metodos de analisis microbiologicos de alimentos - corrie allaert vandevenne

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS

DE ALIMENTOS

© Corric AUaert Vandevenne y Marta Escolá Ribes, 2002

Ediciones Díaz de Santos, S. A. Juan Bravo, 3-A. 28006 MADRID España

E-mail: [email protected] Intemet://http:www .diazdesantos.es

ISBN: 84-7978-524-1 Depósito legal: M. 23.431-2002

Fotocomposición: Fernández Ciudad, S. L. Impresión: Fernández Ciudad, S. L. Encuademación: Rústica-Hilo, S. L. Impreso en España

mailto:[email protected]

Autores

• C orrie A l la e r t V andevenne, Técnico en Microbiología (Instituto Pasteur de Lille), responsable del Laboratorio de Microbiología de Alimentos y Aguas del Departamento de Tecnología de Alimentos de la Universidad de Lleida, Coordinadora del Programa EQUASE (Ejercicios de Verificación Externa de Calidad) en España en colaboración con el PHLS (Public Health La- boratory Services) del UK, Representante de la Universidad de Lleida en los ejercicios interlaboratorios de validación de métodos ISO para el CEN (Comité Europeo de Normalización).e-mail: [email protected]

• M a rta E s c o lá Ribes, Ingeniero Agrónomo. Este libro es una versión modificada y adaptada de su Proyecto de Fin de Carrera.

mailto:[email protected]

Agradecimientos

A Vicente Sanchis Almenar, catedrático de Microbiología de Alimentos, por su confianza y por damos ánimos para publicar este proyecto en forma de libro.

A Robert Garrofé Forca, por su fiel y eficaz colaboración técnica para la puesta a punto de los métodos y la integración de los mismos en los sistemas de calidad del laboratorio.

A Nuria Sala Martí, profesora de Microbiología de Alimentos y Agraria, miembro de la comisión ISO/CEN en España, así como a Mercé Torres Grifo, profesora de Microbiología General e Higiene, por su colaboración en los ensayos interlaboratorios de validación y sus criticas constructivas.

Reflexiones

«Quedé muerto así como mineral y me convertí en planta.Quedé muerto luego como planta y tomé una forma sensible.Quedé muerto luego como animal, me puse atuendo humano.¿Cuándo me hice menos por la muerte?»

RUMI

«La vida... una profundidad viva de equilibrios, siempre en movimiento y fusión, de tensiones y desahogos, en la constante transformación de creación y destrucción.»

Edward C. Whitmont

«As microbiologists, dealing with living organisms, we should probably have leamed by now to always expect the unexpected.»

Sheila Eaton, Responsable de la Organización de EQUAL del PHLS.

Es la conclusión de más de 10 años de ejercicios interlaboratorios para Verificación Extema de Calidad.

«De luz y de sombra soy, quiero darme a las dos.»

Gabriel y Galán

Voor Boy en Sor

ÍNDICE

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... XIX

CAPÍTULO PRIMERO

PROCEDIMIENTO GENERAL DE REDACCIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS (PNT - A L -001) ............................................................................. 1

CAPÍTULO SEGUNDO

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002) ......... 9

Tablas de resultados................................................................ 16Anexo 1: Tablas de límites de confianza ............................................................................... 42Anexo 2: Ejem plos ............................................................................................................. 46Recuento en medio sólido sin identificación: Ejemplos 1 al 12 ......................................... 47Recuento en medio sólido después de identificación: Ejemplos 13 al 26 .............. 51Recuento en medio líquido: Ejemplos 27 al 31 ........................... 58

CAPÍTULO TERCERO

PROCEDIMIENTOS DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ALIM EN TO S.................... 61

PNT - AL - 003: Método horizontal para el recuento de microorganismos a 30 °C (método de referencia) .................................................................................... 62

PNT - AL - 004: Método horizontal para el recuento de microorganismos a 30 °C (método de rutina)........................................................................................................................... 64

PNT - AL - 005: Método horizontal para el recuento de levaduras y mohos (método de referencia) ......................................................................... 66

PNT - AL - 006: Método horizontal para el recuento de levaduras y mohos (método de rutina) ............................................................................. 68

PNT - AL - 007.1: Método horizontal para el recuento sin revivificación de Enterobacte-riaceae. Técnica del NMP (método de referencia) ............................................................ 70

PNT - AL - 007.2: Método horizontal para el recuento sin revivificación de Enterobacte-riaceae. Técnica por recuento de colonias (método de referencia)................................... 72

PNT - AL - 008: Método horizontal para la investigación de Enterobacteriaceae con pre-enriquecimiento (método de referencia)............................................................................. 75

Xltl

XIV Indice

PNT - AL - 009: Método horizontal para el recuento sin revivificación de Enterobacte-riaceae. Técnica por recuento de colonias (método de rutina) ...................... 77

PNT - AL - 010: Método horizontal para el recuento de cóliformes totales. Técnica delNMP (método de referencia) ................................................................................................ 80

PNT - AL - 011: Método horizontal para el recuento de coliformes totales. Técnica por re-cuento de colonias (método de referencia) .......................................... 82

PNT - AL - 012: Método horizontal para el recuento de coliformes totales (método de rutina) ....................................................... 84

PNT - AL - 013: Método horizontal para el recuento de Escherichia coli presuntivos. Técnica del NMP (método de referencia).................................................................................. 86

PNT - AL - 014: Método horizontal para el recuento de Escherichia coli /Lgl ucuronidasapositivos (método de rutina) .................................................. 88

PNT - AL - 015.1: Método horizontal para el recuento de estafilococos coagulasa positivos (CPS) con confirmación. Técnica por recuento de colonias (método de referencia) ........................................................................................... 90

PNT - AL - 015.2: Método horizontal para el recuento de estafilococos coagulasa positivos (CPS) sin confirmación. Técnica por recuento de colonias (método de referencia) ..................................... 93

PNT - AL - 016.1: Método horizontal para el recuento de estafilococos coagulasa positivos (CPS). Técnica con confirmación de colonias (método de rutina) ......................... 95

PNT - AL - 016.2: Método horizontal para el recuento de estafilococos coagulasa positivos (CPS). Técnica sin confirmación de colonias (método de ru tina)........................... 98

PNT - AL - 017: Método.horizontal para el recuento de Bacillus cereus (método de referencia) ............................................................................................. 100

PNT - AL - 018: Método horizontal para el recuento de Bacillus cereus (método de rutina). 103 PNT - AL - 019: Método horizontal para el recuento de Clostridium perfringens (método

de referencia) ........................................................................................................................... 106PNT - AL - 020: Método horizontal para el recuento de Clostridium perfringens (método

de ru tin a ) ............................................................................................... 109PNT - AL - 021: Método horizontal para la investigación de Salmonella (método de re

ferencia) .......... 112PNT - AL - 022: Método horizontal para la investigación de Salmonella (método de ru

tina) ........................................................... 118PNT - AL - 023.1: Método horizontal para la investigación de histeria monocytogenes

(método de referencia) ..................... 123PNT - AL - 023.2: Método horizontal para el recuento de Listeria monocytogenes (mé

todo de referencia) .................................................................................................................. 127PNT - AL - 024: Método horizontal para la investigación de Listeria'monocytogenes (mé

todo de ru tin a )......................................................................................................................... 131PNT - AL - 025: Método horizontal para la investigación de Campylóbacter termotole-

rantes (método de rutina) ...................................................................................................... 135

CAPÍTULO CUARTO

PRO CEDIM IENTO GENERAL DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO(PNT - M E - 0 0 1 ) ................................................................................................................... 141

CAPÍTULO QUINTO

PRO CED IM IEN TO GENERAL DE CONTROL DE CALIDAD DE M EDIOS DECULTIVO (PNT - M E - 002) ............................................................................................ 147

INQief XV

CAPÍTULO SEXTO

PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ............... 15 1

Relación de medios de cultivo y PNT - AL en el que aparecen ......................................... 153PNT - ME - 003: Procedimiento para la preparación de la peptona salina (PS) ....... 155PNT - ME - 004: Procedimiento para la preparación del agar para recuento (PCA) 156PNT - ME - 005: Procedimiento para la preparación del agar blanco (A B )...................... 157PNT - ME - 006: Procedimiento para la preparación del agar glucosa y cloranfenicol

(CGA) ................................................................................................................................. 158PNT - ME - 007: Procedimiento para la preparación del caldo tamponado con bilis, verde

brillante y glucosa (caldo E E )........................................................................................... 159PNT - ME - 008: Procedimiento para la preparación del agar bilis cristal violeta y gluco

sa (VRBG) ..................................................................................................... 160PNT - ME - 009: Procedimiento para la preparación del agar glucosado (A G )................ 161PNT - ME - 010: Procedimiento para la preparación del agar nutritivo (AN) .................. 162PNT - ME -011: Procedimiento para la preparación del caldo nutritivo (CN )................. 163PNT - ME - 012: Procedimiento para la preparación del agua de peptona tamponada

(APT) ............................................................................................................... 164PNT - ME - 013: Procedimiento para la preparación del caldo de triptona lauril sulfato

(TSL) - ................................................................................................................. 165PNT - ME - 014: Procedimiento para la preparación del caldo lactosado biliado verde bri

llante (BGBL) ..................................................................................................................... 166PNT - ME - 015: Procedimiento para la preparación del agar lactosado con bilis al cristal

violeta y rojo neutro (VRBL)......................................................................................... 167PNT - ME - 016: Procedimiento para la preparación del caldo Escherichia coli (caldo EC).. 168PNT - ME - 017: Procedimiento para la preparación del agua de triptona (A T)............... 169PNT - ME - 018: Procedimiento para la preparación del agar con tergitol-BCIG (PTX) 170PNT - ME - 019: Procedimiento para la preparación del medio de Baird-Parker (BP) 171PNT - ME - 020: Procedimiento para la preparación del caldo de cerebro-corazón (BHI).... 172PNT - ME - 021: Procedimiento para la preparación del agar con plasma de conejo y fi-

brinógeno (RPF) ................................................ :............ 173PNT - ME - 022: Procedimiento para la preparación del agar manitol yema de huevo con

polimixina (M YPA)........................................ 174PNT - ME - 023: Procedimiento para la preparación del medio Voges-Proskauer (MR-

V P )......................................................................................................................... 175PNT - ME - 024: Procedimiento para la preparación del medio nitrato (M N ).................. 176PNT - ME - 025: Procedimiento para la preparación del agar sangre (AS) ...................... 177PNT - ME - 026: Procedimiento para la preparación del agar movilidad (AM) ............... 178PNT - ME - 027: Procedimiento para la preparación del agar triptona-sulfito con ciclose-

rina (TSC) ........................................................................................................................ 179PNT - ME - 028: Procedimiento para la preparación del tioglicolato (TIO) ..................... 180PNT - ME - 029: Procedimiento para la preparación del medio lactosa sulfito (L S ) 181PNT - ME - 030: Procedimiento para la preparación del caldo con verde de malaquita y

cloruro de magnesio (Rappaport-Vasiliadis modificado) (RV )................................... 182PNT - ME - 031: Procedimiento para la preparación del caldo selenito-cistina (SC) ...... 183PNT - ME - 032: Procedimiento para la preparación del agar rojo fenol y verde brillante

(BGA) .............................................................................................................................. 184PNT - ME - 033: Procedimiento para la preparación del medio Hektoen (HK)................ 185PNT - ME - 034: Procedimiento para la preparación del agar Kligler .............................. 187PNT - ME - 035: Procedimiento para la preparación del agar nutritivo semisólido (ANS)... 188PNT - ME - 036: Procedimiento para la preparación del caldo Fraser semi (FS) ............. 189PNT - ME - 037: Procedimiento para la preparación del caldo Fraser completo (FC) .... 190

X VI ÍN D ICE

PNT - ME - 038: Procedimiento para la preparación del agar Oxford.............................. 191PNT - ME - 039: Procedimiento para la preparación del agar Palcam.............................. 192PNT - ME - 040: Procedimiento para la preparación del agar triptona de soja-extracto de

levadura (TSYEA) ......................................................................................................... 194PNT - ME - 041: Procedimiento para la preparación del caldo para la utilización de los

glúcidos (ramnosa y xilosa)................. 195PNT - ME - 042: Procedimiento para la preparación del caldo de Parfc y Sanders ........... 196PNT - ME - 043: Procedimiento para la preparación del agar de Karmali (AK) .............. 197PNT - ME - 044: Procedimiento para la preparación del agar Butzler modificado 199PNT - ME - 045: Procedimiento para la preparación del caldo de Brucella (CB)............... 200PNT - ME - 046: Procedimiento para la preparación del agar de sangre Columbia 201PNT - ME - 047: Procedimiento para la preparación del agar de sangre Mueller-Hinton 202PNT - ME - 048: Procedimiento para la preparación del agar citrato de hierro tres azúca

res (TSI) ............................................................................................................................ 203PNT - ME - 049: Procedimiento para la preparación del caldo triptona de soja (TSB) .... 205

CAPÍTULO SÉPTIMO

PROCEDIMIENTO GENERAL DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS (PNT - RE - 001) ........................................................................................................................ 207

CAPÍTULO OCTAVO

PROCEDIMIENTO GENERAL DE CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS(PNT - RE - 002) ............... 213

CAPÍTULO NOVENO

PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS.................................. 217

Relación de reactivos y medio al que se añaden................................................................. 219PNT - RE - 003: Procedimiento para la preparación del suplemento antimicrobiano de

gentamicina ........................................................................................................... 220PNT - RE - 004: Procedimiento para la preparación de la solución estéril de yema de hue

vo .................................................................................................................................... 221PNT - RE - 005: Procedimiento para la preparación del telurito potásico al 1% .............. 222PNT - RE - 006: Procedimiento para la preparación de la sulfametacina al 0,2% ........... 223PNT - RE - 007: Procedimiento para la preparación del sulfato de polimixina B al 4% ... 224PNT - RE - 008: Procedimiento para la preparación del rojo de m etilo............................ 225PNT - RE - 009: Procedimiento para la preparación de la solución de cc-nafto!............... 226PNT - RE - 010: Procedimiento para la preparación de la solución de KOH al 40% ...... 227PNT - RE -011: Procedimiento para la preparación del reactivo de nitratos.................... 228PNT - RE - 012: Procedimiento para la preparación del metabisulfito sódico al 1,2%.... 229PNT - RE - 013: Procedimiento para la preparación del citrato férrico amoniacal al 1%.... 230PNT - RE - 014: Procedimiento para la preparación del suplemento selectivo para el cal

do Frasersemi ....................... 231PNT - RE - 015: Procedimiento para la preparación del suplemento selectivo para el cal

do Fraser completo ........................................................................................................ 232PNT - RE - 016: Procedimiento para la preparación del suplemento selectivo para el agar

Oxford.......................................................................... 233

ÍNDICE XVII

PNT - RE - 017: Procedimiento para la preparación del suplemento selectivo para el agarPalcam ............................................ 234

PNT - RE -018: Procedimiento para la preparación de la solución de antibióticos «A»para el caldo de Park y Sanders ................. 235

PNT - RE - 019: Procedimiento para la preparación de la solución de antibióticos «B»para el caldo de Park y Sanders ........................................................................................ 236

PNT - RE - 020: Procedimiento para la preparación del suplemento selectivo para el agarde Karmali ................. *........ 237

PNT - RE - 021: Procedimiento para la preparación del suplemento selectivo para el agarButzler................................................................................................................................. 238

PNT - RE - 022: Procedimiento para la preparación del reactivo de K ovacs ........ 239PNT - RE - 023: Procedimiento para la preparación de la solución salina (SS)................ 240PNT - RE - 024: Procedimiento para la preparación del reactivo para la investigación de la

/í-gaiactosidasa (ONPG ).................................................................................................... 241PNT - RE - 025: Procedimiento para la preparación de la solución de fenilalanina al

0,5% (FA) ........................................................................................................................... 242PNT - RE - 026: Procedimiento para la preparación de la solución de cloruro férrico al

10% ..................................................................................................................................... 243

BIBLIOGRAFÍA G EN ER A L.............................................................................................. 245

NORM ATIVA ......................................................................................................................... 247

INTRODUCCION

1*1 presente libro va dirigido a los profesionales y estudiantes de Microbiología del sector agro-alimentario en el control de las materias pom as y los productos terminados, a los laboratorios de análisis de alimentos, a los técnicos de laboratorio, a las Universidades que reali/an prácticas de microbiología de alimentos y de control de calidad.

Para aplicar los métodos aquí descritos se requiere que el laboratorio disponga del material y equipos corrientes en un laboratorio de microbiología de alimentos. Este material estará debidamente calibrado, verificado y mantenido en óptimas condiciones de funcionamiento según procedimientos propios del sistema de calidad de cada laboratorio y adaptado a la norma ISO 7 2 IX (Reglas Generales para los ensayos microbioMgícos). Además, cada método puede precisar algún material o equipo especifico.

La implantación de las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) y Aseguramiento de la Calidad obliga a normalizar toda* la* operaciones que se realizan en el laboratorio. Por ello se han redactado una serie de procedimientos e instrucciones de trabajo con el fin de dar uniformidad y consistencia a los análisis de alimentos que se reali/an en los laboratorios de microbiología y reducir los riesgos de error por parte de las personas que realizan el ensayo.

Dado que la finalidad de trabajar con BPL es la obtención de resultados analíticos de calidad y conseguir la aceptación mutua de estos resultados entre los diferentes países. tenemos que seguirlas escrupulosamente.

La elaboración de estos documentos viene dada por la necesidad de tener un sistema unificado de funcionamiento y gestión de los laboratorios, ya que hace falla asegurar la calidad e integridad de los resultados y datos obtenidos en los análisis, y establecer esquemas de funcionamiento equivalentes entre laboratorios.

Así. se ha realizado una homogenei/ación de los métodos de análisis de alimentos, unificando sus características en base a las normas internacionales correspondientes (ISO: International Standard Organisation: EN: Eumpcan Norme; NF: Norme Fran^ai- se; AFNOR: Association Fran^aisc de Norma lisa tion). Junto con ellos se han redactado los procedimientos de preparación de los medios de cultivo y reactivos necesarios para realizar los ensayos, de manera que hay una explicación de cada uno de los aspectos de los procedimientos de análisis.

Los resultados de los análisis son el producto final del trabajo del laboratorio, de manera que se ha de obtener un resultado fiable, lo cual es el principal objetivo de todos los sistemas de calidad. A causa de la complejidad de la norma do expresión de re-

X IX

XX INTR O DU CCIO N

mlüdtKv. cii e l apartado currcNpixKlicnic d e k n P N T • A L (incfodos) úucai)Kantc \c ex* p o ix el c a so general y ve ha redactado un pfOced¡m»enM> (P N T - AL - 0(121 que explica detalladam ente la m anera d e ex p resa r los resultado* en cada p o sib le c aso . E n este PN T se expone e n unas tabla* la form a d e o b ten er y ex p resa r e l resultad»» d el análisis para c ad a P N T - A L. A dem ás, en este p roced im ien to hay e jem p lo s d e casos prácticos que ayudan a la ap licac ión d e las fórm ulas.

Lo* m étodo* IS O (2 placa* po r d ilu c ió n , co n tin u ac ió n d e 5 c o lu n ia s) suelen u tilizarse c o m o m étodc» d e referencia y lo s m étodos N F < I p laca p o r d ilu c ió n . co n firm ac ió n d e 3 co lon ias) s e suelen e m p lear co m o m cU xk» d e rutina, siendo lo* dos inetod»»s norm alizados.

C on el <»bjchvo d e un ifo rm izar todos lo s p roced im ien tos del laboratorio , se han re d ac tad o unos Pr»»cvdtin ionios N ttrm alizados d e T rabajo (P N T ) q u e d an la* in stru ccio nes para la redacc ión d e todos e s to s docum entos, tan to d e m étodos d e análisis d e a lim entos (P N T - A L - 0 0 1 ) c o m o l»»s d e p reparación y con tro l d e calidad d e lo* m edios de cu ltiv o (PNT - M E - 001 y P N T - M E - 0 0 2 ) y reactivos ( P N T - R E - 001 y P N T - R E - 0 0 2 ) necesario* para ellos.

L os P roced im ien tos S o rm a !iza d o s d e T raba jo i P S T > son un con jun to d e instrucc iones e scritas d e o b lig ad o y rigu roso cum plim ien to q u e d escriben c ó m o deben rea lizarse determ inado* m étodos d e ensayo , có m o d eben m anejarse los equ ip o s d e análisis o c ó m o se debe p n x v d c r ante cu a lq u ier o tra ac tiv idad d e l laboratorio .

L a preparación de algunos medio* d e cu ltiv o ( PN T - M E) o reactive» (P N T • R E ) es e spec ifica de una m arca com ercia l. Ante* d e ap licarlos habrá q u e cxnnprobar la c o m posición d e l m ed io o reactivo tesad»» en e l laboratorio y adaptarlo a la* ia s tm o c k in » del p roveedor o d e la no rm a orig inal.

L a norm alización e s un p roceso con tinuo d e m ejo ría e n los análisis , y aunque los cam bio* sea n len tos, d eb id o al pnces»» d e e labo rac ión d e norm a* in ternacionales, p a sad»» algunos aikts e s aconsejab le comprobar que la norm a e n la que se ba*a e l PN T no haya su frido ni(»di fie aciones.

E n e l m o m en to d e la redacción d e l libro , a lgún met»»do ya había valido c o n pequeño* cam bio*, c o m o p o r e jem p lo el d e recuen to d e cn tcrohactcrias. m étodo en e l cual se suprim e la confirm ación tic colonia*. Per»» la experiencia dem u estra que esta c o n firm ación es m uy útil a la hora d e ev itar falsos p ositivos en según q u é productos. A sí que hem os dejad»» la confirm ación . va q u e siem pre e s m ás fácil qu itar pasos q u e no añadir.

I i \ ikw niii l*U l EN. \ P AFX’O R (A w ia c v ^ n F\pi»W«l.i «l* \ n m n l i / j r i r í o ) m- van clab»»rand(» y rev isando d e m anera con tinua C o m o este pro c e so suele se r bastan te largo , c* aconsejab le consu ltar las siguiente* pág inas w eb:

• ISO: http:Uwww.iso.ch• EN : h ttp . wh w .een o tm be• AFN< )R : h ttp .7;»»w w afnor.fr• A E X O R : hrtp: w w w .a en o r .e s

l l t im a i nen ie se e s tá rea lizando la validación d e le» metode»* IS O para e l C EN (C o m ité Europe»» d e N orm alización), y c o m o consecuencia se inclu irán e n las norm as los datos de precisión (expresados en repetí bilidad y Yvproductbilidad) definidos durante U>5 c iim ) iw ¡nkiiotK)catorio5. P or cM» m u liv o . h » nonn«w de recien te pub licación in c luyen en la expresión d e resu ltados el apartad»* «P recisión» . Las dem ás norm a* se re m iten a una norm a general, la IS O 7 2 1K.

http://www.iso.ch

http://www.aenor.es

IN T R O D U C C IO N XXI

El año 20()0 vio la aparición de la norma ISO 17025 Prescripciones generales para la competencia de los laboratorios de calibración v ensayos. Esta norma es el resulta- di» de un intento de armonización entre los diferentes documentos existentes, com o la Guía ISO 25. la norma EN 45001 y las ISO 9000.

Los cambios a destacar son los que hacen hincapié en la relación laboratorio/cliente. teniendo en cuenta la información que busca el cliente y para qué quiere esta información. En el caso de los ensayos, el método em pleado para dar esta información es fundamental, así como características com o la precisión en términos de repetihilidad y reproducibilidad. incertidumbres y validación.

En una nota se explica que para validar métodos conviene em plear una com binación de las siguientes técnicas:

• Utilización de material de referencia.• Comparación de los resultados con los obtenidos con otros métodos.• Comparaciones interlaboratorios (ejercicios de verificación extem a de calidad).• Evaluación sistemática de los factores que puedan afectar a los resultados.• Evaluación de las incertidumbres en base a principios teóricos y conocimiento

práctico del método.

Mediante las incertidumbres (material de referencia empleado, métodos y equipos, condiciones ambientales, propiedades y condiciones del objeto sometido a análisis, el técnico, etc.) y los límites de confianza del método, se presenta ahora un resultado, no como un valor único, pero com o un conjunto de valores numéricos, todos ellos probables. I lav que destacar que la palabra ¡nccrtidwnbrc sale 34 veces en esta nueva norma.

Con los métodos que presentamos en este libro se persigue obtener un sistema de trabajo cuyo objetivo es agilizar y facilitar las operaciones del laboratorio, al tener a mano y desglosadas por pxsos todas las operaciones a seguir para realizar el análisis, asegurando al mismo tiempo que éstas se realizan correctamente.

Los esquemas: en color, son un fiel reflejo de los medios de cultivo y de todas las reacciones bioquímicas que en ellos se producen; de esta manera: ayudarán a las personas que se inician en estos métodos; al reflejar las características del medio y de las colonias que crecen en él. Así: se puede saber rápidamente si el medio que se ha de utilizar se necesita en fraseos, en luln»s (cu ii o sin campana) o en placas, conocer su color original y observar los cambios que sufre en el proceso. Respecto a las colonias, al estar dibujadas con su color, textura y halo, se puede comprobar si su crecimiento es el correcto.

Así. estos PN'T son unas guías de trabajo muy útiles a la hora de iniciar y seguir los análisis.

CAPÍTULO PRIMERO

Procedimiento general de redacción de métodos de análisis de alimentos (PNT - AL - 001)

PNT - AL 001 PROCEDIMIENTO GENERAL DE REDACCION-DE MÉTODOS DE ANALISIS DE ALIMENTOS

I. OBJETO

FJ presente documento tiene como finalidad normalizar y homogcncizar la redacción de los pro cedí míenlos de análisis de alimento*.

2. AMBITO DE APLICACION

Se aplica a todos los análisis realizados según loes PNT • AL.

y REFERENCIAS

• ISO 72IS < 1W6): Microbiología de Alimentos. Realas generales para los exámenes mi- crobiológkos.

• Normas ISO. EN y AFNOR en las que se basan los PNT - AL• Manual de Calidad del Laboratorio de Microbiología.• Procedimiento General de Redacción de Documentos.• Guías ENAC y ISO 17025.

4. METODOLOGÍA

1. Recopilar la documentación existente (normas internacionales ISO. EN. AFNOR. CNAN. de.. PNT del propio laboratorio, artículos en res islas especializadas...) y la documentación en proyecto sobre el procedimiento que queremos redactar.

2. Estudiar el modo operativo del laboratorio pura el cual se realiza el documento.3. Adaptar el Procedimiento General de Redacción de Documentad a este documento.

5. PROCEDIMIENTO

Los PNT realizados según el presente documento son instrucciones de trabajo para facilitar y agilizar el análisis en el laboratorio, de manera que presentan una fomvi esquematizada de realizar los ensayos. Por consiguiente, en caso de necesitar m is detalles, se deberá acudir a la documentación original (norma en la que se basan).

E s to s procedimientos de métodos de análisis de alimentos están formados por dos parles bien diferenciadas:

• Instrucciones de trabajo• Esquema del proceso.

Estos procedimientos constan de los siguientes aportados:

0. Carátula.1. Definición.2. Medios de cultivo.

4 MÉTOOOS 0€ ANALISIS MKTKOBlOLÓGlCOS 0€ ALIMENTOS

y. Reactivos.4. Siembra.5- Recuento (en caso que ve realice).6. Confirmación ten caso que ve realice).7. Expresión tic resultado*.X. Esquema.

5.1. Carátula

U carátula debe encabezar cada uiu de las p ilm as del PNT y ha de incluir los siguientes apartados:

• Título del PNT.• Tipo y número del PNT.• Norma en la que ve bcusa.• Número de pagina.

5.1.1. Título Jet PNT

En este apartado deberá constar:

• Tipo de análisis que se realiza: recuento o investigación, especificando si se utiliza alguna técnica en particular ( sin/con rcvivificación/pcc--enriquecimiento, por recuento de colonias, por número m is probable...).

• El microorganismo o grupo de microorganismos que se estudia.

NOTA I: l.n* nombre* científico* de microorganismos, en latín, deben esc ribirse en cursiv a con letras minúsculas y la inicial en mayúscula (por ejemplo Siilmonetfo), mientras que los nombre* de U* familias, también en latín, se escribirán del mismo modo pero sin cursiva (por ejemplo Enterobactcriaccac).

Para homogcncizar los distintos títulos que aparecen en la documentación (método de referencia. método de rutina, directiva general...) se ha optado por nombrar como MÉTODO HORIZONTAL. que es la denominación que se aplica como titulo en las nuevas normas internacionales. Con esta denominación indicamos que los método* se aplican a todo tipo de producto*, salvo raras excepciones; estos caso* particulares estarán indicados en los PNT sobre preparación de la porción analítica y diluciones decimales y son específico* de cada laboratorio.

De esta manera lo* métodos de referencia y de rutina se distinguen según la norma en la cual están basados (los métodos de referencia v: basan en normas ISO/EN y los de rutina en normas Al-NOR)

Asimismo, también se Ka unificado el nombre del tipo de análisis, sustituyendo ENUME- RACIÓN por RECUENTO.

5.1.2. Tipo y número Jet PNT

En el caso que nos ocupa, el número del documento vendrá precedido por las siglas PNT * AL, en referencia a *u condición de procedimiento normalizado de análisis de alimento*, seguida* de un número de tres cifras (por ejemplo, PNT * AL -011).

En determinados análisis» por ejemplo, cuando *c realiza un recuento del mismo microorganismo por dos técnicas distinta*, el PNT se divide en do* parte*. Este hecho se indicará en la

f*O C € O iU l€N TO C E N £ * A l OE *COACC»ON 0€ METODOS D€ ANÁLISIS DE ALIMENTOS S

numeración. de manera que junto al número de irc* cifran seguirá un punió «.* y el número « I * o «2». según corresponda (por ejemplo. PNT * AL * 017.1).

NOTA 2: liste desdoblamiento se suele manifestar también en la norma original.

5.1.3. Norma en la <¿tre re hasa

Dado que estos PNT $on una adaptación de las normo* correspondiente*, según el método de trabajo del laboratorio y. por tanto, se Kan hecho ciertos cambios en ellas, no se puede decir que se han resumido sino que. basándose en ellas. pura asegurar que los ensayos se realizan correctamente. se ha esquematizado el proceso en función de su uso en el lugar de trabajo, listos cambios. en ningún caso son sustanciales.

Así pues, en la carátula debe figurar BASADO EN» la norma ISO/EN (pura métodos de referencia) o AFNOR (para métodos de rutina) correspondiente al ensayo, indicando su número y la fecha de edición (mes y año).

5.2. Definición

Fn este apartado incluiremos todas aquellas definiciones de términos, acciones, etc . que aparecen en el procedimiento cuya descripción puede ser importante a la hora de realizar el análisis y adaptarlo a la petición del cliente. Asi. encontraremos en todos los casos la definición del microorganismo ensayado y. opcionalmcntc. otras explicaciones de aspectos del análisis que puedan ser de utilidad.

El término o términos definidos se subrayarán, empezando la definición con letra mayúscula. En la definición se ha hecho una unificación de las definiciones, de manera que. en todos los

casos, se termina con la frase -cuando el ensayo se realiza según el siguiente método», independientemente de que el documento esté basado en una norma ISO/EN o en una AFNOR.

A continuación se exponen dos definiciones cuya explicación, para simplificar, se ha excluido de los PNT (puc* se repiten de manera idéntica en todas la* normas), pero que son de gran importancia a la hora de realizar los ensayos.

• Recuento Je mtcroor^anhmo% •: Número de microorganismos 1 encontrado por gramo o mililitro de muestra cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

• Investigación de mknfor$am.\m*M *: Determinación de la presencia o ausencia de estos microorganismos * en una cantidad determinada de muestra cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

5JI. Medios de cultivo

En esta sección se da la relación de lodos tos medios de cultivo que se utilizan en el ensayo, dispuestos según su orden de utilización, y acompasados, si se da el coso, de las siglas o abreviaturas con las que se los conoce habitualmcntc. entre paréntesis.

Dado que muchos de estos medios se denominan de distinta manera, según la caví comercial que los suministra, los nombres que se les ha dado son aquéllos con los que se les conoce en el laboratorio en el cual se han redactado estos PNT.

Par.» cada uno de estos medios de cultivo se ha realizado un PNT. en el cual se indica, entre otras cocas, su composición, preparación, conservación y controles (ver PNT - ME correspondiente).

1 Remplazar por el nombre del ittocroorgintsmo emayado.

MÉTODOS 0£ ANALISIS M»C*O8K>t0G>CO$ 0€ AUM ENTOS

5.4. Kcuclitot

Este apartado estará formulo por una lista tic lo* reactivo* necesario* parj realizar el análisis. Como en alguno* métodos no son necesario*. esta sección puede no aparecer en el PNT.

Entendemos por reactivos:

• Suplemento* de medio* de cultivo.• Sustrato* bioquímico* pora investigación de reaccione* en/imáitca*.• Sustancia* pura poner en evidencia reaccione* bioquímica*.• Etcétera.

La denominación de esta* sustancias c* la que se le* da en el laboratorio, aunque en alguno* caso* se acompaña del nombre químico del componente principal.

NOTA 3: Los suplementos que se añaden a los medio* de cultivo sólo se incluyen a la listade reactivo* cuando se incorporan al medio Klsc en el momento de realizar el análisis.

Para cada uno de esto* reactivo* *c ha realizado un PNT. en el cual *e indica, entre otra* cosa*. *u composición, preparación, conservación y controles (ver PNT * RE correspondiente).

La* cantidades a añadir. a*í como su presentación, corresponden a la marca utilizada en el laboratorio en el cual se han realizado los PNT. de manera que pueden variar en función del proveedor; en este caso se deberá cumplir con sus instrucciones.

5.5. Siembra

En este apartado *c explican, paso por paso, cada una de la* accione* a realizar en el ensayo, desde la siembra hasta la incubación, indicando:

• M e d io s de cultivo ncccvirio*. señalando si se encuentran en tubos o en placas; en este caso se indicará si la siembra c* en superficie o por inclusión y si se realiza doble capa. Tamb*én constará en este aportado *i lo* medio* han de tener característica* particulares (temperatura. estar regenerado...>.

• Temperatura y tiempo de incubación. En general, la incubación se realizará en estufas reg u la d a s a la temperatura indicada; en caso contrario, por ejemplo, cuando se realiza en baño tcrmostático. deberá constar en el apunado.

En aquellos análisis en lo* que el periodo de incubación no tiene una duración definida. pues depende de la velocidad de crecimiento de las colonias, se ha indicado el tiempo mínimo de incubación y. en caso que no se observe crecimiento, se da. entre paréntesis, el periodo máximo durante el cual se examinará si hay o no desarrollo de colonia*, con la frase a h si es necesario».

En el caso de reaccione* bioquímicas, *c indica de c*u manera el tiempo máximo de tncuhoción para asegurar la ncgatividad.

Por ejemplo, si se indica que la incubación debe ser a 30 *C ± I ”C durante 24 h (♦ 4$ si es necesario), significa que si después de 24 h de incubación no se observa un crecimiento característico del microorganismo en vivado, se deberán mantener las placas en la estufa hasta el tiempo máximo indicado.

En lo* procedimiento*donde hay etapas muy diferenciadas, se ha dividido el *¡k\t\jaÍo en las distinta* fa*cs: Prc-cnriquccimicnto. Enriquecimiento. Aislamiento. Selección (puede que no se den toda*).

En lo* caso* en que se realice aislamiento y selección de colonia* para realizar la posterior confirmación. *e deberán describir las características (color, tamaño, si forman o no halo «le lis**

P A O C E D iM lE N T O G E N E R A l DE K C O A C C lO N 0 € M E T O D O S D€ A N Á U S IS DE A U M E N T O S 7

o de precipitado y. de ser asi. de qué color > de la* colonia* típicas del microorganismo ensayado en el medio correspondiente (denominadas en codo* lo* caso* como -COLONIAS CARAO- TURISTICAS»).

NOTA 4 En general, la dilucidn madre se prepara con 10 mililitros (si el producto es líquido) ó 10 gramos (para el resto de productos) de muestra en 90 mL de pcplona salina <PS) a T ambiente.

5.6. Recuento

En esta sección se darán la* característica* de los tubo* positivo* (ensayo en medio líquido) o de la* colonia* que se Kan de contar de cada placa (ensato en medio sólido) y. *i se da el caso, lo* requisito* de los tubos/placa* que se han de retener para realizar sobre *u* colonia* la* prueba* de confirmación bioquímica. En este caso, el aportado de RECUENTO puede aparecer después del de CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA incluido en el aportado ILXPRLSIÓN Dli RLSULTADOS.

5.7. Confirmación

En caso de que el método requiera la realización de pruebas bioquímicas y scrológica* para confirmar la* colonias, se espinará cada una de ella* en este apañado, indicando sobre qué colonia* o tubos se realiza, los medios y reactivos necesarios, la temperatura y el tiempo. sciVatando también el resultado que debe considerarse como positivo.

NOTA 5: En este aportado no se explica el modo operatorio de la* prueba* de la oxtdavi y la calalasa. ni la realización de la* tinciones Grain. ya que estas operaciones, al ser de uso habitual en el laboratorio, han de ser conocida* por todo el personal.

Debido a su extensión c importancia sobre el resultado del análisis, en algunos casos se ha añadido como apartados independiente* la LECTURA * INTERPRETACION de las pruebas bioquímicas y seto lógicas.

5.X. Expresión de resultado*

Este apartado c* un extracto del PNT - AL - (X>2 (Procedimiento de Expresión de Resillado*l para cada método de análisis, de manera que se indica únicamente la manera de calcular el resultado para el caso general y se remite al PNT - AL - 002 para el resto de caso*, así como para La consulta del significado de los símbolos que aparecen en las fórmulas, y siempre en caso de duda.

Así. en el t ato Je recuento en medio .fótrdo. se indicará qué placas se han de retener para calcular el resultado (en función del número de colonias, señalando si se trata de colonias en total, colonias características o colonia* identificada*) > mediante qué e x p re s ió n se obtendrá el número de colonia*.

En el cato Je inm utación , se indicarán la* característica* accesoria* pura considerar que en la muestra hay presencia o no del microorganismo estudiado.

Para el CúM> de ret uerto en medio flu id o , se indicará a purtir de qué tubos se ha de calcular el NMP.

5.9. Esquema

El esquema c* un resumen visual de todo el proceso, indicando con dibujo* el orden a seguir pora realizar cada uno de lo* pasos del ensayo; este apartado estará en la hoja final del documento.

* M E T O D O S 06 A N A L IS IS M £ ftO B K > L Ó G )C O S 0 € A L IM E N T O S

En una columna situada a la izquierda de la ho j» indicaremos el día de análisis en el que no* encontrando*, de manera que en el re*to de la hoja se muestren la* operaciones que *e deben realizar durante el mismo. Ia% accione* a realizar en día* distinto* están se p a ra d a s por una barra con una flecha.

Señalar que en lo* procedimiento* en lo* que en el texto se han diferenciado la* distinta* etapa* del análisis, también se ha indicado cada paso en el esquema.

El esquema empieza con la preparación de la dilución madre y el banco de diluciones {cuando c* necesario). Es importante destacar que c! número de diluciones que se ha dibujado c* oriental iva. de n*ancra que se prepararán tantas diluciones como sea necesario, independientemente de la cantidad de tubos que se hayan dibujado.

La muestra líquida, sí el ensayo se realiza con un producto líquido, o la dilución madre. si se realiza con otro* producto*, están representada* por una bolsa de ««Slomacbcr-, s d resto de d iluciones por un tubo con 9 raL de peptona salina (FS) (saho en casos particulares, en los cuales se indicará el medio utilizado para hacer la* diluciones). Debajo de cada elemento del banco de diluciones *c indicará el orden de dilución correspondiente, sin paréntesis para ensayos con producto* líquido* y entre paréntesis cuando realiza dilución madre. Este orden de dilución *c escribirá en todo* lo* paso* de la siembra.

A continuación, mediante una* flecha* que salen de cada dilución, se indica la cantidad de muestra que se ha de sembrar en la placa o tubo. Cuando se siembran placa*, cuando se realiza siembra superficial, el nombre del medio a sembrar estará encima de ella* mientras que *c colocará debajo *i la siembra es por inclusión, indicando en este caso la cantidad y temperatura del medio a añadir.

Cuando se siembra en placa*, en caso de que se deba extender el inoculo con asa de Dti- galski. en el esquema aparecerá dibujada el asa. mientras que si la siembra es por aislamiento, en la* placas se pintarán estría* (este aislamiento por estría* puede realizarse de distinta* maneras). Si Ka *icmbra es por picadura en un tubo con medio sólido, se dibu jirá una línea vertical que ocupe el medio, desde la parte superior.

Asimismo, cuando se siembra en medio líquido con un asa de Kollc. *c dibujará este utensilio junto a los tubo*.

Debajo de las placa* o tubo* *c indicará el tiempo y la temperatura de incubación, señalando también si hay caractcrístis'a* particulares que deban ser tcnidasen cuenta.

En los pasos de recuento y confirmación se seguirá el mi*n>o procedimiento, dibujando en las placa* el crecimiento de Us colonia*.

El esquema finaliza con la frase •»lectura > expresión de resultados», si no se ha realizado confirmación: o bien, si se han efectuado pruebas bioquímicas y/o scrolójjica*. se darán lo* rc- sultadosdcl caso favorable. En los recuento* en medio líquido *c remitirá al cálculo del NMI*

CAPÍTULO SEGUNDO

Procedimiento de expresión de resultados (PNT - AL - 002)

PNT - AL - 001 PROCEDIM IEN TO DE EXPRESION DE RESULTADOS

1. O B JETO

El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la expresión de resultados de los análisis de alimentos.

2. ÁM BITO DE A PLICACIÓ N

Se aplica a todos los análisis realizados según los PNT - AL.

3. REFERENCIAS

• ISO 7218 (1996): Microbiología de Alimentos. Reglas generales para los exámenes mi- crobiológicos.

• AFNOR XP V 08-102 (1997): Microbiología de Alimentos. Reglas generales para el recuento de colonias y expresión de resultados. Caso de recuento en medio sólido.

• Normas ISO, EN y AFNOR en las que se basan los PNT - AL.• Documentos del Laboratorio de Microbiología: Manual de Calidad y Procedimiento Ge

neral de Redacción de Documentos.

4. GENERALIDADES

El presente documento está formado por una serie de tablas que muestran la manera de realizar la expresión de resultados para cada método horizontal de recuento o investigación según la norma ISO, EN o AFNOR correspondiente. Estas tablas están ordenadas según su orden de PNT - AL, y están divididas según los tres casos posibles:

• Caso general.• Estimación de pequeños números.• Ninguna colonia.

Para completar este procedimiento, en el ANEJO 1 se adjuntan las tablas necesarias para el cálculo de los resultados y en el ANEJO 2 se incluyen ejemplos de cálculo para cada uno de los casos posibles, junto con un diagrama para facilitar su localización.

5. FORM ULAS

En general, para obtener el resultado de los recuentos de microorganismos en medio sólido, se utiliza la media ponderada. En los métodos de referencia, ésta se obtiene con la expresión:

N = £C(«! +0,1 -n2) • d

Para los métodos de rutina, la expresión utilizada es:

1,1 - d

11

12 M ÉTO D O S DE ANÁLISIS M ICROBIOLÓGICOS DE A U M E N TO S

L os resultados obtenidos m ediante las fórm ulas $e han de redondear a dos cifras significativas, utilizando las reglas habituales, tal com o se describe en el A partado 6 y retener com o resultado el número de m icroorganism os por m ililitro (en productos líquidos) o po r gram o (en el resto de productos), expresado com o un núm ero com prendido entre 1,0 y 9,9 m ultiplicado por la po tencia de 10 adecuada.

Dado que en algunos casos los mismos conceptos se expresaban con letras distintas según la norma de la que estaban extraídos, se ha hecho una recopilación y homogeneización de términos, para que cada símbolo tenga el mismo significado en todas las fórmulas.

5.1. C aso general

Para que un resultado se considere válido, se estima que en general es necesario contar las colonias de al menos una placa que contenga un mínimo de 15 colonias.

En las fórmulas que se utilizan en el caso general, aparecen unos símbolos cuyos significados se explican a continuación:

• N: núm ero de m icroorganism os por m ililitro o por gramo.• XC: suma de las colonias contadas en todas las placas retenidas de dos diluciones sucesivas

y con al menos una placa con un mínimo de 15 colonias.• ILa: suma de las colonias del microorganismo 1 calculadas después de la identificación, en

todas las placas retenidas de dos diluciones sucesivas y con al menos una placa con un mínimo de 15 colonias.

• V: volumen de inoculo aplicado a cada placa, en mililitros.• n¡: núm ero de placas retenidas en la prim era dilución.• n2\ número de placas retenidas en la segunda dilución.• d: nivel de dilución correspondiente a la primera dilución retenida (d = 1 cuando la mues

tra para análisis se ha sembrado directamente (productos líquidos)).

Para el caso de recuento después de identificación:

• b : núm ero de colonias que responden a los criterios de identificación.• C: número total de colonias por placa (antes de identificación).• A: número de colonias características que se resiembran (en general A = 5 en método de re

ferencia y A = 3 en método de rutina).

Para estafilococos coagulosa positivos (CPS):

• A c: número de colonias características resembradas.• A nc: número de colonias no características resembradas.• bc: número de colonias características que son coagulasa positivas.• bcn: número de colonias no características que son coagulasa positivas.• cf: número total de colonias características de estafilococos coagulasa positivos contados en

la placa.• cnc: núm ero total de colonias no características de estafilococos coagulasa positivos con

tados en la placa.

1 Rem plazar por el nom bre del m icroorganism o ensayado.

PRO CEDIM IENTO DE EXPRESIÓN DE R ESULTAD O S (P N T - AL - 002) 13

5.2. Estim ación de pequeños núm eros

En las fórm ulas que se u tilizan en el caso de estim ación de pequeños núm eros, aparecen unos sím bolos, cuyos significados se explican a continuación:

• Ne: núm ero estim ado de m icroorganism os por m ililitro o por gramo.• C: núm ero de colonias contadas.• sum a de las colonias contadas después de la identificación en las dos placas (método de

referencia).• a: núm ero de colonias contadas después de la identificación.• V: volum en de inoculo aplicado a cada placa, en m ililitros.• d : nivel de d ilución correspondiente a la dilución m adre o a la prim era dilución sem brada

o retenida (d = 1 cuando la m uestra para análisis se ha sem brado directam ente (productos líquidos)).

5.3. Casos p a rticu la re s

En las fórm ulas que se utilizan en el caso de estim ación de pequeños núm eros, aparecen un símbolo, cuyo significado se explica a continuación.

• d: nivel de d ilución correspondiente a la dilución retenida.

6. R ED O N D EO

• Si la últim a cifra es inferior a 5, la cifra precedente no se m odifica.• Si la ú ltim a cifra es superior o igual a 5, la cifra precedente será aum entada una unidad.

Proceder de esta form a secuencialm ente con todas las cifras del núm ero obtenido hasta que se obtengan dos cifras significativas.

7. PR E C ISIO N Y L ÍM IT E S DE CO NFIA NZA

La precisión de los m étodos de ensayo corresponde, según la ISO 17025, a la determ inación de la repetibilidad y de la reproducibilidad de un m étodo de ensayo norm alizado por ensayos in- lerlaboratorios.

En la expresión de resultados hay un apartado de PRECISIÓN, que sólo se refleja en aquellos procedim ientos basados en norm as que incluyen esta valoración; sin em bargo, se supone que en futuras m odificaciones de las normas internacionales este apartado aparecerá en todas ellas, ya que la fiabilidad del m étodo es m uy im portante a la hora de aceptar o rechazar el lote, producto, etc.

De la m ism a m anera, en futuras m odificaciones de estas norm as se cambiarán los lím ites superiores e inferiores para los recuentos de colonias, adaptándose a los lím ites de confianza; así, el lím ite superior pasará de 300 a 324, y el lím ite inferior de 15 a 10.

Para estim ar la validez del resultado obtenido y evitar interpretaciones dem asiado estrictas, es necesario determ inar el intervalo de confianza que caracterice el reparto estadístico de los m icroorganism os en la m uestra.

Así, el lím ite de confianza 5 que caracteriza la dispersión m icrobiana en la m uestra, con una probabilidad del 95% , se calcula m ediante la expresión siguiente;

S C 1,92 + 1,96VSC B B ~ B

_1_d

14 MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE AUM ENTOS

con:

£ = V-C/1, + 0,1 712)

siendo:

• YJC: suma de las colonias contadas en todas las placas retenidas.• 71 j: número de placas retenidas en la primera dilución.• n2: número de placas retenidas en la segunda dilución.• V: volumen de inoculo sembrado en cada placa, en mililitros.• d: nivel de dilución correspondiente a la primera dilución retenida.

N O TA : En el caso de recuento después de identificación, sustituir 2C por Ea.

CASO PR Á C TIC O : El resultado del análisis de un alimento es el siguiente:

Dilución

ío-1 io-2 io-3 10"4

Número de colonias

>300 2

>300 3

Placas retenidas

Con N = 1,9 • 104 por gramo, para 422 colonias contadas en las placas retenidas. El intervalo de confianza S es:

- _ [422 [ 1,92 + 1.96V4221 112,2 + 2,2 ~ 2,2 J lO-

8= (191,82 + 0,87 ± 18,30) • 102

Así, los límites de confianza son:

Ó, = 1,7 1o4 y 4 = 2,1-104

Para las técnicas de NMP y de estimación de pequeños números, estos límites de confianza, en la práctica, se suelen obtener mediante las tablas que se adjuntan en el ANEXO 1.

Señalar que las variaciones que se dan aún pueden ser más importantes en la práctica, en particular entre los resultados obtenidos por distintos microbiólogos.

8. CO M ENTARIO S

En este apartado queremos recalcar algunos aspectos de la norma AFNOR XP V 08-102 que son nuevos respecto a las normas publicadas anteriormente y que pueden ser útiles a la hora de resolver dudas.

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT - AL - 002) 15

8.1. Casos particulares

Los casos particulares, aunque son bastante improbables, se pueden presentar (por ejemplo, números muy diferentes de colonias entre las dos placas de una misma dilución, o bien una proporción muy alejada de la del factor de dilución entre las placas de dos diluciones sucesivas). En estos casos, un microbiólogo competente deberá examinar, interpretar y, si es necesario, rechazar los resultados obtenidos.

8.1.1. Recuento de colonias en total. Método de rutina

En el caso que únicamente la placa de la última dilución sembrada tenga menos de 300 colonias (o cualquier otro número indicado en la norma específica), calcular el número N' de microorganismos 2 presentes en la muestra de ensayo con ayuda de la ecuación:

N ' =V d

siendo:

• C: suma de las colonias contadas en la placa con un mínimo de 15 colonias.• V: volumen de inóculo sembrado en cada placa, en mililitros.• d: nivel de dilución correspondiente a la dilución retenida.

8.2. Aplicación de los límites de confianza

En el caso que el número total de colonias sea mayor que 300 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) en las dos placas de una primera dilución di9 con un número de colonias menos que 15 en las dos placas de la dilución d2 siguiente:

• si el número total de colonias en cada una de las placas de la dilución dl está comprendido entre 324 y 300 (parte superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 300), utilizar el modo de cálculo del caso general;

• si el número total de colonias en cada una de las placas de la dilución dx es superior a 324 (límite superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 300), retener sólo el resultado de los recuentos de la dilución <¿2 y realizar una estimación de pequeños números, excepto en el caso de recuento de colonias en total con un número máximo fijado en 300 colonias, si el último resultado es menos que 10 (límite inferior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 15).

2 Remplazar por el nombre del microorganismo ensayado.

TAB

LAS

DE

RE

SU

LTA

DO

S

16 MÉTODOS D€ ANÁLISIS MéCROBKDlOGICOS 0€ AUMENTOS

.2J8 s£c/.

u5 *3

221OxirO

«is

2f8t£c•ao

S•gB

8

E

1

.o1u

fefc.

I

§

¡= ¿ £ ¿ ¿ a ;- o .nB **= 5 c* r ^ O a i >

■6 * § 3 £I s aoJS a1 1 "

5 5 1 | * - 8 |

J f | £ ■ « * J |

^ i l i i f s l

S Í E « 1 S

¡ s i l .

o♦

n

•o2Jí S5d >a §I 5 8 |o O?S 3Z ^I I

ec3SJ|i lI -

E

3

í

$

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN OE RESULTADOS IPNT • AL - 002)

co

aje

-2 ** c g ®S S g l |

. 5 0 ^ . 3 P 3 V IflI e f - i 88 « “ e « 8 -S § 5 s

> ■* S

“ ° I5 8

| iu S 6 3

5 1

1 * . i § ?S E 2

UmSCts

í?sbe

i

É

.1

Jw

s«*I

es_v

O

1c«#2

S

-s = ¿ J í á -á

C/5 6 3 * 3 c

a|3■

« ‘I | 8 J -

" I5 E

I

í

!

&esZ

JOE

£

S

a

&

33

aae

s

32

i

>o

13OXOII

aT

ÉL

! i -l %i «§ ^

«13II

2•£ jg-S 5

8 S

s |

j«3E -8

1E

« I ^ 8 M -

■ aE

<sr»S

M ÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIM ENTOS

<3>

OC/D

CUIz"3•ob"ecu'O íHaJBcucu03

O03

OS-.a>-4-»e

WO)X3E‘o03o

* s’>Va>u.

Ecu'3

P¿5

-QBX>OVi'03

OJ -a»e

'3S■á3-OB'53O

ocu&<L)cá*C<L>O03X)O

W<u-o

J -

Sos•X3O

B'2"2*3a>

o3 .2 sfu CU

zCU

03U>CUBcu040O</303

O

• túenocuenOX> B ■*—•

B

'2CU*3

J3

2CJ *4—.

B*303Et-«HBO

CJ

U3 en os os

‘2 ’g o 2O o o .leoo O

8X3 en

,1§•O

BOO03

• o3 C/D O2 CU cc3 o3 CU O

© ©ccS 03 oo en 03 O "O O* 2

O O

cc$X3cu

1 *O o— > ti B03 <»CU •—<

<U___cc3 _ .ti

. 5 v í g ^ O •2 NC B es . 03 Jr?w 2 -8

o>

En

la té

cnic

a de

l NM

P se

pued

en

obse

rvar

va

riac

ione

s im

port

ante

s. L

os

resu

ltado

s ob

teni

dos

segú

n es

te m

étod

o de

berá

n ut

iliza

rse

con

prud

enci

a.

Los

límite

s de

conf

ianz

a se

dan

en las

T

AB

LAS

2 y

3.

M É TO D O S DE A N Á LISIS M ICROBIO LÓGICOS DE A LIM E N TO S

Tf«OoI00o;>faZ

¥co’oo4>-ooa4>3oouuOO.es

'£o'O»Ho>3S.2*E§CQfeOuo>

•4-»cfeO)■o>©• —*os€*>►g.e*Ko4-4ca>3oo>fe

OsOo(

fe<

a

fe£

2coCJ3C3CUD3

3 fe e•3

i3<L>

’OfH n

di)3‘£

• •—•OO3

<U-2 o >xfe> fe xQ 3 O• »HP ‘3 x: U-I3 i— O

X&J2 o (U4-4< 3 33 fe ^ w

3 enO «U fe P O

• 1-4

en 3 ‘ 3£ crfeO 3

3

<1>t-H

’o

2a>o

I en3 o -r* *—* 2O 3es* O

• § a«-*4> Oo § fe fe

~ 1 4) e■° s§ * © O feO 23 fe

1 eno

O

V3O•30 3 O*a> en 0. Oa> S= 6 i t1enfe

3fc*0>3a>oc©en3u

3

^3u

en3"2*£o»4-4o>uen3U3

« - i ^ na0 =3 • § s1

3cr

2 o04-0<u35

- Sá4) 2 ene 'C O4 oo

o ’o 2c 3 f e• fHO c5 <U X<Dou-

3o3

'E -2feOen

3O

<u4-4

3 •o3 3 fe .bfe 3 2 i3N 34 §

C\3f e

• i caJ&i“ I I

O

Í

•rt ’O fe 3- O < f e ca

2Cu

2 3 <u o .£ 3 o.3 3 3 '3 ü £ ^ 3 ca en

203o3 ^

13 3 c 54a * g

ii

3'©

Ocu-fe

« ’g 5 s

1 2 1 - a 3 83 3 o O

en O

en

-§<D

’O

3 ^B 'C b w§ 8 fe &3 °

«oen

- 3

8

1

PROCE O M IE N TO D€ EXPRESIÓN DE R E S U LTA D O S IP N T - A L - 002» 25

26 M ÉTODO S DE ANÁLISIS M ICROBIOLÓGICOS DE A LIM EN TO S

c*roocTtocn & CO C3*sOO©©13

C©o©b,t-o euCdO©HCO©3o-H-*coa»

O©

c©9o©ffüí

03coooede5CZ

Js 73?• S

^ 3

'Oco2

1X<L>

Cd©o

1 3

coCGO

©1 3

OsO

*4—*CO

1CO 4—•

CJ

a lo

oOcoO

«2 2 Ít3 S3

OOi ¡tao

coO ’S*3•c &© ©© bHcr© co

Oo J© b-13 ©

3 oco

' SH cd

’© M ©03 133 cd

toG©

w cd

s

OO h

&bOoco©

Ojo ©COO"3 O

V ) ¿T v> H—» ©■ ■ H T— <

©1 3

co O ■*—*

©13

132© co oco g

O

©*o2

OC©

CO

§a

CQ!—©c©OX)©COCOO

3'C dO

O

“aMc

o+

©

CO03-O*S©

COcd©03

2 §1 iO 13 co co ed O*3o ©S ?§ 1 s© "3 ‘5513 „ ©co «g © o ca 3 ^ O co g ‘O coS ' a S 03O

c©*55©©

PROCEDIM IENTO DE EXPRESIÓN DE R ESULTADO S (PNT - AL - 002) 27

CS*£Oooc§DG

(ü en-o o. O <D > ^

•s g? 6 ' IG £7» _ no ^£ P j- « £, =

13 ¥ ^

<Dc3

’OcdO

G -j-h2 v-gOh 3 _< ed Ge I<L> O — G00 c

GO’OenO’O

G 'S • «>—4» -4—»

S' 82 G o #O£

G ° o

I !oo

fe Ova ’o

’OG •*—*

a l

P O^ oO” oon

§ a

«+-h enG3 O O tiO 1—' ’O

^ Ohen v— ''O oG g

* 1

OO h<L>G m'o 2u-i o ^ O8 1

"Q O h

enOO ¿I

’O o

o 'og i s &

«Oo■00o>feg,en213o£uoooa>’O

Go>GoCUfe

fe■HZ

fe

vaO»Ga»GO’a> en fe Oa> a>= EJ'§es

vafe

cd OV3 03

l.-f*2h

JE3 ^

«8 >——< H—*<L> O > G•a -g ■a s.oí vrTü §S 1'*3 5 §

CO cd

I "Oh (D va ’O 2 en S c jg<L> £d

M S*S 0> 'g £ g 2G *¿3 ü O G g

| 8 S

J3 - § —• o .2<D G O ’O ’O O

O¿3

O vaOh Ova -t-hU o G .cr

G Oi aH—• /\

200ofe6/3G 2 £ oG

’Oo

O va^ o• r h—»

81 II P

OO“X3G

Ohva§O£

Gua>Ca>00oenGU

GO13U II

<D'4—*0

1enG’O‘cOi<uX-cnGC->G

«O

<L>S

. 2o

’OenO

’O<L)

’O<l>> enG G

>G • •—Hen

<uen Ocd Go en

*H—* enxcn <D'£ G

'C<u§ cd

% “ o) en ■G cd2 ’o’O o cd o -G o cd »/-na 2

c 2d a

enGO

3PQí£>>

G*35*3<u5-fe

<D

§

M ÉTO D O S DE AN ÁLISIS M ICROBIOLÓGICOS DE ALIM EN TO S

a>UmOu

§-2

5|haa>

o>3a>

coO■

*Icdü0

1 0 -4

§§cv,S ¡

•*—* o 3

cdcd bO •

T í cd « -o«•& 53 & 8

4>’a>co

'cd6co

I

'Oco

£JiSb O<ü>73

0 9O:üco

acoO3co

s8 f8 I§ §«1 13 ,3 ®í<33 13

' cd

-s s•8 d g .'S•o gS g§ c

. 1 s

§ §«> S

1 3 b O

1 S '1 I-?r, cy S J8 'O

J «*2 -tí* § &-g ~i ®

8.8 ed ^ 2 ^ O 8 ■«. ! ! CO >

coOá0<413

3S í

i£CÍ4S í

o3aSí3t?

04

e?<D§O0a*

Ico

1

*■8 £1

8OO§6§

,C J ,

<L>

•gcocd

*8co

■s><D<D43eCO

¡’oaco

s.¡ab O

<Do3O

1cdT3(L>Qh .s . 80 .tí,2 o^ Cl4

1 |o a'o c.§ sg i 5 s

1 3 cd

co

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (PNT • AL • 002)

§.2

|

a>**3 M , «t rs

o§

a>a .

8

a>

OHHaiHHo

a

' I

i

i

i

$<D

' I<DCfl«>

I

Ioo

■iIoo<L>

C4>aoa>P<

<d■

H

£

<pS d

« <N

c3

rs

GO

cdGC

g ó

tn

^ <d °o -8 — ° c¡ S •2 'o R2 -tH U

l i s

| g 2Jj ü 43 «8 § § «> o S>*0 Wh '2 |»>§ 0) ^ >HS 6 8'3 ü ¿3

R c•— á <1 <L>W O

2

w

M É TO D O S DE A N Á LISIS M ICRO BIO LÓ GICOS DE A LIM EN TO S

03*CjOO©03G=3OCc

co«oc

■ooo>feZ©> ■

OfeedCOed

g‘c©s->©©

a7»b

■co

©©

©*K©©co

t í©

-o© 4—>C©G©©t í

t í<

■

HZfe

co©»G©©c r©f e co©© s~G ©G s

'O '©'© G©B»nCZ)

t í

03t-©G©©D©coed

U

©©

73O

G©

scd

fe

ed ed O§

cd ✓— Vtí< COre t 1/5 *S03 4) J©

£ Vr~t £ ^ © s

G

'o ©S © ■*-* § ^ S© 5 U 1 3

-i > 2G vS1 So ^

.G ed cdO cd NG 2 73• h í2 c

CO fe ed

2 o fe ©o ° P o

^ 8 © -S

u ©Cd joB 2G "© •2 SgÜ *- iH ^1 3 03ed 2 ’—1 O © ©

1 3 1 3

o 9 ^9 © fe o„ « 13•2 p *©- s í . > g - .© .GC *CO '© o g -s; fe £ H ed a

t í cd 1 3 . 1 3 O

^ U o eo o -fcSO *3 • »—< C2 •““< •*—io> bo r3S Á 6

CCL O fe

.« .2; o-5 o.p o © r~“ o -x3© fe o| g s .

na -S §© '© G g g 3«3 J—lo © 2 G © G © © edS *&b &b

c3N

l ised

gC/3©©ecd

a>1 3

"©

cdfecd

1cd > o o

1 3tiG G

ed

3' O co 03©

OG ©l—i

© 

G s ©

©© bHr ¡ cdi ■« © G

© -j=¡G G 03O edO © ©

— N /— x03 03O OG -4—*

© ©© PO " G ©

C/3t if e

b -cdOo CO

4—* o 03©O G cd

GO

3 , GO

l~lf e 2 O

•2 -A -S 1=3-2 B

* > o -sí g O fer°d 03

Ofe

,'■'3t í O« .2 G .G • O g ^

^ S--Sg 03 ‘Gsd 03 ©03 © . - _2 ,“~H

CO

I s i'G 3 G C M i- <3 e¿,v&II KS 2

C3 GZ o ¡G

cu "tí 00% 9 t í .g.2 'So 1 3 o

o feG edCd 03 _-£ ^ 03.© G © 'g ©O 32 -5

G o P © 2 g G G fe ,§ M oí§ c ¿ . gÍS *S» P.<3 OII es

03©

■ -S í ©

OBedfeb

Ot í

13

II

« «» •©i s£ 5G ©3 2Jrí ©© o c© 03*-> cd© *g

oed " o

©

Gcd

-Gcd w-\O ’l* ed

"fe ü

C P 03í > S ©

G'O

©©s-fe

PQ<E- 1©

>

©G §

vccd

*©G

vn > COcdO-N O"© G

OGcd

g '©4—»G

cT 6 O© co

03o © co G- T <4—> co •2 034—»03 CO©

<U

cd’o©

O©03cd

© S3p < O G4—*

G©

cd

*§

U ~ iT—Kcd

OO©

©OO c3 «O

CLcr—H*G'©

<D'Td cd

c3G CO

(U co fe©G(-<O

4—* • fH

5

r-"

+© ’— 1 ,___ co

G 03 cd V©03©

O +G 03~ r~^ 7dO£1-4

Ococd© nr °o

tí. cof--V

,O © co

Oh w G 1

.52c

oCJae3

a

00ooo oVO

oCZ)

CZ>CUo

o>

Cnocuesen

- 2" 35 ocdooenOooo

sa■*->a>Oí

XO

cO)3O<x>

0 4

OI

- co

^ <D <D t í

I I

| ft í <L>t í .£ ¡ 

Or— tO

cd 531 X I cS<D

"O OVi X

O CU L ¿— N en CUenO O U

X3 Vio

X*»—it í

<Df_.encd

Og

<n2

Xcd

‘ t íJD

Ooo

• i£

£tí

'O

OO

oXcd4-*

r -H• »-4O

cdUP tíen

■úiS

I

£ 5

£

t-HO ^ c u ^

5 £ ’OCU - jh

U g .O tí5^ en£ B^ o en 53 Otí o

‘S í c u

•cdViooViOc u

0 0 encu OC J O

Xo otH Vi

CUD en

X Oen t íO Ot í s— '<L> O

2 e

"§s

2

. 1

£

oo x cu 3

Y—I ' 1en

<D O X ) +5

Oen a0 .g1 i .‘Sí .CU

oB2o oViocu

o o . CU /-ívu g

1—I X <L> O

X t—ien ^ O «5t í o <D t í

enO*co>escr<x> en

& £a> S

e EC x d: 2 § o cd

enw

cduo>ea>&IDOencd

O

8O

encd

X• p-tc<va>í~encdacd

i i r j

’ S § . - ' 2 - j c u O cd — 53

i » « J 5 2 cd NI ^3 3 3 2 S fe S «T ! ^^ cd o

OXcd

en cd cd ¿2. en O en O cd xCU p 53en « C To cd 1=1rr-i f— I

en ^ O

•H (U 3 00 > X

2 c*rs <utí Xo x ° 3 «

^ 3In tí *“• O O — .■*-* T * (L)O O P O u

gí

O ¡ 2 ~♦-HCU 0) en X )£ <*> t í O3 ■ «— <U5 S« g6 S

(üViCUX<L>

0 X cd

Ien<D

1

Ití

¿ i

<N

cdxcdO

«t í

en20 t í

X

1

J

iB

o

o o o

P l -<d .q " xj 12

 £en<L) cd

o . E“ o en O

T ) „

« B - C

2 2 i3 en en p<D Ui53 CUa xG <L>

(51

o(-4

o

tía>

X3

O. +

o oO cd

o 2 « o o) ^ o tí Gs *enen cd2 - -

' t í£ C o 2 ° 2

8 Í3m o cd en4-» COg ' t íffi ^

X3enO

03<ü

X3

13> 52 - 5j cd C303 '«o cd <d

^ O en 53 cd en

. 2 «5 - t í <L> en c v -« t? Vh Oa) *rí -*-» o

/-i -i—*vtí ,221 §t í O t í cd

fe ^tí °2 %£ ' t í X o

. »——< cd o

-tí oCd W-'s

8 -

cdtíP

O£

<K-)CQ

ía3

>

t í' O

ocuu

CU

ooT— (<N

Ooo»— i

a3>

M É TO D O S DE ANÁLISIS M ICR O BIO LÓGICOS DE A L IM E N TO S

CdcoooedBSexc

NIo©ooooN©o

enfeoco©►

coofeeded3oxAO©coO©O©

«GC3•*-»co©©13©

■4- *c©©©©

t í

Nvi

t í>

HZfe

co©«G©©cr© co fe O © 5= E s 'ied

COt í

© co G O

"© g> Ga 2

co c3ed N¡o 3 03 3

©o ^

G £

«g_55 (L>

— G OO G

<L) •- i |ed cE cC C2

G .2• fH i »2 e JE o3 ° G x „

G o

^ G o O

•8 §

‘ i - Sc r — -

'C©1

G ©

I I

1 !

8 £ coco ©

1— 4 fe © X

G ©55 co O cd G ©

©GO

Gcd

'©G

O

1

I

O | C4 X eo fe oC O Gfe 3 CJ O*

©S-©C©ox©w>es

U

©©3u

ot í

13

O+

II

esGG©4—»©*-co©©©

X P O G O Jg O P

E G 03o >p « T 'Eo M 05 ©© .2 2 * *"j é * 3G co co O ' C co3 2 g “ g o

S i a gco © 3 2 cd GS c g

f f i i 2 G

e 'S© o

2 I© o© co ■© cd3 '£

J2cd 3

G ©03 I/-No 7 ©fe -^esG Ot í £

G'O

©©ufe

<t í

©>

oor m4 CNjr -Ooot— 4

©>

«no■00o>feg ,

CQc"ocuc

3

essU5=COOcooCQOco

'<X>H

cofeCJC/3oSi

enOfeCQer,CG

1301)CQOoenOoOo

8CQ-4-»CO A- ~ * s

cu

_ 53 8 ^

7 0

€ £-rt O 'O \nO •~b yc u 3

53 -o .21 3 0

S -8cQ O ccj ✓— s ¿3 g co O <U 7 0

i &

§

l—<

a coO70

1

r 1

1 8 ° - §

c of e - Hu aO i 3

B

l-l

a Ico ^ feu .cr

735-q£

.cuCo

•g 2^ o w o O T 3

1 I2 3 I

1CO

012 G0

OfeY? •feu S^ O

70 cu o73 £enO £ C g

«S £ 2 3

enO«ccu3crcuS - S<U *-B g

' O 'S3O c CQ

enfe

CQJfe<UC<ubeoenCQ

U

3

'CQV

enCQ73 • —eCU-4-»

£enCQcuCQ

i i <u H5 3 C «C — cU 7 3C<* 7 0 \ 3

« i §S - “s •o

E ZcQ 55 ^

<3 7 3U rs 70

| « s^ 2 o. 7 3 y — '

- . 3 <ucQ 73 u.O O ’OU ÍT<

OOo•4—»oo

7 3

2o.enO

o h tu

■ l . l ' ECQ

•«—icoc'O• rHO

£3■iO1 S o

en CQ'S o •2O o o o»o o*-c O O

OfeCOfeUo■8CQ

en<U

§1E'3a"o2-o5<u

C o

1-4

&2

en O4—4o o

„ 2 20) en

§ p I

cu

6o

» 2¿*6

« 2s T e

a) en i

: ? § 8

che-O

-oh:

<uE

1 6 fe aen ' O

o r st í cyj f e O'3 *0 3 g

13 ScQ S3 - h C ü

¿ C O « C CQ f eu o

1 S- s «p CQ

Ec -2<U 7 0

3 'O • —••Í2*D<u

II

e3«-icua a<u-4-4 scu73 oocQ «oJ3CQ <uO 73CQ O

'f e £CQC 1

P E Por

razon

es de

orden

única

mente

esta

dístic

o, en

el 95%

de

los

Ver

TABL

A 1

caso

s, los

lím

ites

de co

nfian

za

de est

e mé

todo

varían

de

l +1

7,3%

al +1

4,7%

para

150

colon

ias c

ontad

as y

del +

63,4

%

al -37

,8%

para

15 co

lonias

con

tadas

.

M É TO D O S DE A N Á LIS IS M ICR O BIO LÓ G ICO S DE A LIM E N TO S

NiNV )

OOo>fegcn2‘eo0 cu<ü-oc'©‘2cd1 v. ití tíOcu

cd_cu’£cuvq>

fecofeOcnOcnOCUcdcnJ2"36DCdOcucnOCUocuC i503a>o>Xea»tícua>

fe

feI

fefe

.2*£’ocucdctíOX)tí

03 cdXcdtí

<13 cnX O4—»

CUO 03 tír\ > X

a> • •h cd X X2 53t í cn <utí P

- ó '2 <»o C ^ o H—i fe tí p§ ^ «3 ’t í

tí i *a -2 22 X tí cu tí

otí

í>> <3 cd. t í c/iOt í OO 03 fe g

oo u £

cdcdtíC/3

Cn22 o o 1

•° X o o x Vi o

'Tn SO g °

x P o•iH Tjtí o ° CT'S 'd

O£cdfeoVi O CU

OO fe . CJ 303

XcnOgs

cu3Xo

§o

cnO« t ía>tíc ra>cu ga> Vi•w o>« i'O 'tí*2 c cd£lofe

cdVicutíO)OEocncdu

tícuIdü

cncdX*£a>4-1a>Vicncdcucd

cdN

cdcdtícnauIcd03

X'áu>‘tíT3

cd£a'O"23

43 O X X en -2 O X tí g£

13X

•S-oo g tí o

rxi O Vi%

cncd ocd c_> p>, tí "X cd o ’ n t Q.

OO < 3

<13t í ^ £ cdId íd tí 0 fe cn cn cd2 3t í o3 o

X — <

ocu00feotí .

x— e73 O o

x T3cd -»-i £ Si.5 c r t í ^cn 1— 1 03 cn

O£OO

tí x 't í o tí tí

OII

ocu

oofeV03

Xo

Xcd£ /1n'

*tí Ocn 4 1 a> C3 _ tí O X vi o

£ fe't í cn

?. S5 3 L j o

^ feb

O

II

03X

cd tí tí .X cn X

.2 <n tí o£’o0

O *03 O >

« 2 X cd

1 .83 vg £ gtí O

¡3 &

S'g§ 1Vi c i 03 o Cí<L> oo '*-* cd

C/Dcd> • rHcn03CUtícncn03tíO

tíOoo

tí o

03 Xcd

X cd i/ig 2fe^cdtí O

P £

tíX

cu<33s-

fe

<fe

03>

5R g«o 'co\ tí CO, 1 > vo03 O +tí03

X2

’áuX

O'<13tí >>

CU • •4—»co

V-4& 3

XNi—1 co tí+-»co "O Ocu .

<D cd cncncd

<L> cd X■4—»<D

11 <o

cd4—>tíO

cd o cu oO

■£x

cu

X 8 cncd• r»*<tí

cn cd Otí03

034—> s OX c cu oViO M 1/1

1 <03X

cnO

r -

Tcdcd

cn03 e/ío T3 CUtíO

cncd ooN O Ocd cn O íV i O + co

ViO

i <03 '2

1fe X X Td

.2'5oCJCQcsbec

c3g -2

^ Sco «* O cQ

co O

6 cQ

CQ

co O •*—> O3

<L> *0•S o 1__< 1

o o/

«o8

£cuoco8

cQ co co

á §

t 3CO i3 a

’5 -S S 6

• »h ^ 4 rS .W CU W ü

<L>T3 cQO _

5) ^G ^

O£oo

CQ

O 8

QQ<L>TD co CQ

• ao oo <ü So* c3

.G T3

2| J *c3 co £? 2

§ 1 w 3 o o

6 3?

o .53

CO

2CO -¡-h

Q £Ss

C-i ^O O Oh "O

co o

a •§t>o 2S ^2 8 .2 P £ 3

S i^ CQ <D &

co O O Oh O co ^¿ 2 w ¡§ £ 2

(SfOONr -Oen«o8

Oí

a

a

o>"O2ca>so coO. o ü «e ES vd:2 § o CQ

coH

CQu4>Ci>C£OcoCQ

V

a13O

coCQJO’S0>•*■*CJucosCQ

¿j O co

X J O -*—»

« 3-5 -a 3 S■acó* c3eQ N o ;r3 cQ cQ

2i

XS O .co O

OT3coCQ

00

CQcQ

co<D36

£ g 2C3JOIO 1

CQO e o33

oo•*co cQ • 1—1CQCO

2ao

<L>o 3TD3 oOT3Ol-Huoco Oha>O CO *oJO COOc

2 •§ 6

CQO . . CQ QO h gco O O O

o52 *o*2 cQ

S ico <L> CQ *-■

-O .— ie5 O g c3O co O <D5§ O h•3 >< O (Do

'O £

e E~ o ^ 8 8. gg S 3I 2 &G co vi=5

a> o

o 2 o CQT 3 t-c cQ W )£ Uh

•3 oO h

2 C£ .52

■ ? i §r * b OE o ^

" § 1 ¿ " E S

coOH—■O3

<L>2 OI S£ .52 '3 0 -c « *2 ^ M o1h ^^ O ^

O CO

II .a § sT e 3

cQ 1 Uh <D cQ• P-H O T 3 coO-o*o

732

O h

CO 8

coO

* oCQ

CQO•fHg

CQ• f-HaoS<D£

cQOiP4-»xS 3 ' 3 G

3 3 o G (L>co cr1 T 32 O• »H

oO 3 • »H

coO

X )

c

C . — O

c3 8cu<ü ' O <L>3o

s<cu

*o o Wh ocQ X ) 3Wh

• pOco

o coJ3CQO h

<

c P3OO

CQ•oCQN

cq

^ Q Q O h OQ

co2O hX0>CQ

<L>

1

| < II 8

• * Go g O 8 % °* 2 g<L> O h £

- o co *>

% - 8 - eO O

f e s6 c ' § 1 |

e

sa,

S

<L>c53o13U

Co 8 _ cu cQsu — O £

• pHCO

i .p*<DCQ

"8

Nc

o+

II

c'O

CJa>uPh

3>i• iH

£i*H—>• »HG co £i3 CQ> G H—>O3 3CO*So l-cd <D Jrí CQ• •—i O 2 OG 3 cO co (UH—>coCQ3o co<L>G 'S

•GocoT—4.23 cQX 3O■8

33

CQ*oI-HcoO coO 3L<L>H3G-o cQ •

<DTDC3O co

S £ CQO

c'2*0CQ£u

c3O

O

CQ ^5 - 1—< CQoo a

t «o 3 8 O cuCQO Sco 3 O ^ co —. cQ 8u c§ CQ

§ ■ 8

O §" io ' g *o os - scW ¿2

o A T3 íi ’O

§I

§g

.5=1 o § ’oH—1

O S ■S.-S ! - §

a ^ '§R o . c —ü 1> 3T3 g cQ-5=! 2 O

S u l& c 3cQ <D co

.2’£

3o

5

St-i

>

<D

co

PNT

• AL

- 018

. Re

cuen

to

de Ba

cillu

s cer

eus

(NF

V 08

-058

)

36 M ÉTO D O S DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE A U M E N TO S

esC

oesa3W)a

<U’OCS

'2o'ooesGGCU)G

eSX IOG

• tHOO

—3 • oaes o t ¡- G co eS (O O ' o cí Ü r| —( í-, C2

es co eS c¡—i C <t>G G ’T'3 a> 'O o• i-Hco O ^3 £. og s á

a OG'OOí-,CXoo

73 esCS «3 eS g eS CX,

£

cu"3

-c>S

oo

^ • 3 *gcu g-, ,cr° co Oo O-2 t>'o "O a o CQ &

S 'S ' -a áT 3 r G

oGcu o oCX'O

x o Ho 2 ’O 255 2 t»0

t-« O Oh

O

•-Í *? J3 O ' 3O30Q

♦—4<L)"as-3

Oo

’O2Oh

’— 1 Ocu -t»^ & co r32 2

~3

(L> I-, co O O CX’O

cnO>ca>3cra>ft g cu o >G a>C |'O '3

es

cnW

3ju'73ü

08u<uGCUC£

esO cnes

3*2<u-4—1cuu.cn08CUes

o*35-ess_cu

OO

3 O CQ tu•8 ■§ O 2"O ex,eS '— "G O*G ¿3

2 1 u *■* G (-4'3 2G. . 03O s

víX £ <3 O c*o ’O

a>'Oo73CS

CU

CU

'GG

X<3II

.cr*

oüCx,coOt-H4-»

O2eS£3txOt-HOCXco3OV.oo-Sí corq» o o O 3 Goq -o

i >0 iG C§ o• s i

■ § 11 s>’G O eo H cu .2

CU2'GG

O*3

-CS

Oo

ocx,«o3 .Cu /•— •>x- 55cu O O ’O

co_3

I fCQ O

3 O O £-o cxeS co.i gco O CU s' -

2 IG § .1 & G c-1 .. O “C3 CXa 3

O v,-~J“ o< oII

(U es COt i y , 2

 G CU .2 *2 2 X _ g' 2 es oo 2 - o

coeS

CO

Í-H co cu eS G "G cu g4-» Oo § o u(U ^-o T—1S -o S* 0 - 8 ct5 zrí 4—>o S w g .g 'acx '2 3G O eS x eS

¡ 3 ’ S ‘ o

G'OOcu

ex

C

CU>

CNr-Oook—I

a>>

PROCEDIM IENTO DE EXPRESIÓN DE R ESU LTA D O S (P N T - A L - 002) 37

.2‘c

z s

oo03tí300c

ss ^ 8 .a.3 13Cu tí ooO o3

ed

<D "O cd tí§> 42

.s 2tí <D tí(D a

C O I d

-3 §<D "P

T3 OO cu

o o:s £3 o

ítí <t> co i O s4-» cda c-3 E'tí _ , O 3 b v°O . • t-4

< - ? O

^ b cu. tí s: °

! s^3 -O 'S cd^ -

s *i » CO

tí <TÍ- a * >

i 1-P g o S^ txo& • £ CO «

S 2 § 3 3¡ o

ts So ;tí• rH

p e .

CO -tí^ S-,

tí £pí=¡ ^ -S cq S i . 2

co

5*1*<¡O

O

5 .

<L> "tí

co O

tí<D

S

OScdtoo*~iOtíuco ■

§ Stoo t í.5 g' f e ’gxs

tí<utítía>

(tí

ONrHO

i

<

coO'tía>tícra» co o , Otí 5a 6tí vH

:2 § o» ed

cow

edtía>títítoeOcoed

O

3

'CdU

cocd

”2etí4-itítícocdtícd

cd

• ■ LJ•2 2 ^

3co c3 cd M

M '-3tí s2 s2 «* co cd cd ¿2 O co cd tí

^ Ico c O cd

"tí

4 3'tí

co >

H I a)'O .2 -o»—« 4—Jü cí co t í o cd

*3 ° ‘S^ ^ ° Cd CO tr— (—1 O O'S 2 °o t í 2^ sw (Uo

* tí co * 3 O 00g-ta o

3 £ §

s e 6s ■§ «tí § tí ntí tí tí

i .tíuX<L>coSicu ' ■

.5 6cu O C^'O *«4 cd£ 4=¡ 3 tí

í£2 co ^3 a)cÍ5 'tí■2 ís o 8

<L>

'U z * .cd C j-¡ <u

tí

« V ,tí

cotítoo vST sí ^

’ J** co O

B fe g-a

B ps cu

6'§ g S o S i: .S » 5 3

s T o a a

OX

-o I ^

-§

Is

'§

u ¿ o b

cd « cd<u

a(L)

tí'tíO

g ^§ ) tí O <D

Sí á

.5 § ^ BS.S

^3

OSí04

O+

tí'O

oo¿tí

Ph

l a .rtí S

o :sCu CO

s áí3 SOcotí 'tí

*S £o or-H CdO tí o tí

o

<D O tí

4—<CO

Ouo

<udtícoOtí(D

<DtíO

• t-HOtí

oT5(ü

-O

títí

Is •ed 00 § .2 O tí cu O

tí o x : ^tíid o>

-tí ^S" °g gp tí

<L>T i t íC >

Ver

ISO

7218

Ve

r TA

BLA

1

M ÉTO D O S DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE A LIM EN TO S

.2*2’ooesGGOJOC

<D CS•O r—'cSGO

GOU

cS ocSl-l co £ O=1 G c r2 vS-

es G cG Goo <x G cx« s > * -2 £ ^o *■*G 23

53 cS<D G

’O O _ G o) ’O> o • C-¡ tí c 3 ?cS j-J CS_r sjCS - T—Io 03 es 2

co O o-,

¡L°O . g

i S3-SeSOU ■*—i-o 3i §CG 13

M *’O cocS 3

OOU G

’O ’O

B § •2 t¡*t3 O

O2CS

feo“3 i—O

CXo ¡¡2 ✓—A

’O § g _ . oo *—*i - s § S 'f e - ’HCU G

■¿3 CX, CX

VO«OoIoo<G>

coRcutooR

£<uCXsa

i a£coO

a>’O

GsuGcuO»

Oí

H-J

IHZOn

cnO

«GOUGO"su cn o . O su S= E

:2 gcuCS

t í

cts-sucsutooocnes

O

GCU73O

cnCS

’O*2su-*-»suV.cnGCUCS

es o hco COau o

s|G3 'G-8 ^ - o J=íau o -> J2

■a ■§■a s.cS 2 2 2 nCX xqZ7 <**5 s

GO cS

¿ acx <uco ’O2 CO*-* O

G SUOU gcS su2 §G '■£

mD G

o’OcS

au

cScoauC XX

Ü U .’O 2 lo- O

■o 2 ^2cS R 3 2

*G Rco ’ *>» coau ^ o2 ! § au R- ’O

oViC X

au’Oo

’OcS

Ocx

*Gcoau

cu3

’O

O- CO n eS co -—i

cS O G 2 ©

O2au G O o

2' OG3

II

OG

«oR ,-AS cu co &o O

.R tu

.R G _ S— td o lo oJrí X v_g cx cxG co

'2 S oG s ¿ ¡'ti 3 3 ~3 H Qvs

3II¿ * G b s í o feb

-o ’O o cu

cSau’OcoO

’OCS

au’ O

Rcu0*0R

au

—<au TO Cu . . 2 cx GO 5 «= co. 3 auCS R3 >-,o ^ cx

R XtS *>O eS

G'Oes O au2 au G C ’O es

OX

-o I ^II3

C X

<Q *2 2 2

au c ’O au ^ 'Oau2'GG

Tu

533o73CJ

coO _

§ 2 IG CX yes 'O G *2 co au au t í G cx cn G X

R G au

• S G £^ " sR* co . 2cu au - 3 ^ G «B 8 2s au es

~3 cx £

"3

II

2 2 y ° 2 3.CScuco co CS oG ^ o au o ’V° Tu

o >»0 ’G coeS >

au eS 'Zo ’O auco £ y o cS Gg . y ^

• § S 8

• 1—4v22GGRauGau+-> coau cS

’O ’ceS Ot í ’oa cuo »oCS 4—1

’a . auCS ’OG o

2

C3*33• —4CUSJ

<t í5Hau

>

O

Oco

JDau’O

»oo\TuGau

CS

ror-^

GO’oo<ocS

c3cx

00

1cS

o |•3 |CO ^’O o2 ^ m

au au — ^5/5 ü - au ^

Gau2au

o•2'OGau’O

au’OcoauCO

au’O

co CS

CS

C « G OS OOoau

’ Ocoau

oCX,

G

'ocuo 52 un «54—1 ^3

cScS t i

2 Ocx o

MÉTODOS ■ n á U l i a m ichodiolóoicob ob a l im b n t o s

cd

1

1

+3

g

PéS

«'í

2cOA

o

3>csu

09os*0

£

ess

o+sT

^ .2

1 § I iII

Ver

ISO

7218

Ve

r TA

BLA

1

PROCEDIM IENTO DE EXPRESION DE R ESU LTA D O S (PNT - AL - 002)

Nr—sOcn

ca<L>cCSi-a>

oa«o0

1 <3a>•aa

'Oas’SCAa»>a

U -i N

•

HZs-

o

£

42 MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

TABLA 1: Límites de confianza para las estimaciones de pequeñosnúmeros de colonias

En esta tabla se dan los límites de confianza al nivel del 95% para la estimación de pequeños números, cuando el número de colonias retenidas' sobre las placas es menor que 15 microorganismos*.

Núitiero de microorgánismos *

Límites de confianza al nivel 95%

Inferior Superior

1 <1 2

2 <1 4

3 <1 5

4 1 6

5 2 9

6 2 10

7 2 12

8 3 13

9 4 14

10 4 16

11 5 18

12 6 19

13 7 20

14 7 21

15 8 23

* Reemplazar por el nombre del microorganismo ensayado.

TA B LA 2: Tabla de NM P para 3 x 1 g. (mL), 3 x 0,1 g. (m L) y 3 x 0,01 g. (mL)

Número de resultados positivos

Coef.NMP

Categoría cuando el número de ensayos es: Límites de confianza

1 2 3 5 10 >95% >95% >99% >99%

0 0 0 <0,30 0,00 0,94 0,00 1,400 0 0 0,30 3 2 2 2 1 0,01 0,95 0,00 1,400 1 0 0,30 2 1 1 1 1 0,01 1,00 0,00 1,600 1 1 0,61 0 3 3 3 3 0,12 1,70 0,05 2,500 2 0 0,62 3 2 2 2 1 • 0,12 1,70 0,05 2,500 3 0 0,94 0 0 0 0 3 0,35 3,50 0,18 4,601 0 0 0,36 1 1 1 1 1 0,02 1,70 0,01 2,501 0 1 0,72 2 2 1 1 1 0,12 1,70 0,05 2,501 0 2 1,1 0 0 0 3 3 0,4 3,5 0,2 4,61 1 0 0,74 1 1 1 1 1 0,13 2,00 0,06 2,701 1 1 1,1 3 3 2 2 2 0,4 3,5 0,2 4,61 2 0 1,1 2 2 1 1 1 0,4 3,5 0,2 4,61 2 1 1,5 3 3 3 3 2 0,5 3,8 0,2 5,2

3 0 1,6 3 3 3 3 2 0,5 3,8 0,2 5,22 0 0 0,92 1 1 1 1 1 0,15 3,50 0,07 4,602 0 1 1,4 2 1 1 1 1 0,4 3,5 0,2 4,62 0 2 2,0 0 3 3 3 3 0,5 3,8 0,2 5,22 1 0 1,5 1 1 1 1 1 0,4 3,8 0,2 5,22 1 1 2,0 2 2 1 1 1 0,5 3,8 0,2 5,22 1 2 2,7 0 3 3 3 3 0,9 9,4 0,5 14,22 2 0 2,1 1 1 1 1 1 0,5 4,0 0,2 5,62 2 2 3,5 0 0 0 0 3 0,9 9,4 0,5 14,22 2 1 2,8 3 2 2 2 1 0,9 9,4 0,5 14,22 3 0 2,9 3 2 2 2 1 0,9 9,4 0,5 14,22 3 1 3,6 0 3 3 3 3 0,9 9,4 0,5 14,23 0 0 2,3 1 1 1 1 1 0,5 9,4 0,3 14,23 0 1 3,8 1 1 1 1 0 0,9 10,4 0,5 15,73 0 2 6,4 3 3 2 2 2 1,6 18,1 1,0 25,03 1 0 4,3 1 1 1 1 1 0,9 18,1 0,5 25,03 1 1 7,5 1 1 1 1 1 1,7 19,9 1,1 27,03 1 2 12 3 2 2 2 1 3 36 2 443 1 3 16 0 0 0 3 3 3 38 2 523' 2 0 9,3 1 1 1 1 1 1,8 36,0 1,2 43,03 2 1 15 1 1 1 1 1 3 38 2 523 2 2 21 2 1 1 1 1 3 40 2 563 2 3 29 3 3 3 2 2 9 99 5 1523 3 0 24 1 1 1 1 1 4 99 3 1523 3 1 46 1 1 1 1 1 9 198 5 2833 3 2 110 1 1 1 1 1 20 400 10 5703 3 3 >110

Los límites de confianza de esta tabla tienen como finalidad dar algunas nociones sobre la influencia de las variaciones estadísticas en los resultados. Existirán siempre otras fuentes de variaciones que, en algunos casos, pueden ser importantes.

TABLA 3: Tabla de NM P para 3 x 0,1 g. (mL), 3 x 0,01 g. (m L) y 3 x 0,001 g. (mL)

Número de resultados positivos Coeficiente Límites de confianza del 95%

0,1 g 0,01 g 0,001 g NMP/g* Inferior Superior

0 0 0 <3 — —

0 1 0 3+ <1 171 0 0 4 <1 211 0 1 7+ 2 271 1 0 7 2 281 2 0 11+ 4 352 0 0 9 2 382 0 1 14+ 5 482 1 0 15 5 502 1 1 20+ 7 602 2 0 21 8 623 0 0 23 9 1303 0 1 39 10 1803 1 0 43 10 2103 1 1 75 20 2803 2 0 93 30 3803 2 1 150 50 5003 2 2 210+ 80 6403 3 0 240 90 1.4003 3 1 460 100 2.4003 3 2 1.100 300 4.8003 3 3 >1.100 .— —

Los resultados normales, obtenidos en el 95% de los ensayos, no están seguidos por un más. Resultados « + » improbables, obtenidos en un 4% de los casos, si que están seguidos por un «+».

Las combinaciones de tubos positivos que no se muestran en la tabla, aparecen en menos del 1% de los ensayos; si se observan a menudo, significa que la técnica empleada es defectuosa o que las suposiciones en las que se basa el NMP estimado no se han cumplido. Para estas combinaciones que no se reflejan en la tabla se puede extrapolar un NMP a partir de la siguiente combinación más elevada que aparece en la tabla (por ejemplo, un caso 2 0 2 tendría un resultado aproximado de 20, que es el NMP correspondiente al caso 2 11.

* Todos los resultados de NMP/g se pueden expresar como NMP/100 g multiplicando por 100.

P R O C ED IM IEN TO DE EXPRESIÓN DE R E S U L TA D O S (P N T - A L - 002) 45

TABLA 4: Explicación de las categorías de los resultados

Antes de empezar los ensayos se ha de decidir qué categoría será aceptada, es decir: sólo la 1, la 1 y la 2 o bien la 1, la 2 y la 3.

Verificar, según el número de muestras examinadas por lote en la tabla de N M P adecuada, si las series de número de tubos positivos correspondientes a las diluciones seleccionadas son aceptables desde el punto de vista estadístico. Esta aceptabilidad depende del número de muestras examinadas y de la decisión de aceptar o de rechazar las categorías 2 y 3.

Así, por ejemplo, cuando se aceptan los resultados de la categoría 1 de la tabla, la secuencia 2 2 1 sólo se puede admitir cuando se analizan 10 muestras por lote. A l contrario, cuando los resultados menos probables de la categoría 2 se aceptan igualmente, la secuencia 2 2 1 será admitida en el caso de haber examinado 2, 3 ó 5 muestras. En ningún caso esta secuencia 2 2 1 es válida para una muestra única.

Para cada secuencia considerada aceptable según lo descrito, determinar el coeficiente NM P mediante la correspondiente tabla 3.

Si la decisión es muy importante para ser tomada basándose en los resultados, se habrán de aceptar únicamente los resultados de la categoría 1 o, como mucho, de las categorías 1 y 2.

Los resultados de la categoría 0 se habrán de considerar con mucha prudencia.

Categoría Definición

1 Cuando el número de microorganismos en el producto es igual al N M P hallado, el resultado es uno de los que tiene la posibilidad más elevada de ser obtenido. Existe como mucho el 5% de posibilidades de obtener un resultado que es menos probable que el menos probable de esta categoría.

2 Cuando el número de microorganismos en el producto es igual al N M P hallado, el resultado es uno de los que tiene menos posibilidades de ser obtenido, incluso el menos probable de la categoría 1, pero existe como mucho el 1 % de posibilidades de obtener un resultado que es menos probable que el menos probable de esta categoría.

3 Cuando el número de microorganismos en el producto es igual al N M P hallado, el resultado es uno de los que tiene menos posibilidades de ser obtenido, incluso menos posibilidades que el que menos posibilidades tiene de la categoría 2, pero existe como mucho el 0,1 % de posibilidades de obtener un resultado que es menos probable que el menos probable en esta categoría.

0 Cuando el número de microorganismos en el producto es igual al N M P hallado, el resultado es uno de los que tiene menos posibilidades de ser obtenido, incluso menos probable que el que menos posibilidades tiene de la categoría 3. No existe ninguna posibilidad del 0,1% de obtener un resultado en esta categoría sin que sea falso.

Los límites de confianza que se dan en las TAB LAS 2 y 3 están destinados únicamente a sugerir algunas nociones de la influencia de las variaciones estadísticas sobre los resultados. Siempre habrá otras fuentes de variaciones que puedan ser por sí mismas, alguna vez, más importantes.

46 M ÉTO D O S DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE A LIM EN TO S

ISSIéSÉí I í

o

pqQOfe

oU

wQOe

O

O s5

§Uso

u

o

o

o

o

co

¡zo i0 coO

§ w o*OípqQ

coOCá

-4 w

1pq l ' gZ y Mtqo 2 . °o H Wco co P< pq c yO pq

PupqQ

coO

, P J

pqO ' g►—i z

§O ^ o

£ § * ZO h eco co P< pq oO

s

§

PROCED IM IEN TO DE EXPRESIÓN DE R E S U LTA D O S (P N T - A L - 002) 47

M É TO D O DE R EFER EN C IA

EJEMPLO 1: Caso general

Un recuento de microorganismos da como resultado:

Primera dilución retenida:io-2

Segunda dilución retenida:io-3

Número de colonias168 14

215 25

Entonces:

XC = 168 + 215 -f 14 4- 25 = 422V (/ i , + 0 , l n 2) d 1 • [2 = (0,1 + 2)] * 10“2 0,022

Después de redondear el número obtenido, consideramos que el resultado es 19.000 (o 1,9 x 104) microorganismos por mililitro o por gramo de producto.

EJEMPLO 2: Estimación de pequeños números

Si las dos placas, al nivel de la muestra de ensayo (para productos líquidos), de la dilución madre (para el resto de productos) o de la primera dilución sembrada o retenida, contienen menos de 15 colonias (en total, características o identificadas).

Un recuento da como resultado:


Número de colonias12

13

Entonces:

^ _ X C _ . J 2 ± « . . _ 2 5 _* V n d 1 • 2 • 10 0,02

Después de redondear el resultado obtenido, consideramos que el número estimado de microorganismos por mililitro o por gramo de producto es 1.300 (o 1,3 x 103).

EJEMPLO 3: Casos particulares

En el caso de que el número total de colonias sea mayor que 300 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) en las dos placas de una primera dilución dl9 con un número de

48 M ÉTODO S DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIM ENTOS

colonias menos que 15 en las dos placas de la dilución d2 siguiente, si el número total de colonias en cada una de las placas de la dilución d1 está comprendido entre 324 y 300 (parte superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 300).


Primera dilución retenida:io -2

Segunda dilución retenida: 10"3


322 12

Utilizar el modo de cálculo del caso general a partir de las placas de las dos diluciones retenidas.

EJEM PLO 4: Casos particulares

En el caso de que el número total de colonias sea mayor que 300 (o cualquier otro número indicado en la norma específica), en las dos placas de una primera dilución dx, con un número de colonias menos que 15 en las dos placas de la dilución d2 siguiente, si el número total de colonias en cada una de las placas de la dilución dx es superior a 324 (límite superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 300), retener sólo el resultado de los recuentos de la dilución d2 y realizar una estimación de pequeños números, excepto en el caso de recuento de colonias en total con un número máximo fijado en 300 colonias, si el último resultado es menos que 10 (límite inferior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 15) (ver Ejemplo 5).





350 14

Proceder a una estimación de pequeños números a partir de las colonias contadas en las dos placas de la dilución 10-3.






350 6

El resultado de este recuento no es aceptable.



En el caso de que únicamente las dos placas de la ultima dilución sembrada tengan menos de 300 colonias (o cualquier otro número indicado en la norma específica).


Última dilución retenida:io -2

Número de colonias120

130

Entonces:

N ' ZC 120 + 130 250V n d * 1*2* 10" 0,0002

= 1.250.000

Después de redondear el número obtenido, consideramos que el resultado es 1.300.000 (o 1,3 x 106) microorganismos por mililitro o por gramo de producto.

M ÉTO D O DE R UTIN A



Primera dilución retenida:io-2Segunda dilución retenida: ío-3

Número de colonias 83 13

Entonces:

N = ZC 83 + 13 96V (n, + 0,l*n2) * ¿ l * [ l + ( 0 , l l ) ] * 1 0 z 0,011

8,727




Primera dilución retenida:io-2Número de colonias 12


Entonces:

Después de redondear el resultado obtenido, consideramos que el número estimado Ne de microorganismos por mililitro o por gramo de producto es 1.200 (o 1,2 x 103).


Caso en el que el número total de colonias sea mayor que 300 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) en la placa de una primera dilución du con un número de colonias menor que 15 en la placa de la dilución d2 siguiente, si el número total de colonias en la placa de la dilución dx está comprendido entre 324 y 300 (parte superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 300).


Prim era dilución retenida: io-2

Segunda dilución retenida: 10-3




Caso en el que el número total de colonias sea mayor que' 300 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) en la placa de una primera dilución con un número de colonias menor que 15 en la placa de la dilución d2 siguiente, si el número total de colonias en la placa de la dilución dx es superior a 324 (límite superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 300), retener sólo el resultado del recuento de la dilución dl y realizar una estimación de pequeños números, excepto en el caso de recuento de colonias en total con un número máximo fijado en 300 colonias, si el último resultado es menos que 10 (límite inferior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 15) (ver Ejemplo 11).-


Prim era dilución retenida:io-2

Segunda dilución retenida:10-3


Proceder a una estimación de pequeños números a partir de las colonias contadas en las dos placas de la dilución 10~3.

PROCEDIM IENTO DE EXPRESIÓN DE R ESULTADOS (PNT - A L - 002) 51



Primera dilución retenida:io-2Segunda dilución retenida:ío-3


El resultado de este recuento no es aceptable.


Caso en el que únicamente la placa de la última dilución sembrada tenga menos de 300 colonias (o cualquier otro número indicado en la norma específica).


Última dilución retenida: 10"*

Número de colonias 125

Entonces:

C 125N ' = = --------r = 1.250.000

V d 110^

Después de redondear el número, obtenido, consideramos que el resultado es 1.300.000 (o 1,3 x 106) microorganismos por mililitro o por gramo de producto.

M ÉTODO DE REFERENCIA

EJEM PLO 13: Caso general


Primera dilución retenida: 1 0 3

Segunda dilución retenida: 10"*


80 7

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS (P N T- AL - 002) 55

M E T O D O D E RU TIN A



Prim era dilución retenida:io-3

Segunda dilución retenida: 10


Han sido resembradas:

• De las 66 colonias de la dilución 10-3: 5 colonias, de las cuales 4 han respondido a los criterios de identificación; así: a = 53.

• Las 4 colonias de la dilución 10"4, de las cuales 3 han respondido a los criterios de identificación; así: a = 3.

Entonces:

N = Ta 53 + 3 56 = 50.909V ( n x + 0,l*/i2)*d 1* [2+ (0,1*1)] 10 0,011




Prim era dilución sembrada:io-2

Número de colonias identificadas 12

Entonces:

Nt = - = = 1.200* d 0,01

Después de redondear el resultado obtenido, consideramos que el número estimado Ne de microorganismos por mililitro o por gramo de producto es 1.200 (o 1,2 x 103).

Si, para una primera dilución dx, el número total de colonias características y no características es mayor que 150 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) con colonias identificadas y si, en la dilución siguiente hay menos de 150 colonias (o cualquier otro número indicado en la norma específica), no se puede contar ninguna colonia identificada.



Segunda dilución retenida: 1<H

Número de colonias 180 22con colonias identificadas

presentessin colonias identificadas

presentes

El resultado es menos de 1.000 y más de 100 microorganismos por mililitro o por gramo de producto.


Si, en una primera dilución dl9 el número total de colonias características y no características es mayor que 150 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) sin colonias identificadas y si, en la dilución d2 siguiente hay menos de 150 colonias (o cualquier otro número indicado en la norma específica), no se puede contar ninguna colonia identificada.


Primera dilución retenida: 10"2

Segunda dilución retenida: 1(H

Número de colonias 180 22sin colonias identificadas

presentessin colonias identificadas

presentes

El resultado es menos de 1.000 microorganismos por mililitro o por gramo de producto.


En caso de que el número total de colonias características y no características sea mayor que 150 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) en la placa de una primera dilución dl9 con un número de colonias identificadas menor que 15 en la placa de la dilución ^siguiente, si el número total de colonias en la placa de la dilución dx está comprendido entre 167 y 150 (parte superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 150).



Segunda dilución retenida: 10-3

Número de colonias 165 8colonias identificadas




Caso en el que el número total de colonias características y no características sea mayor que 150 (o cualquier otro número indicadp en la norma específica) en la placa de una primera dilución con un número de colonias identificadas menor que 15 en la placa de la dilución d2 siguiente, si el número total de colonias en la placa de la dilución dl es superior a 167 (límite superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 150), retener sólo el resultado del recuento de la dilución d2 y realizar una estimación de pequeños números.


Primera dilución retenida:ío-2

Segunda dilución retenida: IQr3


colonias identificadas

Proceder a una estimación de pequeños números a partir de las colonias contadas en la placa de la dilución 10-3.


Caso en el que únicamente la placa de la última dilución sembrada tenga menos de 150 colonias (o cualquier otro número indicado en la norma específica) características y no características.


Entonces:

Primera dilución sembrada: 10"4

Número de colonias identificadas 125

AT = - — = 125 = 125 = 1.250.000V n - d 110-4 0,0001

Después de redondear el número obtenido, consideramos que el resultado es 1.300.000 (o 1,3 x 106) microorganismos por mililitro o por gramo de producto.

58 M ÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIM EN TO S

EJEM PLO 27: Al menos una dilución tiene los tres tubos positivos

Escoger la dilución más elevada (aquélla con menor concentración de muestra) que presente tres tubos positivos, así como las dos diluciones siguientes que tengan tubos positivos (es decir, aquéllas donde las concentraciones de muestra sean iguales a 1/10 y 1/100 de la primera dilución escogida). Ver CASO 1 en la TABLA 5.

Si se ha preparado un número insuficiente de diluciones por encima de la dilución más elevada con tres tubos positivos, escoger en su lugar las tres diluciones más elevadas de la serie (es decir, aquéllas que tengan una concentración más baja de muestra). Ver CASO 2 en la TABLA 5.

TABLA 5: Ejemplos de elecciones de resultados positivos p a ra el cálculode los valores del NM P

CASO

Núm ero de tubos positivos obtenidos a p a rtir de tres tubos incubados para las cantidades siguientes

de m uestra sem brada por tubo*NMP**

Productoslíquidos 10 mL 1 mL 10-1 mL 10-2mL 10"3mL Productos

líquidosOtros

productosO tros

productos 1 g 10"1 g 10^2g io-3g 10^g mL-1 g-1

1 3 3 2 1 0 1,5 O1 1,5 • 102

2 3 3 3 0 — 2,4 * 101 2,4 • 102

3 2 2 1 1 0 7,4 7,4 • 101

4 3 3 0 0 0 2,4 2,4 • 101

5 2 2 0 1 0 2,1 • 101 2,1

* Números en negrita: combinación elegida.** Cálculo a partir del coeficiente de NMP para los tres tipos (TABLA 1).

E JEM PLO 28: Ninguna dilución tiene los tres tubos positivos

Cuando el caso 1 no se puede aplicar, escoger las tres diluciones más elevadas de la serie (aquéllas con menor concentración de muestra) que contengan al menos una respuesta positiva. Ver CASO 3 en la TABLA 5.


En todos los casos donde más de una de las tres diluciones escogidas según los dos casos anteriores no tenga tubos positivos, retener la dilución menos elevada que no presente ningún tubo positivo (es decir, la que tiene una mayor concentración de muestra) y las dos diluciones más ba


jas precedentes (es decir, aquéllas con las concentraciones de muestra iguales a 10 y 100 veces la de la primera dilución escogida, ver CASOS 4 y 5 en TABLA 5), excepto cuando sólo se encuentran tubos positivos al nivel de la primera dilución preparada a partir de la muestra.

En este caso, es necesario retener las tres primeras diluciones para el cálculo el NMP, igual que si esta serie tuviera dos diluciones sin ningún tubo positivo.

EJEMPLO 30: Determinación del coeficiente NMP

Verificar, según el número de muestras examinadas por lote en las TABLAS 2 y 3, si las series de número de tubos positivos correspondientes a las diluciones seleccionadas son aceptables desde el punto de vista estadístico. Esta aceptabilidad depende del número de muestras examinadas y de la decisión de aceptar o de rechazar las categorías 2 y 3 (ver TABLA 4).

Así, por ejemplo, cuando se aceptan los resultados de la categoría 1 de la TABLA 4, la secuencia 2 2 1 sólo se puede admitir cuando se analizan 10 muestras por lote. Al contrario, cuando los resultados menos probables de la categoría 2 se aceptan igualmente, la secuencia 2 21 será admitida en el caso de haber examinado 2, 3 ó 5 muestras. En ningún caso esta secuencia2 2 1 es válida para una muestra única.

Para cada secuencia considerada aceptable según lo descrito, determinar el coeficiente NMP mediante la TABLA 2.

EJEMPLO 31: Cálculo del número más probable (NMP)

A partir del coeficiente de NMP obtenido de las TABLAS 2 y 3, determinar el número de microorganismos más probable por mililitro o por gramo de muestra con ayuda de la expresión:

C = M — VV0

siendo:

• Cs: número más probable de microorganismos en un volumen de referencia Vs.• M: coeficiente NMP obtenido en las TABLAS 2 y 3 por la dilución base V0.• F: inversa de la tasa de dilución correspondiente a la dilución eventual considerada como

dilución de base utilizada (generalmente F = 10,100, etc.).• Vs: volumen de dilución elegido para expresar la concentración en microorganismos.• V0: dilución de base.

Expresar el resultado de microorganismos por mililitro (producto líquido) o por gramo (resto de productos) como un número comprendido entre 1,0 y 9,9 multiplicado por 10*, siendo x el orden de magnitud apropiado de 10.

Si el NMP es inferior a 03 microorganismos por mililitro (para productos líquidos) o por gramo (para el resto de productos) y si se ha utilizado un modo operatorio adecuado para un número bajo de microorganismos, el resultado deberá expresarse de la manera siguiente: menos de 1 microorganismo en 1 mL (para productos líquidos) o en 1 gramo de producto (para el resto de productos).

CAPÍTULO TERCERO

Procedimientos de métodos de análisisde alimentos

MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTODE MICROORGANISMOS A 30°C

PNT - AL - 003 Basado en la norma ISO 4833 (Julio 1991)

1. Definición:Microorganismos: Bacterias, levaduras y mohos que se desarrollan en aerobiosis, cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:Agar para recuento (PCA).Agar blanco (AB).

3. Siembra:• Sembrar por duplicado 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre en placas Petri

estériles.• Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales.• Verter en cada placa unos 15 mL de PCA a 45°C ± 1°C.• Mezclar el inóculo con el medio y dejar que solidifique *.• Incubar a 30°C ± 1°C durante 72 h ± 3 h.

4. Recuento:• Contar las colonias de aquellas placas que contengan un máximo de 300.

5. Expresión de resultados 2:• Retener las placas que contengan un máximo de 300 colonias al nivel de dos diluciones

sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias.• Calcular el número N de microorganismos por mililitro o por gramo con la expresión:

JV = K -------(u, + 0,1-ti 2) d

1 Si sospechamos que la muestra contiene microorganismos cuyas colonias invaden la superficie del medio, después dé la solidificación verter 4 mL de AB a 45°C ±1°C y dejar reposar.

2 Consultar el PNT - AL - 002 de expresión de resultados.

PROCEDIMIENTOS DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS 63



fe-mL 1 mL 1 mL 1 mL

10-»—

10-2 io-3Vw/ío-4

(10-2) <HH) o c n (10-5)

1 mLyy1 mL 1 mL

"O71 mL

Verter en cada placa 15 mL de PCA a 45°C ± 1°C Mezclar e incubar a 30°C ± 1°C durante 72 h ± 3 h*

Retener las placas con menos de 300 colonias

Lectura y expresión de resultados

* Si es necesario, añadir 4 mL de AB a 45°C ± 1°C.


MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS A 30°C

PNT - AL - 004 Basado en la norma NF V 08-051 (Diciembre 1992)

1. Definición:Microorganismos: Bacterias, levaduras y mohos que se desarrollan en aerobiosis, cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:Agar para recuento (PCA).Agar blanco (AB).

3. Siembra:• Sembrar 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre en una placa Petri estéril.• Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales.• Verter en cada placa unos 15 mL de PCA enfriado a 45°C - 47°C.• Mezclar el inoculo con el medio y dejar que solidifique3.• Incubar a 30°C ± 1°C durante 72 h ± 3 h.

4. Recuento:• Contar las colonias de aquellas placas que contengan un máximo de 300.

5. Expresión de resultados4:• Retener las placas que contengan un máximo de 300 colonias al nivel de dos diluciones

sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias.• Calcular el número N de microorganismos por mililitro o por gramo con la expresión:

3 Si sospechamos que la muestra contiene microorganismos cuyas colonias invaden la superficie del medio, después de la solidificación verter 4 mL de AB a 45°C - 47°C y dejar reposar.





1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

0B0Muestra líquida 10°

Dilución madre (IO-1)io-1

(io-2)IO"2

(io-3)IO"3

(10-4) 1CH(io-5)

o o1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mLo o o o o10°

(io-1)io-1

(1(L2)io-2

(1(L3)10-3

(10-*)10^

(io-5)

Verter en cada placa 15 mL de PCA a 450C-470C Mezclar e incubar a 30°C ± 1°C durante 72 h ± 3 h*


10°

(IO-1)io-1

(IO-2)10-2

(io-3)io-3

(1(^)io-1

(io-5)


* Si es necesario, añadir 4 mL de AB a 45°C — 47°C.


MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTODE LEVADURAS Y MOHOS

PNT - AL - #05 Basado en la norma ISO 7954 (Agosto 1988)

1. Definición:Levaduras y mohos: Microorganismos que a 25°C forman colonias en un medio selectivo, cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medio de cultivo:Agar glucosa y cloranfenicol (CGA).

3. Siembra:• Sembrar por duplicado 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre en placas Petri

estériles.'• Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales.• Verter en cada placa unos 15 mL de CGA a 45°C ± 1°C.• Mezclar el inóculo con el medio y dejar que solidifique.• Incubar a 25°C ± 1°C durante 5 días.

4. Recuento:• Contar las colonias de cada placa a los 3,4 y 5 días de incubación.

5. Expresión de resultados 5:• Después de 5 días de incubación, retener las placas que contengan un máximo de 150 co

lonias, si es posible al nivel de dos diluciones sucesivas.• Calcular el número N de levaduras y mohos por mililitro o por gramo con la expresión:

* = s e -----------(/i, + 0,1 • /i2) • d




PNT - AL - 005 Basado en la norma ISO 7954 (Agosto 1988)

DIA 1 I mL 1 mL 1 mL 1 mL

Muestra líquida 10° Dilución madre (10-1)

DIA 6

10-'(HH)

Verter en cada placa 15 mL de CGA a 45°C ± 1°C Mezclar e incubar a 25°C ± 1°C durante 5 días


10-'(1(H)


Vw/10-'

v 7io-2

Nw/10-3

v^7

1(H(io-2) (10-3) (10^) (10-=)

1 mL0 1 mL 1 mL

0 1 mL

68 M ÉTO D O S DE ANÁLISIS M iCROBIOLÓGICOS DE ALIM EN TO S

M ÉTO D O H O RIZO N TA L PARA E L RECUENTODE LEVADURAS Y M OHOS

PN T - AL - 006 Basado en la norm a XF V 08-059 (Noviembre 1995)

1. Definición:Levaduras: Microorganismos aerobios mesófilos que, en cinco días, a 25°C, se desarrollan en la superficie del medio sólido, formando colonias mates o brillantes, presentando frecuentemente contomo regular y una superficie más o menos convexa cuando el ensayo se realiza según, el siguiente método.Mohos: Microorganismos aerobios mesófilos, filamentosos, que en la superficie de un medio sólido a 25°C, desarrollan colonias cuando el ensayo se realiza según el siguiente método; este desarrollo puede proceder de la germinación de esporas o del crecimiento de fragmentos micelares.

2. M edio de cultivo:Agar glucosa y cloranfenicol (CGA) con gentamicina.

3. Siem bra:• Sembrar 0,1 mL de muestra líquida o 0,1 mL de dilución madre en placas Petri con el me

dio CGA.• Extender con asa de Drigalski.• Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales.• Incubar a 25°C ± 1°C durante 5 días.

4. Recuento:• Contar las colonias de cada placa a los 3 ,4 y 5 días de incubación.

5. Expresión de resu ltados6:• Después de 5 días de incubación, retener las placas que contengan un máximo de 150 co

lonias, al nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias.

• Calcular el número N de levaduras y mohos por mililitro o por gramo con la expresión:

0,11 d




PNT - AL - 006 Basado en la norma XF V 08-059 (Noviembre 1995)

DIA 1

DÍA 6

l mL 1 mL 1 mL 1 mL

0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL

CGA con gentamicina

10°( 10- 1)

10-1( 10-2)

10-2(10-3)

10-3( 10-4)

Incubar a 25°C±1°C durante 5 días

0,1 mL

l o o o o olO*

( 10-3)


ü - s : » ! » :r*n"i ; o > ;• v *ii* i * n m m • ■ t ■ • i

L a Ti > “ ■ .»"• J f« ' $

1 « " « ^ •! » • • • ■ • A

1 0 » 1 0 - 1

( 1 0 - 1) ( 1 0 - 2 )

10-*(10-3)

10-3(1(H)

10-*(10-5)


70 MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE AUM ENTO S

M ÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO SIN REVIVIFICACIÓNDE Enterobacteriaceae. TÉCNICA DEL NMP

PNT - AL - 007.1 Basado en la norm a ISO 7402 (Diciembre 1993)

1. Definición:Enterobacteriaceae: Bacterias que fermentan la glucosa y dan una reacción oxidasa negativa cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:Caldo tamponado con bilis, verde brillante y glucosa (caldo EE) a doble y simple concentración.Agar bilis cristal violeta y glucosa (VRBG).Agar glucosado (AG).Agar nutritivo (AN).

3. Reactivo:Reactivo para la prueba de la oxidasa.

4. Siembra:Enriquecimiento:• Sembrar 10 mL de muestra líquida o 10 mL de dilución madre en tres tubos con 10 mL de

caldo EE a doble concentración.• Sembrar 1 mL de la muestra líquida o 1 mL de dilución madre en tres tubos de caldo EE

a simple concentración.• Repetir esta operación con las siguientes diluciones decimales.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.Aislamiento:• Aislar en placas de VRBG a partir de cada tubo.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.Selección:• Resembrar 5 colonias típicas bien aisladas (de color rojo violeta y a veces rodeadas de una

halo de precipitación del mismo color, o mucosas)7 en placas de AN.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.

5. Confirmación bioquímica:Prueba de la oxidasa: Se realiza con cada una de las colonias aisladas. La prueba es positiva si al cabo de 10 sg aparece una coloración violeta.Prueba de fermentación de la glucosa:• Sembrar por picadura en tubos de AG a partir de cada una de las colonias aisladas oxidasa 0 .• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h. La prueba es positiva si en la totalidad del tubo

aparece una coloración amarilla.6. Expresión de resultados 8:

• Contar el número de tubos positivos para cada dilución. Si al menos una de las colonias es oxidasa 0 y glucosa 0 , consideraremos positivo el tubo a partir de cual se ha realizado el subcultivo.

• Determinar el número más probable (NMP) con la ayuda de una tabla.

7 Algunas Enterobacteriaceae pueden provocar una decoloración de sus colonias y del medio, de manera que si no se encuentran colonias típicas, sembrar las colonias blanquecinas.


P R O C ED IM IEN TO S DE M É TO D O S DE A N Á L IS IS DE A L IM E N TO S 71

M ÉTO D O HORIZONTAL PARA EL RECUENTO SIN REVIVIFICACIÓNDE Enterobacteriaceae. TÉCNICA DEL NMP


1 mL 1 mL

Dilución madre (10-1)

y y10 mL 1 mL

caldo EE doble

(io-2)

1 mL

(io-3)

1 mL

( 10- )

01 mL

caldo EE simple concentración

BBS10°

(io-1)io-1

(io-2)io-2

(io-3)10-3

(10^)Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h

L

A islam ientoSembrar una placa de VRBG a partir de cada tubo

Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h

Tomar 5 colonias típicas de cada placa y sembrar en AN


oxidaxa 0 IH ül> ü® AG


Determinar el NMP

72 M ÉTODOS DE ANÁLISIS MICRO BIOLÓGICOS DE ALIM ENTOS

M ÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO SIN REVIVIFICACIÓNDE Enterobacteriaceae. TÉCNICA POR RECUENTO DE COLONIAS


1. Definición:

Enterobacteriaceae: Bacterias que fermentan la glucosa y dan una reacción oxidasa negativa, cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:Agar bilis cristal violeta y glucosa (VRBG).Agar glucosado (AG).Agar nutritivo (AN).


4. Siembra:• Sembrar por duplicado 1 mL de la muestra líquida o 1 mL de dilución madre en sendas

placas Petri.• Verter unos 15 mL de VRBG a 45°C ± 1°C.• Una vez solidificado, cubrir con 10-15 mL del mismo medio.• Dejar solidificar e incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.• Repetir esta operación con 1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales.

5. Recuento:• En las placas que contengan menos de 150 colonias, contar aquellas que tengan un diá

metro mayor o igual que 0,5 mm, de color rojo-violeta y a veces rodeadas de un halo de precipitación o mucosas. Consideraremos estas colonias como presuntas Enterobacteriaceae9.

• Tomar cinco colonias características de cada placa retenida y sembrarlas por separado en placas de AN.

• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.

6. Confirmación bioquím ica10:Prueba de la oxidasa: Se realiza con cada una de las colonias aisladas. La prueba es positiva si al cabo de 10 sg aparece una coloración violeta.Prueba de fermentación de la glucosa:• Sembrar por picadura en tubos de AG a partir de cada una de las colonias aisladas oxida

sa 0 .• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h. La prueba es positiva si en la totalidad del tubo

aparece una coloración amarilla.

9 Si la mitad de la superficie de la placa está invadida, la determinación se considerará sin valor. Si la zona invadida fuera inferior a la mitad de la superficie de la placa, se efectúa el recuento de colonias sobre la zona clara y se extrapola este valor a la superficie total.

10 Estas pruebas pueden realizarse simultáneamente con la siembra en AN, según criterio del laboratorio.


7. Expresión de resultados n :Si al menos el 80% de las colonias características seleccionadas son confirmadas como Enterobacteriaceae (es decir, oxidasa © y glucosa ©), el número de bacterias presentes será el encontrado en el recuento (ver punto 5).Si no es así, calcularemos el número a partir del porcentaje de colonias oxidasa 0 y glucosa © sobre el número total de colonias seleccionadas.La expresión que nos permite calcular el número N de Enterobacteriaceae por mililitro o por gramo de producto es:

(/i, + 0,1-n2)-d


74 M É TO D O S DE AN ÁLISIS M ICR OBIOLÓG ICOS DE A LIM EN TO S

M ÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO SIN REVIVIFICACIÓNDE Enterobacteriaceae. TÉCNICA POR RECUENTO DE COLONIAS

PNT - AL - 007.2 Basado en la norma ISO 7402 (Diciembre 1993)

D IA 1

D IA 3

D IA 4

D IA 2 | [

1 mL 1 mL 1 mL

1 mL 1 mL

10°(io-‘)

io-1(io-2)

1 mL

10-2(io-3)

1 mL

io-3(io-4)

Verter 15 mL de VRBG a 45°C ± 1°C Cubrir con 10-15 mL de VRBG



10°

(io-1)10-1

(io-2)10-2

(io-3)io-3

(IO-4)Contar las colonias de presuntas Enterobacteriaceae

Tomar 5 colonias características de cada placa y sembrar en AN


oxidaxa © AG

Incubar a 37°C ± 1 ° C durante 24 h ± 2 Ii



MÉTODO HORIZONTAL PARA LA INVESTIGACIÓNDE Enterobacteriaceae CON PRE-ENRIQUECIMIENTO

PNT - AL - 008 Basado en la norma ISO 8523 (Febrero 1992)

1. Definición:Enterobacteriaceae: Bacterias que fermentan la glucosa y dan una reacción oxidasa negativa cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:Agua de peptona tamponada (APT).Caldo tamponado con bilis, verde brillante y glucosa (caldo EE).Agar bilis cristal violeta y glucosa (VRBG).Agar nutritivo (AN).Agar glucosado (AG).


4. Siembra:Pre-enriquecimiento:• Realizar una dilución 1/10 en ATP.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 16 h - 20 h.Enriquecimiento:• Sembrar 1 mL del cultivo anterior en 10 mL de caldo EE.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h.Aislamiento:• Aislar en placas con VRBG.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.• Resembrar 5 colonias típicas bien aisladas (de color rojo-violeta y a veces rodeadas de un

halo de precipitación del mismo color)12 en placas de AN.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.

5. Confirmación bioquímica:Prueba de la oxidasa: Se realiza con cada una de las colonias aisladas. La prueba es positiva si al cabo de 10 sg aparece una coloración violeta.Prueba de fermentación de la glucosa:• Sembrar por picadura en tubos de AG a partir de cada una de las colonias aisladas oxida

sa ©.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h. La prueba es positiva si en la totalidad del tubo

aparece una coloración amarilla.

6. Expresión de resultados13:Consideramos la muestra positiva en la investigación de Enterobacteriaceas si una de las colonias características es oxidasa 0 y glucosa 0 .

12 Algunas Enterobacteriaceae pueden provocar una decoloración de sus colonias y del medio, de manera que si no se encuentran colonias típicas, tomar de las colonias blanquecinas y sembrar.


76 M É TO D O S DE A N Á L IS IS M IC R O B IO LÓ G IC O S DE A L IM E N TO S

M ÉTO D O HORIZONTAL PARA LA INVESTIGACIÓNDE Enterobacteriaceae CON PRE-ENRIQUECIM IENTO

PNT - AL - 008 Basado en la norm a ISO 8523 (Febrero 1992)

DIA I

DIA 3

DIA 4

DIA 5

DIA 6

P r a - a n r i n i i A / ' í m i a n f n 1 g de muestra

10 mL ATP

Incubar a 37°C ± 1°C durante 16 h-24 hDIA 2 1 C

E nriquecim iento1 mL

10 mL caldo EE

Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h-24 h

VVRBG


AN


-Confirmación o

oxidaxa © B AG


ResultadoGlucosa ® (color amarillo)


MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO SIN REVIVIFICACIÓNDE Enterobacteriaceae. TÉCNICA POR RECUENTO DE COLONIAS

PNT - AL - 009 Basado en la norma NF V 08-054 (Octubre 1993)

1. Definición:

Enterobacteriaceae: Bacterias que fermentan la glucosa y dan una reacción oxidasa negativa cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:

Agar bilis cristal violeta y glucosa (VRBG).Agar glucosado (AG).Agar nutritivo (AN).

3. Reactivo:

Reactivo para la prueba de la oxidasa.

4. Siembra:

• Sembrar en una placa Petri 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre y verter unos 15 mL de VRBG a 45°C - 47°C.

• Una vez solidificado, cubrir con unos 5 mL del mismo medio.• Dejar solidificar en incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.• Repetir la operación con 1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales.

5. Recuento:

• En las placas que contengan menos de 150 colonias, contar aquellas con un diámetro mayor o igual que 0,5 mm, de color rojo violeta y a veces rodeadas de una halo de precipitación del mismo color. Consideraremos estas colonias como presuntas Enterobacteriaceae.

• Tomar cinco colonias características de cada placa retenida y sembrarlas por separado en placas de AN.

• Incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.

6. Confirmación bioquímica:

Prueba de la oxidasa:• Se realiza con cada una de les colonias aisladas. La prueba es positiva si al cabo de 10 sg

aparece una coloración violeta.

Prueba de fermentación de la glucosa:• Sembrar por picadura en tubos de AG a partir de cada una de las cepas oxidasa ©.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h. La prueba es positiva si en la totalidad del tubo apa

rece una coloración amarilla.


Se han resembrado:

• De las 66 colonias de la dilución 10~3: 8 colonias, de tas cuales 6 han respondidoa los criterios; así: a - 50.

• De las 80 colonias de la dilución 10-3: 9 colonias, dfe las cuales 6 han respondido a los criterios; así: a — 53.

• Las 4 colonias de la dilución IO-4, de las cuales las 4 han respondido a los criterios; así: a — 4.

• De las 7 colonias de la dilución 10-4: 5 colonias, de las cuales 4 han respondido a los criterios de identiñcación; así: a = 6.

Entonces:

t f - ___________50 + 53 + 6 + 4 _ 113V- ( n , + 0 , l - i h ) - d 1 • [2 + (0,1 • 2 ) ] ■ 10-3 2.2 1 0 ' 3



Si las dos placas, al nivel de la muestra de ensayo (para productos líquidos), de la dilución madre (para el resto de productos) o de la primera dilución sembrada o retenida, contiene menos de 15 colonias (en total, características o identificadas).



Número de colonias 12

13

Entonces:

12+13z - ^ — = 1.250 * V-n-d 1 • 2 • 10 0,02

Después de redondear el resultado obtenido, consideramos que el número estímalo de microorganismos por mililitro o por gramo de producto es 1.300 (o 1,3 x 103).


Si para las dos placas de una primera dilución dx, el número total de colonias características y no características es mayor que 150 (o cualquier otro número indicado en la norma e>pecífica) con colonias identificadas y si, en la dilución siguiente hay menos de 150 colonias (ocualquier otro número indicado en la norma específica), no se puede contar ninguna colonia identificada.

PROCEDIMIENTO DE EXPRESIÓN DE RESULTADOS {PNT - AL - 002) 53


Primera dilución retenida: 14H


Número de colonias 180 22210 25

con colonias identificadas presentes

sin colonias identificadas presentes

El resultado es menos de 1.000 y más de 100 microorganismos por mililitro o por gramo de producto.


Si, en las dos placas de una primera dilución d¡, el número total de colonias características y no características es mayor que 150 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) sin colonias identificadas y si, en las dos placas de la dilución d siguiente hay menos de 150 colonias (o cualquier otro número indicado en la norma específica), no se puede contar ninguna colonia identificada.







El resultado es menos de 1.000 microorganismos por mililitro o por gramo de producto.


En el caso de que el número total de colonias características y no características sea mayor que 150 (o cualquier otro número indicado en la norma específica) en las dos placas de una primera dilución du con un número de colonias menos que 15 en las dos placas de la dilución d2 siguiente, si el número total de colonias en cada una de las dos placas de la dilución dx está comprendido entre 167 y 150 (parte superior del intervalo de confianza de una media ponderada igual a 150).


Primera dilución retenida: io-2

Segunda dilución retenida:xa-3



Utilizar el modo de cálculo del caso general a partir de las placas de lás dos diluciones retenidas.



Caso en el que el número total de colonias características y no características sea mayor que ISO (o cualquier otro número indicado en la norma específica) en las dos placas de una primera dilución d¡, con un número de colonias menos que 15 en las dos placas de la dilución d2 siguiente, si el número total de colonias en cada una de las dos placas de la dilución dx es superior a 167 (límite superior del intervalo de conñanza de una media ponderada igual a 150), retener sólo el resultado de los recuentos de la dilución dj y realizar una estimación de pequeños números.



Segunda dilución retenida: ío-3



Proceder a una estimación de pequeños números a partir de las colonias contadas en las dos placas de la dilución 10-3.


Caso que únicamente las dos placas de la última dilución sembrada tengan menos de 150 colonias (o cualquier otro número indicado en la norma específica) características y no características.


Última dilución sembrada: 1(M

Número de colonias identificadas

120130

Entonces:

N - . - g - . . - ” g— 1.250.000V n d 1-2-10 0,0002

Después de redondear el número obtenido, consideramos que el resultado es 1.300.000 (o 1 ,3 x 106) microorganismos por mililitro o por gramo de producto.


MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES.TÉCNICA POR RECUENTO DE COLONIAS


1. Definición:

Coliformes: Bacterias que a 30°C son capaces de fermentar la lactosa cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medio de cultivo:

Agar lactosado con bilis al cristal violeta y rojo neutro (VRBL).

3. Siembra:

• Sembrar por duplicado 1 mL de la muestra líquida o 1 mL de dilución madre en sendas placas Petri estériles.

• Repetir esta operación con 1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales.• Verter 15 mL de VRBL a 45°C ± 2°C.• Mezclar y dejar solidificar.• Preparar de la misma manera una placa testigo, para controlar la esterilidad del medio.• Cubrir con 4 mL del mismo medio a 45°C ± 2°C.• Dejar solidificar e incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.

4. Recuento:

• Contar las colonias características de coliformes (de diámetro mayor o igual de 0,5 mm, de color rojo-violeta y a veces rodeadas de un halo de precipitación) en las placas que contengan menos de 150 colonias características y/o no características.

5. Expresión de resultados17:

• Retener las placas que contengan un máximo de 150 colonias características al nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga más de 15 colonias características.

• Calcular el número N de coliformes por mililitro o por gramo de producto con la expresión:

(«, + 0 ,l /2 2) r í


PROCEDIMIENTOS DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ALIM ENTOS 83

MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES.TÉCNICA POR RECUENTO DE COLONIAS

PNT - AL - 011 Basado en la norm a ISO 4832 (Julio 1991)

1 rnL 1 mL 1 mL

Placatestigo

01 mL

01 mL

10° ío - 1 lO"2(10-1) (10-2) (IO"3)

Verter 15 mL de VRBL a 45°C ± 2°C Mezclar y dejar solidificar

Cubrir con 4 mL de VRBL a 45°C ± 2°C Incubar a 30°C ± 1°C o 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h

Retener las placas con menos de 150 colonias características

10°

(10-1)10-1

(10-2)10-2

(10-3)10-3

( 10^ )


84 M ÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIM ENTOS

M ÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTODE COLIFORMES TOTALES.


1. Definición:

Coliform es: Bacterias que a 30°C forman colonias características en el agar lactosado con bilis al cristal violeta y rojo neutro (VRBL) cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. M edio de cultivo:Agar lactosado con bilis al cristal violeta y rojo neutro (VRBL).

3. Siembra:

• Sembrar en una placa Petri 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre.• Repetir la operación con 1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales.• Verter 15 mL de VRBL a 45°C - 47°C.• M ezclar y dejar solidificar.• Preparar de la misma manera una placa testigo, para controlar la esterilidad del medio.• Cubrir con unos 5 mL del mismo medio a 45°C - 47°C.• Dejar solidificar en incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.

4. Recuento:

• Contar las colonias características de coliformes (de diámetro mayor o igual de 0,5 mm, de color rojo-vipleta y a veces rodeadas de un halo de precipitación) en las placas que contengan menos de 150 colonias características y/o no características.

5. Expresión de resultados18:

• Retener las placas que contengan un máximo de 150 colonias características y/o no características al nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga más de 15 colonias características.

• Calcular el número N de coliformes por mililitro o gramo de producto mediante la expresión:


PROCEDIMIENTOS DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS 8ü

MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTODE COLIFORMES TOTALES.


1 mL

Muestra líquida 10° Dilución madre (10~‘)

Placatestigo

1 mL

10°

(10-1)

10-'(io-2)

1 mL

1 mL

io-2(I0-3)

1 mL

Verter 15 mL de VRBL a 45°C ± 47°C Mezclar y dejar solidificar

1 mL

Cubrir con 5 mL de VRBL a 45°C ± 47°C Incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h

io-3( 10^ )

o o &I mL

io-3( 10- )




MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTODE Escherichia coli PRESUNTIVOS. TÉCNICA DEL NMP

PNT - AL - 013 Basado en la norma ISO 7251 (Septiembre 1994)

1. Definición:Escherichia coli: Bacterias que a 45°C fermentan la lactosa con producción de gas y que a esta misma temperatura producen indol a partir del triptófano cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:Caldo de triptona lauril sulfato (TSL).Caldo Escherichia coli (Caldo EC).Agua de triptona (AT).

3. Reactivo:Reactivo de Kovacs.

4. Siembra:• Sembrar 10 mL de muestra líquida o 10 mL de dilución madre en tres tubos de TSL a do

ble concentración.• Sembrar 1 mL de la muestra líquida o 1 mL de dilución madre en tres tubos de TSL a sim

ple concentración.• Repetir esta operación con las siguientes diluciones decimales.• Preparar de la misma manera una placa testigo, para controlar la esterilidad del medio.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+ 24 h si es necesario).

5. Confirmación:• A partir de cada tubo con formación de gas, sembrar con asa de Kolle en Caldo EC y en

AT, atemperados a 45°C ± 2°C.• Incubar en un baño a 45°C ± 0,5°C durante 48 h ± 2 h.

6. Recuento:Prueba del Indol:• Añadir 0,5 mL de reactivo de Kovacs a los tubos de AT.• Mezclar y examinar al cabo de 1 min.• Una coloración roja en la fase alcohólica indica reacción ©.Formación de gas:• La formación de gas en la campana de Durham indica reacción ©.

7. Expresión de resultadosl9:• Retener 3 diluciones según el caso:

a) Cuando al menos una dilución presenta 3 tubos positivos, elegir la más diluida que presente los 3 tubos positivos y las dos diluciones siguientes con tubos positivos.

b) En caso contrario, elegir las tres diluciones más diluidas que contengan al menos un tubo positivo.

• Determinar el NMP con la ayuda de una tabla.


MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTODE Escherichia coti PRESUNTIVOS. TÉCNICA DEL NMP

PNT - AL - 013 Basado en la norma ISO 7251 (Septiembre 1994)

1 mL 1 mL 1 mL

' 'O O O O10 mL

TSL a doble concentración

1 mL 1 mL 1 mL

TSL a simple concentración

1 mL

0 00 00i 00010°

(10-1)10- '

( 10-2)10-2

(lo-3)io-3

o < nIncubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+24 h si es necesario)

Sembrar a partir de los tubos con gas en EC y AT a 45°C ± 2 ± C

\ i i 6 0@@ o® 1LBh: BBB : ;0 : : JB 0- —

10° 10-' 10-2 10-3( lo -1) (10-2) (10-3) (lO 4)

Incubar en baño a 45°C ± 0,5 ± C durante 48 h + 2 h

3Añadir 0,5 mL de reactivo de Kovacs a los tubos de AT000HB B

Mezclar y examinar al cabo de 1 min Contar el número de tubos con coloración roja y formación de gas

EC e AT

Determinar el NMP


MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTODE Escherichia coU 0-GLUCURONIDASA POSITIVOS


1. Definición:

Escherichia coli ¡3-glucuronidasa positivos: Bacterias que a 44°C forman colonias características en el agar con tergitol (PTX), adicionado de un substrato cromogénico (BCIG) que revele la presencia de /3-glucuronidasa cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medio de cultivo:Agar con tergitol - BCIG (PTX)

3. Siembra:• Sembrar en una placa Petri 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre.• Repetir la operación con 1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales.• Verter 15 mL de PTX a 45°C - 47°C.• Mezclar y dejar solidificar.• Incubar a 44°C ± 1°C durante 18 h - 24 h.

NOTA: En caso de sospechar la presencia de Escherichia coli estresados, es conveniente realizar una primera incubación a 37°C ± 1°C durante 4 h y luego la incubación a 44°C ± 1 °C durante 18 h - 20 h.

4. Recuento:• Contar las colonias características de Escherichia coli /3-glucuronidasa positivos (de color

azul) en las placas que contengan menos de 150 colonias características y no características.

5. Expresión de resultados 20:• Retener las placas que contengan menos de 150 colonias al nivel de dos diluciones suce

sivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias características.

• Calcular el número N de Escherichia coli /3-glucuronidasa positivos mediante la expresión:

-° Consultar el PNT - AL - 002 de expresión de resultados.

MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTODE Escherichia coü {3-GLUCURONIDASA POSITIVOS

PNT - AL - 0X4 Basado en la norma NF V 08-053 (Diciembre 1993)

1 mL 1 mL 1 mL

10“3(l< n

Verter en 15 mL de PTX a 45°C-47°C Mezclar y dejar solidificar


10°(10-*)

10-2( 10-3)

90 MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE AUMENTOS

MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE ESTAFILOCOCOSCOAGULASA POSITIVOS (CPS). TÉCNICA POR RECUENTO DE COLONIAS

PNT - AL - 015.1 Basado en la norma ISO 6888-1 (Febrero 1999)

1. Deñnición:Estafilococos coagulasa-positivos (CPS)'. Bacterias que forman colonias características y/ono características en la superficie de un medio de cultivo selectivo, y que dan una reacciónpositiva en la prueba de la coagulasa cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:Medio de Baird-Parker (BP).Caldo de cerebro-corazón (BHI).

3. Reactivo:Plasma de conejo.

4. Siembra:• Sembrar por duplicado 0,1 mL de la muestra líquida o 0,1 mL de dilución madre en dos

placas Petri con medio BP.• Repetir esta operación con 0,1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales21.• Extender con asa de Drigalsky.• Tapar y dejar absorber durante 15 min. a T ambiente.• Incubar durante 24 h - 48 h a 37°C ± 1°C.

5. Recuento:• Después de 24 h ± 2 h de incubación, marcar en la placa las colonias características (de 1

a 1,5 irnn de diámetro, negras o grises, brillantes y convexas, rodeadas de una zona clara).• Incubar durante 24 h ± 2 h más.• Marcar las colonias características (de 1,5 a 2,5 mm de diámetro; parte de la zona clara

puede volverse opaca y estar en contacto con las colonias), y también las colonias no características (éstas pueden no tener zona clara).

• Retener las placas que tengan un máximo de 300 colonias, con 150 colonias características y no características al nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias.

2! Para recuentos bajos se puede sembrar 1 mL en una placa de 140 mm o en tres placas de 90 mm (por duplicado).

PROCEDIMIENTOS DE MÉTODOS DE ANÁUSIS DE ALIMENTOS 91

6. Confirmación:• Elegir al azar de cada placa seleccionada:

— 5 colonias características si sólo hay colonias características.— 5 colonias no características si sólo hay colonias no características.— 5 colonias características y 5 colonias no características si están presentes ambos tipos.— Si hay menos de 5 colonias, de cualquier tipo, elegirlas todas.

• Sembrar en un tubo con BH1.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.• Añadir 0,1 mL de cada cultivo a tubos con 0,3 mL de plasma de conejo.• Incubar a 37°C ± 1°C.• Examinar la coagulación del plasma al cabo de V2 h, 1 h, 4 h, 6 h y, si es negativo, hasta

las 24 h ± 2 h de incubación. Consideramos la reacción positiva cuando el coágulo ocupa más de V2 del volumen ocupado inicialmente por el líquido.

NOTA: Realizar un control negativo añadiendo 0,1 mL de BHI estéril al plasma de conejo e incubar sin sembrar y un control positivo con CPS.

7. Expresión de resultados**:• Calcular el número a de estafilococos coagulasa positivos identificados por placa retenida

mediante la expresión:

Calcular el número N de estafilococos coagulasa positivos identificados presentes en la muestra problema mediante la expresión:

JAN = ----------—----------V -(/i,+0 ,l-/i2)-rí


92 M ÉTOD O S DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIM ENTOS


PNT - AL - 015.1 Basado en la norma ISO 6888-1 (Febrero 1999)

D IA 1

D IA 2

D IA 4

1 mL 1 mL 1 m L

^ 0 0 0M uestra líqu ida 10°

D ilución m adre (10-1)o10 m L

ío-1(ío-2)

1 mL

io-2( 10~3)

1 m L

10-3(10-*)01 m LI oo oo"oo oo

10°

(10-1)10-*

(10-2)10-2

(10-3)10-3

(10-*)Tapar y dejar absorber durante 15 min

Incubar durante 24 h ± 2 h a 37°C ± 1°C

Marcar las colonias características

10°

(10-1)10- '

(10-2)Incubar durante 24 h ± 2 h a 37°C ± 1°C

IO"2(10-3)

10-3( 10- )

D IA 3 ■ C

Marcar las colonias características y no características Retener las placas que tengan menos de 150 colonias

Sembrar en BHI (según caso) CONTROL ®

\ 0 0 0 0 0 0 Incubar durante 24 h ± 2 h a 37°C ± 1°C

CONTROL © CONTROL © 0,1 m L de cada cultivo 0,1 m L B H I estéril0 0 0 0 0 0 U

Incubar a 37°C ± 1°C Examinar la coagulación al cabo de Vi h, 1 h, 4 h, 6 h (hasta 24 h ± 2 h)




PNT - AL - 015.2 Basado en la norma ISO 6888-2 (Abril 1999)

1. Definición:Estafilococos coagulasa-positivos (CPS): Bacterias que forman colonias características en el medio de agar selectivo de plasma de conejo y fibrinógeno cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:Agar con plasma de conejo y fibrinógeno (RPF).

3. Siembra:• Sembrar por duplicado 1 mL de la muestra líquida o 1 mL de dilución madre en dos pla

cas Petri.• Repetir esta operación con 1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales.• Verter en cada placa unos 3 mm de RPF a 47°C ± 0,5°C 23.• Mezclar el inóculo con el medio y dejar que solidifique.• Tapar y dejar absorber durante 15 min a T ambiente.• Incubar durante 18 h - 24 h a 37°C ± 1°C (+ 18 h - 24 h si es necesario).

4. Recuento:• Retener las placas que contengan que contengan un máximo de 300 colonias, con 100 co

lonias características al nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias características.

• Contar las colonias características de cada placa, que en RPF pequeñas, negras o grises, o incluso blancas, están rodeadas de un halo de precipitación que indica la presencia de coagulasa.

5. Expresión de resultados24:Calcular el número N de estafilococos coagulasa positivos presentes por mililitro o por gramo de producto con la expresión:

YjCN = --------- — ----------V (n, +0,1 n2) d

23 Añadir el suplemento a la base en el momento de preparar las placas.24 Consultar el PNT - AL - 002 de expresión de resultados.



PNT - AL - 015.2 Basado en la norma ISO 6888-2 (Abril 1999)

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Muestra líquida 10° Dilución madre (10-1)

10-*(10-2)

I(H(10-3)

10-’(10©

10"*( 10©

1 mLoo10°

(10-1)

1 mLoo10-'

(10-2)

1 mLoo10-2

(10-3)

1 mLooIO"3

(IO-»)

1 mLoo10-3

(10-»)Verter unos 3 mm de RPF a 47°C ± 0,5°C Mezclar y dejar absorber durante 15 min

Incubar durante 18 h-24 h a 37°C ± 1°C (+18 h-24 h si es necesario)


10°

(10-»)10-'

(ío-2)io-2

(io-3)10-3

(10-»)1CH

(ío-5)Lectura y expresión de resultados


MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE ESTAFILOCOCOSCOAGULASA POSITIVOS (CPS). TÉCNICA CON CONFIRMACIÓN DE COLONIAS

P N T -A L -016.1 Basado en la norma NF V 08-057-1 (Noviembre 1994)

1. Definición:Estafilococos coagulasa-positivos (CPS): Bacterias que forman colonias características y no características en la superficie de un medio de cultivo selectivo, y que dan una reacción positiva a la coagulasa cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:Medio de Baird-Parker (BP).Caldo cerebro-corazón (BHI).

3. Reactivo:Plasma de conejo.

4. Siembra:• Sembrar 0,1 mL de muestra líquida o 0,1 mL de dilución madre en una placa Petri con BP.• Repetir la operación con 0,1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales25.• Extender con asa de Drigalsky.• Tapar y dejar absorber durante 15 min. a T ambiente.• Incubar durante 24 h - 48 h a 37°C ± 1°C.

5. Recuento:• Después de 24 h ± 2 h de incubación, marcar en la placa las colonias características (de 1

a 1,5 mm de diámetro, negras o grises, brillantes y convexas, rodeadas de una zona clara).• Incubar durante 24 h ± 2 h más.• Marcar las colonias características (de 1,5 a 2,5 mm de diámetro; parte de la zona clara

puede volverse opaca y estar en contacto con las colonias), y también las colonias no características (éstas pueden no tener zona clara).

• Retener las placas que tengan menos de 150 colonias características y nó características al nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una de las placas contenga un mínimo de 15 colonias.

25 Para recuentos bajos se puede sembrar 1 mL en una placa de 140 mm o en tres placas de 90 mm (por duplicado). En este caso, realizaremos las operaciones de recuento y confirmación sobre el conjunto de estas placas.


6. Confirmación• Elegir al azar 3 colonias características de cada placa seleccionada (opcionalmente también

3 colonias no características) y sembrar en un tubo con BHI.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.• Añadir 0,1 mL de cada cultivo a tubos con 0,3 mL de plasma de conejo.• Incubar a 37°C ± 1°C.• Examinar la coagulación del plasma al cabo de V2 h, 1 h, 4 h, 6 h y, si es negativo, hasta

las 24 h ± 2 h de incubación. Consideramos la reacción positiva cuando el coágulo ocupa más de 3A del volumen ocupado por el líquido.

NOTA: Realizar un control negativo añadiendo 0,1 mL de BHI estéril al plasma de conejoe incubar sin sembrar y un control positivo sembrando CPS.

7. Expresión de resultados27:• Calcular el número a de estafilococos coagulasa positivos identificados por placa retenida

mediante la expresión:

Calcular el número N de estafilococos coagulasa positivos identificados presentes en la muestra problema mediante la expresión:

LaN = ------------

V - U d

26 Realizar la prueba de la catalasa (facultativa), reteniendo las colonias catalasa ©.27 Consultar el PNT - AL - 002 de expresión de resultados.


MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE ESTAFILOCOCOSCOAGULASA POSITIVOS (CPS). TÉCNICA CON CONFIRMACIÓN DE COLONIAS

PNT - AL - 016.1 Basado en la norma NF V 08-057-1 (Noviembre 1994)

1 mL 1 mL 1 mL

0 0 0Muestra líquida 10°

Dilución madre (10-)

' O '0,1 mL

10-(10-2)

10-2(10-3)

10-3( 10- )o o

0,1 mL 0,1 mL 0,1 mLO "O o10°

( 10- )10-'

(IO-2)10-2

(10-3)io

do-)Tapar y dejar absorber durante 15 min

Incubar durante 24 h ± 2 h a 37°C ± 1°C

Marcar las colonias característicasO O10°

(10-*)io

do-2)io

do-3)IO-3

oo-)Incubar durante 24 h ± 2 h a 37°C ± 1°C

Marcar las colonias características y no características Retener las placas que tengan menos de 150 colonias

Elegir 3 colonias de cada placa y tipo y sembrar en BHI CONTROL 0

\ 0 0 0 0 0 0Incubar durante 24 h ± 2 h a 37°C ± 1°C

0,3 mL plasma de conejo

CONTROL © CONTROL © 0,1 mL de cada cultivo 0,1 mL BHI estéril000000 o

Incubar a 37°C ± 1°C Examinar la coagulación al cabo de V2 h, 1 h, 4 h, 6 h (hasta 24 h ± 2 h)

\ 7Lectura y expresión de resultados


MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE ESTAFILOCOCOSCOAGULASA POSITIVOS (CPS). TÉCNICA SIN CONFIRMACIÓN DE COLONIAL


1. Definición:Estafilococos coagulasa-positivos (CPS): Bacterias que forman colonias características e ri un medio sólido selectivo con plasma de conejo y fibrinógeno cuando el ensayo se realiza se.gún el siguiente método.

2. Medio de cultivo:Agar con plasma de conejo y fibrinógeno (RPF).

3. Siembra:• Sembrar 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre en una placa Petri estéril.• Repetir la operación con 1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales.• Verter en cada placa unos 10 mL de RPF a 47°C ± 0,5°C28.• Mezclar el inóculo con el medio y dejar que solidifique.• Tapar y dejar absorber durante 15 min a T ambiente.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h (+ 18 h - 24 h si fuera necesario).

4. Recuento:• Contar las colonias características de cada placa, que son negras o grises, pequeñas y es

tán rodeadas de una zona opaca o turbia, indicativa de la presencia de coagulasa.• Retener las placas que contengan menos de 100 colonias características al nivel de d o s di

luciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias características.

5. Expresión de resultados 29:Calcular el número N de estafilococos coagulasa positivos por mililitro o por gramo c o n la expresión:

YTN =

1 , 1 d

28 Añadir el suplemento a la base en el momento de preparar las placas.29 Consultar el PNT - AL - 002 de expresión de resultados.

PROCEDIMIENTOS DE MÉTODOS DE ANÁUSIS DE AUMENTOS 99

MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE ESTAFILOCOCOSCOAGULASA POSITIVOS (CPS). TÉCNICA SIN CONFIRMACIÓN DE COLONIAS


1 mL 1 mL 1 mL

O O O1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

10°(ío-1) (io-2) (io-3)

10-3(ío-1)

Verter en cada placa 10 mL de RPF Mezclar e incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h-24 h

(+18 h-24 h si es necesario)


(10-J) (10-3)


(IO-)


MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTODE Bacillus cereus

PNT - AL - 017 Basado en la norma ISO 7932 (Enero 1994)

1. Definición:

Bacillus cereus: Microorganismos lecitinasa © que no fermentan el manitol cuando el análisis se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:Agar manitol yema de huevo con polimixina (MYPA).Agar glucosado (AG).Medio Voges-Proskauer (MR-VP).Medio nitrato (MN).

3. Reactivos:• Reactivos para la reacción de Voges-Proskauer (VP):

— solución de a-naftol.— solución de hidróxido potásico.— cristales de creatina.

• Reactivos para la investigación de nitritos:— solución de 5-2 ANSA.— solución de ácido sulfanflico.— solución de ácido acético.— zinc en polvo.

4. Siembra:• Sembrar por duplicado 0,1 mL de muestra líquida o 0,1 mL de dilución madre una placa

de MYPA.• Extender con asa de Drigalski.• Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales30.• Tapar y dejar absorber durante unos 15 min. a T ambiente.• Incubar a 30°C ± 1°C durante 18 h - 24 h (+ 24 h si es necesario).

5. Recuento:• Retener las placas que contengan menos de 150 colonias, si es posible al nivel de 2 dilu

ciones sucesivas. Es necesario que una placa contenga un mínimo de 15 colonias características.

• Contar las colonias de presuntos Bacillus cereus (grandes, rosadas, que no fermentan manitol y casi siempre rodeadas de una zona de precipitado).

NOTA: Si las placas contienen un gran número de microorganismos manitol ©, el color rosado característico puede desaparecer.

30 Para recuentos bajos se puede sembrar 1 mL en una placa de 140 mm o en tres placas de 90 mm (por duplicado).

PROCEDIMIENTOS DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE AUMENTOS 101

6. Confirmación:• Elegir al azar 5 colonias de presuntos Bacillus cereus de cada placa seleccionada (si hay

menos de 5 elegirlas todas) y sembrar— Por picadura en los tubos de AG, regenerado (10 min en agua hirviendo).— Por emulsión en tubos de MR-VP.— Por emulsión en tubos de MN a 30°C (1°C.

• Incubar a 30°C (1°C durante 24 h (+ 24 h para MR-VP).

7. Lectura:AG:Interpretación: Positivo cuando aparece coloración amarilla.MR-VP:• Transferir de cada tubo 1 mL de cultivo a un tubo vacío.• Añadir 0,2 mL de solución de hidróxido de potasio, 0,6 mL de solución de (-naftol y al

gunos cristales de creatina.• Mezclar enérgicamente y dejar reposar durante 1 h.Interpretación: Una coloración rosa eosina en la superficie del tubo indica reacción positiva.MN:• Añadir a cada tubo de 0,2 a 0,5 mL de reactivo completo para la investigación de nitritos.Interpretación: Consideramos nitritos (si aparece una coloración roja. Generalmente la reacción es instantánea; si no aparece coloración roja en 15 minutos, añadir zinc en polvo, y si a los 10 minutos no se colorea, consideramos la prueba positiva.

8. Interpretación de las pruebas bioquímicas: Bacillus cereus es:

Manitol en MYPA ©Lecitina en MYPA 0Glucosa 0Voges-Proskauer 0Nitritos 0

9. Expresión de resultados31:• Si al menos un 80% de las colonias seleccionadas son confirmadas, tomar como número

de Bacillus cereus el obtenido en el recuento (ver punto 5). En los demás casos, se calcula el porcentaje de los confirmados entre los seleccionados.

• Calcular el número N de microorganismos por mililitro o por gramo con la expresión:

EaN = --------—--------(/i, +0 ,l-/i2)-d


102 M ÉTO D O S DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIM ENTO S

M ÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTODE Bacillus cereus

PNT - AL - 017 Basado en la norm a ISO 7932 (Enero 1994)

DIA 1

DIA 2

DIA 3

1 mL 1 mL 1 mL

Muestra líquida 10° Dilución madre (10_l)

iO

0,1 mL

10°

(10-')

ío-1 io-2 io-3(io-2) (io-3) (ío-*)o

0,1 mL 0,1 mL 0,1 mLMYPA

10-'(10-2)

10-2(10-3)

10~3(10-4)

Tapar y dejar absorber durante 15 min Incubar a 30°C ± 1°C durante 18 h-24 h (+ 24 h si es necesario)

< >Retener las placas con menos de 150 colonias

f v v S I C*S5úl

10°(10-«)

10-2( 10-3)

10- '

( 10-2)

Contar las colonias de presuntos B. cereus r ~ ~ i

10 -3(10-4)

Elegir al azar 5 colonias presuntas de cada placa y sembrar en:

\ eMR-VP AG (regenerado) MN (a 308C ± 1°C)

Incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h (+ 24 h para MN-VP)

1 mL

+ reactivos11 e + reactivos

VP 0 si aparece coloración rosa

AG 0 si aparece coloración amarilla

Nitritos 0 si aparece coloración roja o si

después de añadir Zn no se colorea


7. Expresión de resultados14:• Retener las placas que contengan un máximo de 150 colonias características y no carac

terísticas al nivel de dos diluciones sucesivas (una placa debe contener un mínimo de 15 colonias características).

• Calcular el número N de Enterobacteriaceae identificadas (oxidasa © y glucosa ©) mediante la expresión:

Calcular el número N de Enterobacteriaceae identificados presentes en la muestra problema, como media ponderada a partir de dos diluciones sucesivas, con la expresión:

Xa N — ———1,1 d


PROCEDIMIENTOS DE MÉTODOS DE ANÁLISIS DE AUM ENTOS 79

MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO SIN REVIVIFICACIÓNDE Enterobacteriaceae. TÉCNICA POR RECUENTO DE COLONIAS

PN T - AL - 009 Basado en la norm a N F V 08-054 (O ctubre 1993)

1 mL 1 mL 1 mL

01 mLO

01 mLO

01 mLO I mLO

10°(10-')

10-1(10-2)

10-2(10-3)

10 3 (10-1)

Verter 15 mL de VRI5G a 45°C-47°C Cubrir con unos 5 mL de VRBG


RecuentoRetener las placas con menos de 150 colonias

m mKa&í&í)

10°(10-1)

10*(102)

io-2(io-3)

103 ( 104)

Contar las colonias de presuntas EnterobacteriaceaeI

Tomar 5 colonias característicasde cada placa y sembrar en AN


80 MÉTODOS DE ANÁLISIS MICRO BIOLÓGICOS DE AUMENTOS

MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES.TECNICA DEL NMP

PNT - AL - 010 Basado en la norma ISO 4831 (Jnlio 1991)

1. Definición:Coliformes: Bacterias que a 30°C son capaces de fermentar la lactosa con producción de gas cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:Caldo de triptona lauril sulfato (TSL).Caldo lactosado biliado verde brillante (BGBL).

3. Siembra:• Sembrar 10 mL de muestra líquida o ÍO mL de dilución madre en tres tubos de TSL a do

ble concentración.• Sembrar 1 mL de la muestra líquida o 1 mL de dilución madre en tres tubos de TSL a sim

ple concentración.• Repetir esta operación con las siguientes diluciones decimalesI5.• Incubar a 30°C ± 1°C durante:

— 24 h ± 2 h en tubos de concentración doble.— 2 4 h ± 2 h ó 4 8 h ± 2 h e n tubos de concentración simple.

• Realizar lecturas al cabo de 24 h y 48 h .

4. Confirmación:• Retener los tubos que presentan formación de gas.• A partir de cada tubo con gas, sembrar con asa de Kolle en BGBL.• Incubar a 30°C ± 1°C, realizando lecturas al cabo de 24 h ± 2 h (+ 24 h si es necesario).• Consideramos la reacción positiva si se produce desprendimiento de gas.

5. Expresión de resultados16z• Contar el número total de tubos con producción de gas.• Retener 3 diluciones, según el caso:

a) Cuando al menos una dilución presenta 3 tubos positivos, elegir la más diluida que presente los 3 tubos positivos y las dos diluciones siguientes con tubos positivos.

b) En caso contrario, elegir las tres diluciones más diluidas que contengan al menos un tubo positivo.

• Determinar el NMP con la ayuda de una tabla.

15 Realizar un número de diluciones suficiente para que todos los tubos de la última dilución sean negativos.


MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES.TÉCNICA DEL NMP


1 mL 1 mL 1 mL

Muestra líquida 10° Dilución madre (10"')

10-'(io-2)

10-2 io-3(lo-3) ( l< no o

1 mL

TSL a doble concentración

1 mL 1 mL 1 mL 1 mLTSL a simple concentración

A 10J101 0 A 10) A 00 A IQJ IQJIQJIÜJ10°

(ío-1)10- '

(IO-2)ío-2

(10-3)10-3

(10- )

Incubar a 30°C ± 1°C durante 2 4 h ± 2 h ( + 2 4 h s i e s necesario)

VSembrar a partir de los tubos con gas en BGBL

0 A . ÜJIQJ I0JIQJI0J ÍIüJIÜJ10°

(10-')10-' 10-2 IO-3

(10-2) (10-3) (10-)

Incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+ 24 h si es necesario)

Contar el número de tubos con producción de gas Determinar el NMP

* Introducir el asa dos veces, sin agitar.

MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENCO DE Bacillus cereus

PNT-AL-018 Basado en la nonnaXPV 08-058 (Nortembre 1995)

1. Definición:Bacillus cereus: Microorganismos lecidnasa © que no fermenta*1 el manitol cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:Agar manitol yema de huevo con polimixina (MYPA).Agar sangre (AS).Agar movilidad (AM ).

3. Siembra:• Sembrar 0,1 mL de muestra líquida o 0,1 mL de dilución mad*® en una placa de MYPA.• Extender con asa de Drigalski.• Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales 3*~• Tapar y dejar absorber durante unos 15 min a T ambiente.• Incubar a 30°C ± 1°C durante 18 h - 24 h (+ 24 h si es necesaí10)-

4. Recuento:• Retener las placas que contengan menos de 150 colonias, si es posible al nivel de 2 dilu

ciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga m mínimo de 15 colonias características.

• Contar las colonias de presuntos Bacillus cereus (grandes, rosad38* <lue no fermentan manitol y casi siempre rodeadas de una zona de precipitado).

NOTA: Si las placas contienen un gran número de microorganismo® ©* el color rosado característico puede desaparecer.

5. Confirmación:• Elegir al azar 3 colonias de presuntos Bacillus cereus de cada p*30® seleccionada (si hay

menos de 3, elegirlas todas) y sembrar— Estrías paralelas en AS (prueba de la hemólisis)— Por picadura en AM (prueba de la movilidad)

• Incubar a 30°C ± 1°C durante 18 h - 24 h.

32 Para recuentos bajos se puede sembrar 1 mL en una placa de 140 mm o e11 tres placas de^m m .33 La movilidad se pone en evidencia por el desarrollo bacteriano a lo largo tubo y 611 p™unoiaad a

partir del punto de picadura.

6, Interpretación:Bacillus cereus presenta las siguientes características:

104_______________ MÉTgBBB M ANALI8I9 MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

Medio de cultivo

Resultados confirmandoBacillus cereus

MYPA Formación de colonias típicas

Agar sangre Bacillus cereus es muy hemolítico

Agar movilidad Bacillus cereus es móvil

7. Expresión de resultados M:

Si al menos un 80% de las colonias seleccionadas son confirmadas, tomar como número de Bacillus cereus el obtenido en el recuento (ver punto 5). En los demás casos, se calcula el porcentaje de los confirmados entre los seleccionados.

• Calcular el número a de Bacillus cereus presentes con la expresión:

* = A .CA

• De las placas con menos de 150 colonias, calcular el número N de colonias de Bacillus cereus por mililitro o por gramo con la expresión:

N — --------(n, + 0,1 * /i2) • d



M ÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTODE Bacillus cereus

PNT - AL - 018 Basado en la norma XP V 08-4158 (Noviembre 1995)

1 mL 1 mL 1 mL

Muestra líquida 10° 10"1Dilución madre (10-1) (10“2)

10"2(10“3)

io-3do-»)

0,1 mL&

0,1 mLO 'O0,1 mL 0,1 mL

MYJPA

10°(10-')

10“ »

(10-2)10-2

(10-3)10-3

(10-4)Tapar y dejar absorber durante 15 min

Incubar a 30°C ± 1°C durante 18 h-24 h (+ 24 h si es necesario)


10° 10-’(10

10-2 10-J(10-3) (lo*)

Contar las colonias de presuntos B. cereus

Elegir al azar 3 colonias presuntas de cada placa y sembrar en:

Tv-/AS AMIncubar a 30°C ± 1°C durante 18 h-24 h



M ÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTODE Clostridium perfringens.

PNT - AL - 019 Basado en la norm a EN 13401 (Abril 1999)

1. Definición:

Clostridiwn perfringens: Bacterias que forman colonias características (rodeadas de un halo negro) en el medio selectivo especificado, y que dan reacciones de confirmación positivas cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. M edios de cultivo:Agar triptona-sulfito con cicloserina (TSC).Medio tioglicolato (TIO).M edio lactosa sulñto (LS).

3. Reactivos:M etabisulfito sódico al 1,2%.Citrato férrico amoniacal al 1%.

4. Siem bra:• Sembrar por duplicado 1 mL de muestra líquida o 1 mL dilución madre en placas Petri es

tériles.• Repetir la operación con las siguientes diluciones decim ales.• Verter en cada placa unos 15 mL de TSC a 47°C ± 0,5°C 35.• Mezclar el inóculo con el medio y dejar que solidifique.• Añadir 10 mL del mismo medio y dejar solidificar.• Incubar a 37°C ± 1 °C durante 20 h ± 2 h en jarras para anaerobios.

5. Recuento:• En las placas que contengan menos de 150 colonias, contar las colonias negras de pre

suntos Clostridium perfringens, si es posible al nivel de 2 diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias.

6* Confirm ación:• Elegir al azar 5 colonias características de cada placa seleccionada (si hay menos de 5 ele

girlas todas) y sembrar con pipeta Pasteur en medio TIO regenerado (10 minutos en agua hirviendo).

• Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h en jarras para anaerobios.• Transferir 5 gotas al medio LS regenerado (10 minutos en agua hirviendo).• Añadir 0,5 mL de cada uno de los reactivos (recién preparados).• Incubar en un baño de agua a 46°C ± 0,5°C durante 18 h - 24 h.

35 Entre la siembra y esta operación no deben transcurrir más de 15 minutos.


7. Lectura:Considerar positivos los tubos que presentan más de '/4 de gas en la campana Durham y que tengan un precipitado negro.

NOTA: En caso de duda, transferir 5 gotas del cultivo en el medio LS a otro tubo con el mismo medio. Incubar a 46°C ± 0,5°C durante 18 h - 24 h en un baño de agua e interpretar según lo descrito.

8. Interpretación:Consideramos que las bacterias que forman colonias negras características en el medio TSC y que se confirman positivamente en el medio LS son Clostrídium perfringens.

9. Expresión de resultados• Calcular el número a de colonias de Clostrídium perfringens presentes con la expresión:

De las placas con menos de 150 colonias, calcular el número N de colonias de Clostrídium perfringens por mililitro o por gramo con la expresión:

l aN{n{ + 0 , l / i2) d



M ÉTO DO HORIZONTAL PARA EL RECUENTODE Clostridium perfringens .

PNT - AL - 019 Basado en la norm a EN 13401 (Abril 1999)

1 mL 1 mL 1 mL

Dilución madre (10~!)o1 mL

(10-2)

01 mL

(10-3)o1 mL

(10 )

' O '1 mL

10°(10-')

lo-'(1(H)

I0-2( 10-3)

10-3(10-*)

En menos de 15 min, verter 15 mL de TSC a 47°C ± 0,5oC Cubrir con 10 mL de TSC

Incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h ± 2 h enjarras para anaerobiosFF-Retener las placas con menos de 150 colonias

10°(10-')

10-' 10-2(10-2) (10-3)

Contar las colonias negras

io-3(ío -1)

cFF~

Elegir 5 colonias de cada placa y sembrar en medio TIO regenerado

\ B B B B BIncubar a 37°C ± 1°C durante 18 h-24 h en jarras para anaerobiosFF7

Transferir con pipeta Pasteur 5 gotas al medio LS regenerado

reactivos

Incubar a 46°C ± 0,5°C durante 18 h-24 h en un baño de agua



MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTODÉ Clostrídium perfringens.

PNT - AL - 020 Basado en la norma NF V 08-056 (Abril 1994)

1. Definición:

Clostrídium perfringens: Bacterias que forman colonias negras en el medio selectivo especificado y .qué dan reacciones de confirmación positivas cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:Agar triptosa-sulfito con cicloserina (TSC).Medio tioglicolato (TIO).Medio lactosa sulfito (LS).

3. Reactivos:Metabisulfito sódico al 1,2%.Citrato férrico amoniacal al 1%.

4. Siembra:• Sembrar 1 mL de muestra líquida o 1 mL de dilución madre en una placa Petri estéril.• Repetir la operación con las siguientes diluciones decimales.• Verter en cada placa unos 15 mL de TSC a 47°C (0,5°C)37.• Mezclar el inóculo con el medio y dejar que solidifique.• Añadir unos 10 mL del mismo medio y dejar solidificar.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h ± 2 h en jarras para anaerobios.

5. Recuento:• En las placas que contengan menos de 150 colonias, contar las colonias negras de pre

suntos Clostrídium perfríngenSi si es posible al nivel de 2 diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias.

6. Confirmación:• Elegir al azar 3 colonias características de cada placa seleccionada y sembrar con pipeta

Pasteur en medio TIO regenerado (10 minutos en agua hirviendo)38.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h ± 2 h enjarras para anaerobios.• Transferir 5 gotas al medio LS regenerado (10 minutos en agua hirviendo).• Añadir 0,5 mL de cada uno de los reactivos (recién preparados).• Incubar en un baño de agua a 46°C ± 0,5°C durante 24 h ± 2 h.

37 Entre la siembra y esta operación no deben transcurrir más de 15 minutos.38 Si no es posible seleccionar colonias características bien aisladas, sembrar 3 grupos de colonias en el

medio TIO. Incubar en anaerobiosis a 37°C ± 1°C durante 20 h ± 2 h y aislar en placas con TSC (ver punto 3). Escoger de cada placa al menos una colonia característica aislada y confirmar.


7. Lectura:Considerar positivos los tubos que presentan más de 1/3 gas en la campana Duitiam y que tengan un precipitado negro.

NOTA: En caso de duda, transferir 5 gotas del cultivo en el medio LS a otro tubo con el mismo medio. Incubar a 46°C ± 0,5°C durante 18 h - 24 h en un baño de agua e interpretar según lo descrito.

8. Interpretación:Consideramos que las bacterias que forman colonias negras características en el medio TSC y que se confirman positivamente en el medio LS son Clostridium perfringens.

9. Expresión de resultados39:• Calcular el número a de colonias de Clostridium perfringens por mililitro o por gramo con

la expresión:

De las placas con menos de 150 colonias, calcular el número N de colonias de Clostridium perfringens por mililitro o por gramo con la expresión:

N = *1,1'd



MÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTODE Clostridium perfringens.

PNT - AL - 020 Basado en la norma NF V 08-056 (Abril 1994)

1 mL 1 mL 1 mL

Dilución madre (10-1)

■ Q r1 mL

(10-2)

1 mL

(io-5)

01 mL

(10-*)

■ O1 mL

10°oo-1)

10-»

(io-2)io-2

(io-3)10-3

(ífr4)

En menos de 15 min, verter 15 mL de TSC a 47°C ± 0,5°C Cubrir con 10 mL de TSC

Incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h ± 2 h en jarras para anaerobios


10°

(10-1)10- '

( 10-2)10-2

( 10-3)10- ’

( 10 )Contar las colonias negras

Elegir 3 colonias de cada placa y sembrar en medio TIO regenerado

Incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h ± 2 h en jarras para anaerobios

Transferir con p peta Pasteur 5 gotas al medio LS regenerado

0 0 0 + reactivos

Incubar a 46°C í 0,5°C durante 24 h ± 2 h en un baño de agua

\ 7Lectura y expresión de resultados

112 MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓG1COS DE ALIMENTOS

M ÉTO D O H O RIZO NTAL PA RA LA INVESTIG ACIÓND E Salm onella

PN T - AL - 021 Basado en la norm a ISO 6579 (D iciem bre 1993)

1. D efinición:Salmonella: Microorganismos que forman colonias características en los m edios selectivos especificados, y que tienen las características bioquímicas y serológicas descritas cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. M edios de cultivo:Agua de peptona tamponada (APT).Caldo con verde de malaquita y cloruro de m agnesio o de Rappaport-Vassiliadis m odificado (RV).Caldo selenito-cistina (SC).Agar rojo fenol y verde brillante (BGA).M edio Hektoen (HK).Agar nutritivo (A N ).Agar Kligler.Agar nutritivo sem isólido (A N S).

3. R eactivos:Solución salina (SS).Reactivo para la investigación de la jS-galactoxidasa (ONPG).Solución de fenilalanina al 0,5% (FA).Solución de cloruro férrico al 10%.Galerías miniaturizadas de orientación e identificación bioquímica (API).

4 . Sueros:Antisueros polivalentes «O», «V¡» y «H».

5. Siem bra:Pre-enriquecimiento:• Preparar la dilución madre añadiendo 225 mL de APT a 25 mL o 25 g de muestra.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 16 h - 20 h.Enriquecimiento:• Sembrar 0,1 mL del cultivo en un tubo con 10 mL de RV.• Sembrar 10 mL del cultivo en un fiasco con 100 mL de SC.• Incubar el tubo de RV a 42°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.• Incubar e l fiasco de SC a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (4-24 h si es necesario). Aislamiento 40:• Aislar en placas de BGA a partir de cada tubo de RV incubado durante 24 h ± 2 h.• Realizar la misma operación en HK.• Aislar en placas de BGA a partir de cada frasco de SC 4t incubado durante 24 h ± 2 h.• Realizar la misma operación en HK.

40 Si tras 20 h - 24 h de incubación el crecimiento es débil o no aparecen colonias típicas de Salmonella, incubar de nuevo las placas a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h.

41 No agitar el frasco de SC.


• Incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h - 24 h (+ 24 h si es necesario).• Aislar en placas de BGA a partir de cada frasco de SC incubado durante 48 h ± 2 h.• Aislar en placas de HK a partir de cada irasco de SC incubado durante 48 h ± 2 h.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h - 24 h (+ 24 h si es necesario).

6. Confirmaciones:• Retener de cada aislamiento 5 colonias típicas o sospechosas de Salmonella (si en algu

na placa hay menos de 5, elegirlas todas), que sobre BGA son incoloras o rosas, con un halo rojo y sobre Hektoen son verde-azulado con un centro negro.

• Sembrar en placas de AN.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h42.Pruebas bioquímicas:• KLIGLER

• Sembrar las colonias seleccionadas en estría y por picadura.• Incubar a 37°C ± I°C durante 24 h ± 2 h. Consideraremos los siguientes resultados:

Base Amarillo Glucosa 0

Rojo o sin cambio de color Glucosa 0

Negro Formación de HZS

Burbujas o fisuras Formación de gas a partir de la glucosa

Pendiente Amarillo Lactosa 0

Rojo o sin cambio de color Lactosa 0

Interpretación: Los cultivos típicos de Salmonella responden a una pendiente roja con o sin formación de gas y base amarilla, con formación de H2S en un 90% de los casos43.

* INVESTIGACIÓN DE LA 0-GALACTOSIDASA• Emulsionar el cultivo en 0,25 mL de SS.* Añadir 0,25 mL de ONFG.■ Mezclar e incubar en a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h, haciendo lecturas al cabo de

'/2 h, 1 h, 2 h y 24 h.

Interpretación: Cuando la reacción es positiva aparece una coloración amarilla.NOTA 1: En caso de obtener un Kligler lactosa 0 o una /J-galactosidasa 0 que al mismo tiempo presente formación de sufhídrico, sembrar en medio lisina-hierro para descartar así las salmonelas del grupo Illa y mb.

* INVESTIGACIÓN DE LA FENILALANINA DES AMINAS A* Emulsionar el cultivo en 0,5 mL de APT.* Añadir 0,5 mL de FA.• Mezclar e incubar en a 37°C ± 1 °C durante 4 h.• Añadir una gota de cloruro férrico al 10%.

42 Si fuera necesario, volver a aislar en AN e incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h - 24 h.43 Existen algunas cepas de Salmonella lactosa © . En este caso, una confirmación preliminar de Sal

monella no debe basarse únicamente en los resultados obtenidos en el Kligler.

I R MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE A L I M E N T O S

Interpretación: Cuando la reacción es positiva aparece una coloración verde espinaca, mientras que cuando ésta es negativa, el color que aparece es am arillo.

• GALERÍA DE IDENTIFICACIÓN 44• Realizar una emulsión en SS.• Sembrar según las indicaciones del fabricante.Interpretación: Comparar los resultados obtenidos con el patrón dé colores y consultar el índice analítico y/o el «software» APILAB PLUS.

Pruebas serológicas:* ELIMINACIÓN DE LAS CEPAS AUTO-AGLUTINABLES

• Depositar una gota de SS sobre un portaobjetos.• Hacer una emulsión del cultivo sospechoso.• Remover durante 30 s - 60 s.Interpretación: La cepa es auto-aglutinable si se forman agrupamientos irregulares, de manera que no puede realizar la identificación serológica.

* ESTUDIO DE LOS ANTÍGENOS «O» y «V¡»• Hacer una emulsión del cultivo puro en una gota de cada uno d e los sueros polivalen

tes sobre un portaobjetos45.• En caso de no obtener un resultado positivo, hacer una em ulsión del cultivo puro en

una gota de antisuero «V¡» sobre un portaobjetos45.• Remover durante 30 s - 60 s.• Realizar las pruebas con los sueros monovalentes «O» correspondientes al suero po

livalente que ha dado positivo (según tabla del proveedor).Interpretación: La reacción se considera positiva si hay aglutinación.

* ESTUDIO DE LOS ANTÍGENOS «H»• Sembrar una colonia pura no auto-aglutinable en ANS.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h.• Hacer una emulsión del cultivo puro en una gota de antisuero «H», sobre un portaob

jetos45.• Remover durante 30 s - 60 s.Interpretación: La reacción se considera positiva si hay aglutinación.

7. Interpretación de las pruebas bioquímicas:Las colonias presuntivas de Salmonella presentan las siguientes características:■ Kligler típico.■ F A © .■ /3-galatosidasa © .■ API según perfil típico.

NOTA 2: Salmonella Typhi no produce gas de glucosa. Las subespecies nía y IUb pueden ser lactosa 0 o © , pero son siempre )3-galatosidasa © . Salm onella Paratyphi A da reacción negativa a la descarboxilación de la L-lisina. Así que para e l estudio de estas cepas puede ser útil realizar pruebas bioquímicas complementarías.

44 La norma permite realizar todas las pruebas bioquímicas con una galería miniatunzada (API).45 Utilizar los sueros polivalentes y monovalentes uno después del otro.


S. Interpretación de las pruebas serológicas:Las colonias presuntivas de Salmonella presentan las siguientes características:

Reaccionesbioquímicas

Auto-aglutinación Reacciones serológicas Interpretación

Típicas No Antígeno «O», «V¡» o «H» positivo SalmonellaTípicas No Negativo Posible SalmonellaTípicas Sí No realizadas Posible SalmonellaNo típicas No Antígeno «O», «V^ o «H» positivo Posible SalmonellaNo típicas No Negativo No Salmonella

9- Confirmación definitiva:Las cepas consideradas como Salmonella o como posible Salmonella deben ser enviadas a un centró especializado para la identificación de este microorganismo y la determinación definitiva del serotipo.

19* Expresión de resultados:Indicar la presencia/ausencia de Salmonella en 25 mL o 25 g de producto.

a 16 MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

MÉTODO HORIZONTAL PARA LA INVESTIGACIÓNDE Salmonella

PN T - A L -021 Basado en la norma ISO 6579 (Diciembre 1993)

DÍA 1

DÍA 2

DÍA 3

DÍA 4

DÍA 5

DÍA 6

25 mL o 25 g de muestra 225 mL de APT

!

0,1 mL~ ^ y10 mL

10 mL de RVIncubar a 42°C ± 1°C

durante 24 h ± 2 h

100 mL de SCIncubar a 37°C±1°C

durante 24 h ± 2 h (+24 h si es necesario)

BGA HKf f

BGA HK

Incubar a 37°C í 1°C durante 20 h-24 h (+24 h si es necesario)

BGA HK

Incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h-24 h (+24 h si es necesario)FFElegir 5 colonias de cada placa

Sembrar en AN


f f



PNT - AL - 021 Basado en la norma ISO 6579 (Diciembre 1993)

DIA 6

DIA 7

DÍA 8

AGAR KLIGLER


INVESTIGACIÓN DE LA P-GALACTOSIDASA*0,25 mL de ONPG

0,25 mL de SS

INVESTIGACIÓN DE LA FENILALANINA0,5 mL de FA 0,5 mL de SS

Incubar a 37°C ± 1°C, con lecturas al cabo de

'/2 h, 1 h, 2 h y 24 h

Incubar a 37°C ± 1°C durante 4 h

Añadir 1 gota de cloruro férrico

Si las pruebas de la p-galactosidasa y fenilalanina son © , realizar un API

ELIMINACIÓN DE LAS CEPAS AUTOAGLUTINAB LES

ESTUDIO DE LOS ANTÍGENOS

«o»durante 18 h-24 h

* Ver NOTA l,p ág . 113



PNT - AL - 022 Basado en la norma NF V 08-052 (Septiembre 1993)

1. Definición:Salmonella: Microorganismos que forman colonias características en los m edios selectivos especificados y que tienen las características bioquímicas y serológicas descritas cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:Agua de peptona tamponada (APT).Caldo con verde de malaquita y cloruro de magnesio o de Rappaport-Vassiliadis modificado (RV).Caldo selenito-cistina (SC).Medio Hektoen (HK).Agar nutritivo (AN).Agar Kligler.

3. Reactivos:Solución salina (SS).Reactivo para la investigación de la /3-galactoxidasa (ONPG).Solución de fenilalanina al 0,5% (FA).Cloruro férrico al 10%.Galerías miniaturizadas de orientación e identificación b i o q u í m i c a (API).

4. Suero:Antisuero «O».

5. Siembra:Pre-enriquecimiento:• Preparar la dilución madre añadiendo 225 mL de APT a 25 mL o 25 g de muestra (x mL

o x g de muestra + 9x mL de APT).• Incubar a 37°C ± 1°C durante 16 h - 20 h.Enriquecimiento:• Sembrar 0,1 mL del cultivo en un tubo con 10 mL de RV.• Sembrar 2 mL del cultivo en un tubo con 20 mL de SC.• Incubar el tubo de RV a 42°C ± 1 °C durante 18 h - 2 4 1.• Incubar el frasco de SC a 37°C ± 1 °C 18 h - 24 h.Aislamiento 46:• Aislar en placas de HK a partir de cada tubo de RV.• Aislar en placas de HK a partir de cada tubo de SC47.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h (+ 24 h si es necesario).

46 Si tras 20 h - 24 h de incubación el crecimiento es débil o no aparecen colonias típicas de Salmonella, incubar de nuevo las placas a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h.

47 No agitar el frasco de SC.


6. Confirmaciones:• Retener de cada aislamiento 2 o más colonias típicas o sospechosas de Salmonella48, que

en medio HK son de color verde-azulado, con o sin centro negro.Pruebas bioquímicas:* KLIGLER

• Sembrar las colonias seleccionadas en estría y por picadura.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 Jh ± 2 h. Consideraremos los siguientes resultados:


Rojo o sin cambio de color Glucosa ©

Negro Formación de H2S

B urbujas o ñsuras Formación de gas a partir de la glucosa

Pendiente Amarillo Lactosa 0

Rojo o sin cambio de color Lactosa ©

Interpretación: Los cultivos típicos de Salmonella responden a una pendiente roja con o sin formación de gas y base amarilla, con formación de H2S en un 90% de los casos49.

* INVESTIGACIÓN DE LA /3-GALACTOSIDASA• Emulsionar el cultivo en 0,25 mL de SS.• Añadir 0,25 mL de ONPG.• Mezclar e incubar en a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h, haciendo lecturas al cabo de

y2h, 1 h, 2 h y 24 h.Interpretación: Cuando la reacción es positiva aparece una coloración amarilla.NOTA 1: En caso de obtener un Kligler lactosa 0 o una j3-galactosidasa 0 que al mismo tiempo presente formación de sufhídrico, sembrar en medio lisina-hierro para descartar así las salmonelas del grupo Illa y Illb.

* INVESTIGACIÓN DE LA FENILALANINA DESAMINASA• Emulsionar el cultivo en 0,5 mL de APT.• Añadir 0,5 mL de FA.• Mezclar e incubaren a 37°C ± 1°C durante 4 h.• Añadir una gota de cloruro férrico al 10%.Interpretación: Cuando la reacción es positiva aparece una coloración verde espinaca, mientras que cuando ésta es negativa, el color que aparece es amarillo.

* GALERÍA DE IDENTTHCAaÓN50• Realizar una emulsión en SS.• Sembrar según las indicaciones del fabricante.Interpretación: Comparar los resultados obtenidos con el patrón de colores y consultar el índice analítico y/o el «software» APILAB PLUS.

** Si fuera necesario, volver a aislaren AN e incubar a 37°C ± 1°C durante 20 h - 24 h.49 Existen algunas cepas de Salmonella lactosa 0 . En este caso, una confirmación preliminar de Sal-

monella no debe basarse únicamente en los resultados obtenidos en el agar Kligler.50 La norma permite realizar todas las pruebas bioquímicas con una galería miniaturizada (API).

120 MÉTODOS DE ANÁLISIS MICRO BIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

Pruebas serológicas:* ELIMINACIÓN DE LAS CEPAS AUTO-AGLUTINABLES

• Depositar una gota de SS sobre un portaobjetos.• Hacer una emulsión del cultivo sospechoso.• Remover durante 30 s - 60 s.Interpretación: La cepa es auto-aglutinable si se forman agrupamientos irregulares, de manera que no puede realizar la identificación serológica.

* ESTUDIO DEL ANTÍGENO «O»• Hacer una emulsión del cultivo puro en una gota/de antisuero «O», sobre un portaob

jetos51.• Remover durante 30 s - 60 s.Interpretación: La reacción se considera positiva si hay aglutinación.

7. Interpretación de las pruebas bioquímicas:Las colonias presuntivas de Salmonella presentan las siguientes características:■ Kligler típico.■ F A © .■ /3-galatosidasa © .■ API según perfil típico.

NOTA 2: Salmonella Typhi no produce gas a partir de glucosa. Las subespecies Día y HIb pueden ser lactosa © o © , pero son siempre /3-galatosidasa ©. Salmonella Paratyphi A da reacción negativa a la descarboxilación de la L-lisina. Así que para el estudio de estas cepas puede ser útil realizar pruebas bioquímicas complementarías.

8. Interpretación de las pruebas serológicas:Las colonias presuntivas de Salmonella presentan las siguientes características:

Reaccionesbioquímicas

Auto-aglutinación Reacciones serológicas Interpretación

Típicas No Antígeno «O» positivo Salmonella

Típicas No Negativo Posible Salmonella

Típicas Sí No realizadas Posible Salmonella

No típicas No Negativo No Salmonella

9. Confirmación definitiva:Las cepas consideradas como Salmonella o como posible Salmonella deben ser enviadas a un centro especializado para la identificación de este microorganismo y la determinación definitiva del serotipo.

10. Expresión de resultados:Indicar la presencia/ausencia de Salmonella en 25 mL o 25 g de producto (x mL ó x g de producto).

51 Utilizar los sueros poli y monovalentes uno después del otro.




DIA 1

DÍA 2

DIA 3

DIA 4

25 mL o 25 g de muestra 225 mL de APT


~ ^ y0,1 mL 2 mL

i10 mL de RV


20 mL de SC


FFHK HK

Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h-24 h (+24 h si es necesario)

Retener de cada medio 2 o más colonias típicas o sospechosas




DÍAS

DÍA 6

Pruebas bioquímicas AGAR KLIGLER


INVESTIGACIÓN DE LA £-GALACTOSIDASA*

0,25 mL de ONPG 0,25 mL de SS

INVESTIGACIÓN DE LA FENILALANINA

0^ mL de FA 0,5 mL de SS

DÍA 7

Incubar a 37°C ± 1 °C, con lecturas al cabo de lfi h, 1 h, 2 h y 24 h

Incubar a 37°C ± 1°C durante 4 h

Añadir 1 gota de cloruro férrico

DIA 8

Si las pruebas de la p-galactosidasa y fenilalanina son 0 , realizar un API

I

Pruebas serológicas

ELIMINACIÓN DE LAS CEPAS AUTOAGLUTINABLES

ESTUDIO DE LOS ANTÍGENOS

* Ver NOTA 1, pág. 119


MÉTODO HORIZONTAL PARA LA INVESTIGACIÓNDE Listeria monocytogenes

PNT - AL - 023.1 Basado en la norma ISO 11290-1 (Diciembre 1997)

1. Definición:Listeria monocytogenes: Microorganismos que forman colonias características en los medios selectivos especificados y que poseen las características bioquímicas, morfológicas y fisiológicas descritas cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:Caldo Fraser semi (FS).Caldo Fraser completo (FC).Agar OXFORD.Agar PALCAM.Agar triptona de soja-extracto de levadura (TSYEA).Agar sangre (AS).Caldo para la utilización de los glúcidos (ramnosa y xilosa).Agar movilidad (AM).

3. Reactivos:Solución de peróxido de hidrógeno.Suplemento para el medio Fraser semi.Suplemento para el medio Fraser completo.

4. Cepas:Cepa de Rhodococcus equi (ATCC 25923).Cepa de Staphylococcus aureus (ATCC 6939).

5. Siembra:P re-enriquecimiento:• Preparar la dilución madre añadiendo 225 mL de FS a 25 mL o 25 g de muestra (x mL x g

de muestra + 9x mL de medio).• Incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.Enriquecimiento:• Sembrar 0,1 mL del cultivo en un tubo con FC.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 48 h ± 2 h.Aislamiento:• Sembrar el cultivo de pre-enriquecimiento en agar OXFORD.• Sembrar'el cultivo de pre-enriquecimiento en agar PALCAM.• Sembrar el cultivo de enriquecimiento en agar OXFORD.• Sembrar el cultivo de enriquecimiento en agar PALCAM.• Incubar a 37°C ± 1 °C durante 24 h ± 2 h (+ 24 h si es necesario).

NOTA 1: En agar OXFORD, al cabo de 24 h de incubación, las colonias de Listeria sp son pequeñas, de color grisáceo, rodeadas de un halo negro. Después de incubar 24 h más, doblan su tamaño, se vuelven más oscuras, a veces con reflejos verdosos, apareciendo un halo negro y una depresión central.

124 MÉTODOS DE ANÁLISIS MICRO BIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

En agar PALCAM, al cabo de 24 h de incubación, las colonias de Listeria sp. son pequeñas, de color verde con reflejos grisáceos, eventualmente con un centro negro y siempre rodeadas de un halo negro. Después de incubar 24 h más, aparece una depresión central.

6. Confirmación de Listeria sp:

• A partir de cada placa incubada, tomar 5 colonias presuntivas de Listeria sp. (si una placa tiene menos de 5 colonias, retenerlas todas).

• Aislar en TSYEA.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h - 24 h (o hasta que haya un desarrollo satisfactorio)52.

NOTA 2: En el medio TSYEA, las colonias de Listeria sp. son pequeñas, convexas, incoloras, translúcidas y con bordes regulares.

Prueba de la catalasa:Realizar la prueba en una colonia aislada en TSYEA.

Coloración de Gram:Las colonias de Listeria sp. se presentan en forma de pequeños y finos bacilos Gram 0 .

Examen de movilidad53:• Sembrar por picadura una colonia en AM.• Incubar a 25°C ± 1°C durante 48 h (+ 3 días si es necesario).• Examinar el desarrollo alrededor de la picadura. Listeria sp. son móviles y dan un cultivo

típico en forma de sombrilla.

7. Confirmación de Listeria monocytogenes:

Investigación de la hemolisis:• Sembrar por picadura en AS una colonia aislada en TSYEA.• Sembrar cultivos de control positivo (Listeria monocytogenes) y negativo (Listeria inno

cua).• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h.• Examinar con luz blanca. Listeria monocytogenes presenta una estrecha zona de clara y li

gera /3-hemólisis.

Utilización de glúcidos:• Sembrar en xilosa y ramnosa una colonia aislada en TSYEA.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 5 días. La reacción es positiva si aparece una coloración

amarilla.

Test de CAMP:• Sembrar en paralelo en AS las cepas de Rhodococcus equi y de Staphylococcus aureus.• Sembrar en perpendicular las cepas problema, junto con dos cepas control (.Listeria mo

nocytogenes y Listeria innocua).

NOTA 3: La reacción es positiva si hay un aumento de la zona de /3-hemólisis en la intersección de la cepa a ensayar con cada uno de los otros cultivos.

52 En caso necesario, realizar el test de iluminación de Henry. Listeria sp. aparece de color azulado con una superficie granulada.

53 Si se observa al microscopio, Listeria sp. aparece como bacilos finos y cortos, con movilidad en forma de voltereta.


8. Interpretación:

Todas las Listeria sp. se presentan como pequeños bacilos Gram © , móviles, catalasa 0 . Listeria monocytogenes se diferencia de las demás especies por las características siguientes:

Especie HemolisisProducción ácido CAMP test

Ramnosa Xilosa S. aureus R. equi

L. monocytogenes + + - + -

L. innocua - V - - -

L. ivanovii + - + - +

L. seeligeri (+) - + (+) -

L. welshimeri - V + - -

L. grayi - - - - -

siendo:* V: reacción variable* (+): reacción débil* +: reacción positiva en más del 90%* —: ausencia de reacción

Pre-enriquecimiento 25 mL o 25 g de muestra 225 mL de FS

/] DMX

+ suplemento (x mL)

Incubar a 30°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h<F \ 7 EnriquecimientoO Jm L

Agar OXFORD Agar PALCAM

Incubar a 37°C ±1°C durante 24 h ± 2 h (+24 h si nec.)

eFC

+0,1 mL de suplemento


Aislamiento

Agar OXFORD Agar PALCAM

Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+24 h si es necesario)

Confirmación del géneroSem brar 5 colonias de cada placa en TSYEA


PRUE LA CATALASA MOVILIDAD COLORACIÓN GRAM

0AM

/ V />

AM: Incubar a 25°C ± 1°C durante 48 h (+3 días si es necesario)[------7"~' == = = = = =..:...= = = □

Confirmación de la especie INVESTIGACIÓN HEMOLISIS UTILIZACIÓN GLÚCIDOS TEST CAMP

AS Ramnosa Xilosa AS

Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+4 h días para glúcidos)

c'O13O<L>-o

O.<DTD<L)W)

VLectura


METODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTODE Listeria monocytogenes


1. Definición:

Listeria monocytogenes'. Microorganismos que forman colonias características en los medios selectivos especificados y que poseen las características bioquímicas, morfológicas y fisiológicas descritas cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:Agua de peptona tamponada (APT).Agar PALCAM.Agar triptona de soja-extracto de levadura (TSYEA).Agar sangre (AS).Caldo para la utilización de los glúcidos (ramnosa y xilosa).Agar movilidad (AM).

3. Reactivo:

Solución de peróxido de hidrógeno.

4. Cepas:

Cepa de Rhodococcus equi (ATCC 25923).Cepa de Staphylococcus aureus (ATCC 6939).

5. Siembra:

• Preparar la dilución madre añadiendo 100 mL de APT a 10 mL o 10 g de muestra ( r mL o x g de muestra + 9x mL de medio).

• Dejar en reposo durante 1 h ± 5 min.• Sembrar por duplicado 0,1 mL de la dilución madre en agar PALCAM.• Repetir esta operación con 0,1 mL de cada una de las siguientes diluciones decimales54.• Extender con asa de Drigalsky.• Tapar y dejar absorber durante 15 min. a T ambiente.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+ 18 h - 24 h si es necesario).

6. Recuento:

• Contar las colonias que, tras 24 h de incubación, sean pequeñas, de color grisáceo y rodeadas de un halo negro. Después de incubar 24 h más, las colonias son mayores, eventualmente con reflejos verdosos y con una depresión central.

• Retener las placas con menos de 150 colonias características, si es posible al nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos una placa contenga un mínimo de 15 colonias.

54 Para recuentos bajos se puede sembrar 1 mL en una placa de 10 mm o en tres placas dé 90 mm (por duplicado).


7. Confirmación de Listeria sp.:• Tomar cinco colonias presuntivas de Listeria sp. de cada placa retenida y sembrar por se

parado en placas de TSYEA.• Incubar a 37°C ± 1 °C durante 18 h - 24 h (o hasta que haya un desarrollo satisfactorio) 55.

NOTA: En el medio TSYEA, las colonias de Listeria sp. son pequeñas, convexas, incoloras, translúcidas y con bordes regulares.Prueba de la catalasa:Realizar la prueba en una colonia aislada en TSYEA.Coloración de Gram:Las colonias de Listeria sp. se presentan en forma de pequeños y finos bacilos Gram 0 .

Examen de movilidad56:• Sembrar por picadura una colonia en AM.• Incubar a 25°C ± 1°C durante 48 h ± 3 días.• Examinar el desarrollo alrededor de la picadura. Listeria sp. son móviles y dan un culti

vo típico en forma de sombrilla.

8. Confirmación de Listeria monocytogenesiInvestigación de la hemolisis:• Sembrar por picadura en AS una colonia aislada en TSYEA.• Sembrar cultivos de control positivo (Listeria monocytogenes) y negativo (,Listeria in

nocua).• Incubar a 37°C ± 1 °C durante 24 h ± 2 h.• Examinar con luz blanca. Listeria mococytogenes presenta una estrecha zona de clara y ligera /3-hemólisis.

Utilización de glúcidos:• Sembrar en xilosa y ramnosa una colonia aislada en TSYEA.• Incubar a 37°C ± 1 °C durante 5 días. La reacción es positiva si aparece una coloración

amarilla.

Test de CAMP:• Sembrar en paralelo en AS las cepas de Rhodococcus equi y de Staphylococcus aureus.• Sembrar en perpendicular las cepas problema, junto con dos cepas control (Listeria

monocyto genes y Listeria innocua). La reacción es positiva si hay un aumento de la zona de /Lhemólisis en la intersección de la cepa a ensayar con cada uno de los otros cultivos.

9. Interpretación:

Todas las Listeria sp. se presentan como pequeños bacilos Gram 0 , móviles, catalasa 0 . Listeria monocytogenes se diferencia de las demás especies por las características descritas en la tabla del PNT-AL-023.1.


56 Si se observa al microscopio, Listeria sp aparece como bacilos finos y cortos, con m ovilidad en forma de voltereta.

PROCEDIMIENTOS DE MÉTODOS DB ANALISIS DB ALIMBNTOS 1 ||

Expresión de resultados57:• Calcular el número a de colonias de Listeria monocyto genes presentes con la expresión:

a = * CA

• De las placas con menos de 150 colonias, calcular el número N de colonias de Listeria monocytogenes por mililitro o por gramo con la expresión:

XaN = -------------------------------------

V • («j + 0,1 • n2) d

Consultar el PNT - AL - 002 de expresión de resultados.

130 M ÉTO DO S DE A N Á LIS IS M ICRO BIO LÓG ICO S DE ALIM EN TO S

M ÉTODO HORIZONTAL PARA EL RECUENTODE Listeria monocytogenes

PNT - AL - 023.2 Basado en la norm a ISO 11290-2 (Diciembre 1998)

DIA 1

DIA 3

DIA 2$$

25 mL o 25 g de muestra 225 mL de FS

■T!DM

Dejar en reposo durante 1 h ± 5 min

io-2

0,1 mL 0,1 mLAgar PALCAM

Tapar y dejar absorber durante 15 min a T ambiente Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+18 h-24 h si es necesario)


Sem brar 5 colonias de cada placa en TSYEA Incubar a 37°C ± 1°C durante 18 h-24 h

PRUEBA DE LA CATALASA M OVILIDAD

r

COLORACION GRAM

AM: Incubar a 25°C ± 1°C durante 48 h (+3 días si es necesario)

INVESTIGACIÓN HEM OLISIS* UTILIZACION GLUCIDOS* TEST CAMP*

AS Ramnosa Xilosa ASIncubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+4 h días para glúcidos)

c.'2'o«3JO3

<L>

en'<L>3O.enO-oc<uCU)




1. Definición:Listeria monocytogenes: Microorganismos que forman colonias características en los medios selectivos especificados y que poseen las características bioquímicas, morfológicas y fisiológicas descritas cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:Caldo Fraser semi (FS).Caldo Fraser completo (FC).Agar OXFORD.AgarPALCAM.Agar triptona de soja-extracto de levadura (TSYEA).Agar sangre (AS).Caldo para la utilización de los glúcidos (ramnosa y xilosa).Agar movilidad (AM).

3. Reactivos:Solución de peróxido de hidrógeno.Suplemento para el medio Fraser semi.Suplemento para el medio Fraser completo.

4. Cepas:Cepa de Rhodococcus equi (CIP 5869).Cepa de Staphylococcus aureus (CIP 5710).

5. Siembra:P re-enriquecimiento:• Preparar ía dilución madre añadiendo 225 mL de FS a 25 mL o 25 g de muestra (x mL o

x g de muestra + 9x mL de medio).• Incubar a 30°C ±1°C durante 24 h ±2 h.Enriquecimiento:• Sembrar 0,1 mL del cultivo en un tubo con FC.• Incubar a 37°C ± 1 °C durante 48 h ± 2 h.Aislamiento58:• Sembrar el cultivo de pre-enriquecimiento en agar OXFORD.• Sembrar en agar OXFORD el cultivo de enriquecimiento incubado durante 24 h.• Sembrar en agar OXFORD el cultivo de enriquecimiento incubado durante 48 h.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h 2 h (+ 24 h si es necesario).

NOTA 1: En agar OXFORD, al cabo de 24 h de incubación, las colonias de Listeria sp. son pequeñas, de color grisáceo, rodeadas de un halo negro. Después de incubar 24 h más, doblan su tamaño, se vuelven más oscuras, a veces con reflejos verdosos, apareciendo un halo negro y una depresión central.

58 Según el tipo de flora acompañante de las muestras, podemos sustituir el agar Oxford por agar PALCAM.


6. Identificación de Listeria sp.:• A partir de cada placa incubada, tomar 5 colonias presuntivas de ser Listeria sp. (si una

placa tiene menos de 5 colonias, retenerlas todas).• Sembrar en TSYEA.• Iócubar a 37°C ±1°C durante 18 h - 24 h (o hasta que haya un desarrollo satisfactorio)59.

NOTA 2: En el medio TSYEA, las colonias de Listeria sp. son pequeñas, convexas, incoloras, translúcidas y con bordes regulares.Prueba de la catalasa:Realizar la prueba en una colonia aislada en TSYEA.

Coloración de Gram:Las colonias de Listeria sp. se presentan en forma de pequeños y finos bacilos Gram © .Examen de movilidad60:• Sembrar por picadura una colonia en AM.• Incubar a 25°C ± 1°C durante 48 h (+ 3 días si es necesario).• Examinar el desarrollo alrededor de la picadura. Listeria sp. son móviles y dan un cultivo típico en forma de sombrilla.

7. Confirmación de Listeria monocytogenes:Investigación de la hemolisis:• Sembrar por picadura en AS una colonia aislada en TSYEA.• Sembrar cultivos de control positivo (Listeria monocytogenes) y negativo (Listeria inno

cua).• Incubar a 37°C ± 1 °C durante 24 h ± 2 h.• Examinar con luz blanca. Listeria mococytogenes presenta una estrecha zona de clara y li

gera /3-hemólisis.Utilización de glúcidos:• Sembrar en xilosa y ramnosa una colonia aislada en TSYEA.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 5 días. La reacción es positiva si aparece una coloración

amarilla.

Test de CAMP :• Sembrar en paralelo en AS las cepas de Rhodococcus equi y de Staphylococcus aureus.• Sembrar en perpendicular las cepas problema, junto con dos cepas control (Listeria mo

nocytogenes y Listeria innocua).

NOTA 3: Considerar la reacción positiva si hay un aumento de la zona de /Lhemólisis en la intersección de la cepa a ensayar con cada uno de los otros cultivos.


60 Si se observa al microscopio, Listeria sp. aparece como bacilos finos y cortos, con movilidad en forma de voltereta.


8. Interpretación:

Todas la Listeria sp. se presentan como pequeños bacilos Gram 0 , móviles catalasa 0 . Listeria monocytogenes se diferencia de las demás especies por las características siguientes:

Especie HemolisisProducción ácido CAMP test

Ramnosa Xilosa S. aureus R . equi

L . monocytogenes + + — + —

L. innocua — V — — —

L. ivanovii + — + — +

L. seeligeri (+) — + (+) —

L. welshimeri — V + — —

L. grayi — — — — —

siendo:* V: reacción variable* O): reacción débil* +: reacción positiva en más del 90%* -: ausencia de reacción

M É T O D O H O R IZO N TA L PARA LA IN V ESTIG A CIO NDE L isteria m onocytogenes

PNT - AL - 024 Basado en la norm a N F V 08-055 (D iciem bre 1993)

DIA 1

DIA 2

DIA 3 DÍA 4

DIA 5

DIA 6

DIA 6

L6

Pre-enriquecimiento 25 m Lo 2 5 „ de muestrag225 mL de FS

DM suplem ento (x m L)


OI

0,1 mLEnriquecimiento

+0,1 m L de suplem ento

Agar O X FO R D

Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h*

FC

Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h* durante 48 h ± 2 h*

Aislamiento

Agar O X FO R D

Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+24 h si es necesario)

Confirmación del géneroSem brar 5 colonias de cada placa en T SY EA


PRUEBA DE LA CATALASA M OVILIDAD COLORACION GRAM

TAM

AM : Incubar a 25°C ± 1°C durante 48 h (+3 días si es necesario)I —. _ .. i

Confirmación de la especie*INVESTIGACIÓN HEMOLISIS UTILIZACIÓN GLÚCIDOS TEST CAMP

B #AS Ram nosa X ilosa AS

Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h (+4 h días para glúcidos)

e■oocdJD3

<D■oVU3Ouoo<U"Oa<L>W)«5

.... ...Lectura


M ÉTODO HORIZONTAL PARA LA INVESTIGACIÓN DE Campylobacter TERMOTOLERANTES

PNT - AL - 025 Basado en la norma ISO 10272 (Enero 1995)

1. Definiciones:

Campylobacter termotolerantes: Microorganismos que forman colonias típicas en medios selectivos sólidos cuando se incuban a 42°C y que poseen una movilidad característica y las propiedades bioquímicas descritas cuando el ensayo se realiza según el siguiente método.

2. Medios de cultivo:

Caldo de Park y Sanders.Agar de Karmali (AK).Agar Butzler modificado.Caldo de Brucella (CB).Agar de sangre Columbia.Agar citrato de hierro tres azúcares (TSI). Agar de sangre Mueller Hinton.

3. Reactivos:

Sangre de caballo desfibrinada.Solución de antibióticos «A».Solución de antibióticos «B».Reactivo para la prueba de la oxidasa.Solución H20 2 al 3%.Reactivo para la detección de la hidrólisis del hipurato.• Solución de hipurato sódico.• Solución de nihidrina al 3,5%.Discos de ácido nalidíxico.Discos de cefalotina.

4. Siembra:

• Preparar la dilución madre añadiendo 9x mL de caldo Park y Sanders a .v (g o mg) de muestra.

• Sembrar con asa en AK.• Sembrar con asa en agar Butzler modificado.• Incubar a 42°C ± 1°C en atmósfera microaerófila, inspeccionando al cabo de 48 h y 72 h

(+ 2 días si es necesario).

Pre-enriquecimiento 61:• Incubar la dilución madre de caldo Park y Sanders durante 4 h a 32°C ± 1 °C en atmósfe

ra microaerófila.

61 En ciertos casos, se puede sustituir el caldo Park y Sanders por caldo Preston. Ver norma ISO 10272.


Enriquecimiento:• Añadir la solución antibiótica «B» al 5%.• Incubar a 37°C ± 1°C durante 2 h y luego 40 h ± 2 h a 42°C ± 1°C en atmósfera microae-

rófila.Aislamiento:• Sembrar el cultivo enriquecido en AK.• Sembrar el cultivo enriquecido en agar Butzler modificado.• Incubar a 42°C ± 1°C en atmósfera microaerófila durante 24 h (+ 4 días si es necesario).

NOTA: En AK las colonias de Campylobacter termotolerantes son grises, planas y húmedas, con tendencia a extenderse. En agar Butzler las colonias características pueden virar a marrón y pueden tener distintos tamaños.

5. Confirm ación:• Retener de cada medio 5 colonias características o sospechosas.Morfología y movilidad:• Hacer una tinción Gram de una colonia de cada placa y examinar al microscopio.• Emulsionar cada colonia de bacilos Gram 0 curvados en 1 mL de CB y observar la mo

vilidad; Campylobacter se mueve en forma de sacacorchos.• Sembrar las colonias que posean estas características en agar Columbia sangre e incubar

en atmósfera microaerófila a 42°C ± 1 °C durante 24 h ± 2 h.

6. IdentificaciónCrecimiento a 25°C:• Sembrar con asa las colonias anteriores en CB.• Incubar a 25 °C ± 1°C durante 2-5 días en atmósfera microaerófila.• Examinar si hay crecimiento.Pruebas bioquímicas:• PRUEBA DE LA OXIDASA• AG ARTSI

• Sembrar en TSI las colonias seleccionadas.• Incubar a 42°C (1°C durante 24 h (+ 5 días si es necesario) en atmósfera microaerófila. In terpretación : Consideraremos los siguientes resultados:


Rojo o sin cambio de color Glucosa 0

Negro Formación de H2S

Burbujas o fisuras Formación de gas a partir de la glucosa

Pendiente Amarillo Lactosa 0 / Sacarosa 0

Rojo o sin cambio de color Lactosa 0 / Sacarosa 0

* PRUEBA DE LA CATALASA* SENSIBILIDAD AL ÁCIDO NALIXÍDICO Y A LA CEFALOTINA

• Realizar una suspensión en CB de densidad 0,5 en la escala McFarland.• Diluir la suspensión 1:10 con el mismo caldo.


• Inundar la superficie de una placa de agar Mueller Hinton al 5% de sangre con la suspensión.

• Dejar en contacto durante 5 minutos y eliminar el exceso.• Secar las placas en la estufa a 37°C ± 1°C durante 10 minutos.• Colocar en la superficie del agar un disco de ácido nalidíxico (30 pg) y un disco de ce-

falotina (30 pg).• Incubar a 37°C ± 1°C durante 24 h ± 2h en atmósfera microaerófila.

Interpretación: Consideraremos resistente la bacteria si hay crecimiento hasta el límite del disco y sensible si hay zonas sin crecimiento (zonas de inhibición).

* DETECCIÓN DE LA HIDRÓLISIS DEL HIPURATO• Sembrar las colonias de bacilos Gram © aisladas en tubo de hemolisis con 0,4 mL de

solución de hipurato sódico.• Mezclar e incubar a 37°C ± 0,5°C durante 2 h en un baño de agua.• Añadir, sin mezclar, 0,2 mL de solución de nihidrina en la superficie de la solución de

hipurato sódico.• Incubar durante 10 minutos más.

Interpretación: Consideramos la reacción positiva si aparece coloración violeta oscuro.

7. Interpretación de resultados:

Las colonias de Campylobacter sp. son:■ Bacilos pequeños y curvados.■ Con movilidad característica.■ Gram © .■ Oxidasa 0 .■ Glucosa © .■ Lactosa 0 .■ Sacarosa 0 .■ Producción de gas 0 .Consideramos presencia de Campylobacter sp. si al menos una colonia presenta estas características.

Características C .jejun i C. coli C. lari C. upsaliensis

Crecimiento de 25°C — — — —

H2S (Agar TSI)* — (+) — —

Ácido nalixídico S S R S

Hidrólisis del hipurato + — — —

Catalasa + + + — o débil

Cefalotina R R R S

Leyenda: +: positivo; —: negativo; (+): débilmente positivo; S: sensible; R: resistente

* Débil producción de H2S en el agua de condensación al cabo de 5 días.


138 M ÉTO D O S DE A N Á LIS IS M ICRO BIO LÓ G ICO S DE A L IM E N TO S

M ÉTO D O HORIZONTAL PARA LA INVESTIGACIÓNDE C am ylobacter TERM OTOLERANTES

PNT - AL - 025 Basado en la norm a ISO 10272 (Enero 1996)

DIA 1

DIA 3

DIA 4

DIA 5

AgOA- mL de m uestra 9x mL de caldo de Park y Sanders

l+ suplem entos

AK Agar Butzler m odificado

Incubar a 42°C ± 1°C en atm. m icroaerófila durante 48 h y 72 h

(+2 días si es necesario)

\ 7Pre-enriquecim iento

Incubar a 32°C ± 1°C en atm m icroaerófila durante 4h

FF OEnriquecim iento 7 ^ ^

Añadir solución antibiótica B al 5% Incubar a 37°C ± 1°C durante 2 h


Aislamiento FF

AK Agar Butzler m odificado

Incubar a 42°C ± I°C durante 24 h (+4 días si es necesario) en atmósfera m icroaerófila

Seleccionar 5 colonias típicas o sospechosas de cada placa Tinción Gram de cada colonia. Exam inar al m icroscopio

FFEm ulsionar las colonias Gram 0 curvadas en 1 mL de CB

Observar la m ovilidad. Debe ser en form a de sacacorchos

F>Sem brar estas colonias en Agar Colum bia sangre

Incubar a 42°C ± 1°C durante 24 h ± 2 h en atm ósfera m icroaerófila

FFIdentificación

DIA 1

DIA 3

DIA 4

DIA 5

MÉT

OD

O H

ORI

ZON

TAL

PARA

LA

INV

ESTI

GA

CIÓ

N

DE

Cam

pylo

bact

er T

ERM

OTO

LER

AN

TES

PNT

- AL

- 025

Bas

ado

en la

nor

ma

ISO

102

72 (E

nero

199

6)

/CB

Incu

bar a

25°

C±1

°C

en at

m, m

icroa

eróf

ila

dura

nte 2

-4 d

ías

CREC

IMIE

NTO

A 25

°C

PRUE

BA D

E LA

OXI

DASA

AGAR

TSI

0 si

en 10

s ap

arec

e co

lorac

ión m

alva

iIn

cuba

r a 42

°C

en at

m. m

icroa

eróf

ila

dura

nte 2

4 h

(+5 d

ías si

es n

eces

ario)

PRUE

BA D

ELA

CATA

LASA

0 si

al ca

bo de

30 s

apar

ecen

bur

buja

s

SENS

IBIL

IDAD

ÁCI

DO N

ALDC

ÍDIC

O Y

CEFA

LOT1

NAHI

DRÓL

ISIS

DEL

HIP

URAT

O

CB d

e de

nsid

ad 0

,5

10"'

\$ O

0,4 m

L hi

pura

to só

dico

Incu

bar e

n un

bañ

o a

37°C

± 0,

5°C

dura

nte 2

h

oAg

ar M

uelle

r-Hin

ton

al 5%

de s

angr

eDe

jar e

n co

ntac

to d

uran

te 5 m

in y

elim

inar

el ex

ceso

0,2 m

L de

solu

ción

de

nihi

drin

a en

supe

rficie

oSe

car e

n es

tufa

a In

cuba

r 10 m

in m

ás37

°C ±

1°C

dura

nte 1

0 min

0 si

apar

ece

color

ación

viole

ta

Coloc

ar u

n di

sco d

e ácid

o nali

xídico

(30 |

ig)

y otro

de c

afalo

tina (

30 fi

g)In

cuba

r a 25

°C ±

1°C

en at

m. m

icroa

eróf

ila d

uran

te 24

h ±

2 h


Procedimiento general de preparación de medios de cultivo (PNT - ME - 001)

CAPÍTULO CUARTO

PNT - ME - 001 PROCEDIM IENTO GENERAL DE PREPARACIÓNDE MEDIOS DE CULTIVO

1. OBJETO

El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la preparación de los medios de cultivo necesarios para realizar los análisis de alimentos y aguas.

2. ÁMBITO DE APLICACION

Se aplica a todos los medios de cultivo que se preparan en Microbiología y se utilizan en los ensayos que se realizan en el laboratorio.

3. REFERENCIAS


♦ Normas ISO, EN y AFNOR en las que se basan los PNT - AL.• Catálogos de las casas comerciales suministradoras.* Documentos del Laboratorio de Microbiología: Manual de Calidad y Procedimiento Ge


4. PROCEDIM IENTO

Se redactará un PNT para cada uno de los medios de cultivo necesarios para realizar los ensayos de el laboratorio; en él se darán instrucciones de trabajo para facilitar y agilizar su preparación.

Estos procedimientos se denominan PNT - ME y constan de los siguientes apartados:

0. Carátula.1. Finalidad de uso.2. Principios.3. Preparación.4. Composición en g/1.5. Controles del medio preparado.6. Conservación.

4.1. Carátula

En la carátula deberemos indicar:

• Nombre completo del medio de cultivo que se va a preparar, según su denominación en el método o el PNT - AL en el que se utiliza y, entre paréntesis, las siglas con las que se le conoce en el laboratorio.

• Tipo y numero del PNT: PNT - ME - seguido por un número de tres cifras. Los procedimientos se han numerado según el orden en el que aparecen en los PNT - AL.

143


4.2. Finalidad de uso

La finalidad de uso explica la utilidad del medio de cultivo en el ensayo en el que se utiliza.

4.3. Principios

En este apartado se explica, de manera resumida, la actividad del medio o de alguno de sus componentes en el análisis.

4.4. Preparación

Se señala, de forma clara y concisa, cada uno de los pasos a seguir para preparar el medio de cultivo, indicando:

• la cantidad de medio deshidratado necesario (en caso de no disponer de medio preparado, figurará la frase «disolver los ingredientes» e indicaremos el tipo y cantidad de componentes en el apartado composición en g/1);

• el tipo, volumen y, en caso necesario, la calidad del diluyente utilizado;• el modo de disolución;• la cantidad de medio a repartir, indicando el tipo y volumen del recipiente;• si se esteriliza en autoclave, señalar el tiempo y temperatura; en caso contrario, indicar el

tipo y características del proceso de esterilización empleado;• en caso de añadir algún reactivo, indicar el momento de adición, nombre de la sustancia y

cantidad, indicando también el número de PNT - RE - correspondiente (en caso de tratarse de reactivos compuestos por distintas sustancias) o la referencia comercial (en caso de reactivos simples);

• todas las operaciones párticulares de cada medio (atemperar, dejar los tubos en posición inclinada...).

4.5. Composición en g/1

Este apartado es una lista de cada uno de los ingredientes, indicando su nombre, calidad(si es necesario) y cantidad exacta.

NOTA 1: Esta lista está elaborada a partir de las instrucciones del fabricante del medio utilizado en el laboratorio en el que se han redactado los PNT, de manera que se tendrá que adaptar, en cada caso, a las instrucciones del proveedor.

4.6. Controles del medio preparado

Estos controles se realizan para confirmar la calidad del medio de cultivo y constan de cuatro pruebas *:

• Control macroscópico (examen visual).• Control de pH.• Control de esterilidad.• Control de eficacia.

1 Estos controles se explican en el PNT - ME - 002 sobre control de calidad de medios de cultivo.

PROCEDIMIENTO GENERAL DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 146

En este apartado se exponen las características físicas y de pH que debe reunir el medio preparado, indicando asimismo las cepas a ensayar y los caracteres a estudiar en el control de eficacia, basados principalmente en la morfología y el color de las colonias y en las reacciones de diferenciación y selectividad.

4.7. Conservación

Indicar, para cada tipo de recipiente utilizado, las condiciones de tiempo y temperatura necesarias para la conservación del producto en condiciones óptimas, de manera que su eficacia no se vea alterada.

En aquellos medios de cultivo que se puedan alterar con la luz o la humedad, deberán indicarse estas condiciones particulares de almacenamiento.

NOTA 2: Cuando se indica que el medio de cultivo debe utilizarse inmediatamente, se permite que el producto se pueda emplear durante un periodo de 5 horas después de su preparación.

CAPÍTULO QUINTO

Procedimiento general de control de calidad de medios de cultivo (PNT - ME - 002)

PN T M P m ? PROCEDIM IENTO GENERAL DE CONTROLDE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO

1. OBJETO

El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la realización de los controles de medios de cultivo.


Se aplica a todos los medios de cultivo que se preparan en Microbiología y se utilizan en los ensayos que se realizan en el laboratorio.

3. REFERENCIAS


• Normas ISO, EN y AFNOR en las que se basan los PNT - AL.• Catálogos de las casas comerciales suministradoras.• Documentos del Laboratorio de Microbiología: Manual de Calidad y Procedimiento Ge


4. PROCEDIM IENTO

Los medios de cultivo utilizados en los ensayos del laboratorio deben pasar unos controles, que se especifican en el apartado 5 de su PNT - ME correspondiente.

En general se realiza:

• Un control macroscópico.• Un control de pH a 25°C.• Un control de esterilidad.• Un control de eficacia.

Los controles del medio se deben realizar el mismo día o como máximo al siguiente de su preparación.

4.1. Control macroscópico

El control macroscópico es un examen visual que se realiza en todos los casos para poder descartar cualquier error importante en la preparación del reactivo. Se observa si su consistencia (líquida o sólida), su color y su aspecto (transparente, opalescente, con o sin precipitado...) corresponden con los que se indican en el PNT.

4.2. Control de pH

Se realiza con un pHímetro una medición del pH del medio a una temperatura de 25°C; el valor obtenido ha de corresponder con el indicado en el PNT correspondiente, donde se da un intervalo de aceptación de ± 0,2.

1 A r>


4.3. Control de esterilidad

Este control se efectúa para comprobar que el medio de cultivo no está contaminado, cosa que lo haría inadecuado para su finalidad.

Después de incubar el medio (un 10% del lote preparado) a 30°C ± 1°C durante 72 h ± 4 h, se observa su aspecto, transparencia, si hay turbidez o cambio en el color, si hay gas en la campana de Durham... Se desechará el medio que presente alteraciones en alguno de estos caracteres.

En el caso de los medios no transparentes, realizar un subcultivo en un medio de cultivo no selectivo (AN, PCA, TSA). Los medios destinados a controles de esterilidad deberán incubarse en su totalidad.

4.4. Control de eficacia

Este control se realiza para comprobar la eficacia del medio de cultivo, observando determinados caracteres que el crecimiento de determinadas cepas (que se especifican en el PNT - ME correspondiente) produce en el medio que se está controlando.

Se siembran tantas placas o tubos con medio de cultivo como cepas distintas se requieran para el control y se incuban en las mismas condiciones de tiempo y temperatura que se necesitan para el análisis de alimentos o de aguas en que interviene el medio.

Después de la incubación se evalúan las características dadas en el PNT - ME, observando aspectos como el crecimiento y color de las colonias, eljcolor del medio, la formación de precipitado o de gas, si hay o no halo...

Procedimiento de preparación de medios de cultivo

CAPÍTULO SEXTO

Il RELA CIÓ N DE M EDIO S DE CU LTIV O Y PNT - AL EN EL QU E APARECEN ||

MEDIOS ...... _ -JjSó L a s T

003 PEPTONA SALINA ps TODOS

004 AGAR PARA RECUENTO PC A 003004

(K)5 AGAR BLANCO AB 003004

006 AGAR GLUCOSA Y CLORANFENICOL CGA 005006

(X)7 CALDO TAMPONADO CON BILIS, VERDE BRILLANTE Y GLUCOSA

CALDOEE

007,1008

(X)8 AGAR BILIS CRISTAL VIOLETA Y GLUCOSA VRBG007.1007.2 008 009

009 AGAR GLUCOSADO AG

007.1007.2 008 009 017

010 AGAR NUTRITIVO AN

007.1007.2 008 009 021 022

011 CALDO NUTRITIVO CN

012 AGUA DE PEPTONA TAMPONADA APT008021022

023.2

013 CALDO DE TRIPTONA LAURIL SULFATO TSL 010013

014 CALDO LACTOSADO BILIADO VERDE BRILLANTE BGBL 010

015 AGAR LACTOSADO BILIADO AL CRISTAL VIOLETA Y ROJO NEUTRO VRBL 011

012

016 CALDO EC EC 013

017 AGUA DE TRIPTONA AT 013

018 AGAR CON TERGITOL-BCIG PTX 014

019 MEDIO DE BAIRD-PARKER BP 015.1016.1

020 CALDO CEREBRO-CORAZÓN BH1 015.1016.1

02! AGAR CON PLASMA DE CONEJO Y FIBRÓGENO RPF 015.216.2

022 AGAR MANITOL YEMA DE HUEVO CON POLIMIXINA MYPA 017018

023 MEDIO VOGES-PROSKAUER MR-VP 017

024 MEDIO NITRATO MN 017


PNT-MÉ MEDIOS SIGLAS PNT-AL

025 AGAR SANGRE AS018

023.1023.2 024

026 AGAR MOVILIDAD AM018

023.1023.2 024

027 AGAR TRIPTONA-SULFITO CON CICLOSERINA TSC 019020

028 MEDIO TIOGLICOLATO TIO 0190020

029 MEDIO LACTOSA SULFITO LS 019020

030 CALDO CON VERDE DE MALAQUITA Y CLORURO DE MAGNESIO O DE RAPPAPORT-VASSILIADIS MODIFICADO RV 021

022

0 3 1 CALDO SELENTO-CISTINA VSC 021022

032 AGAR ROJO FENOL Y VERDE BRILLANTE BGA 021

033 HEKTOEN 021022

034 AGAR KLIGLER 021022

035 AGAR NUTRITIVO SEMISÓLIDO 021

036 CALDO FRASER SEMI FS 023.1 024

037 CALDO FRASER COMPLETO FC 023.1024

038 AGAR OXFORD 023.1024

039 AGAR PALCAM023.1023.2 024

040 AGAR TRIPTONA DE SOJA-EXTRACTO DE LEVADURA TSYEA023.1023.2 024

04! CALDO PARA LA UTILIZACIÓN DE LOS GLÚCIDOS023.1023.2 024

042 CALDO DE PARK Y SANDERS 025

043 AGAR KARMALI AK 025

044 AGAR BUTZLER MODIFICADO 025

045 CALDO DE BRUCELLA CB 025

046 AGAR DE SANGRE COLUMBIA 025

047 AGAR DE SANGRE MUELLER-HINTON 025

048 AGAR CITRATO DE HIERRO TRES AZÚCARES TSI 025

049 CALDO TRIPTONA DE SOJA TSB RE-004

PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 155

PNT-M E-003 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE LA PEPTONA SALINA (PS)

1. Finalidad de uso:PS (Peptona Salina) es un diluyente que se utiliza para realizar la dilución madre y los bancos de diluciones.

2. Principios:

Se trata de un medio no inhibidor que facilita la recuperación de microorganismos estresados.

3. Preparación:• Disolver los ingredientes en 1 L de agua destilada.• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir:

► 9 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm. o► el volumen necesario, según uso, en frascos de capacidad adecuada (uno de los dos).

• Esterilizaren autoclave a 120°Cdurante 15 min.

4. Composición en g/1:Peptona.......................................................................................................................... 1Cloruro sódico................................................................................................................ 8,5

5. Controles del medio preparado:

► Control macroscópico: Caldo de color amarillo claro, sin precipitado.► pH a 25°C: 7,0 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

Microorganismo Crecimiento

histeria monocytogenes Bueno

Escherichia coli Bueno

6. Conservación:

► Fraseos.....................► Tubos con sero-tapón

6 meses a 2°C-8°C. 1 mes a 2°C-8°C.

156 MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIO LÓGICOS DE ALIMENTOS

PNT - ME - 004 PRO CED IM IEN TO PARA LA PR EPA RA CIÓ N DEL AGAR PARA RECUENTO (PCA)

1. Finalidad de uso:PCA (Píate Count Agar) es un medio de cultivo utilizado para la multiplicación y recuento por inclusión de todos los microorganismos aerobios mesófílos poco exigentes, en alimentos.

2. Principios:La composición del medio permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos.

3. Preparación:• Disolver 23,5 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.• Según el uso:

► Placas:> Repartir 150 mL de medio en frascos de 250 mL. t> Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.«> Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.t> Repartir asépticamente en placas.

► Tubos:> Repartir 5-6 mL de medio en tubos de 16 X 160 mm.

Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.> Dejar solidificar en posición inclinada.

4. Composición en g/1:Triptona................................................................................................ 10Extracto de levadura................................................................................................................. 2,5Glucosa ............................................................................................................................. 1Agar bacteriológico.................................................................................................................. 15

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Medio sólido de color ámbar, ligeramente opalescente.► pH a 25°C: 7,0 + 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

M icroorganism o Crecimiento

Staphylococcus aureus Bueno

Listeria monocytogenes Bueno


6. Conservación:► Frascos ................................................................................................... 6 meses a 2°C-8°C.► Tubos con tapón de rosca 3 meses a 2°C-8°C.► Tubos con sero-tapón ........................................................................ 1 mes a 2°C-8°C.► Placas ........ 1 mes a 2°C-8°C.


PNT - ME - 005 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DEL AGAR PARA BLANCO (AB)

1. Finalidad de uso:AB (Agar Blanco) se utiliza §n el método ISO 4833 para el recuento en alimentos de microorganismos aerobios mesófilos poco exigentes cuando se sospecha que el producto a analizar contiene microorganismos cuyas colonias invaden la superficie de los medios.

2. Principios:El AB cubre el medio de cultivo, facilitando así el recuento de las colonias.

3. Preparación:• Disolver 18 g de agar en 1 L de agua destilada.• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 100 mL de medio en frascos de 250 mL.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.

4. Composición en g/1:Agar bacteriológico ......................................................................................................... 18

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Medio de color blanquecino.► pH a 25°C: 7,0 ± 0,2.► Control de esterilidad.

6. Conservación:► Frascos 6 meses a 2°C-8°C.


PNT - ME - 006 PROCEDIM IENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL AGAR GLUCOSA Y CLORANFENICOL (CGA)

1. Finalidad de uso:CGA (Agar Glucosa y Cloranfenicol) es un medio de cultivo utilizado para el recuento de levaduras y mohos en alimentos.

2. Principios:El medio contiene extracto de levadura y glucosa, que favorecen el crecimiento de las levaduras y mohos.La presencia del clorafenicol, que es un antibiótico estable al calor, inhibe el crecimiento de bacterias.

3. Preparación:• Disolver 40,1 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 100 mL de medio en frascos de 150 mL.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.• Atemperar en un baño a 45°C - 47°C.

NOTA: Cuando este medio se utiliza para el recuento de levaduras y mohos según la norma AFNOR (XF V 08-059), y en caso que se sospeche la presencia de contaminación importante por bacterias Gram negativas, añadimos al medio 2 mL de SUPLEMENTO ANTIMICROBIANO DE GENTAMICINA (PNT-RE-003). Homogeneizar sin incorporar aire. Repartir en placas Petri estériles y dejar solidificar.

4. Composición en g/1:Extracto de levadura.............................................................................................................. 5G lucosa.................................................................................................................................... 20Cloranfenicol.......................................................................................................................... 0,1Agar bacteriológico............................................................................................................... 15

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Medio sólido de color ámbar, ligeramente opalescente.► pH a 25°C: 6,6 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

M icroorganismo Crecim iento

Saccharomyces cerevisiae Bueno

Aspergillus niger Bueno

Escherichia coli Nulo

6. Conservación:► Frascos 6 meses a 2°C-8°C.► P lacas.................... 1 mes a 2°C-8°C.


PNT - ME - 007PROCEDIM IENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL

CALDO TAMPONADO CON BILIS, VERDE BRILLANTE Y GLUCOSA (CALDO EE)

1. Finalidad de uso:

El CALDO EE (Caldo tamponado con bilis, verde brillante y glucosa) es un medio de cultivo selectivo utilizado para la detección de enterobacterias en alimentos.

2. Principios:

La presencia simultanea de bilis y verde brillante inhibe el crecimiento de la mayoría de bacterias Gram positivas y de las Gram negativas no enterobacterias.Los fosfatos de sodio y potasio hacen que se mantenga el pH del medio, mejorando así su capacidad de recuperación.

3. Preparación:

• Disolver 43,5 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Remover suavemente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.

4. Composición en g/l:

Peptona ............................................................................................................................... 10G lucosa .................................................................................................................... 5Fosfato d isódico................................................................................................................. 6,45Fosfato m onopotásico....................................................................................................... 2Bilis de buey desecada...................................................................................................... 20Verde brillante ................................. 0,015

5. Controles del medio p reparado:

► Control macroscópico: Caldo de color verde, translúcido y sin precipitado.► pH a 25°C: 7,2 + 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:



Salmonella Enteritidis Bueno

Enterococcus faecalis Nulo

6. Conservación:

► Tubos con tapón de rosca 3 meses a 2°C-8°C.


PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL AGAR BILIS CRISTAL VIOLETA Y GLUCOSA (VRBG)

1. Finalidad de uso:VRBG (Agar Bilis Cristal Violeta y Glucosa) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el aislamiento y recuento de enterobacterias en alimentos.

2. Principios:El medio contiene cristal violeta y sales biliares que inhiben el crecimiento de la flora acompañante Gram positiva. La presencia del rojo neutro permite que se forme un halo violeta al borde de las colonias debido a la acidificación de la glucosa y precipitación de las sales biliares.Las colonias de enterobacterias adquieren en este medio coloración violácea.

3. Preparación:• Harnear con alcohol el recipiente y los instrumentos a utilizar y dejar enfriar.• Disolver 39,5 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada estéril.• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 150 mL de medio en frascos estériles de 250 mL.• NO AUTOCLAVAR.• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.

4. Composición en g/1:Peptona de carn e ............................................................................................................ 7Extracto de levadura...................................... 3G lucosa........................................................... 10Sales biliares ................................................... 1,5Cloruro sódico ............................................... 5Rojo neutro ..................................................... 0,03Violeta cristal.................................................. 0,002Agar bacteriológico ....................................... 13

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Medio sólido de color granate claro.► pH a 25°C: 7,3 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

Microorganismo Crecimiento Colorcolonias

Colormedio

Escherichia coli Bueno Rojo Rojo

Salmonella Enteritidis Bueno Rojo Rojo

Staphylococcus aureus Nulo

6. Conservación:Utilizar inmediatamente.


PNT - ME - 009 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL AGAR GLUCOSADO (AG)

1. Finalidad de uso:AG (Agar Glucosado) es un medio de cultivo utilizado para observar si el microorganismo estudiado es capaz de fermentar la glucosa.

2. Principios:La fermentación de la glucosa provoca la acidificación del medio, de manera que el indicador (púrpura de bromocresol) hará que el color pase de púrpura a amarillo al disminuir el pH.

3. Preparación:

• Disolver los ingredientes en 1 L de agua destilada.• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm.• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 20 min.• Mantener los tubos en posición vertical.• Justo antes del empleo, fundir, dejándolo hervir durante unos 10 minutos, y enfriar rápi

damente a la temperatura de incubación (30°C ± 1°C).

4. Composición en g/i:Triptona .......................................................................................................................... 10Extracto de levadura ............................................................................. 1,5G lucosa........................................................................................................................... 10Cloruro sódico ............................................................................................................... 5Púrpura de bromocresol................................................................................................ 0,015Agar bacteriológico .......... 15

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Medio sólido de color púrpura, ligeramente opalescente.► pH a 25°C: 7,0 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

M icroorganismo Color medio

Staphylococcus aureus Amarillo

Bacillus cereus Amarillo

Pseudomonas aeruginosa Violeta

ó. Conservación:► Tubos con tapón de rosca 3 meses a 2°C-8°C.► Tubos con sero-tapón......................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.


PNT - ME - 010 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL AGAR NUTRITIVO (AN)

1. F inalidad de uso:AN (Agar Nutritivo) es un medio de cultivo utilizado para el crecimiento y/o recuento de microorganismos poco exigentes.

2. Principios:El medio suministra los elementos nutritivos necesarios pura el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos.

3. P reparación:• Disolver 35 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Llevar a ebullición y mantener durante 1-2 min, hasta conseguir una completa disolución.• Según el uso:

► Placas:> Repartir 150 mL de medio en frascos de 250 mL.> Esterilizar en el autoclave a 120°C durante 15 min.> Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.> Repartir asépticamente en placas.

► Tubos:> Repartir 5-6 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm.> Esterilizar en el autoclave a 120°C durante 15 min.> Dejar solidificar en posición inclinada.

► Frascos: Almacenar según indicaciones.

4. Composición en g/1:T rip tona ................................................................................................. 10Extracto de carne ................................................... 5Cloruro sódico ............................................................................. 5Agar bacteriológico ........................................................................................ 15

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Medio sólido de color ámbur, ligeramente opalescente.► p H a 2 5 °C :7 ,l ±0 ,2 .► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

Microorganismo ( 'iwlmleulo

Staphylococcus aureus Dueño

Listeria monocytogenes Dueño

Escherichia coli Dueño

6. Conservación:► Tubos con tapón de rosca 3 meses a 2°C-8°C.► Tubos con sero-tapón ............................................... I mes a 2°C-8°C.► F rascos 6 meses a 2°C-8°C.► P la c a s ........................ 1 mes a 2°C-8°C.


PNT - ME - 011 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL CALDO NUTRITIVO (CN)


CN (Caldo Nutitivo) es un medie de cultivo utilizado para el crecimiento y/o recuento de microorganismos poco exigentes.

2. Principios:

El medio suministra los elementos nutritivos necesarios para el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos.

3. Preparación:

• Disolver 20 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm.• Esterilizar en el autoclave a 120°C durante 15 min.

4. Composición en g/I:

Triptona..................................................................................................................... 10Extracto de carne ...................................................................................................... 5Cloruro sódico ............................................................................................................. 5


► Control macroscópico: Caldo de color ámbar, ligeramente opalescente.► pHa25°C:7,l ±0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:





6. Conservación:

► Tubos con tapón de rosca► Tubos con sero-tapón ....

3 meses a 2°C-8°C.1 mes a 2°C-8°C.


PN T - M E - 012 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL AGUA DE PEPTONA TAMPONADA (APT)

1. Finalidad de uso:APT (Agua de Peptona Tamponada) es un medio de cultivo utilizado para realizar un pre-enriquecimiento de Salmonella en alimentos.

2. Principios:El medio revitaliza las salmonelas que hayan podido sufrir daños en el tratamiento de los alimentos.El cloruro sódico actúa manteniendo la balanza osmótica y los dos fosfatos conservan tamponado el medio.

3. Preparación:• Disolver 25,5 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 225 mL de medio en frascos de 250 mL o según uso.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.

4. Composición en g/1:Peptona pancreática de carne..................................................................................... 10Cloruro sódico ................................................................................................. 5Fosfato disódico........................................................................................................ 9Fosfato monopotásico ............................................................................................... 1,5

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Caldo de color amarillo claro sin precipitado.► pH a 25°C: 7,2 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:


Salmonella Enteritidis BuenoEscherichia coli Bueno


6. Conservación► Frascos ...... 6 meses a 2°C-8°C.


P N T -M E -0 1 3 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL CALDO DE TRIPTONA LAURIL SULFATO (TLS)

1. Finalidad de uso:TLS (Caldo de Triptona Lauril Sulfato) es un medio de cultivo selectivo utilizado para la detección y recuento de colifomflss totales y Escherichia coli en alimentos.

2. Principios:Gracias a su excelente capacidad nutritiva y a la presencia de fosfatos, este medio permite un rápido crecimiento de coliformes y la producción de gran cantidad de gas a partir de la fermentación de la lactosa, incluso con poco inoculo.El medio contiene lauril sulfato sódico, que inhibe el crecimiento de la flora acompañante sin interferir en el crecimiento de los coliformes.

3. Preparación:Medio de simple concentración'.• Disolver 35,6 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm, provistos de campana de Durham.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.• Comprobar que la campana esté llena de medio y sin gas.Medio de doble concentración:• Disolver 71,2 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 10 mL de medio en tubos de 20 x 200 mm, provistos de campana de Durham.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.• Comprobar que la campana esté llena de medio y sin gas.

4. Composición en g/1:Triptona ................................................................................................................................. 20L actosa................................................................................................................................... 5Fosfato dipotásico................................................................................................................ 2,75Fosfato m onopotásico.......................................................................................................... 2,75Cloruro sódico ...................................................................................................................... 5Lauril sulfato sódico ............................................................................................................ 0,1

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Caldo de color ámbar, limpio y sin precipitado.► pH a 25°C: 6,8 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

Microorganismo Crecimiento Formación de gas

Escherichia coli Bueno Positiva

Enterococcus faecalis Nulo

6. Conservación:► Tubos con tapón de rosca► Tubos con sero-tapón.....



PNT - ME - 014 PR O C E D IM IE N T O PARA LA PREPARACIÓN DOL CALDO LACTO SA D O BILIA D O VERDE BRILLANTE (BCJHL)

1. Finalidad de uso:BGBL (Caldo Lactosado Biliado Verde Brillante) es un medio de cultive) Util tundo pftfi Itt detección y recuento de coliformes totales y fecales en alimentos (pincha piONUHtlVM y confirmativa).

2. Principios:El medio contiene bilis al 2% y verde brillante, de manera que inhibe el crecimiento d# prí©- ticamente todas las bacterias Gram positivas.El crecimiento se demuestra por la turbidez del medio, y la fermentación de Itt IllCtOKtt por Itt formación de gas en la campana de Durham.

3. Preparación:Medio de simple concentración:• Disolver 40 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm, provistos de campana de Durham.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.• Comprobar que la campana esté llena de medio y sin gas.Medio de doble concentración:• Disolver 80 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 10 mL de medio en tubos de 18 x 180 mm, provistos de campanil do Durham.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.• Comprobar que la campana esté llena de medio y sin gas.

4. Composición en g/1:T rip to n a ............................................................................................................................... 10Bilis bacteriológica de buey ............................................................................................. 20Lactosa ................................................................................................................................. 10

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Caldo de color verde brillante, campana sin gas.► pH a 25°C: 7,2 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

Verde brillante 0,0133

Microorganismo Crecimiento Formación de gas

Escherichia coli Bueno Positivo

Salmonella Enteritidis Bueno Negativo

6. Conservación:► Tubos con tapón de rosca► Tubos con sero-tapón .....



P N T -M E -0 1 5PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL

AGAR LACTOSADO CON BILIS AL CRISTAL VIOLETA Y ROJO NEUTRO (VRBL)

1. Finalidad de uso:VRBL (Agar Lactosado con Bilis al Cristal Violeta y Rojo Neutro) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el aislamiento y recuento de coliformes.

2. Principios:El medio contiene cristal violeta y sales biliares que inhiben el crecimiento de la flora acompañante Gram positiva.La fermentación de la lactosa provoca la acidificación del medio, dando unas colonias de color rojo debido al indicador (rojo neutro) y a veces con un halo de precipitación de ácidos biliares.

3. Preparación:• Flamear con alcohol el recipiente y los instrumentos a utilizar y dejar enfriar.• Disolver 41,5 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada estéril.• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 150 mL de medio en frascos estériles de 250 mL.• NO AUTOCLAVAR.• Atemperar en un baño a 45°C - 47°C.

4. Composición en g/1:Triptona ............................................................................................................................... 7Extracto de levadura .......................................................................................................... 3L actosa................................................................................................................................. 10Sales biliares ....................................................................................................................... 1,5Cloruro sódico .................................................................................................................... 5Rojo neutro ......................................................................................................................... 0,03Violeta c ris ta l...................................................................................................................... 0,002Agar bacteriológico ........................................................................................................... 15

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Medio sólido de color granate claro, ligeramente opalescente.► pH a 25°C: 7,3 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:


Colormedio

Escherichia coli Bueno Rojo Rojo

Pseudomonas aeruginosa Bueno Naranja No cambia



PNT - ME - 016 PR O C E D IM IE N T O PA RA LA PREPA RA CIÓ N D EL CALDO Escherichia (CALDO EC)

1. F inalidad de uso:

El CALDO EC (Caldo Escherichia coli) es un medio de cultivo utilizado para la confirmación y recuento (NMP) de coliformes fecales y Escherichia colú,

2. Principios:

Las sales biliares inhiben el crecimiento de las bacterias Gram positivas, así como de los microorganismos no adaptados al medio ambiente intestinal.La temperatura de incubación (44°C) hace que la técnica sea más selectiva.El crecimiento se demuestra por la turbidez, mientras que la fermentación de la lactosa se observa por la formación de gas dentro de la campana de Durham.

3. P reparación :

• Disolver 37 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm provistos de campana de Durham.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.• Comprobar que la campana esté llena de medio y sin gas.

4. Com posición en g/1:

Peptona pancreática de carne .................................................................................................. 20Lactosa ........................................................................................................................................... 5Mezcla de sales b ilia res............................................................................................................ 1,5Cloruro só d ico ........................................................................................................................... 5Fosfato disódico ........................................................................................................................ 4Fosfato monopotásico .............................................................................................................. 1,5

5. C ontroles del medio p reparado :

► Control macroscópico: Caldo de color ámbar claro, campana sin gas.► pH a 25°C: 6,9 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

M icroorganism o Crecim iento Form ación de gas


Salmonella Enteritidis Escaso Negativo

6. Conservación:

► Tubos con tapón de rosca 6 meses a 2°C-8°C.► Tubos con sero-tapón ............................................................................ 1 mes a 2°C-8°C.

mOCIOIMIINTO M PMPARACIÓN DI MIDIO! DI OULTIVO 160

PNT-M E-017 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL AGUA DE TRIPTONA (AT)


AT (Agua de Triptona) es un medio de cultivo utilizado para la observación de la producción de indol por parte de algunos microorganismos, principalmente de la familia de las Entero- bacterias.

2. Principios:

En condiciones de aerobiosis, algunos microorganismos degradan el triptófano y lo convierten en indol mediante la enzima triptofanasa. Éste es detectado por el reactivo de Kovacs o por una mezcla de ácido nítrico y nitrato sódico, coloreando de rojo el medio.

3. Preparación:

• Disolver 15 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Calentar suavemente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 5 mL de medio en tubos de 15 x 100 mm con tapón de rosca.• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.

4. Composición en g/1:

Peptona de caseína.................................................................................................. 10Cloruro sódico ............................. 5


► Control macroscópico: Caldo de color ámbar claro.► pH a 25°C: 7,3 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

Microorganismo Crecimiento Color rojo


Salmonella Enteritidis Bueno Negativo

6. Conservación:

► Tubos con tapón de rosca 6 meses a 2°C-8°C.


PNT - ME - 018 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL AGAR CON TERGITOL-BCIG (PTX)


PTX (Agar con Tergitol-BCIG) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el recuento de Escherichia coli /3-D-glucuronidasa positivos en alimentos.

2. Principios:

El medio contiene tergitol-7, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas, limita la invasión de Proteus y favorece la recuperación de Escherichia coli.El BCIG es un substrato cromógeno; la mayoría de cepas de Escherichia coli tienen /3-D- glucuronidasa, que hidroliza el BCIG, dándole una coloración azul.

3. Preparación:

• Disolver 20,4 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 100 mL de medio en frascos de 250 mL.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.• Atemperar en un baño a 45°C - 47°C.


Peptona de c a rn e .................................................................................................................. 5Extracto de levadura ........................................................................................................... 3Fosfato d ipotásico ............................................................................................................... 0,3Tergitol-7 .............................................................................................................................. 0,095B C IG ...................................................................................................................................... 0,05Agar bacteriológico ............................................................................................................ 12


► Control macroscópico: Medio sólido blanquecino, ligeramente opalescente.► pH a 25°C: 7,2 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

Microorganismo Crecimiento Color colonias

Escherichia coli Bueno Azul

Citrobacter freundii Bueno Blanco


6. Conservación:

► Frascos ....... 1 mes a 2°C-8°C, resguardados de la luz.


PN T -M E -019 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL MEDIO DE BAIRD-PARKER (BP)

1 .

2 .

3.

4

5.

Finalidad de uso:BP (Baird-Parker) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el recuento de estafilococos, principalmente los CPS (Estafilococos Coagulasa Positivos) en alimentos.Principios:El cloruro de litio y el telurito potásico inhiben la flora acompañante; el telurito también es el responsable de la coloración negra que adquieren las colonias capaces de reducirlo. La glicina y el piruvato sódico estimulan el crecimiento de los estafilococos.La adición de sulfametazina inhibe el crecimiento de Proteus, mientras que la yema de huevo deja patente la acción de la lecitinasa.Preparación:• Disolver 58 g de medio deshidratado en 950 mL de agua destilada.• Llevar a ebullición durante 1 -2 min hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 190 mL de medio en frascos estériles de 250 mL.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.• En el momento de preparar las placas, añadir asépticamente a cada frasco:

► 10 mL de SOLUCIÓN ESTÉRIL DE YEMA DE HUEVO (PNT-RE-004).► 2 mL de TELURITO POTÁSICO AL 1 % (PNT-RE-005).► 5 mL de SULFAMETAZINA AL 0,2%1 (PNT-RE-006).

• Homogeneizar sin incoiporar aire.• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.• Dejar solidificar.

Composición en g/950 mL:Triptona.................................................................................. 10Extracto de carne ................................................................................................................ 5Extracto de levadura ........................................................................................................... 1Piruvato sódico ............................................................................................................... 10Glicina............................. 12Cloruro de litio .................................................................................................................... 5Agar bacteriológico ............................................................................................................ 15

Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Medio sólido amarillo opaco.► pH a 25°C: 6,8 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

Microorganismo Crecimiento Color colonias Halo

Staphylococcus aureus Bueno Negro Positivo

Staphylococcus epidermidis Bueno Negro-grisáceo Negativo

6. Conservación:► Frascos con medio base ........................... 6 meses a 2°C-8°C,► Placas .................................................................................................. 15 días a 2°C 8°C.

En caso que se sospeche la presencia de Proteus.

171M M B H i

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL CALDO DE CEREBRO-CORAZÓN (BHI)

1. Finalidad do uso:

BHI (Caldo de Cerebro - Corazón) es un medio nutritivo tamponado utilizado para el cultivo de una amplia variedad de microorganismos exigentes, tanto aerobios como anaerobios facultativos, como Streptococcus sp., Meningococcus sp. y Staphylococcus sp.

2. Principios:

El elevado contenido de compuestos nutritivos de este medio favorece el rápido crecimiento de los microorganismos, manteniendo además sus características de antigenidad, virulencia y toxicidad.El medio permite realizar la prueba de la coaguiasa para los estafilococos.

3. Preparación:

• Disolver 37 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 5 mL de medio en tubos de 15 x 100 mm.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.


Extracto de cerebro .................................................................................................................. 7,8Extracto de corazón .................................................................................................................. 9,7Peptona de gelatina .................................................................................................................. 10Cloruro só d ico ........................................................................................................................... 5Fosfato d isó d ico ........................................................................................................................ 2,5G lucosa ....................................................................................................................................... 2

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Caldo de color ámbar.► pH a 25°C: 7,4 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:


Estreptococcus pyogenes Bueno


6. Conservación:

PNT - ME - 020

► Tubos con tapón de rosca► Tubos con sero-tapón .....


PNT - ME - 021 PROCEDIM IENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL AGARCON PLASMA DE CONEJO Y FIBRINÓGENO (RPF)

1. Finalidad de uso:RPF (Agar base Baird-Parker con Plasma de Conejo y Fibrinógeno) es un medio de cultivo utilizado para el recuento sin necesidad de confirmación de los CPS (Estafilococos Coagu- lasá Positivos) en alimentos.

2. Principios:El suplemento RFP (Rabbit Plasma Fibrinogen) permite observar la acción de la coagulasa de los estafilococos y contiene un inhibidor de la tripsina para evitar la fibrinólisis total o parcial de los halos formados en tomo a las colonias coagulasa positivas.

3. Preparación:• Fundir el medio base BP y atemperar en un baño a 45°C - 48°C.• Añadir 10 mL de agua destilada estéril a un frasco de suplemento RPF.• Mezclar suavemente hasta la disolución completa.• Añadir el suplemento RPF al medio base BP.• Homogeneizar sin incoiporar aire.• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.• Dejar solidificar.

4. Composición en g/1:MEDIO BASE:Triptona .......... 10Extracto de carne .•........................................ 5Extracto de levadura............................................................................. 1Piruvato sódico .............................................................................................. 10G licina................................................................................... 12Cloruro de l i t io ....................................................................................................... 5Agar bacteriológico .................................... 12,5SUPLEMENTO RPF:Fibrinógeno bovino ........................................................................................................ 3,75 gPlasma de conejo ............................................................................................. . 50 mLInhibidor de tripsina .......................... ............................................................................ 50 mgTelurito potásico ............................................................................................................. 25 mg

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Medio sólido de color ámbar, opalescente.► pH a 25°C: 7,6 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

M icroorganism o Crecimiento Halo

Staphylococcus aureus Bueno Positivo

Staphylococcus epidermidis Bueno Negativo



PNT - ME - 022 PR O CED IM IEN TO PARA LA PREPARACIÓN D EL AGAR M A NITOL YEMA DE HUEVO CON POLIM IXINA (MYPA)

1. Finalidad de uso:MYPA (Agar Manitol Yema de Huevo con Polimixina) es un medio de cultivo utilizado para la detección y recuento de Bacillus cereus en alimentos.

2. Principios:El manitol contenido en el medio nos permite la diferenciación de Bacillus cereus, que es un microorganismo manitol negativo, frente a la flora acompañante manitol positiva, que hace que el rojo fenol del medio vire de rojo a amarillo.Asimismo, el crecimiento de la flora acompañante se ve inhibido por la polimixina, que no afecta al crecimiento Bacillus cereus.Bacillus cereus produce lecitinasa, de manera que degrada la lecitina de la yema de huevo formando un halo de precipitado alrededor de sus colonias.

3. Preparación:• Disolver 46 g de medio deshidratado en 0,9 L de agua destilada.• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 180 mL de medio en frascos de 250 mL.• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.• En el momento de preparar las placas, añadir asépticamente a cada frasco:

► 20 mL de SOLUCIÓN ESTÉRIL DE YEMA DE HUEVO (PNT-RE-004).► 2 mL de SULFATO DE POLIMIXINA B AL 4% (PNT-RE-007).

• Homogeneizar sin incorporar aire.• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.• Dejar solidificar.

4. Composición en g/1:Peptona ............................................................................................................................... 10M anito l................................................................................................................................ 10Cloruro sódico .................................................¿................................................................. 10Extracto de carne ............................................................................................................... 1Rojo fenol ........................................................................................................................... 0,025Agar bacteriológico .......................................................................................................... 15

5* Controles del medio p reparado:► Control macroscópico: Medio sólido de color rojo-rosado.► pH a 25°C: 7,0 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

M icroorganism o Crecim iento Colorcolonias

Colormedio Halo

Bacillus cereus Bueno Incoloro Rojo +Staphylococccus aureus Bueno Amarillo Amarilo + / -

6. Conservación:► Frascos con medio base ........................................................................ 6 meses a 2°C-8°C.► Placas 1 semana a 2°C-8°C.

PNT - ME - 023 PROCEDIM IENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL MEDIO VOGES PROSKAUER (MR-VP)

1. Finalidad de uso:MR-VP (Rojo de Metil-Voges Proskauer) es un medio utilizado como prueba bioquímica para diferenciar los microorganismos (principalmente enterobacterias) según la vía que utilicen para degradar la glucosa.

2. Principios:Algunos microorganismos fermentan la glucosa por la vía llamada ácido-mixta, produciendo una importante acidificación del medio. Así, al añadir el indicador rojo de metilo este se mantendrá de color rojo a pH < 4,4. En caso que pH >5,1 el medio se volverá amarillo. Otros microorganismos la fermentan por la vía de degradación del 2,3-butanodiol; este metabolito se manifiesta con los reactivos para Voges-Proskauer (solución de a-naftol y de KOH), que en una reacción positiva dan un color rosa violáceo en la parte superior del tubo.

3. Preparación:• Disolver 17 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 5 mL de medio en tubos de 15 x 100 mm con tapón de rosca.• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.

4. Composición en g/1:Peptona de carne ...................................................................................................................... 7Glucosa ..................................................................................................................................... 5Fosfato dipotásico.................................................................................................................... 5

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Caldo de color ámbar translúcido.► pH a 25°C: 6,9 ±0,1.► Control de esterilidad.► Control de eñcacia:

M icroorganismo Rojo metilo Voges Proskauer

Escherichia coli Positivo Negativo

Enterobacter cloacae Negativo Positivo

NOTA: La lectura se realiza con:- ROJO DE METILO (PNT-RE-008)■ SOLUCIÓN DE tt-NAFTOL + KOH AL 40% (PNT-RE-009) • SOLUCIÓN DE KOH AL 40% (PNT-RE-010)

6. Conservación:Tubos con tapón de rosca 6 meses a 2°C-8°C.

176 MÉTODOS DE ANÁUSIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

PNT - ME - 024PR O CED IM IEN TO PARA LA PREPARACIÓN

DEL M EDIO N ITRATO (MN)

&, Finalidad de uso:

MN (Medio Nitrato) es un medio de cultivo que pone en evidencia la capacidad del microorganismo de reducir los nitratos a nitritos.

2. Principios:

La presencia de nitritos se manifiesta mediante la adición de reactivos, que hacen que el medio se vuelva rojo.

3. Preparación:

• Disolver los ingredientes en 1 L de agua destilada.• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 5 mL de medio en tubos de 15 x 100 mm.• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.


Peptona ......................................................................................................................................... 5Extracto de carne ........................................................................................................................ 3Nitrato po tásico ........................................................................................................................... 1


► Control macroscópico: Caldo de color ámbar translúcido.► pH a 25°C: 7,0 ± 0 ,1 .► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

M icroorganism o Crecim iento Form ación de N 0 2


Pseudomonas aeruginosa Bueno Negativo

NOTA: La lectura se realiza con:

- REACTIVO DE NITRATOS (PNT-RE-019)

6. Conservación:

► Tubos con tapón de ro sc a 6 meses a 2°C-8°C.► Tubos con sero-tapón ........................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.


PNT - ME - 025 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL AGAR SANGRE (AS)

1. Finalidad de uso:AS (Agar Sangre) es un medio de cultivo con elevado poder nutritivo utilizado para el recuento, aislamiento y conservación de microorganismos delicados.

2. Principios:La composición nutritiva del medio permite la recuperación de microorganismos sin interferir en sus reacciones hemolíticas.

3. Preparación:• Disolver 40 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 100 mL de medio en frascos de 250 mL.• Esterilizar en autoclave a 121aC durante 15 min.• Atemperar en un baño a 45°C - 47°C.• Añadir un 5% de SANGRE DE CORDERO ESTÉRIL.• Mezclar suavemente.• Repartir en placas Petri estériles.• Dejar solidificar.

NOTA: El medio se puede preparar en doble capa poniendo en el fondo de la placa una capa sin sangre.

4. Composición en g/1:Peptona.................................................................................................................................. 15Hígado hidrol izado ............................................................................................................... 2,5Extracto de levadura......................................................... 5Cloruro sód ico ....................................................................................................................... 5A gar........................................................................................................................................ 12

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Medio sólido de color rojo sangre.► pH a 25°C: 7,4 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

Microorganismo Crecimiento Hemolisis

Staphylococcus aureus Bueno p +++

Streptococcus pyogenes Bueno p +++

6. Conservación:► Frascos con medio b a se 6 meses a 2°C-8°C.► Placas..................................................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.

178 MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGlCOS DE ALIMENTOS

PNT - ME - 026 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL AGAR MOVILIDAD (AM)


AM (Agar Movilidad) es un medio de cultivo que permite diferenciar entre microorganismos móviles o inmóviles.

2. Principios:El medio contiene una cantidad muy pequeña de agar, permitiendo así visualizar el desplazamiento de los microorganismos móviles y el estancamiento de los inmóviles.

3. Preparación:• Disolver los componentes en 1 L de agua destilada.• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 5-6 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm.• Esterilizaren autoclave a 121 °C durante 15 min.• Enfriar en posición vertical a temperatura ambiente.


Peptona de caseína................................................................................................. 20Peptona de carne .................................................................................................... 6,1Agar bacteriológico................................................................................................. 3,5


► Control macroscópico: Medio translúcido, ligeramente opalescente.► pH a 25°C: 7,3 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

Microorganismo Movilidad

Proteus hauseri Positivo

Klebsiella pneumoniae Negativo

6. Conservación:► Tubos con tapón de rosca► Tubos con sero-tapón .



PNT - ME - 027 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL AGAR TRIPTONA-SULFITO CON CICLOSERINA (TSC)

1* Finalidad de uso:TSC (Agar Triptona-Sulfito con Cicloserina) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el aislamiento y recuento de clostridios sulfito-reductores en alimentos.

2. Principios:Los clostridios reducen el sulfito a sulfuro, que reacciona con el citrato de hierro formando un halo negro alrededor de las colonias por la precipitación del sulfuro de hierro.La presencia de cicloserina da más especificidad al medio.

3. Preparación:• Disolver 42 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 20 mL en tubos de 18 x 180 mm o 150 mL en frascos de 250 mL de capacidad,

según su uso.• Esterilizaren autoclave a 121°C durante 15 min.• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.• En el momento de preparar los tubos o frascos, añadir el SUPLEMENTO DE CICLO-

SERINA:► En tubos: 0,2 mL.► En frascos: 1,5 mL.

• Homogeneizar sin incorporar aire.

4. Composición en g/1:T riptona.................................................................................................................................... 15Peptona de c a rn e .......................................................................... 5Extracto de levadura ............................................................................................................... 5Metábisulfito sódico ............................................................................................................... 1Citrato férrico amoniacal ............................................................................................ 1Agar bacteriológico .............. 15

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Medio sólido de color ámbar.► pH a 25°C: 7,6 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:


Clostridium perfringens Bueno Negras

6. Conservación:► Frascos con medio b a se ............................................................................ 1 mes a 2°C-8°C.► Tubos con sero-tapón ............................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.


PNT - ME - 028 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL TIOGLICOLATO (TIO)

1. Finalidad de uso:TIO (Tioglicolato) es un medio de cultivo utilizado para controles de esterilidad orientado a bacterias anaerobias estrictas o facultativas.

2. Principios:La reducción de la cisteína y del sulñto sódico crea unas condiciones adecuadas para microorganismos anaerobios, ayudando también a ello la presencia de agar.La resazurina se utiliza como de indicador de óxido reducción.La ausencia de agentes selectivos permite el crecimiento de la mayoría de los microorganismos.

3. Preparación:• Disolver 29,7 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.• Dejar atemperar a temperatura ambiente.NOTA: En el momento de utilizar, regenerar el medio colocando los tubos durante 10 min en un baño hirviendo y dejar atemperar.

4. Composición en g/I:Triptona ................................................................................................................................ 15Extracto de levadura ........................................................................................................... 5G lu co sa ................................................................................................................................. 5,5Cloruro sódico ..................................................................................................................... 2,5Tioglicolato sódico ............................................................................................................. 0,5Cisteína ................................................................................................................................. 0,5Resazurina ............................................................................................................................ 0,001Agar bacteriológico ............................................................................................................ 0,75

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico:

— Medio regenerado: Caldo de color ámbar traslúcido.— Medio no regenerado: Caldo ligeramente espeso de color ámbar traslúcido con la su

perficie rosada brillante.► pH a 25°C: 7,1 ±0 ,2 .► Control de esterilidad.► Control de eficacia:


Estreptococcus pyogenes Bueno

Clostridium perfringens Bueno

6. Conservación:► Tubos con sero-tapón . 1 mes a T ambiente, resguardados de la luz.


PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL MEDIO LACTOSA SULFITO (LS)

1. Finalidad de uso:LS (Lactosa Sulfito) es un ínedio de cultivo selectivo utilizado para la identificación de Clos- tridium perfringens en alimentos.

2. Principios:La presencia de campana de Durham permite observar la fermentación de la lactosa.El medio contiene metabisulfito y una sal de hierro, que reaccionan dando lugar a un precipitado negro de sulfuro de hierro.La temperatura de incubación (46°C ± 1°C) hace que el medio sea más selectivo.

3. Preparación:• Disolver 20,3 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm, provistos de campana de Durham.• Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 20 min.• Comprobar que la campana esté llena de medio y sin gas.• En el momento de utilizar, añadir asépticamente a cada tubo:

► 0,5 mL de METABISULFITO SÓDICO AL 1,2% (PNT-RE-12).► 0,5 mL de CITRATO DE HIERRO AMONIACAL AL 1% (PNT-RE-13).

NOTA: En el momento de utilizar, regenerar el medio colocando los tubos durante 10 min en un baño hirviendo y dejar atemperar (antes de incorporar los reactivos).

4. Composición en g/1:T rip tona............. 5Extracto de levadura.............................................................................................................. 2,5Lactosa ....... 10Cloruro sód ico ........................................ 2,5Clorhidrato de cisteína .......................................................................................................... 0,3

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico (medio regenerado): Caldo de color ámbar claro. Al regenerar el

medio, la campana puede tener un poco de aire que desaparece al enfriarse.► pH a 25°C: 7,1 ±0,1.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

Microorganismo Crecimiento Gas(V4 de la campana)

Precipitadonegro

Clostridium perfringens Bueno Positivo Positivo

PNT - ME - 029

6. Conservación:► Tubos con sero-tapón 1 mes a 2°C-8°C.

1B2 MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

PNT - M E - 030PR O C E D IM IE N T O PARA LA PR EPA RA CIÓ N D EL CALDO

CON V ERD E DE M ALAQUITA Y CLO RU RO D E M A GNESIO (RA PPA PO RT-V A SSILIA D IS M O D IFICA D O ) (RV)

1. Finalidad de uso:RV (Caldo de Rappaport-Vassiliadis modificado) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el enriquecimiento de Salmonella en aguas y alimentos.

2. Principios:El medio está formulado basándose en cinco características diferenciales de Salmonella respecto a otras enterobacterias:■ Capacidad de resistir altas presiones osmóticas.■ Capacidad de multiplicación a pH relativamente bajos.■ Son relativamente más resistentes a la presencia del verde de malaquita.■ Tienen relativamente menos requerimientos nutricionales.■ La temperatura de incubación es un factor selectivo.

3. Preparación:• Disolver 26,75 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Calentar suavemente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm.• Esterilizar en autoclave a 115°C durante 15 min.

4. Composición en g/1:Peptona de soja ...................................................................................................................... 4,5Cloruro sódico ........................................................................................................................ 7,2Dihidrogenofosfato de p o tas io ............................................... 1,26Fosfato d ipo tásico .................................................................................................................. 0,18Cloruro de magnesio anhidro .............................................................................................. 13,58Verde de m alaqu ita ................................................................................................................ 0,036

f » C ontro les del m edio p rep a rad o :► Control macroscópico: Caldo translúcido de color azul-verdoso.► pH a 25°C: 5,2 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

M icroorganism o Crecim iento

Salmonella Typhimurium Bueno


6. C onservación:► Tubos con tapón de ro s c a ...................................................................... 6 meses a 2°C-8°C.► Tubos con sero-tapón .............................................. 1 mes a 2°C-8°C.


PNT - ME - 031 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL CALDO SELENITO-CISTINA (SC)


SC (Caldo Selenito-Cistina) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el enriquecimiento de Salmonella en aguas y alimentos.

2. Principios:El selenito sódico inhibe el crecimiento de bacterias intestinales, coliformes y enterococos, principalmente en las primeras 6-12 h siguientes al inicio de la incubación. Después, el efecto inhibidor disminuye lentamente. Así, Salmonella, Proteus y Pseudomonas no son inhibidos.La cistina mejora sensiblemete el crecimiento de Salmonella.

3. Preparación:• Flamear con alcohol el recipiente y los instrumentos a utilizar y dejar enfriar.• Disolver 23 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada estéril.• Llevar a ebullición durante 1-2 min.• Repartir 90 mL de medio en frascos estériles de 250 mL o 18 mL en tubos de 18 x 180 mm.• NO AUTOCLAVAR.• Enfriar rápidamente en un baño de agua.

NOTA: Al calentar el medio, evitar respirar los vapores, pues son altamente tóxicos.

4. Composición en g/1:Polipeptona..................................................................................................................... 5Lactosa............................................................................................................................. 4Fosfato monosódico........................................................................................................ 10Selenito sódico................................................................................................................ 4C istina.............................................................................................................................. 0,01

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Caldo de color ámbar-anaranjado.► pH a 25°C: 7,0 ± 0,2.► Control de esterilidad► Control de eficacia:


Salmonella Enteritidis Bueno

Escherichia coli Regular

Staphylococcus aureus Malo/Nulo

6. Conservación:► Frascos................................................................. 1 semana a 4°C, resguardados de la luz.► Tubos con sero-tapón......................................... 1 semana a 4°C, resguardados de la luz.

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE AUMENTOS

EPNT - ME - 032 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL AGAR ROJO FENOL Y VERDE BRILLANTE (BGA)

1. Finalidad de uso:'BGA (Agar Rojo Fenol y Verde Brillante) es un medio de cultivo selectivo utilizado para el aislamiento de Salmonella en aguas y alimentos.

2# Principios:El medio de cultivo tiene una fuerte concentración de verde brillante, de manera que inhibe notablemente el crecimiento de la mayoría de microorganismos, excepto Salmonella.La presencia de lactosa y sacarosa permite una buena diferenciación de Salmonella, que da colonias rosadas con un anillo rojo, frente al resto de flora acompañante, que forma colonias más pequeñas de color verde-amarillo, debido a la acidificación producida por la fermentación de la lactosa y/o de la sacarosa.

3. Preparación:• Flamear con alcohol el recipiente y los instrumentos a utin^u y dejar enfriar.• Disolver 53,6 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada estéril.• Llevar a ebullición durante 1-2 min har*° conseguir una completa disolución.• Repartir 150 mL de medio en frascos estériles de 250 mL.• NO AUTOCLAVAR.• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.• Dejar solidificar.

4. Composición en g/1:Triptona ............................................................................................................................ 10Extracto de carne ............................................................................................................ 5Extracto de levadura ....................................................................................................... 3Lactosa ...................................................................................................................... 10Sacarosa............................................................................................................................ 10Fosfato disódico............................................................................................................... 1Fosfato monosódico........................................................................................................ 0,6Rojo fenol ........................................................................................................................ 0,09Verde brillante ...................... 0,005Agar bacteriológico ........................................................................................................ 14

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Medio sólido de color rojo.► pH a 25°C: 6,9 ( 0,2► Control de esterilidad.► Control de eficacia:


Coloranillo

Escherichia coli Moderado Amadlo Amarillo

Salmonella Enteritidis Bueno Rosa Rojo

6. Conservación: ► Placas ......... 1 mes a 2°C-8°C.


PROCEDIM IENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL MEDIO HEKTOEN (HK)


HK (HEKTOEN) es un medio dé cultivo selectivo utilizado para el aislamiento de enterobacterias patógenas, principalmente Shigella y Salmonella.

2. Principios:

El medio tiene un elevado valor nutritivo, y las sales biliares que contiene inhiben el crecimiento de la flora Gram positiva y algunos Gram negativos.Los indicadores azul de bromotimol y fucsina ácida permiten la diferenciación de las bacterias lactosa positivo (de color amarillo-naranja) de las lactosa negativo (de color azul-verdoso).La presencia de tiosulfato sódico permite la producción de SH2, que al combinarse con citrato férrico forma un compuesto negro en el centro de las colonias.

3. Preparación:

• Flamear con alcohol el recipiente y los instrumentos a utilizar y dejar enfriar.• Disolver 75 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada estéril.• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 150 mL de medio en frascos estériles de 250 mL.• NO AUTOCLAVAR.• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.• Dejar secar la superficie del medio en cabina para evitar posteriores expansiones de

Proteus.

4. Composición en g/I:

Hidrolizado de carne ........................................................................................................ 12Extracto de levadura ........................................................................................................ 3Sales biliares ..................................................................................................................... 9Lactosa............................................................................................................................... 12Sacarosa............................................................................................................................. 12Salicina .............................................................................................................................. 2Cloruro sódico .................................................................................................................. 5Tiosulfato sódico ................................ 5Citrato férrico am oniacal................................................................................................ 1,5Azul de brom otim ol........................................................................................................ 0,065Fucsina ácida .................................................................................................................... 0,040Agar bacteriológico ......................................................................................................... 13


► Control macroscópico: Medio sólido de color verde oscuro, opalescente.► pH a 25°C: 7,6 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:


Microorganismo Crecimiento Color colonias Color anillo

Shigella flexneñ Muy bueno Verde No hay

Salmonella Enteritidis Muy bueno Verde con centro negro No hay

Escherichia coli Bueno Amarillo-naranja Salmón

6. Conservación:

► Placas ........ 1 semana a 2°C-8°C.


PROCEDIM IENTO PARA LA PREPARACIÓNDEL AGAR KLIGLER

1. Finalidad de uso:KLIGLER es un medio de cultivo diferencial utilizado principalmente para la identificación de Enterobacteriaceae mediante la detección de la fermentación de la glucosa y de la lactosa, así como de la producción de gas y ácido sulfhídrico.

2. Principios:La fermentación de la glucosa se manifiesta por la producción de ácido, de manera que el indicador vira de rojo a amarillo, aunque en la superficie vuelve el color rojo debido a que, como hay poco azúcar, la producción de ácido es muy limitada y se produce una alcalini- zación por oxidación.En cambio, cuando fermenta la lactosa, la abundante producción de ácido impide la reoxidación, y el medio permanece de color amarillo en la parte inclinada del tubo.La producción de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato se manifiesta por el ennegreci- miento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro en presencia de citrato férrico.

3. Preparación:• Disolver 58 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada estéril.• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 5-6 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.• Dejar solidificar en posición inclinada con una pendiente corta y fondo abundante (ambos

de ± 3 cm).

4. Composición en g/1:Triptona ........................................................... 20Extracto de carne .............................................................................................................. 3Extracto de levadura ........................................ 3G lucosa .............................. 1L actosa ...................... 10Cloruro sódico ................. 5Tiosulfato sódico ............................................................... 0,5Citrato férrico ................................................................................................................... 0,5Rojo fenol ................ 0,025Agar bacteriológico ......................................................................................................... 15

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Medio sólido de color rojo-marrón.► pH a 25°C: 7,4 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

Microorganismo Crecimiento Pendiente Fondo Gas s h 2

Shigella flexneri Bueno Roja Amarillo — —

Citrobacter freundii Bueno Amarilla Amarillo + +

PNT - ME - 034

6. Conservación:► Tubos con sero-tapón 1 mes a 2°C-8°C.


EPNT - ME - 035 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL AGAR NUTRITIVO SEMISÓLIDO (ANS)


ANS (Agar Nutritivo Semisólido) es un medio de cultivo utilizado para el crecimiento y/o recuento de microorganismos poco exigentes.

2. Principios:


3. Preparación:

• Disolver 35 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Llevar a ebullición y mantener durante 1-2 min, hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 150 mL de medio en frascos de 250 mL.• Esterilizar en el autoclave a 120°C durante 15 min.• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.• Repartir asépticamente en placas.


T rip tona.......................................................................................................*........................... 10Extracto de c a rn e ...................................................................................... 4............................ 5Cloruro sód ico .................................................. 5Agar bacteriológico............................................................................................................... 7,5


► Control macroscópico: Medio semisólido de color ámbar, ligeramente opalescente.► pH a 25°C: 7,1 ±0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:





6. Conservación:

► Frascos 6 meses a 2°C-8°C.► P lacas..................................................................................................... 1 mes a 2°C-8°C.


PROCEDIM IENTO PA RA LA PREPARACIÓ N DEL CALDO FRA SER SEM I (FS)

1. F inalidad de uso:FS (Fraser Semi) es un medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Lis- teria monocytogenes en alimentos.

2. Principios:Listeria hidroliza la esculina del medio en glucosa y esculetina, que forma un complejo de color negro con los iones férricos provenientes del citrato férrico.La elevada concentración de cloruro sódico del medio incrementa su selectividad, mientras que el cloruro de litio inhibe el crecimiento de la mayoría de cocos entéricos que también pueden hidrolizar la esculina. Asimismo, la acriflavina inhibe el crecimiento de otros microorganismos Gram positivos.El ácido nalixídico bloquea la replicación del ADN de las bacterias sensibles a este agente antibacteriano.

3. P reparación:• Disolver 55 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Remover suavemente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 225 mL de medio en frascos de 250 mL.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.• En el momento de utilizar, enfriar el medio a 25°C ± 2°C y añadir 2,25 mL de SUPLE

MENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER SEMI (PNT-RE-014).• Homogeneizar sin incorporar aire.

4. Composición en g/1:Polipeptona ............................................................................................................................ 10Extracto de levadura ............................................................................................................. 5Extracto de carne .................................................................................................................. 5Cloruro sódico........................................................................................................................ 20Fosfato disódico anhidro ..................................................................................................... 9,6Fosfato m onopotásico.......................................................................................................... 1,35Esculina .................................................................................................................................. 1Cloruro de litio ....................................................................................................................... 3

5. C ontroles del m edio preparado :► Control macroscópico: Caldo de color ámbar, homogéneo.► pH a 25°C: 7,2 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:




PNT - ME - 036

6. Conservación:► Frascos con medio b a s e .......► Frascos con medio completo

6 meses a 2°C-8°C.1 semana a 2°C-8°C,

resguardados de la luz.


PRO CED IM IEN TO PARA LA PREPARACIÓND EL CALDO FRASER COM PLETO (FC)

1. Finalidad de uso:FC (Fraser Completo) es un medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Listeria monocytogenes en alimentos.

2. Principios:Listeria hidroliza la esculina del medio en glucosa y esculetina, que forma un complejo de color negro con los iones férricos provenientes del citrato férrico.La elevada concentración de cloruro sódico del medio incrementa su selectividad, mientras que el cloruro de litio inhibe el crecimiento de la mayoría de cocos entéricos que también pueden hidrolizar la esculina. Asimismo, la acriflavina inhibe el crecimiento de otros microorganismos Gram positivos.El ácido nalixídico bloquea la replicación del ADN de las bacterias sensibles a este agente antibacteriano.

3. P reparación:• Disolver 55 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Remover suavemente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.• En el momento de utilizar, enfriar el medio a 25°C ± 2°C y aáadir a cada tubo 0,1 mL de

SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER/COMPLETO (PNT-RE-015).• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 x 160 mL.• Homogeneizar sin incorporar aire.

4. Composición en g/1:Polipeptona ............................................................................................................................ 10Extracto de levadura ............................................................................................................ 5Extracto de carne ................................................................................................................. 5Cloruro sódico ...................................................................................................................... 20Fosfato disódico anhidro .................................................................................................... 9,6Fosfato m onopotásico.......................................................................................................... 1,35Esculina ................................................................................................................................. 1Cloruro de litio ...................................................................................................................... 3

5. Controles del medio p reparado :► Control macroscópico: Caldo de color ámbar, homogéneo.► pH a 25°C: 7,2 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:




PNT - ME - 037

6. Conservación:► Frascos con medio b a s e .......► Frascos con medio completo


resguardados de la luz.


PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL AGAR OXFORD

1. Finalidad de uso:OXFORD es un medio de cñltivo selectivo utilizado para el aislamiento de Listeria monocytogenes en alimentos.

2. Principios:El medio contiene polipeptona, que favorece el crecimiento de Listeria, extracto de levadura, que es una fuente de vitamina B y almidón, que es la fuente de energía para el desarrollo microbiano.La concentración de cloruro sódico del medio mantiene su equilibrio osmótico.Listeria es capaz de hidrolizar la esculina en glucosa y esculetina, que forma un compuesto negro con los iones férricos provenientes del citrato férrico.

3. Preparación:• Disolver 58,5 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Llevar a ebullición durante 1 -2 min hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 100 mL de medio en frascos de 150 mL.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.• En el momento de preparar las placas, añadir asépticamente a cada frasco 1 mL de SU

PLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR OXFORD (PNT-RE-016).• Homogeneizar sin incorporar aire.• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.• Dejar solidificar.

4. Composición en g/1:Polipeptona............................................................................................................................ 20Extracto de levadura........................................ 3Almidón ................................................................................................................................ 1Cloruro sódico ...................................................................................................................... 5Esculina................................................................................................................................. 1Citrato férrico amoniacal .................................................................................................... 0;5Cloruro de l i t io ...................................................................................................................... 15Agar bacteriológico.............................................................................................................. 13

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Medio sólido de color amarillo verdoso, con reflejos azulados, li

geramente opalescente.- pH a 25°C: 7,2 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:


Listeria monocytogenes Bueno/Muy bueno Verde oliva, rodeadas de un halo negroEnterococcus faecalis Débil/Nulo

6. Conservación:► Frascos con medio b ase ....► Placas con medio completo


resguardadas de la luz.

192 MÉTODOS DE ANÁLfSIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS

PROCEDIM IENTO PARA LA PREPARACIÓNDEL AGAR PALCAM

1. Finalidad de uso:PALCAM es un medio de cultivo selectivo utilizado para el aislamiento de Listeria monocytogenes en alimentos.

2. Principios:La acción combinada de la ceftazidima y el cloruro de litio hace que el medio sea muy selectivo.La fermentación del manitol por parte de las bacterias contaminantes hace que el rojo fenol se vuelva amarillo.El medio contiene polipeptona, que favorece el crecimiento de Listeria, extracto de levadura, que es una fuente de vitamina B, glucosa y almidón, que son la fuente de energía para el desarrollo microbiano.La concentración de cloruro sódico del medio mantiene el equilibrio osmótico.Listeria es capaz de hidrolizar la esculina en glucosa y esculetina, que forma un compuesto negro con los iones férricos provenientes del citrato férrico.

3. Preparación:• Disolver 68,9 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución^• Repartir 100 mL de medio en frascos de 150 mL.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.• Enfriar y mantener en un baño a 45°C - 48°C.• En el momento de preparar las placas, añadir asépticamente a cada frasco 1 mL de SU

PLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR PALCAM (PNT-RE-017).• Homogeneizar sin incorporar aire.• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.• Dejar solidificar.

4* Composición en g/1:Polipeptona ......................................................................................................................... 20Extracto de levadura.......................................................................................................... 3Glucosa .................... 0,5A lm idón ........................................................... 1Cloruro sódico ............................................................................................. 5Esculina .............................................................................................................................. 0,8Citrato férrico amoniacal ................................................ 0,5Cloruro de litio .......................................................................................................... 15M anitol.................................................................................................................... 10Rojo fenol ........................................................................................................................... 0,08Agar bacteriológico .................................. 13

5, Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Medio sólido de color rojo, ligeramente opalescente.► pH a 25°C: 7,1 ±0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:



Listeria monocytogenes Bueno/Muy bueno Verde oliva, rodeadas de un halo negro

Enterococcus faecalis Nulo .

6. Conservación:► Frascos con medio base .................................................................... 6 meses a 2°C-8°C.► Placas con medio completo 1 semana a 2°C-8°C,


994 MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS— w— - — ------ -------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

| | p N T - ME - 040 PROCEDIM IENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL AGAR TRIPTONA DE SOJA-EXTRACTO DE LEVADURA (TSYEA)


TS YEA (Agar Triptona de Soja-Extracto de Levadura) es un medio de cultivo utilizado para el crecimiento y/o recuento de una gran variedad de microorganismos exigentes.

2. Principios:


3. Preparación:

• Disolver los componentes en 1 L de agua destilada.• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 100 mL de medio en frascos de 250 mL.• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.• Dejar solidificar.


T rip tona.......................................................................................... 17Peptona de so ja ............................................................................. 3G lucosa................................................................................................................................... 2,5Cloruro sód ico ....................................................................................................................... 5Extracto de levadura.............................................................................................................. 6Agar bacteriológico.................................................................... 15

S, Controles del medio preparado:

► Control macroscópico: Medio sólido de color ámbar.► pH a 25°C: 7,3 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:



Streptococcus pyogenes Bueno

6. Conservación:

► Frascos► Placas .



PNT - ME - 041PROCEDIM IENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL

CALDO PARA LA UTILIZACIÓN DE LOS GLÚCIDOS(RAMNOSA Y XILOSA)

1. Finalidad de uso:El CALDO PARA LA UTILIZACIÓN DE LOS GLÚCIDOS (RAMNOSA Y XILOSA) es un medio de cultivo utilizado para observar si el microorganismo estudiado es capaz de fermentar estos glúcidos.

2. Principios:La fermentación de la ramnosa y la xilosa provoca la acidiñcación del medio, de manera que el indicador (púrpura de bromocresol) hará que el color pase de púrpura a amarillo al disminuir el pH.

3. Preparación:• Disolver los ingredientes en 1 L de agua destilada.• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 4,5 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm.• Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min.• En el momento de utilizar, añadir asépticamente a cada tubo (según la solución que pre

paremos):► 0,5 mL de SOLUCIÓN DE RAMNOSA, o► 0,5 mL de SOLUCIÓN DE XILOSA.

• Homogeneizar sin incorporar aire.NOTA: Las soluciones de glúcidos se preparan disolviendo 5 g de L-ramnosa o 5 g de D- xilosa en 100 m L de agua destilada. Esterilizar por filtración.

4. Composición en g/1:Peptona ................................................................................................................................ 10Extracto de carne ............................................................................................................... 1Cloruro sódico .................................................................................................................... 5Púrpura de brom ocresol ........ 0,02

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Medio sólido de color púrpura.► pH a 25°C: 6,8 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

Microorganismo Color medio ramnosa

Color medio xilosa

Listeria monocytogenes Amarillo Violeta

Listeria ivanovii Violeta Amarillo

6. Conservación:► Tubos de medio base con tapón de ro sc a 6 meses a 2°C-8°C.► Tubos de medio base con sero-tapón ............................................... 1 mes a 2°C-8°C.► Tubos de medio completo con tapón de rosca 3 meses a 2°C-8°C.► Tubos de medio completo con sero-tapón........................................ 1 mes a 2°C-8°C.


| PNT - ME - 042 PR O C E D IM IE N T O PA RA LA PR EPA RA CIÓ N D EL CALDO DE PA R K Y SANDERS

1. Finalidad de uso:El CALDO DE PARK Y SANDERS es un medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Campylobacter en alimentos.

2. Principios:El elevado contenido de compuestos nutritivos de este medio favorece el rápido crecimiento de los microorganismos, manteniendo además sus características de antigenidad, virulencia y toxicidad.

3. Preparación:• Disolver los ingredientes en 945 mL de agua destilada.• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 250 mL de medio en frascos de 500 mL.• Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.• En el momento de utilizar, añadir asépticamente a cada frasco:

► 50 mL de SANGRE DE CABALLO DESFIBRINADA.► 5 mL de SOLUCIÓN DE ANTIBIÓTICOS «A» (PNT-RE-018).

4. Composición en g/945mL:Triptona .................................................................................................................................... 10Peptona de c a rn e ..................................................................... 10Glucosa ................................................................................. 1Extracto de levadura .............................................................................................................. 2Citrato sód ico ........................................................................................................................... 1Cloruro sódico ........................................................................................................................ 5Hidrogenosulfito sódico ........................................................................................................ 0,1Piruvato sódico ....................................................................................................................... 0,25

5. C ontroles del medio p reparado :► Control macroscópico: Caldo de color ámbar, ligeramente opalescente.► pH a 25°C: 7,0 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

M icroorganism o C recim iento

Campylobacter sp. Bueno


6. Conservación:► Tubos con tapón de rosca► Tubos con sero-tapón .....



PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL AGAR KARMALI (AK)


AK (Agar de Karmali) es un medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Campylo- bacter en alimentos, después de un enriquecimiento previo.

2. Principios:

El medio contiene polipeptona, que favorece el crecimiento de colonias de Campylobacter, extracto de levadura, que es una fuente de vitamina B y almidón, que es la fuente de energía para el desarrollo microbiano.La concentración de cloruro sódico del medio mantiene su equilibrio osmótico, mientras que la cicloheximida previene el desarrollo de levaduras.El carbón activo, piruvato sódico y hematina favorecen el crecimiento y la aerotolerancia de Campylobacter.

3. Preparación:

• Disolver 46,1 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 100 mL de medio en frascos de 150 mL.• Esterilizar en autoclave a 115°C durante 15 min.• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.• En el momento de preparar las placas, añadir asépticamente a cada frasco 1 mL de SU

PLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR DE KARMALI (PNT-RE-020).• Homogeneizar sin incorporar aire.• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.• Dejar solidificar.


Extracto de levadura......................................................................................................... 20Polipeptona........................................................................................................................ 3Almidón .............................................................................................................................. 1Cloruro sódico ......................................................... 5Piruvato sódico .................................................................................................................. 0,1Carbón activo ..................................................................................................................... 4H em atina....................... *..... 0,032Cicloheximida........................................................... ........................................................ 0,1Agar bacteriológico .......................................................................................................... 13,5


► Control macroscópico: Medio sólido de color negro.► pH a 25°C: 7,4 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE ALIMENTOS


Campylobacter jejuni Bueno/Muy bueno

Campylobacter coli Bueno


ó. Conservación:► Frascos con medio base ....► Placas con medio completo

6 meses a 2°C-8°C. 1 semana a 2°C-8°C,



PNT - ME - 044 PROCEDIM IENTO PARA LA PREPARACIÓNDEL AGAR BUTZLER MODIFICADO


El AGAR BUTZER MODIFICADO es un medio de cultivo selectivo utilizado para el aislamiento de Campylobacter en alimentos, después de un enriquecimiento previo.

2. Principios:

El medio contiene elementos adecuados para el crecimiento de colonias de Campylobacter.

3. Preparación:

• Fundir el medio base AGAR DE SANGRE COLUMBIA (PNT-ME-046) en un baño a 45°C - 48°C.

• Añadir el SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR BUTZLER (PNT-RE-021).• Homogeneizar sin incorporar aire.• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.• Dejar solidificar.• En el momento de utilizar, secar las placas, en una cabina, hasta que la superficie esté li

bre de humedad.


Ver PNT-ME-053.


► Control macroscópico: Medio sólido de color rojo.► pH a 25°C: 7,3 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:


Campylobacter jejuni Bueno/Muy bueno

Campylobacter coli Bueno


6. Conservación:

► Frascos con medio b a se ...................................................................... 6 meses a 2°C-8°C.► Placas con medio completo, sin secar ......................................... 4 horas a T ambiente o

3 días a 2°C-8°C.


PNT - ME - 045 PROCEDIM IENTO PARA LA PREPARACIÓNDEL CALDO DE BRUCELLA (CB)


CB (Caldo de Brucella) es un medio de cultivo no selectivo para microorganismos exigen tes.

2. Principios:

El medio tiene un elevado poder nutritivo.El bisulfito sódico actúa como agente reductor.

3. Preparación:

• Disolver 28,1 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Remover suavemente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir en frascos o tubos, según uso.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.

4* Composición en g/l:

T riptona................................................................................................................................... 10Peptona de carne .................................................................................................................... 10Extracto de levadura............................................................................................................... 2G lucosa.................................................................................................... 1Cloruro sód ico ........................................................................................................................ 5Bisulfito sódico ...................................................................................................................... 0,1


► Control macroscópico: Caldo transparente de color ámbar, sin precipitado.► pH a 25°C: 7,0 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:


Brucella abortus* Bueno/Muy bueno


Campylobacter jejuni Bueno

* Incubar en C 02.

6. Conservación:

► Frascos con medio b a se ....................................................................... 6 meses a 2°C-8°C.► Tubos con tapón de ro sc a 3 meses a 2°C-8°C.


PNT - ME - 046 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓNDEL AGAR DE SANGRE COLUMBIA

1. Finalidad de uso:AGAR DE SANGRE COLUMBIA es un medio de cultivo altamente nutritivo utilizado para el aislamiento de una gran variedad de microorganismos exigentes.

2. Principios:El medio contiene peptona, que favorece el crecimiento de las colonias y extracto de levadura, que es una fuente de vitamina B.El almidón, además de proporcionar energía, actúa como agente desintoxicante.La adición de sangre de cordero desfibrinada favorece la detección de reacciones hemolíti- cas y suministra el factor X necesario para el crecimiento de un gran número de bacterias.

3. Preparación:• Disolver 42,5 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 100 mL de medio en frascos de 250 mL.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.• En el momento de utilizar, añadir asépticamente 5 mL de SANGRE DE CORDERO

ESTÉRIL.• Homogeneizar sin incoiporar aire.• Repartir asépticamente en placas Petri estériles.• Dejar solidificar.• En el momento de utilizar, secar las placas, en una cabina, hasta que la superficie esté li

bre de humedad.

4. Composición en g/1:Polipetona............................................................................................... 17Peptona pancreática....................................................... 3Extracto de levadura........................................................................................................ 3Almidón de maíz ................................................................................ 1Cloruro sódico .......................................................... 5Agar bacteriológico ................... 13,5

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Medio sólido opaco de color rojo.► pH a 25°C: 7,3 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

Microorganismo Crecimiento Tipo de hemolisis

Streptococcus pyogenes Bueno/Muy bueno BetaStaphylococcus aureus Muy bueno Beta/Gamma

6. Conservación:► Frascos con medio base ..................................................................... 6 meses a 2°C-8°C.► Placas con medio completo, sin se ca r ........................................ 4 horas a T ambiente o

1 mes a 2°C-8°C.


PNT - ME - 047 P R O C E D IM IE N T O PARA LA PR EPA RA CIÓ N D EL AGAR D E SA NGRE M U ELLER-HIN TO N

1. Finalidad de uso:AGAR DE SANGRE MUELLER-HINTON es un medio de cultivo utilizado para el estudio de la susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos y sulfamidas.

2. Principios:Este medio se utiliza junto a unos discos de papel impregnados con antibióticos. AI situar los discos en el agar, estos absorben una cantidad de agua suficiente para disolver el antibiótico, que se difunde en el medio.De esta forma de crea un gradiente de concentración de antibiótico alrededor del disco, mientras que las bacterias inoculadas se van multiplicando hasta que encuentran una zona con una cantidad inhibitoria de antibiótico.

3. Preparación:• Disolver 38 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Llevar a ebullición durante 1 -2 min hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 100 mL de medio en frascos de 250 mL.• Esterilizar en autoclave a 115°C durante 15 min.• Atemperar en un baño a 45°C - 48°C.• Añadir 5 mL de SANGRE DE CORDERO ESTÉRIL.• Mezclar suavemente.• Repartir asépticamente el medio en placas Petri estériles formando una capa de unos 4 mm

de grosor.• Dejar solidificar.• En el momento de utilizar, secar las placas, en una cabina, hasta que la superficie esté li

bre de humedad.

4. Composición en g/1:Hidrolizado de case ína ........................................................................................................... 17,5Infusión de carne .................................................................................................................... 2Almidón soluble ..................................................................................................................... 1,5Agar bacteriológico ................................................................................................................ 17

5. Controles del medio preparado:► Control macroscópico: Medio sólido de color rojo.► pH a 25°C: 7,3 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:


Streptococcus pyogenes Bueno/Muy bueno

6. Conservación:► Frascos con medio base ......................................................................... 6 meses a 2°C-8°C.► Placas con medio completo, sin secar ........................................... 4 horas a T ambiente o

1 mes a 2°C-8°C.


PNT - ME - 048 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL AGAR CITRATO DE HIERRO TRES AZÚCARES (TSI)


TSI (Agar Citrato de Hierro Tres Azúcares) es un medio de cultivo utilizado para la identificación de enterobacterias.

2. Principios:

La fermentación de los azúcares contenidos en el medio (glucosa, lactosa y sacarosa) produce una acidificación que hace que éste pase de rojo a amarillo.Las bacterias que fermentan únicamente la glucosa se detectan al volver el medio rápidamente a su coloración inicial en la parte superior del tubo. Aquéllas que no fermentan ninguno de los tres azúcares no harán cambiar el color del medio.La producción de ácido sulfhídrico se observa por la presencia de deposiciones negras de sulfuro de hierro en el fondo del tubo producidas por la reacción del tiosulfato en presencia del citrato férrico.Asimismo, la producción de gas en la fermentación se detecta por la aparición de burbujas o la rotura del agar.

3. Preparación:

• Disolver 60,1 g de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Llevar a ebullición durante 1-2 min hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 5-6 mL en tubos de 16 x 160 mm.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.• Inclinar los tubos para obtener un fondo y una pendiente de ±3 cm de profundidad.


Extracto de carne .............................................................................................................. 3Extracto de levadura......................................................................................................... 3Peptona ............................................................................................................................... 14Cloruro sódico ................................................................................................................... 5L actosa................... 10Sacarosa.............................................................................................................................. 10G lucosa ................................................................................... 1Citrato férrico .......................................................................... ................... 0,3Tiosulfato sódico ............................................................................................................... 0,3Rojo fenol .......................................................................................................................... 0,024Agar bacteriológico .......................................................................................................... 13,5


► Control macroscópico: Medio sólido de color rojizo.► pH a 25°C: 7,4 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:


Microorganismo Crecimiento Pendiente Fondo Gas s h 2

Shigella flexneri Bueno Roja Amarillo — —

Citrobacter freundii Bueno Amarilla Amarillo + +

(• Conservación:

► Tubos sin inclinar► Tubos inclinados.

6 meses a 2°C-8°C. 1 semana a 2°C-8°C.


PNT - ME - 049 PROCEDIM IENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL CALDO TRIPTONA DE SOJA (TSB)


TSB (Caldo Triptona de Soja) es un medio de cultivo nutritivo universal utilizado para el crecimiento y recuperación de microorganismos exigentes (aerobios o anaerobios).

2. Principios:

La composición del medio permite el crecimiento satisfactorio de una amplia variedad de microorganismos.El cloruro sódico mantiene el equilibrio osmótico, mientras que el fosfato dipotásico mantiene el pH.

3. Preparación:

• Disolver 30 gr de medio deshidratado en 1 L de agua destilada.• Calentar gradualmente hasta conseguir una completa disolución.• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm.• Esterilizar en autoclave a 120°C durante 15 min.


T rip tona............................................................................................................................... 17Peptona de so ja ...................................................................................................................... 3G lucosa................................................................................................................................... 2,5Cloruro sódico ....................................................................................................................... 5Fosfato dipotásico................................................................................................................. 2,5


► Control macroscópico: Caldo de color ámbar, translúcido.► pH a 25°C: 7,3 ± 0,2.► Control de esterilidad.► Control de eficacia:

M icroorganismo Crecimiento



6. Conservación:

► Tubos con sero-tapón 6 meses a 2°C-8°C.

CAPÍTULO SÉPTIMO

Procedimiento general de preparación de reactivos (PNT - RE - 001)

P N T - R E -001 PROCEDIMIENTO GENERAL DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS

I. OBJETO

El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la preparación de los reactivos necesarios para realizar los análisis de alimentos y aguas.


Se aplica a todos los reactivos que se preparan en la Unidad de Microbiología, y se utilizan en los ensayos que se realizan en este laboratorio.

3. REFERENCIAS

• ISO 7218 (1996): Microbiología de alimentos. Reglas generales para los exámenes mi- crobiológicos.



4. PROCEDIMIENTO

Se redactará un PNT para cada uno de los reactivos necesarios para realizar los ensayos de este laboratorio; en él se darán instrucciones de trabajo para facilitar y agilizar su preparación.

Estos procedimientos se denominan PNT - RE y constan de los siguientes apartados:

0. Carátula.1. Finalidad de uso.2. Principios.3. Preparación.4. Composición.5. Controles del reactivo preparado.6. Conservación.7. Medios utilizados.

4.1. Carátula

En la carátula deberemos indicar:

• Nombre del reactivo que se va a preparar, según su denominación en el método o el PNT - AL en el que se utiliza. Si el producto puede ser empleado con distinta concentración, ésta deberá constar en el título.

• Tipo y número del PNT: PNT - RE - seguido por un número de tres cifras. Los procedimientos se han numerado según el orden en el que aparecen en los PNT - ME.


4.2. Finalidad de uso

kft finalidad de uso explica la utilidad del reactivo en el ensayo en el que se utiliza.

4.3. Principios

Bn este apartado se explica, de manera resumida, el modo de acción del reactivo.

4.4. Preparación

Se indica, de forma clara y concisa, cada uno de los pasos a seguir para preparar el reactivo, indicando la cantidad de los ingredientes necesarios, el tipo, volumen y calidad del diluyente utilizado, el modo de disolverlos y, en caso necesario, el modo de esterilización (tiempo y temperatura si se esteriliza con autoclave o tipo de membrana si la esterilización es por filtración).

NOTA 1: Es frecuente que los ingredientes del reactivo se presenten en viales cuyo contenido es una mezcla de las cantidades necesarias de los componentes. En este caso, sólo se indicará el volumen de diluyente necesario para reconstituirlo. Estas presentaciones y reconstituciones dependen de las marcas comerciales. Siempre habrá que cumplir las indicaciones del proveedor.

4.5. Composición

Bate apartado es una lista de cada uno de los ingredientes, indicando su nombre, calidad (si es necesario) y cantidad exacta. Incluiremos también la cantidad y calidad de los diluyentes, excepto Cuando la preparación se realiza a partir de un vial a reconstituir.

NOTA 2: Esta lista está elaborada a partir de las instrucciones del fabricante del medio utilizado en el laboratorio en el que se han redactado los PNT, de manera que se tendrá que adaptar, en cada caso, a las instrucciones del proveedor.

4.6. Controles del reactivo preparado

Batos controles (detallados en el PNT-RE-002) se realizan para confirmar la calidad del reactivo y constan de dos pruebas:

• Control macroscópico (examen visual).• Control microscópico (examen analítico), formado por un control de esterilidad y otro de

eficacia. Estos controles no.se hacen en todos los productos y su realización dependerá del tipo de reactivo.

Cuando son reactivos preparados por casas comerciales o suplementos de medios de cultivo, ftí asume que estos han sido controlados por el proveedor.

4.7. Conservación

Indicar las condiciones de tiempo y temperatura necesarias para la conservación del producto en condiciones óptimas, de manera que su finalidad no se vea alterada.

PROCEDIMIENTO GENERAL DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS (PNT - RE - 001) 211

En aquellos reactivos que se puedan alterar con la luz o la humedad, deberán indicarse estas condiciones particulares de almacenamiento.

NOTA 3: Cuando se indica que el reactivo debe utilizarse inmediatamente, se permite que el producto se pueda emplear durante un periodo de 5 horas después de su preparación.

4.8. Medios utilizados

En este apartado se señalan los medios o reacciones bioquímicas en los que se emplea el reactivo, indicando la cantidad y el momento en que se añade.

CAPÍTULO OCTAVO

Procedimiento general de control de calidad de reactivos (PNT - RE - 002)

PNT - RE - 002 PROCEDIMIENTO GENERAL DE CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS

1. OBJETO

El presente documento tiene como finalidad normalizar y homogeneizar la realización de los controles de reactivos.

2. ÁMBITO DE APLICACIÓN

Se aplica a todos los reactivos que se preparan en la Unidad de Microbiología y se utilizan en los ensayos que se realizan en este laboratorio.

3. REFERENCIAS

• ISO 7218 (1996): Microbiología de alimentos. Reglas generales para los exámenes mi- crobiológitos.



4. PROCEDIM IENTO

Los reactivos utilizados en los ensayos del laboratorio deben pasar unos controles, que se especifican en el apartado 5 de su PNT - RE correspondiente. Estos controles se adaptan según el tipo de reactivo y su finalidad de uso.

En general se realiza:

• Un control macroscópico.• Un control de esterilidad.• Un control de eficacia.

En algunos reactivos se han de hacer controles periódicos, tal como se indica en su PNT - RE correspondiente, para asegurar que no pierden calidad durante su almacenamiento.

4.1. Control macroscópico

El control macroscópico es un examen visual que se realiza en todos los casos para poder descartar cualquier error importante en la preparación del reactivo. Se observa si su consistencia (en general líquida), su color y su aspecto (transparente, opalescente, con o sin precipitado...) corresponden con los que se indican en el PNT.

4.2. Control de esterilidad

Este control se efectúa en aquellos productos que, por su composición, son susceptibles de contaminarse, cosa que les haría inadecuados para su finalidad.

215

El control de esterilidad delw realizante en cabina de flujo laminar, utilizando un medio de eultlvo puru microorganismos aerobios (en general TSB) y otro para anaerobios (en general TIO). Ambos medios se especif ican en el PNT - RE correspondiente.

La operación consiste en introducir en los medios correspondientes una pequeña cantidad de reactivo, en general I mL. En el medio TIO, sembrar en el fondo del tubo, evitando introducir aire.

Después de incubar a 30°C ± 1 °C durante 72 h ± 2 h, se observa si hay turbidez o cambio en el color.

NOTA 1: Antes de utilizar, el medio TIO se ha de regenerar, desoxigenándolo durante 10 minutos en un baño con agua hirviendo.

NOTA 2: En caso de duda, se realiza un subcultivo, sembrando con asa en TSYEA a partir del medio TSB y en TSYEA y TSC sin cicloserina a partir del medio TIO. Incubar a 30°C ± 1 °C durante 48 h ± 2 h (cuando se siembra a partir del medio TIO, incubar en anaerobiosis).

l i a M i-10 1 to a b* ANAblilB M ie n o i iO L ó a ic o s o e a i . im i.n t o h

4.3. Control de eficacia

Ente control se realiza para comprobar la eficacia del reactivo. Sin embargo, el control se efectúa Únicamente en aquellos productos que se elaboran en el mismo laboratorio, pues se supone que las preparaciones comerciales garantizan su eficacia. Así pues, en PNT - RE correspondiente indicará si se debe realizar el control de eficacia, señalando, en este caso, las cepas y el medio que se han de utilizar.

En ciertos reactivos, como el ONPG y la FA, se hace un control con cepas positivas, otro con cepas que dan un resultado negativo y un control sin sembrar. En otros casos el control se realiza después de la inclusión del producto en el medio de cultivo, como sucede con la yema de huevo, los antibióticos y los suplementos, o se utilizan como reveladores de reacciones bioquímicas, combinándose con los medios de cultivo u otros substratos.

CAPÍTULO NOVENO

Procedimientos de preparación de reactivos

RELACIÓN DE REACTIVOS Y M EDIO AL QUE SE AÑADEN

PNT-RE REACTIVOSMEDIO AL

QUE SE AÑADE

PNT-ME

*003 SUPLEMENTO ANTIMICROBIANO DE GENTAMICINA CGA 006

004 SOLUCIÓN ESTÉRIL DE YEMA DE HUEVO BP/MYPA 019/022

005 TELURITO POTÁSICO AL 1% BP 019

006 SULFAMETAZINA AL 0,2% BP 019

007 SULFATO DE POLIMIXINA B AL 4% MYPA 022

008 ROJO DE METILO MR-VP 023

009 SOLUCIÓN DE a-NAFTOL MR-VP 023

010 SOLUCIÓN DE KOH AL 40% MR-VP 023

011 REACTIVO DE NITRATOS MN 024

012 METABISULFITO SÓDICO AL 1,2% LS 029

013 CITRATO FÉRRICO AMONIACAL AL 1% LS 029

014 SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER SEMI FC 036

015 SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER COMPLETO FC 037

016 SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR OXFORD OXFORD 038

017 SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR PALCAM PALCAM 039

018 SOLUCIÓN DE ANTIBIÓTICOS «A» PARA EL CALDO DE PARK Y S ANDERS

PARK Y SANDERS 042

019 SOLUCIÓN DE ANTIBIÓTICOS «B» PARA EL CALDO DE PARK Y S ANDERS

PARK Y SANDERS 042

020 SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR KARMALI AK 043

021 SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR BUTZLER BUTZLER 044

022 REACTIVO DE KOVACS 017

023 SOLUCIÓN SALINA SS

024 REACTIVO PARA LA INVESTIGACIÓN DE LA j8-GALACTOSIDASA ONPG

025 SOLUCIÓN DE FENILALANINA AL 0,5% FA

026 CLORURO FÉRRICO AL 10%

91Q

no mUtodoi o» A N A U |l|M ie n o iiO L ú a ic o 8 oe a lim e n to s

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL SUPLEMENTO ANTIMICROBIANO DE GENTAMICINA

1. Finalidad de uso:GENTAMICINA es un suplemento antimicrobiano selectivo que se añade al medio CGA para el recuento de levaduras y mohos en alimentos según el método AFNOR.

2. Principios:Este antibiótico inhibe el crecimiento de la mayoría de bacterias, favoreciendo así el desarrollo de levaduras y mohos.

3. Preparación:• Añadir asépticamente 5 mL de agua destilada estéril al vial con el producto liofilizado.• Disolver cuidadosamente, evitando la formación de espuma.• Si es necesario, enjuagar el vial con 1 mL más de diluyente.

NOTA: En caso de no utilizar todo el contenido del vial, indicar en el envase la fecha de reconstitución y conservar según lo indicado en el punto 6.

4. Composición:Sulfato de gentamicina...................................................................................................... 25 mg.

5. Controles del reactivo preparado:► Control macroscópico: Líquido incoloro.► Control de eficacia: En CGA con levaduras y mohos.

6. Conservación:► Vial sin reconstituir .................................................... A 2°C-8°C, protegidos de la luz,

hasta la fecha de caducidad.► Vial reconstituido ................................................ 1 mes a 2°C-8°C, protegidos de la luz.► Placas preparadas................................................. Usar el mismo día de la preparación.

7. Medios utilizados:► CGA (PNT-ME-006): Añadir 2 mL de suplemento a 100 mL de medio.

MOCIDIMIflNTOS DB FRBPARACION DB RBACTIVOB 221

P N T - R E - 0 0 4 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN ESTÉRIL DE YEMA DE HUEVO

1. Finalidad de uso:La SOLUCIÓN ESTÉRIL DE YEMA DE HUEVO es un aditivo que se añade a algunos medios para enriquecerlos y para facilitar la identificación por la acción lecitinasa.

2. Principios:La adición de yema de huevo a medios sólidos en placa permite visualizar una zona clara alrededor de las colonias que poseen proteasas y a veces otro halo de precipitación por lipo- lisis.

3. Preparación:• Limpiar los huevos con agua y jabón.• Aclarar, secar y rociar con alcohol, dejándolo evaporar.• Romper la cáscara por un extremo y hacer un agujero con unas tijeras estériles.• Aspirar la clara con una pipeta estéril de 5 mL con la punta rota.• Transferir la yema a un frasco estéril de 250 mL.• Diluir con agua destilada estéril en una proporción 1:4.• Homogeneizar por agitación.• Calentar en un baño a 45°C ± 0,5°C durante 2 h.• Dejar sedimentar en nevera durante 18 h - 24 h.• Separar el sobrenadante de forma aséptica y trasvasarlo a un recipiente estéril.

4» Composición:Yema de huevo Agua destilada

5. Controles del reactivo preparado:► Control macroscópico: Solución líquida de color amarillo anaranjado.► Control de esterilidad: En TSB y TIO.► Control de eficacia: En BP con Staphylococcus aureus o en MYPA con Bacillus cereus.

6. Conservación:A 4°C, realizando controles de esterilidad periódicamente y antes de cada uso.

7. Medios utilizados:► BP (PNT-ME-019): Añadir 10 mL de suplemento a 190 mL de medio, en el momento de

preparar las placas.► MYPA (PNT-ME-022): Añadir 20 mL de suplemento a 180 mL de medio, en el momento

de preparar las placas.

1 unidad (=20 mL).80 mL.

M I MÉTODO* 01 A N A LIIII MICROIIOLÓOlCOe DE ALIMENTOS

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL TELURITO POTÁSICO AL 1 %

1. Finalidad de uso:El TELURITO POTÁSICO AL 1 % es un agente selectivo que se utiliza en algunos medios para estafilococos como reactivo inhibidor y diferencial.

2. Principios:Evita el crecimiento de la mayoría de los microorganismos Gram negativos y de los Gram positivos que no son capaces de reducirlo.Hay una correlación entre la capacidad de reducción del telurito potásico a teluro y la pato- genicidad de los estafilococos.Los estafolococos que pueden reducir el telurito a teluro, formando colonias negras.

3. Preparación:• Disolver 1 g de telurito potásico en 100 mL de agua destilada.• Esterilizar por filtración con filtro de membranas de 0,45 jli de tamaño de poro.

4. Composición:Telurito potásico ................................................................................................................. 1 g.Agua destilada................................................................................................................ 100 mL.

5. Controles del reactivo preparado:► Control macroscópico: Líquido incoloro.► Control de esterilidad: En TSB y TIO.► Control de eficacia: En BP con Staphylococcus aureus.

6. Conservación:A 4°C, protegido de la luz.

7. Medios utilizados:► BP (PNT-ME-019): Añadir 2 mL de suplemento a 190 mL de medio, en el momento de

preparar las placas.

PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS 223

PNT - RE - 006 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE LA SULFAMETAZINA AL 0,2%


La SULFAMETAZINA AL 0,2% es un suplemento antimicrobiano selectivo que se añade al medio BP para facilitar el recuento de estafilococos en alimentos.

2. Principios:

Este antibiótico limita el crecimiento de Proteus.

3. Preparación:

• Disolver cuidadosamente la sulfametazina en la disolución de hidróxido sódico, evitando la formación de espuma.

• Añadir 90 mL de agua destilada.• Esterilizar por filtración con filtro de membranas de 0,22 |i de tamaño de poro.

4. Composición:

Sulfametazina ..................................................................................................................... 0,2 g.Disolución de hidróxido sódico (0,1 m ol/L )................................................................. 10 mL.

5. Controles del reactivo préparado:

► Control macroscópico: Líquido incoloro.► Control de esterilidad: En TSB y TIO.

6. Conservación:

► Disolución preparada ............................................................................... 1 mes a 3°C ± 2°C.

7. Medios utilizados:► BP (PNT-ME-019): Añadir 10 mL de disolución a 190 mL de medio, en el momento de

preparar las placas.

H 4 M iT O P O I B l A N 4 U B H M IBW QIIOLOaiCOl DB ALIMENTOS

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL SULFATO DE POLIMIXINA B AL

1. Finalidad de uso:El SULFATO DE POLIMDQNA B AL 4% es un suplemento selectivo utilizado en los medios MYPA y PEMBA para el aislamiento y recuento de Bacillus cereus.

2. Principios:Inhibe el crecimiento de la flora acompañante.

3. Preparación:• Añadir asépticamente 5 mL de agua destilada estéril al vial con el producto liofílizado.• Disolver cuidadosamente.• Evitar la congelación.


4. Composición:Polimixina B .............................................................................................................. 50.000 IU.

Si Controles del reactivo preparado:► Control macroscópico: Líquido incoloro.

6i Conservación:► Vial sin reconstitu ir.......................................... A 2°C-8°C, hasta la fecha de caducidad.► Vial reconstituido ............................................. 1 mes a 2°C-8°C.

7i Medios utilizados:► MYPA (PNT-ME-022): Añadir 2 mL de suplemento a 180 mL de medio, en el momento

de preparar las placas.

PROCEDIMIENTOS DE PREPARACION DE REACTIVOS 226

PN T-R E-008 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL ROJO DE METELO

1. Finalidad de uso:El ROJO DE METILO se utiliza como indicador de pH en la prueba del Rojo de Metilo de los tests IMVIC.

2. Principios:Las enterobacterias pueden fermentar la glucosa mediante 2 vias: la ácido-mixta y la 2,3,bu- tanodiólica.Así, después de la incubación en el medio predominan los productos ácidos si la vía es la ácido-mixta, mientras que si es la 2,3,butanodiólica predominan los productos neutros.Al añadir el indicador al medio, éste virará a rojo si el medio es ácido, mientras que cambiará a amarillo si no ha habido acidificación.

3. Preparación:• Disolver 0,1 g de rojo de metilo en 300 mL de etanol absoluto.• Añadir agua destilada hasta obtener un volumen de 500 mL.

4. Composición:Rojo de metiloEtanol .............Agua destilada

5. Controles del reactivo preparado:► Control macroscópico: Líquido de color naranja-rojo.► Control de eficacia: En RM-VP con Escherichia coli (positivo) y Enterobacter cloacae

(negativo).

6. Conservación:

A T ambiente.

7. Medios utilizados:► MR-VP (PNT-ME-023): Añadir 5 gotas de reactivo en un cultivo de unos 2-3 mL, que ha

estado incubado durante 24 h.

0,1 g. 300 mL. 200 mL.

I » M lTO D O I D I ANALIBI* MICHOHIOLÓQIC08 DE ALIMENTOS

PN T - RE - 0 09PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN

DE LA SOLUCIÓN DE a-NAFTOL

1. Finalidad de uso:La solución de a-NAFTOL se utiliza junto con el KOH como indicador en la prueba de Voges-Proskauer de la fermentación de la glucosa en los tests IMVIC.

2. Principios:Las enterobacterias pueden fermentar la glucosa mediante 2 vias: la ácido-mixta y la 2,3, bu- tanodiólica.El a-naftol detecta los metabolitos que se forman en la vía 2,3, butanodiólica, haciendo que la superficie del medio cambie a rojo, en condiciones aerobias.Este viraje se manifiesta si el medio se encuentra en condiciones alcalinas; éste es el motivo por el que añadimos también KOH.

3. Preparación:• Disolver 5 g de a-naftol en 100 mL de etanol absoluto.

4. Composición:a-naftol ........................................................................................................................... 5 g.Etanol ..................................................................................... 100 mL.

5. Controles del reactivo preparado:► Control macroscópico: Líquido translúcido de color rosado.► Control de eficacia: En RM-VP, junto con KOH, con Enterobacter cloacae (positivo) y

Escherichia coli (negativo).

6. Conservación:A 4°C, resguardados de la luz, hasta que se vuelva de color marrón con precipitado.

7. Medios utilizados:► MR-VP (PNT-ME-023): Añadir 10 gotas de solución en un cultivo de unos 2-3 mL, que

ha estado incubado durante 24 h. Añadir el KOH y después el a-naftol; agitar y dejar reposar de 15 min a 2 h.

NOTA: Para acelerar el proceso, se puede:■ Calentar suavemente el tubo con el medio.■ Oxigenar el tubo.■ Añadir cristales de creatina.


PNT * R E -010 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE KOH AL 40%


La solución de KOH AL 40% se utiliza junto con el a-naftol para alcalinizar el medio en la prueba de Voges-Proskauer de la fermentación de la glucosa en los tests IMVIC.

2. Principios:

El KOH se añade al medio con la finalidad de aumentar su pH.

3. Preparación:

• Disolver 40 g de KOH en 100 mL de agua destilada.

4. Composición:

KOH ..............Agua destilada

5. Controles del reactivo preparado:

► Control macroscópico: Líquido incoloro.► Control de eficacia: En RM-VP, junto con a-naftol, con Enterobacter cloacae (positivo)

y Escherichia coli (negativo).

6. Conservación:

A T ambiente.

7. Medios utilizados:

► MR-VP (PNT-ME-023): Después de añadir el a-naftol, añadir 6 gotas de solución en un cultivo de unos 2-3 mL, que ha estado incubado durante 24 h. Agitar y dejar reposar de 15 min a 2 h.

NOTA: Para acelerar el proceso, se puede:■ Calentar suavemente el tubo con el medio.■ Oxigenar el tubo.■ Añadir cristales de creatina.

40 g. 100 mL.


PNT - RE - 011 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DEL REACTIVO DE NITRATOS

1. Finalidad de uso:El REACTIVO DE NITRATOS se utiliza para identificar la enzima nitrato-reductasa.

2. Principios:Los microorganismos que poseen el enzima reducen los nitratos a nitritos. Los nitritos, al reaccionar con estos reactivos, producen un compuesto azoico de color rosa-rojo.

3. Preparación:• Disolver 0,1 g de 5,2 ANSA en 100 mL de ácido acético (15% v/v).• Disolver 0,4 g de ácido sulfamínico en 100 mL de ácido acético (15% v/v).• Filtrar separadamente las dos soluciones en papel de filtro.

4. Composición:Solución A: 5,2, A N SA 0,1 g.

Ácido acético (2,6 mol/L) 100 mL.Solución B: Ácido sulfanílico 0,4 g.

Ácido acético (2,6 m o l/L ) 100 mL.

5 Controles del reactivo preparado:► Control macroscópico: Líquidos incoloros.► Control de eficacia: En MN con Escherichia coli (positivo) y Acinetobacter sp. (negativo).

6. Conservación:A 5°C, resguardados de la luz, mientras se conserven incoloros o rosa pálido.

7. Medios utilizados:► MN (PNT-ME-024): Añadir 0,2 mL de cada solución al cultivo incubado durante 24 h ±

2 h.La reacción acostumbra a ser instantánea; si no hay cambio de color en 15 minutos, añadir zinc en polvo. El zinc reduce los nitratos que quedan en el medio. Si la reacción continua siendo negativa significa que los nitratos se habían reducido directamente a N2. Una reacción positiva con zinc indica que no había habido ningún tipo de reducción previa.

NOTA: En caso de no disponer de ANSA, utilizar:Solución A: Ácido sulfanílico 0,8 g.

Ácido acético (5 mol/L) 100 mL.Solución B: a-nafto l 0,5 g.

Ácido acético (5 mol/L) 100 mL.


PNT - RE - 012 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL METABISULFITO SÓDICO AL 1,2%

1. Finalidad de uso:El METABISULFITO SÓDICO AL 1,2% se utiliza como agente reductor e indicador.

2. Principios:En el medio LS, la reducción del sulfito por parte de los clostridios en presencia del citrato férrico da lugar a la formación de sulfuro de hierro, que forma un precipitado negro en el fondo del tubo.

3. Preparación:

• Disolver 1,2 g de metabisulfito sódico en 100 mL de agua destilada.• Esterilizar por filtración con filtro de membrana de 0,45 p de tamaño de poro.

4. Composición:Metabisulfito só d ico ..................................................................................................... 1,2 g.Agua destilada .............................................................................................................. 100 mL.

5. Controles del reactivo preparado:► Control macroscópico: Líquido incoloro.► Control de esterilidad: En TSB y TIO.► Control de eficacia: En LS con Clostridium perfringens.

6. Conservación:A 4°C durante 24 h.

7. Medios utilizados:► LS (PNT-ME-029): Añadir 0,5 mL de reactivo en cada tubo con 10 mL de medio, en el

momento de utilizar.


P N T -R E -013 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL CITRATO FÉRRICO AMONIACAL AL 1%

1. Finalidad de uso:El CITRATO FÉRRICO AMONIACAL AL 1 % se utiliza como componente diferencial y indicador.

2. Principios:En el medio LS, la reducción del metabisulfito por parte de los clostridios en presencia del citrato férrico da lugar a la formación de sulfuro de hierro, que forma un precipitado negro en el fondo del tubo.

3. Preparación:• Disolver 1 g de citrato de hierro en 100 mL de agua destilada.• Esterilizar por filtración con filtro de membrana de 0,45 p. de tamaño de poro.

4. Composición:Citrato férrico amoniacal ................................................................................................... 1 g.Agua destilada................................................................................................................ 100 mL.

5. Controles del reactivo preparado:► Control macroscópico: Líquido de color ámbar.► Control de esterilidad: En TSB y TIO.► Control de eficacia: En LS con Clostridium perfringerís.

6. Conservación:A T ambiente durante 24 h.

7. Medios utilizados:► LS (PNT-ME-029): Añadir 0,5 mL de reactivo en cada tubo con 8 mL de medio, en el

momento de utilizar.

NOTA: En caso de no disponer de citrato férrico amoniacal, utilizar SULFATO DE HIERRO.


PNT - RE - 014 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER SEMI


El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER SEMI se utiliza con el medio para el enriquecimiento primario para la detección de Listeria monocytogenes en alimentos.

2. Principios:El suplemento es una mezcla de dos agentes antimicrobianos (el ácido nalixídico y la acriflavina) y un reactivo (el citrato férrico). El ácido nalixídico bloquea la replicación del ADN de las bacterias sensibles a él, mientras que la acriflavina impide el crecimiento de bacterias Gram positivas.Evita el crecimiento de la mayoría de los microorganismos contaminantes, favoreciendo así el crecimiento de Listeria.El citrato de hierro se utiliza para visualizar la esculetina, que es producida por Listeria a partir de la esculina. En presencia de iones férricos, la esculetina forma precipitados negros, que aparecen progresivamente. Asimismo, el hierro favorece el crecimiento de Listeria.

3. Preparación:• Añadir asépticamente 5 mL de solución 1:1 de etanol y agua destilada estéril al vial con el

producto liofílizado.• Disolver cuidadosamente, evitando la formación de espuma.• Si es necesario, enjuagar el vial con 1 mL más de diluyente.


4. Composición:Ácido nalixídico 5 mg.Clorhidrato de acriflavina 6,25 mg.Citrato de hierro (III) am oniacal................................................................................ 250 mg.

5. Controles del reactivo preparado:► Control macroscópico: Líquido oscuro, que puede contener precipitado.

6. Conservación:► Vial sin reconstituir A 2°C-8°C, protegido de la luz,

hasta la fecha de caducidad.► Vial reconstituido ............ 1 mes a 2°C-8°C, protegido de la luz.

7. Medios utilizados:► FRASER SEMI (PNT-ME-036): Añadir 2,25 mL de suplemento a 225 mL de medio, en

friado a 25°C, en el momento de utilizar.


P N T - M E -015PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION

DEL SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER COMPLETO

1. Finalidad de uso:El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL CALDO FRASER COMPLETO se utiliza con el medio para el enriquecimiento secundario para la detección de histeria monocytogenes en alimentos.

2. Principios:El suplemento es una mezcla de dos agentes antimicrobianos (el ácido nalixídico y la acriflavina), en una concentración distinta a la del medio FRASER SEMI, y un reactivo (el citrato férrico). El ácido nalixídico bloquea la replicación del ADN de las bacterias sensibles a él, mientras que la acriflavina impide el crecimiento de bacterias Gram positivas.Evita el crecimiento de la mayoría de los microorganismos contaminantes, favoreciendo así el crecimiento de Listeria.El citrato de hierro se utiliza para visualizar la esculetina, que es producida por Listeria a partir de la esculina. En presencia de iones férricos, la esculetina forma precipitados negros, que aparecen progresivamente. Asimismo, el hierro favorece el crecimiento de Listeria.


producto liofilizado.• Disolver cuidadosamente, evitando la formación de espuma.• Si es necesario, enjuagar el vial con 1 mL más de diluyente.


4. Composición:Ácido nalixídico ............................................................................................................ 10 mg.Clorhidrato de acriflavina 12,5 mg.Citrato de hierro (III) am oniacal.................................................................................. 250 mg.

5. Controles del reactivo preparado:► Control macroscópico: Líquido oscuro, que puede contener precipitado.

6. Conservación:► Vial sin reconstituir

► Vial reconstituido ..

7. Medios utilizados:► FRASER COMPLETO (PNT-ME-037): Añadir 0,1 mL de suplemento en cada tubo con

10 mL de medio, enfriado a 25°C, en el momento de utilizar.

A 2°C-8°C, protegido de la luz, hasta la fecha de caducidad.

1 mes a 2°C-8°C, protegido de la luz.

PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIÓN DE REACTIVOSm

PNT - RE - 016 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR OXFORD

1. Finalidad de uso:El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR OXFORD se utiliza para la detección y recuento de Listeria en alimentos.

2. Principios:El suplemento es una mezcla de tres antibióticos (la colistina, el cefotetán y la fosfomicinu), un agente antifúngico (la cicloheximida) y un tinte antiséptico (la acriflavina).Evita el crecimiento de la mayoría de los microorganismos contaminantes, favoreciendo uní el crecimiento de Listeria.



NOTA: En caso de no utilizar todo el contenido del vial, indicar en el envase la fecha de re- constitución y conservar según lo indicado en el punto 6.

4. Composición:Ciclohexim ida......Sulfato de colistinaC efo tetán ...............Fosfom icina..........Acriflavina ...........

5. Controles del reactivo preparado:► Control macroscópico: Solución fluorescente de color amarillo-verdoso.

6. Conservación:► Vial sin reconstituir ....................................................... A 2°C-8°C, protegido de la luz,

hasta la fecha de caducidad.► Vial reconstituido ................................................... 1 mes a 2°C-8°C, protegido de la luz.

7. Medios utilizados:► AGAR OXFORD (PNT-ME-038): Añadir 1 mL de suplemento a 100 mL de medio, en el

momento de preparar las placas.

200 mg. 10 mg.

1 mg. 5 mg. 2,5 g.


PNT - RE - 017PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DEL

SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR PALCAM


El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR PALCAM se utiliza con el medio para la detección y recuento de Listeria en alimentos.

2. Principios:

El suplemento es una mezcla de antibióticos (la polimixina y la ceftazidima) y un tinte antiséptico (la acriflavina).Evita el crecimiento de la mayoría de los microorganismos contaminantes, favoreciendo así el crecimiento de Listeria.

3. Preparación:

Añadir asépticamente 5 mL de agua destilada estéril al vial con el producto liofilizado. Disolver cuidadosamente, evitando la formación de espuma.Si es necesario, enjuagar el vial con 1 mL más de diluyente.


4. Composición:

Sulfato de polimixina B .................................................................................................. 5 mg.C eftazidim a.......................................................................................................................... 10 mg.A criflav ina............................................................................................................................ 2,5 g.


► Control macroscópico: Solución transparente de color amarillo.

6* Conservación:

► Vial sin reconstitu ir....................................................... A 2°C-8°C, protegido de la luz,hasta la fecha de caducidad.

► Vial reconstituido...................................................... 1 mes a 2°C-8°C, protegido de la luz.


► AGAR PALCAM (PNT-ME-039): Añadir 1 mL de suplemento a 100 mL de medio, en el momento de preparar las placas.


PNT - ME - 018PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN

DE LA SOLUCIÓN DE ANTIBIÓTICOS «A» PARA EL CALDO DE PARK Y SANDERS


La SOLUCIÓN DE ANTIBIÓTICOS «A» se añade al caldo de Park y Sanders para la detección de Campylobacter termotolerantes en alimentos.

2. Principios:El suplemento es una mezcla de antibióticos (la vancomicina y el lactato de trimetoprima). Evita el crecimiento de la mayoría de los microorganismos contaminantes, favoreciendo así el crecimiento de Campylobacter.

3. Preparación:• Disolver los componentes en 10 mL de solución 1:1 de etanol al 95% y agua destilada es

téril.• Esterilizar por filtración con filtro de membrana de 0,45 jn de tamaño de poro.

4. Composición:V ancom icina..................................................................................................................... 0,02 g.Lactato de trim etoprim a.................................................................................................. 0,02 g.E ta n o l................................................................................................................................. 5 mL.Agua destilada .................................................................................................................. 5 mL.

5. Controles del reactivo preparado:► Control macroscópico: Solución transparente de color ámbar.► Control de eficacia: En CALDO DE PARK Y SANDERS con Campylobacter sp.

6. Conservación: Utilizar inmediatamente.

7. Medios utilizados:► CALDO DE PARK Y SANDERS (PNT-ME-042): Añadir 10 mL de suplemento a 250 mL

de medio, en el momento de utilizar.

230 MI* 1 ODON 01 A N A U IH MICROBIOLOGICOS DE ALIMENTOS

PNT - ME - 0J9PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN

DE LA SOLUCIÓN DE ANTIBIÓTICOS «B» PARA EL CALDO DE PARK Y SANDERS

1. Finalidad de uso:La SOLUCIÓN DE ANTIBIÓTICOS «B» se añade al caldo de Park y Sanders en el enriquecimiento para la detección de Campylobacter termotolerantes en alimentos.

2. Principios:El suplemento es una mezcla de antibióticos (la vancomicina y la cicloheximida). Evita el crecimiento de la mayoría de los microorganismos contaminantes, favoreciendo así el crecimiento de Campylobacter.

3. Preparación:• Disolver los componentes en 50 mL de solución 1:1 de acetona y agua destilada estéril.• Esterilizar por filtración con filtro de membrana de 0,45 p, de tamaño de poro.

4. Composición:

Cefoperazona Cicloheximida Acetona .........Agua destilada.................................................................................................................... 25 mL.

5. Controles del reactivo preparado:► Control macroscópico: Solución transparente de color ámbar.► Control de eficacia: En CALDO DE PARK Y SANDERS con Campylobacter sp.

6. Conservación: Utilizar inmediatamente.


0 ,032 g.0,1 g.

25 mL.

► CALDO DE PARK Y SANDERS (PNT-ME-042): Aüadir 12,5 mL de suplemento a 250 mL de medio, en el momento de utilizar.


PNT-RE-020 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR DE KARMALI


El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR DE KARMALI se utiliza con el medio para el aislamiento selectivo de Campylobacter en alimentos.

2. Principios:

El suplemento es una mezcla inhibitoria compuesta por dos antibióticos (la vancomicina y la cefoperazona). La cefoperazona amplía el espectro de acción de la vancomicina, de manera que hay una mayor inhibición de las bacterias contaminantes.

3. Preparación:

• Añadir asépticamente 5 mL de agua destilada estéril al vial con el producto liofilizado.• Disolver cuidadosamente, evitando la formación de espuma.• Si es necesario, enjuagar el vial con 1 mL más de diluyente.


4. Composición:

V ancom icina........................................................................................................................... 10 mg.Cefoperazona........................................................................... 16 mg.


► Control macroscópico: Solución de color blanco, ligeramente opalescente.► Control de eficacia: En AGAR KARMALI con Campylobacter.

6. Conservación:

► Vial sin reconstituir.............. A 2°C-8°C, protegido de la luz,hasta la fecha de caducidad

► Vial reconstituido...................................................... 1 mes a 2°C-8°C, protegido de la luz

7. Medios utilizados:► AGAR KARMALI (PNT-ME-043): Añadir 1 mL de suplemento a 100 mL de medio, en

el momento de preparar las placas.


PNT - RE - 021 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DEL SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR BUTZLER

1. Finalidad de uso:El SUPLEMENTO SELECTIVO PARA EL AGAR BUTZLER se utiliza con el medio para el aislamiento selectivo de Campylobacter en alimentos.

2. Principios:El suplemento está formado por una mezcla de cinco agentes antimicrobianos. Esta combinación permite el crecimiento de Campylobacter a 37°C, especialmente el de las cepas que no crecen a 43°C.La colistina del medio provoca la ruptura de las membranas celulares de las bacterias Gram negativas, mientras que la cicloheximida inhibe el crecimiento de ciertos mohos.




4. Composición:Bacitracina ...........Sulfato de colistinaCefazolina ............Novobiocina.........Cicloheximida ......

12.500 IU. 5.000 IU.

7.5 mg.2.5 mg. 25 mi.

5. Controles del reactivo preparado:► Control macroscópico: Solución amarillenta, sin precipitado.► Control de eficacia: En AGAR COLUMBIA SANGRE con Campylobacter.

6. Conservación:► Vial sin reconstituir ...................................................... A 2°C-8°C, protegido de la luz,

hasta la fecha de caducidad.► Vial reconstituido ................................................... 1 mes a 2°C-8°C, protegido de la luz.

7. Medios utilizados:► AGAR BUTZLER (PNT-ME-044): Añadir 1 mL de suplemento a 100 mL de medio.


PNT - RE - 022 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE KOVACS


El REACTIVO DE KOVÁCS se utiliza para la detección del indol, resultante de la degradación del triptófano en el medio AT por parte de algunos microorganismos.

2. Principios:

Cuando el reactivo de Kovacs entra en contacto con el indol se desarrolla una coloración rojo cereza característica, en forma de anillo, en la superficie del tubo (en la zona en contacto con el oxígeno).

3. Preparación:• Disolver 5 g de 4-dimetilamino-benzaidehído en 75 mL de alcohol isoamílico a 50°C -

55°C.• Homogeneizar sin incorporar aire.• Mantener el recipiente en un baño con agua helada.• Añadir el ácido clorhídrico concentrado mientras se agita.

4. Composición:Ácido 4-dimetilamino-benzaldehído .................................................................................. 5 g.Alcohol isoam ílico.......................................................................... 75 mL.Ácido clorhídrico 1,18 -1,19 d ........................................................................................... 25 mL.


► Control macroscópico: Líquido amarillo.► Control de eficacia: Con Escherichia coli (positivo) y Salmonella Enteritidis (negativo).► La producción de indol se inhibe por la presencia de nitritos.

6. Conservación:

A 4°C, resguardados de la luz.

7. Medios utilizados:► AT (PNT-ME-017): Añadir 0,5 mL de cada reactivo en cada tubo. Agitar para que el in

dol entre en contacto con el reactivo y dejar actuar un máximo de 1 minuto.


PNT - RE - 023 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE LA SOLUCIÓN SALINA (SS)

1. Finalidad de uso:La SOLUCIÓN SALINA (SS) se utiliza en pruebas bioquímicas y en la prueba de autoa- glutinación para la investigación serológica de Salmonella.

2. Principios:La solución salina es un diluyente no tóxico para los microorganismos.

3. Preparación:• Disolver 8,5 g de cloruro sódico en 1 L de agua destilada.• Homogeneizar sin incorporar aire.• Repartir 10 mL de medio en tubos de 16 x 160 mm.• Esterilizaren autoclave a 121°C durante 15 min.

4. Composición:Cloruro sódico .................................................................................................................... 8,5 g.Agua destilada 1 L.

5. Controles del reactivo preparado:► Control macroscópico: Líquido incoloro.► Control de esterilidad: Incubar a 30°C durante 3 días.► Control de eficacia: Sembrar Enterococcus y Salmonella. Si no se aprecia crecimiento

(turbidez), aislar en PCA.

6. Conservación:3 meses a 4°C-6°C, realizando controles de esterilidad periódicamente y antes de cada uso.

7. Utilización:• Sero-aglutinación.• Emulsión para API.

PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS

PNT - ME - 024PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DEL REACTIVO PARA LA INVESTIGACIÓN

DE LA 0-GALACTOSIDASA (ONPG)

1. Finalidad de uso:El REACTIVO PARA LA INVESTIGACIÓN DE LA 0-GALACTOSIDASA (ONPG) se utiliza para detectar la presencia de la enzima /3-galactosidasa.

2. Principios:La /2-galactosidasa es una enzima que desdobla la molécula de lactosa en galactosa y glu cosa. Cuando el ONPG entra en contacto con la enzima, ésta transforma el reactivo de oí tofenil a ortofenol, que es de color amarillo.Los microorganismos que no poseen esta enzima no pueden fermentar la lactosa.

3. Preparación:• Disolver 80 mg de ONPG en 15 mL de agua destilada a 50°C - 55°C.• Homogeneizar sin incorporar aire.• Enfriar a T ambiente.• Añadir 5 mL de solución tampón.

4. Composición:

5. Controles del reactivo preparado:► Control macroscópico: Líquido incoloro.► pH a 25°C (solución tampón): 7,00 ± 0,2.► Control de esterilidad: En TSB y TIO.► Control de eficacia: Con Escherichia coli (positivo, color amarillo) y Salmonella Enteri-

tidis (negativo, incoloro).

6. Conservación:A 4°C, hasta que el reactivo se observe turbidez, realizando un control de esterilidad antes de cada uso.


ONPG 80 mg.6,9 g.Solución tampón: Dihidrogenofosfato de sodio

Hidróxido sódico al 30% .... Agua destilada ......................

45 mL. 3 mL.

► SS (PNT-RE-23): Añadir 0,25 mL de cada reactivo en cada tubo. Realizar lecturas al cabo de V2 h, 1 h, 2 h y 24 h.


PNT - RE - 025 PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE LA SOLUCIÓN DE FENILALANINA AL 0,5% (FA)

1. Finalidad de uso:La SOLUCIÓN DE FENILALANINA AL 0,5% (FA) se utiliza, junto con el cloruro férrico, para detectar la presencia de la enzima fenilalanina desaminasa.

2. Principios:Los microorganismos que poseen la enzima fenilalanina desaminasa pueden transformar la fenilalanina en ácido fenilpirúvico (es decir, convertir aminoácidos en ácidos cetónicos) en condiciones de aerobiosis.Esta facultad se utiliza principalmente para diferenciar los géneros Salmonella y Proteus.

3. Preparación:• Disolver 0,5 g de L-fenilalanina en 100 mL de agua destilada estéril.• Homogeneizar sin incorporar aire.• Transferir a un recipiente estéril.

4. Composición:L-fenilalanina................................................................................................................. 0,5 g.Agua destilada.......................................... 100 mL.

5. Controles del reactivo preparado:► Control macroscópico: Líquido incoloro.► Control de esterilidad: En TSB y TIO.► Control de eficacia: Con Proteus (positivo, color verde oscuro) y Salmonella (negativo, in

coloro).

6. Conservación:A 2°C-6°C, realizando controles de esterilidad periódicamente y antes de cada uso.

7. Medios utilizados:► SS (PNT-RE-23): Añadir 0,5 mL en cada tubo.

PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS

PNT - RE - 026 PROCEDIM IENTO PARA LA PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE CLORURO FÉRRICO AL 10%


La SOLUCIÓN DE CLORURO FÉRRICO AL 10% se utiliza, junto con la fenilalanina, para detectar Ja presencia de la enzima fenilalanina desaminasa.

2. Principios:

Los microorganismos que poseen la enzima fenilalanina desaminasa pueden transformar, en condiciones de aerobiosis, la fenilalanina en ácido fenilpiruvico. Este ácido, en contacto con iones férricos, produce una coloración verde oscuro durante unos minutos.

3. Preparación:

• Disolver 10 g de cloruro férrico en 100 mL de agua destilada.• Homogeneizar sin incorporar aire.• Transferir a un frasco de 250 mL.

4. Composición:

Cloruro férrico Agua destilada


► Control macroscópico: Líquido de color crema oscuro.► Control de eficacia: Con Proteus (positivo, color verde oscuro) y Salmonella (negativo, in-

coloro-amarillento).

6. Conservación:

A T ambiente/resguardado de la luz, realizando controles de esterilidad periódicamente y antes de cada uso.


10 g.100 mL.

► SS (PNT-RE-23): Añadir 1-2 gotas de reactivo a cada tubo con 0,5 mL de SS y 0,5 mL de FA, incubado durante 4 h a 37°C ± 1°C.

BIBLIOGRAFÍA GENERAL

B e r g e y ’s m a n u a l (1994): Bergey’s manual of detérminative bacteriology. Ninth edition. Williams & Wilkins. USA.

C a lv ís , S. (1998): Redacción e introducción del Manual de Calidad y del Procedimiento General de Redacción y Gestión de la Documentación en el laboratorio de Microbiología de aguas y Alimentos.

ENAC (1997): Guía para la acreditación de laboratorios que realizan análisis microbiológicos. G-ENAC-04. Rev. 2.

S aba ter , J.; V ilum ara , A. (1989): Buenas prácticas de laboratorio (GLP) y garantía de calidad (Quality Assurance): Principios básicos. Ed. Díaz de Santos. Madrid.

NORMATIVA

• AFNOR NF V 08-050 (1992): Microbiologie alimentaire. Méthode de routine pour le dé- nombrement des coliformes. Méthode par comptage des colonies obtenues á 30°C.

• AFNOR NF V 08-051 (1992): Microbiologie alimentaire. Méthode de routine pour le dé- nombrement des microorganismes. Métode par comptage des colonies obtenues á 30°C.

• AFNOR NF V 08-052 (1993): Microbiologie alimentaire. Méthode de routine pour la recherche des Samonella.

• AFNOR NF V 08-053 (1993): Microbiologie alimentaire. Dénombrement des Escherichia coli /3-gIucuronidase positive par comptage des colonies obtenues. Méthode de routine.

• AFNOR NF V 08-054 (1993): Microbiologie alimentaire. Dénombrement des Enterobacte- riaceae par comptage des colonies. Méthode de routine.

• AFNOR NF V 08-055 (1993): Microbiologie alimentaire. Recherche de Listeria monocytogenes. Méthode de routine.

• AFNOR NF V 08-056 (1994): Microbiologie alimentaire. Dénombrement des Clostridium perfringens par comptage des colonies á 37°C.

• AFNOR NF V 08-057-1 (1994): Microbiologie alimentaire. Méthode de routine pour le dénombrement des St^phylocoques á coagulase positive par comptage des colonies á 37°C. Partie 1. Technique avec confirmation des colonies.

• AFNOR NF V 08-057-2 (1994): Microbiologie alimentaire. Méthode de routine pour le dénombrement des Staphylocoques á coagulase positive par comptage des colonies á 37°C. Partie 2. Technique sans confirmation des colonies.

• AFNOR XP V 08-058 (1995): Microbiologie alimentaire. Dénombrement de Bacillus cereus par comptage des colonies á 30°C. Méthode de routine.

• AFNOR XP V 08-059 (1995): Microbiologie des aliments. Dénombrement des levures et moisissures par comptage des colonies á 25°C. Méthode de routine.

• AFNOR XP V 08-102 (1997): Microbiologie des aliments. Regles générales pour le comptage des colonies et pour l’expression des résultats. Cas du dénombrement sur milieu solide.

• EN 13401 (1999): Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for enumeration of Clostridium perfringens. Colony-count techinique (ISO 7937:1997 modified).

• ISO 7954 (1988): Microbiologie. Directives générales pour le dénombrement des levures et moisissures. Technique par comptage des colonies á 25°C.

• ISO 4831 (1991): Microbiologie. Directives générales pour le dénombrement des coliformes. Technique du nombre le plus probable.

• ISO 4832 (1991): Microbiologie. Directives générales pour le dénombrement des coliformes. Méthode par comptage des colonies.

• ISO 4833 (1991): Microbiologie. Directives générales pour le dénombrement des micro-or- ganismes. Méthode par comptage des colonies obtenues á 30°C.

247

248 NORMATIVA

• ISO 8523 (1992): Microbiologie. Directives générales pour la recherche des Enterobacteria- ceae avec pré-enriquissement.

• ISO 6579 (1993): Microbiologie. Directives générales concemant les méthodes de recherche des Salmonella.

• ISO 7402 (1993): Microbiologie. Directives générales pour le dénombrement sans revivífica- tion des Enterobacteriaceae. Techinque NPP el méthode par comptage des colonies.

• ISO 7251 (1994): Microbiologie. Directives générales pour le dénombrement d ’ Escherichia coli présumés. Thecnique du nombre le plus probable.

• ISO 7932 (1994): Microbiologie. Directives générales pour le dénombrement de Bacillus cereus. Méthode par comptage des colonies á 30°C.

» ISO 7218 (1996): Microbiologie des aliments. Regles générales pour les examens microbio- logiques.

• ISO 10272 (1996): Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for de- tection of thermotolerant Campylobacter.

• ISO 11290-1 (1997): Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes. Partie 1: Méthode de récherche.

• ISO 11290-2 (1998): Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes. Partie 2: Méthode de dénombrement.

• ISO 6888-1 (1999): Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal mehtod for enumeration of coagulase positive staphylococci {Staphylococcus aureus and other species). Part 1: Technique using Baird-Parker agar médium.

• ISO 6888-2 (1999): Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for enumeration of coagulase positive staphylococci {Staphylococcus aureus and other species). Part 1: Technique using Rabbit Plasma Fibrinogen agar médium.

metodos de analisis microbiologicos de alimentos - corrie allaert vandevenne

Documents