Universidad Nacional Mayor de San Marcos

E.A.P. Ingeniera Agroindustrial

INDICE Pginas: INTRODUCCIN. 2

OBJETIVO. 3

FUNDAMENTO TEORICO...3

PARTE EXPERIMENTAL ..6

RESULTADOS ,.....7

DISCUSIN DE RESULTADOS7

RECOMENDACIONES7

CONCLUSIONES .......8

CUESTIONARIO..8

APENDICE9

BIBLIOGRAFA...1O

TCNICAS DE COLORACIN DE MICROORGANISMOS

1. INTRODUCCINEl tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste entre la clula y el medio que la rodea es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse tambin para localizar estructuras especficas en la clula o para distinguir entre tipos diferentes de clulas.

La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos.

Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles. Los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn.

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopia son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie.

2. OBJETIVOEstudiar las tcnicas de coloracin de microorganismos ms empleadas en microbiologa para su diferenciacin y estudio microscpico.3. FUNDAMENTO TEORICO3.1 TINCIN DE GRAM

Se puede utilizar a menudo un mtodo que no tie igualmente todas las clulas, un proceso denominado tincin diferencial. La tincin de este tipo ms extensamente utilizada es la tincin de Gram, denominada as por el bacterilogo dans Hans Christian Gram, quien la desarrollo. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, gran positivas y gran negativas.Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos con cierto detalle la tincin de Gram. Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien primero con una solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado todas las clulas, tanto las gran negativas como las gran positivas, estn teidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo (I2) yoduro potsico (KI). El ingrediente activo es aqu el yodo, el yoduro potsico simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas gran positivas como las gran negativas se encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo despus de la decoloracin, usando bien alcohol o bien acetona, sustancias en las que es soluble el complejo yodo cristal violeta. Algunos organismos (gran positivos) no se decoloran mientras que otros (gran negativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est, por lo tanto, en la resistencia a la decoloracin. Despus de la decoloracin las clulas gran positivas son todava azules, pero las gram negativas son incoloras. Para poner de manifiesto las clulas gran negativa se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas gran negativas son roja grosella mientras que las Gran positivas permanecen azul.

Figura 1: La tincin de Gram.

Finalmente, el carcter de gran positivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos organismos son ms gran positivos que otros y algunos son gran variables, es decir, unas veces gran positivos y otras gran negativos. La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio bacteriolgico.

TINCIN CIDO ALCOHOL RESISTENCIA

Esta tincin sirve principalmente para clasificar mico bacterias y actinomicetos, que tienen un alto contenido en lpidos y en cidos miclicos y que no pueden ser calificadas por la tincin de Gram. Para empezar se hecha sobre el portaobjetos una mezcla de fucsina fenol, en la que la fucsina hace de colorante rosa y el fenol de mordiente. Las clulas se tien de rosa, tanto el cido alcohol sensible como las resistentes. Despus se usa un decolorante orgnico que hace que las bacterias cido alcohol sensibles se decoloren mientras que las cido alcohol resistentes se quedan rosa. Como en la tincin de Gram se utiliza un colorante de contraste que en este caso es el azul de metileno que tie las clulas cido alcohol sensible de color azul quedando las clulas cido alcohol resistente de color rosa.

Figura 2: La tincin cido alcohol resistencia.

Tincin de esporas

Se utiliza para teir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas.Sobre el portaobjetos con la preparacin se echa verde malaquita que tie las clulas de verde. Luego se lava con agua destilada con lo que las clulas se quedan incoloras y las endosporas permanecen verde. Finalmente se usa la safranina para obtener bacterias de color rosa mientras que las endosporas continan con su color verde del verde malaquita

Figura3: La tincin de esporas.

4. PARTE PERIMENTAL

4.1 MaterialesPorta objetoMicroscopioAsa de siembraMechero

4.2 MuestrasMC carneAPS arroz

4.3 Reactivos Agua destiladaCristal violetaLugolAlcohol cetonaSafranina

4.4 Procedimiento experimental En el centro de una lmina porta objeto se coloca una gota de agua destilada. Con ayuda del asa de siembra se toma una alcuota del cultivo muestra y extender en la lmina. Llevar al mechero y flamear hasta fijar la muestra. Colocar 2 gotas de cristal violeta y dejar actuar por 2 minutos. Lavar con agua de cao, aadir lugol y dejar actuar por un minuto. Seguidamente enjuagar con agua de cao. Decolorar con alcohol-acetona cuidadosamente para evitar llevarse el frotis. Aadir 2 gotas de fucsina bsica o safranina y dejar actuar por un minuto. Secar y observar en el microscopio a menor aumento y luego a mayor aumento. Hacer los esquemas de sus observaciones. Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersin.

5. RESULATADOS

muestraTipo de bacteria

MC carmeestreptococosGran positivas

APS arrozGran negativo

6. DISCUSIN DE RESULTADOSLa diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin se debe:En las bacterias Gram negativas: La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea.En las bacterias Gram positivas: Al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violcea.

7. RECOMENDACIONES Al enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua corriente se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, sta debe caer sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra. Tambin el enjuague se debe realizar poniendo la lmina portaobjetos en posicin inclinada hacia abajo.

8. CONCLUSIONESLos fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre lasparedes celularesde las bacterias Gram positivas y Gram negativas

CUESTIONARIO

Cul es la accin que cumple el lugol en la coloracin Gram?En el lugol (KI) el ingrediente activo es el yodo, el yoduro potsico simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. En conclusin el lugol es un mordiente, sustancia que forma compuestos insolubles con colorantes y determina su fijacin en las bacterias.Cul es la razn del uso de alcohol acetona?El alcohol-acetona se usa para realizar la decoloracin, sustancia que es soluble en el complejo yodo cristal violeta. Algunos organismos (gran positivos) no se decoloran mientras que otros (gran negativos) lo hacen.Cul es el fundamento de la coloracin Gram?Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre lasparedes celularesde las bacterias Gram positivas y Gram negativas.La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa depeptidoglucano. Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez.Qu es un peptidoglicano y cul es su importancia en las bacterias?

ANEXOBacteriasEscherichia coli(Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teidas con la tincin de Gram.

BacteriasClostridium perfringens(Gram positivas)

Bacterias Gram positivas deBacillus anthracis(bacilos morados) que producen una enfermedad llamadaCarbunco, encontrados en una muestraliquido cerebroespinal. Si hubiera una especia de bacteria Gram negativa apareceria de color rosa. El resto sonleucocitosatacando la infeccin.

BIBLIOGRAFA TCNICAS DE TINCIN, ACUA NATURA Aulton Michael E., Ciencia y diseo de formas farmacuticas, 2 edicin, Ed. Elsevier Espaa, 2004.. Madigan, MT; Martinko J, Parker J (2004). Brock Biology of Microorganisms (10th ed.). Lippincott Williams & Wilkins.ISBN 0-13-066271-2. Sgaard M, Nrgaard M, Schnheyder H (2007). "First notification of positive blood cultures: high accuracy of the Gram stain report (Epub ahead of publication)". J Clin Microbiol 45: 1113.

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