MOLECULAIRE SPECTROFOTOMETRIE

Principe:Principe: In de spectrofotometrie wordt de concentratie van een In de spectrofotometrie wordt de concentratie van een gekleurde stof bepaald door de kleur dan de oplossing van die stof gekleurde stof bepaald door de kleur dan de oplossing van die stof te vergelijken met oplossingen waarin diezelfde gekleurde stof zit te vergelijken met oplossingen waarin diezelfde gekleurde stof zit maar dan in concentraties die bekend zijn. De kleur kan afkomstig maar dan in concentraties die bekend zijn. De kleur kan afkomstig zijn van de stof zelf maar kan ook het reactieproduct zijn van de te zijn van de stof zelf maar kan ook het reactieproduct zijn van de te meten stof met een geschikt reagens.meten stof met een geschikt reagens.

Concentratie van een onbekende kan al met het blote oog geschat Concentratie van een onbekende kan al met het blote oog geschat wordenworden

Sneltesten: indicator strips (bijvoorbeeld voor aquaria: nitraat, nitriet, ...)Sneltesten: indicator strips (bijvoorbeeld voor aquaria: nitraat, nitriet, ...) Nauwkeurige meting: met spectrofotometerNauwkeurige meting: met spectrofotometer

Oplossing heeft een kleur omdat het een gedeelte van het licht Oplossing heeft een kleur omdat het een gedeelte van het licht absorbeertabsorbeert

MOLECULAIRE SPECTROFOTOMETRIE

WAT IS LICHT ?

LICHT = elektromagnetische golven

Naargelang de energie-inhoud van deze golven wordt het elektromagnetisch spectrum opgesplitst in :

Gammastraling (behandeling van kanker)

X-stralen (geneeskunde)

Ultraviolet stralen

Zichtbaar licht

Infrarood stralen

Microgolven (microgolfovens)

Radiogolven (F.M. radio, radar, televisie)

veel energie

weinig energie

MOLECULAIRE SPECTROFOTOMETRIE

WAT IS LICHT ?

Enkel een klein deel van het elektromagnetisch spectrum is voor de mens zichtbaar als kleur.

Dit is dan het zichtbare gedeelte.

In dit zichtbare deel van het spectrum kunnen we 7 basiskleuren onderscheiden (dit zijn de kleuren van de regenboog):

Rood, Oranje, geel, groen, blauw, indigo en violet.

MOLECULAIRE SPECTROFOTOMETRIE

Ultra Violet (UV)Ultra Violet (UV) 200 - 400 nm 200 - 400 nm

Zichtbaar (Visible - Vis) 400 - 800 nmZichtbaar (Visible - Vis) 400 - 800 nm

Nabij Infra Rood (NIR) 800 - 2500 nmNabij Infra Rood (NIR) 800 - 2500 nm

Infra Rood (IR)Infra Rood (IR) 2500 - 12500 nm 2500 - 12500 nm

Licht is een elektromagnetisch golfverschijnsel dat zich in vacuum met een constante snelheid (c) van ca. 300 000 km/s voortplant.Een golf kunnen we karakteriseren met:De trillingstijd T: de tijdsduur van een trilling (eenheid: s) De frequentie f: het aantal trillingen per seconde (eenheid: Hz) (f=1/T).De golflengte : de lengte van een trilling (eenheid: nm (10-9 m) of Å (10-10 m)) Het golfgetal s:1/ (eenheid: cm-1) - wordt voornamelijk in de Infra Rood spectroscopie gebruikt de golfsnelheid:  c = (afgelegde weg / tijd) =/ T = f . (f=1/T).

als de golflengte toeneemt neemt de frequentie af en vice versa. 

Electromagnetische golvenElectromagnetische golven

Electrischveld

Magnetisch veld

Kleurencirkel en kleurenspectrum

• als we uit wit licht de kleur groen verwijderen: geeft rode kleur•. We zien steeds de complementaire kleur• liggen tegenover elkaar in het kleurenspectrum

Licht als energieLicht als energie

De intensiteit van een bundel licht is een maat voor de De intensiteit van een bundel licht is een maat voor de hoeveelheid energie. Deze bundel bestaat uit een stroom hoeveelheid energie. Deze bundel bestaat uit een stroom energiedeeltjes. Deze deeltjes worden KWANTEN of energiedeeltjes. Deze deeltjes worden KWANTEN of FOTONEN genoemdFOTONEN genoemd..

De wet van PlanckDe wet van Planck De energie inhoud van elk deeltje is evenredig met de De energie inhoud van elk deeltje is evenredig met de

frequentie. Dit wil zeggen dat een bundelstraling met een frequentie. Dit wil zeggen dat een bundelstraling met een frequentie frequentie f f bestaat uit fotonen met een energie gelijk bestaat uit fotonen met een energie gelijk aan :aan :

E = h . f = h.c/E = h . f = h.c/

Hierin is Hierin is h =h = de constante van Planck = 6,625 x 10-34 J.s de constante van Planck = 6,625 x 10-34 J.s

Interactie tussen materie en Interactie tussen materie en stralingstraling

Materie getroffen door Materie getroffen door electromagnetische straling:electromagnetische straling: De straling wordt De straling wordt doorgelatendoorgelaten: fotonen passeren : fotonen passeren

ongehinderdongehinderd De straling wordt De straling wordt verstrooidverstrooid: fotonen veranderen van : fotonen veranderen van

richtingrichting De starling wordt De starling wordt geabsorbeerdgeabsorbeerd: fotonen worden door : fotonen worden door

het medium opgenomenhet medium opgenomen Energie van het medium zal stijgen met de energieinhoud Energie van het medium zal stijgen met de energieinhoud

van de fotonenvan de fotonen E2= E1 + hfE2= E1 + hf

Moleculaire energieniveausMoleculaire energieniveausVeel meer vrijheidsgraden dan een atoomkern+electronen

Buig, strek, rotatie-modes met eigen gequantizeerde energieniveaus

Kleine energieverschillen ! dichte `bosjes’ van lijnen, voornamelijk IR

De opgenomen energie kan gebruikt worden ter verhoging van:De opgenomen energie kan gebruikt worden ter verhoging van:•Rotatie energie:snelheid waarmee een molecule draait om Rotatie energie:snelheid waarmee een molecule draait om zijn aszijn as•Vibratieenergie: trillen van de atomen in een moleculenVibratieenergie: trillen van de atomen in een moleculen•Electronen energie: energie die de electronen bezitten in hun Electronen energie: energie die de electronen bezitten in hun banen om de atoomkernbanen om de atoomkernEtot= Eelc + Evib + E rotEtot= Eelc + Evib + E rotEelec >> Evib >> ErotEelec >> Evib >> ErotVISVIS IR microIR micro

Grond toestand

Aangeslagen toestand

En

ergi

e

E1=hf1=h.c./1

E2=hf2=h.c./2

E3=hf3=h.c/3

Vibrationele niveausElectronenIn grond toestand

Rotationele niveaus

I0 = Ia + It + Ir

Indien men er voor zorgt dat Ir = 0 door bv. een blanco te gebruiken en te zorgen dat de reflectie geminimaliseerd wordt dan is de bovenstaande vergelijking gelijk aan :

I0 = Ia + It

SpectrofotometrieSpectrofotometrie

De wet van LambertDe wet van Lambertinvloed van de invloed van de vloeistofdikte (cuvette lengte)vloeistofdikte (cuvette lengte) ten opzicht van de ten opzicht van de

intensiteit van de lichtstraal.intensiteit van de lichtstraal.

de intensiteit van de uittredende lichtstraal t.o.v. de vloeistofdikte vertoont een exponentieel dalende kurve.

Waarin k een constante is en b de dikte van de vloeistoflaag

Absorptie

b

It

kbt II 100

kbt

I

I 100

kbkbI

I kbt 10log10loglog0

0I

IT t transmissie 100%

0

xI

IT t Procentuele

transmissie

TI

IA t loglog

0

Dan wordt bkA .

Wet van BeerWet van Beer

Naar analogie van de bovenstaande afleiding van de wet Naar analogie van de bovenstaande afleiding van de wet van Lambert kan men de wet van Beer bepalen.van Lambert kan men de wet van Beer bepalen.

Hierin wordt de absorptie bestudeerd i.f.v. de Hierin wordt de absorptie bestudeerd i.f.v. de concentratie concentratie van de oplossingvan de oplossing waardoor men licht gaat zenden. waardoor men licht gaat zenden.

Men bekomt eveneens een exponentieel dalende kurve met Men bekomt eveneens een exponentieel dalende kurve met volgende formule :volgende formule :

IItt = I = I00 . 10 . 10 – k2.C– k2.C

Verdere analoge afleiding leert ons dat de absorptie in een Verdere analoge afleiding leert ons dat de absorptie in een oplossing rechtevenredig toeneemt met stijging van de oplossing rechtevenredig toeneemt met stijging van de concentratie in de oplossing of :concentratie in de oplossing of :

A = k2 . CA = k2 . CIt

C

Wet van Lambert-BeerWet van Lambert-BeerIndien men de wet van Lambert en Beer samenvoegt kan men Indien men de wet van Lambert en Beer samenvoegt kan men

stellen dat :stellen dat :

A = k . bA = k . b

A = kA = k22 . C . C

Of dat Of dat A =k. kA =k. k22 .b. C .b. C

A = ε .b. C

De wet van Lambert-Beer geldt alleen als aan de volgende voorwaarden wordt voldaan:•monochromatisch licht •"optisch lege" vloeistoffen (geen lichtverstrooiende deeltjes aanwezig) •constante temperatuur •niet te geconcentreerde oplossing

ε = molaire absorptiecoefficient (L/(mol.cm))b= dikte van de cuvettec= concentratie in mol/L

Opnemen van Opnemen van absorptiespectrumabsorptiespectrum

Manueel of automatisch (in nieuwere toestellen)Manueel of automatisch (in nieuwere toestellen) 2 oplossingen: 2 oplossingen:

blanco (bevat alles behalve de te meten stof)blanco (bevat alles behalve de te meten stof) Standaard met hoogste concentratieStandaard met hoogste concentratie

Voorbeeld: Fe2+ + fenantroline geeft rood complexVoorbeeld: Fe2+ + fenantroline geeft rood complex

dus absorbeert tussen 480 en 550nmdus absorbeert tussen 480 en 550nm

we nemen het spectrum op tussen 450 en 600nmwe nemen het spectrum op tussen 450 en 600nm

AA

450450 0,070,07

470470 0,10,1

490490 0,170,17

510510 0,220,22

530530 0,250,25

550550 0,250,25

570570 0,210,21

590590 0,140,14

610610 0,070,070

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

400 450 500 550 600 650

Doel = ConcentratiemetingenDoel = Concentratiemetingen

A4

A3

A2

A1

Ax

C1 C2 C3 C4

Cx

y = ax + b

Calibratiemethode: ijklijnVan de te bepalen verbinding wordt een serie (nauwkeurig

bekende!) verdunningen gemaakt, waarvan de absorpties worden gemeten.

Door gebruik te maken van interpolatie kan de concentratie van een onbekend monster na meting van de absorptie worden berekend

Concentratiebepaling: Concentratiebepaling: praktisch voorbeeldpraktisch voorbeeld

Fe met fenantrolineFe met fenantroline Welk concentratiegebied: rekening houden met lineair gebied Welk concentratiegebied: rekening houden met lineair gebied

(uit literatuur): tot 10 mg/L(uit literatuur): tot 10 mg/L Maak stockoplossing van 0.5g/L=500 mg/LMaak stockoplossing van 0.5g/L=500 mg/L Hieruit maken we verdunningen :Hieruit maken we verdunningen :

0mg/L, 1mg/L, 2mg/L, 3mg/L, ....10mg/L en meten de absorbantie0mg/L, 1mg/L, 2mg/L, 3mg/L, ....10mg/L en meten de absorbantie Concentratiebepaling:Concentratiebepaling:

Meet Absorbantie van onbekende oplossingMeet Absorbantie van onbekende oplossing Kunnen gemiddelde Kunnen gemiddelde ε ε bepalen uitbepalen uit de standaarden en deze de standaarden en deze

gebruiken in de berekeninggebruiken in de berekening Kunnen ijkrechte opstellen en concentratie van onbekende Kunnen ijkrechte opstellen en concentratie van onbekende

berekenen uit vergelijkingberekenen uit vergelijking

InstrumentatieInstrumentatie

lichtbron golflengteselectie

uittreespleet

cuvet

detector

versterker

uitlezingintreespleet

stralingsbronstralingsbron

De Stralingsbron moet van constante De Stralingsbron moet van constante stralingsintensiteit zijn en straling uitzenden zo stralingsintensiteit zijn en straling uitzenden zo gelijkmatig mogelijk over het gehele gelijkmatig mogelijk over het gehele golflengtegebied verdeeld. golflengtegebied verdeeld.

Meestal gebruikt men voor het zichtbare gebied Meestal gebruikt men voor het zichtbare gebied een wolfraam lamp die een continue spectrum een wolfraam lamp die een continue spectrum heeft van 350 - 2500 nm.heeft van 350 - 2500 nm.

Een Deuteriumlamp met een hoge intensiteit Een Deuteriumlamp met een hoge intensiteit tussen 180 nm en 375 nmtussen 180 nm en 375 nm Deze lamp wordt in het U.V. gebied gebruikt.Deze lamp wordt in het U.V. gebied gebruikt.

GolflengteselectieGolflengteselectie

Filters of monochromators worden gebruikt om de door de Filters of monochromators worden gebruikt om de door de bron uitgezonden straling te scheiden in zijn samengestelde bron uitgezonden straling te scheiden in zijn samengestelde golflengtes.golflengtes.

Monochromatisch licht nodig voor:Monochromatisch licht nodig voor: Grotere selectiviteitGrotere selectiviteit Betere gevoeligheidBetere gevoeligheid Zekerheid dat aan wet Lambert-Beer voldaan wordtZekerheid dat aan wet Lambert-Beer voldaan wordt

Voor de golflengteselectie kunnen:Voor de golflengteselectie kunnen: FiltersFilters (absorptie of interferentiefilters) (absorptie of interferentiefilters) Monochromators: Monochromators: prismasprismas en en roostersroosters

FiltersFilters

AbsorptiefiltersDit zijn filters die een deel van het lichtspectrum doorlaten en een ander deel tegenhouden door absorptie. Ze bestaan uit gekleurd glas of uit een organische kleurstof gesuspendeerd in gelatine en vastgehouden tussen glazen plaatjes.Ze hebben een effectieve bandbreedte van bv. 20 nm dwz dat bv. een filter van 500 nm eigenlijk alle golven doorlaat tussen 490 nm en 510 nmInterferentiefiltersDeze zijn gebaseerd op optische interferentie, reflectie en uitdoving.Ze hebben een kleinere bandbreedte dan de absorptiefilters

MONOCHROMATORS: PrismaMONOCHROMATORS: Prisma

Lichtstralen worden Lichtstralen worden gebroken bij de overgang gebroken bij de overgang van lucht naar glas (wet van van lucht naar glas (wet van Snellius) (n=brekingsindex)Snellius) (n=brekingsindex)

Breking is Breking is golflengteafhankelijk: golflengteafhankelijk: hierdoor krijgen we dispersie hierdoor krijgen we dispersie van lichtvan licht

Een lens focuseert het Een lens focuseert het uittredend licht naar de uittredend licht naar de uittreespleetuittreespleet

Door het prisma te draaien Door het prisma te draaien kan men de gewenste kan men de gewenste golflengte selecterengolflengte selecterenWet van Snellius

Monochromator: roosterMonochromator: rooster

Rooster of tralie op Rooster of tralie op regelmatige afstand van regelmatige afstand van elkaar (vb. krassen op een elkaar (vb. krassen op een glazen plaat (zo als een CD)glazen plaat (zo als een CD)

Parabolische spiegel richt wit Parabolische spiegel richt wit licht op het roosterlicht op het rooster

Licht van verschillende Licht van verschillende golflengtes wordt weerkaatst golflengtes wordt weerkaatst onder een andere hoekonder een andere hoek

22dede spiegel richt het spiegel richt het weerkaatst licht op de weerkaatst licht op de uittreespleetuittreespleet

Door de tralie te draaien Door de tralie te draaien selecteert men de golflengteselecteert men de golflengte

monochromatormonochromator

Een monochromator zal de lichtstraling scheiden volgens de golflengte en zal om het even welk deel van de straling doorlaten. Alle licht gaat dus door heen de monochromator. Er zal dus niet geselecteerd worden door absorptie zoals bij filters.

Kuvetten zijn de recipiënten die gebrukt worden om de oplossingen te meten in de spectrofotometer.Er bestaan talrijke uitvoeringen naargelang het gebruik.Kuvetten kunnen gemaakt zijn uit glas, kwarts of kunststof.Kwartskuvetten worden gebruikt voor het werken in het UV-gebied, hoewel heden ook kunststofkuvetten uit bv. metacrylaat kunnen gebruikt wordenNaargelang het volume kan men kuvetten van verschillende inhoud en weglengte gebruiken.De meest gebruikte weglengte is één cm en het meest courante volume is 3,5 ml en 1,5 ml.Een kuvet heeft meestal twee gepolijste of heldere zijden en twee matte zijden, doch voor bv. fluorimetrie moet men kuvetten gebruiken met vier gepolijste zijden.

cuvettencuvetten

detectordetector

De stralingsdetector (bv fotocel) zet de erop vallende straling om in een elektrisch signaal dat na versterking wordt gemeten. Van de detector wordt vereist:- een hoge gevoeligheid voor een groot golflengtegebied- een rechtlijnig verband tussen de intensiteit van de lichtstraling en het daardoor opgewekte elektrische signaal. De versterker moet een lineaire afhankelijkheid tussen invoer en uitvoer bezitten. De meter geeft het gemeten signaal aan op een transmissie schaal (%) en/of extinctie schaal (log-schaal).

Fotocel: cylindrisch glazen omhulsel met fotogevoelige kathode en anode.Lichtinval rukt electronen los uit kathode die worden aangetrokken door de kathode waardoor een stroom ontstaat

Fotovermeningvuldigingsbuis: een fotogevoelige kathode en 10 anodes op verschillend potentiaal: geeft een belangrijke versterking van het signaal

•De meetresultaten van een spectrofotometrische bepaling worden zowel analoog als digitaal geregistreerd •kan ze zowel als een absorptie A of Procentuele Transmissie % T aflezen.•Ook kan men bij een aantal spectrofotometers rechtstreeks concentraties aflezen mits men de richtingscoëfficiënt ( de molaire absorptiecoëfficiënt ) kent en in het apparaat vastlegt.

uitlezinguitlezing

spectrofotometer recorderAutomatische buret

Spectrofotometrische titratieSpectrofotometrische titratie

In plaats van een cuvetmeetcel (1cm) ondergedompeld in de oplossing

Titreren met constante debiet(ml/min)

Papier loopt met constante snelheid (cm/min)

CH3COOH FFT kleurloosNaOH roos-paars

Eindpunt van de titratie

Bepaling absorptiespectrum FFT in zuur en basisch midden

A

zuur

A

basisch

Bepaling werkgolflengte

CH3COOH + NaOH CH3COONa + H2O

Spectrofotometrische titratie van azijnSpectrofotometrische titratie van azijn