meccanismi di patogenesi batterica: esotossine · determinando la specificità di bersaglio della...
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Meccanismi
di patogenesi batterica:
esotossine
G. Di Bonaventura, PhD
Cds Medicina e Chirurgia
Università di Chieti-Pescara
AA 2015-2016
Azione patogena dei batteri
mediata da fattori di virulenza
• Produzione di tossine (tossinogenesi)
– esotossine (principalmente Gram+)
– endotossina (LPS) (solo Gram-)
• Sostanze proteiche (PM: 10-900 kDa) sintetizzate in forma solubile dai batteri, in particolar modo dai Gram+
• Spesso controllate da geni extracromosomici (plasmidi)
• Vengono escrete nel mezzo circostante, ma rilasciate anche in seguito a lisi cellulare
• Si legano a specifici recettori cellulari (specificità cellulare) risultando tossiche o letali per le cellule dell’ospite
• Elevata tossicità (anche per ingestione) per gli animali: dose minima letale 1-5 g (appena 2x10-5 g per la tossina botulinica)
• La natura proteica le rende altamente antigeniche (immunogene), stimolando così la formazione di antitossina neutralizzante
• Apirogene
• Convertite (mediante trattamento con formalina, acidi, calore) a tossoidi o anatossine
Esotossine: principali caratteristiche
Sull’inibizione delle tossine batteriche si basa la risposta immunitaria attiva,
caratteristica dei principali vaccini antibatterici
Le tossine batteriche sono, infatti, il principale bersaglio della sieroprofilassi
Costituenti dei principali vaccini antibatterici (vaccino antitetanico, antidifterico e
antipertosse) sono le anatossine o tossoidi, esotossine alle quali è stato
artificialmente eliminato il potere tossico preservandone le proprietà
antigeniche (immunogene)
Esotossine: classificazione
• Specificità di bersaglio (tropismo cellulare):– tossine neurotrope: agiscono a livello del sistema nervoso
centrale o periferico (tossina tetanica e botulinica)
– enterotossine: agiscono sulla mucosa intestinale (tossina colerica, enterotossine di E. coli)
– tossine pantrope: diffusione dei recettori cellulari (tossina difterica, tossina pertossica, tossina di Shiga)
• Meccanismo di azione:– superantigeni (tossine tipo I)
– esotossine che danneggiano le membrane della cellula ospite(tossine tipo II)
– tossine A-B ed altre tossine che interferiscono con le funzioni della cellula ospite (tossine tipo III)
Esotossine di tipo I
Superantigeni
Attivazione linfociti T4:
“Presentazione” dell’antigene
1. Antigeni esogeni (batteri, virus, miceti, protozoi) vengono fagocitati da antigen-presenting cells (APC: macrofagi, cellule dendritiche, linfociti B) all’interno di un fagosoma.
2. Il fagosoma si fonde con il lisosoma.3. Degradazione proteasica degli antigeni a peptidi.4. Molecole MHC-II vengono sintetizzate nel reticolo
endoplasmico e trasportate verso il complesso di Golgi. Legame della catena Ii alle molecole MHC-II (per evitare che peptidi per MHC-I si leghino a MHC-II).
5-6. Il complesso MHC-II / Ii chain viene trasferito nel complesso di Golgi all’interno di vescicole.
7. Le vescicole si fondono con il fagolisosoma contenente peptidi. La catena Ii viene rimossa ed i peptidi sono liberi di legarsi al MHC-II.
8. Il complesso MHCII-peptide viene trasportato alla membrana citoplasmatica dove si ancora.
9. Il complesso peptide/MHC-II può essere riconosciuto da un linfocita T4 mediante T-cell receptor (TCR) e CD4 aventi forma complementare.
“Presentazione” dell’antigene
I superantigeni sono proteine batteriche ad azione toxin-
like che attivano le cellule T CD4+ legandosi
aspecificamente (senza presenza di Ag specifico) al T
cell receptor (TCR) ed al complesso maggiore di
istocompatibilità di classe II (MHC-II) dei macrofagi.
L’interazione aspecifica APC-linfocita T mediata dal
superantigene si traduce nella attivazione e
proliferazione delle cellule T e nell’attivazione dei
macrofagi con rilascio di elevate dosi di diverse
citochine: dapprima IL-2 (febbre, nausea, vomito,
diarrea) che, a sua volta, stimola la sintesi di altre
citochine (IL-1, IL-8, TNF-α, PAF) coinvolte nella
patogenesi dello shock (danno endoteliale, CID,
insufficienza respiratoria)
Legame convenzionale APC-linfocita T4
Superantigene: legame aspecifico APC-linfocita T4
Toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1), prodotta da alcuni ceppi di S. aureusche causano la sindrome dello shock tossico (febbre, rush, shock)
Enterotossine, prodotte da S. aureus; causano tossinfezione alimentare
(nausea, febbre, vomito, diarrea). La tossina stimola il vago causando vomito
incoercibile.
Tossina pirogenica, prodotta da ceppi invasivi di S. pyogenes
superantigeni associati a S. pyogenes potrebbero causare psoriasi
Heat-stable toxins (sta) di ceppi enterotossigenici di E. coli
Antigeni di M. tuberculosis, del virus rabbico e di HIV possono essere
considerati superantigeni
Esempi di alcuni superantigeni
di origine microbica
Esotossine di Tipo IITossine che agiscono a livello della superficie cellulare
Le tossine emolitiche (emolisine o citolisine) sono enzimi che producono pori nella membrana cellulare, digeriscono materiali cellulari, alterano la composizione della
membrana
Tossina esfoliativa (due varianti antigeniche: A, B), prodotta da S. aureus, causa il clivaggio delle proteine di matrice extracellulare dello strato granuloso
dell’epidermide (sindrome della cute pseudo-ustionata)
Esotossina B, prodotta da ceppi invasivi di streptococchi β-emolitici di gruppo A (Streptococcus pyogenes). Questa esotossina è una proteasi che degrada il tessuto
muscolare (miosite) o la guaina di rivestimento del muscolo (fascite necrotizzante).
Citolisine prodotte da Gram+
• Queste citolisine sono costituite in gran parte da una sola subunità
• Agiscono formando un poro “a biscotto” (proteico) nella membrana cellulare bersaglio
• I pori annullano il gradiente Na+/K+
transmembrana, provocando la lisi osmotica della cellula
• L’ingresso di Ca2+ extracellulare causa un’attivazione della cellula bersaglio
• Esempi: listeriolisina (L. monocytogenes), pneumolisina (S. pneumoniae), tossina-a (S. aureus)
Streptolisina O vs eritrociti di coniglio
Citolisine prodotte da Gram-
• Meccanismo di azione similare a quello delle citolisine prodotte dai Gram+
• Agiscono formando un poro funzionale transmembrana, sebbene la struttura differisca da quella dei pori prodotti da Gram+
• Repeats-in-ToXin (RTX) family
E coli – emolisina alfa (HlyA)
P. vulgaris – emolisina
Pasteurella haemolytica - leucocidina
E. coli: HlyA
Esotossine prodotte da Clostridium perfringens
Tossine ad effetto necrotizzante ed emolitico che, insieme alla distensione
del tessuto ad opera del gas prodotto dalla fermentazione dei
carboidrati, favoriscono la diffusione della gangrena gassosa
(mionecrosi).
Possono essere inoltre causa di una forma mista diarroico-dissenterica.
tossina alfa (lecitinasi): aumenta la permeabilità dei capillari e
delle cellule muscolari distruggendo la lecitina presente nella
membrana citoplasmatica, con formazione di edema.
tossina kappa (collagenasi): causa la degradazione del tessuto
connettivale e muscolare, responsabile delle lesioni molli.
tossina mu (ialuronidasi): causa la rottura dei legami intercellulari
nel tessuto.
Esotossine prodotte da Clostridium difficile
Colite pseudomembranosa = sindrome dissenterica con crampi, diarrea
acquosa/sanguinolenta, febbre, leucocitosi
La Tossina A è una potente enterotossina che esercita anche
attivitità citolitica, danneggiando le cellule mucosali intestinali, che in tal
modo perdono il controllo del flusso di H2O. Inoltre, esse richiamano
e distruggono i neutrofili, causando il rilascio degli enzimi
lisosomiali che potenziano il danno tessutale.
La Tossina B è una potente tossina citolitica.
Proteine dimeriche, ossia composte da due parti: componente A (active) e
componente B (binding).
Prodotte sia dai batteri Gram+ che Gram- e secrete in sede extracellulare
Il componente B si lega al recettore superficiale della cellula ospite, così
determinando la specificità di bersaglio della tossina.
Esotossine di Tipo IIITossine “A-B” che interferiscono con le funzioni della
cellula ospite
• La tossina viene, quindi, traslocata attraverso la
membrana:
• per endocitosi: il componente A si separa da B
per migrare nel citoplasma;
• altre tossine A-B prevedono l’ingresso nella
cellula del solo componente A, generalmente
attraverso un poro di membrana.
La principale difesa dell’ospite nei confronti delle
tossine è rappresentata dalla produzione di anticorpi
anti-tossina (neutralizzanti). Una volta legata
dall’anticorpo, la tossina non potrà più legarsi al
recettore di superficie cellulare.
• Tossina difterica (Corynebacterium diptheriae)
• Tossina di Shiga (Shigella dysenteriae, E. coli enteroemorragici EHEC)
• Tossina colerica (Vibrio cholerae)
• Tossina pertossica (Bordetella pertussis)
• Enterotossine (Clostridium perfringens, Bacillus cereus)
• Tossina carbonchiosa (Bacillus anthracis)
• Tossina tetanica o tetanospasmina (Clostridium tetani)
• Tossina botulinica (Clostridium botulinum)
Esempi di tossine A-B
Esotossine che interferiscono con le funzioni della cellula ospite
Inibizione della sintesi proteica cellulare:
• tossina difterica (Corynebacterium dyptheriae)
• tossina di Shiga (Shigella dysenteriae)
• tossine Shiga-like (E. coli enteroemorragici)
• tossina A (Pseudomonas aeruginosa)
regione che lega
il recettore
regione catalitica
regione di
traslocazione
• Prodotta da Corynebacterium diphteriae
per conversione lisogenica (fago
temperato β) del gene tox, attivato da
carenza di Fe.
• La tossina difterica (62 kDa) presenta tre
regioni distinte:
• B, lega il recettore (COO-)
• T, di traslocazione
• A, catalitica (NH3+)
Tossina difterica
Meccanismo di azione della tossina difterica
• La morte cellulare è causata da un blocco
della sintesi proteica secondario alla ADP-
ribosilazione di EF-2, fattore necessario per la
traslocazione dal sito A al sito P della catena
proteica nascente.
• Bersaglio della tossina sono le cellule
cardiache, nervose e renali (tossina pantropa)
• La porzione “D" del vaccino DTP contiene il
tossoide difterico per stimolare la sintesi di Ab
“neutralizzanti”, ossia diretti verso il componente
B della tossina.
Tossina di Shiga (e tossine Shiga-like)
• Tossina A-B (struttura A-B5), prodotta da Shigella spp e da E. coli enteroemorragici (E. coli O157:H7)
• Si lega al globoside Gb3 di membrana• Penetrazione intracellulare per endocitosi• Tox (frammento A1) con attività catalitica N-glicosidasica,
che causa la degradazione di rRNA della cellula ospite, prevenendo così l’adesione del tRNA “carico” e, in tal modo, blocca la sintesi proteica cellulare
• La tossina inoltre: – potenzia il rilascio LPS-mediato di citochine (IL-1, TNF-α)– danneggiando le pareti dei vasi ematici, sembra essere
responsabile della sindrome uremica emolitica, complicanza della shigellosi e delle infezioni da E. coliO157:H7
Esotossina A di P. aeruginosa Tossina A-B: componente A (COO-), componente B (NH3
+)
Meccanismo di azione similare a quello della tossina difterica
Alterazione del contenuto intracellulare di AMP-ciclico (azione catalitica ADP-ribosilante):
• tossina colerica (V. cholerae)
• tossina pertossica (B. pertussis)
• tossina termolabile di E. coli
Esotossine che interferiscono con le funzioni della cellula ospite
Tossina colerica
• Prodotta da Vibrio cholerae
• Struttura A2-B5
• Il componente A, formato da due frazioni (A1, A2), è
dotato di attività ADP-ribosilante
• Il componente B, formato da 5 frazioni, lega il
ganglioside GM1 presente sulle cellule epiteliali
dell’intestino tenue (enterotossina)
• Aumenta la concentrazione di AMPc, causando:
- liberazione di ioni sodio, potassio, bicarbonati
- perdita di liquidi (fino a 20 L/die acqua), diarrea e
grave disidratazione
• Batterio poco invasivo, patogenicità legata alla tossina.
Proteina G inibitoriaProteina G stimolatoria
L’adenilato-ciclasi converte l’ATP in AMP-ciclico (cAMP), “secondo”
messaggero che attiva diversi geni e funzioni cellulari.
In condizioni fisiologiche, la funzionalità dell’adenilato-ciclasi è regolata da
due proteine G (che legano il GTP): la proteina G stimolatoria (Gs), attivante;
la proteina G inibitoria (Gi), inibente l’attivazione dell’enzima.
ATTIVAZIONE della
proteina G stimolatoria
La proteina G stimolatoria (Gs) è il bersaglio della tossina colerica, che
così mantiene l’enzima costantemente attivato, causando un
significativo aumento della quantità intracellulare di cAMP (fino a 100
volte maggiore vs fisiologica).
Tossina colerica
L’aumento di AMPc blocca il normale trasporto di Na+ dal lume intestinale verso il torrente ematico e causa la fuoriuscita, verso il lume, di K+ e bicarbonati.
Il movimento di ioni richiama H2O dal torrente circolatorio verso il lume intestinale, causando diarrea e massiva perdita di liquidi (mortalità per disidratazione).
• Prodotta da Bordetella pertussis
• Costituita da una subunità tossica S1 e 5 subunità di legame (da S2 a S5 + 2 subunità S4).
• La S2 si lega al lattosilceramide. La S3 si lega a recettori presenti sui fagociti causando un aumento del CR3 sulla superficie cellulare.
• La porzione S1 della tossina ha attività ADP-ribosilante e si lega alla proteina Gi (regolazione negativa dell’adenilato-ciclasi), inibendola.
Tossina pertossica
INIBIZIONE della
proteina G inibitoria
La proteina G inibitoria (Gi) è il bersaglio della tossina della pertosse. La Gi
viene così inattivata e non è più in grado di inibire l’adenilato-ciclasi, con
conseguente aumento della quantità intracellulare di cAMP.
Tossina pertossica
Tossina pertossicaeffetti biologici
A seconda del tipo cellulare interessato, l’aumento intracellulare di AMPc può causare:
nell’epitelio respiratorio, l’aumento delle secrezioni respiratorie e della produzione di muco, caratteristiche dello stato parossistico della pertosse (tosse, broncospasmo, dispnea);
nei fagociti, riduzione della fagocitosi (chemotassi, engulfment, killing);
nel sangue, un’aumentata sensibilità all’istamina e conseguente aumento della permeabilità capillare, ipotensione e shock;
nelle cellule nervose, encefalopatia.
Esotossine che interferiscono con le funzioni della cellula ospite
Alterazione del contenuto intracellulare di AMP-ciclico
(azione enzimatica adenilato-ciclasica)
Fattore I (edema factor) prodotto da Bacillus anthracis:
adenilato-ciclasi batterica che causa AMPc intracellulare.
Tossina carbonchiosa
Bacillus anthracis produce tre tossine (2 x A + 1 B), in proporzioni differenti, che debbono assemblarsi per poter essere biologicamente attive:
- antigene protettivo (protective antigen, PA)
- fattore edematogeno (edema factor, EF)
- fattore letale (lethal factor, LF)
PA (componente B) si lega ai recettori e viene clivato da una proteasi (scoprendo un sito di legame per LF e/o EF), polimerizza formando un poro a livello transmembrana, quindi lega EF e/o LF.
EF (componente A) è una adenilato-ciclasi che potenzia la sintesi di AMPc nella cellula ospite, influenzando la fagocitosi ed inibendo la produzione di TNF-α e IL-6 da parte dei monociti. Ciò è responsabile dell’alterazione delle difese dell’ospite e causa un forte edema (accumulo di liquidi negli spazi intercellulari), caratteristico dell’antrace e visibile al punto di ingresso del microrganismo.
Tossina carbonchiosa
LF (componente A) è una proteasi che attacca, inibendole, alcune chinasi (MAPK, Mitogen-Activated Protein Kinase) che intervengono nelle cascate di segnali indotte da vari stimoli attivata da stimoli di membrana (mitogeni), bloccando la trascrizione di numerosi fattori trascrizionali (es. NfκB) coinvolti nella attivazione di geni codificanti per ILs ed effettori della risposta immune:
- a bassi livelli, LF inibisce il rilascio di citochine pro-infiammatorie IL-1, TNF-α e NO. Questo può inizialmente ridurre la risposta immune nei confronti del microrganismo e della tossina da esso prodotta.
- ad alti livelli, invece, LF è citolitico per i macrofagi, causando il rilascio di IL-1, TNF- αe NO. L’eccessivo rilascio di queste citochine può portare ad una massiva risposta infiammatoria ed alla cascata dello shock, simile allo shock settico.
Esotossine che interferiscono con le funzioni della cellula ospite
Interferenza con il rilascio di neurotrasmettitori (tossine neurotrope):
• tossina tetanica
• tossina botulinica
• Tossina neurotropa prodotta da Clostridium tetani (a codificazione plasmidica).
• Sintetizzata come singola molecola (150 KDa), vienequindi scissa da proteasi in due subunità peptidiche, unite da un ponte S-S:
- subunità leggera (catena A)- subunità pesante (catena B)
• La catena B si lega con l’estremità -COOH terminale ad un recettore sulla superficie dei neuroni (ganglioside GM2). La estremità -NH2 rende possibile la traslocazione.
• La catena A, una zinco-endopeptidasi, viene internalizzata e risale dalle terminazioni periferiche al SNC tramite trasporto assonale retrogrado.
Tossina tetanica (tetanospasmina)
A-B. La trasmissione nervosa è regolata dall’equilibrio tra neurotrasmettitori eccitatori ed inibitori.
C. I neurotrasmettitori inibitori (GABA, glicina) prevengono la depolarizzazione della membrana postsinaptica e la conduzione del segnale elettrico.
D. La tetanospasmina non interferisce con la produzione del GABA o della glicina, ma con il loro rilascio (attività presinaptica). In assenza di neurotrasmettitori inibitori, l’eccitazione degli assoni non è contrastata, causando la simultanea contrazione dei muscoli flessori ed estensori (paralisi spastica, morte per insufficienza respiratoria)
Tossina tetanica: meccanismo di azione
La componente "T" del vaccino DTP consiste nel tossoide tetanico, che stimola la produzione di anticorpi neutralizzanti, ossia diretti verso il componente B della tossina. Una volta legata dall’anticorpo, la esotossina non sarà più in grado di legarsi ai recettori cellulari di superficie.
Rilascio muscolare per
azione dei neuroni inibenti
Meccanismo di azione
della tetanospasmina
• Clostridium botulinum produce una endopeptidasi che blocca il rilascio
di acetilcolina a livello della giunzione neuromuscolare.
• La tossina botulinica scinde la sinaptobrevina interferendo con la
formazione delle vescicole sinaptiche.
• Il risultato è la paralisi flaccida: debolezza discendente bilaterale a
carico dei muscoli periferici, morte per paralisi dei muscoli respiratori.
Tossina botulinica
Contrazione muscolare
mediata da acetilcolina
Meccanismo di azione
della tossina botulinica
tossina tetanica
vs
tossina botulinica
Enterotossine
Diversi batteri (Clostridium perfringens, Bacillus cereus) producono
esotossine che si legano alle cellule del piccolo intestino. La
maggior parte di queste tossine causa una ADP-ribosilazione delle
proteine della cellula ospite che modula la sintesi di molecole
regolatrici a struttura ciclica (cAMP, cGMP) nelle cellule della
mucosa intestinale.
Elevati livelli di cAMP e cGMP provocano la perdita di elettroliti e
di acqua, causando diarrea.
Invece, le enterotossine prodotte da Staphylococcus aureus e dai
ceppi enterotossigenici di Escherichia coli esibiscono un differente
meccanismo d’azione, funzionando da superantigeni.
Proprietà delle
tossine batteriche di
tipo A–B
Le endotossine batteriche
La endotossina è il lipolisaccaride (LPS),
costituente il rivestimento esterno dei
batteri Gram-negativi
E’ presente, quindi, soltanto nei batteri
Gram-negativi
Le diverse attività
del lipopolisaccaride
Tossicità mediata
dell’endotossina
da P.R. Murray, K.S. Rosenthal, G.S. Kobayashi, M.A. PfallerMicrobiologia
EDISES
SEPSI
Indica una risposta infiammatoria sistemica (SYRS, Systemic Inflammatory
Response Syndrome) sostenuta da gravi infezioni (principalmente da Gram-
negativi) in organi o apparati (polmoni, addome, vie urinarie). E’ caratterizzata dalla
massiccia produzione di elevate quantità di fattori infiammatori
(PGs,TNFs, IL1, IL6, IL8, IL12).
Le citochine proinfiammatorie innescano:
• alterazione degli endoteli vascolari con collasso ipotensivo (sepsi ipotensiva)
• cascata della coagulazione con la formazione di diffuse coagulazioni intravasali
(DIC: disseminated intravascular coagulation)
• estesi fatti emorragici con la grave compromissione di diversi organi (Shock
settico) ed effetti fatali per il paziente
SHOCK SETTICO
Termine utilizzato per raggruppare una serie di eventi fisiopatologici che portano al
collasso del sistema circolatorio causando il quadro clinico della sindrome da
insufficienza multipla di organi (MOFS) che può provocare la morte del paziente