Medizinische MikrobiologieMedizinische MikrobiologiePharmazie KursPharmazie Kurs

K. ZimmermannFLI f. Medizin. Mikrobiologie

Methoden zum Nachweis von MikroorganismenMethoden zum Nachweis von Mikroorganismen

• Mikroskopie– Lichtmikroskopie

• Nativpräparate• Färbungen

– Übersichtsfärbungen � Methylenblau– Differentialfärbungen � Gram

� Ziehl-Neelsen– Elektronenmikroskopie

• Kultur• Serologische Methoden• Molekularbiologische Methoden• Zellkultur• Tierversuch

Mikroskopischer Nachweis von MikroorganismenMikroskopischer Nachweis von Mikroorganismen

Lichtmikroskopie- Nativpräparate: ungefärbt

- Übersichtsfärbungen (ein Farbstoff)� Darstellung von Strukturen

- Differentialfärbungen (Färbung/Gegenfärbung)� Zellwand: Gram-F., Ziehl-Neelsen-F.� Kapsel / Sporen / Geißeln

Elektronenmikroskopie

Ablauf GramfAblauf Gramf äärbungrbung

1. Lufttrocknen u.Fixieren (Hitze, Ethanol)

2. Färben mit GentianaviolettGentianaviolett-Phenol-Ammoniumoxalatlösung

anschließend spülen (H2O)

3. Beizen (Lugolsche Lösung)Jod-Kaliumjodid-Lösung

anschließend spülen (H2O)

4. Entfärben mit 96%igem Alkoholanschließend spülen (H2O)

5. Gegenfärbung mit FuchsinFuchsin-Phenolrot-Lösung

anschließend spülen (H2O)

Vermehrung von MikroorganismenVermehrung von Mikroorganismen((MikroorganismenkulturMikroorganismenkultur ))

Nährmedien / Kulturmedien:zur Kultivierung von Mikroorganismen dienende Substrate, die alle zum Wachstum erforderlichen Nährstoffe enthalten

- synthetische Medien ↔ komplexe Medien- feste Medien ↔ flüssige Medien- Universalmedien (Komplett-, Vollmedien) ↔ Spezialmedien

beinhalten eine genau bestimmte Anzahl und Menge an Inhaltsstoffen, die chemisch gereinigt werden, u m Spuren von anderen Stoffen auszuschließen (z.B. Amies-Medium)

Synthetische Medien(def. Medien)

Nährboden (Nährbouillon mit zugesetzten Verfestigungsmitteln, z.B. Gelatine, Agar)

Feste Medien

Nährbouillon, Nährbrühe(z.B. Fleischwasser)

Flüssige Medien

Sonderform der definierten Medien, beinhalten nur die minimal nötigen Stoffe für das Wachstum der zu kultivierenden Mikroorganismen

Minimalmedien

bestehen aus Nährstoffen deren Inhalte nicht chemisch bestimmt sind, wie zum Beispiel Rindfleisch-Extrakt, Caseinhydrolysat, Hefeextrakt(z.B. Blutagar)

Komplexe Medien

CharakterisierungNährmedium

Nährmedien zur Kultivierung von Mikroorganismen

Agar (Agar-Agar):

● gelierfähiges Polysaccharid, vorwiegend Polygalaktane. Gewinnung hauptsächlich inOstasien aus verschiedenen Meeres-Rotalgen (Gelidium, Gracilaria).

● Nähragar wird beim Erhitzen ab 95°C flüssig und erst arrt ab 45°C.

● Agar wird von Bakterien nicht abgebaut.

Vorteil gegenüber Nährbouillon :

auf festen (Agar-)Nährböden können Reinkulturenvon Bakterien isoliert werden.

Blutagar:

zu 100 ml verflüssigtem Nähragar(auf 50°C abgekühlt) 5-10 ml defibriniertes Blut geben, mischen und in Petrischalen ausgiessen.

Nährmedien zur Kultivierung von Mikroorganismen

Nährmedien zur Kultivierung von Mikroorganismen

Spezialmedien, die eine Unterscheidung verschiedener Mikroorganismen ermöglicht. Sie zeigen bestimmte Stoffwechselleistungen an(z.B. MacConkey-Agar)

Differentialmedien(Indikatormedien)

Spezialmedien, enthalten Hemmstoffe, die nur das Wachstum bestimmter Mikroorganismen zulassen(z.B. Tinsdale-Agar zur Anzucht von Korynebakterien)

Selektivmedien

Medien, die das Wachstum bestimmter Bakterien fördern(z.B Mannit-Kochsalz-Agar zur Anzucht von Staphylococcus aureus)

SpezialmedienElektivmedien

komplexe oder synthetische Nährmedien, auf der eine Vielzahl verschiedener Mikroorganismen wachsen(z.B. Blutagar)

Universalmedien(Komplettmedien )

CharakterisierungNährmedium

NNäährbhrb öödenden

• GrundbestandteileAgar-Agar Seealgen, getrocknete Kolloidsubstanz

fester Nährboden = 1-2%

Peptone eiweißhaltiges Material, Fleisch, Casein,Sojabohnen, enzymat. Hydrolyse (Polypeptid, Dipeptid, Aminosäure)völlig löslich in H2O pH 5-7

Fleischextrakt mageres RindfleischHefeextrakt autolysierte Hefe (Vit. B-Komplex)

• Spezielle NährsubstrateSerum 10%Blut 5-10% Schaf defibriniertKochblut (hohe Ansprüche) 5-10 min 75-80°CMacConkey-Agar = Selektivnährboden (kein Blut)Eiernährboden ( Malachitgrün + Ei-emulsion)

Differenzierung grampositiver KokkenDifferenzierung grampositiver Kokken

Katalase

StreptokokkenStreptokokken

positiv negativ

StaphylokokkenStaphylokokken

positiv negativ

Koagulase

St. St. aureusaureus KNSKNS

Hämolyse

αα ββ ((γγ))

VSVS((ßß)HS)HS

anhanhäämol.Strmol.Str..

Das eisenporphyrinhaltige Enzym Katalase wird von

den meisten oxidasepositiven

aeroben und fakutativ anaeroben Spezies

- mit der wichtigsten Ausnahme STREPTOKOKKENSTREPTOKOKKEN -gebildet.

Es wandelt im Energiestoffwechsel gebildetes Wasserstoffperoxid in Wasser und molekularen Sauerstoff um.

KatalaseKatalase--ReaktionReaktion

Freie Koagulase (extrazelluläres Enzym) bindet an Prothrombin und aktiviert die Entstehung von Fibrin aus Fibrinogen.

Clumping Faktor(zellwandgebundenes Protein) = Fibrinogenrezeptor

Differenzierung von Staphylococus aureusund Koagulase-negativen Staphylokokken (KNS)

KoagulaseKoagulase--ReaktionReaktion

durch die Koagulase-Reaktion gebildetes Fibringerinnsel in einem Reagenzglas

Latexpartikel sind mit Fibrinogen und IgG beladen � Fibrinausfällung durch Koagulase und Clumping factor

Protein A von Staph. aureus bindet an den Fc Teil von Immunglobulinen,welche dann nicht mehr an den Fc-Rezeptor von Phagozyten binden

Ausserdem sind die Latexpartikel mit spezifischen Antikörpern gegen die Kapsel-polysaccharide von Staph. aureus beladen.

Durch diese Mehrfachbeladung besteht die Möglichkeit, alle Stämme zu erfassen.

KoagulaseKoagulase--ReaktionReaktion

• Nachweis von Cytochromen aus der Atmungskette, die Sauerstoff als terminalen Elektronenakzeptorim Energiestoffwechsel verwenden

• Cytochrome ermöglichen den Eintritt von atmosphärischen Sauerstoff in den Zellstoffwechsel, indem sie durch molekularen Sauerstoff oxydiert werden

OxidaseOxidase --ReaktionReaktion

• in der Zelle erfolgt die enzymatische Reduktion der Cytochrome

• künstliche Substrate (N,N-Dimethyl-1,4-diaminobenzol) bewirken die Reduktion des Cytochromoxidase-Systems (d.h. sie werden oxydiert)

• Substrate in Abhängigkeit vom Reduktions-/Oxidationszustand farblos bzw. gefärbt

Gramnegative StGramnegative Stääbchen: bchen: BspBsp Enterobakterien: biochemische ReaktionenEnterobakterien: biochemische Reaktionen

KohlenhydratspaltungKohlenhydratspaltungAbbau von Kohlenhydraten (Glucose, Lactose, Rhamnose) � Säure (18 – 24 h)

Indikator: Bromthymolblau � Farbumschlag blaugrün (negativ) zu gelb/orange(positiv)

CitratCitrat --AbbauAbbauC-Quelle: Citrat, N-Quelle: Ammoniumsalz (Grundlage für Energie- + Baustoffwechsel)

� AlkalisierungIndikator: Bromthymolblau � Farbumschlag grün (negativ) zu blau (positiv)

HH22SS--BildungBildung- aus Eiweißkörpern bzw. S-haltigen Aminosäuren (insbes. Cystein)- aus S-haltigen, (an)organischen Zusätzen [(Thio-)Sulfaten, Sulfiten, Cystein]Indikator: Metallsalz (insbes. Ferrochlorid + Bleiacetat) � Sulfid (schwarzerNiederschlag)

UreaseUrease--NachweisNachweis/ / IndolIndol --BildungBildungIndikator: Phenolrot (durch Säurebildung aus Glucose-Abbau � gelb = negativ)

- Urease:Harnstoff � Ammoniak + CO2 positiv (rotviolett )- Indol: Eiweißabbau (Tryptophan) � Indol (Nachweis mit Kovacs Reagenz, roter Ring)- Beweglichkeit:Wachstum außerhalb des Impfstichs (wolkenartige Trübung) im Agar

OrnithinOrnithin --DekarboxylierungDekarboxylierungL-Ornithin (L-Lysin u.a) [pH niedrig] � Amine + CO2 (pH-Anstieg)Indikator: Bromkresolpurpur �Farbumschlag von farblos/gelblich (negativ) zu violett (positiv)

Mikroflora im Menschen

10310810111011 – 1012Dickdarm

103105107107 – 108unterer Dünndarm

102103104104 – 105oberer Dünndarm

103104104104 – 105Magen

10210810121012 - 1013Zahnfleisch-tasche

10210810111010 - 1011

(Plaquesubstanz)Zahn-oberfläche

102107108108 – 109

(Speichel)Zungen-oberfläche

Sproßpilzeaerobe Bakterien

anaerobe Bakterien

Keimzahl(pro ml o. g)

Standort

Mikroflora im Menschen

MycoplasmaEntamoeba gingivalisTrichomonas tenax

Str. sanguisStr. mitisS. epidermidisMicrococcus

Sulcusgingivalis

VeillonellaFusobacteriumLeptotrichiaPrev. oralisBact. corrodensPropionibacterium

PeptostreptococcusActinomycesNocardiaLactobacillus

NeisseriaHämophilusMycoplasmaProtozoa (Entamoeba gingivalisTrichomonas tenax)

Str. mutansStr. sanguis

Zahn-oberfläche

Str. sanguisStr. salivariusStr. mitis

Wangen-schleimhaut

VeillonellaPrev. melaninogenicaPrev. oralis

PeptococcusPeptostreptococcusPropionibacteriumActinomyces

NeisseriaVibrioHaemophilusEnterobacteriaceaeCandida u.a.

Str. salivariusStr. mitisStr. sanguisMicrococcus, StaphylococcusCorynebacterium

Zungen-oberfläche

gramnegativgrampositivgramnegativgrampositiv

AnaerobierAerobierStandort

DesinfektionDesinfektion

heißt, einen Gegenstand in den Zustand versetzen, in dem er nicht mehr infizieren kann

Wirksamkeit abhängig von:• Temperatur• Einwirkungszeit• Konzentration und Art des Wirkstoffes• weitere Faktoren: inkorporierte MO (Ausscheidungen, Blut)schlecht o. nicht erreichbar

DesinfektionsverfahrenDesinfektionsverfahren

thermische MethodenUV-Strahlen Filtration

PhysikalischPhysikalisch

Chemisch Chemisch

Heißwasser strömender Dampf Niederdruckdampf75 - 95°C 100°C 105°C, Unterdruck10 - 30 min 10 - 30 min 1 -15 min

Chemothermisch Chemothermisch

Alkohole / Aldehyde / Phenole und Derivate / Metalle / Halogene /Oberflächenaktive Substanzen / Oxidantien

Kombination von feuchter Hitze (60°C) und chemischen Desinfektionsmitteln bei thermolabilen Werkstoffen

Wirksamkeit von DekontaminationsmaWirksamkeit von Dekontaminationsmaßßnahmennahmen

Reinigung: mechanische Entfernung Reduktion der Keimzahl (2-3 log-Stufen = 99 – 99,9 %)

Antiseptik : Inaktivierung von MO auf lebendem Gewebe

Desinfektion:Reduktion der Keimzahl (5 log-Stufen = 99,999 %)Inaktivierung krankheitserrregender MO

Entkeimungsfiltration:Abtrennung lebender und toter MO, nicht aller Viren

Sterilisation:Inaktivierung aller MO inklusive aller Sporen und VirenKeimzahlreduktion mind. 6 log-Stufen

Sporenbildende BakterienSporenbildende Bakterien

grampositive Stäbchen

aerob: Bacillusanaerob: Clostridium

Bakteriensporen � stoffwechselinaktive Dauerformen� hohe Umweltresistenz

Artspezifische Sporenform und –lokalisationSporenbildung(Sporogenese) durch Nährstoff-Mangel

induziertSporenkeimung:Aktivierung, Keimung, Auswachsen

Bacillus subtilis Bacillus cereus

Bacillus: aerobesporenbildende Stäbchen

Bedeutung:Toxinbildner (Lebensmittel, Bioterrorismus), Antibiotikaproduzent, Bioindikator (Phenylketonurienachweis, Sterilisatoren), Proteasebildner (Waschmittel)

verschiedene Spezies verursachen Krankheiten durch die Produktion von potenten Protein-Ektotoxinen

Wichtige Humanpathogene Spezies:

A) Clostridium botulinum

B) Clostridium tetani

C) Clostridium perfringens

D) Clostridium difficile

Clostridium: anaerobe sporenbildende Stäbchen

Auswertung Sporenbildner

anaerobaerob

subterminale ovale Spore (Tennisschläger)

++Clostridium botulinum

schlanke Stäbchen z.T. mit ovaler subterminaler Spore

Weißlich, flache Kolonien mit unregelmäßigem Rand(Geruch nach Stalldung)

++Clostridium difficile

große grampositive Stäbchen mit abgerundeten Enden

flach, matt glänzend, unregelmäßiger Rand, Doppelzonenhämolyse

++Clostridium perfringens

terminale runde Spore (Trommelschläger)

durchsichtig, flach, stumpfe Ober-fläche, unregelmäßiger Rand mit Ausläufern

++Clostridium tetani

ovale zentrale bis subterminale Spore

flache trockene Kolonien, unregelmäßiger Rand

++Bacillus subtilis

MikromorphologieMakromorphologie (Blutagar)WachstumSpezies

Wichtige Erreger von Humanmykosen(Auswahl)

Cryptococcose /ZNSVogelkotCryptococcus

Primäre SystemmykosenPflanzen, Erdboden

Dimorphe Pilze(außereuropäische MykosenzB. Histoplasma

AspergilloseLunge und andere Organe

MucormykoseVerletzungsmykosen

ubiquitärSchimmelpilzeAspergillus spp.

Zygomyceten (Mucor u.a.)Dematiaceae

CandidoseHaut, Schleimhaut, andere Organe

Mensch, Tier, Nahrungsmittel

HefenCandida

DermatophytoseHaut, Haare, NägelMensch, Tier,

Erdboden

DermatophytenTrichophyton spp.Microsporum spp.Epidermophyton

Mykose/häufige LokalisationReservoirErreger

DermatophytenDermatophyten

Keratinophile Pilze, Einteilung � ungeschlechtliche Fortpflanzungs-

Organe (Mikro-und Makrokonidien)

geophil Erde � Mensch, Kontamination� selten Infektion

zoophil Tier � Mensch, intensiver Fellkontakt

anthropophil Mensch � Mensch oder indirekt

Pathogenese: Sporen� Keratinozyten�Auskeimen zu Hyphen

fungistatische Lipide und Proteine können

Eindringen verhindern

Infektion � gesteigerte Desquamation(Schuppung)

� Hyperkeratose

Tinea = Sammelbegriff für oberflächliche Dermatomykoseunabhängig von SpeziesT.pedis (Fuß)T.capitis (Kopf)T.inguinalis (in der Leistenbeuge)T.corporis (Körper)T.barbae (Bart)

Therapie: �lokale Applikation (Salben) Azoleausgedehnte Dermatosen (Haut, Nagel, Haare)

� systemische Therapie Griseofulvin, Itraconazol6 Monate (Finger)� 12 Monate (Fuß)

KlinikKlinik

Labordiagnostik Labordiagnostik VirusVirus --assoziierterassoziierter ErkrankungenErkrankungen

direkter Virusnachweismit Virusvermehrung

ZellkulturBruteiVersuchstier

ohne VirusvermehrungMikroskopie (Einschluß-K.)ElektronenmikroskopieAntigenvirale Nukleinsäure

indirekter VirusnachweisImmunantwort des Wirtes

virus-spezifische Antikörper

direkt indirekt

HA Hämagglutination x

HHT Hämagglutinationshemmung x

ELISA Enzymimmunoassay x x

IBL Immunoblot x

FAT Fluoreszenzantikörpertechnik x x

CPE zytopath.Effekt in der Zellkultur x

NAT Nukleinsäurenachweis x

RT-PCR, n-PCRReal-time PCR

Sequenzierung Nukleotid-alignment x

Methoden zum VirusnachweisMethoden zum Virusnachweis

Polymerasekettenreaktion

Nukleinsäureextraktion aus Probe

Cave:RNA-Viren Reverse Transcription in c-DNA

Amplifikation DNA, Primer, dNTP,Taq-Polymerase

Denaturing der Ziel-DNA � EinzelsträngeTemperatursenkung � Anlagerung der Primer = Start der Neusynthese

Temperaturanstieg ���� Sythese-Stop���� erneute Denaturierung

����X-Zyklen (25 – 50 � Kettenreaktion)

Cave: Störfaktoren ���� Heparin, Proteinasen, Harnstoff, Phenol, Paraffin, Salze

Detection der Amplifikate

a) Längenscreening im Gel

Ethidiumbromid

klassische PCR

b) Fluoreszenzsignale messen

markierte Oligonukleotide

Real-time PCR

Amplifikation

Detektion

in einem Reaktionsgefäß

Basis: 5‘Exonuklease-Aktivität der AmpliTaq -DNA-Polymerase

spezielle fluorogene Sonde = Oligonukleotidmarkiert mit Reporter -Farbstoff (5‘Ende)

Quencher -Farbstoff (3‘Ende)

Real-time PCR nach TaqMan TM Prinzip

Virusisolierung

Versuchstier

embryoniertes Hühnerei

Zellkultur (monolayer)

a) primär (aus Organen angezüchtet, diploid)

b) diploid = Zell-Stamm (2.-50. Passage, begrenzte Lebensdauer)

c) Zell-Linie = permanent (unbegrenzte Passagenzahl,tri-, tetra-, polyploid, oft tumorbildend)

Zellbiologische VerfahrenZellbiologische Verfahren

AntikAntik öörperrper --NachweiseNachweise

Neutralisationstest

Hämagglutinations-Hemmtest

Komplementbindungs-Reaktion

Immunfluoreszenztest

ELISA

Immunoblot

Quantitativ���� Serumtitration����Titer

����Einpunktverfahren(ELISA )

Detektions-Antikörper(Enzym-markiert)

nachzuweisende Komponente aus Patientenmaterial(AK / Ag)

adsorbierter Nachweisparameter (Ag / AK)

Enzym

� setzt farbloses Substrat um

� es entsteht ein löslichesfarbiges Produkt

OD-Messung

ELISA ELISA (Enzyme (Enzyme linkedlinked immunoimmuno sorbentsorbent assayassay))

Beurteilung von Antikörperbestimmung

Akute Infektion IgM Antikörper Nachweis in einer Probe

Cave: persistierende Virusinfektionen ���� bei Aktivierung erneut IgM -Bildung möglich

Intrauterine Infektion IgM im Serum des Embryo

ab 19.SSW selbständige IgM Bildung

keine Placentapassage

NT und HHT Antikörper anstieg 4-fach in zweiProben, Abstand 14 Tage

Differenzierung: akute Phase,

postakutePhase

WesternWestern--BlotBlot = Immunoblot= Immunoblot

Auftrennung der Virusproteine����Molekulargewicht

Nitrozellulose

Patientenantikörper

enzymgekoppelter Anti-Human IgG Antikörper

farbloses Substrat

Umwandlung in unlöslichenfarbigen Niederschlag