MICROSCOPIA ELECTRONICĂ: NOŢIUNI GENERALE, DESCRIEREA MICROSCOPULUI ELECTRONIC DE TRANSMISIE (TEM), MICROSCOPULUI

ELECTRONIC DE TIP “SCANNING”, MICROSCOPUL ELECTRONIC DE ÎNALT VOLTAJ

În microscopia electronică fasciculul de lumină este înlocuit cu un fascicul de electroni acceleraţi.

Relaţia dintre puterea (limita) de rezoluţie şi lungimea de undă a radiaţiei luminoase, stabilită pentru microscopia optică este corectă şi aplicabilă pentru orice formă de radiaţie deci şi pentru un fascicul de electroni. Proprietăţile de undă ale electronului au fost descoperite de fizicianul francez L. de Broglie, în 1924 , Electronii nu au o lungime de undă constantă; ea creşte pe măsura, ce creşte viteza electronilor. Într-un microscop electronic, la o tensiune de accelerare de 100.000 V, lungimea de undă a electronilor este de 0,004 nm. Rezoluţia teoretică (calculată) corespunzătoare acestei lungimi de undă ar trebui să fie de 0,002 nm. În fapt, ea este mai mică, fiind limitată de mai multe cauze, printre care: a. aberaţiile lentilelor electromagnetice sunt mai greu de corectat decât cele ale lentilelor de sticlă; b. tehnicile de preparare (fixare, includere, contrastare) şi c. efectele de deteriorare ale specimenului datorate fasciculului de electroni. În consecinţă, specimenele de natură biologică pot fi observate în microscopia electronică la o rezoluţie limită de 2 nm (20 Å), de aproximativ 100 de ori mai bună decât rezoluţia microscopului optic.

Cele mai perfecţionate microscoape electronice aflate in exploatare în diferite laboratoare, au rezoluţii garantate de 2-3 Å iar în condiţii speciale se poate ajunge la 1,2-1,4 Å şi o putere de mărire (directă, în aparat) de 800,000 de ori. Deci, rezoluţia acestor aparate se apropie de dimensiunea atomului de hidrogen care este de 1 Å. Pentru comparaţie, reamintim că rezoluţia ochiului uman, la o distanţă de 25 cm a obiectului, este de 0,1 mm iar a microscopului optic de 0,1-0,2 μm .

Judecând după performanţele de rezoluţie ale microscoapelor electronice actuale (2-3 Å) s-ar putea considera că observarea directă a aminoacizilor în moleculele proteinelor, de exemplu, nu reprezintă o problemă. Aminoacidul cu diametrul cel mai mic este glicina (5.1 Å), iar cel mai mare este triptofanul (175.5 Å).

Acest lucru nu este posibil deoarece rezoluţia amintită se poate obţine doar pe reţelele cristaline ale unor substanţe şi nu direct pe biomolecule.

Domeniul de investigaţie de la celulă până la moleculă sau atom, care urmăreşte înţelegerea organizării ansamblurilor de molecule în structuri supramoleculare, a proceselor legate de biosinteza acestora precum şi a funcţiilor lor, constituie domeniul ultrastructural. La acest nivel nu se mai poate vorbi de zoologie, morfologie sau fiziologie (în sensurile clasice), ci de un spaţiu unificat al cunoaşterii viului, acela al biologiei celulare şi moleculare.

1. Microscopul electronic de transmisie (TEM)

Într-o perspectivă foarte generală, microscopul electronic de transmisie (fig.1,2) este similar microscopului optic. Sursa de iluminare este înlocuită cu un filament sau catod care are rolul de a emite fasciculul de electroni. Catodul este localizat în partea

superioară a unei coloane cilindrice de aprox 2m. Pentru a se evita dispersia electronilor din fascicul prin coliziunea cu moleculele aerului, în coloană se creează vid prin pomparea în afară a aerului.

Electronii produși de filamentul supraîncălzit sunt accelerați față de un anod, căruia i se aplică o tensiune negativă ce smulge electronii și îi accelerează. Fasciculul trece printr-o deschidere îngustă a anodului și străbate în întregime coloana.

De-a lungul coloanei sunt plasați mai mulţi e1ectromagneţi (lentile electromagnetice) care pot concentra sau focaliza fasciculul îndeplinind un rol similar cu acela al lentilelor de sticlă din microscopia optică.

Fig. 1 Schema componenetelor unui microscop electronic de transmisie

Fig. 2 Microscopul electronic de transmisie

Un sistem de diafragme cu diametrul de 30-100µm opresc trecerea electronilor mărginași, îmbunătățindu-se claritatea și contrastul imaginilor.

Specimenul este situat în coloana vidată, pe direcţia fasciculului de electroni. În urma coliziunii electronilor fasciculului primar cu specimenul, rezultă mai multe tipuri de electroni sau radiaţii, majoritatea fiind utilizate în diverse microscoape electronice (fig. 3). Ca și în microscopia optică, specimenul este „colorat” (contrastat) cu substanțe electrocondense adică substanțe capabile să disperseze cea mai mare parte a electronilor incidenți pe suprafața ocupată de ele. Electronii care au străbătut preparatul (transmiși) sunt focalizați pentru a forma o imagine pe un ecran fluorescent sau pentru a impresiona o placă fotografică. Deoarece regiunile dense ale preparatului vor dispersa majoritatea electronilor, aceste zone vor arăta pe ecran sau în fotografie ca zone mai negre, mai închise și se vor numi zone electron-dense.

Electroni transmiși

Fig. 3 Prezenterea schematică a interacțiunii dintre fasciculul primar de electroni și specimen

2. Microscopia electronică de baleiaj (SEM)

Microscopul electronic de baleiaj (termen derivat din lb. franceză) sau microscopul electronic scanning (termen derivat din lb. engleză) (fig. 4) permite obţinerea unor imagini tridimensionale ale specimenului. Prin intermediul unui astfel de aparat se pot studia suprafeţele obiectelor biologice, fără a se obţine însă informaţii despre modul de organizare în profunzime (referitoare la structurile lor interne).

În timp ce în microscopia electronică de transmisie (TEM) imaginea se formează datorită electronilor transmişi (care pot trece prin preparat), în microscopia electronică scanning (SEM) imaginea se obţine prin detectarea şi măsurarea fluxurilor electronice dispersate sau emise (electroni secundari) de pe suprafaţa specimenului. Deci, cu cât suprafaţa specimenului va dispersa (reflecta) în mai mare măsură electronii fasciculului cu atât imaginea obţinută va fi mai bună. Proprietăţile reflectorizante ale suprafeţelor specimenelor sunt amplificate prin acoperirea lor cu un strat subţire de metal greu (aur, platină, aliaj aur-platina etc.). Pe suprafaţa specimenului este proiectat un fasicicul foarte îngust de electroni care parcurge într-un mod ordonat întreaga sa suprafaţă (baleiere, scanare). Detectorul de electroni dispersaţi (reflectaţi) sau secundari (emişi din specimen

în urma coliziunii cu electronii fasciculului primar) măsoară punctiform proprietăţile acestora traducându-le într-un semnal luminos pe ecranul unui monitor. Imaginea specimenului pe ecran se reconstituie pe baza semnalelor ( imaginilor) punctiforme datorate electronilor dispersaţi sau secundari detectaţi.

Microscoapele de baleiaj permit diferenţe mari între planurile de focalizare, deci facilitează examinarea suprafeţelor unor obiecte relativ mari. Deoarece cantitatea electronilor dispersaţi este dependentă şi de unghiul dintre suprafaţa specimenului şi fasciculul de electroni, imaginea obţinută va fi mai luminată sau mai umbrită. Se amplifică astfel aparenţa de tridimensionalitate spaţialitate.

Microscoapele electronice de baleiaj sunt mai mici şi mai puţin costisitoare în comparaţie cu microscoapele electronice de transmisie. Microscoapele de baleiaj (cele uzuale) nu au o rezoluţie foarte mare ci doar de aproximativ 10nm; mărirea efectivă ( obţinută în aparat) este de pană la 20.000 de ori.

În concluzie, microscopia electronică de baleiaj poate fi utilizată în mod curent pentru ivestigarea celulelor întregi, a ţesuturilor, a fragmentelor de organe ( de exemplu, a fragmentelor de frunze, rădăcini etc.) sau chiar a unor organisme de dimensiuni adecvate (unele insecte, de exemplu).

În ultimul timp, s-a reuşit o îmbunătăţire substanţială a rezoluţiei în microscopia electronică de baleiaj reducându-se mult diferenţa faţă de TEM. Au fost produse instrumente care permit o rezoluţie de 0,5-1 nm, deci, o vizualizare directă, tridimensională, a unor detalii de nivel molecular. Acest nou domeniu al SEM poartă, numele de microscopie electronică scanning de înaltă rezoluţie (HRSEM - engl. High-Resolution Scanning Electron Microscopy ) . Aceste performanţe au fost obţinute prin utilizarea electronilor slab accelaraţi, care reduc producerea de sarcini electrice în specimen precum şi capacitatea de penetrare a specimenului, chiar dacă. acesta este foarte subţire.

Fig. 4 Microscopul electronic de baleiaj (SEM)

3. Microscopul electronic de voltaj supraînalt

Este o variantă a TEM cu o coloană cu lungime totală de 10m. Deoarece tubul de accelerare este de dimensiuni mari, accelerarea electronilor este de aproximativ 1.000.000 V. Acest voltaj conferă electronilor suficientă enargie cinetică pentru a penetra prin preparate cu grosime de microni sau chiar prin întreaga celulă. Imaginea rezultată este o “radioscopie celulară” care evidențiază ultrastructura întregii celule, fără a fi nevoie de ssecțiuni ultrafine.

Principalul avantaj al microscopului electronic de voltaj supraînalt este acela că permite observarea în profunzime și dă o imagine tridimensionslă asupra celulei. Rezoluția și adâncimea câmpului sunt extrem de performante pe toată grosimea preparatului.