Novel mutations in penicillin-binding protein genes in clinical Staphylococcus aureus isolates that are methicillin resistance on

susceptibility testing, but lack the mec gene.Xiaoliang Ba, Ewan M. Harrison, Giles F. Edwards, Matthew T. G. Holden, Anders Rhod Larsen,

Andreas Petersen, Robert L. Skov, Sharon J. Peacock, Julian Parkhill, Gavin K. Paterson and Mark A. Holmes

George Alves do Nascimento

Biologia Molecular Aplicada a Farmácia

Introdução• Os antibióticos β-Lactâmicos

interferem na síntese da paredecelular bacteriana. A penicilinaacopla num receptor presente namembrana interna bacteriana (PBP)e interfere com a transpeptidaçãoque ancora o peptidoglicanoestrutural em volta da bactéria,impedindo a síntese da paredecelular bacteriana.

Introdução• Inicialmente, a primeira forma de

defesa bacteriana descoberta eramediada pela expressão daenzima β-Lacmatamase.

• Com o objetivo de escapar daação da β-Lactamase, foi criada aprimeira penicilina semi-sintética.A meticilina.

• Porém, desde sua introdução, em1961, surgiram várias linhagensde SA que haviam desenvolvidoresistência a meticilina, os MRSA,sendo estes resistentes a maioriados antibióticos β-Lactâmicos.Desenvolvimento da Oxacilina.

Introdução

Mecanismo de resistência• A resistência dos MRSA aos β-

Lactâmicos se dá pela aquisição dogene mecA ou seu variante, o genemecC, que codificam uma (PBP)2aalternativa, que tem menor afinidadepelos antibióticos β-Lactâmicos.

• Também tem sido estudada aresistência a oxacilina (BORSA),atribuindo essa resistência asuperprodução de β-Lactamase etambém à mutações cromossômicas.

Importância Clínica• A detecção dos mec genes ou da

PBP2a, são padrão ouro no diagnósticode MRSA.

Objetivos• 4 linhagens isoladas de MRSA, que não possuíam os genes mecA

ou mecC, mas ainda sim eram fenotipicamente resistentes aosantibióticos β-Lactâmicos, foram estudas quanto ao possívelmediador dessa resistência.

• As 4 linhagens tiveram seus genomas sequenciados e analisadosem uma gama de ensaios fenotípicos.

• MRSA mec-negativos podem ser causas de infecções em sereshumanos , mas podem ser classificados como susceptíveis ameticilina, com base apenas nos testes para PBP2a e mec genes.Um potencial motivo para a falha do tratamento.

Métodos• Os isolados foram cultivados em

placa Agar sangue e em caldo TSB a37°C.

• Os testes de sensibilidadeantimicrobiana foram realizadosusando um disco de susceptibilidadede acordo com os critérios da BSAC(Methods for AntimicrobialSusceptibility Testing).

• Os isolados foram testados paraprodução de β-Lactamase usando oβ-Lactamase (nitrocefin)indentification sticks.

Métodos

• O DNA dos isolados foi extraídoem overnight cultures usando oMasterPure Gram-positive DNAPurification Kit.

• A sequencia genômica foi obtidaatravés da Illumina Library e Hi-seq sequencing.

• Os genes que codificam as PBPforam identificados usando osoftware BLAST.

BLAST – ferramenta básica de busca por alinhamentos locais

• Existem variações nos programas BLAST, mas todoscompartilham a característica comum de encontrar regiõesde similaridade entre diferentes genes codificantes deproteínas.

• Uma pesquisa BLAST permite que um investigador compareuma sequencia fornecida em uma consulta com umabiblioteca ou base de dados de sequências e identificar asbibliotecas de sequências que se assemelham à sequênciaconsultada e que estejam acima de um certo grau desemelhança.

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

Resultados

• Foram identificadas 4 mecA/C-negative isolados (XB84,XB85, XB86 e XB87) que exibiam resistência apenicilinas. Pertencentes ao STs 15, 1, 15, 8respectivamente.

• Todos os quatro apresentaram resistência a oxacilina,cefoxitin e penicilina nos testes de sensibilidade (BSAC),exceto XB84 que apresentou um limite de tolerânciapara oxacilina.

Positivo para a produção de β-Lactamase, medidos pelo Nitrocefin

XB84XB85

XB87

XB86, Resultado negativo para a produção de β-Lactamase

Resultados• Para melhor elucidar a base molecular da resistência, os quatros isolados

tiveram seu genoma sequenciado.

• Isso confirmou que nenhum dos isolados continha os mec genes A/C ounenhuma sequencia homologa a estes.

Resultados• Depois foi usado o BLAST para identificar

outros isolados numa coleção genômica,que compartilhassem 100% deidentidade de nucleotídeos ao longotodo o locus da β-Lactamase (bla) (blaz,blaI, blaR).

• Foram identificado 3 isolados com o geneblaZ tipo A e 12 isolados com o gene blaZtipo C, sendo testada a resistência dessesisolados a oxacilina e cefoxitin ( Dadosnão foram inclusos).

• Nenhuma associação foi encontradaentre a presença do blaZ gene em suavarias formas e a resistência.

• Realizou-se testes de susceptibilidadenestes isolados, agora na presença doacido clavulânico, nas proporções 2:1ou 1:1.

• Nenhuma redução foi vista nas zonasde inibição da oxacilina, cefoxitin oupenicilina em combinação com o ácidoclavulânico. Isso sugere que a β-lactamase não é a mediadora daresistência.

Resultados

• Além da β-Lactamase e da PBP2a, outras cinco proteínas (PBP2,PBP4, GdpP, YjbH, e AcrB) veem sendo relatadas por estaremassociadas a resistência em SA.

• As sequencias de DNA dos quatro isolados que codificam ascinco proteínas foram comparadas com um painel de isoladossensíveis pertencentes aos mesmos STs.

• Foi descoberto um pequeno número de substituições deaminoácidos presentes nas PBP1, 2, 4 e YjbH em um ou maisisolados resistentes mais ausente nas sensíveis.

Resultados: substituições de aminoácidos

• 1º Lugar: substituição no domínio da transpeptidase PBP1.

XB85 (ST1)

XB86 (ST15)

XB87 (ST8)

Substituição His 449 Tyr

Resultados: substituições de aminoácidos

• 2º Lugar: Substituição no domínio da transpeptidase de PBP2.

XB84 (ST15)

XB86 (ST15)

XB87 (ST8)

Thr – 552 Ile

XB87 (ST8)

Resultados: substituições de aminoácidos

• 3º Lugar: compartilhamento da substituição no domínio datranspeptidase PBP3.

XB84 (ST15)

XB85 (ST1)

XB86 (ST15)

Ser – 664 Phe

Resultados: substituição de aminoácidos

• Foi identificado duas diferentes substituições não conservativasna mesma posição do domínio da transpeptidase PBP1:

Tyr - 336 Asn

CysTyr - 336

Resultados: substituições de aminoácidos

• Um número de substituições únicas também foram encontradasem um dos isolados resistentes que estavam ausentes nosisolados sensíveis do mesmo ST.

• Duas outras substituições foram encontradas em PBP2:

Thr – 31 Met em XB85

Asp – 156 Tyr em XB86

Thr – 371 Ile em XB85 no domínio de PBP1.

Discussão

• Neste trabalho foram identificados MRSA isolados pertencentes atrês STs. Esta resistência não parece ser mediada por hiperproduçãode β-Lactamase.

• Também foi identificada uma série de novas substituições nosdomínios das transpeptidase das PBPs 1, 2, 3 que poder ser osmediadores dessa resistência.

• Os domínios das transpeptidases, são o alvo dos antibióticos β-Lactâmicos e substituições nesses domínios reduzem a eficácia daacilação das PBP, proporcionando um certo grau de resistência.

Discussão

• Dado o pequeno número de isolados nesse estudo, a busca alvode mutações poderiam ter excluídos outros genes envolvidos naresistência.

• Atualmente os MRSA mec-negativos não são amplamentedivulgados. É importante caracterizar seu mecanismo deresistência, em especial para os laboratório clínicos, umas vezque o diagnóstico atual dos MRSA limita-se a detecção dosgenes mecA/C ou da PBP2a.

Referências

• Biologia molecular do Gene. 5º edição, James D. Watson [et al]

• Microbiologia / Gerard Tortora, Berdell R. Funke. 8º edição.