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Master « Biologie Cellulaire, Master « Biologie Cellulaire, Physiologie, Pathologie »Physiologie, Pathologie »

des Universités Paris 5 et 7des Universités Paris 5 et 7

Pr J.-J. MERCADIERPr J.-J. MERCADIER

Cours N°3Cours N°3

Master 1 médicalMaster 1 médicalUE8 : Biologie cellulaire, physiologie, pathologieUE8 : Biologie cellulaire, physiologie, pathologie

cardiovasculaire et de l’hémostasecardiovasculaire et de l’hémostase

Pathophysiology of heart failurePathophysiology of heart failure

Progression of Pathologic Hypertrophy ?

Cardiac hypertrophy is likely maladaptive long-term• Risk factor for arrhythmia and sudden death

• Risk factor for developing heart failure

• Response to hypertension, coarctation, infarct, ge netic mutations, infection, etc.

Normal Hypertrophied Dilated

Seidman and Seidman, 2001, Cell

Jeffery D. MOLKENTINJeffery D. MOLKENTIN

??

??

??

Various types of LV hypertrophyVarious types of LV hypertrophy

HBPHBPASAS

MechanicalMechanicaloverloadoverload

Various degrees of fibrosisVarious degrees of fibrosis

PressurePressure

SARCOMERESARCOMEREββββββββMHCMHCMLC2MLC2ActinActinTnT, ITnT, IααααααααTMTM

MBPCMBPC……

CYTOSKELETONCYTOSKELETONDesminDesmin

DystrophinDystrophinLamin A/CLamin A/C

MLPMLP……

MonogenicMonogenic

AVFAVFMRMRARARVolumeVolume

MIMI

Physiologic?Physiologic?

????

LV REACTION TO CHRONIC OVERLOADLV REACTION TO CHRONIC OVERLOAD

THE LEFT VENTRICLE THE LEFT VENTRICLE (the pressure generator)(the pressure generator)ReshapingReshaping - - wall thicknesswall thickness

- size and shape of the cavity- size and shape of the cavity

ACCORDING TO THE LAPLACE LAWACCORDING TO THE LAPLACE LAW

= k= k P P xx r r

eeWall stressWall stress = = σσσσσσσσINSERM U 460INSERM U 460Faculté X. BichatFaculté X. Bichat

ASSOCIATED WITH MYOCARDIAL HYPERTROPHYASSOCIATED WITH MYOCARDIAL HYPERTROPHY

WHEN THEWHEN THE LOAD/CONTRACTILE CAPACITY LOAD/CONTRACTILE CAPACITY RATIORATIOOF THE MYOCARDIUM IS INCREASEDOF THE MYOCARDIUM IS INCREASED

THE LAPLACE LAWTHE LAPLACE LAW

INSERM U 460INSERM U 460Faculté X. BichatFaculté X. Bichat Grossmann et al. Grossmann et al. J. Clin. Invest.J. Clin. Invest. 1975 1975

THE LEFT VENTRICLE THE LEFT VENTRICLE (the pump=the pressure generator)(the pump=the pressure generator)ReshapingReshaping - - wall thicknesswall thickness

- size and shape of the cavity- size and shape of the cavity

THE MYOCARDIUM THE MYOCARDIUM (the force generator of the pump)(the force generator of the pump)HypertrophyHypertrophy - - bigger (and different) myocytesbigger (and different) myocytes= more muscle= more muscle - more non muscle cells- more non muscle cells

- changes in the extracellular matrix- changes in the extracellular matrix

LV REACTION TO CHRONIC OVERLOADLV REACTION TO CHRONIC OVERLOAD

INSERM U 460INSERM U 460Faculté X. BichatFaculté X. Bichat

MYOCARDIAL HYPERTROPHYMYOCARDIAL HYPERTROPHY


LEFT VENTRICLE LEFT VENTRICLE (the pump = pressure generator)(the pump = pressure generator)ReshapingReshaping - increased wall thickness- increased wall thickness

- changes in size and shape- changes in size and shapeof LV cavityof LV cavity

MYOCARDIUM MYOCARDIUM (the force generator of the pump)(the force generator of the pump)HypertrophyHypertrophy - bigger myocytesbigger myocytes(more muscle)(more muscle) - more non muscle cells- more non muscle cells

- changes in the ECM- changes in the ECM

MYOCYTES MYOCYTES (the force generator of the myocardium)(the force generator of the myocardium)DestructurationDestructuration bigger myocytes with changesbigger myocytes with changes

- in cell microarchitecture and - in cell microarchitecture and - in protein phenotype- in protein phenotype

GENES INSIDE MYOCARDIAL CELLSGENES INSIDE MYOCARDIAL CELLSCHANGE THEIR EXPRESSIONCHANGE THEIR EXPRESSION

RE

MO

DE

LIN

GR

EM

OD

ELI

NG

LV REACTION TO CHRONIC WORK OVERLOADLV REACTION TO CHRONIC WORK OVERLOAD

CHRONIC LEFT VENTRICULAR OVERLOADCHRONIC LEFT VENTRICULAR OVERLOAD

Myo

card

ial r

emo

del

ing

Myo

card

ial r

emo

del

ing

I. Acute PhaseI. Acute Phase III. Heart FailureIII. Heart Failure

00 TimeTime

Neu

rohu

mor

al

Neu

rohu

mor

al

activ

atio

nac

tivat

ion


Increased Increased σσσσσσσσ Increased Increased σσσσσσσσ

II. CompensatedII. Compensated HypertrophyHypertrophy

Normal Normal σσσσσσσσ

RemodelingRemodeling

??

HypertrophicHypertrophicgene programgene program

OBJECTIF

Notre équipe a créé un modèle de souris double transgénique conditionnelle (Tet-off/FKBP12.6) dans le fond génétique B6D2. L’expression du transgène est réprimée en présence de doxycycline (Dox) et induite par le retrait de la Dox de l’alimentation des souris. Ces souris devant être soumises à une sténose de l’aorte thoracique (TAC) pour induire hypertrophie et insuffisance cardiaque, nous avons voulu savoir si la Dox exerce un effet sur ces paramètres.

Modèle expérimental: La TAC = surcharge de pression par sténose de l’aorte thoracique réalisée sur des souris mâles B6D2/F1 (19-22g) (n=120) anasthésiées par Kétamine/Xylasine.

Guide d’un diamètre 0,4 mm ( du diamètre ~ 60%).

Cathétérisme du ventricule gauche:Anesthésie: Isoflurane 2%, 100% O2

Introduction de la sonde Millar 1,4 French par la carotide droite jusqu’au ventricule gauche.Logiciel d’analyse : Iox (EMKA).

PCR en temps réel: Extraction et Reverse Transcription des ARNm du ventricule gauche. Les amplifications en temps réel des ADNc du BNP et de la GAPDH sont réalisées dans un Lightcycler (Roche). Le BNP est normalisé par rapport à la GAPDH de chaque échantillon.

Matériels et Méthodes

p<0,001

0

2

4

6

8

10

Sham1 Mois

VG

+VD

/BW

(m

g/g)

Sham2 Mois

TAC1 Mois

TAC2 Mois

p<0,001

ns

� A 1 mois, l’hypertrophie cardiaque est plus élevée dans le groupe TAC + Dox (73%)que dans

le groupe TAC(55%).

� A 2 mois, l’hypertrophie cardiaque ne diffère plus entre le

groupe TAC + Dox (91%) et le groupe TAC (98%)

0

2

4

6

8

10

Sham 2 Mois

+ Dox

Sham 2 Mois

TAC 2 Mois

+ Dox

TAC 2 Mois

VG

+VD

/BW

(m

g/g)

0

2

4

6

8

Sham 1 Mois

+ Dox

Sham 1 Mois

TAC 1 Mois

+ Dox

TAC 1 Mois

p<0,01

VG

+VD

/BW

(m

g/g)

Paramètres anatomiques

0

5

10

15

20

25

BNP/GAPDH

Sham1 Mois

Sham2 Mois

TAC1 Mois

TAC2 Mois

UA p<0,01

p<0,05

Sham1 Mois

+ Dox

Sham1 Mois

TAC1 Mois

+ Dox

TAC1 Mois

0

5

10

15

20

25

30

BNP/GAPDH

UA p<0,05

0

5

10

15

20

25

30

35

40

BNP/GAPDH

Sham2 Mois

+ Dox

Sham2 Mois

TAC2 Mois

+ Dox

TAC2 Mois

UAns

L’expression de l’ARNm du BNP, marqueur de l’hypertrophie, s’accroît

dans le modèle de la TAC.

A 1 mois la Dox accentue l’effet hypertrophique de la TAC.

Expression d’un marqueur de l’hypertrophie : le BNP

P max

PTDVG

dP/dT maxdP/dT min

TACSham

Pre

ssio

n (m

mH

g)

Unité de Volume Relative (µL)

Courbes Pression/Volume chez la souris

dP/d

T m

ax (

mm

Hg/

s)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

Sham TAC1 Mois

TAC2 Mois

p<0,01

-12000

-10000

-8000

-6000

-4000

-2000

0

Sham TAC1 Mois

TAC2 Mois

dP/d

T m

in (

mm

Hg/

s)p<0,01

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

Sham TAC1 Mois

TAC2 Mois

p<0,001 p<0,01

Pm

ax (

mm

Hg)

Sham TAC1 Mois

TAC2 Mois

0

5

10

15

20

25

30

35

PT

DV

G (

mm

Hg) ns

p<0,01

Paramètres Hémodynamiques mesurés chez la Souris

� La TAC provoque une hypertension chez les souris t rès marquée à 1 mois et qui diminue à 2 mois.

� Une baisse de contractilité est observée à 2 mois post-TAC, accompagnée d’un dysfonctionnement systolique (Pmax ) et diastoli que (PTDVG ).

� Nous avons défini 2 groupes d’animaux, l’un présen tant une hypertrophie compensée, l’autre une insuffisance cardiaque sévèr e, en se basant sur la présence d’œdème pulmonaire (LW TAC > LWSham + 2 SD).

� Selon ce critère de sélection, un plus grand nombr e de souris est en IC à 1 mois en présence de Dox. Le test de Χ2 révèle que cette différence est significative. Cepe ndant, cette différence disparaît à 2 mois.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Sham1 Mois

Sham2 Mois

TAC1 Mois

HC

TAC2 Mois

HC

TAC1 Mois

IC

TAC2 Mois

IC

Lung

W/B

W

mg/g

Sham

HC (Hypertrophie Compensée)

IC (Insuffisance Cardiaque)

74%

26%

64%

36%

31%

69%

74%

26%

p<0,02ns

TAC1 Mois TAC

2 Mois

Dox Dox

Classification de l’hypertrophie et de l’insuffisance cardiaque

� Nous avons défini 2 groupes d’animaux, l’un présen tant une hypertrophie compensée, l’autre une insuffisance cardiaque sévèr e, en se basant sur la présence d’œdème pulmonaire (LW TAC > LWSham + 2 SD).

� Selon ce critère de sélection, un plus grand nombr e de souris est en IC à 1 mois en présence de Dox. Le test de Χ2 révèle que cette différence est significative. Cepe ndant, cette différence disparaît à 2 mois.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Sham TAC 1 Mois TAC 2 mois

dP/d

t max

(m

mH

g/s)


PT

DV

G (

mm

Hg)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

HC

IC

HC DOX

IC DOX


-12000

-10000

-8000

-6000

-4000

-2000

0

dP/d

t min

(m

mH

g/s)

Variation des paramètres hémodynamiques chez les souris HC et IC

Une PTDVG très élevée, une dP/dT max et min diminuée sont observées chez les souris en IC,

ce qui reflète un dysfonctionnement cardiaque

sévère et conforte notre classification.

CONCLUSION

La doxycycline favorise le développement de l’hypertrophie et de l’insuffisance cardiaque un mois après une sténose de l’aorte thoracique. Cet effet n’est plus observé deux mois après la sténose.

Ceci doit conduire à la prudence dans la réalisation du plan expérimental et dans l’interprétation des résultats dans les modèles d’hypertrophie cardiaque chez les souris transgéniques dont l’expression du transgène est pilotée par le système Tet-on/Tet-off.

Les facteurs déclenchants et Les facteurs déclenchants et les voies de l’hypertrophieles voies de l’hypertrophie

Le stressLe stressbiomécaniquebiomécanique

Mercadier et al. Mercadier et al. Am. J. Physiol.Am. J. Physiol. 1987 1987INSERM U 460INSERM U 460Faculté X. BichatFaculté X. Bichat

THE TRIGGERSTHE TRIGGERS

Day 4Day 4 Day 30Day 30INSERM U 460INSERM U 460Faculté X. BichatFaculté X. Bichat

THE TRIGGERSTHE TRIGGERS

Mercadier et al. Mercadier et al. Am. J. Physiol.Am. J. Physiol. 1987 1987

TRIGGERS OF MYOCARDIAL / CARDIAC MYOCYTE REMODELINGTRIGGERS OF MYOCARDIAL / CARDIAC MYOCYTE REMODELING

COMPLEX COMBINATION OF FACTORS:COMPLEX COMBINATION OF FACTORS:

22 NeurohumoralNeurohumoral Ang IIAng II AT-1(-2)RAT-1(-2)R ET-1ET-1 ET-AET-A

NENE αααααααα11 && ββββββββ1/21/2 TNFTNFαααααααα TNF-RTNF-R

IGF-1 IGF-1 IGF-1-RIGF-1-R TGFTGFββββββββ TGFTGFββββββββ-R-R

CT/LIFCT/LIF gp130 gp130 AldoAldo MR MR

othersothers ……

11 MechanicalMechanical

Diastolic stretchDiastolic stretch - - Ang II – ET1Ang II – ET1 (auto/paracrine?) (auto/paracrine?)- stretch-sensitive channels- stretch-sensitive channels- - NaNa++-H-H++exchangerexchanger- - MLPMLP, , MelusinMelusin ……

Systolic stress(?)Systolic stress(?)- - load / contractile capacity?load / contractile capacity?

Main pathways leading to cardiac myocyte remodelingMain pathways leading to cardiac myocyte remodeling

EXTRACELLULAR SPACEEXTRACELLULAR SPACE

NUCLEUSNUCLEUS Hypertropic gene programHypertropic gene program

STRETCHSTRETCH NaNa++/H/H++XX

NCX/AlkalosisNCX/Alkalosis

AP-1, GATA, MEF2…AP-1, GATA, MEF2…

NE AII ET-1NE AII ET-1

p38 JNK1/2p38 JNK1/2 ERK1/2ERK1/2

PKCPKCα,βα,βα,βα,βα,βα,βα,βα,β

NF-ATNF-AT

CalcineurinCalcineurin

NF-ATNF-ATPP

NF-ATNF-AT

CaMCaM

CsA, FK506CsA, FK506

[Ca[Ca2+ 2+ ]]

IGF-1IGF-1

RTKsRTKs

PI3KPI3K

AktAkt

TGF-TGF-ββββββββ

TAK1TAK1

TranslationTranslation

TranscriptionTranscription

CaMKIICaMKII

HDACHDACPP

HDACHDAC

HDACHDACKinaseKinase

CaMKIICaMKII

KN-93KN-93

GGααααααααq/11q/11

PLCPLC

GPCRGPCR

Dilated cardiomyopathies:Dilated cardiomyopathies:a way to characterize the stretch sensor machinery ?a way to characterize the stretch sensor machinery ?

Kenneth R. ChienKenneth R. Chien Nature Nature 20002000INSERM U 460INSERM U 460

Faculté X. BichatFaculté X. Bichat

MLPMLP

Muscle LIM Protein (MLP)

• Belongs to the group of LIM only proteins• Known to be involved in myogenesis and as a co-factor

of transcription• MLP k.o. mice develop severe DCM (Arber et al. 1997)

R. KnöllR. Knöll

Papillary muscle stretch

R. KnöllR. Knöll

BNP and stretch response

R. KnöllR. Knöll

INSERM U 460INSERM U 460Faculté X. BichatFaculté X. Bichat Knöll et al. Knöll et al. Cell Cell 20022002

Laminin

AKT GSK3ββββ

Hypertrophy genes

NF-AT/GATA4

α7α7α7α7 β1β1β1β1D

Talin

αααα-actininVinculin

actin

Melusin

G. TaroneG. Tarone

Effects of altered redox balance in the heart

RedoxsignallingOxidative

damage

Inactivation of NO

Loss of NO effects

Alteredcellular

phenotypeMyocyte dysfunction

Energetic deficit Cell death

Antiox ROS

A.M.Shah

O2-

generation

SHAM

LVH

LV / body weight

1

2

3

1 3 6 10Weeks post-op

Rat

io (

mg/

g)

***

NADPH -dependent

0.02

0.07

0.12

0.17

0.22

MLU

/ m

in.

Weeks post-op1 3 6 10

LVHSHAM

** *

Progressive LVH

� NADPH oxidase activity in progressive pressure-overload LVH

G-pig aortic bandingLi / Grieve

Hypertension 2002A.M.Shah

p40

O2O2

-

p67

p40

p22gp91

p47rac

H+ + NADP NADPH

Phagocyte-type NADPH oxidase

Ang II , ET-1Alpha agonists CytokinesCyclic stretch

VSM

fibroblasts

endothelial cells

cardiomyocytes

A.M.Shah

Role of gp91phox-containing NADPH oxidase in Ang II-induced LVH ?

p67

p40

p22gp91

FAD p47rac

P M Dinauer

gp91phox knockout mouse

- RT WT gp91 phox-/-

240bp

A.M.Shah

WT sham WT Ang II

gp91phox-/- sham gp91phox-/- Ang II

% C

hang

e in

myo

cyte

are

a

WT gp91phox-/-0

5

10

15

20

25*

Inhibition of angiotensin II-induced cardiachypertrophy in gp91phox-deficient mice

Bendall et al Circ 2002A.M.Shah

WT sham WT Ang II

gp91phox-/- Ang IIgp91phox-/- sham

Inhibition of angiotensin II-induced cardiacfibrosis in gp91phox-deficient mice

Bendall et al Circ 2002

WT gp91phox-/-0

50

100

150

200*

% c

hang

e

A.M.Shah

5 10 15 20 25 300

1000

2000

3000

4000

5000

6000d

P/d

t ma

x (m

mH

g/s

)

Preload (cm H20)

WT Band WT Sham

* †

5 10 15 20 25 300

1000

2000

3000

4000

5000

6000

dP

/dt m

ax (

mm

Hg

/s)

Preload (cm H20)

gp91phox-/- Band gp91phox-/- Sham

5 10 15 20 25 30

-4000

-3000

-2000

-1000

0

dP

/dt m

in (

mm

Hg

/s)

Preload (cm H20)

5 10 15 20 25 30

-4000

-3000

-2000

-1000

0

dP

/dt m

in (

mm

Hg

/s)

Preload (cm H20)

*

KO

WT

LV dysfunction is inhibited in gp91phox knockout mice after aortic constriction

Grieve et al 2003Isolated ejecting heartsA.M.Shah

INT P=0.004

* †

0 10 20 30 400

20

40

60

80

100

120

140

LV

Pre

ssu

re (

mm

Hg

)

LV Volume (µl)

WT Band WT Sham

0 10 20 30 400

20

40

60

80

100

120

140

LV

Pre

ssu

re (

mm

Hg

)

LV Volume (mmHg)

gp91phox-/- Band gp91phox-/- Sham

Grieve et al 2003A.M.Shah

LV dysfunction is inhibited in gp91phox knockout mice after aortic constriction

No inhibition of pressure-overload LVH in gp91phox KO mice

42.4 % 43.2 %

Grieve / Byrne 2003

ANF mRNA expression

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

WT gp91 phox-/-

AN

F/G

AP

DH

(A

rbitr

ary

units

) ShamBand

Cardiac morphometrics

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

LV:b

ody

wei

ght (

mg/

g)

ShamBand42.4 % 43.2 %

* *

**

WT gp91 phox-/-

A.M.Shah

Les facteurs déclenchants et Les facteurs déclenchants et les voies de l’hypertrophieles voies de l’hypertrophie

L’hypertrophie :L’hypertrophie :Physiologique/benefiquePhysiologique/benefique

vsvsDélétèreDélétère

luciferaseΤΑΤΑΤΑΤΑΤΑΤΑΤΑΤΑ-164 +12

9xNFAT sites

Generation of calcineurin-NFAT reporter TG mice

0100200300400500

1000200030004000

Brain

Thym

usSpl

een

Live

rLu

ng

Kidne

yOva

ryTe

stis

Pancr

eas

Sm.In

test

ine

Tib.

Anter

ior

Heart

RLU

µµ µµg

-1

Line 15.1

Gastro

c.+S

ol.


A

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

1 Day 2 Days 3 Days 4 Days 14 Days 56 Days

ShamTAC

646446 10 88879

0.99X 2.27X 1.77X 2.49X 2.08X 3.13X

RLU

µµ µµg

-1

**

*

*

B

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 Day 2 Days 3 Days 4 Days 14 Days 56 Days

* *

HW

/BW

(m

g/g)

Sham TAC 14 days

C

Calcineurin-NFAT Activity Sustains Load-Induced Hyp ertrophy


A

0

4

8

12

16

20

Sham MI comp. MI failing

Lung

wei

ght/B

W (

mg/

g)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Sham MI comp. MI failing7 5 3

RLU

µµ µµg

-1

1.69X 5.03X

*

* †

0

2

4

6

8

10

Sham MI comp. MI failingH

W/B

W (

mg/

g)

* †

0

10

20

30

40

Sham MI comp. MI failingFra

ctio

nal s

hort

enin

g (%

)

**†

B

C D Sham MI failing 21 days

MI-induced Heart Failure Augments Calcineurin-NFAT signaling


Calcineurin-NFAT signaling is both necessary and su fficient in mediating pathologic cardiac hypertrophy

What is the relative role of calcineurin-NFAT signa ling in regulating adaptive (physiologic) versus patholo giccardiac hypertrophy?

Question


A

B

01234567

Wheel running Swimming

**

HW

/BW

(m

g/g)

0

500

1000

1500

2000

2500

Wheel running Swimming

RestExercise

RLU

µµ µµg

-1

8 88 6

Rest Swim

Physiologic Hypertrophy Does Not Activate Calcineur in-NFAT

Phos-473-Akt

Akt

Rest SwimD

C


0

10

20

30

40

01234567

0

500

1000

1500

2000* *

BW

incr

ease

(%

)

HW

/TL

(mg/

mm

)

RLU

µµ µµg

-1

Vehicle

IGF-1+GH

Vehicle

IGF-1+GH

Vehicle

IGF-1+GH

A

Phos-473-Akt

Akt

Vehicle IGF-1+GHB

IGF-1/GH Stimulation Does Not Activate Calcineurin- NFAT in vivo

Rest TAC Swim IGF-1+GH

ß-MyHC

ANF

BNP

Sk. αααα-actin

SERCA2

GAPDH

C

*Model: 14 days ofIGF-1/GH infusionIn NFAT-luc reporterTG mice


Normaladult heart Hypertrophy

Pathologic Progam?

Adaptive Program?

Calcineurin-NFAT

GH/IGF-1/PI3K/Akt


« Physiological »« Physiological »hypertrophyhypertrophy

(exercise(exerciseconditioning,conditioning,pregnancy…)pregnancy…)

Beneficial/detrimental pathwaysBeneficial/detrimental pathways

• BeneficialBeneficial

– PKCPKCεεεεεεεε– ERK1/2ERK1/2– PI3K – AKT PI3K – AKT – Calcineurin/NFAT Calcineurin/NFAT

(moderate activation)(moderate activation)

• DetrimentalDetrimental

– PKCPKCαααααααα, (δ?), (δ?), (δ?), (δ?), (δ?), (δ?), (δ?), (δ?)– p38 kinase, JNKp38 kinase, JNK– CaMKIICaMKII– CalcineurinCalcineurin /NFAT /NFAT

(strong activation)(strong activation)

Progression toProgression toheart failureheart failure

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