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Z Rheumatol 2009 · 68:683–694DOI 10.1007/s00393-009-0461-3Online publiziert: 12. Juli 2009© Springer Medizin Verlag 2009

M. Jakobs1, 3 · T. Häupl2 · V. Krenn1, 3 · R. Guenther3

1 Zentrum für Histologie, Zytologie und Molekulare Diagnostik Trier2 Medizinische Klinik mit Schwerpunkt Rheumatologie und klinische Immunologie, Charité-Universitätsmedizin Berlin3 Institut für Pathologie, Charité-Universitätsmedizin Berlin

MMP- und FAP-vermittelte inflammationsunabhängige Destruktion von Knochen und Knorpel in der rheumatoiden Arthritis

Originalien

Die Ätiologie der rheumatoiden Arthri-tis (RA) ist bisher noch nicht vollständig geklärt. Ein Zusammenhang zwischen autoimmunologischen und genetischen Prozessen, resultierend in der Dysregu-lation von Immunzellen und den von ih-nen sezernierten Zytokinen, wird vermu-tet [21]. Konzepte, welche die Gewebszer-störung auf inflammationsbedingte oder auf tumorös infiltrative/destruktive Pro-zesse zurückführen, werden derzeit disku-tiert. Neuere Untersuchungen haben ge-zeigt, dass neben den inflammatorischen Zellen auch residente Fibroblasten der Synovialmembran einen entscheidenden Beitrag zur Pathogenese der RA leisten [21]. Diese aktivierten oder tumorassozi-ierten Fibroblasten weisen eine deutliche Überexpression von Protoonkogenen und Transkriptionsfaktoren (z. B. AP-1, NF-κB, PTEN) auf [25].

> Es besteht ein eindeutiger Zusammenhang zwischen Inflammation und der Progression von Tumoren

Bekannt ist, dass ein eindeutiger Zusam-menhang zwischen Inflammation und der Progression von Tumoren besteht [2]. Zum Beispiel wird die Erkrankung der pigmentierten villonodulären Synoviali-tis (PVNS) aus dem rheumatischen For-menkreis heutzutage als benigne Neopla-sie synovialer Stromazellen mit tumorige-

ner und inflammatorischer Komponente angesehen [4]. Ein weiteres Beispiel für das Zusammenwirken von Inflammation und Tumorprogression wird anhand des Riesenzelltumors (RZT) der Knochen sichtbar. Dieser weist neben Tumorfibro-blasten einen erheblichen Anteil an Ent-zündungszellen auf.

RZT sind primär osteolytische Läsi-onen, die meist bei jungen Erwachsenen nach Schluss der Epiphysenfugen auf-treten. Sie neigen dazu, in angrenzendes Weichgewebe hineinzuwachsen und die betroffenen Knochen massiv zu destru-ieren. In 2–6% aller Fälle kann der RZT maligne entarten und Metastasen bilden. Insbesondere aufgrund des lokalen, des-truktiven Wachstums wird dieser als se-mimaligne Entität eingestuft. Neben den charakteristischen multinukleären Rie-senzellen bestimmen mononukleäre Zel-len (Makrophagen-ähnlich und Fibro-blasten-ähnlich) das histologische Bild [30]. In-vitro-Experimente zeigen, dass mit zunehmender Passagezahl die mul-tinukleären Riesenzellen und die Makro-phagen-ähnlichen Zellen absterben, hin-gegen die Fibroblasten-ähnlichen Zellen eine Apoptosetoleranz aufweisen [30]. Dies deutet darauf hin, dass vermutlich die Fibroblasten-ähnlichen Zellen den tumorigenen Anteil im RZT bilden.

Der „High-grade-Synovialitis“ (RA) und dem RZT ist gemein, dass sie durch einen extensiven Um- und Abbau von

Matrixkomponenten mit nachfolgender Knochen- bzw. Knorpeldestruktion cha-rakterisiert sind. Der histopathologische Vergleich beider Entitäten zeigt, dass sowohl multinukleäre Riesenzellen als auch ein dichtes Stroma mit aktivierten Fibroblasten vorhanden sind. Inzwi-schen konnten vor allem durch Einsatz der Mikroarray-Technik einige prädikti-ve und prognostische Faktoren identifi-ziert werden, jedoch bleibt eine Vorher-sage des Krankheitsverlaufs und der The-rapie aufgrund der zellulären Heteroge-nität der RZT schwierig. In einer voran-gegangenen Untersuchung erstellte un-sere Arbeitsgruppe Genexpressionspro-file von primären RZT im Vergleich zu deren Rezidiven [7]. Diese Studie erg-ab eine hohe Anzahl von therapeutisch und prognostisch relevanten Genen wie beispielsweise die Hochregulation von Matrix-Metalloproteinase 13 (MMP-13) in den rezidivierenden verglichen zu pri-mären RZT.

Auch die entzündlich-rheumatischen Erkrankungen stellen aufgrund fehlender ursächlicher Erklärung eine große Her-ausforderung für die klinische Praxis dar. Eine weitere Studie unserer Arbeitsgruppe, welche sich mit dem Vergleich der Gen-expressionsprofile von RA und Synovial-gewebe gesunder Gelenke befasste, erg-ab signifikant hoch- bzw. runterregulier-te Gene (z. B. MMP-1, Chemokinrezep-tor 5/CCR5), die im Zusammenhang mit

RedaktionW.L. Gross, Lübeck/Bad Bramstedt F. Moosig, Lübeck/Bad Bramstedt

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der Entstehung der RA gesehen werden können [8].

Die Aufgabe der vorliegenden Arbeit bestand darin, die in beiden vorangegan-genen Studien generierten Genexpressions-profile der RA und des RZT miteinander zu vergleichen und vom Normalgewebe abzugrenzen. Es sollten Gene identifiziert und validiert werden, die das Konzept des inflammatorischen, aber auch des tumo-rigenen Ursprungs bei der Pathogenese der RA unterstützen könnten.

Material und Methoden

Der Studie zugrunde liegende Mikroarray- und FPCA-Analysen

In 2 früheren, unabhängig voneinander durchgeführten Mikroarray-Studien un-serer Arbeitsgruppe wurde einerseits die RNA von Patienten mit RA (n=10) mit Synovialgeweben normaler Gelenke (ND; n=10) auf HG-U133A-Mikroarrays hybri-disiert und verglichen. Weiterhin wurde die RNA von 7 RZT (5 Primärtumoren, 2 Rezidive) auf HG-U133A-Mikroarrays hybridisiert und analysiert. Da in allen Fällen Gewebeproben verwendet wurden, muss die hohe Variabilität der zellulären Zusammensetzung der verschiedenen En-titäten und der Einzelproben berücksich-tigt werden. Beispielsweise spiegelt eine Reihe von Genen, die sich zwischen RA und Normalspendern differenziell ver-halten, die Infiltration von Immunzellen in das entzündete Gewebe wider. Diese Überlappung von Genen muss bei der Auswertung der Mikroarray-Daten be-rücksichtigt werden. Mit Hilfe einer spe-ziellen Berechnungstechnik („Function-al Profile Component Analysis“, FPCA) kann der Anteil der verschiedenen Zell-typen abgeschätzt und daraus für jedes Gen eine zu erwartende Aktivität für den Normalzustand der Mischung ermittelt werden [8, 10]. Der Vergleich zwischen diesem virtuellen Mischprofil und dem tatsächlich gemessenen Profil liefert einen Überblick über die Regulation der Gene im Rahmen der Entzündung. Zur Ver-gleichbarkeit der Zellzusammensetzung wandte man auch für die RZT-Proben die FPCA an.

Nach Vergleich der generierten Mi-kroarray-Datensätze aus der ersten Ana-

lyse von Normalspendern und RA zeigten sich folgende in der RA differenziell überexprimierten Gene: MMP-1, MMP-3, CCR1 und CCR5. Diese Gene wurden aufgrund ihrer funktionellen Eingruppie-rung – Matrixumbau, Inflammation und Immunantwort –als potenzielle prognos-tische Faktoren der RA ausgewählt und mittels Immunhistochemie validiert. Es zeigte sich, dass auf Proteinebene alle An-tigene in der RA im Vergleich zu Normal-spendern signifikant hochreguliert vorla-gen (Daten nicht gezeigt).

> Bei RA-Patienten konnte eine Überexpression der Gene MMP-1, MMP-3, CCR1 und CCR5 nachgewiesen werden

In einer weiteren früheren Untersuchung unserer Arbeitsgruppe wurden die Gen-expressionsprofile von primären RZT mit denen von RZT-Rezidiven verglichen [7]. Die differenziell exprimierten Gene FGFR3, EphA1, CD52, AMFR und Clau-din7, die im Zusammenhang mit Entste-hung, Progression und Metastasierung des RZT stehen, wurden mittels Immun-histochemie validiert. Zusätzlich konn-ten diverse MMPs wie MMP-1, MMP-11, MMP-13 und MMP-25 sowie der inflam-mationsrelevante CCR1 als differenzi-ell hochregulierte Gene in den rezidivie-renden RZT gefunden werden.

Da sich in beiden Studien überlap-pende, differenziell exprimierte Gene (z. B. MMP-1 und CCR1) fanden, wur-den anschließend die Mikroarray-Da-ten der Normalspender, der RA und der RZT miteinander verglichen. Dieser Ver-gleich liefert den Schwerpunkt der vor-liegenden Arbeit, da hier Normalgewe-be, Entzündung und Tumor bezüglich ihres Expressionsverhaltens untersucht wurden.

Immunhistochemische Validierung

Analysiert wurde paraffinfixiertes und kryokonserviertes Material von nichtpa-thologischen Synovialmembranen (ND; Normalspender n=14; im Mittel 48 Jah-re, 88% Männer, 12% Frauen), Synovi-almembranen der RA (n=20; im Mit-tel 62 Jahre, 25% Männer, 75% Frauen) und Gewebe von RZT (n=19; im Mit-

tel 35 Jahre, 53% Männer, 47% Frauen). Die Synovialmembranen wurden in der histopathologischen Diagnostik mittels des Synovialitis-Scores graduiert [18]. Für die Normalspender wurde ein Score von 0 bis 2 vergeben (n=8 0/9, n=5 1/9 und n=1 2/9). Bei der RA zeigte sich folgende Verteilung: n=1 2/9, n=1 3/9, n=3 4/9, n=5 5/9, n=3 6/9, n=5 7/9 und n=2 8/9 Punkten.

Das paraffinfixierte Material wur-de geschnitten (1–2 µm), in einer abstei-genden Alkoholreihe entparaffiniert und mit Zitratpuffer (pH-Wert 6,1) demas-kiert. Native Proben wurden mit Ace-ton fixiert. Nach einem Peroxidaseblock folgte die Inkubation des Primärantikör-pers (FAP Calbiochem 1:1000, CCR5 Ab-cam 1:150, MMP-2 Zytomed 1:100, MMP-9 Zytomed 1:100, MMP-1 Chemicon 1:75, MMP-3 Chemicon 1:20, MMP-14 Zyto-med 1:30, CCR1 R&D Systems 1:50). Zur weiteren Färbung wurde der Univer-sal LSAB™+ Kit/HRP (DAKO) nach An-gaben des Herstellers benutzt. Die Farb-reaktion erfolgte mit DAB (3’3-Diamino-benzidin), die Kernfärbung durch Häma-laun. Als Positivkontrolle wurden Gewe-be der Tonsille (CCR1), der Milz (CCR5), des Mammakarzinoms (MMPs) sowie der Leberzirrhose (FAP) verwendet. Bei den Negativkontrollen wurde kein Primäran-tikörper zugegeben. In keinem dieser Fäl-le konnte eine Antigenreaktion detektiert werden.

Die immunhistochemischen Fär-bungen wurden mittels des immunreak-tiven Scores (IRS, mod. nach Remmele u. Stegner [26]) von 2 unabhängigen Per-sonen beurteilt. Der IRS setzt sich zusam-men aus der Anzahl der positiv gefärbten Zellen (PP; 0: ungefärbt, 1: 1–25% gefärbt, 2: 26–50% gefärbt, 3: 51–75% gefärbt, 4: 76–100% gefärbt) sowie der Färbeintensität (SI; 0: keine Färbung, 1: schwache Färbung, 2: mittlere Färbung, 3: starke Färbung). Beide Parameter wurden zum immun-reaktiven Score multipliziert (IRS=PPxSI). Die statistische Auswertung erfolgte mit-tels des Mann-Whitney-U-Testes (SPSS 13.0). Die Bonferroni-Korrektur für mul-tiple Parameter wurde angewendet. Un-terschiede mit p<0,05 wurden als statis-tisch signifikant bewertet.

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Originalien

Ergebnisse

FPCA-Analyse der RA und des RZT

Die beiden der Studie zugrunde liegen-den vorangegangenen Mikroarray-Ana-lysen (Vergleich RA und Normalgewebe sowie primäre und rezidivierende RZT) wurden bereits im Material- und Metho-denteil beschrieben. Die Auswertung der FPCA-Daten beider Studien zeigte, dass in der RA Zellen folgendermaßen ver-teilt sind: 14% Monozyten, 2% Granulo-zyten, 5% T-Zellen, 7% B-Zellen und 72% fibroblastoide Zellen. Im RZT konnte eine ähnliche prozentuale Verteilung der Zel-len verglichen zur RA detektiert werden (12% Monozyten, 13% Granulozyten, 3% T-Zellen, 4% B-Zellen und 68% fibroblas-toide Zellen). Damit bilden die Fibroblas-ten-ähnlichen Zellen die Mehrheit der ge-weblichen Zusammensetzung der RA und des RZT.

Vergleichende Analyse der Genexpressionsprofile von ND, RA und RZT

Im paarweisen Vergleich der RA und der RZT gegenüber dem Normalgewebe zeigten 169 Gene eine 70%ige differenzielle Expression. Die deutlich unterschiedliche Genexpression der beiden pathologischen Entitäten, verglichen mit Normalspendern, sowie die gleichsam veränderte Regulation der Gene in RA und im RZT wurden mit-tels Cluster-Analyse graphisch dargestellt (. Abb. 1). Hierbei werden 2 Gruppen (ND und RA/RZT) gebildet und die Akti-vität jedes Gens gegenüber dem Normal-zustand beurteilt. Rot bedeutet eine bis zu 3fach erhöhte, grün eine bis zu 3fach ver-ringerte Genaktivität. Die RA/RZT-Grup-pe weist eine deutlich erhöhte Aktivität ih-rer Gene gegenüber dem Normalgewebe auf. Als eines der signifikant überexpri-mierten Gene in der RA und im RZT ver-glichen zum Normalgewebe konnte FAP („Fibroblast Activation Protein“) detek-tiert werden.

Die Selektion der Kandidatengene für die weitere immunhistochemische Vali-dierung erfolgte anschließend aufgrund der beiden Voruntersuchungen (Mikro-array-Analyse RA vs. Normalgewebe so-wie RZT) sowie dem paarweisen Ver-

Zusammenfassung · Abstract

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M. Jakobs · T. Häupl · V. Krenn · R. Guenther

MMP- und FAP-vermittelte inflammationsunabhängige Destruktion von Knochen und Knorpel in der rheumatoiden Arthritis

ZusammenfassungHintergrund. Aufgrund der teilweisen mor-phologischen Ähnlichkeiten der rheumato-iden „High-grade-Synovialitis“ mit mesenchy-malen, semimalignen Tumoren und der Hypo-these, dass die Progression der rheumatoiden Arthritis (RA) nicht nur inflammationsabhän-gig, sondern auch durch tumorähnliche Me-chanismen bedingt ist, erfolgte ein Vergleich zuvor generierter Genexpressionsprofile von RA und Riesenzelltumoren (RZT) gegenüber Normalsynovium (ND).Methoden. Die Validierung der selektierten Kandidatengene aus dem Vergleich beider Expressionsdatensätze erfolgte mittels Im-munhistochemie an Geweben von RZT, RA und ND.Ergebnisse. CCR1, CCR5, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-14 und FAP zeigten auf mRNA-Ebene eine signifikante Hochregu-

lation in der RA und im RZT verglichen zu ND. Mittels Immunhistochemie konnte eine signi-fikante Überexpression in der RA und im RZT gegenüber ND für MMP-1, MMP-9, MMP-14 und FAP validiert werden.Schlussfolgerung. Für die MMPs – insbe-sondere für MMP-9 – wird eine wichtige Rol-le in der frühen Phase der Matrixdegradati-on in der RA angenommen. Das Vorkommen von FAP sowohl in der High-grade-Synovia-litis der RA als auch im Stroma semimaligner Tumoren deutet auf eine tumorähnliche Ge-websdestruktion in der chronischen Synovia-litis bei RA hin.

SchlüsselwörterRheumatoide Arthritis · Riesenzelltumor · Genexpressionsprofile · „Fibroblast Activation Protein“ · Matrix-Metalloproteinasen

MMP- and FAP-mediated non-inflammation-related destruction of cartilage and bone in rheumatoid arthritis

AbstractIntroduction. Due to morphological simi-larities of high-grade synovitis in rheumatoid Arthritis (RA) and mesenchymal, semimalig-nant tumors and the hypothesis that RA pro-gression is not only inflammation-related, but also determined by tumor-like mechanisms, a comparison was made between expression profiles of RA, giant cell tumor of bone (GCT) and normal synovium (ND).Methods. Array data of selected genes were validated through immunohistochemical staining of paraffin-embedded and deep frozen tissue samples of GCT, RA and normal synovium.Results. With microarray analysis, CCR1, CCR5, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-14 and FAP were found to be signifi-

cantly upregulated in RA and GCT compared to ND. A significant upregulation in RA and GCT compared to ND could be validated by immunohistochemistry for MMP-1, MMP-9, MMP-14 and FAP.Discussion. For MMPs, and MMP-9 in par-ticular, an important role in early cartilage destruction of RA was suggested. The pres-ence of FAP in RA and in stroma of a semi-malignant tumor indicates tumor-like tissue destruction in chronic synovitis associated with RA.

KeywordsRheumatoid arthritis · Giant cell tumor · Gene expression profile · Fibroblast activation pro-tein · Matrix metalloproteinases


gleich zwischen RA/RZT und Normalge-webe (. Tab. 1). Aus der RA-Genexpres-sionsanalyse wurden die der Immunant-wort zugehörigen Gene CCR1 und CCR5 selektiert, da diese schon im Vorfeld mit-tels Immunhistochemie als signifikant hochreguliert in der RA verglichen zu normalem Synovialgewebe validiert wer-den konnten. Da neben CCR1 auch MMP-1 und MMP-3 sowohl in der RA-Analyse als auch im Genexpressionsprofil der RZT als signifikant überexprimiert detek-tiert werden konnten, wurden diese bei-den als weitere potenzielle Zielgene her-ausgefiltert. Der paarweise Vergleich bei-der Studien lieferte FAP als weiteres Gen zur nachfolgenden Validierung.

Die FPCA zeigte sowohl in der RA als auch im RZT einen hohen Prozentsatz von Fibroblasten-ähnlichen Zellen. Das auf fibroblastoiden Zellen exprimierte FAP ist in der Lage, MMPs zu aktivieren [15]. Daher wurden zusätzlich zu den se-lektierten Genen weitere MMPs (MMP-2, MMP-9, MMP-14) untersucht. Die Höhe der relativen Expressionssignale aller Kan-didatengene kann . Abb. 2 a–h entnom-men werden. Für die Gene CCR1, CCR5, FAP und MMP-9 konnte eine signifikante Hochregulation in der RA verglichen mit

den Normalspendern und im RZT vs. Normalspender festgestellt werden. MMP-1, MMP-2 und MMP-3 zeigten eine signi-fikant niedrigere Expression in den RZTs verglichen mit dem Normalgewebe. Ver-gleicht man die Expressionswerte von RA und RZT, konnte für CCR1, MMP-1 und MMP-2 eine signifikante Runterregulati-on und für CCR5, FAP und MMP-14 eine deutlich erhöhte Expression im RZT de-tektiert werden.

Immunhistochemische Analyse

Die IRS-Werte der einzelnen mittels Immunhistochemie validierten Antigene können . Tab. 2 entnommen werden. Für CCR1, CCR5, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9 und MMP-14 wurde paraffin-fixiertes Gewebe von je 10 RA, 10 RZT und 10 Normalspendern gefärbt. Für die FAP-Validierung wurde natives Material von 10 RA-Fällen, 10 RZT und 5 Normal-spendern verwendet.

Der Chemokinrezeptor CCR1 (. Abb. 2 a) zeigte im Normalgewebe eine Anfärbung von Endothelzellen und Makrophagen. In der RA wurde in der ge-samten Deckzellschicht, in Stromazellen (Makrophagen und Fibroblasten) und in

den Lymphfollikeln CCR1 exprimiert. Im RZT wiesen die multinukleären Riesenzel-len eine schwache mosaikähnliche Anfär-bung auf, während die Stromazellen stär-ker anfärbt vorlagen. Für CCR1 konnte auf Proteinebene eine signifikante Hochregu-lation in der RA verglichen zu Normal-spendern validiert werden (p=0,003).

CCR5 wies im Normalsynovium (ND) ein ähnliches Expressionsmuster wie CCR1 auf, jedoch waren Stromazellen schwächer angefärbt (. Abb. 2 b). In der RA zeigte sich die Deckzellschicht durch-gehend mit fokalen Verdichtungen ange-färbt. Endothelien und perivaskuläre Zel-len waren ebenso wie Fibroblasten CCR5-positiv. Im RZT konnte eine höhere Ex-pression von CCR5 verglichen zur RA festgestellt werden (IRSRZT 7,2; IRSRA 6,1). Das Zytoplasma der multinukleären Riesenzellen wurde homogen angefärbt; Stromazellen waren ebenfalls CCR5-posi-tiv. CCR5 zeigte eine signifikante Hochre-gulation im RZT verglichen zum Normal-gewebe (p=0,003).

Eine starke Expression wies die Kolla-genase MMP-1 (. Abb. 2 c) im Normal-gewebe auf (IRS 4,5). In allen Komparti-menten des RA-Gewebes zeigten sich dicht eingestreute MMP-1-positive Zellen (En-

3.0 -3.01:1

ND

8

ND

6

ND

5

ND

7

ND

1

ND

3

ND

2

ND

9

ND

4

ND

1

RZT

RZT

RZT

RZT

RZT

RZT

RZT

RA1

RA2

RA6

RA7

RA3

RA9

RA4

RA5

RA8

RA1

0

Abb. 1 8 Systematische Mustererkennung (Cluster-Analyse) aller differenziell exprimierten Gene zwischen nichtpatholo-gischem Synovialgewebe (ND), rheumatoider Arthritis (RA) und Riesenzelltumoren (RZT). RA und RZT weisen trotz unter-schiedlicher Pathogenese im Vergleich zu ND eine ähnliche Genregulation auf. Hierarchisches Clustering unterteilt die Proben in 2 Gruppen: ND und RA/RZT. Die RA/RZT-Gruppe weist im Vergleich eine in der Mehrheit signifikant erhöhte Genaktivität (rot) gegenüber den Normalspendern auf, welche im Vergleich mehrheitlich geringere Genaktivität (grün) besitzen


Originalien

dothelien, Fibroblasten, Makrophagen). Die Riesenzellen des RZT wiesen eine mit-telstarke zytoplasmatische Anfärbung mit homogenem Muster auf. Der Vergleich zwischen den einzelnen Entitäten ergab in jedem paarweisen Vergleich eine signi-fikante Hochregulation (Normalspender vs. RA p=0,001; Normalspender vs. RZT p=0,003; RA vs. RZT p=0,05).

Die MMP-2-Expression konnte im Normalgewebe nur auf Endothelzellen und auf vereinzelten Fibroblasten detek-tiert werden (. Abb. 2 d). Die Intensität der Anfärbung im Normalgewebe lag bei 2,3. So wies die RA keine intensivere (SI 2,4), aber eine quantitativ ausgedehntere Fär-bung auf (PPRA 2,3 vs. PPND 1,1). Auffäl-lig waren die positiv gefärbten Lympho-zytenaggregate. Eine heterogene Expressi-on von MMP-2 konnte in den RZT detek-tiert werden. Für MMP-2 lagen auf Pro-teinebene signifikant höhere Expressions-werte in der RA gegenüber Normalgewe-ben vor (p=0,006).

Für das Stromelysin MMP-3 (. Abb. 2 e) wies das Synovium der Normalspender eine geringe Expression auf. Vereinzelt konnte eine Anfärbung von Fibroblasten beobachtet werden. Die RA zeigte eine MMP-3-Expression in der Deckzellschicht und im Zottenstroma. Lymphfollikel wiesen eine diffuse Anfär-bung auf. Ein heterogenes Expressions-muster konnte für MMP-3 im RZT detek-tiert werden. Vier von 10 Schnitten wa-ren negativ, während in 6 von 10 Schnit-ten multinukleäre Riesenzellen und we-nige fibroblastoide Zellen schwach ange-färbt waren. Verglichen zum Normalge-webe konnte in der RA eine signifikante Überexpression von MMP-3 festgestellt werden (p=0,0009).

Im Normalgewebe wurde keine MMP-9-Expression detektiert (. Abb. 2 f). In der RA waren Stromazellen besonders kräftig angefärbt. MMP-9 konnte in der Deckzellschicht durchgehend detektiert werden. Etwas schwächer zeigte sich die Expression auf Endothelzellen und Lym-phozyten. Besonders intensiv war die An-färbung von MMP-9 im Zytoplasma der multinukleären Riesenzellen der RZT. Ein heterogenes Expressionsmuster zeigte sich in den mononukleären Stromazellen. Für MMP-9 konnte im Vergleich der 3 Enti-täten eine signifikante Steigerung der Ex-

pression validiert werden (Normalspen-der vs. RA p=0,0002; Normalspender vs. RZT p=0,0002; RA vs. RZT p=0,05).

Eine MMP-14-Expression (. Abb. 2 g) konnte in der Deckzellschicht der Normal-gewebe detektiert werden. Zahlreiche En-dothelzellen wiesen eine Anfärbung auf, jedoch mit geringerer Intensität. Im Un-terschied zu den Normalspendern (PP 1,3) wies die RA (PP 3,0) eine größere Anzahl gefärbter Zellen auf, die vorwiegend im Stroma zu finden waren. Lymphfollikel zeigten sich durchgehend angefärbt. Im RZT konnte nur bei etwa 50% der Zellen eine positive MMP-14-Anfärbung nach-gewiesen werden. Eine signifikante Hoch-regulation von MMP-14 konnte im Ver-gleich von RA gegen Normalgewebe vali-diert werden (p=0,006).

FAP wies im normalen Synovium in 4 von 5 Fällen keine Expression auf. Im Ge-gensatz zum Normalgewebe konnte eine FAP-Expression (. Abb. 2 h) in den Fi-broblasten der Deckzellschicht und des Stromas der RA nachgewiesen werden. Im Stroma fiel eine erhöhte Dichte an FAP-positiven Zellen um Gefäße auf. Endo-thelien selbst und Lymphozytenaggregate

waren durchgehen negativ. Auch im RZT wurde eine intensive FAP-Expression auf den Fibroblasten detektiert, während multinukleäre Riesenzellen und mono-nukleäre Makrophagen im Stroma nega-tiv waren. Eine signifikante Hochregula-tion der FAP-Expression zeigt sich für RA vs. Normalspender (p=0,006) und RZT vs. Normalspender (p=0,006).

Korrelation zwischen IRS und Synovialitis-Score

Der Synovialitis-Score [18] erfasst semi-quantitativ die entzündlichen Verände-rung der Synovialmembran, während durch eine immunhistochemische Ana-lyse das gewebliche Verteilungsmuster eines Antigens dargestellt wird. Durch die Korrelation des IRS und des Synovi-alitis-Scores kann die Expression der im-munhistochemisch dargestellten Prote-ine mit dem Schweregrad der entzünd-lichen Gewebsveränderung verglichen werden. CCR5, MMP-1, MMP-2, MMP-14 und FAP wiesen einen Korrelationskoef-fizienten im Bereich von 0,6 bis 0,8 auf. Die höchsten Korrelationen konnte für

Tab. 1 Selektion der validierten Kandidatengene

Mikroarray-Ana-lyse RA vs. ND

Mikroarray-Ana-lyse RZT

Literatur Paarweiser Ver-gleich der Genex-pressionsprofile

Validierung

CCR1CCR5MMP-1MMP-3

CCR1MMP-1MMP-3

MMP-2MMP-9MMP-14

CCR1CCR5MMP-1MMP-3FAP

CCR1CCR5MMP-1MMP-3MMP-2MMP-9MMP-14FAP

Tab. 2 Ergebnis der immunhistochemischen Analyse mittels des IRS-Scores

ND RA RZT

PP SI IRS PP SI IRS PP SI IRS

CCR1 1,3 1,0 2,0 3,6 2,2 8,0 3,2 1,7 4,5

CCR5 1,9 1,7 3,4 3,3 1,9 6,4 1,8 2,0 7,2

MMP-1 2,6 1,7 4,6 4,0 2,2 9,8 3,6 2,1 7,4

MMP-2 1,1 2,3 2,6 2,3 2,4 5,4 2,8 1,8 4,7

MMP-3 0,8 0,6 0,8 2,8 1,7 5,4 0,8 0,6 1,2

MMP-9 0,0 0,0 0,0 3,1 2,4 6,5 3,1 2,9 9,4

MMP-14 1,3 1,6 2,4 3,0 2,1 6,2 3,1 2,0 5,4

FAP 0,8 1,3 1,3 3,3 2,4 7,6 3,9 3,5 9,7Angegeben sind die Mittelwerte der positiven Zellpopulation (PP; 0: ungefärbt, 1: 1–25% gefärbt, 2: 26–50% gefärbt, 3: 51–75% gefärbt, 4: 76–100% gefärbt), der Färbeintensität (SI; 0: keine Färbung, 1: schwache Färbung, 2: mittlere Färbung, 3: starke Färbung) sowie deren Produkt (IRS=PPxSI)


2A CCR1

RAND

RZT

2B CCR5

ND RA

RZT

CCR1

IRS vs. SIG

1210000

1000

100SIG

SIG

ND NDRA RARZT RZT

35 231 102IRS

IRS

IRS

10

1

10

8

8

6

4

4,5

2

2

0

CCR5

IRS vs. SIG

1210000

1000

100SIG

SIGND NDRA RARZT RZT85 393 1019

IRS

10

1

10

8

6,1

6

4

7,2

2

3,4

0

Abb. 2 9 Immunhistoche-Immunhistoche-mische Validierung der Kan-didatengene im Vergleich zum Mikroarray. Darstel-lung der immunhistoche-mischen Färbungen für Normalgewebe (ND), rheu-matoide Arthritis (RA) und Riesenzelltumor (RZT). 200fache Vergrößerung (FAP 400fach). Die Graphi-ken zeigen den Vergleich zwischen immunreaktivem Score (IRS, lineare Darstel-lung) und Signalstärke des Gens im Array (SIG, loga-rithmische Darstellung). a Vor allem die CCR1-posi-tive Deckzellschicht und die Expression in den Lymph-follikel werden deutlich. Im RZT zeigt sich eine Anfär-bung der Riesenzellen und der mononukleären Kom-ponente. b CCR5-positives Endothel in ND und RA. Eine starke Expression von CCR5 in der Deckzellschicht der RA wird deutlich. Stro-ma- und Riesenzellen im RZT exprimieren CCR5.


Originalien

2C VEGF

ND RA

ND RA

2D MMP-1

IRS vs. SIGRZT

IRS vs. SIGRZT

CCR11210000

1000

100SIG


IRS

10

1

10

8

3,1 3,1

6

4

2

0,9

0

CCR11210000

1000

100SIG


IRS

IRS

IRS

10

1

10

8

9,8

6

4

7,4

2

4,5

0

Abb. 2 fortlaufend 7 c Deutliche Überexpression

von MMP-1 in der RA und im RZT verglichen zum ND.

d In ND MMP-2-positives Endothel, in der RA eben-

falls angefärbte Lymphfolli-kel. Erhöhte Expression von

MMP-2 in den multinukle-ären Riesenzellen des RZT.


2E MMP-2

2F MMP-3

MMP-21210000

1000

100SIG

SIGND NDRA RARZT RZT

2781 3233 1472IRS

IRS

IRS

10

1

10

8

5,4 4,7

6

4

2

2,6

0

MMP-31210000

1000

100SIG

SIGND NDRA RARZT RZT

1113 6184 19IRS

10

1

10

8

4,5

6

4

1,2

2

0,8

0

ND RA

IRS vs. SIGRZT

ND RA

IRS vs. SIGRZT

Abb. 2 fortlaufend 9 e Eine deutlich höhere Ex-pression von MMP-3 in der RA verglichen zum ND wird sichtbar. Im RZT zeigen sich schwach angefärbte multi-nukleäre Riesenzellen. f MMP-9-negatives ND- Gewebe bei starker Hoch-regulation in RA und RZT. Die im Vergleich zur mono-nukleären Komponente erhöhte Expression in den multinukleären Riesenzel-len wird deutlich.


Originalien

Abb. 2 fortlaufend 7 g Auffallend starke Expres-

sion von MMP-14 in den Lymphfollikeln der RA.

h Hochregulation der Pro-teinexpression von FAP in

der RA und im RZT verg-lichen zu ND. Die multinuk-leären Riesenzellen im RZT

sind FAP-negativ

2G MMP-9

2H MMP-14

MMP-91210000

1000

100SIG

IRS


IRS

10

1

10

8

6,5 8,5

6

4

2

0

0

MMP-141210000

1000

100SIG

IRS


IRS

10

1

10

8

6,2

6

4

5,4

2

2,4

0

ND RA

IRS vs. SIGRZT

ND RA

IRS vs. SIGRZT


MMP-3 (0,83) und MMP-9 (0,85) festge-stellt werden.

Diskussion

Die hier validierten Genexpressionspro-file zeigen, dass sowohl in der RA als auch im RZT Gene gegenüber dem Normalge-webe hochreguliert werden, die mit Ma-trixdegradation und Invasion assoziiert sind. Die RA und der RZT sind Entitäten, bei denen neben Immunzellen ein fibro-blastenreiches Stroma und multinukle-äre Riesenzellen im Vordergrund stehen. Als Hauptkomponenten des Matrixum-baus gelten aktivierte Fibroblasten, welche über 170 Gene (z. B. FAP und MMPs) dif-ferenziell gegenüber nichttransformierten Fibroblasten exprimieren [22].

Es wurde gezeigt, dass aktivierte Fi-broblasten zur Transformation von Ge-websmakrophagen zu Osteoklasten bei-tragen können [11]. Ein ähnlicher Mecha-nismus wird bei der Bildung der multi-nukleären Riesenzellen im RZT disku-tiert. Die Beeinflussung von Makropha-gen spielt im Tumorstroma eine wichtige Rolle, da eine fortlaufende Ausschüttung von Chemokinen eine inflammationsbe-dingte Tumorinvasion fördert [2]. Die-ser Mechanismus treibt auch die Gewebs-zerstörung bei chronisch entzündlichen Erkrankungen an [2]. Selbst nach Weg-fall einer chemokinreichen Inflammation bleibt der Phänotyp der aktivierten Fibro-blasten bestehen, was zu einer fortschrei-tenden Matrixdegradation führt [21]. So-mit sind Fibroblasten im Krankheitsge-schehen von RA und RZT keine auf an-dere Zellarten reagierende, sondern viel-mehr selbstständig agierende Komponen-te und daher bei möglichen Therapieopti-onen nicht außer Acht zu lassen.

Chemokine aus Tumor- und Entzün-dungszellen wie Tumor-Nekrose-Faktor- (TNF-)α und Interleukin- (IL-)1 steigern die Expression der MMPs über die Akti-vierung der MAP- („Mitogen-Activated Protein-“) Kinase [24]. CCR1 und CCR5 werden als Chemokinrezeptoren auf Immunzellen wie T-Lymphozyten und Makrophagen exprimiert, was ihre ho-hen Werte in der RA erklärt. Neuere Un-tersuchungen weisen für beide Antigene jedoch einen Bezug zu Neoangiogenese durch Endothelzellmigration aus [12], wel-

ches die in dieser Untersuchung gefunde-ne Anfärbung von Endothelzellen unter-streicht. Es wurde gezeigt, dass aktivierte Fibroblasten in der RA CCR5 und dessen bindende Chemokine exprimieren, so-dass neben einer parakrinen auch eine au-tokrine Wirkung existiert [29]. Die CCR5-vermittelte Chemokinbindung wird über den MAPK-Signalweg weitergeleitet [29]. Dieser Signalweg und seine erhöhte Ak-tivierung spielt in vielen Tumorerkran-kungen eine wichtige Rolle. Wir vermu-ten daher, dass die permanente Aktivie-rung des MAPK-Signalweges via Chemo-kinrezeptor-Ligand-Bindung auch in der RA über aktivierte Fibroblasten onkogene Eigenschaften fördert. Auch eine erhöhte MMP-2- und MMP-9-Expression durch Aktivierung des MAPK-Signalweges wur-de bereits beschrieben [16, 31]. Diese bei-den MAPK-abhängigen MMPs sind bei tumorassoziierten Fibroblasten auf Invadopodien gemeinsam mit FAP ko-lokalisiert und führen zu Invasion und Matrixdegradation.

> FAP wird in 90% aller epithelialen Karzinomgewebe im Stroma, aber nicht auf den Tumorzellen selbst exprimiert

FAP wird in 90% aller epithelialen Karzinomgewebe im Stroma – und da-mit auf aktivierten Fibroblasten –, aber nicht auf den Tumorzellen selbst expri-miert [13]. Neben Tumorgewebe ist be-kannt, dass FAP im RA-Stroma (be-sonders in der Deckzellschicht) sowie bei Leberzirrhose und Wundheilung auf Fibroblasten exprimiert wird [5]. In Normalgewebe tritt FAP nur bei prolife-rierenden Endometriumzellen und Me-lanozyten auf [14]. Die Array-Daten für FAP wurden durch die Immunhisto-chemie auf Proteinebene validiert. Eine Hochregulation der Expression für FAP konnte vom Normalgewebe über RA bis hin zum RZT gezeigt werden. Sowohl in der RA, als auch im RZT wurde eine Ex-pression nur auf Fibroblasten, nicht aber auf Tumor- oder Immunzellen gefunden. FAP ist in der Lage, Signalmoleküle, wel-che in Proteinen der extrazellulären Ma-trix gebunden sind, freizusetzen. So kann es eine Vielzahl von Zellen im Stroma be-einflussen.

FAP ist eine N-glykosilierte membran-gebundene Typ-II-Serinprotease, die auch als Seprase („Surface Expressed Protease“) bezeichnet wird [13]. Das Molekül be-sitzt eine Kollagenase- und eine Dipep-tidyl-Peptidase-Aktivität, die über eine gemeinsame katalytische Domäne ver-mittelt wird [14]. Nach vorheriger Spal-tung durch MMP-1 gilt u. a. Kollagen I als Substrat für FAP [1].

Die MMPs umfassen insgesamt eine Gruppe von 24 zinkabhängigen Proteasen, die in der Lage sind, Matrixproteine zu spalten und abzubauen. Mit Ausnahme der membranassoziierten MMPs werden sie als Zymogene synthetisiert und sind erst durch Abspaltung eines Propeptids durch Proteasen oder andere MMPs ak-tiv [17]. An der Aktivierung von MMP-1 ist das Urokinase-Plasminogenaktivator/Plasmin-System beteiligt [15]. Die Fähig-keit, Kollagen I als Tripelhelix zu spalten, trägt der schon im Synovium der Nor-malspender hohe Wert für MMP-1 Rech-nung, da bereits dort ein physiologischer Matrixumbau durch mechanische Rei-zung bei Gelenksbewegung stattfindet. Gleichzeitig legt diese Fähigkeit eine tra-gende Rolle in der Knochendestruktion und Gewebsinvasion im RZT nahe, da natives Kollagen I als wichtigstes Binde-gewebsprotein gilt.

In einem Vergleich zwischen trauma-induzierter und rheumatoider Arthritis zeigt sich MMP-1 stärker mit der chro-nischen Entzündung als mit Traumen as-soziiert [17]. Auch in dieser Untersuchung fällt die hohe Expression von MMP-1 in der RA auf, was die starke Affinität zu entzündungsgestützter Gewebszerstö-rung unterstreicht. Neben sezerniertem MMP-1 dient den aktivierten Fibroblas-ten ein speziell ausgebildeter Zellfortsatz, das Invadopodium, zur Matrixdegrada-tion. Dieses ist u. a. mit MMP-2, MMP-9 und MMP-14 sowie mit FAP besetzt [15]. MMP-2 aktiviert MMP-13 und wird selbst durch TIMP-2 und 2 Molekülen MMP-14 aktiviert [19]. MMP-2 ist in der Lage, das Basalmembran-Kollagen IV zu spalten, was bei der Durchbrechung von Epithel-verbänden wichtig ist. Die immunhisto-chemischen Färbungen legen nahe, dass MMP-2 am Endothel aktiviert wird und die Kollagenaseaktivität zum Umbau des Gefäßnetzes verwendet wird. Ein Effekt,


Originalien

der sich in der RA aufgrund der erhöh-ten Proteinexpression deutlich verstärkt. MMP-14 als membranständige Protease wird besonders fokal auf den mononuk-leären Zellen im Stroma des RZT expri-miert, MMP-2 hingegen auf den multi-nukleären Riesenzellen. Daher schei-nen die multinukleären Riesenzellen die Hauptproduzenten für proMMP-2 zu sein, welches vornehmlich dann im Stroma aktiviert wird und dort die Gewebszer-störung vorantreibt. Dieses Expressions-muster konnte schon in früheren Studien gezeigt werden [27].

Auffällig ist die Ähnlichkeit der IRS-Werte für MMP-2 und MMP-14 sowie die überlappende Anfärbung auf Fibro-blasten, was durch die Rolle von MMP-14 als Aktivator von MMP-2 auf Invadopo-dien zu erklären ist. Dies unterstreicht die Verbindung der beiden Antigene zuein-ander. Für weitere Studien wäre eine Ko-immunpräzipitation zur Lokalisation von MMP-2 und MMP-14 auf Invadopodien hilfreich.

MMP-3 wurde in vorangegangenen Untersuchungen neben rheumatoiden Er-krankungen auch eine Rolle bei posttrau-matischen Arthritiden zugewiesen [17]. MMP-3 kann andere MMPs wie MMP-1 und MMP-13 aktivieren [15]. Aufgrund der geringen Expression scheint MMP-3

aber nicht unmittelbar am Abbau von Matrixproteinen beteiligt zu sein, son-dern es scheint vielmehr als Verstärker der MMP-Aktivierungskaskade zu die-nen. Die räumliche Nähe zwischen den MMPs und FAP auf den Invadopodien der Fibroblasten könnte über die Bindung von α3β1-Integrin zur Aktivierung des Urokinase-Plasminogen-Systems führen, welches über Zwischenschritte zur Akti-vierung der MMPs führt.

Ein interessanter Befund ist das Fehlen einer MMP-9-Protein-Expression im ND bei vorhandenem mRNA-Niveau. MMP-9 wird vermutlich wie CEA (karzino-embryonales Antigen) im Zuge der Re-aktivierung embryonaler Programme bei Tumorpatienten exprimiert [6]. Im Serum Gesunder ist es nach der Geburt nicht mehr nachweisbar. Es wurde gezeigt, dass MMP-9 im Serum bei Tumorpatienten ein sensitiverer Marker als CEA sein kann [20]. Dies bedeutet, dass die Verwendung des MMP-9-Serumspiegels als Marker für die RA dienen könnte. Weiterhin kann die translationshemmende Kontrolle auf eine Rolle in der Frühentstehung und in der Akutphase der RA hinweisen [3], da MMP-9 ähnlich wie MMP-2 dazu in der Lage ist, die Basalmembrankollagene zu spalten und den Hauptregulator der Neo-angiogenese VEGF („Vascular Endothe-

lial Growth Factor“) freizusetzen [28]. Dies und die Korrelationsuntersuchung zwischen dem IRS und dem Synovialitis-Score, welche MMP-9 als am besten kor-relierendes Antigen ausweist, deutet dar-auf hin, dass MMP-9 zukünftig als Mar-ker in der pathologischen Routineunter-suchung von RA-Synovium Anwendung finden könnte [9].

Alle in dieser Studie untersuchten Anti-gene weisen in ihren Eigenschaften direkt via FAP oder indirekt über andere Akti-vierungskaskaden (z. B. MAPK-Signal-weg) eine Verbindung zu aktivierten Fi-broblasten bezüglich Immunstimulation und Matrixabbau auf. Das hypothetische Modell in . Abb. 3 zeigt, wie aktivierte Fibroblasten unter Verwendung der hier untersuchten Antigene mit gemeinsamen Mechanismen sowohl in der RA als auch im RZT zu deren Pathogenese beitragen könnten.

Fazit für die Praxis

Genexpressionsprofile der RA und des RZT wurden verglichen und ein Set von gleichsam regulierten Genen mittels Im-munhistochemie validiert. Neben MMP-1 und FAP wies MMP-9 eine signifikant er-höhte Expression gegenüber ND auf. Das Fehlen des MMP-9-Proteins bei vorhan-

Abb. 3 7 Hypothetisches Modell zum Matrixabbau bei rheumatoider Arthri-tis (RA) und Riesenzelltu-

mor (RZT). Aktivierte Fibro-blasten stellen das zentra-

le Element für Matrixdegra-dation nach Transformation durch Zytokine und Wachs-

tumsfaktoren bei chro-nischer Entzündung (RA) und im Tumor (RZT) dar.

FAP dient als spezifischer Marker für aktivierte Fibro-

blasten und ist in der Lage, über eine Kaskade

verschiedene MMPs zu aktivieren


denem mRNA-Niveau in ND deutet auf eine Reaktivierung embryonaler Pro-gramme in der RA und im RZT hin. Die starke Korrelation von MMP-9 mit den semiquantitativen Werten des Synoviali-tis-Scores lässt auf eine Rolle in der Früh-entstehung und in der Akutphase der RA schließen. FAP kann als Marker für aktivierte Fibroblasten angesehen wer-den. Diese nehmen eine zentrale Rolle im Matrixabbau beider Entitäten ein. FAP zeigte sowohl in der RA als auch im RZT eine Hochregulation gegenüber norma-ler Synovialis. FAP könnte als zukünftiger therapeutischer Ansatzpunkt für RA und Tumorerkrankungen dienen, da eine ge-hemmte Matrixdegradation die Pannus-bildung bzw. Tumorinvasion erschwert. Der FAP-Inhibitor Talabostat wurde in ei-ner Phase-II-Studie an Patienten mit me-tastasierten kolorektalen Karzinomen und in einer Phase-III-Studie bei kleinzel-ligem Bronchialkarzinom getestet [23]. Ob eine Anwendung von Talabostat auch bei Patienten mit RA möglich wäre, soll-te überprüft werden.

KorrespondenzadresseDr. R. GuentherInstitut für Pathologie, Charité-Universitätsmedizin BerlinCharitéplatz 1, 10117 [email protected]

Danksagung. Unser herzlichster Dank gebührt Frau Gabriele Fernahl für die technische Unterstützung. Die Forschung zu diesem Thema wurde von SFB421 (Pro-tektive und pathologische Folgen der Antigenverarbei-tung, Teilprojekt Z3) und dem Nationalen Genomfor-schungsnetz (NGFN, SIPAGE, Teilprojekt 30) unterstützt.

Interessenkonflikt. Der korrespondierende Autor gibt an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

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Originalien

mmp- und fap-vermittelte inflammationsunabhängige destruktion von knochen und knorpel in der...

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