mikro575 outi martikainen 071111

Upload: melih-bayar

Post on 07-Jan-2016

42 views

Category:

Documents


0 download

DESCRIPTION

food microbiology

TRANSCRIPT

  • 17.11.2011 1

    Escherichia coli -bakteeritElintarvike- ja ympristhygienia ja valvonta MIKRO575

    7.11.2011

    Outi Martikainen / Bakteriologian yksikk

  • 17.11.2011 2

    Luennon rakenne

    Escherichia coli bakteerilajina Hydylliset ja haitalliset kolit E. colin eristys E. colin tyypittminen E. colin valvonta

  • 17.11.2011 3

    Escherichia coli bakteerilajina Gram-negatiivinen sauva Fakultatiivisti anaerobi Liikkuva, mys liikkumattomia kantoja Biokemiallisia ominaisuuksia

    Laktoosipositiivinen (90 % kannoista) Beta-glukuronidaasipositiivinen (97 % kannoista) Indolipositiivinen (99 % kannoista)

    Sijoittuminen taksonomisesti Fyyla: proteobakteerit luokka: gammaproteobakteerit lahko:

    Enterobacteriales heimo: Enterobacteriaceae suku: Escherichia laji: Escherichia coli

    Lhilajeja mm. E. albertii, E. hermannii, E. fergusonii Kolonisoi ihmisen ja muiden niskkiden ja lintujen paksusuolta, osa

    normaaliflooran mikrobistoa Vastasyntyneen suolisto kolonisoituu muutaman tunnin kuluttua

    synnytyksest Geneettisesti monimuotoinen laji

    Geenien vaihtoa Salmonella spp., Shigella spp. ja muiden E. coli -kantojen kanssa

  • 17.11.2011 4

    Escherichia coli

    Kaper et al 2004 Nature Reviews

  • 17.11.2011 5

    Hydylliset kolit Normaalimikrobiston kolit estvt tautia aiheuttavia mikrobeja

    tarttumasta isnnn suolistoon tai lisntymst siell K2-vitamiinin tuotto paksusuolessa Probiootit

    E. coli Nissle 1917: kroonisten suolistosairauksien hoidossa vhent patogeenisen kolin (invasiivinen ja

    adhesiivinen) adheesiota suoliston epiteelisoluihin ja lis sytokiinien tuotantoa (Huebner et al 2011)

    Genetiikan malliorganismi Kloonausisntn rekombinaatti-DNA-tekniikoissa

  • 17.11.2011 6

    Haitalliset kolit1. Suolistoinfektiot2. Virtsatieinfektiot3. Meningiitti/sepsis

    Kommensaalikolit voivat aiheuttaa tautia Heikentynyt immuniteetti Suoliston epiteeli vaurioitunut Bakteeri vrss paikassa

  • 17.11.2011 7

    Suolistopatogeeniset E. coli -bakteerit= ripulikolit

    Aiheuttavat suolistoinfektioita ihmisille ripulia, veriripulia ja oksentelua sek mahdollisesti jlkitauteja kuten hemolyyttis-ureeminen oireyhtym (HUS)

    Ripulikolit voidaan jakaa ainakin viiteen luokkaan = patoryhmn: Enteropatogeeninen E. coli (EPEC) Enterotoksigeeninen E. coli (ETEC) Enterohemorraaginen E. coli (EHEC) Enteroinvasiivinen E. coli (EIEC) Enteroaggregatiivinen E. coli (EAEC)

    Ripulikolit esiintyvt elinten, etenkin mrehtijiden, suolistossa kuten normaaliflooran E. coli. Niit on mys todettu olevan maaperss ja vesistiss.

    Ihminen voi saada tartunnan elinperisten elintarvikkeiden vlityksell tai juomalla elinten tai ihmisen ulosteilla saastunutta vett.

  • 17.11.2011 8

    Ripulikolien virulenssimekanismit Eri patoryhmill erilaisia virulenssiominaisuuksia Jotkin ominaisuudet voivat esiinty useammalla patoryhmll Virulenssigeenit sijaitsevat liikkuvissa elementeiss (integroituneet

    transposonit, bakteriofagit ja patogeenisuussaarekkeet) bakteerin kromosomissa ja plasmideissa

    Virulenssigeenien kohteena suoliston epiteelisolut Suoliston epiteelin kolonisaatio Tunkeutuminen solujen sislle Toksiinien tuotto ja niiden erittminen epiteelisoluihin

    Ei-patogeeninen koli voi muuttua patogeeniseksi saamalla virulenssigeenej muilta kolikannoilta tai muilta lajeilta.

    Eri patoryhmt voivat saada toisiltaan virulenssigeenej uusia hypervirulentteja kantoja?

  • 17.11.2011 9

    EHEC-bakteeri A.K.A

    VTEC = verosytotoksinen E. coli toksinen Vero-soluille (apinan munuaissoluja)

    STEC = shigatoksiinia tuottava E. coli Virulenssitekijt

    Shigatoksiinit Stx1 ja Stx2 (stx1 ja stx2) Intimiini = adheesioproteiini (eae) Enterohemolysiini (EHEC-hly/ehx) STEC-autoagglutinoiva adhesiini, Saa (saa)

    Ripuli/veriripuli Jlkitautina hemolyyttis-ureeminen

    oireyhtym (HUS) EHEC O157-seroryhmn kannat vakavin

    taudinkuva etsityin seroryhm Riskiryhmt: alle 5-v lapset, vanhukset

    Kaper et al 2004 Nature Reviews

  • 17.11.2011 10

    Patoryhmien virulenssimekanismit

    Kaper et al 2004, Nature Reviews

  • 17.11.2011 11

    EHEC-tartuntareittej Nautakarja, lampaat (elin

    yleens oireeton) Kotielimet Huonosti kypsennetty tai raaka

    naudan jauheliha Pastroimattomat (maito)tuotteet Hedelmt, salaatit, idut Vesi; jrvet, lammikot Ihmisest toiseen vlittyv

    kosketustartunta Sairaalainfektiot (ruoka;

    salaatti, kotileivokset) Laboratorioinfektiot

  • 17.11.2011 12

    Infektiiviset annokset

    EHEC 10 100 solua EPEC 108 solua ETEC 108 solua EIEC 10 106 solua EAEC 108 1010 solua

    EHEC, EPEC, ETEC ja APEC (avian pathogenic E. coli) mys elinpatogeeneja

  • 17.11.2011 13

    Infektion hoito

    Ripulit itsestn rajoittuvia EHEC: antibiootteja ei suositella

    Solujen hajoaminen shigatoksiinin vapautuminen oireet pahenevat

    Oireeton kantajuus EAEC-patoryhm sek ripulia sairastavilla ett

    terveill lapsilla Afrikassa (Bonkoungou et al 2011)

  • 17.11.2011 14

    E. colin eristminen Elintarvikkeesta Ympristnytteest Ihmisest (uloste, virtsa, veri) Rikasteet Selektiivimaljat

    SMAC (sorbitol-MacConkey) CT-SMAC (kefiksiimi-telluriitti-

    SMAC) CLED (cysteine lactose electrolyte

    deficient medium) Suuri heikkous

    Patogeeninen koli ei eroa ulkonllisesti tai biokemiallisilta ominaisuuksiltaan normaalifloorasta

    Virulenssigeenien etsiminen (PCR, DNA:DNA-hybridisaatio)

    Lihanytteit peptonisuola-liuoksessa.

  • 17.11.2011 15

    Selektiivimaljat SMAC sorbitolin

    fermentaatio EHEC O157-seroryhmn

    kannat usein sorbitolinegatiivisia, mutta mys sorbitolipositiivisia kantoja eristetn usein

    CLED laktoosin fermentaatio

    Enterohemolysiinin tuoton osoittava malja (TBVP) osoittaa vain entero-hemolyyttiset kannat

    SMAC:Sorbitoliafermentoivakanta

    SMAC:Kanta, joka ei fermentoisorbitolia

  • 17.11.2011 16

    Peskkeiden seulominen sekaviljelmst PCR:n avulla

    Yksittiset peskkeet Peskepoolit monen peskkeen testaus

    yhdess reaktiossa Voi olla tylst, jos patogeenin pitoisuus

    nytteess alhainen

  • 17.11.2011 171717

    Peskehybridisaatio Maljan peskkeet jttvt DNA-jljen membraanille leimattu

    koetin pariutuu patogeenisen peskkeen jljen kanssa vasta-aine + vri sitoutuvat patogeenin paikannus maljalta

    Membraanit hybridisaation jlkeen.Malja replikoituna hybridisaatiomembraanille.

    Positiivinen kontrolli Negatiivinen kontrolli Positiivinen kontrolli Positiivinen kontrolli

  • 17.11.2011 18

    Immunomagneettinen rikastus (IMS) Seroryhmn perustuva rikastusmenetelm Seroryhmille O26, O103, O111, O145, O157 Helmien pinnalla seroryhmn vasta-ainetta tarttuu

    bakteerin pintarakenteeseen etsityt bakteerit saadaan talteen helmien mukana ja muista pstn eroon

  • 17.11.2011 19

    Jos ei voi erist Monialukkeinen PCR-menetelm sekaviljelmille ripulikolien

    havaitsemiseksi

  • 17.11.2011 20

    E. colin tyypittminen Serotyypitys

    seroryhm = O -rakenne (O = somaattinen antigeeni LPS:ss)serotyyppi = O:H -rakenne (H = flagellaarinen antigeeni)

    EPEC: O26, O55, O86, O111, O125, O126, O127, O128 EHEC: O26, O45, O91, O103, O111, O113, O145, O157 (O157:H7, O157:H-)

    EHEC O157 faagityypitys serotyypityst tarkempi erottelu Muut fenotyypitysmenetelmt Genotyypitysmenetelmt

    Virulenssigeenit Pulssikenttgeelielektroforeesi geneettinen sormenjlki Sekvensointi (geeni/koko genomi) Virulenssigeenien kuten stx alatyypitys spesifisill alukkeilla tai

    PCR-RFLP-menetelmll

  • 17.11.2011 21

    Serotyypitys

    O-tyypitys H-tyypitys Lasiagglutinaatio Reaaliaikainen PCR

    7 yleisint ihmispatogeenista E. colin O-ryhm(O26, O55, O91, O157, O103, O111 ja O145) ja flagella-antigeenia H7

  • 17.11.2011 22

    Faagityypitys EHEC O157-kannoille

    0 %

    10 %

    20 %

    30 %

    40 %

    50 %

    60 %

    PT2 PT4 PT49 PT8 Other

    Suomessa esiintyvi EHEC O157faagityyppej

  • 17.11.2011 23

    Muut fenotyypitysmenetelmt Mikrobilkeherkkyys Biokemialliset identifioimistestit

    Laktoosin ja sorbitolin fermentointi -glukuronidaasin tuotto (PGUA)

    Enterohemolysiinin tuoton osoitus Shigatoksiinin tuoton osoitus

    Verosolukoe Lateksiagglutinaatio

  • 17.11.2011 24

    Pulssikenttgeelielektroforeesi (PFGE) Vertailu saman serotyypin

    (O:H-rakenne) kantojen vlill

    Bakteerin kromosomaalisen DNA:n pilkkominen restriktioentsyymill

    EHEC XbaI Elektroforeesi, jossa

    shkvirran suunta muuttuu tietyin vliajoin

    Epidemiologiset tutkimukset esim. ruokamyrkytykset

  • 17.11.2011 252525

    PFGE kantojen geneettinen sormenjlki

  • 17.11.2011 26

    EHEC-diagnostiikka TABA:ssa

    TABA:aan lhetettyUlosteen primaariviljelm /

    Puhdasviljelm

    Jos +

    - API 20E- O:H serotyypitys- Faagityypitys (O157)- Stx1 / Stx2 tuotto- Ehly- Antibiogrammi- Sorbitolin fermentointi- Beta-glukuronidaasi

    Lopullisia vastauksia EHEC + (O157) EHEC + (non-O157)EHEC -EPEC +

    PCR-positiivinen peske eristetn ja tunnistetaan

    PCRstx1 , stx2 , eae,ehly, saa

    - PFGE (XbaI)- stx2 alatyypit- eae alatyypit

  • 17.11.2011 27

    Ripulikolidiagnostiikka Suomessa ja monessa muussa maassa etsitn

    yleens vain EHEC-patoryhmn seroryhm O157 vaarallisin seroryhm (HUS)

    Monissa tutkimuksissa jaottelu EHEC O157 ja EHEC non-O157, vaikka mys muiden serotyyppien on todettu olevan erittin virulentteja (esim. O26, O103, O111, O145)

    Muita ripulikoliryhmi ei yleens etsit, kun selvitetn suolistoinfektion aiheuttajaa

  • 17.11.2011 28

    0500

    10001500200025003000350040004500

    2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

    Campylobacter Salmonella Yersinia Shigella EHEC

    Elintarvikevlitteiset bakteeritartunnat vuosina 2000-2010

    Tapaukset Tiedot: THL/TT-rekisteri

  • 17.11.2011 2929

    EHEC-tapaukset vuosittain

    Varmennetut EHEC tapaukset 1996-2010

    2

    51

    29

    116 7 7 6 4 5 6

    93

    13 930

    1

    1

    6

    0 1 1 0 0

    102

    0

    0

    3

    057

    9

    13

    21

    12 7 7 96

    6

    6 35

    13

    11 15

    9

    61

    4338

    1815 15 15

    10

    21

    14 128

    29

    2023

    0

    10

    20

    30

    40

    50

    60

    701

    9

    9

    6

    1

    9

    9

    7

    1

    9

    9

    8

    1

    9

    9

    9

    2

    0

    0

    0

    2

    0

    0

    1

    2

    0

    0

    2

    2

    0

    0

    3

    2

    0

    0

    4

    2

    0

    0

    5

    2

    0

    0

    6

    2

    0

    0

    7

    2

    0

    0

    8

    2

    0

    0

    9

    2

    0

    1

    0

    2

    0

    1

    1

    Non-O157 (n=135)

    sor+ O157:H7/H-

    (n=25)

    sor- O157:H7/H-

    (n=168)

    Yhteens (n=351)

    Kuva: Taru Lienemann/THL

  • 17.11.2011 30

    EHEC-epidemiat Suomessa Pohjanmaa, vuonna 1997

    Seroryhm O157 n. 15 tartuntaa Uimavesi

    Etel-Suomi, 1998-2002 Seroryhm O157 Pieni epidemiaklustereita Jauheliha, nautakarja

  • 17.11.2011 31

    Saksan EHEC O104:H4 -epidemia Tappajakurkut

    Epidemiakannalla EHEC + EAEC -ominaisuuksia stx2, aggR Intimiini-negatiivinen, enterohemolysiini-negatiivinen Multiresistentti

    Harvinaisempi serotyyppi O104:H4 Sairastuneita 2684, kuolleita 39 (20.7.2011 menness) HUS-oireyhtym 1/3 sairastuneista EFSA (Euroopan elintarviketurvallisuus-viranomainen) ja

    ECDC (Euroopan tautikeskus) riskinarvio Saksan ja Ranskan epidemioiden todennkinen yhteinen tekijegyptilist alkuper olevat sarviapilan siementen idut

  • 17.11.2011 32

    Ripulikolit Burkina Fasossa Suomen Akatemian projekti

    2008-2011: Ruoka- ja vesivlitteisten enteropatogeenisten bakteerien epidemiologia Burkina Fasossa

    Mikrobiologista tutkimusta kestvn kansanterveystyn strategian tueksi

    Ei aikaisempaa tietoa enteropatogeenien epidemiologiasta

    Ripulikolien detektointi elintarvikkeista ja ihmisten ulosteista, EHEC-kantojen eristys ja tyypitys

  • 17.11.2011 333333

    Elintarvikehygienia Ouagadougoussa syy ripulikolien korkeaan esiintymiseen raaoissa lihoissa

  • 17.11.2011 3434

    Virulenssigeenien esiintyvyyden vertailu ripulikolipositiivisissa lihanytteiss ja

    lasten ulostenytteiss16-alukkeinen PCR sekaviljelmille

  • 17.11.2011 35

    Burkina Fasosta eristetyt EHEC-kannat Eristysmenetelmin peskehybridisaatio ja PCR-seulonta 21 kantaa: 20 lihoista (naudanlihatuotteet, lampaanliha) ja 1

    ripulia sairastavan lapsen ulosteesta Kaikilla kannoilla stx1, puolella mys stx2 stx2 virulentimpi. Kaikki kannat intimiininegatiivisia (eae-geeni), mutta

    seitsemll kannalla intimiinia mahdollisesti korvaava STEC-autoagglutinoiva adhesiini (saa-geeni) (adheesio suoliston epiteelisoluihin)

    Verosolukokeessa testattu kanta tuotti shigatoksiinia Serotyyppej O8:H-, O38:H26, O82:H8, O179:H- ja

    OX183:H18 on aikaisemmin eristetty ripulipotilailta Serotyyppi O2:H2 on aikaisemmin eristetty HUS-potilaalta

  • 17.11.2011 3636

    Tutkimuksen johtoptksi Ripulikoleja esiintyi 43 % toreilla

    myytviss raaoissa lihoissa sek59 % ripulista krsivillpikkulapsilla Burkina Fasossa

    Lasten ruoka valmistetaan usein samoissa oloissa, jossa raakaa lihaa ksitelln Saastunut liha voi olla pikkulasten ripulikoli-infektioiden takana

    EPEC- ja ETEC-patoryhmt esiintyivt usein sek uloste- ettlihanytteiss mahdollinen tartuntayhteys

    Lihoista ja sairaalta lapselta eristetyt EHEC-kannat ovat mahdollisesti ihmisille patogeenisia

  • 17.11.2011 37

    E. coli -valvonta Elintarvikevalvonta

    Elintarvikkeiden laatuun liittyvt tutkimukset ovat ensisijaisesti toimijan vastuulla

    Omavalvonnan valvonta E. colin kytt indikaattorina (tuotteet, tuotantotilat) kertoo ulosteperisest kontaminaatiosta

    Kontaminaatioiden vhentminen tuotantoelinten teurastuksen jlkeen: ruhojen pesu ja ksittely laimealla hapolla + kylmketju

    Veden laadun valvonta lmpkestoiset koliformit, E. coli Talousvesi Uimavesi

  • 17.11.2011 38

    Mikrobikriteeriasetuksen (2073/2005) mukaiset tutkimukset

    E. coli etsittv: LIHAT: jauheliha, raakalihavalmiste, mekaanisesti erotettu liha (nauta ja lammas: EHEC-listutkimus)KALAT: kuorettomat ja kypsennetyt yriis- ja nilviistuotteet, elvt simpukat, nilviisetMAITO: kulutukseen sellaisenaan tarkoitettu pakattu raakamaito, raakamaidosta tai pastrointia heikommasta lmpksitellyst maidosta valmistettu kerma ja voi, pastrointia voimakkaammasta lmpksitellyst maidosta tai herasta valmistetut kypsyttmttmt pehmet juustot tai kypsytetyt juustotKASVIKSET JA HEDELMT: Pilkotut hedelmt ja vihannekset, kun tarkoitettu sellaisenaan sytvksi (esim. salaatit, raasteet, pakastevihannekset), Hedelm ja vihannesmehut (pastroimattomat, sellaisenaan juotavat)

    Listutkimuksena voidaan etsi EHEC-bakteeria

  • 17.11.2011 39

    EHEC-valvonta Tartuntatautilaki (989/2006) ja -asetus (1376/2006)

    Ihmisten EHEC-infektiot luokitellaan yleisvaarallisiksitartuntataudeiksi

    Elintarvikevalvonta Lihantarkastus Esim. ELISA-mentelmn perustuva pikatesti (antigeeni-

    vasta-ainekompleksin muodostuminen) EHEC O157:lle THL:ss

    Humaanikantojen tyypitys Epidemioiden tilastointi

    EVIRA:ssa Elintarvikkeista ja elimist eristettyjen kantojen tyypitys Escherichia coli O157, O145, O111, O103 ja O26 -

    seroryhmien osoittaminen viljelymenetelmll ja reaaliaikaisella PCR-menetelmll

  • 17.11.2011 40

    Maa- ja metstalousministerin asetus nautojen EHEC-tutkimuksista teurastamossa ja pitopaikassa

    (24/EEO/2006)Teurastamon ja pienteurastamon elintarvikelain 20 :n mukaiseen

    omavalvontasuunnitelmaan on sisllytettv nytteenotto EHEC-bakteerin varalta teurastamolle tai pienteurastamolle vastaanotettujen nautojen ulosteesta liitteen 1 mukaisesti. Nytteet on lhetettv tutkittavaksi elintarvikelain 39 :n 2 momentin mukaiseen laboratorioon. Nytteet on tutkittava E. coli O157-kantojen varalta. Nytteet tutkivan laboratorion on toimitettava eristmns E. coli O157-bakteerikannat Elintarviketurvallisuus-virastoon. Elintarviketurvallisuusviraston on varmistettava sille toimitetut bakteerikannat.

    Elintarviketurvallisuusviraston on laadittava vuosittain teurastamoita koskeva nytteenottosuunnitelma EHEC-seurantaa varten. Suunnitelmassa ilmoitetaan teurastusmriin perustuva nytteiden mr teurastamokohtaisesti. Teurastamossa on otettava nytteitnytteenottosuunnitelman mukaisesti. Nytteenoton on oltava satunnaista ja jakauduttava mahdollisimman tasaisesti koko vuoden ajalle. Pienteurastamossa on otettava vhintn kaksi nytettvuodessa. Jos pienteurastamo teurastaa alle 100 nautaa vuodessa,nytteit ei tarvitse ottaa.

  • 17.11.2011 41

    Viranomaiset: ruokamyrkytysten selvitysty

    THL: TART, TABATartuntatauti-

    rekisteri

    Sairaanhoitopiirit

    ElintarvikevirastoRuokamyrkytys-

    rekisteri

    Elinlkint- ja elin-tarviketutkimuslaitos

    Lninhallitus

    Kunnallinen elintarvikelaboratorio

    Terveydensuojelu-viranomainen

    Terveyskeskus

    Ruokamyrkytysten selvitystyryhmNiemi ym. 2004

  • 17.11.2011 42

    Yhteenveto EHEC (seroryhm O157) merkittvin ruokamyrkytyksi aiheuttava

    koli Tapauksia vuosittain vhn muihin ruokamyrkytysbakteereihin

    verrattuna, mutta aiheuttaa vakavia oireita Ripulikolikantojen muuntuminen uhkana vakavia infektioita Tartuntojen ennaltaehkisy riittvn valvonnan avulla Epidemioiden jljitys vaatii viranomaisten yhteistyt

  • 17.11.2011 43

    KIITOS!

    [email protected]