a jak je aplikujeme?

Strana175

10. Co je to Amesův test a kdy se provádí? Jaké mikrobiální kmeny se při něm

používají?

11. Co je to metabolická aktivace mutagenu a kdy a jak ji zjišťujeme?

12. Jak testujeme haploiditu kvasinek?

13. Jaké znáte postupy křížení a kdy je používáme ?

14. Jak získáme polyploidní kmeny?

15. Co je to komplementace a kdy jí používáme?

16. Jak dosáhneme sporulace u kmenů S.cerevisiae, jak u Schizosaccharomyces pombe?

17. K čemu slouží tetrádová analýza a jak ji provádíme?

18. Kdy používáme hromadnou analýzu spor u kavsinek a jaké jsou její výhody a

nevýhody?

19. U kterých mikroorganismů používáme fúzi protoplastů a v čem spočívají její

výhody?

Strana176

9 HOSTITELSKÉ KMENY ESCHERICHIA COLI

Nejběžnější bakterií používanou v metodách molekulární biologie je Escherichia

coli, obsahující cirkulární chromosom o velikosti cca 3x106 párů basí. V bohatých

mediích poskytujících kromě nezbytných minerálních látek i aminokyseliny, vitaminy,

prekursory nukleových kyselin a další metabolity má E. coli v exponenciální fázi růstu

za intenzivního třepání při 37°C (v baňce objemu minimálně 5× větším než je objem

media pro zajištění dostatečné aerace) generační dobu cca 20 min. Ve stacionární fázi je

zpravidla dosaženo koncentrace cca 2x109 buněk/ml. Tato bakterie však roste dobře i v

minimálním mediu obsahujícím glukosu jako jediný zdroj uhlíku a energie a soli

sloužící jako zdroj dusíku, fosforu, síry a stopových prvků. Této skutečnosti lze využít

pro inkorporaci značených prekursorů do produktů metabolismu. Jedná se např. o

inkorporaci izotopů 15N, 3H nebo 35S do proteinů při bakteriální expresi. Detekční limit

takto radioaktivně značených produktů je o několik řádů nižší ve srovnání s možností

detekce neznačených proteinů. Značení pomocí 15N nebo 13C se používá pro značení

proteinů ke strukturním studiím pomocí NMR spektroskopie.

Pro klonování jsou nejvhodnější bakteriální kmeny zajišťující stabilitu

rekombinantní DNA, tj. kmeny zbavené schopnosti syntézy restrikčních endonukleas,

enzymů schopných degradovat cizorodou DNA. Je rovněž výhodné použít kmen s

porušenou schopností homologní rekombinace (mutant recA), což snižuje riziko

porušení integrity klonované DNA. Hostitelské buňky pro bakteriofágy zpravidla

obsahují mutace potlačující fágové mechanismy vedoucí např. k lyzi membrány E. coli.

Při výběru vhodného kmene je třeba se řídit cílem, k němuž má být použit, např.

pro amplifikaci DNA či expresi genů. Pro účely molekulární genetiky byla připravena

řada mutantů, jejichž genotyp se obvykle udává jako seznam mutovaných alel. Ve všech

manuálech zabývajících se metodami genového inženýrství je uveden takovýto seznam,

Strana177

doplněný fenotypovými projevy jednotlivých mutací. Jednotlivé kmeny jsou komerčně

dostupné a jsou dodávány většinou společností zaměřených na produkty pro

molekulární genetiku. Následující přehled zahrnuje jen některé nejpoužívanější kmeny a

jejich genotypy.

9.1 Některé běžně užívané kmeny E. coli DH1 recA1 endA1 thi-1 hsdR17 supE44 gyrA96 relA1 - rekombinačně

deficientní kmen, používaný pro amplifikaci plasmidové a kosmidové

DNA

DH5 odvozený od předchozího, používaný ke stejným účelům

DH5α obsahuje navíc mutace: φ80 lacZΔM15 umožňující α-komplementaci

JM101 F´ traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15 supE thi Δ(lac-proAB) - kmen,

používaný pro amplifikaci plasmidové a kosmidové DNA, vhodný pro

vektory nesoucí amber mutaci

TG1 odvozený od předchozího, obsahuje navíc mutaci hsdΔ5, zabraňující

modifikaci DNA, nedochází však k její restrikci

JMN110 dam dcm F´ traD36 proAB+ hsdR17 lacIq lacZΔM15 supE44 thi leu rpsL

lacY gal ara tonA thr tsx Δ(lac-proAB) - methylačně deficientní kmen

pro amplifikaci plasmidové DNA, nedochází však k restrikci

syntetizované DNA

BL21(DE3) hsdS gal λcIts857 ind1 Sam7 nin5 lacUV5-T7 gene1 - kmen používaný

k vysoké expresi genů klonovaných do vektorů, obsahujících promotor

bakteriofága T7. Gen pro RNA polymerasu bakteriofága T7 je součástí

bakteriofága λDE3, který je integrován do chromosomu buněk BL21

9.1.1 Fenotypový projev některých mutací

Genotyp Fenotypový projev

λ (DE3) bakteriofág λ nesoucí gen pro T7 RNA polymerasu je integ

Strana178

ara blokuje katabolismus arabinosy

dam, dcm DNA není methylována ve specifických sekvencích (dam meth

endA1 mutace endonukleasy (vysoká kvalita plasmidové DNA)

F´ přítomnost F´ episomu

galK schopnost utilizace galaktosy

gyrA (Nalr) resistence ke kys. nalidixové (ovlivnění DNA gyrasy)

hsd EcoKR-(M-) nemodifikuje ani neštěpí DNA

lacI nadprodukce lac represoru, inhibice transkripce z lac prom

lacY mutace galaktosidpermeasy, blok utilizace laktosy

lacZΔM15 parciální delece genu β-D-galaktosidasy (pro α-

komplementaci)

proAB prolinový auxotrof

recA Rec- defektní rekombinace

relA relaxovaný fenotyp - syntéza RNA i bez syntézy proteinů

rpsL mutace S12 30S ribosomální podjednotky - resistence ke strep

supE44 Sup+ přítomnost supresorového genu tRNA, suprese nonsense

mutací

thi1 thiaminový auxotrof

tonA mutace proteinu vnější membrány resistence k T1 bakte

traD36 blok transferu F´ episomu

uvrA UV citlivost k UV záření

9.2 Uchovávání bakteriálních kultur pro genetické studie

Vzhledem k tomu, že je třeba zachovat genetickou stabilitu pozměněných kmenů

není vhodné jejich uchovávání pasážováním na agarové půdě. Tento způsob totiž

zvyšuje riziko rekombinací a dalších genetických změn. Proto je možné na agarových

půdách uchovávat pouze kmeny určené k brzkému zpracování (např. nově

transformované buňky, které budou použity pro přípravu DNA nebo expresi). Pro

dlouhodobé skladování je vhodné uchovávat kultury způsobem, při němž není nutno

buňky často pomnožovat. Nejpoužívanější metody jsou zmražení na velmi nízké teploty

(-70°C), lyofilizace nebo uchování kultury narostlé v měkkém agaru po inokulaci

vpichem.

Strana179

Mnoho bakteriálních kmenů může být uchováváno na šikmém agaru přelitém

sterilním parafinovým nebo minerálním olejem. K tomuto účelu je vhodné použít buňky

z logaritmické fáze růstu případně bakteriální sporulát. Kultura je inkubována na

šikmém živném agaru a poté je zkumavka s kulturou doplněna parafinovým olejem tak,

aby byl celý agar ponořen (tím je zabráněno jeho vysychání). Takto připravené

konservy lze uchovávat v lednici po několik let. Podobným způsobem lze uchovávat i

kvasničné buňky.

CV.9.1 Příprava zmražené kultury Potřeby : sterilní glycerol, suchý led, ethanolová lázeň (70%), kryogenní nádobky se

šroubovacím víčkem

Provedení :

1. Smíchejte v kryogenní nádobce 2 ml kultury ze střední logaritmické fáze s 1 ml

sterilního glycerolu.

2. Vložte do ethanolové lázně obsahující suchý led (cca -70°C).

3. Zmražené kultury uchovávejte při -70°C.

4. Při oživení kultury seškrábněte sterilní kličkou nebo párátkem trochu zmrzlé

suspenze a čárkujte na Petriho misku se živným mediem.

5. Dbejte na to, aby při manipulaci s konzervou kultura neroztála (nejlépe je uchovávat

ji na suchém ledu po celou dobu operace).

Cv.9.2 Příprava kultur inokulovaných vpichem

Potřeby : kryogenní nádobky se šroubovacím víčkem naplněné do 2/3 LB agarem

Provedení :

1. Do sterilní, šroubovací nádobky naplněné do 2/3 LB agarem, upraveným k tomuto

účelu ponořte očkovací kličku s kulturou. Několikrát vpich opakujte.

2. Inkubujte 8-12 h při 37°C s mírně povoleným víčkem.

3. Poté pevně utáhněte víčko a skladujte při 15° až 20°C.

4. Při oživení kultury naberte sterilním očkem malý kousek agaru a rozetřete na

Petriho misku čárkováním tak, aby byly po inkubaci získány jednotlivé kolonie.

Cv.9.3 Příprava kultur s vrstvou parafinového oleje

Strana180

Potřeby : zkumavka se šikmým živným agarem, sterilní parafinový olej (olej se

steriluje suchým teplem při 180°C po dobu 2 h)

Provedení :

1. Očkovací kličkou inokulujte šikmý agar s bohatou živnou půdou vhodnou pro

příslušný kmen.

2. Inkubujte (v případě E. coli cca 16 h, kvasinky cca 2 dny) při optimální teplotě do

dosažení dostatečného nárůstu. (v případě inkubace na selektivních minimálních

mediích je třeba dobu inkubace výrazně prodloužit).

3. Asepticky přelijte sterilním parafinovým olejem.

4. Uchovávejte při 4°C.

5. Při oživení postupujte stejně jako při očkování z běžného živného agaru

9.3 Bakteriální plasmidové a fágové vektory

V současné době jsou používány tři základní typy vektorů pro izolaci,

amplifikaci (po-množení) a expresi klonované DNA v prokaryotických buňkách. Jedná

se o plasmidy, kosmidy a bakteriofágy. Vektory všech tří skupin byly upraveny tak, aby

vyhovovaly specifickým účelům. Volba příslušného vektoru závisí na metodě, k níž má

být použit. Byly konstruovány vektory vhodné, např. pro přípravu velkého množství

plasmidové DNA, vysokou expresi proteinů, cílenou mutagenezi, přípravu radioaktivně

značených sond či genomových knihoven.

9.3.1 Bakteriální plasmidy

Bakteriální plasmidy jsou extrachromosomální elementy velikosti cca 1000-200

000 párů basí, které jsou schopné autonomní replikace. Jsou tvořeny dvojřetězcovou,

uzavřenou, kruhovou DNA. Jejich replikace může, ale nemusí, být synchronizovaná s

replikací bakteriálního chromosomu a s cyklem buněčného dělení. Pokud oba procesy

nejsou synchronizované může počet plasmidů v buňce dosáhnout několika set kopií

(tzv. „relaxované“ plasmidy). Obecně se za plasmidy s velkým počtem kopií (high copy

number) počítají takové, které se vyskytují ve větším počtu než 20 v jedné buňce. Tyto

plasmidy jsou vhodné pro získání velkého množství DNA pro další práce.

Všechny plasmidy v současné době používané ke klonování jsou oproti

přirozeným plasmidům upravené. Kromě počátku replikace obsahují marker umožňující

Strana181

zvýhodněný růst transformovaných bakterií, neboť i za optimálních podmínek je totiž

plasmid vnesen pouze do malé části buněčné populace. Proto je třeba vyvinout selekční

tlak pro podporu růstu těchto buněk. Pro tento účel bývá zpravidla použit gen, jenž se

fenotypově projevuje jako dominantní rezistence k určitému antibiotiku. Nejčastěji se

používají geny zodpovědné za rezistenci k ampicilinu, tetracyklinu, chloramfenikolu a

kanamycinu. Tato antibiotika působí různým mechanismem (viz tab.xxx ) a vždy je

třeba čerstvě transformované buňky inkubovat nejprve v mediu bez inhibitoru tak, aby

byl překonán tzv. fenotypový lag. Během této doby (30-60 min) dochází k syntéze

genového produktu odpovídajícího za rezistenci. Dalším úsekem, který upřednostňuje

uměle konstruované plasmidy před přirozenými, je polyklonovací místo, což je úsek

DNA umístěný mimo ostatní důležité sekvence, který obsahuje cílové sekvence pro

restrikční endonukleasy. Tato restrikční místa jsou obsažena v plasmidu v jediném

exempláři, což zaručuje snadnou možnost inzerce dalšího úseku DNA.

9.3.2 Plasmidová inkompatibilita

Buňky obvykle nemohou obsahovat dva různé typy plasmidů. Tento jev se

nazývá plasmidová inkompatibilia a plasmidy, např. pMB1 a ColE1, jsou pak

označovány jako vzájemně inkompatibilní. Lze také říci, že patří do společné

inkompatibilní skupiny, která zahrnuje plasmidy se stejných počátkem replikace.

Důvodem inkompatibility je vzájemná kompetice o faktory iniciující replikaci.

Následující tabulka uvádí některé běžně používané plasmidy a jejich replikony

zodpovědné za příslušnost do jednotlivých inkompatibilních skupin.

Deriváty plasmidu Replikon Počet kopií v buňce

pBR322 pMB1 15-20

pUC pMB1 500-700

pACYC p15A 10-12

pSC101 pSC101 ~ 5

ColE1 ColE1 15-20

Plasmidy obsahující replikony ColE1 a pMB1 jsou vzájemně inkompatibilní. Jsou však

kompatibilní s ostatními plasmidy v tabulce.

Strana182

9.3.3 Běžně používané plasmidové vektory

1) pBR322

Klasickým plasmidovým vektorem se stal pBR322 (viz. obr.). Jedná se o malý (3,2 kb)

plasmid, kódující rezistenci k ampicilinu a tetracyklinu. V obou těchto genech jsou

vhodná restrikční místa, která se neopakují na jiném místě v plasmidu, takže lze

rezistenci k těmto antibiotikům v případě potřeby zrušit (tzv. inzertní inaktivace). Ztráta

rezistence k antibiotiku tedy dokazuje, že došlo k úspěšnému vložení inzertu. Tento

vektor byl v poslední době vytlačen výhodnějšími, nově konstruovanými plasmidy.

2) pUC18 a pUC19

Strana183

Jedná se o totožné plasmidy s tím rozdílem, že nesou opačně orientovaná

polyklonovací místa. Jako selekční marker slouží rezistence k ampicilinu. Vektory pUC

se vyskytují v transformovaných buňkách ve velkém počtu kopií, neboť neobsahují gen

(tzv. rop-gen), kódující protein zodpovědný za kontrolu jejich replikace.

Tyto plasmidy obsahují krátký úsek DNA kódující regulační sekvenci a počátek

genu pro β-galaktosidasu (lacZ). Do tohoto úseku bylo vloženo polyklonovací místo

tak, aby nedošlo k posunu čtecího rámce. Vzhledem k velmi malé délce inzertu a

zachování čtecího rámce není výrazně porušena struktura ani aktivita produktu. Genový

produkt zmíněného úseku sám nevykazuje enzymovou aktivitu, ale po jeho expresi v

buňkách kódujících pouze zbylý C- -koncový úsek enzymu může dojít ke spojení

obou podjednotek a k tvorbě katalyticky aktivního proteinu. Dochází tedy ke

komplementaci mutantu s delecí N-koncového úseku pomocí plasmidu obsahujícího

tuto chybějící část. Tento typ je nazýván α-komplementace. Lac+ bakterie lze snadno

detegovat na základě modrého zbarvení kolonií vyrostlých v přítomnosti

chromogenního substrátu, tj. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktosidu (X-gal).

Vložením inzertu do polyklonovacího místa plasmidu dojde k přerušení

sekvence kódující N-koncovou část enzymu. Takto poškozený úsek již není schopen α-

komplementace. U buněk obsahujících takovýto plasmid tedy nedochází ke štěpení X-

gal a vzniklé kolonie zůstávají bílé. Pro potvrzení struktury těchto plasmidů lze opět

použít restrikční analýzu.

Strana184

9.4 Izolace plasmidové DNA

9.4.1 Lyze bakteriálních buněk

Pro izolaci většiny v současnosti používaných plasmidů postačuje buněčná

kultura kultivovaná do pozdní logaritmické fáze v tekutém mediu obsahujícím

antibiotikum zajišťující selekci příslušných transformantů. V případě plasmidů s nižším

počtem kopií lze během kultivace použít přídavek chloramfenikolu, který inhibuje

syntézu buněčných proteinů a tím i replikaci bakteriálního chromosomu. Replikace

plasmidů však ještě po několik hodin pokračuje, což vede k nahromadění většího počtu

kopií plasmidové DNA. Někdy vede ke zvýšení množství plasmidové DNA kultivace

v bohatším mediu (např. TB).

Výběr vhodného postupu zpravidla závisí na velikosti plasmidů. Plasmidy větší

než 15 kb jsou křehčí a je nutno použít šetrnějších metod pro jejich izolaci. Bakteriální

stěny jsou v tomto případě degradovány v izotonickém roztoku sacharosy pomocí

lysozymu a EDTA. Vzniklé sféroplasty jsou lyzovány přídavkem detergentu (např.

SDS).

Pro izolaci malých plasmidů z bakteriálních buněk lze použít drastičtější metody lyze

např. varem nebo přídavkem NaOH.

1) Preparace plasmidové DNA

Volba postupu závisí kromě velikosti plasmidu i na požadovaném množství a

čistotě DNA. Pro řadu účelů postačuje velmi malé množství DNA získané z 1-2 ml

kultury. Výtěžek závisí také na použitém bakteriálním kmeni E. coli. Dobré výsledky

poskytují např. kmeny DH1, DH5, C600 a LE392, zatímco kmeny HB101 a série

JM100 mají vyšší nukleasovou aktivitu, která není zcela inaktivována varem. Řada

laboratorních příruček doporučuje při selhání jedné metody zkusit jinou.

Strana185

Metoda alkalické lyze je založena na faktu, že většina chromosomální DNA,

bakteriálních proteinů a SDS precipituje při neutralizaci silně alkalického roztoku

pomocí octanu draselného. Precipitát je odstraněn centrifugací. V případě požadované

vyšší čistoty se zbylé kontaminující látky extrahují ekvimolární směsí fenolu a

chloroformu. Plasmidová DNA je poté ze supernatantu precipitována ethanolem nebo

isopropanolem.

Při varné metodě jsou buňky lyzovány lysozymem, Tritonem-X100 a následným

varem. Chromosomální DNA zůstává po tomto zásahu přichycena k bakteriální

membráně a je peletována krátkou centrifugací stejně jako varem denaturované

proteiny. Plasmidová DNA je poté precipitována ethanolem nebo isopropanolem.

Minipreparace alkalickou lyzí slouží k rychlé přípravě DNA v množství a čistotě

dostatečné pro sekvenování nebo pro restrikční štěpení či pro transformaci hostitelských

buněk.

Cv.9.4 Minipreparace alkalickou lyzí

Potřeby : LB medium, antibiotikum (ampicilin 50 mg/ml) - skladovat při -20°C,

ethanol – velejemný, směs fenol-chloroform 1:1, - skladovat v temné lahvi při 4°C,

fenol je nutno před použitím pro přípravu směsi ekvilibrovat na pH nad 7,8 (viz

dodatky), při nižším pH by mohla DNA přecházet do organické fáze; RNasa, zbavená

DNasy 10 mg/ml - skladovat při -20°C;

Roztok I: (glukosa/Tris/EDTA) 50 mM glukosa - skladovat při 4°C, 25 mM Tris.Cl

pH 8,0, 10 mM EDTA, lysozym (na špičku špachtle);

Roztok II: (NaOH/SDS) 0,2 M NaOH - připravit vždy čerstvý, 1 % SDS;

Roztok III: 3 M NH4COOH, 1.5 % CH3COOH - skladovat při

4°C; ledová lázeň.

Kultivace buněk :

1. Zaočkujte jednu kolonii nebo ekvivalentní množství buněk ze šikmého agaru do 2

ml LB media obsahujícího ampicilin (50 μl zásobního roztoku).

2. Inkubujte 12-24 h při 37°C za intenzivního třepání.

Lyze buněk a izolace DNA :

1. Převeďte 1,5 ml kultury do mikrozkumavky, odstřeďujte 1 min. při 12 000-15 000

G při 4°C. Odsajte supernatant tak, aby byla peleta co nejsušší.

Strana186

2. Resuspendujte bakteriální peletu ve 100 μl ledového roztoku I opakovaným

pipetováním a vortexováním. Je nutné dokonale resuspendovat! Přidejte lysozym

(na špičku špachtle). Inkubujte 5 min. za laboratorní teploty.

3. Přidejte 200 μl čerstvě připraveného roztoku II. Pevně uzavřete zkumavku a

promíchejte obsah převracením (cca 5×) tak, aby byl celý vnitřní povrch zkumavky

opláchnut. Nevortexujte a nemíchejte intenzivně! Inkubujte na ledu 5 min.

4. Přidejte 150 μl ledového roztoku III. a vortexujte 2 s tak, aby došlo k úplnému

promísení. Inkubujte na ledu 10 min.

5. Odstřeďujte 5 min při 12 000 G při 4°C a převeďte supernatant do nové

mikrozkumavky. Přidejte 1 μl RNasy (10 mg/ml) a inkubujte 30 min. při laboratorní

teplotě.

6. Přidejte stejný objem (cca 400 μl) směsi fenol-chloroform (1:1).

7. Dobře promíchejte vortexováním a odstřeďujte 2 min. při 12 000 G při 4°C.

Převeďte supernatant do nové mikrozkumavky. Vyvarujte se odebrání

mezifázového rozhraní!

8. Precipitujte plasmidovou DNA dvojnásobným objemem ethanolu. Inkubujte na ledu

10 min. Odstřeďujte 10 min. při 12 000 G při 4°C. Opatrně odsajte supernatant tak,

abyste neporušili peletu. Odstraňte zbývající kapky roztoku na stěnách.

9. Má-li být DNA použita ke štěpení restrikčními endonukleasami, opláchněte peletu 1

ml 70 % ethanolu (4°C), odstraňte supernatant, vysušte peletu a rozpusťte ji v 50 μl

vody nebo TE (pH 8,0).

Poznámka : Při práci s fenolem používejte rukavice a buďte obzvláště opatrní. Fenol

může způsobit těžké popáleniny! Potřísníte-li se fenolem okamžitě opláchněte postižené

místo důkladně vodou.

Cv.9.5 Izolace DNA z velkého objemu

Potřeby : stejné jako cv.9.4

Provedení :

1. Buněčnou kulturu narostlou přes noc za třepání při 37°C ve 200 ml LB media

odstřeďte při 5 000 G 20 min, 4°C.

2. Peletu resuspendujte ve 14 ml roztoku I (glukosa/Tris/EDTA), rozdělte do dvou 50

ml kyvet (Falcon se šroubovacím uzávěrem) a přidejte lysozym (na špičku špachtle).

Inkubujte 10 min při laboratorní teplotě.

Strana187

3. Následující objemy jsou udávány pro jednu z kyvet.

4. Přidejte 14 ml roztoku II (NaOH/SDS). Uzavřete kyvety a jemně promíchejte

několikanásobným obrácením uzavřené kyvety. Ponechte 5-10 min při laboratorní

teplotě.

5. Přidejte 11,5 ml ledového roztoku III (NH4COOH /CH3COOH). Promíchejte

několikrát a ponechte alespoň 10 min na ledu. Během této doby se vytvoří bílý,

vločkovitý precipitát, obsahující chromosomální DNA, RNA, a komplexy solí, SDS

a proteinů.

6. Odstřeďujte 15 min při 4°C při 4 000 G (cca 4 000 rpm, Sorval TC6. Pokud se

nepodaří odstranit precipitát, odstřeďte při vyšších otáčkách 5 000 rpm).

7. Opatrně odstraňte bílý povlak z povrchu a opatrně převeďte pipetou supernatant do

nové zkumavky. Přidejte 15 ml směsi fenol-chloroform (1:1) a důkladně protřepte.

Odstřeďte 10 min při 3 000 G. Supernatant převeďte do 50 ml kyvety (Beckman).

Pokud není supernatant čirý, opakujte fenol-chloroformovou extrakci.

8. Přidejte stejný objem ethanolu nebo isopropanolu a ponechte na ledu nebo při -20°C

alespoň 10 min (lze ponechat libovolně dlouho).

9. Odstřeďte při 20 000 G (cca 12 000 rpm, rotor Beckman J-20), 15 min při 4°C.

10. Odlijte supernatant, ponechte kyvety v obrácené poloze na filtračním papíře tak aby

mohlo vytéci rozpouštědlo. Odsajte zbytky rozpouštědla, opláchněte peletu 70%ním

ethanolem a vysušte ji.

11. Rozpusťte peletu v 0,5 ml TE. V případě potřeby purifikujte následujícím postupem

cv.9.6).

2) Purifikace plasmidové DNA

Pokud je požadována plasmidová DNA velmi vysoké čistoty, lze použít pro

purifikaci preparátu, získaného jedním z výše zmíněných postupů, centrifugaci

v gradientu CsCl. Nevýhodou této metody je její časová náročnost a nákladnost, což se

týká nejen zařízení (ultracentrifuga), ale i chemikálií (velká spotřeba CsCl). Další

možností purifikace je precipitace polyethylenglykolem. Tato metoda je rychlá a

relativně účinná. Existuje také celá řada komerčních souprav založených na

chromatografické purifikaci nebo na sorpci plasmidové DNA na membrány uchycené

v mikrozkumavkách. Izolovanou DNA lze skladovat po několik týdnů v TE pufru při

4°C nebo zmraženou na -20°C nebo -70°C po několik let.

Strana188

Izolace plasmidové DNA na komerčním nosiči (převzato z Technického

Bulletinu firmy Promega) umožňuje poměrně účinnou purifikaci DNA bez použití

ultracentrifugy, ovšem s použitím komerčních kolon na jedno použití. Uvedená metoda

je založena na purifikaci DNA z buněčných lyzátů na kolonách firmy Promega.

Analogické kity lze získat i od jiných společností např. Quiagene a dalších.

Pro purifikaci DNA z fágových lyzátů lze použít kromě metody izolace DNA

pomocí stupňové a rovnovážné centrifugace v gradientu CsCl i přečištění na ionexovém

nosiči. Bakteriofágy jsou separovány od buněk a buněčných zbytků pomocí

centrifugace a následně je odstraněn CsCl.

Cv.9.6 Izolace plasmidové DNA na komerčním nosiči

Potřeby : Wizard kit pro purifikaci DNA, RNasa A - 20 mg/ml.

Provedení :

1. Odstřeďte 10 ml buněčné kultury (narostlé přes noc)

2. Šetrně resuspendujte buňky ve 300 μl pufru (resuspension buffer) a přidejte 2 μl

zásobního roztoku RNasy A. Převeďte do mikrozkumavky.

3. Přidejte 300 μl lyzovacího pufru a opatrně promíchejte několikanásobným

převrácením. Buněčná suspenze by se měla rychle vyčeřit - pokud ne pokračujte

v míchání do vyčeření.

4. Přidejte 300 μl neutralizačního pufru a opatrně promíchejte několikanásobným

převrácením.

5. Odstřeďujte 3 min v mikrocentrifuze při maximálních otáčkách (~15 000 g).

6. Převeďte supernatant do nové mikrozkumavky a opakujte odstředění.

7. Rozdělte vyčeřený supernatant do dvou mikrozkumavek (po cca 400 μl)

8. Přidejte po 500 μl purifikační pryskyřice WizardTM Miniprep do každé

mikrozkumavky, dobře promíchejte a ponechte 5 min při laboratorní teplotě (občas

promíchejte).

9. Převeďte obsah obou mikrozkumavek do 5 ml injekční stříkačky. Opatrně do ní

zasuňte píst a pomalu protlačte do minikolony.

10. Promyjte 3 - 4 ml promývacího roztoku (protlačením roztoku pomocí injekční

stříkačky)

11. Odstraňte stříkačku a vložte minikolonu do mikrozkumavky. Odstřeďte při

maximální rychlosti po dobu 1 min.

Strana189

12. Převeďte minikolonu do nové mikrozkumavky a aplikujte na ni 100 μl sterilní

deionizované vody zahřáté na 70°C a ponechte 1 min.

13. Eluujte DNA 1 min centrifugací.

Cv.9.7 Izolace DNA z lyzátů bakteriofága λ pomocí stupňové a rovnovážné

centrifugace v gradientu CsCl

Potřeby : 5 x polyethylenglykol 8 000 (PEG),

SM pufr (na 1 l, 5,8 g NaCl, 2 g MgSO4.7.H2O, 50 ml Tris.Cl [1 mol, pH

7,5],

5 ml želatina [2%]), CsCl, ekvilibrovaný fenol, chloroform, TE [pH 8,0].

Provedení separace fágových částic :

1. Odstřeďte buněčné zbytky centrifugací 1 l fágového lyzátu při 18 000 G 10 min při

4°C.

2. Převeďte 800 ml supernatantu do 1 l odměrného válce a přidejte 200 ml roztoku 5 x

PEG. Překryjte válec parafinem a promíchejte několikanásobným jemným

otočením.

3. Ponechte precipitovat přes noc při 4°C.

4. Odlijte část supernatantu do kádinky (cca 50 ml) pro vypláchnutí zbytku precipitátu.

5. Vylijte opatrně (aby nedošlo ke ztrátě precipitátu) zbylý supernatant a převeďte

precipitát do 50 ml kyvety (Falcon). Vypláchněte několikrát válec supernatantem (z

kroku 5) a přidejte podíly suspenze do kyvety.

6. Odstřeďte 10 min při 3 000 G při 4°C.

7. Vložte kyvetu na led a opatrně odstraňte supernatant.

8. Resuspendujte bílou pastu v minimálním objemu SM (objem přidaného SM by

neměl přesáhnout trojnásobek objemu pasty). Změřte objem suspenze a převeďte ji

do 150 ml baňky.

9. Přidejte ve čtyřech stejných alikvotech pevný KCl tak, aby jeho finální koncentrace

v suspenzi byla 1 M. Po každém přídavku důkladně promíchejte. Inkubujte na ledu

15-30 min.

10. Převeďte suspenzi do 50 ml kyvety (Falcon) a odstřeďte 10 min při 12 000 G při

4°C. (PEG zůstane v peletě, zatímco bakteriofág je v supernatantu.)

Provedení izolace fágových částic :

Strana190

1. Připravte do kyvety SW-28 gradient CsCl o třech koncentracích (je-li k dispozici

jiný rotor zachovejte přibližně vzájemné poměry : 3,5 ml…d=1,7 g/ml, 2,5

ml…d=1,5 g/ml,

2,5 ml…d=1,3 g/ml.

2. Jednotlivé vrstvy musí být přidávány injekční stříkačkou se širokou jehlou velmi

pomalu, aby nedošlo k jejich promíchání.

3. Opatrně převrstvěte lyzátem fága (supernatant z předchozího protokolu).

4. Doplňte cca 2 mm pod okraj SM. Odstřeďujte 2 h při 100 000 G při 15°C.

5. Opatrně odsajte zónu obsahující bakteriofág pomocí injekční stříkačky zasunuté

zpočátku těsně pod ni. Pomalu posunujte jehlu vzhůru v průběhu odsávání. (Zóna

obsahující bakteriofág je zpravidla na rozhraní dvou hustších roztoků. Není-li zóna

viditelná nemá zpravidla význam pokračovat v izolaci).

6. Převeďte roztok do zatavovací kyvety a doplňte ji roztokem CsCl o koncentraci 1,5

g/ml.

7. Odstřeďte 24 h při 80 000 G při 15°C.

8. Odsajte zónu obsahující fága (měla by být vidět pouze jedna zóna).

Provedení extrakce fágové DNA :

1. Dialyzujte 4 h za míchání proti 0,5 l pufru (50 mM NaCl, 50 mM Tris.Cl, pH 7,5, 10

mM MgSO4) při 4°C. Dvakrát opakujte.

2. Třikrát extrahujte stejným objemem pufrovaného fenolu.

3. Extrahujte dvakrát stejným objemem chloroformu.

4. Dialyzujte 8 h za míchání proti 0,5 l TE při 4°C.

9.4.2 Vnesení plasmidové DNA do bakteriálních buněk

Vstup izolované molekuly DNA do bakteriální buňky se nazývá transformace.

K to-muto procesu může docházet spontánně u recipientních buněk ve stavu

kompetence, což je schopnost transportovat DNA z media do buňky. Pro účinné vnesení

DNA do bakteriálních buněk existuje několik metod.

Nejúčinnějším postupem je tzv. elektroporace. Tato metoda je velmi rychlá, ale

vyžaduje speciální, nákladné zařízení. Elektroporace rozšířila aplikační možnosti

přenosu DNA i na velké plasmidy a buňky, u nichž ostatní techniky selhávaly. Při této

technice jsou buňky podrobeny velmi silnému elektrickému šoku, který způsobí lokální

Strana191

změny v membráně a tím vznik pórů, jimiž DNA prochází do buněk. Elektroporací lze

dosáhnout frekvence 109-1010 transformantů na 1 μg plasmidové DNA.

Další metodou je použití CaCl2 pro přípravu buněk schopných přijmout

plasmidovou DNA, tzv. kompetentních buněk. Tato metoda sice neumožňuje získání

tak vysokého množství transformantů jako předchozí, ale je poměrně jednoduchá a

získané kompetentní buňky lze skladovat po několik měsíců při -70°C. Velmi důležitý

je při této metodě optimální fysiologický stav buněk. Proto je třeba přesně dodržet

předepsané kultivační podmínky a získat buňky z počátku logaritmické fáze (OD590 cca

0,375). Dále je třeba dbát na to, aby všechny kroky následující po kultivaci byly

prováděny při 4°C. Vzhledem k tomu, že buňky se stávají citlivými k mechanickému

poškození, je nutné zacházet s nimi jemně, tzn. nemíchat je intenzivně a odstřeďovat při

nízkých otáčkách (max. 1 600 G). Je známo opět několik modifikací, jako je použití

Rb+, Mn++ nebo K+ iontů místo Ca++ a přídavky různých činidel, jako dithiothreitol

nebo dimethylsulfoxid.

Pro uspokojivý výsledek při přípravě kompetentních buněk pomocí CaCl2 a

jejich transformaci je třeba zajistit dostatečnou aeraci a odběr z počátku exponenciální

fáze růstu (při nárůstu kultury nad OD550 ~ 0,4 dochází ke snížení účinnosti

transformace). Poté jsou buňky vystaveny působení CaCl2 za snížené teploty. Takto

připravené kompetentní buňky jsou schopné přijmout plasmidovou DNA.

Cv.9.8 Příprava kompetentních buněk pomocí CaCl2 a jejich transformace

Potřeby : LB medium tekuté; LB - agar s ampicilinem; CaCl2 - 100 mM, pH 8,0 -

vychlazený; vychlazené kyvety a pipety.

Provedení přípravy kompetentních buněk :

1. Připravte inokulum E. coli ve 20 ml LB media. Inkubujte přes noc za třepání při

37°C.

2. 1 ml získaného inokula použijte pro zaočkování 100 ml předehřátého LB media v 1 l

baňce.

3. Inkubujte za intenzivního třepání při 37°C do OD550 ~ 0,375.

4. Ponořte baňku s kulturou do ledové tříště a inkubujte 10 min. Od této doby musí

všechny manipulace probíhat v chladu! Buňky jsou rovněž velmi citlivé na

mechanické poškození - nelze je tedy vortexovat, intenzivně míchat a odstřeďovat

při vysokých otáčkách.

Strana192

5. Odstřeďujte 10 min. při 4°C a 1500 G. Resuspendujte buňky v 50 ml vychlazeného

roztoku CaCl2 a asepticky převeďte do vychlazených, sterilních kyvet. Inkubujte na

ledu 20 min. 6. Odstřeďujte 10 min. při 4°C a 1500 G. Pelety resuspendujte ve směsi 1,75 ml

ledového roztoku CaCl2 a 0,75 ml glycerolu a rozdělte po 100 μl.

7. Inkubujte alespoň 30 min. na ledu. Buňky, které nebudou ihned použity k

transformaci lze zmrazit v lázni obsahující směs ethanolu a suchého ledu (- 70°C) a

uchovávat při - 80°C.

Provedení transformace :

1. Roztavte v ledové lázni mikrozkumavku obsahující 100 μl suspenze kompetentních

buněk

2. Do mikrozkumavky obsahující 100 μl suspenze kompetentních buněk přidejte

plasmidovou DNA (objem odpovídající 10 ng-1μg). Jemně zamíchejte a ponechte

10 min na ledu.

3. Vystavte buňky tepelnému šoku 2 min při 42°C.

4. Přidejte 1 ml LB media a inkubujte 1 h při 37°C.

5. Dobře ochlazenou sterilní skleněnou hokejkou rozetřete max. 200 μl alikvoty na

Petriho misky obsahující ampicilin. Jako kontrolu použijte netransformované buňky.

6. Inkubujte přes noc při 37°C.

9.4.3 Identifikace kolonií obsahujících rekombinantní plasmid

Selekce na půdě obsahující ampicilin zajistí růst pouze těch kolonií, v nichž je

přítomen plasmid nesoucí a exprimující gen pro β-laktamasu, tj. enzym degradující toto

antibiotikum. Selekce transformovaných buněk však nedává informaci o účinnosti

ligace, tj. vložení příslušného fragmentu DNA. Přítomnost vloženého inzertu do

příslušného vektoru je možno prokázat několika způsoby. Běžná metoda je analýza

velikosti DNA nebo přítomnosti nových restrikčních míst (vnesených inzertem) v DNA

izolované z jednotlivých klonů po ligaci a transformaci. Další metody jsou založeny na

inzerční inaktivaci enzymů kódovaných vektorem (izerční inaktivace a α-

komplementace). Hybridizace kolonií vyžaduje použití značené sondy (tj. specifického

fragmentu DNA odvozeného od sledované sekvence).

Strana193

9.5 Bakteriofágové vektory

Název bakteriálních virů tedy bakteriofágů nebo zkráceně fágů je odvozen

z řeckého phage – jíst a popisuje „vyjedené“ plaky viditelné na agarové misce porostlé

bakteriální kulturou.

9.5.1 Bakteriofág λ

Genom bakteriofága λ obsahuje přibližně 50 kb a je uložen v dvojřetězcové

DNA. Tato molekula se nachází ve fágových částicích v lineární formě

s jednořetězcovými komplementárními konci (tzv. cos místa). Tato místa umožňují

cirkularizaci fágového genomu a tím i jeho replikaci. Po infekci hostitelské buňky se

totiž tyto konce spojí za vzniku kruhové molekuly. Zlomy jsou poté doplněny ligasou

hostitelské buňky na uzavřenou kruhovou DNA, která slouží jako templát pro replikaci

a transkripci. Genom bakteriofága λ může být při lyzogenní infekci integrován

specifickou rekombinací do chromosomu hostitelské buňky. V této formě se stává

součástí genomu dalších buněk infikované populace.

Při lytickém cyklu je fágová DNA velmi účinně replikována. Vzniká velké

množství kopií fágové DNA, které jsou inkorporovány do nově vznikajících fágových

hlaviček. Buňka je poté lyzována a bakteriofágy jsou uvolněny a mohou napadnout

další buňky. Povrchové proteiny, které vykonávají funkci receptorů zodpovědných za

přichycení bakteriofága λ slouží buňce zároveň jako přenašeč maltosy. Vzhledem

k tomu, že syntéza tohoto přenašeče je indukována maltosou, musí být bakterie, které

mají být infikovány bakteriofágem λ kultivovány v mediu obsahujícím maltosu.

Kultivace bakteriofágů se poněkud liší od běžné kultivace bakterií. Při inokulaci

je nutné nejprve smíchat promyté buňky E. coli s bakteriofágem λ a inkubovat v MgSO4

roztoku, který stimuluje sorpci fága na povrch bakterií. Zpravidla je třeba připravit

několik ředění bakteriofága. Po uchycení fágů se suspenze rozmíchá v rozehřátém agaru

vytem-perovaném na 47°C a rychle vylije na povrch agaru na Petriho misce. Po 12-16 h

inkubaci při 37°C se v souvislém bakteriálním nárůstu objeví transparentní zóny tzv.

plaky nebo dvorce. Každý plak je vlastně výsledkem infekce jediné buňky jednou

fágovou částicí. Fágy uvolněné po lyzi napadené buňky mohou v omezeném prostoru

Strana194

migrovat polotuhou agarovou půdou a napadat další buňky v bezprostředním okolí.

Každý plak tedy obsahuje geneticky homogenní populaci bakteriofágů.

V současné době je k dispozici velký výběr bakteriofágových vektorů pro různé

účely. Neexistuje universální vektor, který by splňoval požadavky pro klonování všech

fragmentů DNA, které přicházejí v úvahu. Při výběru bakteriofágových vektorů jsou

nejdůležitější následující kriteria :

Přítomnost vhodných restrikčních míst,

Velikost inzertu, který má být klonován,

Další použití vložené sekvence; např. exprese genu.

Výběr vektoru splňujícího první kriterium není problémem. Jednotlivé vektory

se liší různými kombinacemi restrikčních míst v polyklonovacích úsecích. Větším

problémem zůstává omezení velikosti inzertu. Pro lytický cyklus bakteriofága λ jsou

nutné pouze asi dvě třetiny genomu. Centrální třetina genomu může být nahrazena

inzertem, aniž by byl zasažen životní cyklus fága λ. Jeho životnost však prudce klesá je-

li genom větší než 105% nebo menším než 78% ve srovnání se standardním kmenem. Je

tedy nutné najít vhodnou kombinaci vektoru a inzertu zajišťující optimální délku

genomu. Toto omezení může být využito pro selekci vektorů obsahujících inzert, byla-li

před klonováním z vektoru centrální oblasti odstraněna.

.Obdobně jako u plasmidových vektorů, používají se i u fágových vektorů

genetické markery, umožňující detekci rekombinantních bakteriofágů.

Nejpoužívanějším je výše zmíněný gen pro β-galaktosidasu (lacZ). Rekombinantní

bakteriofágy tvoří bezbarvé plaky, zatímco bakteriofágy postrádající inzert rozkládají

chromogenní substrát a tvoří modré plaky. Kromě detekce pomocí lacZ existují

v případě vektorů obsahujících genom bakteriofága λ dvě selekční metody.

9.5.2 hfl- selekce

Tento typ genetické selekce je založen na využití genu kontrolujícího lyzogenii,

tj. genu cI. Tento gen kóduje λ represor, který se váže na operátory OL a OR, blokující

tanskripci časných genů a tím i lytický růst. λ represor se váže také na vlastní promotor,

čímž stimuluje vlastní transkripci. Tentýž protein tedy působí zároveň jako represor i

aktivátor transkripce. Tento gen je zodpovědný za velmi účinnou indukci lyzogenie

v kmenech E. coli nesoucích mutaci hfl- (high frequency of lysogenisation). Takovýmto

vektorem je např. λgt10. Produkty hfl genů stabilizují produkt genu cII, který je

Strana195

pozitivním regulátorem genu cI. V těchto mutantech se tedy akumulují produkty genů

cI a cII. Výsledkem je potlačení lytického cyklu a velmi účinné navození lyzogenie.

Principem selekce je v tomto případě inaktivace cI genu v němž je uměle vytvořeno

EcoRI restrikční místo. Bakteriofágy, obsahující inzert v tomto genu lyzují hfl- kmeny

E. coli a tvoří zřetelné plaky, zatímco fágy s nepoškozeným cI genem plaky netvoří.

9.5.3 spi- selekce

Tento způsob selekce je založen na faktu, že λ bakteriofág neroste

v lyzogenních, bakteriálních kmenech, nesoucích profága P2, označovaných spi+

(sensitivní k P2 interferenci). Naopak mutantní fágové kmeny neobsahující geny pro

rekombinaci red- a gam- rostou v P2 lyzogenních kmenech a vykazují spi- fenotyp

v rec+ kmenech. Vektory běžně používané pro tento typ rekombinace např. λ2001 nebo

λEMBL3 obsahují fragment s red+a gam+ geny. Tyto vektory netvoří plaky na P2

lyzogenech, dokud nedojde k odstranění red+a gam+ fragmentu a jeho náhradě

fragmentem klonované DNA.

9.5.4 λZAP - bluescript M13

Plasmidy pojmenované bluescript M13+ a bluescript M13- obsahují počátek

replikace bakteriofága M13. Liší se orientací tohoto úseku a v důsledku toho poskytují

v případě infekce bakteriofágem jednořetězcovou DNA buď + nebo - orientace. Mohou

také poskytnout RNA, která je komplementární k jednomu z obou řetězců inzertu,

neboť na koncích polyklonovacího místa obsahují opačně orientované promotory

bakteriofágů T3 a T7 .

9.5.5 Tvorba bakteriofágových plaků

Cílem této metody je stanovit počet jednotek tvořících plaky na ml (pfu/ml –

plaque forming units/ml). Toto stanovení je měřítkem koncentrace infekčních fágů a je

základem pro další práci a přípravu požadované koncentrace fágů pro další práce tak,

aby nedocházelo k překryvu jednotlivých plaků při inkubaci fágů. Nejpoužívanější

metodou je přelivová metoda, jejíž pomocí se sleduje počet vytvořených průzračných

plaků (dvorců) v souvislém nárůstu bakterií na agarové půdě v Petriho misce. Princip

spočívá v tom, že se zředěné suspense bakteriofága resuspendují v roztavené a

vytemperované agarové půdě. Pak se smísí s buňkami citlivého bakteriálního kmene.

Tato směs se aplikuje na Petriho misky, kde po rozprostření vytvoří tenkou vrstvu. Po

Strana196

inkubaci se v místech, kde byly přítomny fágové částice vytvoří transparentní kruhové

zóny, jejichž počet je úměrný koncentraci bakteriofága.

Cv.9.9 Tvorba bakteriofágových plaků

Potřeby : SM – suspensní medium (na litr 5.8 g NaCl, 2 g MgSO4.7H2O, 50 ml 1 M

Tris-HCl [pH 7.5], 0,1 g želatina [Difco]),

LB medium, agar (10g Trypton, 5g Yeast Extract, 5g NaCl, 100µl 10 m

NaOH; doplňte H2O do 1l, pro ztužení přidejte 15g bacto-agaru, sterilujte v autoklávu).

NZY medium, agar, top agarosa (5g NaCl, 2g MgSO4.7H2O, 5g Yeast

Extract, 10g NZ Amine-A [kaseinový hydrolyzát], 300µl 10 m NaOH; doplnit H2O do 1

l, pro ztužení přidejte 15g bacto-agaru, pro vytvoření top agarosy přidejte 7g agarosy,

sterilujte v autoklávu. Po autoklávování, přidejte 50 ml 20% maltosy na litr NZY

Autoklávování může oxidovat maltosu a další sacharidy. Proto musí být maltosa

přidávána ze 20% zásobního roztoku sterilizovaného filtrací.)

Provedení :

1. Kultivujte přes noc kmen E. coli citlivý k bakteriofágu λ do stacionární fáze v λ

mediu obsahujícím maltosu (represor tvorby LamB proteinu, receptoru bakteriofága

λ) a Mg++ ionty (usnadňují adsorpci bakteriofága).

2. Roztavte vrchní agar v mikrovlnné troubě nastavené na odmražení (Uvolněte uzávěr

a kontrolujte var. Když se objeví bubliny opatrně vyjměte láhev a agar promíchejte.

Opakujte do úplného roztavení.) nebo na vroucí vodní lázni (15 min).

3. Ponechte agar zchladnout 5 min při laboratorní teplotě a poté vložte do vodní lázně

na 45°-50°C. Ponechte temperovat dostatečně dlouho; vyšší teplota by usmrtila

buňky.

4. Připravte čtyři sériová ředění (1:100) suspense bakteriofága v SM : 1:100; 1:10 000;

1:1 000 000 a 1:100 000 000.

5. Označte šest mikrozkumavek pro každé ředění bakteriofága a jednu pro kontrolu

bez fága a jednu pro kontrolu obsahujícího bakteriofága bez buněk.

6. Stejným způsobem označte 6 NZY agarových ploten a předehřejte na 37°C.

7. Přidejte po 0,3 ml bakteriální suspense v NZYM mediu do každé z označených

zkumavek s výjimkou poslední kontroly (bez buněk). Do této kontrolní zkumavky

přidejte pouze 0,3 ml sterilního media.

8. Přidejte po 100 µl suspense každého sériového ředění do zkumavek a dále přidejte

po 100 µl SM do dvou kontrolních zkumavek.

Strana197

9. Inkubujte při laboratorní teplotě za mírného třepání po dobu 20 min. Při této

inkubaci se bakteriofág sorbuje na bakteriální povrch.

10. Inkubujte při 37°C po dobu 10 min. Během této doby vnese bakteriofág svoji DNA

do bakteriální buňky.

11. Přidejte 3 ml NZY medium top agarosy do každé zkumavky, mírně zamíchej

vortexováním a nalij na 100 mm NZY agarové misky. Rozprostřete agarosu na

povrchu misek mírným nakláněním.

12. Inkubujte zaočkované misky při 37°C po 8–12 h. Při delší inkubaci by mohlo dojít

k vy-tvoření plaků nadměrné velikosti, což by znamenalo jejich vzájemné

překrývání.

13. Spočtěte vytvořené plaky pro jednotlivá ředění a přepočtěte na pfu/ml zásobní

kultury.

14. Misky mohou být skladovány při 4°C po dobu minimálně jednoho týdne.

Cv.9.10 Příprava lyzátu bakteriofága λ

Potřeby : LB medium (10 mmol MgCl2/10 mmol CaCl2),

NZC medium (na 1 l 10 g NZ Amine-A [kaseinový hydrolyzát],5 g NaCl, 2

g MgCl2.6 H2O; autoklávovat 30 min a poté přidat 5 ml 20% Cjako aminokyselin),

λ zřeďovací pufr (20 mmol Tris.Cl [pH 8], 20 mmol MgCl2).

Provedení :

1. Inkubujte přes noc v LB mediu při 37°C kmen E. coli sensitivní k bakteriofágu λ.

2. Převeďte sterilním párátkem jeden plak do 0,4 ml λ zřeďovacího pufru a ponechte 2

h při 4°C, aby se fág mohl uvolnit.

3. Smíchejte 0,1 ml roztoku fága s 0,1 ml bakteriální kultury a 0,1 ml roztoku

MgCl2/CaCl2.

4. Inkubujte na vodní lázni 15 min při 37°C.

5. Převeďte tento roztok do 50 ml NZC media a inkubujte za intenzivního třepání při

37°C, dokud nedojde k lyzi (cca 6 až 8h; od 6 h je nutno kulturu často kontrolovat a

po vyčeření ihned odstředit).

6. Přidejte několik kapek chloroformu pro lyzi zbylých buněk a převeďte roztok do

nových kyvet. Odstraňte buněčné zbytky odstředěním při15 000 G při 4°C.

7. Lyzát převeďte do nových kyvet, přidejte pár kapek chloroformu a krátce

vortexujte. Uchovávejte při 4°C.

Strana198

9.6 Analýza a manipulace s DNA

9.6.1 Elektroforéza v agarosovém gelu

Elektroforéza v agarosovém či polyakrylamidovém gelu se používá k

identifikaci, separaci a purifikaci fragmentů DNA. Fragmenty DNA jsou děleny v

elektrickém poli v závislosti na jejich velikosti (viz obr. ). Touto metodou může být

detegován až 1 ng DNA. Rozdělené fragmenty DNA lze izolovat přímo z gelu a použít

pro další práce. Volbou typu a koncentrace gelu lze zajistit vhodné podmínky pro dělení

fragmentů v různých rozmezích molekulových hmotností. Standardními agarosovými

gely lze snadno separovat DNA velikostí 0,5 až 25 kb (viz tab.). Dělení větších molekul

již není snadné. V tomto případě lze použít pulsní elektroforézu, kterou lze rozdělit

molekuly o velikosti až 2 000 kb.

Jednotlivé formy DNA o stejné molekulové hmotnosti mají různou pohyblivost.

Nadšroubovicová (superhelikální cirkulární) forma je nejkompaktnější a za standardních

podmínek migruje nejrychleji. Otevřená cirkulární forma se zpravidla pohybuje o něco

pomaleji než lineární forma. Vzájemná pohyblivost je však závislá na podmínkách

elektroforézy, zejména na iontové síle pufru, napětí, koncentraci ethidium bromidu a

množství nadšroubovicových závitů u superhelikální formy.

Tabulka č. Rozmezí molekulových hmotností DNA separovaných v agarosovém gelu

o různých koncentracích agarosy

Koncentrace agarosy Rozmezí molekulových hmotností (% w/v) separace lineárních molekul DNA (kb)

0,3 5 − 60 0,6 1 – 20 0,7 0,8 − 10 0.9 0,5 − 7 1,2 0,4 − 6 1,5 0,2 − 3 2,0 0,1 − 2

Protokol agarosové elektroforézy lze rozdělit do tří fází :

1. Příprava gelu vhodné hustoty, volené tak, aby bylo zajištěno optimální rozdělení

očekávaných fragmentů DNA (viz tab.).

Strana199

2. Vzorky DNA jsou aplikovány do jamek v gelu a děleny za napětí vhodného pro

elektroforézu po dobu odpovídající optimální separaci. Pro dosažení optimálního

rozdělení fragmentů větších než 2 kb se doporučuje napětí odpovídající 5 V/cm (cm

vyjadřují vzdálenost mezi elektrodami.

3. Rozdělení lze monitorovat na základě rozdělení pruhů barviv o známých

molekulových hmotnostech. Pro tento účel se nejčastěji používá bromfenolová

modř, která putuje s fragmenty DNA o hmotnosti cca 0,5 kb a xylen cyanol

zpravidla putující s fragmenty velikosti 5 kb. Takže bromfenolová modř,

odpovídající nejkratším fragmentům je indikátorem délky gelu, v níž došlo

k rozdělení.

4. Gel je barven ethidium bromidem (často je ethidium bromid přítomen již během

elektroforézy). Ethidium bromid je interkalační činidlo, které se váže mezi vlákna

DNA a červeno-oranžově fluoreskuje po ozáření UV zářením o vlnové délce 260-

360 nm. Komplex DNA a ethidium bromidu je vizualizován osvětlením pomocí

zdroje UV záření. V případě přítomnosti ethidium bromidu v gelu a pufru během

elektroforézy, lze pozorovat rozdělení fragmentů ozářením přímo

v elektroforetickém přístroji. Detekce na transiluminátoru je však podstatně

citlivější. V případě potřeby je možno pořídit fotografický záznam pomocí Polaroidu

opatřeného vhodným filtrem.

5. Pro posouzení velikosti jednotlivých fragmentů se používají markery molekulových

hmot-ností, což jsou komerčně dostupné směsi fragmentů DNA definovaných

velikostí. Na obr. jsou velikosti fragmentů nejčastěji používaných markerů a jejich

vzájemnou polohu po rozdělení na gelu o 1%ní koncentraci agarosy.

Strana200

Lambda DNA/HindIII Marker GeneRuler™ 1kb DNA Ladder

OBR. Markery molekulových hmotností fragmentů DNA

Pro dělení malých fragmentů DNA lze použít polyakrylamidový gel (viz. tab.)

nebo speciálně připravenou agarosu (sieving agarose). V obou případech lze fragmenty

z gelu purifikovat (nejčastěji elektroelucí). Elektroforézou v polyakrylamidovém gelu za

denaturujících podmínek lze dělit jednořetězcové molekuly DNA.

Tabulka č.xxx Koncentrace akrylamidu poskytující optimální rozdělení DNA fragmentů

Akrylamid Velikost fragmentů Migrace bromfenolové (%) (bp)modři (bp)

3,5 100 - 1000 100 5,0 100 - 500 65 8,0 60 - 400 45 12 50 - 200 20 20 5 - 100 12

Cv.9.11 Elektroforéza v agarosovém gelu

Potřeby : Agarosa, TBE pufr, markery molekulových hmotností, vzorkový pufr pro

agarosovou elektroforézu

Provedení přípravy gelu :

Strana201

1. Připravte 30 ml 0,7 % agarosy v TBE pufru. Rozvařte agarosu v mikrovlnné troubě.

POZOR! Může nastat prudký var a vzkypění agarosy. Zamíchejte vždy, když začne

roztok vřít!

2. Po dokonalém rozvaření agarosy (rozpuštění plovoucích vloček) ponechte roztok

zchladnout na cca 60°C a nalijte do utěsněné elektroforetické vany. Do zářezů při

okraji gelu vložte hřeben a ponechte gel ztuhnout. Obr. Přístroj pro agarosovouelektroforesu

Příprava a aplikace vzorků

1. Roztok DNA nařeďte 1:1 vzorkovým pufrem a promíchejte.

2. Nalijte 150 ml TBE do elektrodového prostoru tak, aby byl ponořen celý gel.

Vyjměte hřeben. Přidejte do vzorkového pufru po 5 μl roztoku ethidium bromidu

(10 mg/ml) na obě strany gelu a promíchejte špičkou mikropipety. (Pozor! Ethidium

bromid je silný mutagen. Při práci s ním používejte ochranné rukavice a pracujte

opatrně)

3. Pipetujte po 5 μl vzorku těsně nad jednotlivé jamky. Vzorek se díky velké viskozitě

vzorkového pufru snadno usazuje na dně. Do jedné z jamek aplikujte marker

molekulových hmotností (3 μl).

Elektroforetické dělení a detekce nukleových kyselin

1. Uzavřete přístroj a připojte ke zdroji. Dodržujte správnou polaritu indikovanou

barevným označením (DNA má za daného uspořádání záporný náboj a putuje tedy k

anodě). Nastavte konstantní napětí 120 V.

2. Sledujte čelo, tvořené bromfenolovou modří (migruje přibližně rychlostí

srovnatelnou s dvojšroubovicovou DNA délky 300 párů basí). Druhé barvivo

obsažené ve vzorkovém pufru migruje stejně jako DNA délky 4 kb.

Strana202

3. Při dosažení vhodného rozdělení těchto markerů vypněte zdroj a vyjměte gel i s

podložkou. (Pracujte s rukavicemi!).

4. Sesuňte gel na UV transiluminátor. Nasaďte si ochranné brýle a zapněte UV zdroj.

5. V případě potřeby dokumentace, fotografujte gel přístrojem Polaroid. Přibližnou

molekulovou hmotnost lze určit porovnáním s markery (viz. obr. )

10 IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ

Identifikace mikroorganismů a jejich klasifikace, tj. zařazení izolovaného

mikroorganismu do určité skupiny, jinak řečeno taxonomie, je samostatnou disciplinou.

Všechna klasifikační schemata se snaží zařadit organismy do skupin podle jejich

podobných vlastností. Nejlepší klasifikační systémy dávají do skupin ty organismy,

které mají společnou evoluci a vylučují nepříbuzné typy. Podobně jako v taxonomii

rostlin a zvířat je pro bakteriální taxonomii základní jednotkou druh.

Současně užívané systémy jsou založeny na tvaru buňky, typu stěny (Gramovo

barvení) a metabolismu. Jako identifikační biochemické znaky byly vybrány takové

schopnosti, které jsou dobře zjistitelné a jsou poměrně stálé. Všechny tyto znaky lze

shrnout pod označení fenotypických znaků. K určení evolučních vztahů a příbuznosti

druhů se používá porovnání nukleotidových sekvencí DNA a rovněž sekvencí 16S

ribosomální RNA, které patří mezi znaky genotypové. V neposlední řadě se užívají pro

identifikaci immunochemické metody, které jsou jsou založeny na schopnosti proteinů

tvořících bičíky nebo povrchové struktury bakterií (jedná se o antigeny) reagovat se

Strana203

specifickou protilátkou, za vzniku komplexu antigen – protilátka, který bývá indikován

různými způsoby.

Velká většina všech identifikací však probíhá v klinických a potravinářských

laboratořích, kde se jedná o určení rodu a druhu příslušné bakterie a evoluční vztahy

k ostatním organismům nejsou tím nejpodstatnějším, i když v současnosti nabývá na

významu určení specifických genů pomocí polymerasové řetězové reakce (PCR), které

dává výsledky o hodně rychleji, nežli standardní kultivační metody.

Současné taxonomické schéma, které používá nejnovější poznatky, je Bergey´s

Manual of Systematic Bakteriology, který má následující členění:

Svazek1 Gramnegativní organismy mající obecný, lékařský nebo

průmyslový význam

Svazek 2 Grampozitivní organismy, s vyjímkou aktinomycet

Svazek 3 Archebakterie, cyanobakterie a zbývající Gramnegativní

organismy

Svazek 4 Aktinomycety

Kromě popisu organismů obsahují všechny čtyři svazky údaje o ekologii,

metodách pomnožování, kultivačních podmínkách, izolaci mikroorganismu a metody

k jejich udržování a konzervování.

Nejdůležitější a bezpodmínečnou podmínkou při jakémkoli identifikačním

postupu je, abychom studovaný kmen měli v čisté kultuře, nejlépe na šikmém agaru. O

čistotě kultury se přesvědčíme tím, že ji podrobíme některému izolačnímu postupu

(nejčastěji se užívá čárkování na agarovou desku) a pak zjišťujeme shodnost

biochemických testů vybraných izolátů. Biochemické testy využívané pro diagnostiku

bakterií byly vybrané tak, že sledované vlastnosti nevykazují velkou proměnlivost a

výskyt mutantů sledovaného znaku je poměrně vzácný. Přesto však výskyt těchto

mutantů u všech sledovaných znaků v poslední době stoupá v dů-sledku stoupajícího

zamoření životního prostředí mutagenními látkami. Z těchto důvodů se v současných

vyhodnocovacích tabulkách uvádí procento kmenů, které vykazují pozitivní reakci (od

100 až do 0).

Identifikace eukaryotních mikroorganismů (kvasinek a plísní) je větší mírou

založena na morfologických znacích. Výchozí publikací pro taxonomii kvasinek je

publikace „The Yeast“ , Lodder. Klíč k určení rodů kvasinek a zkrácené klíče pro určení

nejdůležitějších druhů jsou uvedeny v knize A. Kockové-Kratochvílové „Kvasinky a

kvasinkovité mikroorganismy“(Alfa, Bratislava,1982).

Strana204

Další klíče pak slouží k určování rodů plísní. Např. v češtině je publikace O.

Fassatiové „Plísně a vláknité houby v technické mikrobiologii“( SNTL, Praha, 1979).

10.1 Biochemické identifikační testy bakterií

Pro potřebu klinických a potravinářských laboratoří byly pro rychlou identifikaci

vybraných skupin mikroorganismů vyvinuty biochemické testy. Biochemické testy

zjišťují schopnost organismů syntetizovat určité enzymy. Jsou používány enzymy pro

asimilaci a zkvašování různých uhlíkatých sloučenin a štěpení dusíkatých látek od

močoviny až po jednotlivé aminokyseliny a bílkoviny. Pro diagnostiku reakce se užívá

celá řada indikátorů, které při pozitivní reakci výrazně mění barvu media. Dříve se proto

soubor těchto testů nazýval pestrá řada.

V současnosti se nepřipravují půdy pro tyto testy individuálně, ale využívají se

soubory testů dodávané různými výrobci. Půdy jsou dodávané nadávkované, vysušené a

pochopitelně sterilní.

Nejužívanější je pro diagnostiku skupiny koliformních bakterií

(Enterobacteriacae) ENTEROtest. Pro diagnostiku aerobních nefermentujících tyčinek

NEFERMtest. Diagnostika stafylokoků se provádí STAPHYtestem apod.

10.1.1 Přehled hlavních testovaných vlastností

1) Test na tvorbu H2S

Některé bakterie uvolňují z aminokyselin obsahujících síru (methionin, cystein)

sulfan (sirovodík). K detekci se užívá komplexní půda s glukosou a solemi železa nebo

se solemi dalších těžkých kovů (Pb, Bi). V pozitivním případě vytvořený sulfan,

pocházející ze sirných aminokyselin peptonu, reaguje s ionty železa a dává vznik

tmavo-šedému až černému sulfidu(sirníku). Reakce se odečítá přímo. Tvorba sulfanu je

charakteristická pro hnilobné bakterie, které jsou nežádoucími kontaminanty

v potravinářském průmyslu.

2) Voges-Proskauerův test - VPT

HS_CH2_CH_COOH

NH2

CH3_CH_COOH

NH2

+ H2S

Strana205

Tato reakce nazvaná podle svých objevitelů detekuje tvorbu diacetylu, neboli

acetoinu, (vzniká oxidací acetylmethylkarbinolu) a guanidinových zbytků peptonu.

K průkazu se po nárůstu napřed přidává KOH (roztok VPT I.) a pak α-naftol (VPT II.).

Pozitivní reakce dává vznik červenému zabarvení, které se projeví do 20 minut. Reakce

je typická pro rod Enterobacter.

3) Test zjišťování tvorby indolu – IND

Některé bakterie na půdě bohaté na pepton tvoří z tryptofanu indol. Jeho tvorba

je závislá na zvýšeném obsahu tryptofanu v mediu a vyžaduje nepřítomnost glukosy.

Přítomnost indolu se indikuje přídavkem p-dimethylaminobenzaldehydu, se kterým

tvoří sytě růžový reakční produkt. Pozitivní reakce je typická pro Escherichia coli.

4) Test zjišťování dekarboxylace lysinu – LYS

Jedná se o reakci, která potvrzuje přítomnost lysindekarboxylasy. Test se

provádí v nutričně bohaté půdě s přídavkem lysinu a barviva bromkresol purpuru, který

v pozitivním případě dává čevenofialové zbarvení. Enzym je specifický pro danou

aminokyselinu a působí nejlépe za anaerobních podmínek

5) Test zjišťující schopnost růst na citrátu, jako jediném zdroji uhlíku – SCI

Test využívá půdy nazvané podle svého objevitele Simmonsův citrát. Jako

indikátor růstu je použita bromthymolová modř. Pozitivní reakce dává modré nebo

modrozelené zbarvení.

6) Test k zjištění dekarboxylace ornithinu – ORN

N N

H

CH2_CH_COOH

+ H2O + CH3_CO_COO-

+ NH4+

NH2

H

NH2_CH2

_CH2_CH2

_CH2_CH_COOH

NH2

NH2_CH2

_CH2_CH2

_CH2_CH2

_NH2

+ CO2

Strana206

Jedná se o reakci, která potvrzuje přítomnost ornithindekarboxylasy . Enzym je

specifický pro danou aminokyselinu a působí nejlépe za anaerobních podmínek Test se

provádí v nutričně bohaté půdě s přídavkem ornithinu a barviva bromkresol purpuru,

který v po-zitivním případě dává čevenofialové zbarvení.

7) Test na potvrzení přítomnosti ureasy – URE

Přítomnost enzymu ureasy se testuje na půdě s přídavkem močoviny. Pozitivní

reakce dává červené probarvení (fenolová červeň) reakční směsi, které se objeví

v důsledku alkalické reakce způsobené uvolňovaným NH3.

H2N-CO-NH3 2 NH3 + CO2

8) Test průkazu β-galaktosidasy

Úkolem testu je zjištění produkce enzymuβ-galaktosidasy. Tvorba enzymu se

detekuje na syntetickém substrátu o-nitrofenylgalaktosidu (ONPG), který působením

enzymové hydrolysy uvolňuje žlutě zbarvený nitrofenol.

9) Test na přítomnost lipasy – LIP

Reakce určuje, zda je degradována povrchově aktivní látka Tween 80

(polyoxyethylen sorbitan monooleát), která slouží jako modelový lipid. V přítomnosti

lipolytických enzymů vzniká díky přidanému indikátoru tyrkysové zbarvení.

10) Test zkvašování manitolu – MAN

Cílem testu je zjistit zkvašování manitolu. V pozitivním případě vzniklé

organické kyseliny způsobí změnu barvy acidibasického indikátoru, tj. reakční směs

zežloutne.

11) Test zkvašování inositolu – INO

Cílem testu je zjistit zkvašování inositolu. V pozitivním případě vzniklé organické

kyseliny způsobí změnu barvy acidibasického indikátoru, tj. reakční směs zežloutne

NH2_CH2

_CH2_CH2

_CH_COOH

NH2

NH2_CH2

_CH2_CH2

_CH2_NH2

+ CO2

Strana207

12) Test průkazu deaminace fenylalaninu – FEN (PHE)

Sleduje se deaminace fenylalaninu, který přidaný do testovací půdy. Přidáním

činidla (okyselený roztok FeCl3) se prokazuje pozitivní reakce, neboť směs se

tmavozeleně zabarví.

13) Test dekarboxylace argininu – ARG

V tomto testu se ověřuje aktivita enzymu arginin dihydrolasy. Enzym je

specifický pro danou aminokyselinu a působí nejlépe za anaerobních podmínek.

V případě rozkladu argininu se reakční směs zbarví sytě modře.

14) Test utilizace malonátu – MAL

Cílem testu je zjistit využití malonátu pro růst. V pozitivním případě vzniklé

organické kyseliny způsobí změnu barvy acidobazického indikátoru, kterým je v tomto

případě bromthymolová modř – reakční směs je sytě modrá.

15) Test rozkladu eskulinu - ESL

V tomto testu se sleduje tvorba degradačních produktů eskulinu, které mají

tmavohnědé zabarvení. Vývoj temně hnědého zabarvení je pozitivním průkazem

rozkladu eskulinu.

16) Testy na zkvašování dalších cukrů.

V řadě komerčních testů je připravena cela řada dalších cukrů, která slouží

k testování schopnosti mikroorganismů je zkvašovat. Jsou to hlavně tyto látky: adonitol

CH2_CH_COOH

NH2

CH2_CH2

_COOH

+ NH3

NH2

NH=C NH CH2_CH2

_CH2_CH_COOH

NH2

NH=C_NH_CH2_CH2

_CH2_CH2

_NH2

NH2 + CO2

Strana208

(ADO), cellobiosa (CEL), sacharosa (SUC), trehalosa (TRE), sorbitol (SOR), rhamnosa

(RHA), melibiosa (MLB), rafinosa (RAF), dulcit (DUL) a pochopitelně glukosa (GLU).

K detekci se používají acidobazické indikátory, které v pozitivním případě, tj. tvorbě

organických kyselin mění zabarvení reakční směsi.

10.1.2 Další biochemické testy

1) Hydrolýza škrobu

Škrob je polysacharid, který je štěpen působením amylas na dextriny a případně

až na maltosu (disacharid), která slouží mikroorganismům jako zdroj utilisovatelného

uhlíku. Řada mikroorganismů produkuje extracelulární enzymy typu α-amylasy nebo β-

amylasy. Principem stanovení je skutečnost, že nativní škrob se barví roztokem jodu

modře, delší dextriny jsou červenohnědé a oligosacharidy nedávají s roztokem jodu

žádné zabarvení.

Cv.10.1 Hydrolýza škrobu

Potřeby : 24h staré kultury bakterií, Petriho miska se škrobovým agarem (půda č.XY),

Lugolův roztok (roztok č. XX), kontrolní mikroorganismus (např. Bacillus subtilis).

Provedení :

1. Rozděl misku na dvě poloviny čarou po vnější straně dna micky. Jednu polovinu

zaočkuj rovnou čárkou zkoumanou kulturou, na druhou zaočkuj testovací kmen.

2. Inkubuj 48 h při 30 oC.

3. Po inkubaci polij povrch živné půdy s narostlou kulturou Lugolovým roztokem a

pozoruj, zda vznikájí nezbarvené zóny kolem povrchu kolonií (hydrolýza škrobu).

Půda s nerozloženým škrobem se barví intensivně modře. Výsledky je nutné

odečítat ihned, protože modré zbarvení škrobu po krátké době mizí.

2) Test na proteolytickou činnost bakterií (ztekucování želatiny )

Želatina je bílkovina získávaná hydrolýzou kolagenu. Při rozpouštění ve vodě

tvoří gel, který se působením extracelulárních proteas některých bakterií rozpouští,

želatina „ztekucuje“. Rozklad želatiny může být blokován přítomností glukosy, proto

Strana209

test provádíme v bezcukerném mediu (nejčastěji masopeptonová želatina - MPŽ), buď

klasickou metodou vpichu do MPŽ a poměrně dlouhou inkubací při laboratorní teplotě,

přičemž sledujeme také způsob ztekucení želatiny, nebo modernějšími metodami, které

používají agarovou půdu s 0,4 váhovými % želatiny. Rozklad želatiny je na agarové

půdě detekován po inkubaci silným okyselením půdy, nebo nasyceným roztokem

(NH4)2SO4.

Cv.10.2 Test na ztekucování želatiny

A)

Potřeby : 24 h staré kultury bakterií, zkumavky s MPŽ (půda č.XZ), kontrolní

mikroorganismus (Bacillus subtilis)

Provedení :

1. Zaočkuj vpichem želatinovou půdu a inkubuj při laboratorní teplotě (příp.30 oC) po

3-5 dní. Jednu nezaočkovanou zkumavku inkubuj jako kontrolu.

2. Po inkubaci ochlaď zkumavky v lázni se studenou vodou, nebo v chladničce a sleduj

přítomnost ztekucení až po ochlazení. U zkumavky inkubované při laboratorní

teplotě urči tvar ztekucení podle obr. ( 55)

Obr.55 (str 161)zobrazuje 4 zkumavky s následujícími typy ztekucení: a) miskovité, b)

nálevkovité, c) pytlovité, d) vodorovné.

B) Potřebné : 24 h staré kultury bakterií, Petriho misky s MPA a 0,4% želatiny (půda

č.XX), 10% kyselina octová nebo nasycený roztok (NH4)2SO4, kontrolní organismus

(Bacillus subtilis).

Provedení : 1. Naočkuj sledovaný mikroorganismus technikou čárkování na Petriho misku se

živnou půdou. Inkubuj 2–3 dny při optimální růstové teplotě.

2. Po inkubaci nalej na misku roztok octové kyseliny nebo nasycený roztok

(NH4)2SO4. Jestliže došlo k enzymovému rozkladu želatiny, objeví se kolem kolonií

projasněné zóny.

3. V místech, kde želatina zůstala beze změny, se půda mléčně zakalí. Reakce se

síranem amonným probíhá pomalu, odečítání provádíme za 15 – 30 minut, při

použití kyseliny octové je možno reakci odečítat ihned.

Strana210

3) Hydrolýza kaseinu

Kasein je základní složkou bílkovin mléka. Nativní kasein tvoří koloidní

suspenzi, která je příčinou neprůhledně bílé barvy mléka. Některé bakterie tvoří

proteolytické enzymy schopné rozkládat tuto bílkovinu na kratší úseky, které jsou

rozpustnější a v roztoku průsvitnější, a jsou označované jako peptony. Tato reakce se

někdy nazývá peptonizace.

Cv.10.3 Peptonizační test

Potřeby : Petriho miska s kaseinovým agarem (půda č.xx), 24 h staré kultury bakterií,

kontrolní mikroorganismus (Bacillus subtilis).

Provedení : 1. Zaočkuj testovanou bakterii v rovné čáře na misku s kaseinovým agarem a inkubuj

při 48 h při optimální růstové teplotě. Kontrolní mikroorganismus naočkuj na

zvláštní misku.

2. Po inkubaci sleduj tvorbu vyjasněných zón kolem kolonií vyrostlých na agarové

půdě, které indikují tvorbu proteolytických enzymů.

Poznámka :

Vyjasněné zóny se nejlépe pozorují proti tmavému pozadí.

4) Redukce peroxidu vodíku

Většina aerobních bakterií tvoří enzym katalasu, který rozkládá toxický peroxid

vodíku na vodu a molekulární kyslík. Anaerobní bakterie většinou tento enzym netvoří.

Přítomnost katalasy dokazujeme v MPB, do kterého po inkubaci přidáváme peroxid

vodíku. Za přítomnosti katalasy se vyvíjí plyn (ve formě bublinek).

Cv.10.4 Test na přítomnost katalasy

Potřeby : 24 h stará kultura bakterií, zkumavky s MPB (půda č. XZ.), 3 % roztok

peroxidu vodíku, kontrolní mikroorganismus Escherichia coli.

Provedení :

1. Zaočkuj zkumavku kulturou bakterií a inkubuj při optimální teplotě 48 hod.

2. Po inkubaci přidej do zkumavky 1 ml peroxidu vodíku a nech 15 min stát. Zatřepej

zkumavkou, přítomnost katalasy se projeví unikáním plynu ve formě bublinek :

Strana211

2 H2O2 2 H2O + O2

5) Hemolytická činnost bakterií

Některé bakterie, zvláště pak pathogenní, mají schopnost rozkládat červené

krevní barvivo hemoglobin tak, že se ztrácí červená barva krve (hemolýza). Primárním

místem, které obsahují hemolytické enzymy jsou červené krvinky, ale některé

hemolysiny napadají i jiné buňky. Na deskách s krevním agarem je možné pozorovat

dvojí typ hemolýzy:

1. α- hemolýza (alfa reakce), při které dochází k úplnému rozrušení červených krvinek

a kolem kolonií narostlých na krevním agaru se vytvoří vyjasněné průsvitné zóny;

2. β - hemolýza (beta reakce), při které dochází jen k částečnému rozložení hemo-

globinu a za přítomnosti H2S vzniká zelenohnědý pigment methemoglobin.

Cv.10.5 Hemolytický test

Potřeby : 24 h stará kultura bakterií, Petriho miska s krevním agarem (půda č.xz),

kontrolní mikroorganismus Staphylococcus aureus.

Provedení :

1. Na povrch krevního agaru načárkuj zkoumaný kmen bakterií a inkubuj při 37oC, po

dobu 24–48 hod.

2. Pozoruj typ hemolýzy a urči její typ.

Poznámky :

1. U rodu Staphylococcus se označení hemolýzy používá k rozlišení hemolytické

aktivity. Vůči beraním nebo králičím erythrocytům je α.hemolýza.

2. Proti lidským erythrocytům označuje se δ.

3. Chladové hemolýzy beraních erythrocytů je β.

4. Jako γ-reakce se označují případy, při nichž k hemolýze nedochází, netvoří se žádné

zóny.

10.1.3 Identifikační soupravy

V klinických a kontrolních potravinářských laboratořích se zvyšují nároky na

mikrobiologické vyšetření vzorků, a to především z hlediska identifikace přítomných

Strana212

bakteriálních druhů. Tyto stoupající požadavky se dají zvládnout použitím

diagnostických souprav, které značně zrychlují a usnadňují práci těchto laboratoří.

Diagnostické soupravy se na světovém trhu začaly objevovat již v sedmdesátých letech

a principy na nichž jsou založeny se neustále vyvíjejí. Diagnostické soupravy mají

několik společných rysů :

a) Mají dostatečně dlouhou skladovací dobu (obvykle 6 –12 měsíců).

b) Používají mikrometody, což šetří laboratorní sklo, kultivační půdy, energii i

požadavky na personál.

c) V jedné diagnostické soupravě je sdruženo deset až více než dvacet testů.

d) Testy jsou jednoduché a snadno se provádějí, neboť odpadá příprava půd.

e) K urychlení interpretace výsledků slouží diagnostické tabulky.

f) Firmy, které dodávají testy na trh zaručují možnost telefonické konsultace ve

sporných případech.

g) K vyřízení těchto případů používají počítačových databazí a údajů z vlastní

databanky.

h) Toto vše platí v případě, že je k identifikaci použita čistá kultura,

nekontaminovaná doprovodnou mikroflorou.

V současné době se vyrábí již desítky systémů zavedených v mnoha zemích. Za

všechny uvádíme české soupravy od firmy LACHEMA, dále pak API systém, bio-

Merieux a ENTERO-tube. Ze všech těchto firem má API systém nejširší sortiment

souprav pro různé skupiny bakterií, největší banku dat a také pro identifikaci bakterií

pomocí počítače (API-LAB), což v roce 2000 zavedla i LACHEMA.

10.2 Amplifikace DNA in vitro pomocí polymerase chain reaction (PCR)

Polymerase chain reaction (polymerasová řetězová reakce neboli PCR) je

enzymová metoda sloužící k rychlé syntéze velkého množství definovaného úseku DNA

in vitro. Tato metoda, podobně jako molekulové klonování, umožnila řadu

experimentálních přístupů, jež byly dříve neproveditelné a počet aplikací PCR neustále

vzrůstá. PCR nachází uplatnění, např. při detekci patogenních či kontaminujících

mikrobiálních kmenů, syntéze fragmentů DNA pro klonování do expersních vektorů na

základně chromozomální DNA nebo cDNA při in vitro mutagenezi pro přímé

Strana213

klonování, prenatální diagnostiku dědičných chorob, analýzu alelických sekvenčních

změn a sekvenování DNA. Vzhledem k vysoké citlivosti detekce je možné PCR použít

pro zjištění přítomnosti specifických sekvencí DNA či RNA, a tak detegovat jinak

nezjistitelné množství kontaminujících biologických vzorků. Základem úspěšné reakce

je použití neporušeného úseku DNA, který má být amplifikován (pomnožen). Velmi

důležitým předpokladem pro úspěšnou reakci je navržení vhodných primerů tak, aby

byla zajištěna specifita reakce. Jak návrh oligonukleotidových primerů, tak

programování reakčních kroků vychází z obecné znalosti struktury DNA a ze znalosti

sekvence, k níž jsou příslušné oligonukleotidy komplementární.

Pomocí PCR lze syntetizovat část DNA, pro níž jsou k dispozici

oligonukleotidové primery komplementární k 3´a 5´ koncovým sekvencím úseku, jenž

má být amplifikován. Tato metoda poskytuje až 106

násobné pomnožení během 2-3 h.

Jednotlivé kroky amplifikace zahrnují :

1) denaturaci templátu

2) připojení primerů

3) extensi připojených primerů DNA polymerasou

Opakování těchto kroků vede k syntéze segmentu definovaného primery, které

jsou inkorporovány do nově vznikajících molekul. Fragmenty této délky tvoří hlavní

produkt reakce, ale kromě toho vznikají i delší fragmenty DNA (viz obr. ). Jejich podíl

se však v průběhu reakce snižuje. Při prvním reakčním cyklu vznikají delší fragmenty,

než odpovídá vzdálenosti vymezené zvolenými primery. Ve druhém cyklu poskytují

tyto molekuly fragmenty DNA požadované délky, jejichž podíl exponenciálně roste

v následujících krocích reakce. Delší molekuly budou produkovány i nadále, ale jejich

množství bude stoupat pouze lineární rychlostí. Doba zdvojení odpovídá jednomu cyklu

denaturace templátu, připojení a extenze primeru.

Vzhledem k tomu, že je při každém cyklu DNA zahřívána na vysokou teplotu

(kolem 95°C), byl možný rozvoj této metody až po objevu termostabilních DNA

polymeras, které nejsou touto teplotou inaktivovány. Použití termostabilní DNA

polymerasy (Taq DNA polymerasa z termofilní bakterie Thermus aquaticus) zajišťuje

dostatečnou aktivitu enzymu po celou dobu amplifikace. Taq DNA polymerasa má

teplotní optimum při 75°C a poločas inaktivace je přibližně 40 min při 95°C. Jedná se o

enzym, který má pouze 5´-3´ polymerasovou aktivitu a postrádá 3´-5´ exonukleasovou

Strana214

aktivitu. Taq polymerasa může inkorporovat dUTP místo dTTP, čehož lze využít

k zabránění kontaminace produkty PCR.

Kromě tohoto enzymu jsou používány také Tth DNA polymerasa a Pwo DNA

polymerasa. Tth DNA polymerasa je enzym izolovaný z bakterie Thermus

thermophilus, který má stejné teplotní optimum jako Taq DNA polymerasa. Předností

tohoto enzymu je jeho schopnost působit i jako reversní transkriptasa a tedy možnost

přípravy cDNA. Kombinace reversní transkripce a amplifikace jejího produktu se

zkráceně nazývá RT-PCR. Tato metoda slouží k detekci, kvantifikaci, klonování a

analýze genové exprese na úrovni RNA.

Pwo polymerasa má kromě 5´-3´ polymerasovou aktivitu také 3´-5´

exonukleasovou aktivitu. Tato aktivita zajišťuje zvýšení přesnosti syntézy (cca 10×

přesnější ve srovnání s Taq DNA polymerasou). Přesnost in vitro polymerace je jedním

z nejdůležitějších parametrů při PCR. Je-li použita k amplifikaci sekvence dlouhé 200

párů basí Taq DNA polymerasa, jejíž frekvence inkorporace chyb je cca 2×10-4

chyb/basi, bude při 106 amplifikací obsahovat cca 56% amplifikačních produktů jednu

nebo více nesprávně inkorporovaných basí. Vysoká přesnost PCR produktů je

vyžadována především pro :

Klonování fragmentů,

studium alelického polymorfismu jednotlivých RNA transkriptů,

charakterizace jednotlivých buněčných populací v kultuře,

charakterizace málo častých mutací ve tkáni.

Všechny zmíněné termostabilní DNA polymerasy mohou inkorporovat i

modifikované base

Cv.10.6 Polymerase chain reaction (PCR) Potřeby : viz reakční směs

Provedení :

1. Pro každou reakční směs pipetujte následující množství individuálních komponent :

μl 10 x pufr : 500 mM Kcl,

100 mM Tris.Cl, pH8,4,

15 mM MgCl2,

200 μg/ml želatina,

2 μl směs dNTP,

Strana215

po 1 μl primery,

5 μl templátové DNA (podle koncentrace),

voda - doplnit na 49 μl.

2. Denaturujte 3-4 min při 94°C, přidejte 1 μl Taq polymerasy a spusťte následující

pro-gram : 45 s při 94°C

1 min při 50°C

2 min při 68°C

Tento cyklus opakujte 37×.

Reakční produkt analyzujte pomocí elektroforézy v agarosovém gelu.

10.3 Imunologické metody

Pro identifikaci a izolaci pathogenních mikroorganismů, byla vyvinuta celářada

imunologických metod, umožńujících efektivní kontrolu průběhu onemocnění vyvo-

laného těmito mikroorganismy a stanovení přítomnosti toxigenních mikroorganismů

v prostředí, zejména v potravinách, imunochemickým stanovením vyprodukovaných

toxinů. Imunologických metod se využívá také při serologické identifikaci a typizaci

některých mikroorganismů.

Pathogenita , znamená schopnost mikroorganismů způsobit onemocnění a je

specifickou vlastností určitých druhů mikroorganismů (např. Corynebacterium

diphtheriae je původcem záškrtu). Jednotlivé kmeny určitého pathogenního druhu mají

rozdílnou schopnost napadat hostitele, jedná se o různou virulenci kmenů téhož druhu

(kmeny Corynebacterium diphtheriae mohou být virulentní nebo nevirulentní).

Virulence pathogenního kmene je určena dvěma faktory:

a) schopností množení v těle hostitele,

b) schopností produkovat škodlivé látky – toxiny.

Proniknutí mikrobiálního parazita do buňky hostitele vede k indukci specifické

obranné reakce, imunologické reakce. Hostitelský organismus reaguje na přítomnost

cizích buněk tvorbou obranných látek – protilátek, což jsou bílkoviny globulinového

typu, produkované specifickými krevními buňkami – lymfocyty. Protilátky mají

schopnost specifické vazby na molekuly, struktury nebo buňky, které primárně

indukovaly jejich tvorbu a které souhrně označujeme jako antigeny (imunogeny).

Strana216

Antigenní povahu mají prakticky všechny bílkoviny, řada polysacharidů, lipidy a

nukleotidy, jsou-li vázané na bílkoviny. Nízkomolekulární látky s antigenními

vlastnostmi nazýváme hapteny, jsou aktivizovány navázáním na makromolekulární

nosič (nejčastěji serový albumin). Hapteny specificky reagují s odpovídajícím místem

na molekule protilátky.

Reakce antigenu s protilátkou může být sledovaná in vitro různými metodami.

Protilátky v krevním seru se prokazují různými kvalitativními i kvantitativními

sérologickými reakcemi pomocí známých antigenů, s kterými specificky reagují (např.

mikroorganismy o známých antigenních vlastnostech). Naopak lze identifikovat různé

mikroorganismy, jsou-li k dispozici specifické protilátky proti jejich povrchovým bíl-

kovinám s antigenními vlastnostmi. Při reakci antigenu s protilátkou, vznikají

zesíťované struktury, které jsou často viditelné pouhým okem. Podle typu reakce

rozeznáváme :

a) aglutinaci (antigen má korpuskulární charakter, nejčastěji bakterie),

b) precipitaci (antigen je molekulární povahy – exotoxiny, viry),

c) fixace komplementu jedná se o vazbu komplementu (součást krevního sera) na

komplex antigen-protilátka, působí lyzi antigenu, např. bakteriální buňky.

10.3.1 Aglutinační reakce

Aglutinační reakce mezi homologickou protilátkou a korpukulárním antigenem

probíhá v přítomnosti elektrolytu, (většinou fyziologický roztok). Po smíchání suspenze

buněk (bakterie) s příslušnou protilátkou (antiserem) dochází ke shlukování –

aglutinaci buněk. Při použití standardní suspenze buněk a serie ředění protilátky se

může titrací stanovit množství protilátky v antiseru. Antisera obsahující protilátky se

připraví injikováním antigenu (např. Salmonella \sp.) do pokusného zvířete (krysa,

králík). Po určité době se z krve imunizovaného zvířete připraví serum, které obsahuje

příslušné protilátky.

Aglutinačními testy lze z antibakteriálních protilátek stanovit jen protilátky proti

povrchovým antigenům obsaženým v buněčné stěně, v bičíkách nebo v pouzdrech.

Extrahované, koloidní antigeny musí být před vlastní reakcí adsorbovány na inertní

nosiče.

Strana217

Aglutinační reakce lze využít pro serologickou identifikaci a typizaci bakterií

(např. rodu Salmonella nebo Campylobacter ), nebo naopak při použití známého kmene

lze určit přítomnost protilátek v krevním seru (Widalův test pro stanovení protilátek

proti enterobakteriím a ostatním G- tyčinkám).

Nejjednodušší metodou provedení aglutinačního testu je sklíčková metoda.

Cv.10.7 Sklíčková metoda

Potřeby : 24 h stará kultura testované bakterie na šikmém agaru, fyziologický roztok,

testované antiserum, podložní sklíčka, pipety.

Provedení :

1 Na podložním skle dokonale rozetři 1–2 kličky agarové kultury zkoumaného kmene

v několika kapkách fyziologického roztoku tak, aby vzniklá suspenze byla mléčně

zakalená.

2 Na delší podložní sklíčko nanes několik kapek této suspenze (4–5 kapek).

3 K suspenzi přidej větší kapku tetovaného antisera a směs dobře promíchej párátkem

nebo kličkou a nakláněním sklíčka.

4 Proti černému pozadí sleduj vytvoření shluků – aglutinace.

Poznámka :

Pro zvýraznění reakce lze bakterie obarvit. Sklíčkového aglutinačního testu lze

využít pro serologické stanovení pathogenních vlatností různých druhů průmyslově

využívaných kmenů rodu Saccharomyces ( S. cerevisiae, S. uvarum, S. elipsoideus )

10.3.2 Precipitační reakce

Precipitační testy se používají k průkazu přítomnosti nebo titru protilátek proti

koloidním, rozpustným antigenům, především bakteriálním exotoxinům, cizorodým

proteinům a virům. Ve srovnání s aglutinací vyžaduje tato reakce výrazně vyšší

množství molekul protilátky, aby došlo ke vzniku sraženiny vizuálně detekovatelné.

Precipitaci lze zkoumat ve zkumavkách (prstencový test) nebo v agarovém gelu

(imunodifuse podle Ouchterlonyho-imunoelektroforesa).

a. prstencový test

Tímto testem lze kvalitativně, popř. kvantitativně, určit titr protilátek i antigenu.

Do tenké trubičky nebo zkumavky, pro větší stabilitu upevněné v plastelině, se

napipetuje příslušné množství zkoumaného antisera, které se převrství antigenem proti

Strana218

němuž sledujeme tvorbu protilátek. V pozitivním případě se za několik sekund až

minut, ale někdy i hodin vytvoří na syčné ploše precipitační prstenec, zřetelný proti

tmavému pozadí. Je-li však v seru silný nadbytek protilátek, k precipitaci nedojde a

získáme chybný negativní výsledek.

Při kvantitativním stanovení se geometrická řada ředění vyšetřovaného sera

převrství stejným množstvím antigenu. Titr protilátek se posuzuje podle toho , v kterém

zředění se ještě vytvořil precipitát. Stejným způsobem lze stanovit i titr antigenu při

konstantní koncentraci sera a proměnné koncentraci antigenu. Důležité je, přidávat

roztoky antigenu do zkumavky opatrně, nejlépe stékáním po stěnách, aby se tak

zabránilo smíchání antigenu se serem.

b. Ouchterlonův imunodifuzní test

Tato metoda je kvalitativní a je charakterizovaná tzv. dvojitou imunodifuzí – obě

složky reakce, protilátka i antigen, difundují proti sobě v agarovém gelu různou

rychlostí, která je ovlivněna koncentrací antigenu, protilátky a vlastností gelu. V místě

svého styku tvoří precipitační zóny, jejichž počet závisí na množství komponent

antigenu a na tom, proti kolika z nich jsou ve vyšetřovaném seru protilátky.

Cv.10.8 Ouchterlonův imunodifuzní test

Potřeby : Petriho miska s Ouchterlonovým agarem (půda č. RT), korkovrt, pipety,

sera a antisera dle výběru asistenta.

Provedení :

1 V agaru na Petriho misce vyřízni korkovrtem jamky dle obr. 48 tak, aby centrální

jamka byla 5–8 mm vzdálena od jamek okrajových.

2 Do centrální jamky pipetuj antiserum (protilátku) v množství 20–50 μl , v závislosti

na velikosti jamek. Do okrajových jamek napipetuj dle návodu asistenta buď různé

koncentrace sledovaného sera nebo různá sera.

3 Inkubuj při 37oC a sleduj tvorbu precipitačních zon po dobu 7 dní každý den.

Metodu lze použít i pro stanovení toxigenity mikrobiálních kultur. V tom případě se

pipetuje do centrální jamky vhodně ředěný antitoxin účinný proti toxinu, jehož

přítomnost má být prokázána. Jedna nebo dvě protilehlé jamky se naplní

referenčním toxinem a ostatní jamky filtráty bujonových kultur zkoumaných kmenů.

V případě, že mikrobiální kmen produkuje několik serotypů toxinu, lze k testování

použít směs protilátek. Misky se inkubují v prostředí nasyceném vodní parou 24 h

při 37oC nebo 25oC.

Strana219

4 Vyhodnocení se provádí sledováním precipitačních zon a srovnáním se zonami,

které vznikají mezi protilátkou a referenčním toxinem. Je-li toxin shodný s refe-

renčním, přecházejí čáry plynule do sebe. Nejsou-li shodné, kříží se. Možné případy

pro bivalentní protilátku a dva toxiny viz obr. 49.

obr.48 (str 121) Rozložení jamek při imunodifuzní metodě PL – protilátka, SA – standardní antigen, A – určovaný vzorek antigenu

Obr. 49 Tvorba precipitačních zon v případě bivalentní protilátky a kombinací

dvou odpovídajících antigenů

Poznámka :

Důležitý předpoklad pro použití této metody jsou vhodné koncentrace používaného

antigenu a protilátky, protože precipitát vzniká pouze při jejich optimální konventraci

(tzv.zona ekvivalence).

10.3.3 Imunoelektroforeza

Difuzi antigenu a protilátky v agarovém gelu lze urychlit působením

stejnosměrného elektrického proudu. Z těchto důvodů se vlastní precipitační reakce

kombinují s elek-troforetickými metodami. Imunoelektroforéza a protisměrná

imunoelektroforéza patří mezi kvalitativní metody, kdežto jednoduchá

elektroimunodifuze (tzv. raketová elektroforéza dle laurella) a dvojrozměrná

imunoelektroforéza patří mezi metody kvantitativní.

10.3.4 Komplement – fixační reakce

Touto reakcí se ve vyšetřovaném seru prokazuje přítomnost specifických

protilátek (lysinů) proti bakteriím, virům, parasitům a jiným buněčným antigenům. Při

reakci antigenu s protilátkou vzniká komplex, na který se váže nespecifická součást sera

– komplement. Výsledkem je lyze antigenu, která je jen ve výjimečných případech

detekovatelná vizuálně (např. v případě červených krvinek).

Komplement je nestabilní thermolabilní komplex bílkovin obsažený v krevním

seru teplokrevných živočichů.

Strana220

Lyze bakterií, virů a dalších specifických i nespecifických koloidních antigenů

není makroskopicky prokazatelná a dokazuje se nepřímo průkazem nepřítomnosti

volného komplementu přídavkem hemolytického systému obsahujícího červené krvinky

(beraní a králičí serum) obsahující hemolyzin proti těmto krvinkám.

Cv.10.9 Fixační reakce

Potřeby : sterilní zkumavky, pipety, sera a antisera dle výběru asistenta.

Provedení :

1. Vyšetřované serum zahřej na 56oC po dobu 30 minut, aby se inaktivoval

komplement přítomný v seru v nekonstantním množství.

2. K inaktivovanému seru (0,2 ml) ve zkumavce přidej 0,5 ml naředěného

komplementu (čerstvé serum z krve morčete), které obsahuje o něco více než 2

hemolytické jednotky (hemolytická jednotka je množství komplementu zjištěné jeho

titrací, které právě rozpustí používaný hemolytický systém).

3. Přidej 0,5 ml antigenu.

4. Promíchej a inkubuj při teplotě 37oC 1 h ve vodní lázni.

5. Přidej 0,5 ml hemolytického systému – směs stejných objemů 2% suspenze beraních

krvinek a hemolyzinu.

6. Inkubuj 15 – 30 minut při teplotě 37oC.

7. Pozoruj reakci ve zkumavkách a vyhodnoť:

a) Jestliže byly ve vyšetřovaném seru přítomny protilátky, komplement se

naváže na komplex antigen – protilátka a k hemolyze krvinek nedojde.

b) V případě, že v seru protilátky přítomny nejsou, komplement zůstane volný

a po přidání hemolytického systému se podílí na rozkladu červených

krvinek.

Při reakci je nutno současně provádět kontrolní měření: se standardním pozitivním

serem :

Kontrolu sera přidáním antigenu,

kontrolu antigenu bez přidání sera,

kontrolu komplementu :

• komplement s hemolytickým systémem – (pozitivní reakce),

• kontrola krvinek (v ředícím roztoku) – (negativní rekce).

Poznámka :

Strana221

K ředění používáme fyziologický roztok s veronalovým pufrem. Komplement

fixační reakce se využívá k serologickému vyšetřování řady bakteriálních, virových a

parazitárních onemocnění. Tato metoda má hlavní uplatnění v klinické mikrobiologii a

je zde uváděna pro získání přehledu používaných imunologických metod.

10.3.5 Imunofluorescence

Pro stanovení přítomnosti pathogenního nebo kontaminujícího mikroorganismu

ve směsné kultuře lze s výhodou použít imunofluorescenční techniku. Využívá

schopnosti některých fluoreskujících látek (rhodanin, fluorecein, isothiokyanát aj.)

pevně se vázat na globulinové molekuly, přičemž nemění jejich vlastnosti. Tímto

způsobem je možné značit bílkovinné molekuly protilátek, aniž by se změnila jejich

imunologická aktivita, a přitom po reakci s antigenem vzniká komplex, antigen –

protilátka - fluorescenční barvivo, který fluoreskuje v UV světle a je snadno

pozorovatelný fluorescenční mikroskopií.

Imunofluorescenci lze provádět dvojím způsobem. Buď jako přímou

imunofluorescenci, kdy se fluorescenční barvivo naváže na protilátku, která pak

reaguje s příslušným antigenem, nebo jako nepřímou fluorescenci, kdy se nejdříve

naváže protilátka na antigen a na tento komplex se váže fluoreskující látka označená

protilátka proti globulinu použitého antisera (např. mikrobiální buňky – králičí

specifické antiserum – protilátka proti králičímu globulinu s fluoreskující látkou).

Imunofluorescence se tedy využívá k přímé diagnostice pathogenních kmenů

z pathologického materiálu, potravin a k serologické identifikaci a typizaci kmene, který

nelze jednoduše získat v čisté kultuře. Pro zjednodušení detekce mikroorganismů tímto

způsobem v potravinách nebo jiných vzorcích, je vhodné pomnožení v neselektivních,

popř. selektivních, medií pro určitý sledovaný mikroorganismus (např. rod Salmonella

v selenito-cystinovém mediu).

Tímto způsobem se stanovuje přítomnost cizích kvasinek v pekařském droždí

nebo pivovarských kvasnicích, a to buď „značením“ kulturních kvasinek nebo cizích

kvasinek.

Cv.10.10 Imunofluorescence

Strana222

Potřeby : Suspenze Saccharomyces cerevisiae ve fyziologickém roztoku, suspenze

divokých kvasinek, antiserum proti S. cerevisiae značené fluorescein-isothiokyanátem,

podložní sklíčka.

Provedení :

1. Vytvoř tenký nátěr suspenze S. cerevisiae smíchané s různou koncentrací divokých

kvasinek na podložním sklíčku.

2. Usuš na vzduchu, fixuj plamenem a nech reagovat se značenou protilátkou ve vlhké

komůrce, při pokojové teplotě po dobu 30 minut.

3. Přebytek konjugátu odstraň jemným oplachováním pufrovaným fysiologickým

roztokem o pH 7,0 po dobu 10 minut.

4. Sklíčko přenes do roztoku pufrovaného glycerolu (9 částí glycerolu a 1 část fyzio-

logického roztoku o pH 7,0).

5. Mikroskopuj fluorescenční technikou a spočítej buňky S. cerevisiae a divokých

kvasinek v 30 políčcích. Poměr divokých kvasinek vyjádři v procentech.

Poznámka :

Pro lepší odlišení obou typů kvasinek je vhodné použít jako zdroje vedle světla

UV i upravené viditelné světlo (fázový kontrast). Značené buńky zeleně fluoreskují a

divoké kvasinky jsou černé.

10.3.6 Speciální metody

V poslední době se pro stanovení neznámé koncentrace antigenu využívají nové

imunochemické techniky vyznačující se velkou citlivostí a přesností. Jsou založené na

principu tzv.saturační analýzy, který spočívá v soutěži tzv. ligandů o vazbu na

omezené množství va-zebné bílkoviny, v případě imunochemických reakcí jde o

dvojici antigen – protilátka, kdy antigen ve stanoveném vzorku soutěží o vazebné místo

na protilátce s konstantním množstvím téhož, ovšem značeného antigenu. Podle typu

značkovací látky rozlišujeme různé typy imunostanovení :

a. RIA – radioimunostanovení, kdy antigen je značen radionuklidem,

b. EIA – enzymoimunostanovení , kdy antigen je značen enzymem,

c. FIA – imunofluorostanovení, kdy je antigen značen fluorescenčním

činidlem.

Strana223

RIA metody lze např. využít pro stanovení přítomnosti, produkovaných plísní

Aspergillus flavus, v potravinách nebo krmivech.

10.3.7 Využití imunologických metod v potravinářské mikrobiologii

Imunologické metody se převážně využívají v klinické mikrobiologii pro

identifikaci patogenních mikroorganismů nebo schopnosti napadeného hostitelského

organismu tvořit protilátky. V potravinářské analytice se serologické metody k rychlé

identifikaci patogenních mikroorganismů obsažených v potravinách. Velkého rozšíření

si získaly Latex –testy, kdy je specifická protilátka navázaná na kuličky latexu a

v přítomnosti antigenu (hledané patogenní mikroorganismy) dochází k precipitaci na

podložní destičce. Tyto testy jsou vyvinuty pro salmonely a dokonce i pro toxiny

produkované některými patogeny. Jedná se např o toxiny produkované Clostridium

perfringens nebo Staphylococcus aureus.

11 SEZNAM ROZTOKŮ R-1 Fyziologický roztok NaCl…………...8,5 g H2O……………1000ml R-2 Krystalová violeť (Gram I) A: kystalová violeť……….5g Ethanol (96%ní)………200ml B: 1%ní oxalát amonný Smíchej 20 ml roztoku A a 80 ml roztoku B a zfiltrtuj R-3 Lugolův roztok (Gram II) I2…………..1g KI………….2g H2O………..300ml R-4 Kabofuchsin A: Fuksin basický………1g Ethanol 96%ní………10ml B: 5%ní fenol v H2O……100ml Smíchej oba roztoky a zfiltruj. R-5 Safranin

Strana224

Safranin………….0,5g H2O……………..200ml Po rozpuštění zfiltruj R-6 Methylenová modř pro barvení bakteriálních spor methylenová modř………0,3g ethanol(96%ní)………….30ml H20……………………..100ml Rozpusť barvivo v ethanolu,přidej destilovanou vodu,dobře rozmíchej a zfilruj. Uchovávej v tmavé láhvi. R-7 Methylenová modř pro barvaní mrtvých buněk kvasinek methylenová modř,vodný roztok 1 : 5000……….100ml 0,2 M KH2PO4 s pH upraveným na 4,6 pomocí NaOH ( 1 mol/l)..100ml R-8 Jodový roztok pro barvení glykogenu R-9 Laktofenol R-10 Dornerův roztok nigrosaninu Rozpusť 10g nigrosaninu ve 100 ml destilované vody,vař 30 min,přidej 0,5 ml 40%ního formaldehydu jako konzervační prostředek, dvakrát zfiltruj přes skládaný filtrační papír a uchovávej za asepticých podmínek R-11 Raulinův roztok R-12 Giemsův roztok R-13 Roztok bromthymolové modře (příprava půdy pro zkvašování cukrů P- ) bromthymolová modř………….1,6g ethanol 95%……………………50ml voda……………………………50ml Rozpusť barvivo v ethanolu,přidej vodu a zfiltruj. R-14 Roztok methylčerveně (důkaz tvorby kyselin) 0,1 g methylčerveně rozpusť v 300 ml 95%ním ethanolu a zřeď na 500 ml desti-lovanou vodou. R-15 Pufr pro bakterofágy R-16 Kyselý roztok sublimátu R-17 Bohmova činidla na indol

I. p-dimethylaminobenzaldehyd……1g ethanol 95%ní……………………95ml

Strana225

HCl(konc.)………………………20ml II. nasyc. vod. roztok persíranu draselného R-18 Kovacsovo činidlo n-pentanol...................75ml p-dimethylaminobenzaldehyd …5g HCl koncentrovaná…………….25ml

R-19 Tlumivá peptonová voda Pepton 5,0 g NaCl 8,5 g Na2HPO4.12 H2O 9,0 g KH2PO4 1,5 g Voda 1000 ml pH 7,2

12 Seznam půd

P-1 Plate count agar (PCA) Trypton 5,0 g Kvasničný extrakt 2,5 g Glukosa 1,0 g Agar 10,0 g Voda 1000 ml pH 7,0 ± 0,2 P-2 Glukosové medium s kvasničným extraktem a oxytetracyklinem Kvasničný extrakt 5,0 g Glukosa 20,0 g Agar 12,0 g Biotin 0,0001 g Agar 12,0 g Voda 1000 ml pH 7,0 ± 0,2 Po sterilizaci a vytemperování půdy na 50o C se asepticky přidá roztok 50

mg oxytetracyklinu rozpuštěného v 10 ml sterilní vody

P-3 Czapek-Doxův agar pro plísně NaNO3 2,0 g KCl 0,5 g Mg glyrofosfát 0,5 g Fe SO4 0,01 g K2SO4 0,35 g Sacharosa 30,0 g Agar 12,0 g Voda 1000 ml pH 6,8 ± 0,2

Strana226

P-4 Luria-Bertaniho medium LB Bakto-trypton 10,0 g Kvasničný extrakt 5,0 g NaCl 5,0 g Voda 1000 ml pH 7,2 ± 0,2 P-5 Luria- Bertaniho agar (LBA) Bakto-trypton 10,0 g Kvasničný extrakt 5,0 g NaCl 5,0 g Agar 15,0 g Voda 1000 ml pH 7,2 ± 0,2 P-6 Sabouradův agar Mykologický pepton 10,0 g Maltosa 40,0 g Agar 15,0 g Voda 1000 ml pH 5,6 ± 0,2 P-7 Mueller-Hintonův agar Hovězí výtažek 300,0 g Hydrolyzát kaseinu 17,5 g Škrob 1,5 g Agar 17,0 g Voda 1000 ml pH 7,4 ± 0,2 P-8 Půda pro rod Pseudomonas Pepton 16,0 g Hydrolyzát kaseinu 10,0 g K2SO4 10,0 g MgCl2 1,4 g Agar 11,0 g Glycerol 5 ml Voda 1000 ml pH 7,1 ± 0,2 Po vysterilizování v autoklávu a po ochlazení na 50oC je možno přidávat roztoky

antibiotik. P-9 Kompletní agar Kvasničný extrakt 5,0 g Pepton 3,0 g

Strana227

Hydrolyzát kaseinu 5,0 g Glukosa 10,0 g Voda 1000 ml Agar 18 g pH 7,0 ± 0,2 P- 10 Škrobový agar Trypton 5,0 g Kvasničný extrakt 2,5 g Glukosa 1,0 g Škrob 10,0 g Agar 10,0 g Voda 1000 ml pH 7,0 ± 0,2 P-11 Kopulační agar pro Saccharomyces cerevisiae Kvasniční extrakt 5,0 g Pepton 20,0 g Glukosa 20,0 g Agar 20,0 g Voda 1000 ml pH 7,0 ± 0,2 P-12 Půda pro sledování asimilace zdrojů uhlíku kvasinkami (NH4)2SO4 5,0 g KH2PO4 1,0 g MgSO4. 7 H2O 0,5 g Kvasničný extrakt 10 mg Voda 1000 ml pH 6,6 ± 0,2 Jednotlivé cukry se přidávají do konečné koncentrace 1%. Jedná se o

glukosu, laktosu, maltosu a sacharosu.