Naujausių mokslinių pasiekimų, naujausių mokslinių tyrimo

metodų molekulinės biologijos srityje mokslinė studija

MOLEKULINĖ EKOLOGIJA

Prof. Aniolas Sruoga

Biologijos katedra

Vytauto Didžiojo universitetas

Kaunas – 2007

1. MOLEKULINĖ EKOLOGIJA: MOKSLO RAIDA IR TAIKYMAS

Šiuolaikinis požiūris į populiacijas, kaip vienos rūšies organizmų genetiškai

skirtingų individų grupes, formavosi visą šimtmetį nuo XX a. pradžios. Kadangi

įvairių sričių specialistai akcentuoja skirtingas pupuliacijų savybes, būtina apibrėžti ką

mes vadiname gamtine populiacija – tai vienos rūšies individų grupė, užimanti tam

tikrą teritoriją arba erdvę, kurioje jie keičiasi genetine informacija, palaiko

atitinkamą gausumą ir turi tik tai grupei būdingus požymius.

Visi organizmai, nepriklausomai nuo jų evoliucijos, su aplinka ir tarpusavyje

yra susieti ekologiniais ryšiais. Organizmų tarpusavio sąveika yra tokia sudėtinga, kad

dar ir dabar mažai žinoma apie konkrečius, tarpusavyje susijusius ir vienas nuo kito

priklausančius ekologinius procesus, vykstančius tarp įvairių individų, populiacijų,

biocenozių. Šių ryšių atskleidimas ir tyrimas – viena iš sudėtingiausių šiuolaikinės

biologijos problemų.

Be to dabartinėse sąlygose tai nėra tik natūraliai vykstantys procesai, nes

žmogaus praktinė veikla griauna evoliuciškai susiklosčiusius, natūralius mechanizmus

ir pirmiausiai tuos, kurie saugo ir palaiko genetinę įvairovę ir vidinę organizacinę

struktūrą. Antropogeninis poveikis, stipriai keičiantis gamtą, neišvengiamai veikia

populiacijų genetinę struktūrą ir pasireiškia genų dažnių poslinkiu. Be to žmogaus

poveikis landšaftui, keičia atrankos veiksnius, o tuo pačiu ir populiacijų struktūrą.

Nuo XX a. aštunto dešimtmečio stebimas klimato atšilimas bei pasikeitę

antropogeniniai veksniai turi poveikį ir Lietuvos gyvūnų populiacijoms. Pastebėti

migruojančių paukščių rūšinės sudėties pokyčiai, atskridimo-išskridimo laiko

skirtumai, nebūdingas žiemojimas, žuvų rūšinės sudėties, skaitlingumo, biomasės

pokyčiai, vabzdžių dinamikos pokyčiai, erkių pernešamų infekcinių ligų susirgimų

padažnėjimas dėl klimato kaitos.

Populiacijų genetinė struktūra ir jos genetinis kintamumas yra vienas iš

rodiklių, atspindinčių individų pokyčius besikeičiant įvairiam gyvenimo sąlygų

kompleksui ir leidžiančių įvertinti vykstančių pokyčių mastą (Nei 1987, Ridley 2004,

Beebee 2005).

Genetinis kintamumas yra ir individų adaptacijos įvairioms gyvenimo

sąlygoms rodiklis, todėl jo tyrimas gali būti indikatorius ekologinių sąlygų įvertinimui

ir suteikti informaciją apie genofondo kitimą gamtinėse populiacijose (genų dreifą,

migraciją, aplinkos poveikį). Jo įvertinimas taip pat gali suteikti duomenų apie

migruojančių gyvūnų (pvz., paukščių perinčių bendroje teritorijoje, o žiemojančių

skirtingose vietovėse, migruojančių į nerštavietes žuvų) populiacijų genetinę

struktūrą, paukščių pernešamų parazitų kilmės vietą, platinimą; apie introdukuotų ir

reintrodukuotų gyvūnų prisitaikymo mechanizmus.

Nūdienos biomedicinos ir fizikiniuose moksluose tvirtai įsigali

tarpdisciplininė prieiga. Paskutinio XX šimtmečio pabaigoje pasiekti rezultatai

parodė, kad neįmanoma išanalizuoti zoologinių, botaninių, ekologinių, evoliucijos

problemų be genetikos, chemijos, matematikos, informacinių technologijų pasiekimų.

Susiformavo naujos tarpdisciplininės mokslo šakos – molekulinė biologija,

bioinformatika, biomodeliavimas. Molekulinių metodų panaudojimas populiacijų

ekologiniuose tyrimuose šiandien akivaizdus. Terminas “molekulinė ekologija”

pradėtas plačiai naudoti įvairiuose kontekstuose, apimančiuose biogeocheminių ciklų,

biologiškai aktyvių organinių junginių, ar ekotoksikologijos tyrimus po tarptautinio

žurnalo Molecular Ecology pirmo numerio publikavimo 1992 m. Žurnalo redkolegija

nurodo, kad leidinyje publikuojami rezultatai, kurie panaudoja molekulinę biologiją

įvairių ekologijos ar populiacijų biologijos aspektų analizei, ypatingą dėmesį skiriant

natūralių ir introdukuotų populiacijų bei jų aplinkos tyrimams panaudojant

molekulinę technologiją, o taip pat rekombinantinių organizmų (kitaip genetiškai

modifikuotų organizmų, GMO) išleidimo į aplinką studijoms. Šiandieninių požiūriu

molekulinė ekologija apibrėžiama kaip molekulinių genetinių žymenų

panaudojimas tiriant ekologijos ir evoliucijos problemas, apimančias genetinių

ryšių tarp individų, populiacijų ir/ar rūšių tyrimus, įvertinant kaip patelės

pasirenka patinus, populiacijų prisitaikymo prie kintančios aplinkos

mechanizmus, efektyvaus populiacijos dydžio svyravimo vaidmenį adaptacijos

procese, naujų rūšių formavimosi mechanizmus, introdukuotų ir reintrodukuotų

rūšių poveikį vietinėms populiacijoms, rūšims, antropogeninį poveikį populiacijų

struktūrai, skirtingų genotipų adaptacijai.

Nuo 1992 m. leidžiamas tarptautinis žurnalas „Molecular ecology“.

2. TYRIMO METODAI MOLEKULINĖJE EKOLOGIJOJE

Šiandien, dėl žymiai padidėjusios žmogaus veiklos, ekosistemos pastoviai yra

veikiamos įvairių abiotinių ir biotinių veiksnių. Pagrindinis vaidmuo organizmų

prisitaikymui besikeičiančiose ekosistemose tenka konkrečioms organizmų

populiacijoms, jų sąveikai bendrijoje. Vertinant populiacijų kintamumo priežastis ir

dinamiką bei konkrečios organizmų populiacijos genetinės struktūros pokyčius laike

ir erdvėje tam tikroje buveinėje, gali būti panaudoti daugelis metodų leidžiančių

nustatyti individų genotipus. Visus juos galima suskirstyti į keletą grupių: 1)

morfologiniai-biometriniai metodai; 2) citogenetiniai; 3) imunogenetiniai metodai; 4)

biocheminis baltymų polimorfizmas; 5) DNR polimorfizmas.

Kiekybinei genetinio kintamumo charakteristikai bei tyrimo metodams

keliami keletas reikalavimų: 1) fenotipiniai skirtumai, sąlygoti alelių pakitimais

atskirame lokuse, turi būti nustatomi skirtinguose individuose; 2) alelių pakitimai

viename lokuse turi būti atskiriami nuo alelių pakitimų kitame lokuse; 3) žymi dalis

alelių pakitimų atskirame lokuse turi būti atskiriama viena nuo kitos; 4) tiriami

lokusai turi atspindėti atsitiktinę genų imtį pagal fiziologinį pasireiškimą ir

kintamumo laipsnį.

Kokius žymenis pasirinkti?

Pagrindinė populiacijų biologams iškylanti problema yra rasti tinkamiausius metodus

(Ecology: vol.79(2), 1998 p.372, table 3), kurie patikimai tiksliai atskleistu genetinį

kintamumą išsprendžiant konkrečias problemas, susijusias su:

• mažiausiu mėginių kiekiu,

• tyrimų išlaidos (santykinė kaina) ir

• pavojus sveikatai

Priimtiniausi yra tie metodai, kurie leidžia nustatyti

• Didelį alelių skaicių viename lokuse ir/arba

• Daug lokusų su dviem ar daugiau dažnai aptinkamais aleliais

Morfologinių požymių analizė tenkina pirmą ir antrą kriterijų, tačiau kitos

netenkinamos, kadangi tik dalis alelinių pakitimų sukelia morfologinius pakitimus.

Citogenetiniai metodai, plačiai taikomi antropogeninio poveikio

mutageniškumui įvertinti įvairiuose populiacijose, atspindi tik labai ryškius

chromosominius pakitimus – genomines ir chromosomines mutacijas, atsirandančias

dėl labai stipraus mutageninio poveikio organizmams. Nestiprūs veiksniai, sąveika

tarp skirtingų genotipų bendrijoje nėra registruojama.

Nors imunogenetiniai metodai plačiai taikomi gyvūnų selekcijoje (kaip

genetiniai žymenys), evoliucinių ryšių nustatyme, tačiau vien tiktai kraujo grupių

analizė neduoda pilnos informacijos apie populiacijos kintamumo laipsnį, kadangi

monomorfinių lokusų skaičius tokio tyrimo atveju lieka neaiškus.

XX a. sparčiai vystantis molekulinei biologijai ir atradus baltymų ir DNR

polimorfizmą, pastarieji du metodai padarė perversmą populiacijų ekologijoje,

sudarydami galimybę įvertinti rūšių ir populiacijų genetinį kintamumą laike ir

erdvėje, tirti rūšis, paveiktas ne tik natūralių gamtinių sąlygų, bet ir žmogaus veiklos

padarinių, neišimant individų iš gamtinės aplinkos, kas ypač svarbu tiriant retas ir

nykstančias rūšis.

2. 1. Baltymų polimorfizmas

Baltymų polimorfizmo analizė paremta baltymų elekrtocheminėmis

savybėmis: baltymų (taip pat ir fermentų) molekulių mišinys migruodamas gelyje ir

veikiamas elektrinio lauko išsiskiria į frakcijas priklausomai nuo krūvio, molekulinės

masės ir baltymų dydžio, kurį sąlygoja organizmo genotipas. Įvairių organizmų

audinių pavyzdžiai, norint išlaisvinti fermentus ir kitus baltymus iš ląstelių,

homogenizuojami (susmulkinami) įvairiuose ekstragavimo buferiuose,

centrifūguojami ir supernatanto (tirpios frakcijos) mėginiai užnešami ant gelių.

Šiandien elektroforezėje panaudojami ivairiūs tvirti nešėjai – popierius, agaras,

agarozė, krakmolas, poliakrilamidas, acetatceliuliozė ir kt. geliai. Po to, per gelį keletą

valandų leidžiama pastovi elektros srovė, kurios veikiami baltymai juda gelyje.

Judėjimo greitis ir kryptis priklauso nuo pasirinkto elektroforezės metodo bei pačių

baltymų elektrocheminių savybių. Po elektroforetinio frakcionavimo, panaudojus

specifinius histocheminius fermentų dažymo metodus, geliuose vizualiai galima

nustatyti izofermentų išsidėstymą.

Izofermentai arba jų subvienetai tarnauja kaip žymuo savo genui. Šiuo metu

biocheminės polimorfinės baltymų sistemos plačiai naudojamos molekulinės

ekologijos laboratorijose dėl kelių patogių priežasčių:

1) izofermentus galima nustatyti mažame ekstrakto kiekyje;

2) tuo pačiu metu ir tokiomis pat sąlygomis galima analizuoti daug mėginių;

3) tyrimo metodika standartizuota daugelyje pasaulio laboratorijų;

4) nereikia daug laiko tiriamų pavyzdžių analizei;

5) aleliniai genai vienas kito nemaskuoja – išryškėja kodominantiškai;

heterozigotose dalyvauja abu tipai subvienetų, homozigotose viena;

6) galima išskirti nedideles mutacijas, nepastebimas vizualiai;

7) galima analizuoti iškart keletą atskirų lokusų, t.y. keletą skirtingų požymių;

8) analizei reikalingi palyginti nebrangūs reagentai.

2.1.1. Izofermentai

Genetiniame lygmenyje populiacijos yra pakankamai stabilios sistemos, kurių

pastovumą užtikrina genetinės įvairovės optimumas, bet koks nuokrypis – įvairovės

sumažėjimas ar padidėjimas, sukelia nepalankias biologines pasekmes ir gali baigtis

populiacijos degradacija. Įprastinėje aplinkoje optimali genetinė įvairovė palaikoma

veikiant populiacinės dinamikos faktoriams – natūraliai atrankai, genų mutacijoms,

migracijai.

Genetinis baltymų polimorfizmas sudaro dalį genetinės įvairovės, stebimos

skirtingų rūšių gamtinėse populiacijose. Vykstant neutralioms mutacijoms alelinuose

genuose, formuojasi daugialypės baltymų formos. Kiekvienas individas tik jam

būdinga, unikalią baltymų sudėtį, todėl individų atsitiktinės imties polimorfizmo

tyrimai atspindi genetinio kintamumo procesus, kurie vyksta visoje populiacijoje.

Izofermentai gali būti panaudojami populiacinėje ir evoliucinėje genetikoje, taip pat

tiriant morfogeninius procesus, izofermentų spektro ekspresijos genetinius

mechanizmus (Glazko, 1985). Tiriant izofermentus galime:

1) Įvertinti vidurūšinį ir tarprūšinį genetinį kintamumą;

2) Išaiškinti filogenetinius ryšius tarp skirtingų taksoninių grupių;

3) Įvertinti genetinio kintamumo kiekį formuojantis rūšiai;

4) Tyrinėti mikroevoliucinio proceso pokyčius

Izofermentai – genėtinai žymenys. Bet kuris polipeptidas yra žymuo jį

koduojančiam genui, t.y. jei aptinkami kurio nors tipo subvienetai, tai tas genas yra

aktyviai ekspresuojamas. Populiacinės genetikos tyrimams dažniau pasirenkamos

izofermentinės sistemos, kadangi izofermentus lengviau aptikti dėl jiems būdingo

specifinio katalitinio aktyvumo. Juos patogu naudoti, nes izofermentus galima

nustatyti mažame ekstrakto kiekyje ir tuo pačiu analizuoti daug mėginių vienu metu

(Paulauskas ir kt., 2002).

Taip pat svarbu paminėti, kad aleliai išryškėja kodominantiškai t.y.

heterozigotų atveju vienas kito nemaskuodami. Heterozigotose dalyvauja abu

izofermentų subvieneto tipai, homozigotose tik vienas. Apie genotipą galime spręsti

pagal fenotipų požymį – izofermentų spektrą. Kodominavimas palengvina

elektrofotogramų išaiškinimą (iššifravimą), nes taip ypatingai patogu dirbti su

laukinėmis rūšims, kada hibridiologinė analizė yra apsunkinta arba visai neįmanoma.

Svarbus aspektas, kuris teikia izofermentams pranašumą, tai laikas, kadangi

tiriamų pavyzdžių analizė nereikalauja daug laiko bei rezultatai gaunami greitai bei

yra lengvai įvertinami, nereikia išskyrinėti DNR. Izofermentai leidžia aptikti

nedidelius genų mutacijas, nepastebimas vizualiai ir tuo pačiu metu analizuoti keletą

atskirų genų lokusų.

Šis metodas duoda pilna informaciją apie populiacijos kintamumo laipsnį.

Tačiau kaip ir kiekvienas metodas ir šis turi savotiškų trūkumų. Izofermentai pasižymi

mažu gausumu bei žemu polimorfizmo lygiu. Jų spektrus kartais sudėtinga

interpretuoti dėl susidarančių kompleksų, kurie atsiranda dėl genų poliploidijos arba

duplikacijos, bei integralinių heterodimerų susiformavimo.

Dirbant su izofermentais galimi netikslumai, kurie atsiranda pakitus

izofermentų sudėčiai skiriančioje terpėje. Be to, imant pavyzdžiui iš įvairių audimų ir

juos homogenizuojant, gali išsiskirti fiziologiškai aktyvios medžiagos, kurios sukelia

ryškius pakitimus tiriamo fermento molekulėje.

Analizuojant izofermentus elekroforeziniais metodais išryškinami tiktai tokie

aleliai, kurie sąlygoja izofermentų, besiskiriančių elektroforeziniu judrumu. Dalis

pasikeitusių aminorūgščių gali keisti polipeptido elektrinį krūvį netiesiogiai keičiant

fermento antrinę, tretinę arba ketvirtinę struktūrą. Taigi izofermentai parodo tik dalį

egzistuojančio biocheminio polimorfizmo. Be to, tas pats elektroforezinis alelis gali

turėti keletą genetinių variantų (Žukas, 2005).

Baltymų polimorfizmo analizė paremta baltymų elektrocheminėmis

savybėmis: baltymų (taip pat fermentų) molekulių mišinys, migruodamas gelyje ir

veikiamas elektrinio lauko, išsiskiria į frakcijas priklausomai nuo krūvio, molekulinės

masės ir baltymų dydžio. Gauti rezultatai vadinami elektromorfais. Tai pastebėjo XX

amžiaus trečiajame dešimtmetyje A. Tisel. Priklausomai nuo subvienetų skaičiaus,

baltymai elektroforezės metu gali formuoti keletą elektromorfų tipų. Homozigotų

baltymai, koduojami vienodų vieno lokuso alelių, formuoja vieną frakciją.

Kartais elektromorfai, vienodai judantys gelyje, gali būti koduojami skirtingų

alelių, nes: 1) genetinis kodas yra išsigimęs – viena amino rūgštis gali būti koduojama

keliomis nukleotidų sekomis; 2) pakeitus kai kurias amino rūgštis, elektroforezinis

viso baltymo judrumas gali nepasikeisti; 3) gali atsirasti netikslumų dėl baltymo

sudėties pokyčių ruošiant medžiagą.

2.1.2. Izobaltymai

Polimorfizmas būdingas ne tik fermentams, bet ir daugeliui nekatalitinių

baltymų Hemoglobinas, mioglobinas, feritinas, aktinas ir miozinas turi po keletą

izoformų, kadangi yra oligomerai, jie sudaryti iš dviejų arba daugiau subvienetų tipų.

Nefermentinių baltymų daugybinės formos ištirtos mažiau nei fermentai, kadangi dėl

specifinių katalitinių savybių fermentus lengviau aptikti grubiuose ekstraktuose

(Žukas, 2005). Heterogeniškumo atveju, izobaltymams būdingos tos pačios genetinės

ir negenetinės priežastys. Kadangi baltymų polimorfinėms sistemoms būdingas

nesudėtingas išskyrimas, stabilumas, informatyvumas ir paprasta genetinė kontrolė,

jos plačiai naudojamos populiaciniuose tyrimuose.

Nespecifinio baltymo elektromorfuose išsiskiria makroglobulinai,

postransferinai, transferinai, pretransferinai, postalbuminai, albuminai ir

prealbuminai. Žmogaus ir gyvūnų kraujo plazmoje elektroforezės būdu geriausiai

išsiskiria albuminai, α1 - ,α2 -, β1-, β2- ir γ – globulinai ir transferinai.

Albuminai sudaro 54-58 % visų plazmos baltymų. Jie dalyvauja įvairių

medžiagų, turinčių hidrofobines savybes transporte bei osmosinio slėgio reguliacijoje

(Шубин, Ефимцева, 1988). Jų polimorfiškumas yra aprašomas remiantis daugeliu

naminių gyvūnų tyrimais: arklio, didelių raguotų galvijų, ožkų ir kiaulių. Baltymą

formuoja viena polipeptidinė grandinė.

Transferinai išskirti iš daugelio organizmų yra polimorfiniai, kontroliuojami

autosominio lokuso polialelinės sistemos.

2.1.3. Baltymų elektroforezė ir jos metodika

Elektroforezė yra vienas iš svarbiausių baltymo polimorfiškumo tyrimo

metodų. Elektroforezės tyrimų pradininku laikomas švedų mokslininkas Tisel (1937

m.), kuris nustatė, kad panaudojus elektroforezę laisvame tirpale kraujo serumo

globulinus galima išskaidyti į keletą frakcijų – elektromorfų. Elektroforezės metodas

pirmą aprašytą tiriant esterazių heterozigotiškumą (Market, Hunter, 1957). Krakmolo,

poliakrilamido gelių panaudojimas, histocheminio dažymo metodikos įsisavinimas

atvėrė plačiai duris augalų bei gyvūnų genetinio kintamumo tyrimui ir įvertinimui ne

tik tarp atskirų rūšių bet ir rūšies viduje. 1966 metais Harry, Johson, o ypač Lewontin

ir Hubby publikacijos elektroforezės srityje, tapo bendru metodu gamtinių populiacijų

struktūrai .

Tyrinėjant gamtinių populiacijų genetinę struktūrą, žymenimis naudojami

įvairūs baltymai ir fermentai, elektrofotogramose matomi histochemiškai dažant

gelius po elektroforezės. Baltymai, kaip ir juos sudarančios amino rūgštys, yra

amfoteriniai elektrolitai (gali būti anijonais ir katijonais priklausomai nuo pH). Dėka

baltymo dalelių judėjimo elektros lauke baltymų mišinius galima frakcionuoti. Per

tirpalą leidžiant elektros srovę, įelektrintos molekulės bei jonai juda elektrodo,

turinčio priešingą elektros krūvį link. Judėjimo greitis priklauso nuo judančios dalelės

krūvio dydžio, jos formos ir molekulinės masės, tirpiklio savybių, temperatūros ir kitų

veiksnių (Glemža, 1987). Dėl šių skirtumų elektrinio lauko veikiamos elektringos

dalelės tirpale yra atskiriamos. Tai ir sudaro elektroforezės pagrindą. (Mickevičius,

1999)

Prie kitų veiksnių, veikiančių judrumą priklauso :

• Elektrinis laukas. Jo įtaka dalelių atskyrimui priklauso nuo nuolatinės

srovės stiprumo, įtampos ir varžos. Jonų pernešimo greitis yra

proporcingas srovės stiprumui, o nueitas kelias – srovės laidumo laikui.

Migracijos greitis yra atvirkščiai proporcingas varžai. Aukštos įtampos

naudojamos žemamoliniams junginiams frakcionuoti. Išskiriant šilumai šie

dydžiai kinta, todėl būtina šaldymo sistema.

• Buferis palaiko ir stabilizuoja pH, įtakodamas medžiagos migracijos greitį.

Pradinės buferinių tirpalų savybės: joninė jėga, pH ir buferinė talpa.

Padidėjus joninei jėgai, keičiasi ir suminė srovė, todėl padidėja ir

išskiriamos šilumos kiekis. Jei naudojame buferines sistemas su žema

jonine jėga, srovė ir išsiskiriantis šilumos kiekis sumažėja, bet padidėja

difuzija. Labai svarbu įvertinti buferio pH, nes priklausomai nuo jo

keičiasi judančių junginių kryptis ir dydis. Buferinė talpa pasižymi

didesniu ar mažesniu sugebėjimu neutralizuoti elektrolizės produktus,

susidarančius elektroforezės metu.

• Absorbcija – (pavyzdžio molekulių sulaikymas ant nešėjų) Didžiausia

absorbcija pasižymi popierius, todėl mažėja metodo skiriamoji geba.

• Elekroosmozė – (krūvio atsiradimas tarp buferinio tirpalo vandens

molekulių ir nėšejaus paviršiaus). Iššaukia H30 susidarymą, kuris

pagreitina katijonų judrumą.

Be to, pirminės fermento struktūros pasikeitimas dėl paveldimoje medžiagoje

įvykusios mutacijos, dažnai nors ne visada, įtakoja ir suminį makromolekulės krūvį.

Todėl fermento molekulės, koduojamos skirtingų to paties geno alelių, dažniausiai

elektriniame lauke judės skirtingu greičiu ir užims skirtingas pozicijas po

elektroforezės (Aлтyхob, 1983).

Elektroforezių tipai:

1. Su judama riba – makromolekulės yra visame tirpalo tūryje. Tai analitinis

metodas, naudojamas nustatant baltymų judrumą ir izoelektrinį tašką;

2. Zoninė – tirpalas užnešamas dėmių arba juostų pavidalu. Naudojama

švarumo nustatymui, judrumo ir konformacijos analizavimui, taip pat

gryninimui.

3. Nepertraukiama – pavyzdžių užnešimas nepertraukiamose zonose

Elektroforezė gali būti atliekama skystoje terpėje. Šis metodas pagrįstas

skiriamųjų ribų tarp baltymų ir buferinio tirpalo pastebėjimu ir fiksavimu. Tokiu būdu

nustatoma ar baltymų tirpalas yra vienalytis. Šiuo metodu nustatyta sudėtinga kraujo

baltymų struktūrą ir daugelio fermentų elektroforezinis grynumas.

Tvirtuose nešikliuose: popieriaus, celiuliozės acetato, plonos silikagelio

aliuminio oksido arba celiuliozės sluoksnių, krakmolo, agaro bei poliakilamido.

Bendra visų šių nešiklių ypatybė yra ta, kad atskiriamos medžiagos juda aiškiomis

zonomis ir jose susitelkusias medžiagas po to lengva nustatyti kitais analizės metodais

(Mickevičius, 1999). Dėl gelių cheminių savybių (juose beveik nepasireiškę sorbcija

nei elekroosmozė), baltymų zonos neišsiplečia. Elektroforezė geliuose atliekama

dažniausiai tada, kai reikia analizuoti, o ne preparatyviai aiškinti baltymus (Glemža,

1987).

Agaro gelis dažniausia naudojamas kai reikia analizuoti nedidelius medžiagų

kiekius. Elektroforezė acetilceliuliozėje naudojama klinikiniuose tyrimuose, kai reikia

greitai diagnozuoti kai kuriuos susirgimus, pasireiškiančius eritrocitų ir kraujo serumo

izofermentų spektrų pokyčiais. Elektroforezę krakmolo gelyje kraujo serumo baltymų

analizei pirmasis panaudojo Smith, 1959 metais. Jis patogu naudoti dirbant su

nepatvariais fermentais, kurių aktyvumo išsaugojimas elektroforezės metu susijęs su

tam tikrais sunkumais.

Vienas iš dažniausiai naudojamų gelių yra poliakrilamido, kuri pasižymi

geromis fizinėmis ir cheminėmis savybėmis. Pirmasis šį gelį panaudojo Riamond su

kolegomis 1950 metais. Gelis gaunamas maišant ir polimerizuojant akrilamidą su N,

N′-metil-bis-akrilamidu terpėje, kurioje yra katalizatorius. Katalizatorius , kaip laisvų

radikalų šaltinis, naudojamas oksidacinės-redukcinės sistemos. Pavyzdžiui:

1. Amonio persulfatas -N,N,N,N′- tetrametiletilendiamidas (TEMED)

2. Amonio persulfatas 3 dimetilaminproprio-nitrilas ir kt.

Svarbiausia, kad katalizatorių sistemos neturi veikti nei buferinių tirpalų, nei

gelio elertolaidumo bei klampumo. Gelio klampumas, elastingumas ir tvirtumas

priklauso nuo poliakrilamido polimerizacijos laipsnio (nuo grandinių ilgio) ir nuo

susiuvimo laipsnio, t.y. nuo pridėto N, N′-metil-bis-akrilamido kiekio

Poliakrilamidinis gelis yra stabilus ir inertiškas, labilios struktūros (tai sudaro

galimybę gauti gelius su norimo dydžio poromis). Poliakrilamidinis gelis

neatsorbuojasi, neturi elektooosmozės, atsparus pH ir temperatūros kitimais, netirpsta

daugelyje tirpikliuose.

Atilikus elektroforezę fermentai yra dažomi. Specifiškumą apsprendžia

dažančio tirpalo sudėtyje esantis specifinis analizuojamam fermentui substratas ir

dažančios druskos, kurios reaguoja su fermento kanalizuojamos reakcijos produktu

(Aйaлa, 1984, Harry , Hopkinson, 1977).

Toje vietoje kur tiriamasis fermentas, vyksta cheminė reakcija :

Substratas → Produktas+ druska → spalvota substancija

Ilgesniam gelių saugojimui agaro, acetilceliuliozės ir krakmolo gelio

pavyzdžiai džiovinami, o poliakrilamido laikomi 7% acto rūgštyje po to džiovinami.

Elektroforezės svarbiausi privalumai:

1. Analizuojamas sudėtingas baltymų mišinys. Naudojant specifinius

histocheminius dažymo metodus, nebereikia papildomai jų frakcionuoti

2. Yra galimybė tyrinėt šviežiai išskirtą iš įvairių audinių medžiagą

3. Analizės paprastumas ir gaunamų rezultatų informatyvumas.

Amino rūgščių skirtumų išskyrimas baltymuose priklauso nuo biologinių ir

biocheminių elektroforezės sąlygų, tokių kaip tiriamas audinio ir gelio tipas. Jei ne

visada vienodi visiems individams ir laboratorijoms, kuriose yra atliekama genetinio

kintamumo analizė. Skirtumai sąlygose gali įtakoti kai kuriuos baltymų polimorfizmo

išskyrimo skirtumus (Глазко, 1993).

Tačiau ir baltymų polimorfizmas atspindi tik dalį visų skirtumų DNR

nukleotidų sekose, nes 1) skirtumai tarp sinoniminių kodonų nekeičia koduojamų

aminorūgščių; 2) 90% ar net daugiau DNR, kuriai priklauso intronai ir vieną nuo kito

geno skiriančios nukleotidų sekų dalys, yra netransliuojamos. Todėl paskutiniame

dešimtmetyje plačiai tiriamas DNR polimorfizmas.

2.2. DNR polimorfizmas

Įvertinti DNR polimorfizmo dydį pagal nukleotidus galima keliais būdais: tiesioginiais DNR sekvenavimo metodais nustatant konkrečios genomo dalies nukleotidų sekos įvairovę skirtinguose individuose, ir netiesioginiu pagal DNR restricinių fragmentų ilgio polimorfizmą (RFIP), panaudojus Southern blotingo metodą; itin variabilias DNR sekas, sutrumpintai žymimos VNTR, dar vadinami hipervariabilūs minisatelitai (DNR “pirštų atspaudai”, angl. fingerprints); labai trumpas pasikartojančios sekos STR, pavadintos mikrosatelitais, kurias galima identifikuoti genų introninėse dalyse arba speiserinėje DNR. Hipervariabilių sekų tyrimui pakanka labai nedaug pradinės DNR kiekio, nes panaudojus polimerazinės grandininės reakcijos (PGR) metodą, specifiniai DNR fragmentai pagal atitinkamus pradmenis yra padauginami (amplifikuojama) iki tokio kiekio, kurio užtenka elektroforezinei DNR analizei, nudažius etidžio bromidu ar sidabro nitratu.

Naudojant įvairias restrikcines endonukleazes ir DNR žymes, nustatytas daug didesnis kintamumas nei pagal kraujo grupes, izofermentus ir kitus požymius, paveldimus pagal Mendelio dėsnius.

2.3. Rezultatų įvertinimas

Gautiems molekulinės ekologijos rezultatams įvertinti šiandien plačiai

naudojamas kompiuterinis duomenų apdorojimas. Izofermentinių sistemų analizės

rezultatų apskaičiavimui ir genetiniams panašumams bei skirtumams įvertinti

naudojamos kompiuterinės programos Biosys-1, Biosys-2 ir DNR - PopGene32,

TREECON. Statistiniams duomenų apdorojimams taip pat panaudojamos

kompiuterinės programos PRIMER 5.0, STATISTICA 6.0, taikomos tiek vienmatės

tiek daugiamatės analizės: Kruskalo-Voliso testas; dispersinės analizės (ANOVA,

MANOVA/MANCOVA), diskriminantinė analizė, multidimensinio skirstymo (MDS)

analizė bei RELATE ir 2STAGE analizės – pastarosios naudotos skaičiuojant

koreliaciją tarp dviejų matricų arba tarp daugiau nei dviejų atstumų matricų.

Dendrogramų sudarymui naudojamas UPGMA grupavimo metodas.

3. POPULIACIJOS, POPULIACINĖ GENETIKA

3.1 Populiacijos samprata ir tipai

Populiacija (lot. populiatio, populus – liaudis, minia) – tai vienos rūšies

genetiškai skirtingų individų grupė, užimanti tam tikrą teritoriją arba erdvę, kurioje

jie keičiasi genetine informacija. Populiacija yra elementari rūšies egzistavimo forma.

Populiacijų ekologijos terminą pirmą kartą panaudojo C. Elton (1927) savo

knygoje “Gyvūnų ekologija” teigdamas, kad populiacija yra svarbiausias ekologinis

vienetas, nes populiacijoje gausiai atsiskleidžia rūšies santykiai su aplinka ir

adaptacinės galimybės.

Populiacijų ekologijos (demekologijos) kūrėjais laikomi A. Macfelden (1965)

ir S. Švarc. Jie tvirtino, kad nėra kitos ekologijos, tik populiacijų ekologija, ir kad tik

populiacijų ekologijos pagalba galima išspręsti visų lygių ekologines problemas. Tik

tada, kai E. Odum (1983, 1986) pateikė ekosistemų mokslo koncepciją, tapo aišku,

kad populiacijų ekologija nėra visaapimantis mokslas.

Biologinių sistemų hierarchijoje rūšis yra aukščiau už populiaciją. Kiekviena

rūšis gali sudaryti daug populiacijų. Pavyzdžiui, žmonių populiacijų yra labai daug, o

rūšis viena – Homo sapiens.

Skirtumai tarp tos pačios biologinės rūšies populiacijų nėra dideli. Tos pačios

rūšies skirtingų populiacijų individai skiriasi morfologiškai. Gyvūnai skiriasi kūno

dydžiu, plaukų, akių spalva, augalai – stiebo forma, lapų, žiedų ir vaisių dydžiu,

forma bei spalva. Esminiai yra vidiniai skirtumai, slypintys genofonde. Kiekviena

populiacija turi savo genofondą. To paties genofondo individai yra genetiškai

nevienodi ir individualaus vystymosi metu nevienodai prisitaiko prie aplinkos sąlygų.

Tos pačios rūšies skirtingų populiacijų individai gali tarpusavyje kryžmintis ir keistis

genetine informacija.

Populiacijoje vyksta vienokia ar kitokia panmiksija – įvairių tipų gametų

kryžminimasis populiacijos viduje. Tarp skirtingų rūšių biologinių savybių,

gyvybingumo, sugebėjimo prisitaikyti vienokiose ar kitokiose sąlygose.

Populiacijų tipai nėra griežti. Pagal užimamas teritorijos dydį ir individų

skaičių populiacijos skirstomos į geografines, ekologines ir elementariąsias arba

mikropopuliacijas.

Geografinės populiacijos užima didžiausias teritorijas ir yra didžiausios

individų skaičiumi. Pavyzdžiui, septyntaškė boružė, užimanti didelį arealą Europoje,

Azijoje ir Šiaurės Amerikoje, sudaro keturias geografines populiacijas, kurios skiriasi

aktyvaus periodo trukme. Didžioji zylė sudaro penkias geografines populiacijas, kai

kurios iš jų net tarpusavyje nesikryžmina.

Ekologinės populiacijos – tai vietinės biotopinės populiacijos, gyvenančios

konkrečioje teritorijoje ar erdvėje. Pagal užimamą teritoriją ir pagal individų skaičių

jos daug mažesnės už geografines populiacijas ir silpnai izoliuotos.

Elementariosios arba mikropopuliacijos nėra savarankiška rūšies egzistavimo

forma. Jos skiriasi viena nuo kitos morfologiniais ir fiziologiniais požymiais, tačiau

tarp jų vyksta pilna genetinės informacijos kai俯 a.

Visos populiacijos yra dinamiškos. Kintant populiacijos individų skaičiui ir

užimamos teritorijos dydžiui, populiacijos tipas gali keistis.

Nuolat keliaujančių ar klajojančių rūšių, pavyzdžiui, šiaurės elnių,

populiacijos yra labai didelės, bet jų mažai. Sėslioms rūšims būdinga daug smulkių

populiacijų.

Pagal gebėjimą savarankiškai daugintis populiacijos skirstomos į

nepriklausomas, iš dalies priklausomas, priklausomas, pseudopopuliacijas ir laikinas

populiacijas.

Nepriklausomos arba pastovios populiacijos gali daugintis savarankiškai, be

kitų tos pačios rūšies individų imigracijos.

Iš dalies priklausomos populiacijos gali daugintis savarankiškai, bet individų

imigracija padidina populiacijos gausumą ir gyvybingumą.

Priklausomos populiacijos yra tokios, kuriose gimstamumas nekompensuoja

mirtingumo. Jeigu į tokią populiaciją neimigruoja kitų tos pačios rūšies populiacijų

individai, ji mažėja, degraduoja ir išnyksta.

Pseudopopuliacijos nesugeba savarankiškai reguliuoti savo narių skaičiaus ir

visiškai priklauso nuo individų imigracijos iš kitų populiacijų.

Laikinos arba periodiškos populiacijos susiformuoja iš nuo kitų populiacijų dėl

klimatinių ir mitybos veiksniu poveikio atskilusių individų.

Kiekvieną populiaciją apibūdina šie rodikliai:

• gausumas;

• tankumas;

• vidinė struktūra;

• gimstamumas;

• mirtingumas;

• augimo greitis;

• migracija.

Populiacijos gausumas yra bendras populiacijos individų skaičius jos

užimamoje teritorijoje.

Populiacijos tankumas tai populiacijos individų skaičius jos užimamos

teritorijos ploto (km2, m2, ha) arba erdvės tūrio (m3) vienete. Aukštesniųjų gyvūnų bei

žmonių populiacijų tankumas paprastai vertinamas individų skaičiumi kvadratiniame

kilometre.

Populiacijos gausumą ir tankumą reguliuoja aplinkos veiksniai: klimato

sąlygos, dirvožemio derlingumas, konkuruojančių rūšių poveikis, parazitai, plėšrūnai

ir kt. Vienos populiacijos koncentruojasi nedidelėse teritorijose, pavyzdžiui olandai,

japonai, kitos pasklinda plačiai, užimdamos dideles teritorijas (rusai). Įsisavindamos

naujas teritorijas ir didėdamos individų skaičiumi, populiacijos pretenduoja iš

elementarių pereiti į ekologines.

Populiacijos struktūra priklauso nuo abitinių, biotinių ir antropogeninių aplinkos

veiksnių visumos. Dėl morfologinių, fiziologinių, biocheminių, genetinių procesų,

populiacijos individų lyties, išsidėstymo užimamoje teritorijoje, amžiaus, dauginimosi

ypatumų, konkurencijos susiformuoja sudėtinga vidinė populiacijos struktūra.

3.2. Populiacinė genetika

Populiacinė genetika yra genetikos mokslo šaka, tirianti paveldimumo ir

kintamimo dėsningumus organizmų grupėse, t.y. populiacijose, kurie išreiškiami genų

dažnių paskirstymu ir kitimu įvairiose populiacijose.

Populiacija (lot. populatio – minia, liaudis) – tai istoriškai susiklosčiusi,

vienos biologinės rūšies genetiškai skirtingų individų grupė, gyvenanti tam tikroje

ribotoje rūšies arealo erdvėje ar teritorijoje ir turinti savybių, įgalinančių jai ilgai

egzistuot.

Populiacinėje genetikoje daugiausia dėmesio skiriama lokalaus inbrydingo

grupėms (kuo didesnėms ir geografiškai struktūrizuotoms) – demams, lokaliomis

populiacijomis, Mendelio populiacijoms. Būtent šiose grupėse ir vyksta sisteminiai

alelinių genų dažnių pasikeitimai.

Populiacija, kurioje bet kuris populiacijos narys gali atsitiktinai poruotis su bet

kuriuo kitu populicijos nariu (manoma, kad paprastai jie yra skirtingų lyčių) vadinama

Mendelio populiacija. Aukščiausio rango Mendelio populiacija yra rūšis.

Atsitiktinis kryžminimas – kryžminimas kai poprų susidarymui neturi įtakos

genetinė konstitucija. Asortatyvinis kryžminimas – porų susidarymą sąlygoja

genotipas.

Vienos biologinės rūšies individų grupė, gyvenanti tam tikroje ribotoje rūšies

arealo erdvėje ar teritorijoje dar vadinama lokalinė populiacija.

Organizmų pasiskirstymas rūšies areale nera vienalytis – organizmai jungiasi į

šeimynines grupes (po 4-10 individų). 20-40 šeimyninių grupių gyminystės ryšiais

susijungia į demus, o apie 4% kryžminimų įvyksta tarp organizmų iš skirtingų

lokalinės populiacijos demų.

Genofondu vadinama visų populiacijos individų genotipų visuma. Diploidinių

organizmų populiacijos, sudarytos iš n individų, genofondas susideda iš 2n genomų,

t.y. iš 2n kiekvieno lokuso genų ir n porų homologinių chromosomų.

3.3 Populiacijos genetinė struktūra: fenotipų, genotipų, alelių dažnių įvertinimas

populiacijoje

Populiacijos genetinę struktūrą ir genofondo kitimą nusako atskirų lokusų

alelių dažnis arba genotipų dažnis.

Vienetas, kuriuo operuoja populiacinė genetika, yra genas - fizinis vienetas,

kuris reprodukcijos procese yra perduodamas iš tėvų vaikams ir kuris nulemia pačias

įvairiausias organizmo savybes. Genui būdingos kelios alternatyvios savybės,

būsenos. Todėl tokie genai vadinami aleniniais. Molekuliniu požiuriu aleniniai genai

– tai skirtinga nukleotidų seka lokalizuota toje pačioje DNR atkarpoje.

Populiacinėje genetikoje laikoma , kad bet kuriame genetiniame lokuse yra

bent du aleliniai genai (genomas diploidinis). Jei jų nukleotidų seka yra identiška,

laikoma, kad individas pagal šį geną yra homozigotas, jei ne – heterozigotas, o

kartais sudėtinis (compound) heterozigotas.

Fenotipų dažnis – tai konkretaus feno dažnio pasireiškimas konkrečioje

individų grupėje, lygus individų pagal šį feną skaičiaus santykiui su tirtų individų

skaičiumi (n).

Jei žinomas ryšys tarp genotipų ir juos atitinkančių fenotipų, tai pagal

stebimus fenotipų dažnius galima apskaičiuoti genotipų dažnius. Konkretaus

genotipo dažnis randamas padalijus atitinkamų genotipų skaičių imtyje iš viso imties

genotipų skaičiaus n.

Fenotipų dažnis ne visada lygus genotipų dažniui. Jis lygus tik recesyvinių ir

kodominuojančių alelių genotipų dažniui.

Alelinis dažnis – tai tam tikro alelinio geno dažnis konkrečioje individų

grupėje. Bet kurio alelinio geno dažnis (p) tiriamoje individų grupėje yra lygus

dvigubo homozigotų (Hm) pagal šį alelinį geną skaičiaus (kadangi kiekvienas

homozigotas turi du tuos pačius alelinius genus) ir heterozigotų (Ht) pagal šį alelinį

geną skaičiaus sumai padalintai iš dvigubo individų skaičiaus (n) tiriamoje grupėje

(nes kiekvienas individas turi du alelinius genus), t. y.

p=(2 Hm+Ht)/2 n (3.1.1)

Abiejų alelinių genų dažnių suma populiacijoje visada lygi vienetui, t.y. (p+q=1).

Taip nustatytas alelinio geno dažnis yra tik empirinis ir gali skirtis nuo tikrosios šio

geno dažnio reikšmės konkrečioje populiacijoje. Todėl imtyje tiriamų individų

skaičius turi būti pakankamas (ne mažesnis 20).

Retais aleliniais genais vadinami tokie genai, kurių dažnis tiriamoje

populiacijoje yra mažesnis už 0,05. Daugelis retų alelinių genų yra žalingi ir dėl to

populiacijoje dažniausiai palaikomi tik pasikartojančių mutacijų.

Genų ir genotipų dažniai

Genotipų dažnis yra pakankamai pastovus populiacijos požymis, o genų dažniams

neaptinkama ypatinga populiacinė specifika (Benedictis de, 1978)

Genofondų kintamumas gali būti aprašomas tiek genų, tiek ir genotipų dažniais. Imtis

turi būti reprezentacinė visos populiacijos individų atžvilgiu.

Genofondas – visų populiacijos individų genotipų visuma. Diploidiniams

organizmams jis lygus 2N, kur N – individų skaičius. Kiekviename genome yra

užkoduota visa genetinė informacija, kurią tas individas gavo iš vieno iš tėvų.

Populiacijos genofondas – susideda iš 2N kiekvieno lokuso genų ir N homologinių

chromosomų porų, kur N – individų skaičius. Išimtis: lytinės chromosomos ir su

lytimi sukibę genai, kurie, kiekviename heterogametiniame organizme, egzistuoja po

vieną egzempliorių.

Genų dažniai:

A=(2*A) + AB, B=(2*B) +AB – alelių skaičius, išskaičiuojamas iš fenotipų;

Bendras alelių skaičius – 2n, nes kiekvienas individas neša po du vieno alelio

variantus;

Alelio A dažnis : a=A/2n, n – individų skaičius.

Polialelinių sistemų atveju skaičiavimų principas išlieka tas pats: homozigotiniai

individai neša po du tuos pačius alelius, heterozigotiniai – po vieną skirtingų tipų.

Viena priežasčių, kodėl populiacinėje genetikoje dažniau genetinis kintamumas

aprašomas naudojant genų o ne genotipų dažnius yra ta, kad alelinių variantų yra

žymiai mažiau nei genotipų. {jei skirtingų alelių skaičius lokuse yra k, tai įmanomų

genotipų skaičius yra k(k+1)/2} (Altūhov)

Sudėtingumas aprašant paveldimos informacijos visuma atsiranda dėl didelio

segreguojančių lokusų skaičiaus genome. Bet kokiu atveju, vienintelis būdas aprašyti

paveldimą informaciją – alelinių genų dažnių nustatymas kiekvienam lokusui. Žinant

šį dydį ir stebint jo pokyčius laike (erdvėje) atsiranda galimybė įvertinti genetinio

proceso vyksmus populiacijoje veikiant įvairiems išoriniams ir vidiniams faktoriams.

Kodominantinio paveldimumo atveju: genų dažnių įverčių patikimumas priklauso nuo

laukinės populiacijos imties dydžio. Būtinas imties dydis priklauso nuo populiacijos

genetinės struktūros ir turi būti nustatomas preliminarių tyrimų metu.

Tarkim, kad iš N diploidinių individų N1 turi alelį A, N2 – heterozigotos AB, N3 –

homozigotos BB; visų N1,2,3, suma lygi bendram individų skaičiui N. tokiu atveju

bendras genų skaičius yra 2N. kiekviena homozigota AA turi du A genus, kiekviena

heterozigota AB, po vieną A ir B geną. Bendras A genų skaičius populiacijoje A =

2N1+N2, o šio geno dažnumas: pA= (2N1+N2)/2N = (N1+1/2N2)/N. taip pat aprašomas

ir B alelio dažnumas qB. Tuomet q + p = 1. Tokiu pat principu skaičiuojama ir

polialelinėms sistemoms.

Pav. Ryšys tarp alelių ir genotipų dažnio pagal Hardy-Weinbergo pusiausvyrą

3.4. Populiacijos kintamumas

Genetinis kintamumas yra veiksnys padedantis prisitaikyti prie aplinkos

sąlygų pokyčio. Genetiniai procesai dalyvauja populiacijų dydžio reguliavime ir

kituose ekologiniuose procesuose. Atsiradę pakitimai gali nepasireikšti palikuonių

fenotipe, būti recesyvinėje arba heterozigotinėje formose. Tokiems pakitimams

pasireiškiant fenotipe, galima natūrali atranka, dėl kurios gali susiformuoti ir nauja

rūšys ( Aлтyхob, 1983).

Genetinis kintamumas plačiai paplitęs gamtinėse populiacijose, dėl ko yra palankios

sąlygos evoliuciniam kintamumui. Įvairių organizmų genetinis kintamumas yra

skirtingas (1 lentelė).

1 lentelė. Kai kurių gyvūnų ir augalų genetinis kintamumas gamtinėse populiacijose

(Ayala, 1984)

Organizmai Rūšių skaičius

Vidutinis lokusų

skaičius rūšyje

Vidutinis polimorfizma

s (P)

Vidutinis heterozigotiškumas(H)

Bestuburiai

Drosophila2

82

4 0,529 1,15

Vapsvos 6 15 0,243 0,062

Kiti vabzdžai 4 18 0,531 0,151

Jūrinai bestuburiai1

42

3 0,439 0,124

Sausumos sraigės 5 18 0,437 0,15

Stuburiniai

Žuvys1

42

1 0,306 0,078

Varlagyviai1

12

2 0,336 0,082

Ropliai 9 21 0,231 0,047

Paukščiai 4 19 0,145 0,042

Žinduoliai3

02

8 0,206 0,051

AugalaiSvidulkiniai 1 1 0,231 0,033

2 5Kryžmadulkia

i 5 17 0,344 0,078

Vidurkis

Bestuburiai5

72

2 0,496 0,134

Stuburiniai6

82

4 0,247 0,06

Augalai1

71

6 0,264 0,046

Pagrindinai genetinio kintamumo parametrai yra polimorfizmo lygis (P) ir

vidutinis (faktinis) individų heterozigotiškumas (Ho) bei alelių skaičius lokuse (A).

Šie parametrai naudojami atliekant skirtingų ar pakankamai tarpusavyje nutolusių

gyvūnų taksonominių grupių genetinio kintamumo lyginamąją charakteristiką.

Evoliucijos eigoje dėka mutacijų keičiasi genai ir populiacijoje sutinkami

nevienodoje, o keliose formose. Tokie genai kurie sudaryti daugiau nei iš vieno alelio

vadinami polimorfinais. Polimorfinai aleliai yra apsprendžiami dviejų ar daugiau,

ryškiai besiskiriančių formų koegzistavimą.

Populiacijų analizę galima vykdyti naudojant bet kokį polimorfinių sistemų

kiekį. Aišku, didinant baltymų sistemų kiekį padidėja ir galimybė aptikti skirtumus

tarp populiacijų.

Daug geresnis genetinio kintamumo matas gali būti vidutinis individų

heterozigotiškumas. Skirtingai nuo polimorfizmo šis matas pasižymi tuo, kad jame

nėra laisvumo ir netikslumo. Populiacijos heterozigotiškumas skaičiuojam dviem

etapais. Pirma susumuojama heterozigotus h pagal kiekvieną genetinį lokusą j, o po to

gautą skaičių padalijus iš tirtų individų skaičiaus n bei tirtų lokusų skaičiaus k vidurkį:

Polimorfiniu laikomas toks lokusas, kuriame esančio dažniausiai

pasitaikančio alelinio geno dažnis yra mažesnis už 0,95.

Lokusas, kuriame neaptikta skirtingų alelių nėra polimorfinis, jis vadinamas

monomorfiniu.

Populiacijos polimorfiškumas (polimorfinių lokusų dalis) nustatumas polimorfinių

lokusų skaičių dalijant iš tirtų lokusų skaičiaus k :

P = polimorf. lok. / k

Vidutinis heterozigotiškumas (faktinis) Ho nustatytas sumuojant

heterozigotus h pagal kiekvieną genetinį lokusą j ir gautą skaičių dalijant iš tirtų

individų skaičiaus n bei vidurkinant pagal tirtų lokusų skaičių:

kHo = 1/k ∑ Hj (3.2.1)

j

Hj = h/n (3.2.2)

kur, Hj – heterozigotiškumas j lokuse

Yra teigiama polimorfizmo dydžio ir heterozigotiškumo laipsnio koreliacija. Vidutinė

P reikšmė yra lygi 0,26 + 0,15; vidutinė H reikšmė lygi 0,07 + 0,05. Žmonėms

būdingos tos pačios H ir P reikšmės kaip ir kitiems žinduoliams. Ištyrus europiečius

pagal 87 genetinius lokusus pateikti tokie įverčiai: P = 0,38; H = 0,07.

Genetinio kintamumo įvertinimas.

Tradiciniai genetinės analizės metodai genetinio kintamumo populiacijų lygmenyje

neparodo, todėl vertinant genetinį kintamumą reikia:

- Nustatyti koks yra polimorfinių genų įnašas populiacijoje. Kadangi negalim

ištirti visų lokusų organizme (mes net nežinome tiksliai kiek tų lokusų ten yra), reikia

pasirinkti lokusų imtį, kuri turi būti atsitiktinė. Tokiu atveju rezultatus galima

pritaikyti visos populiacijos mastu. Norint įvertinti polimorfinių lokusų dalį, reikia

išanalizuoti nedidelį skaičių genų, kurie atstovauja nepriklausomą imtį iš visų lokusų

rinkinio. Naudojant tradicinės genetikos metodus tai yra neįmanoma, kadangi geno

buvimo faktas pas individą yra nustatomas atliekant kryžminimą tarp individų

pasižyminčių skirtingu fenotipu pagal to geno koduojamą požymį. Tuomet F1

nustačius kokią dalį užima individai su skirtingais fenotipais, galima išsiaiškinti, kiek

– vienas ar daugiau, genų dalyvauja jo formavime.

Tokiais metodais galima aptikti tik tuos genus kurie pasiduoda genetiniam

kintamumui. Tokiu atveju negalim gauti nepriklausomų genų imties duotajam

genomui, kadangi genai pagal kuriuos nevyksta kintamumas į imtį nepakliūna.

Išeitis atsirado panaudojus molekulinės biologijos metodus. Genetinė informacija

užkoduota DNR struktūrinių genų nukleotidinėse sekose, transliacijos metu

perduodama aminorūgščių sekai, susidaro polipeptidai.

Tyrimams imama baltymų imtis nieko nežinant apie jos populiacinį kintamumą.

Tokia imtis – tai nesimaišanti, visų duotojo organizmo struktūrinių genų, imtis.

Jei vienas ar kitas baltymas yra vienodas pas visus individus, vadinasi šis genas

nepasiduoda populiaciniam kintamumui. Jei stebimi skirtingi baltymo variantai –

genas pasižymi populiaciniu kintamumu.

Šiuo atfveju galima įvertinti ir genetinio kintamumo lygį t.y. nustatyti tiriamo baltymo

variacijų skaičių ir dažnį, kuriuo jos sutinkamos populiacijoje.

Polimorfinių lokusų dalis populiacijoje – P; neigiamos įverčio savybės – negriežtas

pasirinkimas ir netikslumas;

Polimorfinių lokusų skaičius priklauso nuo ištirtų individų skaičiaus. Kad išvengti

imties įtakos P įverčiui taikomi keli kriterijai: 0,95, 0,99 ir pan. Naudojant skirtingus

kriterijus gaunami skirtingi P įverčiai: jei lokusas monomorfinis pagal 95% kriterijų,

tai jis gali būti polimorfinis pagal 99% kriterijų ir pan.

Be viso šito P yra netikslus genetinio kintamumo įvertis – t.y. dėl, to, kad silpnai

polimorfiniai lokusai su labai žemu visų alelių dažniu priskiriami, pagal P, kaip

lygiaverčiai lokusams, kuriuose yra tik keli aleliai, pasižymintys normaliais dažniais.

Pvz.: 1 lokusas – a – 0,95; b – 0,05; 2 lokusas – 20 alelių su dažniais 0,05 . 2 lokusas

yra žymiai polimorfiškesnis, bet pagal 95% kriterijų abu lokusai patampa

lygiaverčiais.

Tikslesnis įvertis – H – heterozigotinių individų skaičius populiacijoje. Nėra

neigiamų P savybių.

Patikimumui H turi būti skaičiuojamas ne mažiau kaip 4 lokusams. {% išraiška}

Tai patikimas kintamumo įvertis, nes atspindi tikimybę, kad dvi duotojo lokuso alelės,

atsitiktinai paimtos iš genofondo, pasirodys esančios skirtingos.

Bet, H neatspindi genetinio kintamumo lygį populiacijose, kuriose vyksta giminingas

kryžminimąsis (“kraujomaiša”). Čia homozigotų bus daugiau nei populiacijose,

kuriose vyksta atsitiktinis kryžmiimąsis, nors alelių dažniai butų tokie patys abiejose

populiacijose. Šito išvengimui skaičiuojamas teorinis heterozigotiškumas, kuris

nustatomas pagal alelių dažnius, darant prielaidą, kad vyksta atsitiktinis

kryžminimąsis.

Įvertinant heterozigotiškumą reikia: 1) ištirti pakankamai didelį skaičių individų,

kad imties dydžiu apsprendžiamas nuokrypis būtų minimalus; 2) ištirti lokusus,

koduojančius skirtingas funkcijas; 3) Tyrimus būtina vykdyti kik galima didesniam

lokusų skaičiuje (15 – 50 lokus ). Tyrinėjant heterozigotiškumą, svarbiausia ne ištirtų

individų skaičius, bet ištirtų lokusų skaičius. Kuo jis didesnis, tuo paklaida būna

mažesnė. Kiekybiškai genetinio kintamumo analizei turi būti ne mažiau kaip 14

lokusų.

3.5 KASTLO - HARDY - WAINBERGO DĖSNIS

1903 m.W. Kastlas (W.E. Castle), o 1908 m. G.H.Hardy ir W.Weinberg’as,

nepriklausomai vienas nuo kito, suformulavo alelių pusiausvyros dėsnį

panmiksinėms populiacijoms, pagal kurį matematiškai įvertinami fenotipų, genotipų ir

alelių dažniai populiacijose:

jei populiacija tenkina panmiksinės populiacijos sąlygas

1. Organizmai tiriamoje populiacijoje yra diploidiniai;

2. Populiacijos reprodukcija vyksta lytiniu keli;

3. Kartos populiacijoje nesutampa;

4. Kryžminimasis populiacijose yra atsitiktinis;

5. Populiacija yra labai didelė;

6. Migracijos poveikis nereikšmingas;

7. Ignoruojamas mutacinio proceso poveikis;

8. Tiriamo genetinio lokuso neveikia natūrali atranka

tai 1) keičiantis kartoms alelinių genų (p ir q) dažnis nesikeičia ir jų suma yra

lygi vienetui

kadangi p+q=1, tai p2+pq=p (p+q)=p (3.3.1)

2) bet kurios kartos genotipų AA, Aa ir aa pusiausvyriniai dažniai

nesikeičia iš kartos į kartą ir yra atitinkamai lygūs p2, 2pq ir q2 ; jų dažnumų

reikšmės gaunamos alelių dažnumų sumą pakėlus kvadratu:

(p+q)2=p2+2pq+q2=1 (3.3.2)

3) genotipų dažnumas pusiausvyrą pasiekia per vieną palikuonių kartą.

Hardy - Wainberg’o- Kastlo dėsningumai teisingi bet kuriam alelių skaičiui k.

(p+q+r)2=p2+2pq+q2+2pr+2rq+r2=1

(p+q+...+z)2=p2+2pq...+q2+2pz+2zq+z2=1

Molekulinė ekologija tiria populiacijų genetinės struktūros išsilaikymo ir kitimo

erdvėje ir laike dėsningumus. H-W taisyklė atspindi panmiksinės populiacijos,

neapribotos individų skaitlingumu ir egzistuojančios ne specifinėje terpėje, genetinės

struktūros stabilumo būseną. Tokioje populiacijoje genotipų proporcijos įgyja

pusiausvyrą jau pirmoje laisvai besikryžminančioje palikuonių kartoje. Kadangi

laisvas kryžminimas tai atsitiktinis gametų apsijungimas, p2+2pq+q2 =1, kai p+q=1.

Jei nėra neigiamų faktorių veikiančių į populiaciją, tai genotipų ir genų dažnių

charakteristikos skaitlingumas išlieka nepakitęs neribotoje kartų kaitoje, t.y. genetinė

dinamika lygi 0. Tai idealus atvejis ir gamtoje praktiškai nesutinkamas, nes visada yra

natūralūs faktoriai (genų dreifas, migracijos, mutacijos, natūrali atranka), kurie išveda

populiaciją iš pusiausvyros ir pažeidžia populiacijos stabilumą. Tai evoliucijos

veiksniai.

Hardy-Wainbergo-Kastlo dėsnio taikymas

A. Genų ir genotipų skaičiavimas, kai ne visi genotipai identifikuojami dėl

dominavimo poveikio

Pvz. Žmogaus albinizmas populiacijoje aptinkamas 1/10 000 dažnumu.

Pagal H-W-K dėsnį genotipo aa dažnumas

q2=0,0001, ⇒ alelio a dažnumas q=(0,0001)1/2=0,01

⇒ alelio A – p=1-0,01=0,99 , o genotipo AA dažnumas p2=0,992=0,98

⇒ genotipo Aa dažnumas 2pq=2x0,99x0,01≈0,02

Išvada: retas alelis populiacijoje egzistuoja heterozigotinėje , o ne homozigotinėje

būsenoje

Jei 2pq / q2 = p / q ⇒ kai q⇒∞ , o p = 1 – q , tai

2pq / q2 = p / q ≈ 1 / q ⇒ vadinasi, kuo mažesnis q, tuo didesnis

heterozigotų skaičius populiacijoje.

Palikuonių kartų skaičius t = 1 / qt - 1 / qo

B. Genų ir genotipų skaičiavimas, kai genai sukibę su lytimi

Homogametinės lyties (moters, drozofilos patelių, paukščių patinų) palikuonių

genotipų dažnumas sutampa su pusiausvyriniais autosominių genų ir genotipų

dažnumais:

Jei A ≡ p ir a ≡ q, tai AA – p2 , Aa – 2pq , aa – q2

Hemizigotinės lyties (vyrų, drozofilos patinų, paukščių patelių) palikuonių genotipų

dažnumas sutampa su genų dažnumais buvusiais pas homogametinę lytį:

A - p ir a - q,

Kai recesyvinis geno dažnumas q, tai hemizigotinio fenotipo dažnumas bus q,o

homogametinio - q2, tada

q / q2 = 1 / q

ir kuo mažesnis q (q⇒∞) , tuo hemizigotinio fenotipo dažnumas bus didesnis.

Išvada: Fenotipai, sąlygoti recesyvinių genų, pas hemizigotas populiacijoje aptinkami

dažniau nei pas homozigametas

Pvz. Daltonizmo genas žmogaus populiacijose paplitęs dažnumu q=0,08.

Kadangi q / q2 = 1 / q = 1/0,08 = 12,5 , todėl vyrai 12,5 karto dažniau serga

daltonizmu nei moterys.

Problemos.

Hemofilijos genas žmogaus populiacijose paplitęs dažnumu q=0,0001. Kokiu

dažnumu hemofiliza pasireikš pas moteris?

4 ELEMENTARŪS EVOLIUCIJOS PROCESAI

Alelių dažnumą keičiantys procesai:

1. Genetinį kintamumą sąlygojantys procesai

a) Mutacijos

b) Rekombinacijos

2. Procesai padedantys genetinį kintamumą perduoti iš kartos į kartą

a) Naturali atranka

b) Migracija

c) Genų dreifas

Genotipų dažnumas keičiasi ir dėl asortatyvinio (neatsitiktinio) porų susidarymo

4.1 Natūrali atranka

Naturali atranka molekulinėje ekologijoje – pagrindinis evoliucijos veiksnys,

iššaukiantis adaptacinius pokyčius populiacinėje struktūroje.

Wt – populiacijos prisitaikymas t.t. laiko momentu.

Wt=Nt/No t.y. prieš tai buvusios kartos ir ateinančios kartos skaitlingumų santykiai;

Wt>1, populiacija auga;

Wt <1, mažėja;

Wt =1, nekinta

Genetinis populiacijos krūvis (Muller, 1950): silpno letalumo genai sugeba atnešti

populiacijai žymiai didesnį nuostolį, nei mutantiniai genai, pasižymintys stipriu

letalumu. Maksimalų genetinį krūvį viename dialeliniame lokuse populiacija neš

tuomet, kai abi homozigotos letalios; tokiu atveju kiekvienoje kartoje žūva 50%

palikuonių.

Atranka heterozigotų naudai

Atranka kai homozigotos turi žemesnį nei heterozigotos prisitaikymą vadiname

superdominavimu arba heteroze

AA Aa aa viso a dažnumaspradinis zigotų dažnumas

p2 2pq q2 1 q

Prisitaikymas, w 1-s 1 1-t

kiekvieno genotipo indėlis į F1

p2(1-s) 2pq q2(1-t) 1-sp2-tq2

normalizuotas dažnumas

p 2 (1-s) /(1-sp2-tq2)

2 pq /(1-sp2-tq2)

q 2 (1-t)/ (1-sp2-tq2)

1 q1 = ( q -t q 2 )/ (1-sp2-tq2)

Alelio dažnumo pasikeitimas:∆q = pq(sp-tq)/(1-sp2-tq2)

Gamtinė atranka heterozės atveju sąlygoja stabilios polimorfinės pusiausvyros

susidarymą

∆q = 0 , kai pq(sp-tq) = 0

bet kai populiacijoje egzistuoja du aleliai, t.y. p ir q ≠ 0 , pusiausvyra nusistovi kai

sp=tq ⇒ s(1-q) = tq ⇒ s=q(s + t)

q=s/(s+t) ir p=t/ (s+t)

Pusiausvyriniai dažnumai heterozės atveju apsprendžiami santikinėmis atrankos

koeficientų reikšmėmis, bet ne apsoliutinėmis

Pvz. Žmogaus heterozė pjautuvinės anemijos atvejuHbAHbA AbAHbS HbSHbSMaliarijai imlūs maliarijai atsparūs žūsta nesulaukę

lytinės brandosw 0,88 1 0,13

IŠVADA: genotipų prisitaikymas priklauso nuo aplinkos sąlygų

ATRANKA PRIEŠ HETEROZIGOTAS

Pvz. Įvykus translokacijoms heterozigotos mažiau prisitaikiusios už homozigotas dėl žemesnio vaisingumo

AA Aa aa viso a dažnumaspradinis zigotų dažnumas

p2 2pq q2 1 q

Prisitaikymas, w 1 1-s 1-t

kiekvieno geno- tipo indėlis į F1

p2 2pq(1-s) q2 1-2spq

normalizuotas dažnumas

p 2 (1-2spq)

2 pq (1-s) //(1-2spq)

q 2 / (1-2spq)

1 q1 = ( q -s pq )/ (1-2spq)

Alelio dažnumo pasikeitimas:∆q = spq(q-p)/(1-2spq)

∆q = 0 , kai p=q, (tai teisinga kai alelių homozigotų w vienodi)tačiau pusiausvyra nestabilikai q > p, ∆q teigiamas q didės kol A eliminuosiskai q < p, ∆q neigiamas, o a artės prie 0

T.y. a) jei populiacija gamtinės atrankos pradžioje nėra tiksliai pusiausvyroje, populiacija tols nuo pusiausvyros kol alelio a dažnumas, buvusio žemiaiu pusiausvyros, nebus lygus 0 ,o alelis pašalintas iš populiacijos

b) jei populiacija yra pusiausvyroje, tai atsitiktinis nukrypimas nuo pusiausvyros (genų dreifas ar kitos priežastys) prives iki to, kad vienas ar kitas alelis bus išstumtas iš populiacijos. (Ši gamtinės atrankos savybė bali būti panaudota kovai prieš vabzdžius-ligų pernešejus.)

Bendras atrankos pagal vieną lokusą modelis

Genotipas: A1A1 A1A2 A2A2 viso a dažnumas

pradinis zigotų dažnumas

p2 2pq q2 1 q

Prisitaikymas, w

w1 w2 w3

kiekvieno geno tipo indėlis į F1

p2w1 2pqw2 q2 w3 w = p2w1+2pqw2+

q2w3

normalizuotas dažnumas

p 2 w 1

w2 pq w 2

wq 2 w 3

w1 q1 =

q(pw2+ qw 3)w

Alelio dažnumo pasikeitimas:∆q = pq (p(w2-w1)+q(w3-w2) /w

kur w = p2w1+-2pq w2+ q2w3 vidutinis populiacijos prisitaikymas

Atranka priklausanti nuo genotipų dažnumo

Taip pat palaiko ir atveda populiaciją prie stabilaus genetinio polimorfizmo

Gamtinė atranka priklauso nuo genotipų dažnumo, kai genotipų prisitaikymas keičiasi

priklausomai nuo jų dažnumo

1) Pw atranka didelė kai genotipas retas ir maža, kai genotipas labai paplitęs

populiacijoje. Jei egzistuoja dažnumas kai abiejų alelių genotipų w vienodas, bus

pasiekta subalansuota popimorfinė pusiausvyra, net nesant heterozei.

Pvz. pupelės Phaseolus lumetus trijų genotipų SS, Ss, ss prisitaikymas w kečiasi iš

kartos į kartą, keičiantis genotipų dažnumui. WSs

2) Nuo dažnumo priklausanti lytinė atranka atsiranda kai kryžminimosi

tikimybė priklauso nuo genotipo dažnumo. (Pvz. Šiaurės tautelių papročiai).

Viduržemio vyrams labiau patinka blondinės, skandinavams – briunetės: pirmenybė

teikiama retų (populiacijoje) alelių nešiotojams

Išvada: a) nuo dažnumo priklausanti atranka retų genotipų naudai yra vienas iš

mechanizmų palaikančių genetinį polimorfizmą populiacijose, kadangi genotipo

prisitaikymas w didėja, mažėjant genotipo dažnumui;

b) nuo dažnumo priklausanti lytinė atranka gali būti ypač reikšminga esant

migracijai, nes nauji genai, atnešti į populiaciją, išlaikomi.

4.2 MUTACIJOS IR MIGRACIJOS

Mutacija – nekryptingi atsitiktiniai genetinės medžiagos pokyčiai, vykstantys

spontaniškai arba veikiant ypatingiems fiziniams, cheminiams ar biologiniams

faktoriams. Spontaninis atsiradimas – tai pagrindas naujoms alelėms, padidinančioms

populiacijos genetinį kintamumą.

Dauguma atsirandančių mutacijų yra žalingos organizmui (Muller, 1950), bet naujai

atsiradusi alelė, nedaranti žalos heterozigotinėje būsenoje, palaipsniui gali įsitvirtinti

rūšies genofonde. Homozigotinių žalingų alelių atveju veikia natūrali atranka.

Vyksta ir neutralios mutacijos ir šis procesas gali nukreipti populiacijos struktūrą nuo

HdyWnb pusiausvyros (Kimura, 1985).

Naujai atsiradusios mutacijos praradimas – negrįžtamas procesas ir jos neįsitvirtina

populiacijoje.

Mutacijos nuolat, kiekvienoje kartoje atsiranda iš naujo, ir neatmetama tikimybė, kad

taip vadinamos naujos mutacijos nebuvo atsiradusios anksčiau.

Kuomet alelio dažnis populiacijoje yra mažas, jo mutavimo į kitą aleli aptikti

praktiškai neįmanoma.

Analizuojant mutacijų įtaką į populiacijų genetinę pusiausvyrą, reikia atsižvelgti į tai,

kad:

1. tiesioginių genetinių mutacijų greitis yra viena eile didesnis nei grįžtamų

2. nors mutacijų tempas yra skirtingas kiekviename lokuse, tačiau alelio A virtimo į

a greitis yra pakankamai žemas – vidutiniškai 10-5-10-6 eilės (genui/per karta).

Migracijos – labai svarbus populiacinės dinamikos faktorius, kadangi kiekviena

populiacija gamtoje egzistuoja ne tik pati sau, bet taip pat sąveikauja ir su kitomis

populiacijomis (nebent yra pilna izoliacija). Vyksta genų kaita. Jei inmigrantai skiriasi

genetiškai, jie gali iššaukti atitinkamus alelių dažnių pokyčius jau pirmoje kartoje. Jei

genų imigracija ir emigracija yra vienodoi intensyvumo, populiacijoje nusistovi

stacionarus procesas.

4.3 ATSITIKTINIS GENŲ DREIFAS.

Atsitiktinis genų dreifas tai stochastinis genų dažnių pokytis sekančiose kartose

vykstantis dėl riboto, bet kurios realios populiacijos skaitlingumo.

Alelių dažnių kitimas, vykstant kartų kaitai, iššaukiamas atsitiktinių priežasčių, pvz.:

mažu populiacijos skaitlingumu. Tai visiškai atsitiktinis procesas, kuris priklauso t.t.

reiškinių klasei, vadinamai imties klaida. Kuo mažesnė imtis, tuo didesnė paklaida,

t.y. kuo mažiau individų kryžminasi tarpusavyje, tuo daugiau pokyčių, nulemiamų

genų dreifo, vyks alelių dažniuose. Kuo didesnis skaičius individų dalyvauja sukuriant

kitą kartą, tuo artimesnis teoriniam yra alelių dažnis.

Čia svarbiausia yra efektyvioji populiacijos dalis, kuri ir duoda pradžią sekančiai

kartai.

Kadangi alelių dažnių pokyčiai vyksta visomis kryptimis, tendencija alelio dažnio

sumažėjimui/padidėjimui visada gali pakisti į priešingą pusę, kol alelio dažnis

nepasiekia 1 arba 0. Jei alelis prarandamas (0) arba fiksuojamas (1), procesas baigiasi.

Alelių dažnis nebekinta tol, kol dėka atsitiktinės mutacijos neatsiranda naujas alelis.

Jei žinom tėvinių individų skaičių bazinėje populiacijoje ir alelių dažnį jame, galim

išskaičiuoti tikimybė gauti vienus ar kitus alelių dažnius F1 kartoje. Variansa –

kintamumo įvertis, gaunamas lyginant dvi imtis. Jei yra du aleliai su dažniais p ir q,

tėvinių individų skaičius lygus N (bazinės populiacijos genų skaičius bus 2N), tuomet

alelių dažnių variansa pirmoje kartoje: s2=pq/2N, o standartinis nuokrypis s – šaknis iš

pq/2N. šios formulės atspindi atvirkštinė priklausomybę tarp imties dydžio (2N) ir

teoriškai tikėtino alelių dažnio kintamumo.

Kumuliatyvinis efektas – atsitiktinio genų dreifo metu atsirandančių pokyčių kaupimo

efektas, kuris veda prie to, kad aleliai fiksuojasi populiacijose.

Tuo atveju kai alelių dažnių duotajame lokuse neveikia jokie kiti procesai (mutacijos,

migracijos ar atranka), evoliucija priveda prie to, kad vienas alelių bus fiksuojamas, o

visi kiti alternatyvūs – eliminuojami. Jei populiacijoje vyksta tik genų dreifas, tai

tikimybė kad duotasis alelis galiausiai fiksuosis yra lygi to alelio pradiniam dažniui.

Jei įvyksta naujo alelio atsiradimas (mutacija) tai jo dažnis 1/2N ir tai tokia tikimybė,

kad jis kada nors įsitvirtins toje populiacijoje.

Vertinant atsitiktinį genų dreifą labai svarbu įvertinti Ne – genetiškai efektyvią

populiacijos dalį.

Homozigotų sukaupimas vykstant genų dreifui parodo jo tiesioginį ryšį su inbrydingu,

t.y. apribotoje skaitlingumu populiacijoje yra sukaupiama neatsitiktinė gametų

asociacija. Toks nuokrypis nuo panmiksijos – stiprėja; išauga “kraujo” giminystės

lygis tarp populiacijos individų. {eiti į inbrydingą}.

4.4 INBRYDINGO KOEFICIENTAS

Hardy-Weinbergo dėsnis teisingas tik tuo atveju, kai vyksta atsitiktinis

kryžminimasis. Jam nesant, vyksta asortatyvinis kryžminimasis, t.y. individai su

tam tikrais genotipais tarpusavy susieina dažniau, nei tikėtina atsitiktinio

kryžminimosi atveju. Asortatyvinis kryžminimas nekeičia genų dažnių, bet keičia

genotipų dažnį. Asortatyvus kryžminimasis vyksta tada, kai dažniau kryžminasi

panašių fenotipinių bruožų individai Disasortatyvus kryžminimasis vyksta tada, kai

tarpusavyje dažniau kryžminasi skirtingų fenotipų individai

Kryžminimasis ir genotipai

Inbrydingas yra genetiškai susijusių individų kryžminimasis

Outbrydingas yra genetiškai nesusijusių individų kryžminimasis

Nesant kitų evoliucijos veiksnių, inbrydingas ar outbrydingas nekeičia alelių dažnio,

tačiau dėl tokio kryžminimosi yra pažeidžiamas genotipų balansas ir jis nebeatitinka

Hardy-Weinbergo pusiausvyros

Labai įdomi asortatyvinio kryžminimo forma – inbrydingas: kryžminimąsis

giminingų individų tarpe yra dažnesnis nei galima tikėtis atsitiktinio kryžminimosi

atveju.

Kadangi giminingi individai yra labiau genetiškai panašūs tarpusavyje, nei

negiminingi, tai inbrydingas veda prie homozigotų padidėjimo ir heterozigotų

sumažėjimo, lyginant su teoriniais duomenimis atsitiktiniam kryžminimui, nors ir

nekeičia alelių dažnio.

Inbrydingas padidina žalingų recesyvinių alelių pasireiškimo tikimybę.

Inbrydingo koeficientas – F – tikimybė, kad kurio nors individo duotame lokuse

atsiras dvi alelės, identiškos pagal savo kilmę (t.y. tikslios protėvinio alelio kopijos).

Dvi alelės, identiškos pagal savo struktūrą, nebūtinai yra identiškos ir pagal kilmę, ir

gali būti paveldėtos iš protėvių, neturinčių jokių giminystės ryšių.

Jei kiekvienoje kartoje naudojamas vienas ir tas pats inbrydinio kryžminimo tipas, tai

inbrydingo koeficientas auga sulig kiekviena karta. Kas kiekviena karta F išauga puse,

prieš tai buvusios kartos, heterozigotų dažnio įverčiu. Inbrydingo rezultate,

homozigotų dažnis populiacijoje išauga heterozigotinių individų sąskaita. Atsitiktinio

kryžminimosi populiacijose, kuriose aptinkami aleliai A ir a su dažniais p ir q,

heterozigotų dažnis bus 2pq. Populiacijose, kuriose yra inbrydingo koeficientas F,

heterozigotų dažnis bus (1-F) nuo jų dažnio atsitiktiniai besikryžminančioje

populiacijoje.

Kai F=0, inbrydingo nėra, genotipų dažniai atitinka HdyWnb pusiausvyrą.

F atspindi individų, homozigotinių pagal kurį nors lokusą, perteklių populiacijoje; taip

pat atspindi homozigotinių lokusų dalies padidėjimą atskirų individų genotipuose.

Inbrydingo koeficientas taip pat vadinamas fiksacijos koeficientu. Tai

paaiškina simbolį F. Fiksacijos koeficientas yra tikimybė, kad alelis populiacijoje

bus fiksuotas homozigotinėje būsenoje

Į populiaciją kurioje vyksta inbrydingas galima žiūrėti kaip į dviejų dalių

bendruomenę, iš kurių vienoje yra visiškas inbrydingas, o kita – visiškai panmiksinė.

Tokiu atveju, dviejų gametų A apsijungimo tikimybė: laisvo kryžminimosi

bendruomenėje yra p2, o esant inbrydingui turi būti didesnė kažkokiu teigiamu dydžiu

ε t.y. p2+ε (yra daugiau homozigotinių individų )

gametų a apsijungimo tikimybe: q2+ε;

gametų a ir A – 2pq -2ε

Genetinės pusiausvyros atveju inbrydingo koeficientas (lygys koreliacijos koeficientui

tarp apsijungiančių gametų):

F= ε/pq t.y. ε = Fpq

Tokiu atveju zigotų dalis: AA: Q1 = p2+Fpq ; Aa: Q2 = 2pq(1-F); AA: Q3 = q2+Fpq

Kai Q1+Q2+Q3 =1.

Jei didelė populiacija yra padalinta į k panmiksinių grupių, tai tokioje visumoje yra

stebimas efektas, panašus į inbrydingo pasekmes esančias nepadalintoje populiacijoje:

homozigotų dalis išauga tarpopuliacin\ės genų dažnių variansos dydžiu, heterozigotų

dalies sumažėjimo sąskaita. Li (1978): “populiacijų padalijimas į atskiras

besikryžminančias grupes formaliai ekvivalentiškas inbrydingo poveikiui visos

populiacijos mastu”. Tokios diferenciacijos laipsnis tiesiogiai susijęs su

tarpopuliacinių genų dažnių pločiu (variansa) – kuo stipriau genetiškai skiriasi

subpopuliacijos, tuo didesnė variansos Vq vertė.

Wright’o F-statistika (1943,1951) – nustatė keletą F-koeficientų, kurie apibūdina

genetinę diferenciaciją:

1. FIT – individo inbrydingo koeficientas visos populiacijos atžvilgiu

2. FIS – individo inbrydingo koeficientas subpopuliacijos, kuriai jis priklauso,

atžvilgiu

3. FST- subpopuliacijos inbrydingo koeficientas visos padalintos populiacijos

atžvilgiu

FST=Vq/vid.q(1-vid.q),

q-geno dažnis padalintoje populiacijoje

Santykis tarp šių koeficientų: FIT =F ST+(1-F ST)F IS

Visi šie indeksai rodo nuokrypį nuo panmiksijos atsirandantį dėl apsijungiančių

gametų koreliacijos ir, galiausiai, nustatomi homozigotinių ir heterozigotinių genotipų

santykiu.

FST labai svarbi biologinė prasmė: stacionariomis sąlygomis atspindi populiacijų

genofondų diferenciacijos ir integracijos procesų balansą.

GST (Nei,75): F-statistikos ekvivalentas, surišantis bendrą (H) ir vidupopuliacinę (H)

genų įvairovę tokia formule:

GST= (HT -vid.HS )/HT,

kur HT =1-Σvid.pi2

vid.Hs =1/nΣHs

Hs=1-ΣpIS2,

kur pIS - i-ojo alelio dažnis S subpopuliacijoje, o

vid.pi – vidutinis i-ojo alelio dažnis visoje padalintoje populiacijoje,

kurią sudaro n subpopuliacijų.

Vid.Hs-vidutinis subpopuliacijos heterozigotiškumas;

- HT - visos padalintos populiacijos heterozigotiškumas, laikant kad ta

populiacija atstovauja vieningaim panmiksinei bendruomenei

Inbrydingo koeficientas skaičiavimas

Inbrydingo koeficientas (F) gali būti suskaičiuotas genealogijoje analizuojant

giminingumo laipsnį.

Inbrydingo koeficientas skaičiuojamas taip:

1. Nustatomas bendrų protėvių skaičius

Bendras protėvis yra tas, kuris yra bendras abiems individo tėvams

IV-1 turi vieną bendrą protėvį I-2

2. Nustatomas inbrydingo kelių skaičius

Inbrydingo kelias = trumpiausias genealogijos kelias, jungiantis abudu tėvus ir

bendrą protėvį.

Kiekvieno inbrydingo kelio ilgis suskaičiuojamas sudedant visus individus,

sudarančius kelią, išskyrus tiriamąjį individą

Pateiktame pavyzdyje yra tik vienas kelias:

IV-1 à III-2 à II-2 à I-2 à II-3 à III-3

Jį sudaro penki nariai.

Pav. Žmogaus genealoginis medis, rodantis inbrydingą

3. Skaičiavimams naudojat formulę

F = Σ (1/2)n(1 + FA)

Kur F yra tiriamojo individo inbrydingo koeficientas,n yra individų kiekis inbrydingo kelyje (išskyrus inbredinį individą), FA yra bendro protėvio inbrydingo koeficientas, Σ rodo sumą dydžių (1/2)n(1 + FA), paskaičiuotų kiekvienam inbrydingo keliui

Pateiktame pavyzdyje yra tik vienas bendras protėvis. Kadangi nieko nežinoma apie

jo paveldėjimą, daroma prielaida, kad FA=0

F = Σ (1/2)n(1 + 0)

F= (1/2)5 = 1/32

F = 3.125%

(F = 3.125%) Rodo geno homozigotiškumo tikimybę individe IV-1. Tai atsitinka dėl

paveldėjimo iš bendro protėvio I-2

Inbrydingo pasekmės gali būti įvertintos ir populiacijoje.

Tegul alelių A ir a dažnis yra p ir q. Tada genotipų dažniai bus nusakomi taip

p2 + Fpq atitinka AA dažnį

2pq(1 – F) atitinka Aa dažnį

q2 + Fpq atitinka aa dažnį

Tegul p = 0.8, q = 0.2 ir F = 0.25, tada genotipų dažniai bus

AA = p2 + Fpq = (0.8)2 + (0.25)(0.8)(0.2) = 0.68

Aa = 2pq(1 – F) = 2(0.8)(0.2)(1 – 0.25) = 0.24

aa = q2 + Fpq = (0.2)2 + (0.25)(0.8)(0.2) = 0.08

Esant inbrydingui bus: 68% AA homozigotų, 24% heterozigotų, 8% aa homozigotų

Nesant inbrydingo (t.y., F=0) bus: p2 = 64% AA homozigotų, 2pq = 32%

heterozigotų, q2 = 4% aa homozigotų

Išvada: Taigi, inbrydingas didina homozigotų dalį ir mažiną heterozigotų dalį.

Gamtinėse populiacijose inbrydingo koeficientas didėja, mažėjant populiacijos

dydžiui.

Inbrydingas gali turėti tiek teigiamų, tiek ir neigiamų pasekmių populiacijai.

Teigiamos pasekmės stebimos žemės ūkio kultūrose - inbrydingas gali padidinti

proporciją homozigotų, turinčių reikalingą požymį. Kaip neigiama pasekmė yra tai,

kad padidėja paveldimų recesyvinių ligų - inbrydingas padidina homozigotiškumo,

tuo pačiu ir ligos, tikimybę.

Inbrydinė depresija ir heterozė.

Selekcijos metu siekiama išvesti linijas pasižyminčias pačiomis geriausiomis

savybėmis, todėl tėviniai individai atrenkami su ryškiausiais požymiais. Vyksta

dirbtinė atranka. Dažnai vykdomas sistemingas inbrydingas, padidinantis

homozigotiškumą…bet…inbrydingas dažnai priveda prie labai svarbių gyvybiškų

savybių, kaip reprodukcija, gyvybingumas, suprastėjimo pas palikuonis. Tai

vad(inama inbrydine depresija. Ji atsiranda dėl letalių recesyvinių alelių

homozigotiškumo.

Heterozės efektas – priešingas inbrydinei depresijai. Pasiekiamas kryžminant

nepriklausomų inbrydinių linijų atstovus. Hibridai pasižymi geresnėmis savybėmis.

Inbrydinės linijos dažnai būna homozigotinės pagal kurį nors reikiamą “teisingą”

alelį, todėl jas sukryžminus, homozigotiškumas pagal dirbtinai atrinktus požymius

išlieka, o “neteisingi” aleliai pereina į heterozigotinę būseną.

5 GENETINIS PANAŠUMAS I IR DISTANCIJA D

Turint daugiau nei dvi imtis, ir analizuojant kelias polimorfines sistemas reikia

įvertinti genetinio panašumo indeksą (I).

Molekulinėje ekologijoje labai svarbu žinoti koks skaičius genų sutampa ir koks

yra skirtingas tarpe dviejų tiriamų populiacijų. Tokios žinios duotų atsakymą į

klausimą, kokio kiekio reikia genų pakaitalų, kad dvi palikuonių linijas atpažinti kaip

naujas rūšis. Išanalizavus ryšį tarp genų ar DNA cheminės struktūros ir baltymus

sudarančių amino rūgščių segmentų atsirado galimybė studijuoti genetinius skirtumus

analizuojant baltymų amino rūgščių seką. Daugelis tyrėjų analizavo to paties baltymo

amino rūgščių segmentų skirtumus pas skirtingus organizmus ir nustatė amino rūgščių

ir genų pakitimų per t.t. laiko vienetą konstantas. Šis metodas labai pasitarnavo tiriant

ilgalaikę evoliuciją, kaip šeimų, eilių ir klasių evoliuciją. Rūšių ir porūšių lygyje šis

metodas nėra labai sėkmingas, kadangi genetiniai pokyčiai šiame lygmenyje per

metus yra per maži. Kad šis metodas būtų naudingas analizuojant rūšių evoliucija turi

būti ištiriama labai daug baltymu sistemų, o amino rūgščių sekų tyrimai yra

pakankamai brangus.

Galimas ir kitas metodas kuris yra greitesnis tačiau ne toks tikslus. Grubus

panašumo įvertinimas gali būti gaunamas analizuojant baltymų elektroforetinį

judrumą. Šis metodas buvo panaudotas Hubbio ir Throckmortono studijose

analizuojant genetines distancijas tarp dvieju skirtingų Drosophila rušių. Išanalizavus

didelį kiekį baltyminių sistemų buvo parodyta kad sibsams budinga didesnis kiekis

bendrų baltymu negu ne-sibsams, bei morfologinių požymių koreliacija su baltymų ir

genų skirtumais. Kadangi amino rūgščių pakitimai per metus pasirodė besą konstanta

ir būdinga daugeliui skirtingų rūšių, pasiūlyta išvada kad sibsams būdinga didesnė

divergencija vieniem nuo kitų, nei ne-sibsams.

M. Nei pasiūlė patogų būdą, pagal kurį, turint elektroforezinius duomenis

galima įvertinti populiacijoje vykstančią genetinę diferenciaciją. Naudojami du

įverčiai:

Genetinis panašumas (I), įvertinantis struktūrinių genų dalį, kurie identiški

abiejose populiacijose.

Genetinė distancija (D), įvertina vidutinišką alelinių pokyčių skaičių

kiekviename lokuse, įvykusių šių populiacijų atskiros evoliucijos metu.

Aleliniai pokyčiai atsiranda tuomet, kai alelinių mutacijų vykstančių atskiruose

lokusuose metu, alelis yra pakeičiamas kitu aleliu arba pasikeis visas alelinių genų

rinkinys iš karto.

Šis metodas įvertina tai, kad alelių pakeitimas gali būti nepilnas, t.y. kažkurioje

populiacijos dalyje naujas alelis gali pakeisti seną, kuris, su didesniu ar mažesniu

dažniu, vis tiek yra aptinkamas populiacijoje.

0<I<1, 0- lyginamose populiacijose nėra bendrų alelių; 1- alelių dažniai yra

vienodi abiejose populiacijose;

0<D<∞, 0 - nėra jokių alelinių pokyčių. Ši reikšmė gali būti didesnė už 1

kadangi evoliucinio proceso metu, vykstančio ilgą laiką, kiekvieno lokuso aleliai gali

būti ne vieną kartą pilnai pakeičiami.

Ik=∑ai bi / √∑ai2 ∑ bi

2,

k- lokusas kurio atžvilgiu populiacija yra polimorfinė pagal i skirtingų alelių; A

ir B – dvi populiacijos; ai ir bi, i-ojo alelio dažniai atitinkamai A ir B (laisvai

besikryžminančios) populiacijose. Jei abi populiacijos monomorfinės pagal tą patį

alelį lokuse, t.y. a ir b lygūs 1, gemnetinis panašumas irgi lygus 1, t.y. populiacijos yra

tapačios pagal šį lokusą; jei lokusas monomorfinis pagal skirtingus alelius (a-0, b-1), I

bus 0, t.y. nėra visiškai jokio tapatumo. ___

Kelių lokusų atveju

Iab=Σaibi, Ia=Σai, Ib=Σbi, tada I=Iab/√IaIb

O genetinė distancija

D= - lnI

Jei nevyksta selekcija ir alelės atsiranda dėl protėvinėje populiacijoje įvykusios

mutacijos Ia,

Ib yra lygūs Wright’o inbrydingo koeficientui.

Genetinės distancijos ir panašumo įvertinimui užtenka 3 lokusų (min)

Pvz.: I-0,525, D-0,644, dviejų populiacijų nepriklausomos evoliucijos eigoje

kiekviename iš 100 lokusų vidutiniškai įvyko 64,4 aleliniai pakitimai (0,64 pakitimai

vienam lokusui).

Taikant Wehrhahns’o(1975) {šis išrado tikimybinį metodą, kuriuo yra tiriami

homologinių baltymų tarpe atsirandantys krūvių pokyčiai; minusas – daryta prielaida,

kad populiacija prasideda nuo vieno alelio.} populiacinės divergencijos numerinius

apskaičiavimus Nei (1972) distancijos patikrinimui, buvo parodyta, kad ši D

išskaičiuota iš elektroforezinių duomenų yra maždaug 10% mažesnė nei tikėtinas

aminorūgščių pakitimų, iššaukiančių krūvio pokyčius ankstyvojoje populiacijų

divergencijos stadijoje, skaičius ir tai gali nulemti nepakankamų įverčius lyginant dvi

rūšis.

Individų imtis įvertinant vid.H gali būti labai maža, jei yra išanalizuojamas

didelis lokusų skaičius ir vid.H yra žemas. Individų skaičius D įvertinimui taip pat

gali būti labai mažas jei D yra didelė, o vidH tarp dviejų lyginamų rūšių yra žemas.

Paišant dendrogramas, remiamasi D skirtumais tarp skirtingų rūšių porų. Jei šie

skirtumai maži, D turi būti išstudijuota preciziškiau. Tokiu atveju turi būti ištirtas

pakankamai didelis individų skaičius kiekvienam tiriamam lokusui. Jei skirtumai labai

dideli, net vieno individo gali užtekti, kad nustatyti jo tikslią dendrogramos

topologiją. Organizmuose, kuriuose vidH didesnis už 0,1 turi būti išanalizuotas

sąlyginai dielis individų skaičius, kad dendrograma būtų teisinga.

Nei unbiased vidH ir D įverčius galima taikyti bet kokiam individų skaičiui, ir

tie įverčęiai bus kokybiški, nepriklausomai nuo to kiek lokusų yra išanalizuota.

Skirtumai tarp biased ir unbiased įverčių yra labai maži kai ištirtų individų skaičius

yra labai didelis (50 ir daugiau).

MinD=-ln [vidGab/√vidGavidGb],

vidGa ir vidGb vidurkinės reikšmes (2naIa-1)/(2na-1) ir (2nbIb-1)/(2nb-1) per visus

ištirtus lokusus r, atitinkamai, o vidGab = Iab. n – individų skaičius (A(a) ir B(b)

populiacijose). Ga ,Gb ir Gab yra Σpi2,Σqi

2, Σ piqi reikšmės per visus lokusus genome. Ia

, Ib ir Iab individų geno identiškumas: Σai2,Σbi

2, Σ aibi vidurkinės reikšmės r ištirtiems

lokusams.

UnbH naudojama jei yra mažas individų skaičius, ir nedidelis skaičius lokusų

išanalizuotas (normoje turi buti atliekama min50 lokusų analizė). Pavyzdžių variansa

įvertina ytarplokusinę ir vidulokusinę variansas.

Genetinis polimorfizmas stebimas gamtinėse populiacijose yra įvairių

evoliucinių jėgų ilgalaikio poveikio rezultatas. Tokiu atveju, teorija aiškinanti

genetinio polimorfizmo esmę turėtų paaiškinti ir evoliucinius pokyčius populiacijoje

vykusius praeityje. Li ir Nei (1975): laikantis mutacijų dreifo hipotezės, tikėtina kad

H koreliacija silpnėja greičiau, nei genetinis I, iklgejant evoliucijos laikui.

Kitų autorių formulės

Cavalli-Sfoza et al(1967):

greičiausiai, ją reik naudoti kai analizuojama populiacijų divergencija rūšies

viduje veikiant atsitiktiniam genų dreifui.

I=(2√2/π)√(1-r),

m

kur r=Σ√piqi, r<1; r=1, kai lyginamos populiacijos yra identiškos. i=1

Edwards (1971):

8(1-r)/ (1+Σ√pi/m)(1+ Σ√qi/m)

m – suminis alelių skaičius lyginamose populiacijose.

________________________

Nei (1972)

m m m

I=Σ(piqi)/ √ ((Σpi2 )(Σqi

2)), i=1 i=1 i=1

gali blogai įvertinti panašumą, jei populiacija ryškiai skiriasi pagal retus alelius

(20%). Jei A ir B populiacijose sutampa 20% alelių tai I rodo visišką panašumo

nebuvimą.

_________________

Sokal, Sneath, 1963:

I=Σpiqi, kuo polimorfiškesnės identiškos populiacijos tuo mažesnė I reikšmė.

_______________________

Rogers (1972):

D=√Σ(pi -qi)2,

Kuo polimorfiškesnės lyginamos populiacijos tuo rodo mažesnę D

2. lentelė. Genų dažnumų p, q bei genotipų dažnumų p2, 2pq, q2 reikšmės.

p p2 2pq q2 q p p2 2pq q2 q.01 .0001 .0198 .9801 .99 .26 .0676 .3848 .5476 .74.02 .0004 .0392 .9604 .98 .27 .0729 .3942 .5329 .73.03 .0009 .0582 .9409 .97 .28 .0784 .4032 .5184 .72.04 .0016 .0768 .9216 .96 .29 .0841 .4118 .5041 .71.05 .0025 .0950 .9025 .95 .30 .0900 .4200 .4900 .70.06 .0036 .1128 .8836 .94 .31 .0961 .4278 .4751 .69.07 .0049 .1302 .8649 .93 .32 .1024 .4352 .4624 .68.08 .0064 .1472 .8464 .92 .33 .1089 .4422 .4489 .67.09 .0081 .1638 .8281 .91 .34 .1156 .4488 .4356 .66.10 .0100 .1800 .8100 .90 .35 .1225 .4550 .4225 .65.11 .0121 .1958 .7921 .89 .36 .1296 .4608 .4096 .64.12 .0144 .2112 .7744 .88 .37 .1369 .4662 .3969 .63.13 .0169 .2262 .7569 .87 .38 .1444 .4712 .3844 .62.14 .0196 .2408 .7396 .86 .39 .1521 .4758 .3721 .61.15 .0225 .2550 .7225 .85 .40 .1600 .4800 .3600 .60.16 .0256 .2688 .7056 .84 .41 .1681 .4838 .3481 .59.17 .0289 .2822 .6889 .83 .42 .1764 .4872 .3364 .58.18 .0324 .2952 .6724 .82 .43 .1849 .4902 .3249 .57.19 .0361 .3078 .6561 .81 .44 .1936 .4928 .3136 .56.20 .0400 .3200 .6400 .80 .45 .2025 .4950 .3025 .55.21 .0441 .3318 .6241 .79 .46 .2116 .4968 .2916 .54.22 .0484 .3432 .6084 .78 .47 .2209 .4982 .2809 .53.23 .0529 .3542 .5929 .77 .48 .2304 .4992 .2704 .52.24 .0576 .3648 .5776 .76 .49 .2401 .4998 .2601 .51.25 .0625 .3750 .5625 .75 .50 .2500 .5000 .2500 .50

6. MOLEKULINĖS EKOLOGIJOS LABORATORINIAI DARBAI

. Baltymų įvairovės tyrimas

Tikslas: Nustatyti tam tikros vietovės gyvūnų izofermentinį kintamumą.

Tyrimo medžiaga. Baltymų elektroforezės metodu tyrimui naudojama po 20-

30 individų iš 4 (ar daugiau) rajonų, 4-8 skirtingų biotopų, audinių (kraujo, raumenų

ar kepenų) mėginiai.

Homogenizavimas: Atšildytas kepenų audinio gabaliukas homogenizuojamas

stikliniame homogenizatoriuje pridedant 0,6 ml homogenato tirpalo.

Homogenizavimo terpė ruošiama iš:

1% Tritonas X–100 -1 ml

MgCl2 x 6H2O – 0,4 g

0,2 M Tris – HCl buferis pH 8 - iki 100 ml

(Tris – 0,6 g; 1 N HCl - 27,5 ml; vanduo iki 100ml)

Saugant biologinius pavyzdžius nuolat vyksta natyvios baltymų struktūros

pakitimai, dėl:

• denatūracijos (polipeptidinių grandinių struktūriniai pokyčiai);

• agregacijos (kelių molekulių susijungimo);

• dezagregacijos į subvienetus (ketvirtinės struktūros praradimas);

• polipeptidinių grandinių degradacijos (pirminės struktūros pokyčiai dėl

proteolitinių fermentų veikimo).

Visi išvardyti procesai nulemia baltymų biologinių savybių praradimą

(fermentinį aktyvumą ir kt. funkcijas) ir tuo įtakoja jų elektroforezinį paslankumą.

Paruoštus homogenatus iki bandymų ir tarp jų laikomi -20°C temperatūroje,

kad fermentai nedegraduotų, neapsikrėstų bakterijomis ir grybeliais, įnešančius

papildomo proteazių aktyvumo.

Centrifugavimas: Jo metu pavyzdžiai paruošiami tyrimui. Centrifugavimo

greitis priklauso nuo pavyzdžio savybių. Centrifuguojama 15 sek. 1,5 tūkst.

apsisukimų per minutę greičiu.

Elektroforezė poliakrilamidiniame gelyje (PAAG)

Aparatūra:

Nespecifinių baltymų ir izofermentų elektroforezei PAAG gelio bloke buvo

naudojama vertikalios gel-elektroforezės aparatai „HIMFILL“, Tallin (4 pav.),

kuriuos sudaro:

- Nejudrūs plieno ir platininis elektrodai

- Kameros buferiui. Suformuojamos įstačius rėmelius nešėjui.

- Rėmeliai nešėjui, kurį kiekvieną sudaro korpusas ir du stiklai

(115x120x1,5 mm).

- Standartinės „šukutės“ pavyzdžių užnešimo vietoms („šulinėliams“)

formuoti gelyje.„Šukutės“ sudaro 13 „šulinėlius“ formuojančių plokštelių

- Tekančio vandens principu veikianti šaldymo sistema ( palaikoma +4ºC

temperatūra)

Darbo metu naudojami 2301 Mcrodrive 1 Power Supply ir УИП-1

maitinimo šaltiniai.

4 pav. Vertikalios gel-elektroforezės aparatai

PAAG bloko paruošimas:

Elektroforezė, priklausomai nuo tiriamos izofermentų sistemos, buvo

atliekama dvisluoksniame vertikaliame 5 / 7,5 % ir vienasluoksniame 5 % PAA

gelyje. Geliai ruošiami remiantis Harry ir Hopkinson (1975) metodinėmis

rekomendacijomis su kai kuriomis modifikacijom.

Pirmiausiai buvo paruošiama 20% AKA:

Akrilamidas 96g

Bis 4g

Dist.vanduo iki 500ml

Paruoštas tirpalas nufiltruojamas ir laikomas tamsoje prie 3-4ºC

temperatūroje.

Tai monomerų tirpalas naudojamas akrilamido linijų polimerų susiuvimui.

Nuo jo santykio priklauso gelio elastingumas ir poringumas.

Taip pat reikia pasiruošti gelinį buferį (Tris-glicininis buferis, pH 8,3):

0,0495 M Tris 6g

0,383 M Glicininas 28,8g

Dist.H2O iki 1000ml

Tris- EDTA-H3BO3 buferis, pH ~8,3 – 8,4 (Peacock et al., 1965)

0,9 M Tris 109,3 g

0,025 M Na2EDTA* 2 H2O (trilonas B) 9,30 g

0,89 M H3BO3 55,04 g

H2O dist. iki 1000 ml

Darbinis buferis:

Tris- EDTA-H3BO3 buferis, pH 8,3 -8,4 200 ml

H2O dist. iki 2000 ml

Gelinis buferis palaiko ir stabilizuoja nešėjo pH, taip įtakodamas medžiagos

migracijos greitį. Be to jis taip pat naudojamas kaip tiriamo pavyzdžio tirpiklis.

Naudojant didelės joninės jėgos buferius, pavyzdžių migracijos greitis mažėja,

sumarinė srovė didėja, išsiskiria šilumos kiekis. Mažinant buferio joninę jėgą

migracijos greitis didėja, sumarinė srovė ir išsiskiriantis šilumos kiekis mažėja, didėja

difuzija ir mažėja skiriamoji geba.

Paruošiami PAAG su skiriamosiomis AKA koncentracijomis:

TEMED (N,N,N,N′- tetrametiletilendiamidas) naudojamas kaip polimerazinės

reakcijos katalizatorius.

PCA naudojamas kaip polimerizacijos iniciatorius.

Ruošiant dvisluoksnį PAAG, koncentruojantis sluoksnis sudaro 1/3-1/4

bendro galutinio tirpalo, o skiriantysis 2/3-3/4. MDH (Malato dehidrogenazė), ME

(Malik fermentas) ir G6PDG (Gliukozė-6- fosfato dehidrogenazė) sistemas tiriant

Komponentai Gelio koncentracija 5% 7,50%20 % AKA 20 ml 30 ml

Pagrindinis buferis 8 ml 8 mlTEMED 0,08 ml 0,08 mlDist.H2O iki 75 75 mlPCA 0,08 g 0,08 g

Galutinė išeiga 80 ml 80 ml

buvo naudojam vienasluoksnis 5 % PAA gelis, o NB (Nespecifinis baltymas) ir EST

(Esterazės) dvisluoksnius 5 % / 7,5% PAA gelius.

Pagrindinės savybės suteikiančios PAAG privalumą prieš kitus nešėjus:

• Pagal porų dydį galima varijuoti plačiose ribose. Gelio procentingumas

pasirenkamas empiriškai, atsižvelgiant į frakcionuoto objekto molekulinę

masę.

• Naudojamo buferio pH neturi ryškios įtakos gelio polimerizacijos

procesui, kas suteikia galimybę eksperimento metu pasirinkti pačias

palankiausias sąlygas.

• PAAG būdinga žemo laipsnio absorbcija ir elektroendoosmozė, dėl ko

makromolekulių migracijos metu dažniausiai išvengiama šalutinių efektų.

• Makromolekulių frakcionavimo laikas PAAG yra sąlyginai trumpas

lyginant su kitais nešėjais.

Prieš sustingstant geliui į jį įdedama „ šukutės“kurios prieš eksperimentą

išimamos ir formuoja „kišenes“ į kurias įnešamas tiriamas homogenatas. Gelių

polimerizacija trunka apie 15-20 minučių.

Elektroforezės paruošimas:

Kamera elektroforezei buvo paruošta sekant nurodymus instrukcijoje.

Elektrodiniai indai užpilami atitinkamu elektrodiniu buferiu. Naudojam šaldymo

sistema, kuri elektroforezės kamerose palaiko 3-5ºC temperatūrą. Elektroforezės metu

bloko pašildymas gali sukelti fermentų inaktyvaciją bei rezultatų iškraipymą.

Paleidžiama preelektroforezę (160V, 30 minučių), kurios metu iš gelių išvaromas

PCA (nes jis yra vienintelis kenksmingas komponentas, kuris veikia fermentus, todėl

prieš pradedant frakcionavimą pašalinamas iš gelio preelektroforezės būdu).

Prieš eksperimentą buvo pasiruošiama dešimt bandinių su 7 µl 40 %

sacharozės tirpalo, kuris suteikia klampumą ir neleidžia pavyzdžiui išplaukti

apsaugodamas nuo išplaukimo efekto pavyzdžių užnešimo į „kišenes“ metu. Taip pat

įlašinama lašas bromfenolio mėlynojo. Tai vadinamas lyderinis dažas (angl. tracker

dye) kurio migracijos greitis yra didesnis nei frakcionuojamų sistemų, todėl pagal jį

stebima elektroforezės eiga. Taip pat imama 10 µl bandinio ir sumaišius su sacharoze

bei bromfenolio mėlynuoju užnešama individualiai į jam skirtą „kišenę“.

Elektroforezė vykdoma tokiu režimu:

I etapas: Pavyzdžių išėjimas iš „kišenių“ (40mA, 20 minučių). Šio etapo metu

baltymai koncentruojasi buferio/gelio riboje ir glaustesnėje formoje patenka į gelį.

II etapas: Darbinis režimas. Srovė pakeliama iki 250V ir frakcionavimas

atliekamas 1-2 valandų.

Baltymų dažymas

Dažymo principas:

Po elektroforezės izofermentų lokalizacija nustatoma dažymo metu.

Specifiškumą apsprendžia dažančio tirpalo sudėtyje esantis specifinis analizuojamam

fermentui substratas ir druskos, kurios reaguoja su fermento kanalizuojamos reakcijos

produktu :

Substratas + fermentas → produktas+ druska → spalvota substancija

Nespecifinio baltymo ir esterazių dažymo metu spalvota substancija susidaro

vykstant druskų kondensacijai su aromatiniu diazotiniu komponentu (FBRR, CBB).

Nespecifinės esterazės (EST) pasižymi labai didele genetine įvairove.

Dehidrogenazių dažymo metu, vyksta tetazolio (NBT) oksidacijos - redukcijos

reakcija, susidaro formazanas, netirpus tamsiai mėlynos-violetinės spalvos junginys.

Dažai gaminami prieš pat dažymą. Bandymo metu buvo dažomi šie fermentai:

• MDH ( Malato dehidrogenazė);

• ME (Malik-fermentas);

• G6PDG ( Gliukozė-6- fosfato dehidrogenazė);

• NSP ( Nespecifinis baltymas)

• EST ( Esterazės)

• LDH ( Laktato dehidrogenazė)

• XDH ( Ksantino dehidrogenazė)

Dažų paruošimas:

Malik-fermentas [ME, E.C. 1.1.1.40

Pagal Ayala et. (1972), Cross et al..(1979) metodikas su tam tikromis

modifikacijomis:

0,05 M Tris-HCl buferis, pH 8,5 100 ml ( 25 ml 0,2 M Tris + 15 ml 0,1 N HCl

+ dist. H2O iki 100ml) arba ( 0,6 g Tris į 25 ml H2O + 15 ml 0,1 N HCl + dist. H2O

iki 100ml)

Malic acid Na2 salt 0,1 g

MgCl2 ∙ 6 H2O 0,025 g

PMS 0,002 g

NBT 0,03 g

NADP 0,04 g

Inkubuojama 37ºC temperatūroje tamsoje 2-4 valandas. ME izofermentai

dažosi tamsiai violetine spalva.

Reakcija: Malic acid Na2 salt + NADP ↔ piruvatas + CO2+ NADPH + H

Malato dehidrogenazė [MDH, E.C. 1.1.1.37]

Pagal Brewer ( 1970) metodika su tam tikromis modifikacijomis:

0,05 M Tris-HCl buferis, pH 8,5 100 ml ( 25 ml 0,2 M Tris + 15 ml 0,1 N HCl

+ dist. H2O iki 100ml) arba ( 0,6 g Tris į 25 ml H2O + 15 ml 0,1 N HCl + dist. H2O

iki 100ml)

Natrio malatas 0,1 g

NAD 0,03 g

NBT 0,03 g

PMS 0,002 g

Inkubuojama 37ºC temperatūroje tamsoje 2 valandas. MDH izofermentai

dažosi tamsiai violetine spalva.

Reakcija: Natrio malatas +NAD ↔ oksalacetatas +NADH +H

Glukozo-6-fosfato dehidrogenazė [G6PDH, E.C. 1.1.1.49]

Pagal Brewer ( 1970) metodika su tam tikromis modifikacijomis:

0,5 M Tris-HCl, pH 7,1 25 ml (1,2g Tris + 45 ml 0,1 N HCl iki pH7 + dist.

H2O iki 100ml)

NADP 0,03 g

NBT 0,02 g

PMS 0,002 g

D-glucose-6-phosphate disodium salt 0,2 g

H2O iki 90ml

Gelis inkubuojamas 37ºC temperatūroje tamsoje apie 1 valandą. Aktyvumas

pasireiškę tamsiai mėlynomis juostomis.

Esterazės [EST, nespecifinės]

Pagal Brewer ( 1970) metodika su tam tikromis modifikacijomis:

α-Naftilacetato tirpalas 0,06 g

Acetonas 3 ml

FBRR ( angl. Fast blue RR salt) 0,06 g

H2O iki 100ml

Inkubuojama 30 minučių. Esterazės pasireiškia rausvos- rudos spalvos

zonomis, naudojant α- izomera – tamsiai rudos spalvos.

Nespecifinis baltymas [NSP]

Comasie blue G-250 arba R-250 0,2 g

HClO4 17,5 ml

H2O iki 500ml

Inkubuojama kambario temperatūroje apie vieną parą. Baltymų frakcijos

nusidažo tamsiai mėlyna spalva.

Laktato dehidrogenazė [LDH, E.C. 1.1.1.27]

0,05 M Tris-HCl buferis, pH 7,5 100ml

Na laktatas 0,2 g

PMS 0,005 g

NBT 0,03 g

NAD 0,02 g

Inkubuojama prie 37ºC temperatūroje tamsoje apie valandą. dažosi tamsiai

mėlyna spalva.

Ksantino dehidrogenazė [XDH, E.C. 1.1.1.204] monomeras arba dimeras.

0,05 M Tris- HCl buferis, pH 8,5 100ml

Hypoxanthine 0,1 g

NAD 0,03 g

NBT 0,02 g

PMS 0,002 g

Inkubuojama prie 37ºC temperatūroje tamsoje.

Po dažymo geliai fiksuojami 7% acto rūgšties tirpale ir įdedami į uždaromą

maišelį.