UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE NICARAGUA

Instituto Politécnico de la Salud

Temas:-Generalidades y características de Enterobacterias.-Pruebas bioquímicasGram + y Gram –-BLEE

Elaborado por:

- Elena Manzanares- Faviola Martínez

Carrera: Lic. Bioanálisis ClínicoIII año

Managua , 24 de Julio de 2009

GENERALIDADES DE ENTEROBACTERIAS

Las Enterobacterias pueden vivir libres en la naturaleza y habitualmente forman parte de la Flora Normal del Colón Humano, en escaso porcentaje (mas del 98% de la flora intestinal son anaerobios de los géneros Bacteroides y Prevotella). Pueden encontrarse transitoriamente en la piel (especialmente perianal), el tracto genital femenino y muy ocasionalmente, el tracto respiratorio superior de los individuos sanos. Las enterobacterias parecen en una mayor proporción en la flora de individuos hospitalizados, especialmente en aquellos que sufren enfermedades graves y debilitantes. Taxonómicamente las enterobacterias se le han definido mas de 25 géneros y 110 especies o grupos: sin embargo, las enterobacterias clínicamente significativas comprenden 20 a 25 especies. Entre ellas los géneros mas importaNtes son: Escherichia, Shigella, Salmonella, Klepsiella, Serratia, Enterobacter, Proteus, Morganella, Providencia, Pseudomona, Acinobacter y Yersinia, entre otras.

Las enterobacterias poseen 3 grupos de antígenos que se han usado para su clasificación: 1) flagelares “H” que son termolábiles; 2) capsulares “K” y 3) somáticos “O”.

Factores de Patogenicidad:

1) Adhesinas, actividad presente en fimbrias, que se asocian con uropatogenicidad de E. coli y enteropatogenicidad para otros géneros de enterobacterias. También existen adhesinas afimbricas. 2) Pseudocápsula, que permite la adherencia a fómites, como sondas urinarias y catéteres.3) Capsula, se asocia con mayor invasividad, particularmente en la Meningitis por E. coli.4) Exotoxinas y exoenzimas: especificas para cada género y especie. 5) Endotóxinas, representada por LPS. Puede provocar el Shock endotoxico.6) Sideróforos.7) Plásmidos, permiten la transferencia de factores de patogenicidad y genes que otorguen resistencia antibiótica a otras bacterias.

- Son bacilos gram (-) dotados por flagelos peritricos o carentes de motilidad.-Crecen sobre peptonas o medios con extracto de carne sin adición de cloruro de sodio ni otros suplementos, crecen bien en Agar MacConkey, ASC, Ach.-No forman esporas, Son oxidasa (-), son catalasa (+), reducen los nitratos, fermentan la glucosa en vez de oxidarla con producción de gas o sin la misma y son aerobios o anaerobios facultativos. - Crecen a temperaturas de 30-37 grados C excepto Salmonella y Shigella y Ph de 7.2 a 7.5

CARACTERISTICAS DE ENTEROBACTERIAS

Características en el crecimientoIdentificación presuntiva rápida, bacterias

entéricas gram (-)

Fermentación rápida de lactosa

Fermentación lenta de lactosa

No fermentación de lactosa

Escherichia coli: brillo metalico sobre medio diferencial: dotado de motilidad, colonias no viscosas, aplanadas.Enterobacter aerogenes: colonias elevadas, sin brillo metálico; con frecuencia motiles; crecimiento mas viscoso.Klepsiella pneumoniae: muy viscoso, crecimiento mucoide, no motil.

Edwarsiella, Serratia, Citrobacter, Arizona, Providencia, Erwinia.

Especies de Shigella: carentes de motilidad, no forman gas a partir de glucosa.Especies de Salmonella: dotado de motilidad; habitualmente forman acido y gas a partir de glucosa.Especies de Proteus: swarming sobre agar, hidrólisis rápida de la urea (olor amoniacal).Especies de Pseudomonas: pigmentos solubles, fluorescencia azul-verdoza, olr a taml pisque o a uva.

Pruebas Bioquímicas de las Enterobacterias

Reacción bioquímica por enterobacterias comunes de importancia clínica Citrobacte

rEnterobacte

rEscherichia Klebsiell

aMorganella Proteus Providenci

aSalmonell

aSerrati

aShigell

a

TSI K/A A/A A/A A/A K/A K/A K/A K/A K/A K/AH2S +/- - - - - + - +/- - -Gas + + + +/- + +/- +/- +/- +/- -

Lisina - +/- + + - - - + + -Fenilalanin

a- - - - + + + - - -

Motilidad + + +/- - + + + + + -Indol +/- - + +/- + +/- + - - +/-

Ornitina +/- + +/- - + +/- - + + +/-Citrato + + - + - +/- + +/- + -

Malonato

Ureasa - - - + + +/- - - -VP - + - - - - - + -

Glucosa + + + + + + + + + +

Arginina +/- +/- - - - - - +/- - -

- Son gram (-),rectos o ligeramente curvos(0.5-1)

- Poseen flagelos polares.

- No producen fragmentacion.

- Emplean pocos hidratos de carbono (glucosa, ribosa, gluconalo), mediante metabolismo oxidativo,.

- Citocromo-Oxidasa (+), catalasa +, lactosa –

- Aerobios obligados.

- Algunas cepas son mucoides (capsula polisacárido) en pacientes con fibrosis quistica.

-Algunas seudomonas (aeruginosa) producen pigmentos difusibles en el medio de cultivo:

a)piocianina(azul)

b)Fluoroceina (amarilla)

c)Pioverdina (verde)

d)Piorrubina (roja-parda)

e)Piomelanina (marron o negro)

TSI :K/K

LIA: K/Ac

Crecimiento a 42 grados.

Pseudomona auroginosa

FLUJOGRAMA DEL PROCESAMIENTO DE MUESTRAS BACTERIOLOGICAS PARA IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS:

MUESTRA (medio de trasporte STUART) sembrar en:

ASC/McK

Observar caracteristicas morfologicas del crecimiento, sospechamos de Gram negativo

Fermentador LAC+

Pruebas bioquimicas: *TSI, LIA,*MIO,Citrato,

Malonato, UREA, VP/RMy y antibiograma

No Fermentador LAC-

TSI, *LIA,MIO,Citrato, Malonato,UREA,

VP/RM y anibiograma

El agar Hierro Tres Azucares (TSI), es un medio sólido y diferencial. El fundamento se basa en la capacidad de un microorganismo de atacar un hidrato de carbono especifico. Incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gas. Junto con la determinación de posible producción de acido sulfhidrico H2S.

TSI

Extracto de carne 3.0 Extracto de levadura 3.0

Peptona 20.0 Lactosa 10.0

Glucosa 1.0 Cloruro sódico 5.0

Citrato férrico amónico 0.5

Tiosulfato sódico 0.5 : fuente de azufre, las bacterias lo reducen produciendo ác. sulfhídrico (precipitado negro)

Rojo de fenol 0.03 : indicador, si vira a rosáceo , indica basicidad del medio, si es amarillo indica acidificación (derivada de ác. de la fermentación)

El agar Hierro Tres Azucares (TSI), es un medio sólido y diferencial. El fundamento se basa en la capacidad de fermentación de dos azucares (glucosa y lactosa), en la producción de ác. sulfhídrico y en la producción de gas. Composicion g/l: Interpretación del TSI:

1Fermentador glucosa, productor ác. sulfhídrico y de gas.

2

3 Fermentador glucosa, lactosa y sacarosa, productor de gas.

Interpretación del TSI:

Interpretación:NC o SC: no cambio o sin cambio LC, Alk o K : alcalinidad

H2S o subíndice s: si produce ác. sulfhídrico G: productora de gas

A/As indica que es fermentador de glucosa, lactosa y sacarosa, si se observa ennegrecimiento del medio hay producción de acido sulfhídrico

Ak/Ac con o sin gas, lo que significa que solamente hay fermentación de glucosa. Si además se observa ennegrecimiento del medio, hay producción de acido sulfihidrico.

Principio:Medir la capacidad enzimática de un microorganismo para descarboxilar un aminoácido en ambiente anaerobio para formar una amina. Con consiguiente alcalinidad. Junto con la determinación de posible producción de ácido sulfhídrico (H2S) y la capacidad enzimática para desminar en ambiente aerobio el aminoácido formando un complejo de color anaranjado que al combinarse con el púrpura del medio da un color rojo en la parte inclinada del tubo.

LIA

Este medio pone de manifiesto: - Descarbosilacion de la lisina (K/K o K/N) Si la bacteria posee la enzima descarboxilasa (LDC) el medio contiene como indicador Purpura de Bromocresol, al activarse la lisina s descarboxilasa en un pH acido, el indicador vira a purpura o conserva el color sin inocular. Cualquier cambio de color en el fondo después de la producción de acido es una prueba positiva.- Desaminación de la lisina (R/A): El inclinado del tubo se torna inicialmente alcalino por la utilización oxidativa de las peptonas; al activarse la desaminasa. El PH alcalino , el color del medio se torna rojo. El fondo del tubo permanece acido (amarillo) por fermentación de la glucosa.No utilización de la lisina: El color amarillo del fondo del tubo se debe exclusivamente a la utilización de la glucosa.Si es productora de ác. sulfhídrico, en cuyo caso el precipitado es negro.- Si es productora de gas.

Este medio pone de manifiesto: - Si la bacteria posee la enzima descarboxilasa (LDC). el medio contiene como indicador Purpura de Bromocresol, cuando la lisina se descarboxila, el medio se acidifica y el indicador vira amarillo en el fondo.- Si es productora de ác. sulfhídrico, en cuyo caso el precipitado negro nos impedirá ver si es LDC + o -.- Si es productora de gas.

Este medio pone de manifiesto: - Si la bacteria posee la enzima descarboxilasa (LDC). el medio contiene como indicador Purpura de Bromocresol, cuando la lisina se descarboxila, el medio se acidifica y el indicador vira amarillo en el fondo.- Si es productora de ác. sulfhídrico, en cuyo caso el precipitado negro nos impedirá ver si es LDC + o -.- Si es productora de gas.

1. LDC -, NO H2S, PRODUCTORA GAS.

2. LDC + ó -, PRODUCTROA H2S Y GAS.

3. LDC - , NO H2S, PRODUCTORA DE GAS

Principio:

Es un medio que se utiliza para determinar la presencia de flagelos, así como los enzimas descarboxilasa de ornitina y triptofanasa. Por lo tanto, sirve para determinar la movilidad, descarboxilación de la ornitina y producción de Indol. Movilidad: Algunas bacterias poseen flagelos y otras carecen de ellos. Este medo ayuda a diferenciar las bacterias móviles de las no móviles.Producción de Indol: Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, el aminoácido triptófano será degradado en varios productos entre los cuales esta el indol, el cual se hace visible al agregarle el reactivo Kovac (para dimetilaminobenzaldehido), o Erlich con un color rosado intenso. Sin la presencia de la enzima y ausencia del indol, el reactivo se transparente. Descarboxilacion de la Ornitina: Detecta la presencia de la enzima descarboxilasa de la ornitina, que de estar presente desdobla la ornitina en putrescina, un producto con Ph alcalino, lo que hace intensificar el color violeta el medio.

MIO

Se usa para determinar si el organismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono y compuesto amoniacales como única fuente de nitrógeno. El medio contiene citrato sódico, fosfato de amonio y azul de bromotimol como indicador; este se tornará azul cuando el medio se basifica. Las bacterias que metabolizan el citrato liberan iones amonio al medio (degradación del fosfato amónico) lo que provoca que este se alcalinice y el indicador vire azul.

CITRATO

Evalúa la capacidad del microorganismo de utilizar el malonato como única fuente de carbono y la desanimación de la fenilalanina, en forma combinada. Las enterobacterias no tienen la capacidad enzimática de realizar las dos reacciones simultáneamente, por lo que, o se observa la utilización del malonato o la desanimación de la lisina. Las bacterias que no utlizan el malonato no poseen la enzima fenilalanina desaminasa, por lo que es posible reacciones de malonato y fenilalanina desaminasa negativas.

MALONATO

Principio:

Determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar la UREA formando 2 moléculas de amoniaco por acción de la enzima UREASA.

Interpretación:

1-Reaccion Positiva: Rojo o rosado intenso o rosado chicha o rosado cíclame.

2- Reacción Negativa: No se produce cambio de color es decir el medio conserva su color original de amarillo pálido o el amarillo es un poco mas intenso.

UREA

Principio:

VP: Determinar la capacidad de un microorganismo de producir un producto final neutro, el acetilmetilcarbino (acetoina), a partir de la fermentación de la glucosa.

RM: Comprobar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del sistema.

Utilización de los reactivos:

1- Dividir asepticamente el medio VP/RM en dos porciones iguales de 1.5ml.

2- Agregar a un tubo 5 gotas de rojo de metilo. Interpretando el resultado inmediatamente.

3- Agregar al otro tubo:

a. 0.6 ml de una solucion de alfa –naftol (6gotas)

b. 0.2ml de una solucion de KOH al 40% (2gotas).

c. Agitar suavemente el tubo para exponer el medio al oxigeno atmosferico a fin de oxidar la acetona y obtener una reaccion de color.

d. Dejar descansar el tubo por lo menos 15 minutos (15-30minutos)

VOGES-PROSKAUER/ROJO DE METILO

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana.

Durante al prueba la enzima oxidasa en presencia de oxigeno, citrocromo C y el reactivo de la oxidasa, este se oxida para producir un compuesto colorido llamado indofenol, el reactivo mas usado es el reactivo de kovacs oxidasa, que es una solución de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%.

El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa.

 Así mismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno  que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica.

PRUEBA DE LA OXIDASA

      Identificar todas las especies de Neisseria (+)

      Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.

      También se usa en algunos casos para diferenciar género y especie de otras bacterias.

El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos tóxico y mucho más sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es más caro. Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso.

LA PRUEBA SE USA SOBRE TODO PARA

1. Método en placa directa

Realización de la prueba:

Método en placa directa

Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla.

Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción se produce en unos 10-15 segundos(UN COLOR VIOLETA), mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.

2. Método indirecto sobre papel

Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri.

Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.

Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado.

La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos.

 

 

LA PRUEBA SE REALIZA:

Los cocos Gram positivos aerobios y anaerobios facultativos que están constituidos por la familia Micrococaecceae (genero Staphylococcus, Micrococcus, PLanococcus y Stomacoccus) y los generos Streptococcus y Enterococcus.

El genero Staphylococcus es aerobio-anaerobio facultativo, se agrupan en racimos, coagulasa+, catalasa+. Dentro del genero las especies de importancia clínica: S.aureus, S.saprophyticus y s. epidermidis.

Los estreptococos son  organismos anaerobios facultativos y Gram Positivos que a menudo aparecen formando cadenas o por pares y son catalasa-negativa (los estafilococos son catalasa positivos). Los estreptococos se subdividen en grupos mediante anticuerpos que reconocen a los antígenos de superficie (Figura 4). Estos grupos incluyen una o más especies. Las agrupaciones de estreptococos más importantes son A, B, y D. Entre los grupos de estreptococos, la enfermedad contagiosa (especificamente faringitis) es causada por el grupo A, el cuál se enfatiza aquí. Streptococcus pneumoniae (es la causa principal de pulmonía humana), Streptococcus mutans y otros estreptococos llamados viridans (entre las causas de caries dental) no pertenecen a grupos antigénicos.

Después del crecimiento de estreptococos en agar con sangre de oveja se observan tres tipos de reacción de hemólisis (alfa, beta, gamma). La hemólisis alfa se refiere a una lisis parcial de eritrocitos que produce una coloración verde que se observa alrededor de las colonias (debido a la  liberación de un producto de degradación de la hemoglobina llamado bili-verdina); la hemólisis beta se refiere a un halo de hemólisis completamente claro y la hemólisis gama se refiere a la ausencia de hemólisis. Los estreptococos del grupo A y B son beta hemolíticos, mientras que D es generalmente alfa o gamma. Los Streptococcus pneumoniae y viridans ("verde") son alfa-hemolíticos. Por lo tanto la reacción de hemólisis es importante para la clasificación de los estreptococos. La reacción de hemólisis junto con otra de las características fisiológicas es suficiente para una identificación clínica presuntiva.

GRAM POSITIVOS

Flujograma de las bacterias GRAM positivas

Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las

bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es

Streptococcus.

Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:

· Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).

· Bacillus (+) de Clostridium (-).

· Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y

C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas:

Prueba de catalasa

· Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.

· Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.

· Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

· Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.

· Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

1. Método del portaobjetos (recomendado):

· Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en slant densamente inoculado.

· Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

2. Método del tubo de ensayo:

La prueba de la coagulasa es usada específicamente para diferenciar las especies del genero staphylococccus:

La coagulasa es una enzima producida por S. aures, es relativamente estable al calor, resiste temperaturas arriba de 60C por 30 minutos. Algunos microbiólogos establecen que al coagulación del plasma ocurre en 2 etapas:

Hay una reacción entre la enzima producida por la bacteria, una porción coagulasa, con un factor o activador presente en el plasma para producir la coagulasa.

La coagulasa real del plasma es activada por la coagulasa.

PRUEBA DE LA COAGULASA

Prepare una suspensión gruesa y bien homogénea de cada microorganismo en una solución salina estéril.

Ponga una gota de la suspensión y una gota de plasma humano o de conejo sobre un portaobjetos, mezclar suavemente con el asa y después por rotación.

Observe si hay aglutinación microscópica lo que indica una prueba positiva

Observe si hay aglutinación microscópica lo que indica una prueba positiva

INTERPRETACION:

Una prueba positiva, usualmente ocurre entre 5-20 segundos.

La prueba negativa si la aglutinación no ocurre dentro de 3-4 minutos.

Tecnica en portaobjeto

En un tubo de 13 x 100 esteril mezclar 0.5 ml  de plasma humano o de conejo y una asada grande de la bacteria aprobar. Rotar suavemente el tubo sin sacudir.

Incubar a 35 grados C de 4-6 horas, observe cada 30 minutos.

PRECAUCIÓN: cuando este checando no sacude el tubo, inclínelo suavemente para ver el coagulo, si este no es visible al final de las 6 horas, déjelo en la incubadora por 24 hrs.

Tecnica en tubo

Fundamento: determina la capacidad de un microorganismo de producir factor CAMP, el cual es un factor extracelular poducida por los Streptococos del grupo B que intensifica la lisis de los globulos rojos producida por la B lisina estafilocócica

Procedimiento: con una cepa de Staphylococcus aureus conocida, haga una estria recta en un plato ASC, perpendicularmente al inoculo y sin tocarlo, trace una estria del Streptococcus beta hemolítico en estudio. Incubar a 35 grados por 4 horas.

Lectura e interpretación:

Una imagen similar a un apunta de flecha, indica reacción positiva.

CAMP TEST

La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, que se basa en que las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan bacilos ácido-alcohol resistentes o BAAR. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. La tinición fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1859 to 1926), un bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854 to 1894), un patólogo.

Tinción Zielh Neelsen

La tinción de Gram es la prueba más simple utilizada en el laboratorio de microbiología. Es elprocedimiento diferencial más comúnmente usado para el examen directo de gran variedad de génerosbacterianos. Fue concebido por Hans Christian Joachim Gram en el siglo IX y se mantiene hasta elmomento sin modificaciones sustanciales. Divide a las bacterias en dos grupos: Microorganismos grampositivos que retienen el colorante primario cristal violeta y se observan de color azul oscuro o púrpura y microorganismos gramnegativos que pueden ser decolorados, esto es que pierden el colorante primario. Subsecuentemente toman el colorante de contraste safranina y aparecen de color rojo o rosa.

TINCION DE GRAM

PROCEDIMIENTO:

1. PREPARACIÓN DEL FROTIS:

 

1.1. Colocar una pequeña gota de solución salina en el centro de la lámina. Si son varias muestras, divida la lámina portaobjetos en su parte posterior en 6 y o más cuadrantes y coloque una pequeña gota de solución salina en cada uno de ellos, según la cantidad de muestras que teñirá.

Las gotas pequeñas hacen que el secado sea rápido. En caso de muestras obtenidas de caldos, no se requiere la solución salina.

 

1.2. Tomar la muestra con asa recta (una UFC) o redonda si se trata de caldos de cultivo y mezclarla con la gota de solución salina. Al mismo tiempo que se hace la mezcla, se dispersa en un área de aproximadamente 1cm por lado. El grosor de la muestra deber ser tal que permita la lectura de letras pequeñas a través del frotis.

 

1.3. Ponga la lámina sobre una superficie plana y espere a que se seque a temperatura ambiente.

 

1.4. Rotular la lámina adecuadamente. Si tiene mas de un Gram en la misma lámina cerciórese que con la rotulación le será posible evitar equivocaciones acerca de la proveniencia de la muestra.

 

1.5. Una vez que el frotis esté seco, fijar la muestra pasándola rápidamente dos veces por encima de la flama del mechero. Evite el sobrecalentamiento ya que la pared celular se destruye y las bacterias grampositivas se observarían como gramnegativas. Para saber la temperatura adecuada coloque inmediatamente la lámina flameada sobre el dorso de una mano. En estos casos, la temperatura se debe tolerar sin hacer ningún esfuerzo de resistencia al calor.

 

1.6. Dejar que el frotis se enfríe.

2. TINCIÓN:

 

2.1. Cubrir el frotis ya fijado y frío con cristal violeta, dejar el colorante por un minuto.

2.2. Enjuagar, dejando resbalar el agua con un chorro suave. Escurrir muy bien.

2.3. Cubrir con lugol y dejar por un minuto.

2.4. Repita el numeral 2.2

2.5. Aplicar 2 ó 3 gotas de alcohol acetona (1:1) o alcohol 70o y balancear la lámina de tal manera que se pueda observar la decolaración. El tiempo adecuado es aquel en que las partes más gruesas han dejado de decolorar al realizar el balanceo.

2.6. Inmediatamente repita el numeral 2.2

2.7. Cubrir el frotis con safranina o fucsina acuosa durante 30 segundos.

2.8. Repita el numeral 2.2

2.9. Dejar secar a temperatura ambiente.

2.10. Examinar en el microscopio con lente de inmersión, empleando aceite de inmersión.

 

En lo relativo a la coloración, ya hemos explicado anteriormente que hablamos de microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teñidos de color azul-violeta y de Gram negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado.

 

Formas básicas en que se puede visualizar la morfología bacteriana en una tinción GRAM: 

Cocos

Bacilos

Espirales

Gram+ Gram -

Cocos Gram-positivosRacimos: forma típica de Staphylococcus sp, como S. aureus

Cadenas: forma típica de Streptococcus sp, comoS. pneumoniae, Streptococcus grupo B

Tetradas: forma típica de Micrococcus sp

Bacilos Gram-positivosGruesos: forma típica de Clostridium sp, como C.perfringens, C. septicum

Finos: forma típica de Listeria sp

Ramificados: forma típica de Actinomycetes

Cocos Gram-negativosDiplococos: forma usual de Neiseria sp, como N. meningitidis

También Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfología de diplococos. Acinetobacter puede ser pleomórfico, y a veces aparece como coco Gram-positivo.

Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp, que puede ser Gram-positivo o Gram negativo,y, a menudo, Gram-variable.

Bacilos Gram-negativosBacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli

Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp, como H. influenzae

Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V. cholerae, y Campylobacter sp, como C. jejuni

Forma de aguja fina: forma usual de Fusobacterium sp

Las BLEE son enzimas que son sintetizadas por los bacilos gramnegativos (enterobacterias y no fermentadores) e hidrolizan los antimicrobianos betalactámicos y por lo tanto, confieren resistencia a penicilinas, cefalosporinas (de primera, segunda, tercera y cuarta generación) y monobactames. Dada su particular estructura química, algunos de estos betalactámicos son resistentes a la hidrólisis: cefamicinas (cefoxitina, cefotetan y otros) y carbapenems (imipenem, meropenem y otros).

Métodos para la detección de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) en bacilos gramnegativos

 

CONFIRMACIÓN DE BLEE POR DIFERENCIA EN EL TAMAÑO DE LOS HALOS ENTRE DOS DISCOS:

Cuando la diferencia entre ceftacidima (o cefotaxima) y ceftacidima/ácido clavulánico (o cefotaxima/ ácido clavulánico) es >5mm se confirma la presencia de BLEE. Es necesario realizar las dos pruebas para determinar si la las BLEE son ceftacidimazas, cefotaximasas o ambas.

MÉTODO DEL “HUEVO” (DEFORMACIÓN) CON TRIPLE DISCO:2.2.1. Discos a utilizar:2.2.1.1 Ceftacidima (CAZ) 30 g2.2.1.2 Ceftriaxona (CRO)* 30 g o cefotaxima (CTX) 30 g2.2.1.3. Amoxicilina con ácido clavulánico (AMC) 20/10 g

Fundamentos fisiológicos del método:Para realizar el antibiograma se colocan en fila los tres discos anteriores teniendo cuidado de colocar el de amoxicilina/clavulánico en el centro de la fila. La distancia recomendada debe ser entre 2 a 3 cm entre el centro de la cefalosporina y el centro del disco de AMC.

El efecto huevo se debe a que el inhibidor se difunde radialmente con gradientes de concentración decrecientes alrededor del disco de AMC. Las bacterias que se encuentran en la zona alrededor de este disco tendrán la BLEE inhibida hasta una distancia tal que el ácido clavulánico haya disminuido lo suficiente como para no seguir inhibiendo a la enzima. Es decir, a mayor distancia del disco de AMC, menor concentración de clavulánico, menor inhibición de la BLEE. Por otro lado, el mismo fenómeno de gradientes de concentración ocurre en los discos de las cefalosporinas puestos a los lados del disco de AMC: a mayor distancia del disco, menor concentración de la cefalosporina de tercera generación. La interacción de estos dos gradientes es la que determina la deformación del halo de inhibición (ver figura

CONTROL DE CALIDAD DE BLEE POR DIFERENCIA EN EL TAMAÑO DE LOS HALOS:Escherichia coli ATCC 25922:<2mm de incremento en la zona de inhibición.Klebsiella pneumoniae ATCC 700603:>5mm de incremento en el halo entre ceftacidima y ceftacidima/ácido clavulánico.>3mm de incremento en el halo entre cefotaxima y cefotaxima/ácido clavulánico

GRACIAS POR SU ATENCION!!!!!!!